Manual de Técnicas y procedimientos para la detección de Vibrio

SECRETARÍA DE SALUD
COMISIÓN FEDERAL PARA LA PROTECCIÓN CONTRA
RIESGOS SANITARIOS
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE
COBERTURA
Manual de Técnicas y Procedimientos
para la Detección
de Vibrio cholerae
en Agua y Alimentos.
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1
Secretaria de Salud
Mercedes Juan López
Comisionado Federal Para la Protección Contra Riesgos Sanitarios
Mikel Andoni Arriola Peñalosa
Comisionada de Control Analítico y Ampliación de Cobertura
Armida Zúñiga Estrada
Comisionada de Evidencia y Manejo de Riesgo
Rocío del Carmen Alatorre Eden-Winter
Comisionado de Operación Sanitaria
Álvaro Israel Pérez Vega
Directora Ejecutiva de Control Analítico
Imelda Rocío Guzmán Cervantes
Directora Ejecutiva de Evidencia de Riesgos
Matiana Ramírez Aguilar
Director Ejecutivo de Programas Especiales
Aldo Verver y Vargas Duarte
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2
Grupo Técnico CCAyAC
Gerencia de Análisis y Desarrollo de Pruebas Microbiológicas
Gerencia de Análisis y Desarrollo de Pruebas Inmunoquímicas y Biología Molecular
Con colaboración de:
Dirección Ejecutiva de Evidencia de Riesgos
Dirección Ejecutivo de Programas Especiales
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3
ÍNDICE
1. Introducción……………………………………………………………………………….
5
2. Marco Legal………………………………………………………………………………
6
3. Justificación……………………………………………………………………………….
8
4. Objetivo General…………………………………………………………………………
8
5. Marco Teórico…………………………………………………………………………….
8
6. Medidas de seguridad en el laboratorio de microbiología…………………………..
18
7. Procedimiento de muestreo…………………………………………………………….
19
8. Preparación de la muestra para el análisis de laboratorio……………………………
27
9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa, aislamiento e
identificación……………………………………………………………………………...
29
10. Informe final de resultados de laboratorio…………………………………………….
46
11. Lineamientos generales…………………………………..……………………………..
46
12. Glosario…………………………………………………………………………………….
48
13. Símbolos y abreviaturas………………………………………………………………...
52
14. Bibliografía………………………………………………………………………………...
54
Anexo I. Método de concentración CDC……………………………………………………
57
Anexo II. Materiales, medios de cultivo, reactivos y equipo de laboratorio requerido
para el análisis microbiológico………………………………………………………………
65
Anexo III. Reactivos, formulación y condiciones de preparación de Medios de cultivo
para el aislamiento e identificación de V. cholerae………………………………………
67
Anexo IV. Diagrama general para aislamiento e identificación de V. cholerae a partir
alimentos………………………………………………………………………………………..
77
Anexo V. Diagrama general para el aislamiento de V. cholerae en moluscos bivalvos
78
Anexo VI. Diagrama general de análisis de hisopo de Moore para el aislamiento e
identificación de V. cholerae a partir de agua y hielo para consumo humano......…….
79
Anexo VII. Diagrama general para el aislamiento e identificación de V. cholerae a
partir
de
muestras
de
aguas
residuales
...…………………………………………………..
80
Anexo VIII. Diagrama general del uso hisopo de Spira para aislamiento e
identificación de V. cholerae a partir aguas ambientales…………………………………
81
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4
1. INTRODUCCIÓN.
El cólera es una enfermedad diarreica infecciosa aguda causada por bacilos de Vibrio cholerae O1 u
O139 toxigénicos el cual es transmitido en algún vehículo de la cadena de transmisión causada por la
ingesta de agua o alimentos contaminados con bacilos de Vibrio cholera toxigénicos. En general, las
enfermedades diarreicas infecciosas agudas son consideradas un problema de salud pública a nivel
mundial presentándose de manera particular en países subdesarrollados y de clima tropical 4, 17. El
cólera es considerado un indicador de la falta de desarrollo social; observándose el resurgimiento de
esta enfermedad en paralelo con el incremento de población de grupos vulnerables que viven en
condiciones precarias y que condiciona la falta de higiene31.
El cólera es una enfermedad diarreica la cual había sido endémica durante años en países de Asia
como la India. Tiene ese nombre debido a que así la llamaron los romanos a partir de las palabras
griegas chole=bilis y rhein=fluir a causa del color de las evacuaciones producidas. Durante el siglo XIX,
el cólera se propagó por el mundo desde su reservorio original en el delta del Ganges en la India,
provocando el deceso de millones de personas en los diferentes continentes. La actual pandemia
(séptima) comenzó en el sur de Asia (Indonesia) en 1961 llegando a África en 1971 y registró una
letalidad de hasta un 50%. Por otra parte, en el continente americano se registró hasta el año de 1991
en las zonas costeras de Perú, causando brotes de enfermedades diarreicas y en donde grupos de
epidemiólogos y de laboratorio identificaron al agente causal como V. cholerae O1 biotipo El Tor,
serotipo Inaba, propagándose a otros países del continente; de esta manera se estableció por lo tanto
que actualmente el cólera es endémico en muchos países del mundo 4,41,42.
Los casos de cólera reportados a nivel mundial han presentado una tendencia a la alza desde el 2007,
donde solo hasta el 2012 han mostrado un descenso en el número de casos5,31, 44. De acuerdo a la
OMS en la Nota descriptiva No. 107 (2014), se calcula que cada año se producen entre 3 a 5 millones
de casos de cólera y entre 100,000 y 120,000 defunciones .A México, el cólera llegó por primera vez
de Europa y se presentó en la ciudad de Guadalajara en 1833, posteriormente otros casos se
presentaron hasta 1875. En 1961 se declaró la 7a pandemia de cólera en Indonesia, siendo reportado
hasta el verano de 1991 el primer caso de cólera en la comunidad rural de San Miguel Totolmaloya,
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ubicada en la Sierra de Goleta en el Estado de México, afectando a 19 personas sin originar ninguna
defunción; sin embargo el padecimiento se propagó a otras entidades federativas afectando
especialmente a las de menor desarrollo de infraestructura sanitaria y núcleos urbanos con factores
determinantes que favorecen la presencia y transmisión de la enfermedad, incluyendo: el bajo nivel
socioeconómico, educación sanitaria deficiente, malos hábitos higiénico-dietéticos, entre otros.11 Los
factores predisponentes son inherentes al huésped, edad, sexo, sistema inmune, genotipo, etc.43
Posteriormente se reportó el mayor número de casos de esta enfermedad siendo confirmados para
finales de 1998, con 45 963 casos en todo el país, con ocurrencia de 552 defunciones. Para el año
2000 y 2001 únicamente se reportaron 6 casos en total. Lo anterior debido al adecuado manejo de la
enfermedad y a las medidas preventivas y de control que se habían establecido para contenerla, pues
la Secretaría de Salud fortaleció su programa de acción, con el objetivo de mantener el cólera bajo
control epidemiológico en el territorio nacional. Cabe señalar que en México como en el resto de Latino
América las cepas de cólera aisladas han sido predominantemente del biotipo el Tor5.
Los últimos casos de cólera en México fueron reportados en septiembre del 2013 en el estado de
Hidalgo, donde el Centro Nacional de Enlace de México para el Reglamento Sanitario Internacional
notificó a la OMS los 10 casos confirmados de infección autóctona por Vibrio cholerae O:1 Ogawa
toxigénico. A partir de ese momento y hasta mediados del mes de octubre del 2013, se notificaron un
total de 171 casos confirmados, incluido un deceso. El análisis llevado a cabo en el estado de Hidalgo
estableció la posibilidad que el agua del río haya sido el origen de contaminación. Ante esto las
autoridades de salud de México han reforzado las actividades de vigilancia epidemiológica a nivel
nacional, con el propósito de evitar el resurgimiento de casos de cólera por cepas ya existentes en el
país o por la introducción de nuevas variantes28,31,36.
2. MARCO LEGAL.
El presente manual se sustenta en lo descrito en el Artículo 4 de la Constitución Política de los
Estados Unidos Mexicanos, así como lo establecido en el Reglamento Interno de Comisión Federal
para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) específicamente en el Artículo 16 que
correspondiente a las atribuciones de la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura
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6
(CCAYAC), es una unidad administrativa de la COFEPRIS, en el que se estipula lo siguiente:
I. Establecer los lineamientos, criterios y procedimientos de operación aplicables al control analítico de
la condición sanitaria en las materias a que se refiere el artículo 3, fracción I, de su reglamento.
II. Proponer las políticas, criterios, procedimientos y requisitos de operación para los laboratorios de
control fisicoquímico, microbiológico, biológico, farmacéutico o toxicológico integrantes de la red
nacional de laboratorios, del sistema federal sanitario y, en general, para los terceros autorizados.
III. Definir y coordinar la aplicación de las políticas para la ampliación de cobertura a través de
laboratorios de prueba y unidades de verificación de terceros autorizados.
IV. Establecer los criterios, métodos y procedimientos para la recepción y procesamiento analítico de
los productos susceptibles de control analítico.
V. Establecer, en coordinación con la Comisión de Evidencia y Análisis de Riesgos, los criterios
aplicables al muestreo y transporte de los productos objeto de control analítico.
VI. Definir las políticas, criterios y lineamientos, en los términos de las disposiciones aplicables, para el
control de calidad sanitaria para la liberación y uso de los productos biológicos utilizados en el país.
VII. Prestar servicios de pruebas analíticas a las unidades administrativas de la Comisión Federal y a
los sectores público, social y privado, para apoyar el cumplimiento de la normatividad sanitaria en las
materias a que se refiere el artículo 3, fracción I, del presente Reglamento.
VIII. Coordinar las actividades de capacitación e investigación de laboratorios y unidades de verificación
a terceros autorizados y de la red nacional de laboratorios de Salud Pública que constituyen la
ampliación de cobertura.
IX. Apoyar la instrumentación de acciones en materia de vigilancia sanitaria, regulación y en su caso,
vigilancia epidemiológica; así como de las encaminadas a la evaluación y seguimiento de eventos
adversos asociados con el uso de medicamentos y productos biológicos.
X. Participar en el ámbito de su competencia, en la protección a la salud de la población durante las
contingencias, accidentes o emergencias en las materias competencia de la Comisión Federal.
XI. Fungir como centro de referencia nacional dentro del ámbito de competencia de la Comisión
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Federal y;
XII. Las demás que le encomiende el Comisionado Federal.
3. JUSTIFICACIÓN.
La Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC), como Laboratorio Nacional de
Referencia, tiene entre sus funciones establecer los criterios, métodos y procedimientos para la
recepción y procesamiento analítico de los productos susceptibles de control analítico, además de
coordinar a la Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). Emite políticas y
lineamientos técnicos de operación aplicables al laboratorio, en el ámbito de la protección contra
riesgos sanitarios, para el aislamiento e identificación de diversos agentes etiológicos como el cólera,
en muestras ambientales y de alimentos, a fin de garantizar resultados confiables y oportunos para
sustentar la toma de decisiones en la vigilancia y control de brotes. Tal es el caso del presente manual
para el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae en muestras de agua y alimentos.
4. OBJETIVO GENERAL.
Proporcionar de manera práctica, clara y sencilla, principalmente a los Laboratorios Estatales de Salud
Pública y Terceros Autorizados, la metodología para el muestreo, aislamiento e identificación de V.
cholerae, en muestras ambientales y de alimentos; a fin de llevar a cabo acciones de protección contra
riesgos sanitarios en apoyo a la vigilancia sanitaria y el control de brotes de cólera en la población
mexicana, adoptando un esquema multidisciplinario, que propicia que dichas acciones sean eficaces.
5. MARCO TEÓRICO.
Los miembros del género Vibrio pertenecen a la familia Vibrionaceae, los cuales son definidos como
bacilos cortos curvos Gram negativos, de 0.5 a 1 μm de longitud, aerobios estrictos, crecen en
presencia de niveles relativamente altos de sales biliares, condiciones alcalinas, producen enzimas
como catalasa y oxidasa y fermentan la glucosa sin producción de gas, reducen los nitratos a nitritos,
no forman esporas, cápsula y fimbrias, son móviles con un flagelo polar al crecer en medio líquido,
algunos requieren de NaCl para su crecimiento, presentan un rango de temperatura de crecimiento de
18 a 37°C, pH de 6 a 9, usualmente sensibles a 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropil-pteridina), muestran
un contenido de G+C en DNA de 40-50%mol, así mismo son productores de varias enzimas
extracelulares como lipasas, amilasas, quitinasas, DNAsas, y lecitinasas. Tres especies, V. cholerae, V.
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parahaemolyticus y V. vulnificus, están documentadas como patógenos en humanos. Algunas cepas de
V. mimicus son reconocidas como patógenas con características similares a V. cholerae, entre estas
que tienen un pH óptimo de crecimiento de 7.6 a 8.6, pero puede ser distinguido por su incapacidad
bioquímica de fermentar la sacarosa (Cuadro 1). Mientras que otras especies como V. alginolyticus, V.
fluvialis, V. furnissii, V. metschnikovii y V. hollisae son consideradas ocasionalmente patógenas.
Numerosas especies de Vibrio son responsables de generar enfermedades en humanos transmitidas
principalmente por el consumo de alimentos crudos o precocidos como mariscos y crustáceos; tal es el
caso de la enfermedad de cólera cuyo agente causal es V. cholerae8,22,42.
La estructura antigénica de los Vibrios está constituida por dos antígenos, que son 1 somáticos “O”
termoestables y 2 Los antígenos “H” flagelares termolábiles; estos últimos comunes en 6 grupos de las
especies Vibrio. El grupo V. cholerae presenta más de 70 serogrupos basados en características
antigénicas de su pared celular, clasificados en forma general como serogrupo O1 y No O1 (a partir de
la aglutinación o no de suero polivalente O1), además con base en características fenotípicas,
propiedades metabólicas, susceptibilidad a bacteriófagos y antimicrobianos, V. cholerae serovariedad
O1 tiene los biotipos: Clásico y el Tor que presentan a su vez los subtipos Ogawa, Inaba y Hikojima
identificados por los factores antigénicos A, B y C9,31,42.
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Cuadro 1. Características bioquímicas de diferentes miembros de la familia Vibrionaceae encontrados comúnmente en alimentos del mar (pescados
y mariscos)22.
Condición
V.
alginolyticus
A
V.
cholerae
A
V.
fluvialis
A
V.
furnissii
A
V.
hollisae
NC
V.
metschnikovii
A
V.
mimicus
V
V.
parahaemolyticus
V
V.
vulnificus
V
+
-
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
+
-
Lisina descarboxilasa
Crecimiento en (p/v)
NaCl:
0%
3%
6%
8%
10%
Crecimiento a 42°C
formación de ácido a
partir de:
Sacarosa
D-celobiosa
Lactosa
Arabinosa
D-Manosa
D-Manitol
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
v
+
+
+
-
+
+
nd
+
+
V
v
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
v
Voges-Proskauer
Gelatinasa
Ureasa
+
+
-
v
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
+
-
+
v
+
-
Agar
TCBS
Oxidasa
Arginina dihidrolasa
A= amarillas, V=Verdes, NC=crecimiento pobre o no presente, Nd no realizado, V=variable, TCBS= tiosulfato de sodio citrato sales biliares.
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Existen proteínas extracelulares sintetizadas por microrganismos patógenos que favorecen el
establecimiento y mantenimiento de la enfermedad en el huésped, estos son denominados factores de
virulencia. Para el caso de V. cholerae O1 y O139 el principal factor de virulencia es la toxina colérica
(CT) la cual es considerada una exotoxina termolábil ya que es liberada al medio extracelular a medida
que crece el microorganismo (con sensibilidad a altas temperaturas) y enterotoxina por que actúa sobre
la pared celular del intestino delgado causando una secreción masiva de líquidos en la luz intestinal.
CT es una toxina A-B al estar constituida por dos polipéptidos unidos covalentemente (A y B) en donde
el componente B generalmente se une a los receptores celulares permitiendo así que el componente A
atraviese la membrana y actué provocando el daño a la célula31,32.
El componente A de la toxina presenta un peso molecular de 27,200 mientras que el componente B
está formado por 5 sub unidades cada una de peso molecular de 11,600. La sub unidad B posee el
sitio de unión a través del cual la toxina se combina específicamente con su receptor el gangliósido
GM1 en la membrana citoplasmica epitelial y así posteriormente la fracción A lleva a cabo la acción
toxica al activar la enzima adenilatociclasa causando la conversión de ATP a AMPc intracelular lo que
condiciona alteración del transporte intracelular de iones y diarrea. Cabe recordar que en mamíferos el
AMPc está involucrado en la acción de distintas hormonas así como la transmisión sináptica en el
sistema nervioso, reacciones inflamatorias e inmunes de los tejidos.
El aumento de AMPc lleva consigo una secreción activa de agua, iones cloruro y bicarbonato en la luz
del intestino procedentes de las células mucosas que van al lumen produciendo pérdida masiva de
líquidos y muerte por deshidratación extrema por lo que el tratamiento consistirá en la administración
oral de soluciones de electrolitos31,32 (Figura 1).
Diversos estudios han demostrado que la toxina colérica esta codificada por el gen ctxA y ctxB cuya
expresión está controlada por un elemento regulador positivo en el gen toxR, el producto de este gen
es una proteína trans membrana que controla no solo la producción de toxina del cólera sino otros
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factores de virulencia como la toxin co-regulated (TCP) proteínas de membrana externa y pili que se
necesitan para adherencia y la colonización exitosa de Vibrio en el intestino delgado, así como
hemolisinas, proteína reguladora (ToxR) y citotoxinas (RTX)30,32.
Algunas cepas de V. cholerae producen otras toxinas como la toxina Zot (zona occludens toxin) que
rompe las uniones (zona occludens) que mantienen la mucosa celular unida y preservan la integridad
de la membrana permitiendo así la fuga del contenido luminal alterando el equilibrio iónico y
ocasionando episodios diarreicos. Hasta 1992 el cólera únicamente era causado por cepas toxigénicas
de V. cholerae O1, pero comenzaron a aparecer brotes que reportaron cada vez más casos de diarrea
deshidratante causados por la cepa de V. cholerae No O1; se realizaron estudios posteriores
revelándose que se trataba de un nuevo serotipo al que se designó como V. cholerae O139.
Al igual que V. cholerae O1, las cepas de V. cholerae O139 tienen los genes ToxR (que regulan la
expresión de varios factores de virulencia), ctxA, cep, ace y zot (genes que codifican para la producción
de toxinas) por lo que no es sorprendente que sean capaces de producir cólera epidémico. Por otra
parte, se han observado diferencias entre V. cholerae O1 y V. cholerae O139; en donde la principal
radica en que O139 presenta una cápsula de polisacárido y distintos determinantes de virulencia del
LPS que no está presente en V. cholerae O1.
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Células epiteliales
+
Na
A)
GM1
Sangre
Luz del intestino delgado
V. cholerae
B)
Sangre
Toxina de V. cholerae
Lumen
Epitelio
Colonización y producción de toxina
Toxina del cólera
Adenilato ciclasa
ATP
AMPcíclico
Activación de la adenilatociclasa por la toxina colérica
C)
Na
Sangre
+
-
Cl
Lumen
-
Flujo de Cl hacia la luz
D)
Bloqueo flujo de Na
+
Na
+
Agua
Cl
Flujo de agua masivo hacia
la luz intestinal
-
Figura 1. Modo de acción toxina colérica. A) proceso normal de tráfico de iones. B) Colonización de V. cholerae siguiendo
con la liberación de la toxina y unión a receptores GM 1 (gangliósidos) del huésped, y toxinas A-B internalizando el
componente A y activando la adenilato ciclasa. C) Bloqueo del flujo normal de Na +.D) Pérdida de agua en el lumen y
diarrea32.
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La cápsula puede presentar funciones de defensa ante la respuesta inmune y la diferencia en los
determinantes antigénicos explicaría porque la respuesta inmune es distinta para ambos serogrupos 8.
Además existen cepas de V. cholerae No O1 diferentes a O139, que no presentan la capacidad de
producir cólera encontrándose que algunas cepas producen un cuadro de gastroenteritis de suave a
moderada en adultos debido a la generación de β-hemolisina (característica de estos serogrupos),
junto con cuadros de apendicitis aguda, colecistitis aguda, otitis media, celulitis, neumonía,
meningoencefalitis y septicemia además de que solo en muy raras ocasiones producen las toxinas CT
y Zot (Figura 2)30,31,41.
Vibrio cholerae
No O1
198 serogrupos
O:2 – O:199
O1
Toxina colérica (+)
Biotipos
Clásico y El Tor
O:139
Toxina colérica (+)
Serotipos
Inaba, Ogawa, Hikojima
Toxigenicidad
CT -
CT +
Figura 2. Clasificación de agente causal del cólera31.
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14
V. cholerae forma parte de la microbiota de ambientes marinos y se ha encontrado asociado con
especies de vertebrados e invertebrados como peces, mariscos y zooplancton. Además es posible
aislarlo de fuentes de agua dulce como son ríos, lagunas, pantanos, corrientes y lagos. Se considera al
ser humano como un huésped incidental y transitorio, para este microorganismo, el cual realiza la
función de diseminarlo hacia otras fuentes de agua y alimentos de otras poblaciones y ecosistemas.
La razón por la que V. cholerae tenga diversos reservorios naturales ha llevado a considerar a varios
investigadores que el control del cólera pueda ser mediante la prevención de la exposición del hombre
a reservorios no detectados y el control de la diseminación secundaria de la enfermedad. Por otra parte
durante el curso de un brote, es posible aislar V. cholerae O1 de pacientes y de muestras ambientales,
sin embargo en los periodos inter epidémicos es difícil aislarlo permaneciendo este en una forma viable
no cultivable debido a condiciones desfavorables ambientales y de nutrientes presentando una alterada
morfología con disminución de su tamaño y acción metabólica (detectables por métodos de
inmunofluorescencia al no mostrar crecimiento sobre medios de cultivo no selectivos), postulándose
que estas formas no cultivables son la manera de sobrevivir y mantenerse en ambientes acuáticos en
periodos inter epidémicos; pero al encontrar condiciones favorables de temperatura, pH alcalino y
concentración de materia orgánica, estas formas no cultivables pueden ser recuperadas manifestando
plenamente su capacidad de infección, patogenicidad y transmisibilidad. Así mismo, se ha propuesto la
capacidad de estos microrganismos de asociarse a fitoplancton, zooplancton y sustratos específicos
como la quitina de mariscos mediante la producción y actividad de quitinasas. Este proceso de igual
forma ocurre y se favorece por condiciones nutrimentales pobres sobreviviendo por tiempo prolongado
al asociarse a la quitina de los artrópodos marinos considerándose esta relación un modo de
persistencia ambiental y diseminación30,31,41.
La enfermedad de cólera.
Los microorganismos patógenos para el hombre pueden ser trasmitidos a través del agua de consumo
ya sea para beber, cocinar, bañarse o nadar. Ya que todos usamos y consumimos agua, en el caso
particular del agua potable, cuando ésta está contaminada, es considerada una importante fuente de
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transmisión de enfermedades y epidemias de graves consecuencias. En países desarrollados la
transmisión de enfermedades por el agua está restringida debido a los altos estándares de higiene y
calidad, ocurriendo brotes debido a fallas en el proceso de potabilización de la misma; sin embargo, los
países en vías de desarrollo sí son afectados por brotes importantes debido comúnmente a la falta de
sistemas eficientes de potabilización de agua y tratamiento de aguas residuales dando lugar a
enfermedades intestinales como cólera, fiebre tifoidea y amebiasis las cuales son consideradas
grandes problemas económicos, sociales y de salud pública.
Los microorganismos que son transmitidos por el agua regularmente se reproducen en el intestino del
huésped (ser humano) y se eliminan a través de la materia fecal; por tanto si esta contaminación no es
identificada y tratada con un proceso de desinfección, un nuevo huésped consumirá el agua y el
patógeno podrá colonizar los intestinos y originar la enfermedad en nuevos individuos 32.
Esta enfermedad es un claro ejemplo de enfermedades trasmitidas y asociada al consumo de agua y
alimentos como moluscos bivalvos y vegetales crudos. El huésped una vez infectado con el agente
causal puede tener un periodo de incubación que va de algunas horas hasta 3 o 5 días, presenta
severos cuadros de vómito, dolor abdominal, fiebre, choques hipovolémicos, procesos diarreicos
(pérdida de agua aproximadamente de 1 L/h en adultos, con una tasa de mortalidad del 60% en
pacientes no tratados, presentando evacuaciones de apariencia de agua de arroz) con la consecuente
deshidratación, hipotensión y muerte32,42.
Fuente y distribución del agente causal de cólera.
V. cholerae O1 es excretado en las heces de pacientes y convalecientes de cólera; así la enfermedad
es trasmitida de manera primaria vía fecal-oral indirectamente a través de suministros de agua
contaminados, siendo la propagación de persona a persona poco común. Cabe mencionar que
aproximadamente el 75% de las personas infectadas con V. cholerae pueden NO presentar ningún
síntoma a pesar que estar presente en las heces durante 7 a 14 días después de la infección.
La infección por cólera se da por ciclos de humano – medio ambiente - humano, transmitiéndose
principalmente de un individuo a otro por la vía fecal-oral a través del consumo de agua o alimentos
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crudos o precocinados del mar (mariscos, moluscos bivalvos, cangrejos, pescado) contaminados con
heces humanas, así mismo individuos enfermos, portadores transitorios y portadores crónicos son
reservorios naturales del agente causal. En las zonas endémicas los brotes tienden a ocurrir en
temporadas de calor con elevada incidencia en niños, mientras que en las zonas no endémicas
aparecen en cualquier época del año y sin un grupo específico de edad. Además los grandes desastres
naturales son también factor de riesgo pues favorecen la contaminación del agua con heces humanas
dando lugar a brotes severos42.
Los agentes causales de cólera como V. cholerae O1 o V. cholera O139 requieren de una ingestión de
108 a 109 Vibrios a través del consumo de agua y alimentos contaminados con heces y/o vómito de
individuos infectados, para generar la enfermedad31,32.
Sin embargo, la posibilidad de que se genere un brote de cólera en una región específica dependerá de
varios factores como: el número de individuos susceptibles, la exposición a aguas cloacales o agua no
tratada y alimentos contaminados además de la presencia de un reservorio acuático de V. cholerae. La
interacción de estas variables podría explicar la aparición del cólera endémico ya sea en forma
estacional o el surgimiento del cólera epidémico (Figura 3)30.
En función del grado de exposición al agua.
En función de la concentración de V. cholerae en
el agua contaminada o alimento de origen marino
A través de la excreción
Se incrementa la población microbiana
Cambios climáticos: °T
del agua, pH, nutrientes e
interacciones bióticas.
Figura 3. Dinámica de transmisión del V. cholerae30.
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17
Medidas de prevención del cólera.
Las medidas eficaces de control y prevención de brotes deben adoptar un enfoque multidisciplinario e
interdisciplinario a través de un sistema de vigilancia eficaz. El suministro de agua potable y el
saneamiento son medidas decisivas para reducir las repercusiones del cólera y otras enfermedades
transmitidas por el agua. Las medidas de prevención del cólera consisten principalmente en
proporcionar agua salubre y saneamiento a las poblaciones que todavía no tienen acceso a servicios
básicos, la educación sanitaria y la higiene de los alimentos son igualmente importantes, cual debe
recordársele a la población en general y principalmente en riesgo (comunidades) a través de los
distintos medios de comunicación. La contaminación ambiental del agua puede prevenirse mediante la
disposición adecuada de las excretas humanas y animales así como a nivel doméstico es importante
educar a la población de los comportamientos higiénicos básicos, mediante la correcta desinfección del
agua de uso o para beber; adecuado almacenamiento y manejo, el lavado regular de manos con agua
y jabón después de ir al baño, antes de comer, así como previo a la preparación y conservación de
alimentos4,31.
Ante la aparición y detección de un brote epidémico la respuesta implica la estrategia de reducir las
defunciones mediante el rápido acceso de tratamiento médico, la reducción de la mortalidad es por el
manejo de sostén y la rehidratación el tratamiento médico y sirve para contener la diseminación, es
decir para que no se continúe reproduciendo el patógeno en el intestino y se evita la propagación de la
enfermedad mediante la tendencia al suministro de agua potable, saneamiento apropiado y educación
sanitaria para mejorar la higiene y las prácticas de manipulación segura de los alimentos por la
comunidad. El suministro de agua potable y saneamiento representan una gran dificultad y
consideración, siendo un factor de importancia decisiva para reducir las repercusiones y brotes de
Cólera y de otras enfermedades transmitidas por el agua4.
6. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.
El laboratorio de análisis de muestras sospechosas de contener V. cholerae debe estar siempre
perfectamente limpio y desinfectado durante el monitoreo microbiológico ambiental el recuento de
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
18
colonias en placa de agar soya tripticasa o agar peptona-glucosa extracto de levadura, no debe rebasar
la cuenta de 15 colonias al ser previamente expuestas 15 minutos e incubadas a 35°C/48h22. Además
de que los procedimientos analíticos y recomendaciones que se ofrecen en el presente Manual deben
ser realizadas considerando las directrices en materia de bioseguridad
que recomienda la
Organización Mundial de la Salud a través de su Manual de Bioseguridad en el Laboratorio25, debido al
manejo de microorganismos infecciosos. Es recomendable seguir medidas de bioseguridad nivel II25.
Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada, esta vestimenta no debe ser usada fuera de las
áreas de trabajo.

Limpieza y desinfección de mesa de trabajo antes y después de procesar muestras.

Mantener cerrada la puerta del laboratorio.

Lavado de manos antes y después de trabajar.

No hablar, estornudar ni toser durante el sembrado de la muestra.

No pipetear directamente con la boca.

Programa para el manejo de RPBI.
7. PROCEDIMIENTO DE MUESTREO.
7.1.
Condiciones generales.
El personal técnico responsable del muestreo deberá realizarlo en condiciones asépticas, usar guantes
de látex estériles desechables; la muestra deberá ser colectada y depositada en recipientes estériles
con tapa de rosca. Si es necesario el uso de bolsas de plástico se deberá tener especial cuidado en
que las bolsas estén íntegras y sean de cierre hermético, de tal manera que la muestra no presente
derrames.
Realizar el etiquetado de la muestra, en la cual se suministre como mínimo la siguiente información:

Nombre del producto.

Número o código de ingreso de muestra.

Número de acta de muestreo.

Nombre del verificador o del responsable del muestreo.

Procedencia (Domicilio o punto de muestreo o nombre del establecimiento).

Fecha y hora de recolección.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
19
Así como cualquier otra información relevante, que pueda ser de utilidad para la rastreabilidad de la
misma.
V. cholerae sobrevive mejor en las muestras conservadas a temperaturas de refrigeración que de
congelación, por lo que será conveniente mantenerlas a temperaturas de entre 4°C a 8°C y ser
transportadas a la mayor brevedad una vez colectadas para su análisis en el laboratorio.
Si las muestras se refrigeran en hielo, evitar el contacto de la muestra con el agua de deshielo, por lo
que es recomendable utilizar refrigerantes (Gel Ice) con el fin de evitar la contaminación cruzada y al
mismo tiempo la muestra conserve las características del entorno donde fue tomada.
7.2. Alimentos.
Los alimentos que por lo general se asocian con la transmisión del cólera son: pescados, mariscos
(particularmente moluscos y crustáceos obtenidos de aguas contaminadas) frutas, vegetales y
alimentos preparados contaminados.
Los alimentos colectados en el muestreo deberán conservarse en refrigeración (4°C a 8°C). No
deberán examinarse muestras con un tiempo mayor a 24h de haber sido colectadas24.
7.2.1. Frutas y vegetales.
Para el muestreo de frutas y vegetales proceder a la selección de piezas tal y como se indica a
continuación en el cuadro 2.
Cuadro 2. Muestreo para frutas y verduras 1,18.
Alimento
Vegetales frescos (con hoja) pequeños
Ejemplo: cilantro, perejil, berro, pápalo, germinados,
etc.
Vegetales frescos (con o sin hoja) medianos
Ejemplo: brócoli, rábanos, cebolla, jitomate, calabaza,
betabel, camotes, zanahoria, jícama, etc.
Que colectar o muestrear
Seleccionar el total de manojos que en
conjunto pesen como mínimo 250 g
Seleccionar 10 piezas de manera individual
que en conjunto pesen como mínimo 250 g
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
20
Alimento
Que colectar o muestrear
Vegetales frescos
(con hoja grandes, por ejemplo: lechuga, espinaca,
coliflor, apio, acelga, col, etc).
Seleccionar 10 piezas de manera individual
que en conjunto pesen como mínimo 250 g.
Frutas, pequeñas por ejemplo: fresas, zarzamora,
10 sub muestras que en total pesen como
uvas, etc.
mínimo 250 g.
Frutas, medianas por ejemplo: duraznos, manzanas,
aguacate, etc.
10 piezas que en total pesen mínimo 250 g.
Si sobrepasan este peso en conjunto, tomar
10 piezas de manera individual.
Frutas, grandes por ejemplo: melones, sandia, etc.
2 pieza individuales las cuales
corresponderán a una muestra.
Fruta fresca picada o rebanada.
Muestrear mínimo 250 g.
Vegetales picados o rebanados
Muestrear mínimo 250 g.
Continuar como se indica en el punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.
7.2.2. Productos de la Pesca.
Frecuentemente, ostras y peces recién capturados que se cultivan como muestras de vigilancia
epidemiológica. Además existe la probabilidad que los intestinos y en menor grado la piel de los
pescados, contengan más bacilos de cólera que el tejido muscular, sin embargo hay que considerar la
contaminación cruzada ya que la carne del pescado que se descama, limpia y almacena en zonas
comerciales puede dar cultivos positivos debido a la contaminación cruzada durante estas operaciones.
Para el muestreo de este tipo de productos considerar a continuación lo correspondiente en el cuadro
3/ Continuar el análisis acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.
Cuadro 3. Muestreo para productos de la pesca1,18.
Producto
Mariscos frescos o pre-cocido
Que cantidad muestrear
Tomar 10 sub muestras aleatorias para completar un peso
mínimo de 250 g que corresponderán a una muestra.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
21
Pescado fresco o congelado
Tomar preferentemente mínimo 5 piezas enteras o en su
defecto o contingencia, filetes.
7.2.3. Moluscos Bivalvos.
Cuadro 4. Muestreo para Moluscos bivalvos.
El muestreo de este tipo de producto deberá consistir de la
Moluscos bivalvos
cantidad necesaria para obtener mínimo 200g de líquido y
carne. Ejemplo: 10 a 12 ostras grandes o 20 a 30 pequeñas
y considerar el peso total de la muestra.
Limpieza y Desconche6.
Limpieza de la concha: Lavarse las manos con agua potable y jabón antes de comenzar. Enjuagar el
exceso de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril bajo el chorro de agua potable
poniendo particular atención en las hendiduras de las conchas. Colocar las conchas limpias en toallas
de papel absorbente o gasas limpias. Desechar los moluscos que tengan las conchas dañadas o con
las valvas abiertas.
Remoción del contenido: Lavarse las manos con agua, jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. Se
puede utilizar guantes para evitar lesiones. Sostener el molusco en la mano sobre una gasa, dirigiendo
la unión de las valvas o bisagra hacia el analista apoyándose sobre la mesa. Con un cuchillo estéril,
insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el musculo abductor de las conchas y
pasar el cuerpo del animal dentro del mismo recipiente.
Para moluscos bivalvos desconchar no menos de 12 organismos grandes o 20 – 30 pequeños.
Continuar acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.
7.3. Agua.
La colecta de la muestra de agua debe realizarse en recipientes de polipropileno de capacidad
aproximada de 3000 mL, previamente lavados con detergente y verificando que no existen residuos del
mismo, esterilizados en autoclave a 121°C/15min/15 lb antes de su uso. Las muestras de agua deben
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
22
analizarse lo más pronto posible después de su recolección; para lo cual se deberán enviar al
laboratorio en condiciones de refrigeración (4°C a 10°C). No deberá transcurrir un periodo de más de
8 h entre la colecta de la muestra y el análisis. Además, es recomendable realizarle al agua de
muestreo durante la colecta, la determinación de parámetros fisicoquímicos (temperatura, salinidad,
conductividad, pH y oxígeno disuelto, cloro libre residual) pues estos pueden influir en la densidad
celular de V. cholerae presente, esto también puede ayudar a estimar correlaciones en la incidencia de
brotes de cólera20. .
Para desactivar el cloro residual en muestras de agua para uso y consumo humano, el recipiente
deberá contener 0.1 mL de tiosulfato de sodio estéril al 1% o agregar esta solución antes de esterilizar
los recipientes; por cada 120 mL de capacidad de los frascos6.
7.3.1. Agua y hielo para uso y consumo humano.
El análisis de agua y hielo se requiere una cantidad mínima de 3 L o 3 Kg respectivamente. Para
muestras de hielo, este deberá fundirse completamente antes de su análisis, por lo que se puede dejar
toda la noche en la parte baja del refrigerador o si es necesario el análisis de inmediato, se deberá
colocar dentro de un baño de agua de 44°C-46°C, por no más de 15 minutos, teniendo extremo
cuidado en que la muestra no entre en contacto con el agua del baño6.
Continuar el análisis acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.
7.3.2. Aguas residuales.
La técnica del hisopo de Moore es considerada de gran utilidad para la búsqueda de V. cholerae en
aguas residuales (domiciliarias, hospitalarias, industriales, de puertos, aeropuertos, plantas de
tratamiento de aguas residuales, etc.) y de aguas superficiales de ríos. Esto debido a la facilidad con la
que se elaboran, montan y colocan los hisopos en las tuberías de entrada o puntos centrales del
sistema municipal de aguas residuales. El empleo del hisopo de Moore permite determinar si existen en
la zona infecciones por V. cholerae O1, además que se puedan detectar infecciones por V. cholerae en
áreas donde la vigilancia epidemiológica de enfermedades diarreicas no ha logrado detectar cólera.
A continuación se describe el material y la preparación del hisopo de Moore.
Para elaborar 10 hisopos de Moore considerar el siguiente material:

12 m de gasa de algodón.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
23

100 m de hilo de pescar de nylon (resistencia tensil ≥11.35 Kg).
Cortar un trozo de gasa de 90 cm de ancho por 180 cm de largo. La gasa se dobla 5 veces en sentido
longitudinal obteniéndose las siguientes dimensiones: 30 cm de ancho por 36 cm de largo. A partir de
la base inferior de 30 cm se cortan 6 tiras de 5 cm de ancho y 26 cm de largo dejándose 10 cm en la
parte superior sin cortar. En este sitio se amarra con un cáñamo de nylon o de otro material fuerte. Se
coloca en papel kraft (o equivalente) y esterilizar a 121 °C/ 15 lb /15 minutos.
Figura 4. Hisopo de Moore, dispositivo para búsqueda de V. cholerae en aguas residuales y
contaminadas11.
La colocación de hisopos debe hacerse corriente arriba del vertedero o de desechos o aguas
residuales, suspendiendo el hisopo en las aguas residuales a analizar. En el caso de las tuberías de
entrada accesible solo por un pozo de inspección, se ata al extremo del hilo un trozo de alambre para
evitar que el hilo se corte al colocar la tapa del pozo, se deja colocado entonces el hisopo durante 24 a
48 h y posteriormente los hisopos e hilo que los sostiene son recolectados introduciéndose en
recipientes previamente estériles de cierre hermético (utilizar guantes de látex y cambiarlos entre tomas
de muestra) y tamaño adecuado con 500 mL de agua peptonada alcalina (APA); las muestras son
rotuladas con datos del lugar de muestreo, tipo de muestra, persona que colectó, número de muestra
hora y fecha de obtención; posteriormente serán trasladadas al laboratorio en una caja de hielo (tipo
cooler) con bolsas de material refrigerante antes de transportarlos al laboratorio. EI hisopo de Moore y
la muestra de agua que lleva impregnada debe constituir cerca de 10% a 20% del volumen total de la
muestra a la que se agrega APA.
Continuar el análisis acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
24
Figura 5. Hisopo de Moore para el monitoreo de agente causal de cólera14.
7.3.3. Aguas superficiales.
Para las muestras provenientes de aguas blancas es decir poco contaminadas, se empleará el método
de hisopo de Spira, consiste en someter el agua de análisis a un filtrado a través de gasa de algodón.
Previo a la toma, se debe medir la temperatura ambiente y determinar pH del punto en que se tomara
la muestra. Para lo cual la gasa se introduce en un frasco de plástico con tapa de rosca (capacidad de
500 g o 500 mL y hasta 1000 mL) el frasco debe tener un orificio de 2 cm de diámetro en el fondo (el
diámetro del orificio es importante; ya que si es demasiado grande, el agua expulsara la gasa, y si es
muy pequeño el flujo será muy lento). La gasa debe tener 30 cm de ancho y se empaca en el frasco
doblándola en capas. Se usará suficiente gasa (aproximadamente de 120 a 180 cm) para formar un
paquete firme pero compresible que ocupe cerca de las 2/3 partes del volumen del frasco. La
esterilización de las trampas de Spira es opcional; para lo cual se envuelve cada frasco en papel de
estaño o de estraza y se esteriliza 121°C/15 min/15 lb. Ya preparada la trampa de Spira para el análisis
de agua, este comienza por verter por la boca del frasco el agua que se va a muestrear y se deja
escurrir por el fondo, posteriormente la gasa se retira bajo condiciones asépticas del frasco Spira y se
coloca en un matraz o frasco con 100 mL de agua peptonada alcalina 10x y se agrega suficiente agua
de la fuente para obtener un volumen final de 1L, registrar el sitio de toma de la muestra, fecha, hora y
responsable, y se traslada la muestra al laboratorio a temperatura ambiente26,41.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
25
Figura 6. Trampa de Spira, empleado para filtrar grandes volúmenes de agua a través de gasas de
algodón que generan el atrapamiento de V. cholerae para su posterior aislamiento en el laboratorio11.
Cuando el muestreo se hace en cuerpos de agua en movimiento como ríos limpios, se coloca el filtro
en el cuerpo del río por lo menos durante 24 h, permitiendo que el flujo del agua entre por la boca del
recipiente y salga por el orificio inferior.
Para el caso de cuerpos de agua sin movimiento como lagos, lagunas y estanques; verter el agua por
la boca del frasco indicando el volumen muestreado, el cual deberá ser como mínimo 5 L, dejando
escurrir por el fondo.
Continuar el análisis acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.
En casos de emergencia donde no sea posible el aislamiento del agente causal de cólera (V. cholerae)
de muestras de aguas ambientales (río, arroyo, pozo, suministro público-grifo-, manantial etc.,) por los
métodos tradicionales mencionados en el presente manual, se sugiere el uso de la metodología de
concentración por ultrafiltración (Anexo I).
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
26
8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ANÁLISIS EN EL LABORATORIO.
8.1. Alimentos.
8.1.1. Frutas y vegetales.
Analizar los alimentos tomando como guía general, la siguiente tabla:
Cuadro 5. Preparado de algunos frutos y vegetales para la detección de V. cholerae18,1.
Vegetales frescos (con hoja)
pequeños
Frutas pequeñas
Fruta fresca picada o rebanada.
Tomar aleatoriamente 25 g del total a de la muestra, en
225 mL de APA.
Vegetales picados o rebanados
Vegetales, medianos y grandes.
Colocar las piezas individuales en una bolsa de plástico
Frutas medianas y grandes.
estéril y enjuagar con 1 L de APA.
Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,
aislamiento e identificación y/o ver el Anexo IV el cual muestra el diagrama general para el aislamiento
de V. cholerae en alimentos/ Para la preparación de la muestra y su análisis microbiológico los
materiales, medios e insumos necesarios se muestran en el Anexo II mientras que en el Anexo III se
muestran las formulaciones de los medios de cultivo y reactivos requeridos.
8.1.2. Pescados.
Es de suma importancia que los pescados sean enteros, sin ser descamados o eviscerados, tomar
tejidos superficiales, vísceras y agallas. Pesar agallas y vísceras en un total de 25 g de todas las piezas
de pescado, cortar en piezas pequeñas y colocar dentro de un vaso de licuadora estéril. Agregar 225
mL de agua peptonada alcalina (APA) al vaso y licuar homogeneizando por 2 minutos a alta velocidad.
Esta será la dilución 10-1 y a partir de esta preparar la dilución 10-2 y 10-3 en 9 o 90 mL de APA e incube
a 35 ± 2°C6,18,1.
Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,
aislamiento e identificación y/o ver el Anexo IV el cual muestra el diagrama general para el aislamiento
de V. cholerae en alimentos.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
27
8.1.3. Mariscos.
Mariscos frescos o pre-cocidos.
Tomar el animal completo, si es posible o la parte central, incluidas las vísceras. Pesar 50 g de cada
muestra de 250 g y licuar durante 2 minutos a alta velocidad (Dilución 10 -1) 6,18,1. Se deberá preparar
diluciones 10-2 y 10-3.
Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,
aislamiento e identificación y/o ver el Anexo IV el cual muestra el diagrama general para el aislamiento
de V. cholerae en alimentos.
8.1.4. Moluscos bivalvos.
De todos los organismos incluir carne y líquido hasta obtener 200 g del producto, agregar la misma
cantidad (200 g) de solución reguladora de fosfatos y homogeneizar en licuadora de 60 – 120
segundos, esta mezcla constituye una dilución 1:2.
Realizar dos series de diluciones, pesando 50 g de la dilución (1:2) y colocarlos en un frasco que
contenga 225 mL de APA. Realizar mínimo una dilución decimal o más en APA acorde a la carga
microbiana esperada. Incubar una serie de diluciones a 35°C ± 2°C /6-8h y otra serie a 42°C ± 0.2°C
/18-21 h. Realizar el aislamiento6.
Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,
aislamiento e identificación y/o ver el Anexo V el cual muestra el diagrama general para el aislamiento
de V. cholerae en moluscos bivalvos.
8.2. Agua.
8.2.1. Agua y hielo para consumo humano.
Filtrar 3 L de la muestra liquida a través de una membrana de celulosa de 0.45 µm de tamaño de poro.
Colocar la membrana en un tubo con 10 mL de APA y homogenizar por 90 s e incubar a 35 ± 2°C.
Para muestras de hielo proceder como marca el punto 6.3.1 y filtrar de 500 mL a 3 L de la muestra
liquida por una membrana de celulosa 0.45 µm de poro. Colocar la membrana en un tubo con 10 mL
de APA y homogenizar por 90 s e incubar a 35 ± 2°C6,18. Continuar el análisis acorde al punto 9.
Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa, aislamiento e identificación. Y ver el Anexo VI
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
28
que muestra el diagrama general para aislamiento e identificación de V. cholerae a partir agua para el
consumo humano.
8.2.2. Aguas residuales.
Hisopo de Moore.
Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,
aislamiento e identificación y ver el Anexo VII el cual muestra el diagrama de análisis de hisopo de
Moore para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir de aguas residuales.
8.2.3. Aguas superficiales.
Hisopo de Spira.
Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,
aislamiento e identificación y/o ver el Anexo VIII que muestra el diagrama general del uso hisopo de
Spira para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir aguas ambientales respectivamente.
9. PROCEDIMIENTO DE ENRIQUECIMIENTO Y SIEMBRA EN PLACA, AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIÓN.
Para los productos de la pesca, realizar el procedimiento como se describe en la Norma Oficial
Mexicana NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.
Para productos lácteos realizar el procedimiento como se describe en la Norma Oficial Mexicana NOM243-SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados
lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.
Para todos los productos diferentes a los anteriores seguir el proceso analítico como a
continuación se indica:
El Anexo IV muestra el diagrama general para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir de
muestras de alimentos.
Recomendaciones generales:
*Para todas las etapas del análisis en el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae se deben incluir
controles positivos y negativos.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
29
*Aflojar todos los tapones de tubos y frascos de APA antes de incubar.
Enriquecimiento: Incubar los frascos de APA a 35 °C ± 2 °C por 6 a 8 h y resembrar. Re-incubar los
frascos toda la noche y hacer una segunda resiembra.
Incubar los frascos de hisopos de Moore y Spira a 35 °C ± 2 °C durante toda la noche.
Siembra en placa: Preparar placas de agar TCBS. También se puede incluir placas de agar modificado
m-CPC. Asegurarse de que las placas no contengan agua de condensación.
Transferir una asada de 3 mm de diámetro de la parte superficial del cultivo del caldo APA a placas de
agar TCBS (y mCPC). Estriar por estría cruzada para obtener colonias aisladas.
Incubar las placas de TCBS toda la noche a 35 °C ± 2 °C. (Incubar las placas de agar mCPC toda la
noche a 39 °C – 40 °C; si no dispone de una incubadora a esta temperatura, entonces incubar a 35 °C
– 37 °C), ya que la selectividad de estos agares está dada por los antibióticos que contiene, no tanto
por su incubación a altas temperaturas.
Las colonias típicas de V. cholerae en TCBS son grandes (2 a 3 mm), mucosas, amarillas, umbilicadas
ligeramente aplanadas con centro opaco y translúcidas en la periferia24,26.
Las colonias típicas de V. cholerae en agar mCPC, son pequeñas, suaves, opacas, verdes a púrpura
con un halo púrpura que se extiende con la incubación.
Las colonias sospechosas deben aislarse en agar T1N1, T1N3 o agar AST – 2% NaCl.
Incubar toda la noche a 35°C ± 2°C y proceder con su identificación. Resembrar tres o más colonias
aisladas de cada placa en agar T1N1. Incubar toda la noche a 35°C ± 2°C6.
Identificación bioquímica.
Pruebas tamiz: La prueba del hilo o cuerda (desoxicolato), es útil para descartar otros microrganismos
particularmente Aeromonas spp. Mientras que la prueba de oxidasa descarta a miembros de la familia
Enterobacteriaceae, El crecimiento en caldo triptona 0% NaCl es una prueba fundamental para
descartar a V. cholerae de otras especies como V. haemolyticus y V. mimicus, cabe señalar que en
ambas pruebas debe utilizarse un cultivo fresco en agar no selectivo;
Serología. El análisis serológico de las colonias aisladas en medios TCBS o mCPC puede ser
suficiente para la identificación preliminar de colonias de V. cholerae. Sin embargo en ocasiones resulta
apropiado realizar pruebas bioquímicas previamente a esto; o si la disponibilidad de antisueros es
limitada algunas pruebas bioquímicas como la del hilo, oxidasa y tolerancia a las sales; son útiles en
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
30
identificación antes de practicar el análisis con antisueros sobre todo cuando hay poca disponibilidad
de estos (Cuadros 6 y 7)24,26,30,.
Pruebas bioquímicas de identificación y confirmatorias.
Prueba de oxidasa.
Esta prueba identifica la actividad de la citocromo oxidasa presente en V. cholerae, la cual es una
enzima de la cadena respiratoria perteneciente al grupo de las hierro porfirinas. Para lo cual son
sometidas para su análisis colonias obtenidas y aisladas recientemente en un medio que no contenga
carbohidratos como agar infusión de corazón (BHI), agar T1N1, agar T1N0, agar soya tripticaseina, (No
deben utilizarse colonias aisladas en agar TCBS).
Se colocan dos o tres gotas del reactivo de oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina al 1%) sobre un
pedazo de papel filtro en una caja de Petri. Se extiende el cultivo sobre el papel filtro humedecido con
un asa de platino (No de nicromio) o aplicador de madera. Si la reacción es positiva, el cultivo
bacteriano cambiara de color a morado oscuro a los 10 s. Si el color aparece después de este tiempo
no se considerara por tanto deben analizarse al mismo tiempo testigos positivo y negativo; la
identificación y descarte por esta prueba radica en que microorganismos de diferentes géneros como
Vibrio, Neisseria, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas y Alcaligenes son oxidasa
(+); mientras que miembros de la familia Enterobacteriaceae son oxidasa (-)20.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
31
Cuadro 6.Características bioquímicas diferenciales entre especies del género Vibrio y otras bacterias25.
Prueba
AHK
AHTA
Hilo
Oxidasa
Gas
Sacarosa
AHL
Arginina
Ornitina
VP
NaCl 0%
NaCl 1%
Vibrio
cholerae
K/A
A/A
+
+
+
+
+
V
+
+
Vibrio Vibriones Aeromonas Aeromonas Plesiomonas Enterobacteriaceae
mimicus halofilos hydrophila
veronii
shigelloides
K/A
V
V
K/AG
K/A
V
K/A
V
V
A/AG
K/A
V
+
+A
+
+
+
+
+
-B
+
+
V
V
V
+
V
+
V
V
+
+
V
V
+
+
V
+
V
+
+
V
V
V
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
K/A=alcalinidad/acidez. AHK=Agar hierro kligler K/A (cuña roja/fondo amarillo), no produce gas, no H 2S a (18–24h)
V=reacción variable K/AG=alcalinidad acidez y gas AHTA=agar hierro triple azucares A/A (cuña amarilla/fondo amarillo, no
produce gas, no H2S a (18–24 h) VP=Voges-proskauer. AHL=agar hierro lisina=K/K (cuña púrpura/fondo púrpura), no
produce gas, no H2S a (18–24 h).A V. parahaemolytlcus, V. cincinnatiensis y V. damsela dan reacciones variables. BV.
fumissii y V. damsela dan reaccionas variables. Las tapas de los tubos de las pruebas bioquímicas deben de mantenerse
poco apretadas antes de la incubación en especial para medios de AHK y AHTA en plano inclinado, ya que pueden
condicionar etapas anaerobias, no generando las reacciones características de V. cholerae.
Cuadro 7. Características de identificación en ensayos bioquímicos de V. cholerae O126.
Ensayo
Hilo mucoide o cuerda
Oxidasa
Agar hierro de Kligler
Agar hierro de tres azucares
Glucosaa (Generación de ácido)
Glucosa (producción de gas)
Sacarosa (producción de ácido)
Lisinaa
Argininaa
Ornitinaa
Crecimiento en 0% NaClb
Crecimiento en 1% NaClb
Voges-Proskauerc
% positivo
100
100
K/A sin gas, sin H2S
A/A sin gas, sin H2S
100
0
100
99
0
99
100
100
75
K/A = alcalinidad/acidez; A/A = acidez/acidez. aModificada mediante Ia adición de 1% de NaCI. Base de caldo nutritivo
(Difco laboratories). cMayor parte de los aislamientos de V. cholerae serotipo O1, biotipo el Tor, dan positiva
Voges~Proskauer, mientras que para cepas del biotipo clásico es negativa.
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32
Prueba del hilo (desoxicolato).
La prueba del hilo se realiza en un portaobjetos o en una caja de Petri de plástico, en la cual se
suspenden colonias de un cultivo de 18 a 24 h en BHI, AST, T1N1, o T1N0 en una gota de solución
acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%. La prueba será positiva cuando las células se lisan por efecto
del desoxicolato, por tanto la suspensión perderá turbidez y el ADN liberado ocasionará que la mezcla
se vuelva viscosa de tal manera que al retirar lentamente de la suspensión el asa, se formara una
cuerda. Generalmente los vibriones son positivos, y cepas del genero Aeromonas suelen ser
negativas26.
Crecimiento en caldos con contenido salino.
Este crecimiento de analiza al sembrar con un inoculo ligero de cultivo fresco tubos con caldo T 1N0,
T1N1y T1N3 (1% triptona, 0% NaCl, 1% triptona, 1% NaCl y 1%, triptona, 3% NaCl) y se incubaran a
35°C ± 2 por 18 a 24h, V. cholerae puede crecer sin NaCl y con NaCl al 3%. Si no se presenta
crecimiento se pueden incubar hasta por 7 días, se debe incluir tubos testigos con una cepa
perfectamente identificada26.
Análisis en agar hierro de Kligler (KIA) y agar hierro triple azúcar (TSI).
Ambos medios de cultivo son selectivos con plano inclinado y se inoculan mediante picadura y estría e
incubándose de 35 a 37 °C /18 a 24 h se debe procurar que las tapas de los tubos estén poco
apretadas antes de incubar ya que pueden ocurrir reacciones no características ocasionando fallos de
interpretación de resultados. Estos medios contienen distintos carbohidratos y son muy usados en
microbiología de diagnóstico. El medio KIA contiene glucosa y lactosa por lo que las reacciones de V.
cholerae en el son semejantes a la de varios integrantes de la familia Enterobacteriaceae que no
metabolizan la lactosa (K/A, no producen gas ni H2S). EI medio TSI está constituido por sacarosa,
glucosa y lactosa, por lo que V. cholerae presenta reacciones de A/A y no produce gas ni H2S26.
Pruebas de análisis de descarboxilación e hidrólisis (LIA).
El metabolismo microbiano involucra reacciones de descarboxilación a partir de fuentes aminoacídicas,
en el cual enzimas decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando el
correspondiente compuesto amínico. Los tres aminoácidos que se prueban regularmente en la
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
33
identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da
cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina genera citrulina por acción de una di
hidrolasa, provocando cambios en el pH del medio donde se llevan a cabo dichas reacciones.
A partir de un cultivo recién obtenido o fresco, los caldos en tubo para las pruebas de arginina, lisina,
ornitina y testigo (sin aminoácidos) modificados por la adición de 1% de NaCl, son ligeramente
inoculados. Posteriormente al caldo en cada tubo se agrega una capa superficial de aceite mineral
estéril de 4 a 5 mm de espesor y se incuba a 35 a 37 °C /48h leyéndose los tubos cada 24h. Si la
prueba es negativa se incuba hasta 7 días. Si se emplean indicadores como el purpura de bromocresol
y rojo de cresol, una reacción alcalina favorece un color morado y por tanto indica una prueba positiva,
por lo que una coloración en amarillo será consecuencia de una prueba negativa y de carácter acido.
La prueba será válida solamente si el tubo testigo permanece negativo (amarillo).
El agente causante de cólera (V. cholerae) es generalmente positivo para la reacción de
descarboxilasa de Iisina y ornitina (K/K, coloración morada el tubo) en tanto que otras especies de
Vibrio son negativas. Además V. cholerae es frecuentemente negativo para la dihidrolasa de arginina
(K/A, color morado–amarillo el tubo) en tanto que Aeromonas, Plesiomonas y ciertas especies de Vibrio
son positivos26.
Voges-Proskauer.
Para esta prueba se utiliza emplea un caldo de Voges-Proskauer con rojo de metilo (MR-VP) al que se
le incorpora 1% de NaCl; además se le adicionan dos reactivos denominados: reactivo A que consiste
en 5% de alfa naftol en etanol absoluto, y el reactivo B el cual es una solución de 0.3% de creatina en
40% de KOH. Se inocula el microorganismo de análisis y se incuba por 48 h y posteriormente se le
agrega los reactivos A y B posteriormente la generación de un color rojo cereza en la parte superior del
caldo en el tubo indicara una reacción positiva26.
En el cuadro 6 y 7 se muestran las características necesarias para identificar cepas del genero Vibrio y
a su vez la especie V. cholerae O1. La habilidad de V. cholerae para desarrollarse en triptona al 1 % en
ausencia de NaCl, lo diferencia de los otros Vibrios sacarosa positivo. Así mismo las tiras diagnósticas
API 20E se han usado exitosamente para su identificación y confirmación de aislamientos por lo que
su uso es ampliamente recomendado.
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34
Análisis serológico.
Las colonias sospechosas se someten a la prueba de aglutinación con antisuero polivalente O1. Los
aislamientos que no aglutinen con el antisuero polivalente al serogrupo O1 se probaran con el antisuero
O139, si la reacción con el antisuero O1 y/o O139 es positiva, se identificará como presuntiva V.
cholerae O1 u O139. Posteriormente el V. cholerae O1 positivo se someterá a confirmación mediante
aglutinación con antisueros monovalentes o antisueros Ogawa o Inaba. Por el tipo específico de
antígenos O, el serogrupo O1 de V. cholerae se ha dividido en otros tres serotipos: Inaba, Ogawa y
Hikojima y una reacción positiva con cualquiera de los antisueros Inaba u Ogawa es suficiente para
confirmar la identificación de un aislamiento de V. cholerae O1, con frecuencia las cepas de un serotipo
producen una aglutinación lenta o débil con el antisuero de otro serotipo. Por tanto se deben analizar
paralelamente las reacciones de aglutinación con ambos antisueros de Inaba y Ogawa; debiendo
usarse la reacción más fuerte y más rápida para la identificación del serotipo (Cuadro 8)26,37. El
antisuero polivalente para V. cholerae O1, y monovalente Inaba y Owaga, y para antisuero O139 se
encuentran comercialmente disponibles. Los resultados de los cultivos que no aglutinan, deberán
reportarse como Vibrio cholerae No O1/ No O139.
Cuadro 8.Reacciones de aglutinación en antisuero de serotipos de Vibrio cholerae serogrupo O126,37..
V. cholerae
antisuero Ogawa
antisuero Inaba
Ogawa
+
-
Inaba
-
+
Hikojima
+
+
a + indica una reacción de aglutinación positiva en el antisuero absorbido.
b – indica una reacción de aglutinación negativa en el antisuero absorbido.
c si existe una reacción positiva en ambos antisueros (Ogawa y Inaba) y se sospecha como serotipo Hikojima, se
envía el aislamiento a un laboratorio de referencia.
Existe la posibilidad de que no se necesite la confirmación de todos los aislamientos, en especial
cuando la disponibilidad de antisueros sea limitada. En tal caso la identificación mínima de V. cholerae
O1 demandará únicamente la confirmación serológica de presencia de antígenos del serotipo O1 en los
aislamientos presuntivos. Sin embargo, si el aislamiento proviene de una región o zona amenazada por
el cólera epidémico o que se encuentra en las primeras fases de un brote de cólera, es necesario
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35
confirmar la producción de toxina del cólera y la identificación bioquímica 26.
Existe la posibilidad de que no se necesite la confirmación de todos los aislamientos, en especial
cuando la disponibilidad de antisueros sea limitada. En tal caso la identificación mínima de V. cholerae
O1 demandará únicamente la confirmación serológica de presencia de antígenos del serotipo O1 en los
aislamientos presuntivos30. Por otra parte, si el aislamiento proviene de una región o zona amenazada
por el cólera epidémico o que se encuentra en las primeras fases de un brote de cólera, es necesario
confirmar la producción de toxina del cólera y la identificación bioquímica 26.
Procedimiento serológico.
Las pruebas de aglutinación para V. cholerae pueden realizarse en una placa de Petri o en una lámina
de cristal limpia, comience por:
1) Fraccionar la lámina en secciones con un lápiz de cera y coloque una gota de solución salina
fisiológica en cada sección de la lámina.
2) Adicionar aproximadamente una gota de 10 μL de antisuero. Retirar una porción del crecimiento de
la superficie del medio de AHK, TSI o BHI u otro medio de agar no selectivo usando un asa de
inoculación, aguja o palillo aplicador estéril. Se debe recordar que no es apropiado realizar pruebas
serológicas con crecimiento de medios selectivos ya que esto puede generar resultados serológicos
falsos; por lo tanto emulsione y mezcle completamente el crecimiento en cada gota de solución salina
0.85% en la lámina para crear una suspensión de apariencia lechosa.
3) La segunda suspensión funcionará como control. De manera general, se mezclan en volúmenes
iguales antisuero y suspensión; sin embargo el volumen de la suspensión puede llegar a ser el doble.
4) Mezclar bien la suspensión; y el antisuero moviendo la lámina en forma de mecedora. La
aglutinación se mostrará mejor si se observa la lámina bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Si
la reacción positiva, aparece de 30 segundos a 1 minuto generándose un precipitado. Inspeccione la
suspensión de salina cuidadosamente para asegurarse de su uniformidad y de que no muestra grumos
resultantes por auto aglutinación; si esta aparece, el cultivo se caracteriza como “rugoso” y no podrá
ser serotipificado (Figura 7)26.
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36
Cepa con características bioquímicas de V. cholerae
Estría en del agar de infusión de corazón (BHI), agar hierro de Kligler (KIA),
agar de tres azucares (TSI) u otro medio de agar no selectivo.
Aglutinación con solución salina
0.85%
(+)
(-)
Aglutinación con polivalente O1
Cepa rugosa
(-)
(+)
V. cholerae No O1
V. cholerae O1
Aglutinación con O139
(-)
Aglutinación Inaba
(+)
V. cholerae No
O139, No O1
V. Cholerae
O139
(+)
V. cholerae O1,
Inaba
Aglutinación Ogawa
(+)
V. cholerae O1,
Ogawa
Figura 7.- Diagrama general de identificación serológica para V. cholerae6,26,30.
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37
Pruebas diferenciales de identificación para biotipos de V. cholerae (El Tor y Clásico).
La determinación de la diferenciación de V. cholerae O1 en los biotipos clásico y EI Tor se considera
de importancia en el ámbito de salud pública y de epidemiologia ya que permite contribuir a identificar
la potencial fuente de la infección. Sin embargo, hay que considerar que la tipificación no es apropiada
para V. cholerae distinto de O1, y las pruebas pueden dar resultados atípicos para V. cholerae O1 no
toxígenico. Además dado que el biotipo El Clásico, se encuentra rara vez, las siguientes son pruebas
opcionales que diferencian al biotipo El Tor:
Las pruebas que se utilizan comúnmente para determinar el biotipo de V. cholerae O1 previamente
sembrado por 24h a 35-37°C en agar base sangre (ABS) son:
1.-Sensibilidad a la Polimixina B (50U), donde el Tor no presenta sensibilidad a diferencia del clásico
que muestra zonas de inhibición y 2.-Hemólisis, la cual es negativa para el clásico y positiva para Tor.
Es conveniente utilizar las dos determinaciones para especificar el biotipo, debido a que los resultados
varían entre diferentes aislamientos. Cabe señalar también que eI biotipo el Tor es el que predomina
actualmente en el mundo y es el único que se ha aislado en el continente americano21,26.
Análisis de pruebas de hemólisis y sensibilidad a polimixina B.
Desde hace tiempo el biotipo Clásico y el Tor se diferenciaban por la capacidad de este último para
producir β-hemolisinas y lisar eritrocitos (hemólisis)23. Sin embargo en décadas recientes ha habido una
tendencia a que casi todos los aislamientos del Tor en el mundo presentaron una ausencia de
hemolisis. Hay excepciones de esta tendencia y han sido las clonas de V. cholerae O1 aisladas de las
aguas del Golfo de México específicamente del área de los Estados Unidos y Australia, que son
altamente hemolíticas en placa o tubo. Por tal motivo, la reacción de hemólisis sigue siendo una
característica fenotípica útil para diferenciar cepas de V. cholerae O1 de las dos regiones mencionadas
del biotipo el Tor del resto del mundo y Latinoamérica. La hemólisis en placa se lleva a cabo al inocular
cepas sospechosas por estría en placas de agar sangre que contengan de 5% a 10% de sangre de
carnero, y se incuban a 35°C +/- 2 /18 a 24 h bajo en condiciones aerobias, debiendo incluir un testigo
altamente hemolítico. La hemólisis se determinara por la zona de colonias aisladas no en las zonas de
confluencia de las colonias. Por tanto, las colonias hemolíticas presentan zonas claras alrededor
cuando se han lisado por completo los eritrocitos así mismo las cepas que producen hemólisis
incompleta no se deben notificar como hemolíticas23,26.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
38
La sensibilidad a polimixina B es otra característica del tipo Clásico, por lo que al inocular cultivos en
agar T1N1 y colocar un disco de polimixina B e incubar a 35°C+/- 2° por 12 a 18h, estas presentarán un
halo >12mm, mientras que el biotipo Tor es resistente; incluso si se inocula los cultivos sospechosos y
crecen en agar mCPC el cual contienen polimixina es considerado biotipo Tor6,23.
Determinación de la enterotoxigenicidad.
Los aislamientos identificados como V. cholerae O1 u O139, deberán probarse para la del gen ctxAB o
sus productos.
Pruebas en el laboratorio de detección de la toxina del cólera.
Un factor de virulencia de las cepas epidémicas de V. cholerae O1 es la producción de la toxina
colérica. Existen diferentes técnicas para valorar la producción de toxina del cólera, incluidas pruebas
de su actividad (biovaloraciones y cultivo de tejidos), antígenos (ELISA, coaglutinación, aglutinación en
látex) y de genes que la codifican (Sondas de ADN, PCR). Los métodos de biovaloración los cuales
emplean animales tienen el inconveniente de causarles un excesivo dolor consume mucho tiempo, es
costosa, incomoda y difícil de estandarizar, mientras que los métodos de cultivo de tejido presentan
una alta sensibilidad y fácil reproducción en el estudio de la producción de toxina. La acción de la
toxina sobre un cultivo celular ha permitido la investigación de las bases moleculares de la
patogenicidad, sin embargo el uso de cultivo de tejidos presenta inconvenientes al requerir laboratorios
con recursos especializados como personal técnico capacitado, reactivos y equipo especial. Por tal
razón y para fines prácticos de dar respuesta rápida a brotes de cólera mediante metodologías
sencillas y prácticas en el presente documento se abordaran los aspectos relacionados en los métodos
basados en inmunovaloraciones y análisis de ADN27.
Inmunovaloraciones.
Análisis de aglutinación pasiva reversa en látex (RPLA).
En el análisis de aglutinación en látex se emplean anticuerpos específicos contra la toxina colérica, los
cuales están unidos a partículas de látex; por tanto esta técnica requiere antisuero de alta calidad o
anticuerpos purificados, una adecuada preparación de látex y material de laboratorio común. Sin
embargo, ya existe un kit comercial32.
Desarrollo de la prueba: Inocular los cultivos en medio AKI y se incuban a 30±2°C/18h en agitación a
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
39
110 rpm; pasado este tiempo se centrifuga de 5 a 7 mL del cultivo a 8000 x g/20 minutos a 4°C,
posteriormente se filtra el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro de 0.2 µm o usar sin
filtrar para emplearlo en la prueba RPLA. Reconstituir la toxina control con 0.5 mL del diluyente,
agitando suavemente hasta disolución total del contenido. El control de toxina aglutinara con el látex
sensibilizado. Su uso proporcionara los patrones positivos de referencia ilustrados más abajo, para la
interpretación de resultados. Debe incluirse el control siempre que se haga la prueba para confirmar el
funcionamiento correcto de la prueba de látex6,23,27.
Los reactivos de látex y el diluyente están listos para su uso.
Agitar los reactivos antes de usarse.
a) Distribuir una placa de microtitulación fondo en V de manera que cada fila tenga 8 pozos y por
tanto cada muestra conste de 2 filas.
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
b)
c)
d) Adicionar 25 µL de diluyente en todos los pozos de las dos filas exceptuando el primer pozo.
Fila 1
Fila 2
25 μL de diluyente
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40
e) Adicionar 25 μL de la muestra a probar en el primero y segundo pozo de cada fila
25μL de la muestra
f) Realizar diluciones al doble (1:2) a partir del segundo pozo de cada una de las dos filas
tomando 25μL hasta el pozo 7, dejar el último pozo que contiene solo diluyente.
Diluciones 1.2
g) Agregar 25 μL de látex sensibilizado a cada pozo de la primera fila y adicionar 25 μL de latex
control a cada pozo de la segunda fila.
h) Mezclar el contenido rotando la placa, evitar derrames del líquido entre los pozos.
i)
Posteriormente cubra la placa con plástico adherible para evitar la evaporación. Colocar la
placa en un lugar libre de vibraciones a temperatura ambiente, evitando mover la placa durante
20-24h. Después coloque la placa en un lugar con fondo negro para facilitar la lectura durante
la incubación.
j)
Al término de la incubación se deberá examinar cada pozo de cada fila y comparar con
testigos (2ª fila).
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41
k) Descontaminar los tubos de centrifuga, filtros de membrana, placas de microtitulación, puntas
de pipetas, y esterilizar en autoclave o desinfectar antes de su desecho con solución de
hipoclorito al 1.3%. Desechar los controles de la toxina y los extractos de los cultivos en
solución de hipoclorito 1.3%.
l)
La interpretación de resultados consistirá en que el patrón de aglutinación debe mostrar el
siguiente comportamiento ejemplificado a continuación. Los resultados clasificados con (+),
(++) y (+++) se consideran como positivos.
Botón
(-)
(±)
(+)
(++)
(+++)
Los resultados en los pozos de la fila que contiene el látex control deben ser negativos. Y solo en
algunos casos pueden observarse aglutinaciones no específicas; en tales casos los resultados deben
interpretarse como positivos si la reacción con el látex sensibilizado es positiva a una dilución mayor
con la muestra como se ve con el látex control. El último pozo de todas las filas debe ser negativo. Si
se observan patrones positivos en algunos de estos pozos la reacción debe considerarse no valida. Por
otra parte cuando existe una cantidad excesiva de toxina, puede observarse un efecto prozona. Por
ejemplo se da un patrón negativo en pozos que contienen la muestra no obstante, como resultado de
las diluciones al doble, la concentración de toxina en cada pozo a lo largo de la fila se va reduciendo
progresivamente y por lo tanto, el efecto prozona originado por el exceso de toxina desaparecerá. Un
patrón positivo de aglutinación puede ser observado tras haber visto patrones negativos en los
primeros pozos de la fila. Con tales resultados la muestra debe reportarse como positiva. La prueba
presenta limitaciones y estas son que la sensibilidad para detectar la toxina es de 1-2 ng/mL, por tanto
si la toxina esta es proporciones menores arrojara un resultado negativo
Detección del gen toxigénico de cólera por PCR.
Esta técnica tiene la ventaja de ser rápida por no requerir cultivos puros ni microorganismos viables. Se
pueden amplificar los segmentos seleccionados de ADN a partir de los caldos incubados de
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
42
enriquecimiento o preenriquecimientos ambientales determinando la presencia del microorganismo o
toxina que se busca un microorganismo sin cultivarlo. Mediante el uso de PCR se puede identificar al
gen relacionado directa o indirectamente con el potencial toxigénico del microorganismo aunque no se
esté expresando la proteína.
La técnica de PCR se lleva a cabo dentro del termociclador e involucra que la doble cadena de ADN
blanco o molde, obtenido previamente a partir del ADN total extraído de los microorganismos presentes
en la muestra, se desnaturalice mediante calor, para suministrar moldes de cadena sencilla, a los que
se unen los cebadores de oligonucleótidos específicos (primers). Éstos se hibridan a su secuencia
complementaria en el ADN blanco, seguido por la extensión del cebador a cargo de una ADN
polimerasa termoestable, con lo cual se van generando copias de la región del ADN molde que
flanquean los cebadores. Este ciclo se repite muchas veces, enriqueciéndose de copias del fragmento
de interés (porción del gen ctxAB). Múltiples métodos de PCR aplicada a diferentes microorganismos
están basados en la inclusión de un paso que involucra la extracción de ADN a partir de alimentos
contaminados, esto por supuesto implica un mayor tiempo de análisis y regularmente también cambios
en la matriz alimentaria; por lo que para esto la reacción de amplificación se puede desarrollar con
lisados crudos de células o en su caso una breve ebullición de una suspensión bacteriana. La PCR
puede detectar hasta una sola célula bacteriana con regímenes de ciclo extendido (50-60) sin embargo
el límite de detección de la PCR directa es limitado (alrededor de 104 unidades bacterianas/g de
alimento). Este nivel de detección se debe a las limitaciones de volumen de reacción (25-100 μL), el
aumento en los productos no específicos y del efecto inhibidor de muchos componentes de los
alimentos sobre la enzima polimerasa Taq. A partir de procedimientos de enriquecimiento resultando en
un aumento de la sensibilidad límites de 0.1 células microbianas/g de alimentos. Los resultados de
amplificación en PCR se obtienen mediante la separación de los productos de amplificación
(amplicones) mediante electroforesis en gel de agarosa peso molecular en pares de bases, por
comparación de un marcador de peso, tinción con colorante intercalante (p. ej. Bromuro de etidio) y
visualización con fluorescencia inducida por luz UV. El método de amplificación y análisis
electroforético requiere generalmente de 2 a 4h después de un enriquecimiento, la sensibilidad,
especificidad y el tiempo permiten que este método de PCR se ha una manera rápida, eficaz y robusta
para la detección de genes de microrganismos patógenos en alimentos. La producción de toxina del
cólera (codificada por los genes ctxAB) es el principal factor en la patogenicidad de la bacteria. El gen
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
43
de la principal toxina del cólera CT puede estar presente en cepas pero no expresarse bajo condiciones
experimentales. Las colonias aisladas en placas de agar selectivo o diferencial e identificadas
bioquímica y serológicamente como V. cholerae, se someten a la prueba de PCR, en la cual se
amplifica una secuencia de ADN específica: el fragmento ctxAB del genoma de V. cholerae (factor
genético relacionado a la producción de enterotoxina), tiene un tamaño de 777 p.b., detectados
mediante electroforesis en gel de agarosa15,23,27,.
Procedimiento para la amplificación de secuencia de gen de V. cholerae que codifica para toxina
de cólera usando APA como caldo de enriquecimiento.
Se realiza preparando la muestra de alimento con el caldo de enriquecimiento e incubando por 6 a 24h
a 35°C±2°C, posteriormente se somete a ebullición 1 mL de la mezcla en tubos de microcentrifuga de
1.5 mL durante 10 min. Los lisados pueden ser almacenados en congelación a -20°C hasta su uso o
inmediatamente para someterlos a su análisis por PCR. Si se procesa inmediatamente se debe hacerlo
de manera simultáneamente con un cultivo control de V. cholerae, de un volumen de 1 mL en APA,
incubado 18 h a 35 °C ±2°C y repitiendo el mismo proceso de ebullición.
A partir de cepas aisladas: Se toma una asada poco abundante de la cepa problema y se resuspende
en un tubo estéril de 1.5mL que contenga 100µL de agua grado biología molecular. Realizar este pasó
por duplicado. En otro tubo adicionar 100µL de agua grado biología molecular como control negativo
de extracción. Colocar los tubos tapados en el termobloque el cual previamente debe encontrarse a
95°C. Incubar los tubos por 5 minutos. Sacar los tubos del termobloque y almacenarlos en refrigeración
por no más de 8 h o en congelación por más tiempo.
Preparación de la reacción PCR.
Consistirá primeramente en minimizar la contaminación cruzada de los reactivos para lo cual se
recomienda que las mezclas maestras o madre sean preparadas, alicuotadas y almacenadas en
congelación hasta su uso, las mezclas maestras contendrán todos los reactivos necesarios excepto
Taq polimerasa y los lisados (molde) a ser amplificados. La reacción final contendrá 10 mM Tris-HCl,
pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP, y dTTP; 2 a 5% (v/v) APA
lisado; 0.5 µM de cada primer y 2.5 U Taq polimerasa por cada 100 µL de reacción; los volumen de
reacción que pueden ser usados son de 25-100 µL se adiciona la Taq polimerasa a la mezcla maestra
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
44
y el lisado APA en una distribución de 0.6 mL en los tubos de microcentrifuga de reacción. Cubrir con
aproximadamente 50-70 µL de aceite mineral esto si el termociclador lo requiere. A continuación se
ajustan las condiciones del termociclador para una eficiente amplificación del gen ctx considerando no
más de 35 ciclos y una desnaturalización inicial de 3 minutos a 94°C, desnaturalización de un minuto a
94°C, hibridación de primers a 55°C por 1 minuto, extensión de primers 1 minuto a 72°C, y
amplificación final durante 3 minutos a 72°C. Posteriormente se lleva acabo el análisis en gel de
agarosa de los productos de PCR que consistirá en mezclar porciones de 10-20 μL de la reacción de
PCR con buffer de carga 6X y colocar la muestra en los pocillos de gel de agarosa de concentración de
1.5-1.8% sumergido en 1X TBE conteniendo 1 µg/mL de bromuro de etidio. Suministre voltaje
constante de 5-10 V/cm, posteriormente visualice las bandas y la migración de los marcadores
moleculares. El producto de la PCR es un fragmento de 777bp de ctxAB, tome las fotografías
respectivas de los geles y reporte resultados, debiéndose incluir los controles positivos y negativos
cada que se realice un análisis en PCR15,23,27. El reporte final por PCR debe incluir las características
de identificación mínimas para los aislados de V. cholerae (Cuadro 9) así mismo la identificación de V.
cholerae por ensayos de PCR deben incluir procedimientos de microbiología tradicional.
Cuadro 9. Pruebas mínimas para la identificación de cepas aisladas de Vibrio cholerae15,23.
Prueba de análisis
Reacción
Porcentaje (%)
Gram (-) negativo, no esporulado
+
100
Oxidasa
+
100
Desoxicolato
±
100
L-lisina descarboxilasa
+
100
L-arginina dihidrolasa
-
0
L-ornitina descarboxilasa
+
98.9
Crecimiento en caldo triptona 1%1
+
99.1b
1Sin
adición de cloruro de sodio.
bV.
cholerae (V.mimicus)
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
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10. INFORME FINAL DE RESULTADOS DE LABORATORIO.
El informe final de V. cholerae, debe incluir la identificación serológica, bioquímica de los aislamientos y
los resultados de enterotoxigenicidad.
En caso de muestras positivas debe ser emitido de forma inmediata para permitir las acciones
pertinentes, en el caso de una vigilancia sanitaria.
Reportar ausencia de V. cholerae incluyendo la masa o volumen de muestra utilizado cuando no se
localicen colonias características.
Reportar como presencia de V. cholerae (incluir la masa o volumen de muestra empleado)
dependiendo de los resultados encontrados)
V. cholerae O: 1
V. cholerae O: 139
V. cholerae No O1 o V. cholerae No O: 139.
Todas las muestras positivas a V. cholerae O: 1 y O: 139, aisladas de aguas y alimentos deberán ser
enviadas para su confirmación y prueba de toxigenicidad a la CCAyAC6.
11. LINEAMIENTOS GENERALES.
a) Envío de cepas a CCAyAC para su confirmación y prueba de toxigenicidad.

Todas las cepas positivas a V. cholerae O:1 y V. cholerae O:139, deberán ser
enviadas a la CCAyAC, en un plazo no mayor a 48 horas. En caso de brote, deberán
enviarse de inmediato.

Asimismo, deberán enviarse el 30 % de las cepas de V. cholerae No O:1

En caso de aislar V. parahaemolyticus, deberá enviarse el 10 % de las cepas. Él envió
de cepas deberá realizarse de acuerdo a los lineamientos de embalaje de triple
envasado descritas en el Manual de Bioseguridad en el Laboratorio emitido por la
Organización Mundial de la Salud29 correspondiente al transporte de sustancias
infecciosas.
b) Asimismo, deberá cumplirse con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-016-SSA22012, Para la vigilancia, prevención, control, manejo y tratamiento de cólera. Tanto para la
vigilancia regular, como para la atención de brotes de cólera.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
46
c) En caso de brotes, la cantidad de muestra colectada deberá ser la necesaria para el análisis
acorde a la naturaleza de la misma conforme a lo establecido en el presente manual, sin
embargo se podrán hacer excepciones a la cantidad disponible de las muestras para la
ejecución del análisis.
d) El análisis en el laboratorio de muestras involucradas en brotes, deberá ser ejecutado acorde a
la metodología establecida en el presente manual. Adicionalmente para estos casos, se puede
hacer uso de métodos rápidos de detección de V. cholerae; como es el caso del PCR en
tiempo real automatizado debidamente establecido y validado. Sin embargo, cualquier
resultado positivo por esta metodología deberá ser confirmado por los métodos descritos en el
presente manual.
e) Las áreas de regulación deberán notificar con anticipación a los laboratorios en donde se
reciba la muestra para su análisis, preferentemente 48 h antes de realizar el muestreo y bajo
un programa de muestreo establecido en conjunto, con excepción de situaciones emergentes.
Durante un brote, los laboratorios deberán informar de manera expedita y oportuna los resultados
obtenidos de las muestras analizadas al área de Protección Contra Riesgos Sanitarios del nivel
Estatal, a la Comisión de Evidencia y Manejo de Riesgo, Comisión de Operación Sanitaria y a
la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.
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47
12. GLOSARIO :
Alimento: Cualquier sustancia en estado sólido o liquido el cual es consumido por los seres vivos con
finalidades nutricionales, metabólicas y fisiológicas.
ADN: Molécula polimérica natural o sintética formada por el azúcar desoxirribosa, fosfato y una base
púrica (adenina, guanina) o pirimidínica (citosina, timina), ordenadas de acuerdo a una secuencia
específica. Cuando el ADN es de doble cadena, cada hebra que lo forma es de secuencia auto
complementaria y se mantienen unidas en dirección anti paralela, una con respecto a la otra, mediante
puentes de hidrógeno.
Agar Selectivo: Medio solido de cultivo que favorece el crecimiento de cierto tipo de microrganismos.
Agua Potable: Agua apta para el consumo humano, libre de riesgos físicos, químicos y biológicos para
la salud, después de ser sometida a procesos de purificación.
Agua Superficial: Es la proveniente de las precipitaciones, que no se infiltra ni regresa a la atmósfera
por evaporación o la que proviene de manantiales o nacimientos que se originan de las aguas
subterráneas.
Anaerobio: Microorganismo capaz de crecer en condiciones ausentes de oxígeno.
Antígeno: Sustancia generalmente de naturaleza proteica que estimula el sistema inmunitario con la
formación de anticuerpos.
Brote: Presencia de dos o más casos confirmados relacionados epidemiológicamente entre sí o la
aparición de un caso en un área donde no se había demostrado la existencia previa de enfermedad.
Caldo de Enriquecimiento: Medio de cultivo en estado líquido el cual contiene todos los nutrientes
necesarios para favorecer el aislamiento de uno o varios microorganismos específicos.
Condición Sanitaria: Especificaciones o requisitos sanitarios que deben reunir cada uno de los
insumos, establecimientos, actividades y servicios que se establecen en los ordenamientos
correspondientes.
Congelación: Método físico que se efectúa por medio de equipo especial para lograr una reducción de
la temperatura de los productos de tal manera que garantice que su centro térmico esté congelado (20°C).
Control Sanitario: Conjunto de acciones de orientación, educación, muestreo, verificación y, en su
caso, aplicación de medidas de seguridad y sanciones, que ejerce la Secretaría de Salud con la
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48
participación de los productores, comercializadores y consumidores, con base en lo que establece la
Ley General de Salud, el presente manual, las Normas Oficiales Mexicanas y otras disposiciones
aplicables.
Electroforesis: Técnica de biología molecular que consiste en la separación de moléculas acorde a la
movilidad y masa molecular de estas bajo un campo eléctrico; las muestras de análisis común son
mezclas de proteínas o ácidos nucleicos.
Endemia: Presencia constante o prevalencia habitual de casos de una enfermedad o agente
infeccioso, en poblaciones humanas, dentro de un área geográfica determinada.
Enterotoxina: Sustancia producto del metabolismo celular principalmente bacteriano el cual presenta
efectos tóxicos en el sistema gastrointestinal del ser humano.
Enzima: Molécula de origen proteico que realiza funciones catalíticas al incrementar la velocidad de
reacciones químicas termodinámicamente posibles en sistemas biológicos.
Epidemia: Aumento en la frecuencia esperada de cualquier daño a la salud en el ser humano, durante
un tiempo y un espacio determinados. En algunos padecimientos la ocurrencia de un solo caso se
considera epidemia.
Etiquetado: Acción de colocar cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva
o gráfica, escrita, impresa, estarcida, marcada, grabada, adherida, sobrepuesta o fijada al contenedor
de la muestra.
Inmunoglobulina: Elementos del sistema inmunitario para identificar y neutralizar partículas extrañas
nocivas para la salud del organismo productor.
Medidas de Prevención: Conjunto de acciones encaminadas a la preparación y disposición que se
hace anticipadamente para evitar un riesgo.
Mezcla maestra: disolución acuosa que contiene todos los componentes o ingredientes reactivos
necesarios para que se efectúe la reacción en cadena de la polimerasa, excepto el ADN molde o
templado sujeto de amplificación.
Microbiota: Conjunto de microorganismos que se localizan de manera normal en diferentes sitios los
cuales pueden ser desde el cuerpo humano hasta diferentes ecosistemas.
Muestreo: Operación de selección de una muestra representativa a partir de una población sujeta a
una determinación analítica.
Oligonucleótidos: Pequeñas hebras de ADN artificial de cadena sencilla, de secuencia conocida, que
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flanquean los extremos de la región genética del templado de interés, y que sirven para ubicar el sitio
de síntesis de ADN para la enzima ADN polimerasa. Se consideran un reactivo de la PCR. También se
les llama iniciadores o primers.
Operón: Elemento genético bacteriano que contiene varios genes agrupados en bloque, corregulados
transcripcionalmente. Está formado por: sitios operadores, promotores y genes estructurales.
Patógeno: Entidad biológica capaz de producir enfermedad y daño al huésped.
Procedimiento: Conjunto de acciones realizadas siempre de la misma forma para obtener los mismos
resultados.
Rastreabilidad: Capacidad para seguir el desplazamiento de un alimento a través de una o varias
etapas especificadas de su producción, transformación, distribución o muestreo.
Refrigeración: Método físico de conservación con el cual se mantiene la temperatura interna de un
producto de 0°C a 4°C.
Reacción en cadena de la polimerasa: Técnica de biología molecular in vitro que permite incrementar
de manera exponencial el número de copias de un segmento de ADN de interés, gracias a la enzima
ADN polimerasa, la cual es termorresistente.
Riesgo Sanitario: Probabilidad de ocurrencia de un evento exógeno adverso, conocido o potencial,
que ponga en peligro la salud y/o la vida humana.
Salud Pública: Conjunto de actividades encaminadas a proteger y mejorar la salud de la población,
entendiendo por salud al estado de bienestar somático, psicológico y social de un individuo y de la
población general.
Sistema Nacional de Salud: Conjunto de dependencias y entidades de la administración pública, tanto
federal como local y las personas físicas o morales de los sectores social y privado que prestan
servicios de salud, así como por los mecanismos establecidos para la coordinación de acciones. Tiene
por objeto dar cumplimiento al derecho de la protección a la salud.
Sub muestra: Porción representativa de un conjunto total que corresponde a una muestra.
Sustrato: Molécula a la cual se une la enzima para su posterior trasformación en otra molécula de
diferentes características.
Técnica: Conjunto de procedimientos y recursos de que se sirve una ciencia o un arte para obtener un
resultado determinado.
Templado: Molécula de ADN de interés; también se conoce como molde ya que sirve para obtener
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
50
copias fieles de la misma mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa.
Termociclador: Equipo que permite tener y mantener de manera programada, grandes cambios de
temperatura, de forma muy rápida y repetida. Su fundamento es la tecnología Peltier y en él se lleva a
cabo la PCR.
Termolábil: Sustancia o compuesto sensible a su descomposición por acción del calor.
Transporte: Acción de traslado en condiciones asépticas y de refrigeración de los productos o
muestras hasta el laboratorio para su análisis microbiológico.
Vigilancia Sanitaria: Conjunto de acciones de evaluación, verificación y supervisión del cumplimiento
de los requisitos establecidos en las disposiciones aplicables que deben observarse en los procesos,
productos, métodos, instalaciones, servicios o actividades relacionados con las materias competencia
de la Comisión Federal.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
51
13. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS.
/: Por.
–: Negativo.
+: Positivo.
±: Más, menos.
≤: Menor o igual que
≥: Mayor o igual que
°C: Grados centígrados.
°T: Temperatura
A/A: Ácido/Ácido.
ABS: Agar Base Sangre.
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
AMPc: Monofosfato de Adenosina Cíclico.
APA: Agua Peptonada Alcalina.
ATP: Trifosfato de Adenosina.
BHI: Agar Infusión de Corazón.
CCAYAC: Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura antes Laboratorio Nacional de
Referenecia
CDC: Centers for Disease Control and Prevention-Centros para la Prevención y Control de
Enfermedades de los Estados Unidos de América.
COFEPRIS: Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.
CST: Caldo Soya Tripticasa.
CT: Toxina de Cólera.
d: Día.
DO: Densidad Óptica.
ELISA: Ensayo por inmunoadsorción Ligado a Enzimas.
g: Gramo.
h: Hora.
INDRE: Instituto Nacional de Referencia Epidemiológica.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
52
INEGI: Instituto Nacional de Estadística y Geografía.
K/A: Alcalino/Ácido.
K/K: Alcalino/Alcalino.
Kg: Kilogramo.
KIA: Agar Hierro Klieger.
L: Litro.
Lb: libras de presión
LPS: Lipopolisacárido.
m: Metro
mCPC: Agar Modificado de Celobiosa, Polimixina, B- Colistina.
mg: Miligramos.
mL: Mililitro.
ng: Nanogramo
NTC: Control negativo de reactivos de PCR.
OMS: Organización Mundial de la Salud.
OPS: Organización Panamericana de la Salud.
p.b.: pares de bases
p/v: Peso/Volumen.
PBS: Solución Salina Reguladora de Fosfatos.
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.
pH: Potencial de Hidrogeno.
RPBI: Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos.
RPLA: Prueba de Aglutinación Pasiva Reversa en Látex.
s: Segundo.
TCBS: Agar tiosulfato, citrato sales biliares sacarosa.
TSI: Agar Hierro Triple Azúcar.
UV: Luz ultravioleta
Vf: Volumen final.
Vi: Volumen inicial.
μL: Microlitro.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
53
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26. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and
Prevention.
Chapter
VI.
Laboratory
identification
of
vibrio
cholerae.
http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html
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Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
56
ANEXO I.
MÉTODO DE CONCENTRACIÓN-CDC-33,39.
1. Introducción.
El presente procedimiento describe el método de ultrafiltración o concentración a través de fibra
hueca sin salida para el muestreo y recuperación de virus, bacterias y parásitos en grandes
volúmenes de agua. Esta técnica conocida como ultrafiltración es aplicable a todas las muestras
de agua, sin embargo el agua con turbiedad puede afectar las tasas de filtración. La técnica ha
demostrado ser efectiva para el agua de proceso que contenga valores de turbiedad < 5NTU
(unidades nefelométricas de turbidez), así como para muestras de aguas residuales y muestras de
agua con una turbiedad de hasta 80 NTU. Este método puede realizarse en campo o laboratorio
con un mínimo entrenamiento técnico del personal.
2.
Equipo, reactivos y suministros.
2.1. Equipo e instrumentos
2.1.1. Bomba peristáltica
2.1.2. Totalizadora de flujo de agua, caudalímetro o probeta graduada de 1L
2.1.3. Balanza
2.1.4. Pipeteador automático
2.1.5. Micropipeteador de 1000 µL
2.1.6. Pinzas manuales
2.1.7. Cronometro con segundero de mano
2.2. Reactivos
2.2.1. Polifosfato de sodio (NaPP).
2.2.2. Tween 80
2.2.3. Emulsión antiespumante Y-30
2.2.4. Tiosulfato de sodio
2.2.5. Agua desionizada, dH2O
2.2.6. APA 2X
2.3. Suministros.
2.3.1. Filtro de diálisis Modelo -REXEED-25S-
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
57
2.3.2. Tubería de silicón L/S 36
2.3.3. Tubería de silicón I/P 89
2.3.4. Adaptador DIN
2.3.5. Tapas de puerto
2.3.6. Tapas de almacenamiento para filtros
2.3.7. Conector de reducción 5/8" x 3/8"
2.3.8. Abrazaderas, SNP-8
2.3.9. Abrazaderas, SNP-12
2.3.10. Abrazaderas, SNP-14
2.3.11. Abrazaderas, SNP-19
2.3.12. Adaptador 3/4" GHT
2.3.13. Adaptador de inserción giratorio x NPT
2.3.14. Contenedores plegables de 20L
2.3.15. Pipetas desechables de plástico de 10mL
2.3.16. Guantes de látex
2.3.17. Vasos de precipitado de 1L
2.3.18. Botellas pyrex de tapa rosca de 500mL
2.3.19. Botellas de plástico de 1L
2.3.20. Botellas de plástico de 125mL
2.3.21. Jeringas de 60 mL
2.3.22. Canoas de pesado
2.3.23. Espátulas de pesado
2.3.24. Puntas para micro pipeta de 1000 µL
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
58
3. Procedimiento.
3.1. Ultrafiltración.
3.1.1. La técnica es útil para cualquier cuerpo de agua ya sea presurizadas como el caso de
ríos y agua de la llave o sin presión como son pozos y lagunas.
3.1.2. Para ejecutar la técnica se debe registrar la información pertinente para asegurar la
trazabilidad de la muestra, para este fin se puede utilizar una hoja de datos de colecta,
además de etiquetar el ultrafiltro con el nombre de la muestra, fecha y hora de colecta.
3.1.3. Ensamblar el dispositivo acorde a la siguiente figura:
Sellar puertos extras de
filtro
Encendido
Sujetador
de tubería
de succión
Dirección
de flujo
Agua filtrada
Caudalimetro
Muestra de agua
Adaptador a
puerto de
entrada
Figura 1. Componentes del equipo de concentración por ultrafiltración durante el muestreo de
agua en campo.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
59
Se utilizara un caudalimetro para medir el volumen de agua filtrada y así calcular la totalidad;
registrar el volumen inicial en la hoja de datos (Figura 1).
3.2. Instrucciones.
3.2.1. Colocar el tubo de entrada (conectado al puerto final azul) en el cuerpo de agua,
garantizando que el extremo de la tubería se mantenga por debajo de la superficie del
agua.
3.2.2. Alimente la entrada del tubo a través de la cabeza de la bomba, cierre el nivel de la
bomba y coloque el extremo de la tubería en la fuente de agua.
3.2.3. Conecte el cable de alimentación adecuado a la toma en la parte posterior de la bomba y
el otro extremo del cable de alimentación a la fuente de poder. La fuente de poder puede
ser externa 12-18 V DC 70 watts o 90-260V AC 47-65Hz.
3.2.4. Determine la dirección de flujo deseada y ajuste el interruptor de dirección de flujo.
Asegurarse que la velocidad se ajusta a cero antes de comenzar a funcionar la bomba.
3.2.5. Encienda la bomba, una vez que la bomba ha iniciado, la velocidad puede ser ajustada
para aumentar gradualmente hasta la velocidad máxima ajustada.
3.2.6. Dejar filtrar el volumen deseado.
3.3. Registre el tiempo de inicio de la filtración.
3.3.1. Por medio del flujometro de agua o caudalimetro tome las lecturas iniciales y finales, la
unidad de medida serán galones (ejemplo 100 L=26.4 gal; 50 L=13.2gals); y deje correr
el agua hasta la lectura deseada.
3.3.2. Si no se utiliza un totalizador de flujo, medir periódicamente la velocidad de flujo y
registrar el tiempo y la velocidad de flujo. Estimar el volumen total de agua filtrada al
multiplicar el tiempo de filtración acumulativo y mediciones de la tasa de flujo.
3.3.3. Monitorear el flujo usando la graduación en la probeta, leer el nivel de agua en el cilindro
y multiplicar por 2 para calcular la tasa de flujo por minuto (ejemplo 900 mL X 2 = 1800
mL/min= 1.8 L / min) y registrarlo en la hoja de datos.
3.3.4. Calcule el tiempo necesario para filtrar el volumen de agua deseado (ejemplo 100 L/1.8 L
= 55.5 minutos). Repita este cálculo cada 15 minutos para medir con precisión cuanto
tiempo debe funcionar la bomba con el fin de filtrar el volumen deseado de agua.
3.3.5. Durante la filtración, inspeccione visualmente el caudal de la tubería de efluentes.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
60
Cambios drásticos en el caudal indicaran obstrucción del filtro en función de la calidad del
agua o atrapamiento de un objeto en la tubería o filtro.
3.3.6. Detener la bomba/cerrar el grifo o llave de agua después del volumen de agua filtrado y
es registrado el tiempo final de la filtración.
3.3.7. Si existe cloro libre o se sospecha en la fuente de agua, adicione solución de tiosoulfato
de sodio al 1% al filtro inmediatamente después de colectar la muestra de agua.
3.3.8. Retire todos los tubos del ultra filtro y coloque sus tapas en todos los puertos y almacene
y envíe inmediatamente al laboratorio para su análisis..
3.3.9. No es necesario colocar el filtro en refrigeración para su transporte al laboratorio.
3.3.10. Los tubos de efluentes puede ser desechado después de la colecta de la muestra, la
tubería de filtrado puede ser re utilizado para consecuentes muestreos.
3.3.11. Registrar todos los datos obtenidos en la hoja de campo utilizada (figura 3).
3.4. Manipulación en el laboratorio de la muestra colectada.
3.5. Ultrafiltrado por retro enjuague.
3.5.1. Realizar la solución de polifosfato de sodio al 10% adicionando 1g a 10 mL de agua
desionizada.
3.5.2. Preparar la solución emulsionante al 1% de antiespumante Y-30, esto adicionando 100
µL, a 9.9 mL de agua desionizada.
3.5.3. Preparar la solución de enjuague (Tween 80 al 0.5%, polifosfato de sodio 0.01% y
0.001% antiespumante Y-30) adicionando 2.5mL de Tween 80, 500 µL de solución de
polifosfato de sodio al 10% y 500 µL de la solución de antiespumante Y-30 al 1% y
complementar con 496.5 mL de agua desionizada (solución de enjuague).
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
61
3.5.4. Montar el equipo de filtración para el retro enjuague acorde a como se muestra en la
figura 2.
Puerto
sellado
Puerto de
conexión al
filtro
Ajustador de
tubería para
succión de
solución de
enjuague
Puerto de
salida de la
solución de
enjuague
filtrada
Solución de
enjuague
Puerto
sellado
Figura 2. Procedimiento de ultrafiltración por retro enjuague de la muestra de agua colectada
en campo.
3.5.5. Retirar las tapas de la entrada o puerto final azul y lateral naranja
3.5.6. Conecte el tubo al puerto lateral naranja y asegure con una abrazadera de manguera.
3.5.7. Coloque la manguera de tubería a través de la bomba peristáltica y lleve el extremo de la
tubería dentro de la solución de enjuague para el retro lavado.
3.5.8. Mantener el puerto final azul sobre un recipiente de 1L para capturar la solución de retro
lavado.
3.5.9. Bombear la solución de enjuague a través del ultrafiltro a 650 mL/min, colectando la
solución de enjuague en un frasco o recipiente estéril. Si la bomba no presenta pantalla
digital la velocidad de flujo se ajusta a una menor.
3.5.10. Continúe bombeando hasta que la velocidad de flujo de salida del ultrafiltro ha
disminuido al mínimo y no queda más solución de enjuague.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
62
3.5.11. Medir y registrar el volumen de enjuague si es necesario.
3.5.12. Proceder al enriquecimiento de la muestra (solución de enjuague colectada).
3.5.13. 1.-Enriquecimiento con agua peptonada alcalinizada (APA)
3.5.14. Llevar a temperatura ambiente el APA a 10x y 2x
3.5.15. Mezclar 500mL del agua del retrolavado por ultrafiltro con 500mL de APA 2X en un
frasco de 1L e incubar a 37°C toda la noche.
3.5.16. El aislamiento de V. cholerae O1 puede ser incrementado a 42°C y si los recursos del
laboratorio lo permiten, se puede realizar un duplicado e incubar las muestras a 42°C.
3.5.17. Proceder a la identificación microbiológica convencional y/o específica.
3.6. Manejo de residuos.
3.6.1. Es completamente responsabilidad del laboratorio cumplir con las normas de regulación
en la gestión de residuos de riesgo biológico y normas de identificación de residuos
peligrosos, restricciones de eliminación en tierra para protección del aire, agua y tierra,
reduciendo al mínimo y controlando todas las emisiones de las campanas de extracción y
las operaciones.
3.6.2. Las muestras, materiales de referencia y equipo si se sabe o sospecha de la presencia
de microorganismos viables pueden ser desinfectados antes de su eliminación o reúso.
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63
Fecha
Nombre del verificador (a):
Laboratorio ID / descripción del proyecto
Nombre de la muestra
Ultrafiltro empleado:
[ ] Fresenius F250NR
[ ] Rexeed- 25S
[ ] Baxter Exelra Plus 210
[ ] Otros-______________
Tiempo inicial de filtración
Tiempo de flujo medido
Volumen en 30 s:
Fin de tiempo de filtración:
Tasa de filtración
(mL/min)
Tiempo para filtrar
volumen deseado:
Tiempo Total:
Muestra sin cloro? [ ] No [ ] SI,
Firma:
Nombre:
Fecha:
Hora:
Cedido o suministrado por:
Recibida por:
Cedido o suministrado por:
Condición
de
la
muestra:
(Para uso de laboratorio
únicamente)
Temperatura Actual:
Recibido en Si / No
hielo
Preservado
Si / No
Sellos
presentes
Comentarios/Observaciones:
Contenedor
intacto
Favor de enviar muestras en hielo para mantener en condiciones de Preservado
refrigeración durante toda la noche.
en el Lab
Si / No
Recibido por:
Si / No
Si / No
Figura 3. Hoja de datos de colecta de la muestra para Ultrafiltración.
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64
ANEXO II.
MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y EQUIPO DE LABORATORIO
REQUERIDO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.
1. EQUIPO.
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
1.7.
1.8.
1.9.
1.10.
1.11.
1.12.
1.13.
1.14.
1.15.
1.16.
1.17.
1.18.
Autoclave.
Balanza granataria con capacidad de 2 Kg y sensibilidad de 0.1 g.
Baño de agua a 42 ± 1 °C con termómetro.
Cámara fotográfica.
Cámara horizontal para electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa
Congelador (-20°C)
Documentador de geles con Transiluminador UV.
Equipo de filtración por membrana.
Fuente de poder para cámara de electroforesis.
Incinerador para agujas y asas de siembra.
Incubadora de 35 ±2ºC con termómetro.
Microcentrifuga.
Motor de licuadora u homogeneizador peristáltico.
Placa de calentamiento.
Potenciómetro.
Termobloque.
Termociclador.
Termómetro de máximas.
Todos los equipos e instrumentos deberán contar con mantenimiento, calificación y/o calibración de
equipos según aplique, en cumplimiento con las Buenas Prácticas de Laboratorio.
2. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS, MATERIALES E INSUMOS.
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.7.
2.8.
2.9.
2.10.
2.11.
2.12.
10X PCR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2).
10X TBE (0.9 M Tris-borato, 0.02 M EDTA, pH 8.3).
Aceite mineral ligero.
Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC).
Agar sangre.
Agar soya tripticasa.
Agar T1N1 (Agar triptona y sal).
Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS).
Agarosa (grado electroforesis ácido nucleico).
Agua estéril desionizada.
Agua peptonada alcalina (APA).
AKI Medio.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
65
2.13.
2.14.
2.15.
2.16.
2.17.
2.18.
2.19.
2.20.
2.21.
2.22.
2.23.
2.24.
2.25.
2.26.
2.27.
2.28.
2.29.
2.30.
2.31.
2.32.
2.33.
2.34.
2.35.
2.36.
2.37.
2.38.
2.39.
2.40.
2.41.
2.42.
2.43.
2.44.
2.45.
2.46.
2.47.
2.48.
2.49.
Antisuero polivalente V.cholerae Hikojima, Inaba, Ogawa.
Antisuero Vibrio cholerae Inaba.
Antisuero Vibrio cholerae O139.
Antisuero Vibrio cholerae Ogawa.
Arginina glucosa inclinado (AGS).
Asas bacteriológicas de 3 a 5 mm de diámetro con porta asa.
Botellas con capacidad de 500 mL.
Botellas de dilución de vidrio de borosilicato.
Buffer de carga de muestra 6X.
Cajas Petri desechables estériles 15 x 150 mm.
Caldo casamino ácidos, extracto de levadura sal (CA-YE) (Gorbach).
Caldo triptona y caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3, T1N6, T1N8 y T1N10
Desoxicolato de sodio al 0.5 % en agua destilada estéril.
Discos de Polimixina –B
Espátulas, cuchillos desconchadores, tijeras, cucharas y/o cuchillos estériles.
Filtros de membrana de 0.45 µm de poro y 47 mm de diámetro.
Guantes de látex estériles.
Kit PCR assay, para Vibrio cholerae, parahaemolitycus, vulnificus.
Kit VET-RPLA, Oxoid.
Marcadores de peso moleculares DNA.
Medios de Cultivo y Reactivos (Anexo I).
Micropipeta calibradas a volúmenes adecuados (0.5-20 µL, 20-200 µL).
Palillos de madera estériles.
Pinzas para membranas.
Pipetas serológicas de 1 mL estériles.
Pipetas serológicas de 10 mL estériles.
Pipetas serológicas de 2 mL estériles.
Placas con 96 pozos con fondo plano estériles con tapa.
Placas de 96 pozos con fondo en “V”.
Primers Oligo para toxina cholera PCR, 10 pmol/µL soluciones stock (5'TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3', 5'-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3').
Puntas para micropipeta.
Reactivo de oxidasa.
Solución bromuro de etidio, 10 mg/mL.
Solución salina fisiológica al 0.85% (estéril).
Taq ADN polimerasa (Disponible comercialmente) ó Amplitaq® 2'-Deoxinucleosido-5'trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); solución stock 1.25 mM de cada dNTP.
Tubos con tapa de rosca de baquelita de 13 x 100 mm.
Tubos con tapa de rosca de baquelita de 16 x 150 mm.
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66
ANEXO III.
REACTIVOS, FORMULACIÓN Y CONDICIONES DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, PARA EL
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae3,23.
Agua Peptonada Alcalina (APA).
FÓRMULA.
Peptona.
10 g
Cloruro de Sodio
10 g
Agua destilada
1000mL
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8.5± 0.2. Esterilizar en autoclave
10 minutos a 121°C.
Agua Peptonada Alcalina 2X APA.
Peptona
Cloruro
de sodio
(NaCl)
Agua
destilada
10.0 g
10.0 g
500 mL
Preparación: Mezclar 10g de peptona y 10g de NaCl en un frasco de 1L. Adicione 500mL de agua destilada y mezcle hasta
disolver. Ajuste pH a 8.5 usando NaOH. Esterilice en autoclave a 121°C/15psi/20minutos. Almacene en refrigeración a 4°C.
Agua Peptonada Alcalina 10X (APA).
FÓRMULA.
Peptona.
100 g
Cloruro de Sodio
100 g
Agua destilada
1000 mL
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8.5± 0.2. Esterilizar en autoclave
15 minutos a 121°C.
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67
Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS).
FÓRMULA.
Extracto de levadura
5g
Proteosa peptona
10 g
Sacarosa
20 g
Tiosulfato de sodio.5H2O
10 g
Citrato de sodio.2H2O
10 g
Colato de sodio (sales biliares)
3g
Bilis de buey (Oxgall)
5g
Cloruro de sodio
10 g
Citrato férrico
1g
Azul de bromotimol
0.04 g
Azul de timol
0.04 g
Agar
15 g
Agua destilada
1 000 mL
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes
en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar.
Enfriar a 50°C y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45°C antes de usar. pH, ver las instrucciones del
fabricante.
Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal).
FÓRMULA.
Triptona o tripticasa
10 g
Cloruro de sodio
10 g
Agar
20 g
Agua destilada
1 000 mL
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. Esterilice en
autoclave 15 minutos a 121°C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio de 45-50°C y distribuya en
cajas Petri estériles.
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68
Agar Gelatina.
FÓRMULA.
Peptona
4g
Extracto de levadura
1g
Gelatina
Agar
15 g
15 g
Agua destilada
1 000 mL
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7.2 ± 0.2. Esterilice en autoclave
15 minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.
Agar Gelatina con Sal
Preparar agar gelatina, pero adicionando 30 g de NaCl/L. Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el
agar. Ajuste el pH de 7.2 ± 0.2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C, y coloque en cajas Petri. Si
es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp tal como V. alginolyticus, use de 25-30 g de agar /L.
Medio base de descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina).
FÓRMULA BASE.
Peptona
5g
Extracto de levadura
3g
Dextrosa (D-glucosa)
1g
Púrpura de Bromocresol
0.02 g
Agua destilada
1 000 mL
Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 g de L-aminoácido a 1 L de base. Como control, use base sin suplemento
(aminoácido). Para Vibrio spp halofílicos, adicionar 15 g NaCl / L. Ajuste el pH de tal manera que después de la
esterilización sea de 6.5 ± 0.2. Distribuya en tubos y esterilice en autoclave 10 minutos a 121°C.
Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0, T1N1, T1N3 y T1N6, T1N8 y T1N10
FÓRMULA.
Triptona o Tripticasa
10 g
Cloruro de Sodio
0,10,30,60,80, o 100 g
Agua destilada
1 000 mL
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue NaCl, para T1N1 use 10 g de NaCl (1% w/v concentración
de cloruro de sodio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3% p/v concentración de cloruro de sodio)
Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C.
Ajuste el pH a 7.2 ± 0.2.
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69
Caldo Soya Tripticasa (CST).
FÓRMULA.
Peptona de Tripticasa (Triptona)
17 g
Peptona de fitona (Soytona)
3g
Cloruro de Sodio
5g
Fosfato dipotásico
2.5 g
Dextrosa
2.5 g
Agua destilada
1 000 mL
Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 mL en matraces de 500 mL o tubos.
Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. El pH final debe ser de 7.2 ± 0.2.
Agar Soya Tripticasa (AST).
FÓRMULA.
Peptona tripticasa (Triptona)
15 g
Peptona de fitona (Soytona)
5g
Cloruro de Sodio
5g
Agar
15 g
Agua destilada
1 000 mL
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolución del agar. Para Vibrio spp
halofílicos, agregar 15 g de NaCl. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a
121°C. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50°C y distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7.3
± 0.2.
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70
Agar de Hierro Kligler (KIA).
FÓRMULA.
Peptona polipeptona
20 g
Lactosa
20 g
Dextrosa
1g
Cloruro de Sodio
5g
Citrato férrico amoniacal
0.5 g
Tiosulfato de sodio
0.5 g
Rojo de fenol
0.025 g
Agar
15.0 g
Agua destilada
1 000 mL
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolución del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. Esterilizar en autoclave
durante 15 minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7.4 ± 0.2.
Agar Arginina Glucosa Inclinado.
FÓRMULA.
Peptona
5g
Extracto de levadura
3g
Tristona
10 g
Cloruro de Sodio
20 g
Glucosa
1g
L-Arginina. (hidrocloruro)
5g
Citrato férrico amónico
0.5 g
Tiosulfato de Sodio
0.3 g
Púrpura de Bromocresol
0.2 g
Agar
13.5 g
Agua destilada
1 000 mL
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolución del agar, y distribuir en cantidades de 5 mL a tubos de
13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6.8 a 7.0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 121°C y deje solidificar el medio
inclinado.
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71
Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI).
FÓRMULA.
Polipeptona
20 g
Cloruro de Sodio
5g
Lactosa
10 g
Sacarosa
10 g
Glucosa
1g
Sulfato ferroso amónico
0.2 g
Tiosulfato de Sodio
0.2 g
Rojo de fenol
0.025 g
Agar
13 g
Agua destilada
1 000 mL
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa
disolución, enfriar a 60°C y ajuste el pH de 7.3 ± 0.1.
Agar de Hierro y Lisina (LIA).
FÓRMULA.
Peptona o gelisato
5.0 g
Extracto de levadura
3.0 g
Glucosa
1.0 g
L-Lisina
10.0 g
Citrato férrico amónico
0.5 g
Tiosulfato de sodio
0.04 g
Púrpura de bromocresol
0.02 g
Agar
15.0 g
Agua destilada
1 000 g
Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta
conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121°C. Enfriar de 50-60°C y ajustar el pH de 6.7 ±
0.1. Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en posición inclinada, de tal modo que
se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.
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72
Solución salina reguladora de fosfatos.
FÓRMULA.
NaCl
7.65 g
Na2HPO4
0.724 g
KH2PO4
0.21 g
Agua destilada
1000 mL
Disolver todos los ingredientes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH y esterilice en autoclave a 121°C/15 min.
Medio AKI.
FÓRMULA.
Peptona
15 g
Extracto de levadura
4g
NaCl
5g
Agua destilada
970 mL
NaHCO3 al 10% esterilizado por filtración
30 mL
Disuelva la peptona, extracto de levadura y NaCl en agua destilada. Esterilice durante 15 minutos a 121°C enfrié y adicione
30 mL de NaHCO3 recién preparado y filtrado y mezcle pH Final, 7.4. Deposite en condiciones asépticas en tubos con tapón
de rosca (15 mL de 16 x 125 mm).
Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer (RM-VP).
FÓRMULA.
Peptona
7g
Glucosa
5g
Fosfato dipotásico
5g
Agua destilada
1 000 mL
Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Para Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g más de NaCl (concentración final
del 2%). Filtrar, enfriar a 20°C y diluir a 1 L. Distribuya en tubos. Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minutos a 121°C.
Ajustar el pH de 6.9 ± 0,2.
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73
Medio para prueba de movilidad (Semisólida).
FÓRMULA.
Peptona
10 g
Extracto de carne
3g
Cloruro de Sodio
5g
Agar
4g
Agua destilada
1 000 mL
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofílicos agregar 15 g más de
NaCl (para una concentración final del 2%). Distribuir en tubos con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a
121°C. Ajustar el pH de 7.4 ± 0,2.
Soluciones y reactivos.
Prueba de Rojo de Metilo.
Reactivo. Fórmula.
Rojo de metilo
0.1 g
Alcohol etílico
300 mL
Agua destilada
200 mL
Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la
solución a 5 mL del cultivo problema. Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4.5 y la prueba es (+). Un color
amarillo se reporta como prueba negativa.
Prueba de Vogues-Proskauer.
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.
Reactivo. Fórmula.
Alfa Naftol
5g
Alcohol Etílico absoluto
100 mL
Añadir 0.6 mL de la solución de Alfa Naftol y 0.2 mL de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 mL de cultivo. Resultados:
El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción positiva.
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
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Prueba de Oxidasa.
Reactivo
FÓRMULA.
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino
1.0 g
Agua destilada
100 mL
Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 7 d. Sembrar en un tubo de base de gelosa para
sangre. Incubar 18 h a 35°C. Agregar 0.3 mL de reactivo. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de
un color azul en un minuto.
Agar modificado de celobiosa, Polimixina, B- colistina (mCPC).
SOLUCIÓN 1.
FÓRMULA.
Peptona
10 g
Extracto de carne
5g
Cloruro de sodio
20 g
Solución Stock de colorante 1 000
1 mL
Agar
15 g
Agua destilada
900 mL
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 48-55°C.
Nota: Este medio debe ser almacenado por 2 semanas en refrigeración.
SOLUCIÓN STOCK DE COLORANTES 1 000 X:
FÓRMULA.
Azul de Bromotimol
Rojo de cresol
Etanol al 95%
4g
4g
100 mL
Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los
colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% (p/v). Agregue 1 mL de esta solución a
cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo cresol / L.
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SOLUCIÓN 2.
FÓRMULA.
Celobiosa
Colistina
Polimixina B
Agua destilada
10 g
400 000 Ul
100 000 UI
100 mL
Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por filtración, agregue
la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.
Solución Salina 0.85% en agua destilada.
NaCl
Agua
8.5g
1L
Disolver 8.5 g de NaCl en agua y esterilizar a 121°C/15min, y enfríe a temperatura ambiente.
Reactivo de desoxicolato de sodio (0.5%) para la prueba del hilo1
La prueba del hilo se utiliza para ayudar en la identificación de V. cholerae.
FÓRMULA.
Desoxicolato de sodio
Agua destilada estéril
5g
1000 mL
Añada el agua destilada estéril al desoxicolato de sodio y mezcle perfectamente, y guarde a temperatura ambiente esta
puede ser útil hasta por 6 meses.
Control de calidad: Antes de utilizar cada nuevo lote de desoxicolato de sodio, debe hacerse un control de calidad.
• Use una cepa de V. cholerae O1 como un control positivo.
• E. coli puede utilizarse como un control negativo.
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ANEXOS IV.
DIAGRAMA GENERAL PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae A PARTIR DE MUESTRAS DE
ALIMENTOS.
Muestra de alimento: 25 g en 225 mL de APA
(10-1)
Se preparan dos series de diluciones en APA (10-2, 10-3) y se incuba a 35 ± 2°C
durante 6 a 8 h y a 42°C por 6 a 8h
Mariscos: 50 g en 225 mL de APA (10-1)
Incubar 18h a 35 ± 2°C
Siembra en placa con medio TCBS e incubación de 18 a 24h/35 ± 2°C
Pruebas bioquímicas preliminares para detección:
Tinción de Gram: (-) bacilos cortos curvos
Morfología colonial en medio
TCBS muestra colonias
amarillas
brillantes de 2 a 4 mm de
diámetro que
pueden ser redondas, planas
lisas, con centro elevado,
seleccione 3 o más colonias.
Prueba de Oxidasa: +
Prueba del hilo: +
KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo
amarillo)
TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña
amarilla/extremo amarillo)
Inocule agar T1N1 o agar soya tripticasa con NaCl al 2%
LIA (Agar hierro lisina): K/K, no gas, no H2S (cuña morada/extremo
morado)
Sistema bioquímica miniaturizadas API20E o Vitek 2
Identificación de serogrupo
aglutinación en lámina
Salina control y antisuero O1
polivalente.
(-)
Salina control y antisuero O139
(+)
(+)
Salina control y antisuero
Inaba y Ogawa
V. cholerae O139
(+)
(+)
Toxigenicidad (PCR y RPLA).
Envíe el aislamiento a Laboratorio Nacional de
Referencia para confirmación y prueba de
toxinas
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ANEXO V.
DIAGRAMA GENERAL PARA EL AISLAMIENTO DE V. cholerae EN MOLUSCOS BIVALVOS.
Transferir 250mL del
homogeneizado a un
2do contenedor.
50g de muestra (dil 1:2) en 200mL
APA por duplicado o 100g muestra
(dil 1:2) en 400mL APA homogeneizar
2 min. Dilución 1:10
1 serie+ 1 frasco
1 serie+ 1 frasco
2 series.
Incubar todas las diluciones
(10-1 a 10-6) a 42°C±0.2°C por
6-8h o toda la noche
Incubar todas las diluciones
(10-1 a 10-6) a 35 ±2°C por
6-8h y por 24 h
Agar TCBS 35 ±2°C
toda la noche
En TCBS se observan
colonias amarillas
brillantes de 2 a 4 mm de
diámetro que
pueden ser redondas, planas
lisas, con centro elevado,
seleccione 3 o más colonias
Pruebas bioquímicas preliminares para detección:
Tinción de Gram: (-) bacilos cortos curvos
Prueba de Oxidasa: +
Inocule agares no selectivos Agar T1N1 o agar soya
tripticasa al 2% NaCl (Agar soya triptona o tripticasaAST-, agar infusión de corazón -BHI-) y use el
crecimiento para serología y pruebas bioquímicas.
Prueba del hilo: +
KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo amarillo)
TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña amarilla/extremo
amarillo)
Identificación de serogrupo
aglutinación en lámina
LIA (Agar hierro lisina): K/K, no gas, no H2S (cuña morada/extremo
morado)
Sistema bioquímica miniaturizadas API20E o Vitek 2
Salina control y antisuero O1
polivalente.
(-)
(+)
Salina control y antisuero O139
Salina control y antisuero
Inaba y Ogawa
(+)
V. cholerae O139
(+)
(+)
Toxigenicidad (PCR y RPLA)
Envíe el aislamiento al Laboratorio
Nacional de Referencia para confirmación y
prueba de toxinas
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ANEXO VI.
DIAGRAMA GENERAL PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae A PARTIR DE AGUA Y HIELO PARA
CONSUMO HUMANO.
Este procedimiento puede aplicarse a muestras de
agua para consumo humano para lo cual se filtran
3000 mL de la muestra de agua a través de un filtro
de membrana 0,45 μm.
Dividir la membrana en 2 y colocar una mitad de la membrana (utilice guantes de látex
estériles) en un tubo con 10 mL de APA y se incuba a 35±2°C por 18 a 24h y la mitad
a 42±0.2°C °C/18-24h. Posteriormente tomar de la parte superior del caldo y
sembrar por estría en agar TCBS. Incubar a 35±2°C/ 18-24h (evite agitar y mezclar el
tubo antes de sembrar).
Pruebas bioquímicas preliminares para detección:
Tinción de Gram: (-) bacilos cortos curvos
Morfología colonial en medio
TCBS. Colonias amarillas
brillantes de 2 a 4 mm de
diámetro que
pueden ser redondas, planas
lisas, con centro elevado,
seleccione 3 o más colonias
Prueba de Oxidasa: +
Prueba del hilo: +
KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo
amarillo)
TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña
amarilla/extremo amarillo)
Inocule agares no selectivos Agar T1N1 o agar soya
tripticasa al 2% NaCl (Agar soya triptona o tripticasaAST-, agar infusión de corazón -BHI-) y use el
crecimiento para serología y pruebas bioquímicas.
LIA (Agar hierro lisina): K/K, no gas, no H2S (cuña morada/extremo
morado)
Sistema bioquímica miniaturizadas API20E o Vitek 2
Identificación de serogrupo
aglutinación en lámina
Salina control y antisuero O1
polivalente.
(-)
Salina control y antisuero O139
(+)
(+)
Salina control y antisuero
Inaba y Ogawa
V. cholerae O139
(+)
(+)
Toxigenicidad (PCR y RPLA).
Envíe el aislamiento al Laboratorio Nacional de
Referencia para confirmación y prueba de
toxinas
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ANEXO VII.
DIAGRAMA GENERAL DE ANÁLISIS DE HISOPO DE MOORE PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V.
cholerae A PARTIR DE AGUAS RESIDUALES.
Colocación del hisopo de Moore en sitio de
análisis durante 24-48h
Introducir hisopo de Moore en 300-500mL de medio de Enriquecimiento APA 6-8 h,
35°±2°C. Si al cabo de 6 a 8 h de incubación el (APA) no se puede sembrar por
estría, se resiembra a las 18 h en otro recipiente con APA, se incuba durante 6 a 8 h
y se siembra en TCBS por estría.
Directo las muestras se siembran en placa en medio TCBS se incuban
a 35°C±2 por 18 a 24h
Pruebas bioquímicas preliminares para detección:
Morfología colonial en medio
TCBS muestra colonias
amarillas
brillantes de 2 a 4 mm de
diámetro que
pueden ser redondas, planas
lisas, con centro elevado,
seleccione 3 o más colonias
Tinción de Gram: (-) bacilos cortos curvos
Prueba de Oxidasa: +
Prueba del hilo: +
KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo
amarillo)
TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña
amarilla/extremo amarillo)
Inocule agares no selectivos Agar T1N1 o agar soya
tripticasa al 2% NaCl (Agar soya triptona o tripticasaAST-, agar infusión de corazón -BHI-) y use el
crecimiento para serología y pruebas bioquímicas.
LIA (Agar hierro lisina): K/K, no gas, no H2S (cuña morada/extremo
morado)
Sistema bioquímica miniaturizadas API20E o Vitek 2
Identificación de serogrupo
aglutinación en lámina
Salina control y antisuero O1
polivalente.
(-)
Salina control y antisuero O139
(+)
(+)
Salina control y antisuero
Inaba y Ogawa
V. cholerae O139
(+)
Toxigenicidad (PCR y RPLA)
(+)
Envíe el aislamiento al Laboratorio Nacional de
Referencia para confirmación y prueba de
toxinas
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
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ANEXO VIII.
DIAGRAMA GENERAL DEL USO DE HISOPO DE SPIRA PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae A PARTIR
AGUAS AMBIENTALES.
Hisopo de Spira en sitio de análisis este comienza
por verter por la boca del frasco el agua que se va a
muestrear y se deja escurrir por el fondo,
posteriormente la gasa se retira bajo condiciones
asépticas del frasco Spira.
La gasa se coloca en un matraz o frasco con 100 mL de APA 10x y se agrega suficiente
agua de la fuente para obtener un volumen final de 1L, registrar el sitio de toma de la
muestra, fecha, hora y responsable, se traslada al laboratorio a temperatura ambiente y
enseguida se procede a incubar a 35±2°C/6 a 8h (Afloje tapas de frasco ) y se siembra
en agar TCBS a 35±2°C °C/18 a 24h, mientras que se re incuba el frasco con APA por
18h mas a 35±2°C y se siembra nuevamente en TCBS e incuba a 35±2°C /18 a 24h
Pruebas bioquímicas preliminares para detección:
Tinción de Gram: (-) bacilos cortos curvos
Morfología colonial en medio
TCBS. Colonias amarillas
brillantes de 2 a 4 mm de
diámetro que
pueden ser redondas, planas
lisas, con centro elevado,
seleccione 3 o más colonias
Prueba de Oxidasa: +
Prueba del hilo: +
KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo
amarillo)
TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña
amarilla/extremo amarillo)
LIA (Agar hierro lisina): K/K, no gas, no H2S (cuña morada/extremo
morado)
Inocule agares no selectivos Agar T1N1 o agar soya
tripticasa al 2% NaCl (Agar soya triptona o tripticasaAST-, agar infusión de corazón -BHI-) y use el
crecimiento para serología y pruebas bioquímicas.
Sistema bioquímica miniaturizadas API20E o Vitek 2
Identificación de serogrupo
aglutinación en lámina
Salina control y antisuero O1
polivalente.
(-)
(+)
Salina control y antisuero O139
Salina control y antisuero
Inaba y Ogawa
(+)
(+)
V. cholerae O139
(+)
Toxigenicidad (PCR y RPLA)
Envíe el aislamiento al Laboratorio Nacional de
Referencia para confirmación y prueba de
toxinas
Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01
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