prácticas de análisis de laboratorio mirobiológicos2

3. Prácticas de análisis de laboratorio microbiológicos
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3.1
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA
TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
I. Q. Sílvia Salas Sosa
Biol. Guadalupe Martínez Morales (Instructora)
Objetivo específico:
•
Ante una muestra de agua residual y mediante la técnica de
tubos múltiples del número más probable (NMP), el
participante cuantificará los coliformes totales y fecales.
3.1.1Fundamento teórico
Las bacterias del grupo coliformes se utilizan desde el inicio del siglo XX como
indicadoras de contaminación fecal. Fueron definidas siempre como bastoncillos gram
negativos, no formadoras de esporas, que pueden crecer en presencia de sales biliares o de otros
agentes tensoactivos y que fermentan la lactosa a 37°C, con producción de ácido (ácidos
orgánicos y aldehidos) y gas en 24 horas.
En las heces, están en la concentración de 10 8-1010 microorganismos por gramo.
Tradicionalmente los coliformes son clasificados en un grupo denominado coliformes
totales y dentro de este existe un subgrupo conocido como Coliformes Fecales.
Los coliformes totales son clasificados como bacilos gram negativos aerobios y
anaerobios facultativos no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y
gas después de incubación durante 24-48 horas a 35°C. Incluye los géneros Citrobacter spp.,
Klebsiella spp., Enterobacter spp., en este último se encuentra la E. coli, exclusiva de heces
animales homeotérmicos.
Los coliformes fecales constituyen un subgrupo de los coliformes totales, y se diferencian
de los anteriores por ser tolerantes a temperaturas mas altas, creciendo a 44.5°C, (APHA,
1995). Se denominan termotolerantes por su habilidad de soportar temperaturas más
elevadas.
3.1.2 Fundamento técnico
A través de diluciones sucesivas de la muestra, se busca obtener inóculos de al menos una célula
que presente crecimiento en el medio de cultivo, presentando en prueba presuntiva una
fermentación de la lactosa y en prueba confirmativa, fermentación de lactosa y
producción de gas.
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La cantidad de tubos positivos y negativos permite obtener una estimación de la densidad
de bacterias obtenidas a través de la aplicación de cálculos de probabilidad.
3.1.3 Equipo
•
•
•
•
Incubadora a 35 °C ± 0.5 °C.
Termobano a 44.5 °C ± 0.2 °C.
Mechero de Bunsen.
Agitador de tubos automático
3.1.4 Reactivos
•
•
•
•
•
Caldo lactosado con púrpura de bromocresol
Caldo Lactosado con verde brillante y bilis al 2 %.
Medio EC
Agua de dilución
Solución de hipoclorito de sodio 2000ppm / etanol 70% (germicida)
3.1.5 Material
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipetas serológicas de 10 mL
Pipetas serológicas de 5 mL
Pipetas serológicas de 1 mL
Tubos de cultivo
Tubos de dilución
Campanas de Durham
Tapas metálicas
Gradillas
Asas de inoculación
Bata
Guantes de latex
Cubrebocas
Nota: Todo el material que tenga contacto con las muestras debe ser esterilizado mediante
autoclave a 121 °C y 15 lb de presión durante 15 minutos.
3.1.6 Procedimiento
a)
Leer el procedimiento de la técnica: Determinación de coliformes totales y fecales
por la técnica del número más probable (NMP), CAMB6-03.
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b)
Preparación de la solución de agua de dilución y de los diferentes medios de
cultivo: El responsable del área se encargará de preparar las soluciones conforme al
procedimiento CAMB6-03.
c)
Para la realización de esta práctica se analizarán las muestras tomadas en la práctica de
muestreo.
d)
Análisis de la muestra.
e)
Solicitar al instructor el equipo de seguridad necesario para la realización de esta
práctica.
f)
Al realizar el análisis la muestra debe estar a temperatura ambiente.
g)
Desinfectar el área de trabajo con el germicida.
h)
Realizar las diluciones tomando en cuenta lo establecido en el procedimiento
CAMB6-03, agitando bien la muestra antes.
i)
Hacer la siembra en los tubos conteniendo el medio de cultivo Caldo Lactosado con
Purpurea de Bromocresol (CLPB) de concentración simple o doble.
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j)
k)
Incubar durante 48 horas a 35 ± 0.5°C y anotar en la bitácora de la incubadora.
Cuantificar los tubos positivos (color amarillo y/o producción de gas en la campana
Durham). Anotar en los formatos de la prueba presuntiva.
l)
Resembrar los tubos positivos:
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m) En tubos de Caldo Lactosado Verde Bilis Brillante al 2% (CLVBB) para análisis de
los coliformes totales, e incubar 48h a 35 ± 0.5°C (incubadora).
n)
En tubos de medio EC para análisis de los coliformes fecales, e incubar 24h a 44.5 ±
0.2°C (termobaño).
o)
Anotar en las bitácoras de equipos correspondientes.
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p)
Cuantificar los tubos positivos y anotar en los formatos de la prueba confirmativa.
q)
Hacer los cálculos de acuerdo con el procedimiento CAMB6-03.
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3.2
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y E. COLI POR LA
TÉCNICA DE SUSTRATO CROMOGÉNICO ESPECÍFICO
I. Q. Sílvia Salas Sosa
Biol. Guadalupe Martínez Morales (Instructora)
Objetivo específico:
Mediante la técnica de número más probable por sustrato
cromogénico específico y en una muestra de agua residual tratada,
el participante cuantificará coliformes totales y Escherichia coli.
3.2.1 Fundamento técnico
El nutriente indicador que contiene el reactivo Colilert®, corresponde al microbio que se
desea analizar (microbio objetivo). Los microbios objetivos tienen afinidad por el
nutriente indicador que se corresponde con su metabolismo, y que puede usar como
una fuente importante de carbono.
Los nutrientes indicadores específicos de Colilert : orto-nitrofenil-(-d-galactopiranoside
(ONPG) y el 4-metril-umbeliferil-(-d-glucuronido (MUG), mismos que se corresponden
con las enzimas constitutivas, que están siempre presentes en la bacteria y que solo existen en
las bacterias del grupo coliformes y en E. coli. Las bacterias coliformes contienen la
enzima constitutiva (3-galactosidasa.
Si existe una bacteria coliforme en la muestra, metabolizará al ONPG partiendo la porción
indicadora, la enzima cromogénica indicadora de los coliformes (orto-nitrofenol); la
cual, una vez partida, se torna amarilla.
La bacteria E. coli contiene la enzima constitutiva (3-glucuronidasa. Si esta presente en la muestra,
E. coli metaboliza al MUG, liberando así a la porción indicadora, enzima cromogénica
indicadora de E. coli (4-metil-umbeliferona) la cual, al partirse, produce fluorescencia.
3.2.2 Equipo
•
•
•
•
•
•
Sellador Quanty-Tray
Incubadora a 35 °C ± 0.5AC
Lámpara de luz ultravioleta
Guantes de latex
Cubrebocas
Bata
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3.2.3 Reactivos
• 30 cápsulas Colilert® con dosis para usarse en 100 mL de agua
• Agua de dilución
3.2.4 Material
•
•
•
•
•
30 frascos para agua de dilución con capacidad para contener 100 ± 2 mL.
Pipetas serológicas de 10 mL esterilizadas
28 placas Quanty-Tray 2000
1 aza de inoculación
1 mechero de Bunsen
3.2.5 Procedimiento
a)
Antes de iniciar se debe leer el procedimiento de la técnica: Determinación de
coliformes totales y E.coli por la técnica de sustrato cromogénico (CATMPB06-02).
b)
Para la realización de esta práctica se analizaran las muestras tomadas en la práctica de
muestreo.
c)
Se prepara la solución de agua de dilución. El responsable del área debe preparar
esta solución conforme al procedimiento CATMPB06-02.
Al realizar el análisis la muestra debe estar a temperatura ambiente.
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d)
Desinfectar el área de trabajo con un germicida.
e)
Realizar las diluciones tomando en cuenta lo establecido en el procedimiento
CATMPB6-02.
f)
Encender el sellador IDEXX. Cuando este listo se encenderá el foco verde. Anotar
en la bitácora del sellador.
g)
Agregar el reactivo Colilert® y agitar la solución hasta completar disolución del
reactivo. Debido a su toxicidad es importante utilizar guantes de latex y cubrebocas al
aplicar este reactivo.
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h)
Vaciar la dilución en una placa Quanty-Tray.
i)
Pasar la placa en el sellador.
j)
Se incuban las placas durante 24 ± 2h a 35 ± 0.5°C. Anotar en la bitácora de la
incubadora.
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k)
Examinar las placas a las 24hrs. de acuerdo al procedimiento CATMPB6-02 (cuantificar
los cuadros amarillos y los cuadros que se tornan fluorescentes a la luz U.V.).
l)
Realizar los cálculos de acuerdo al procedimiento CATMPB6-02
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Bibliografía
Ramírez A. Víctor, “Coliformes por la técnica del NMP”, procedimiento CAMB603, 21p.
Rolim Mendonca Sergio, “Sistemas de lagunas de estabilización” Como utilizar aguas
residuales tratadas en sistemas de regadío, Mc Graw Hill., 370p.
Tomasini Ortiz A. Cecilia, “Determinación de coliformes totales y E. coli por la técnica del sustrato
cromogenico específico”, procedimiento CATMPB6-02, 17p.
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3.3
TÉCNICA DE HUEVOS DE HELMINTO NMX-AA-SCFI-1999.
M.C. Martha Millán Cabrera
Biol. Guadalupe Martínez Morales (Instructora)
Objetivo específico:
•
En una muestra de agua residual, el participante determinará
y cuantificará los huevos de helminto.
3.3.1 Campo de aplicación
Esta técnica se aplica para la cuantificación de huevos de helminto en muestras de lodos,
afluentes y efluentes de plantas de tratamiento.
3.3.2 Definiciones
a) Helminto: Término designado a un amplio grupo de organismos que incluye a todos los
gusanos parásitos (de humanos, animales y vegetales) y de vida libre, con formas y
tamaños variados.
b) Ascaris: Nematelminto gusano cilíndrico sin divisiones o anillos, presenta dimorfismo
sexual y se encuentra parasitando el intestino de algunos mamíferos entre ellos el
hombre.
c) Plathelminto: Gusanos dorsoventralmente aplanado, algunos de interés médico son:
Taenia solium, Hymenolepis nana y diminuta, entre otros.
d) Método difásico: Técnica de concentración que utiliza la combinación de dos reactivos
no miscibles y donde las partículas (huevos, detritus), se orientan en función de su
balance hidrofílico-lipofílico.
e) Método de flotación: Técnica de concentración donde las partículas de interés
permanecen en la superficie de soluciones cuya densidad es mayor. Por ejemplo la
densidad de huevos de helminto se encuentra entre 1.05 a 1.18, mientras que los líquidos
de flotación se sitúan entre 1.1 a 1.4.
3.3.3 Fundamento
Utiliza la combinación de los principios del método difásico, obteniendo un rendimiento de
un 90%, a partir de muestras artificiales contaminadas con huevos de helminto.
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3.3.4 Equipo
-
Centrífuga con intervalos de operaciones de 1000 a 3000 rpm
Bomba de vacío adaptada para controlar la velocidad de succión 1/3 hp
Microscopio óptico con aumentos de 10 a 100 x, platina móvil
Agitador de tubos adaptable con control de velocidad
Parrilla eléctrica con agitación
Densitómetro con intervalos de medición 1.1 a 1.4 g/cm3
3.3.5 Reactivos
-
Sulfato de zinc heptahidratado
Ácido sulfúrico
Eter etílico
Alcohol etílico
Formaldehído
Hipoclorito de sodio al 70%
Detergente.
Agua desionizada o potable
3.3.5.1 Preparación de reactivos
A) Solución de sulfato de zinc, gravedad específica de 1.3 g/cm3
Sulfatos de zinc .............................................. 800 g
Agua desionizada ...........................................1000 mL
Preparación:
Disolver los 800 g de reactivo en 1000 mL de agua desionizada y agitar hasta su completa
disolución. Medir la densidad con el densitómetro y en caso necesario ajustar a 1.3 g/cm3
agregando reactivo o agua según sea el caso.
B) Solución ácida alcohol
Ácido sulfúrico 0.1 N.............................................. 750 mL
Etanol concentrado................................................. 350 mL
Preparación
Homogeneizar 650 mL de ácido sulfúrico 0.1 N y con 350 ml de etanol para obtener 1 litro de
la solución ácida- alcohol. Almacene en un recipiente con tapa de rosca.
Hipoclorito de sodio al 70%
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Preparación
Disolver 70 mL. de hopoclorito de sodio en 30 mL. de agua desionizada y almacenar a
temperatura ambiente en un reciente de plástico.
3.3.6 Material
-
Garrafones de plástico de 5-8 L
Probetas graduadas de plástico (1 L, 250 y 50 mL.)
Tubos de centrífuga de 50, 250 mL.
Recipientes de plástico de (2 L)
Vasos de precipitado de plástico (1 L)
Pipetas de vidrio (10 mL)
Cámara de conteo (Doncaster o Sedgwich- Rafter)
Tamiz de 150 o 160 µm
Guantes de látex
Bulbo de goma
Matraz oxitazato de 2 L
Manguera de hule
Embudo de plástico
Aplicadores de madera
3.3.7 Condiciones de la muestra
Preparar un garrafón de plástico, translucido de 8 litros desinfectado con cloro (lo cual evita
que con el uso continuo las paredes del recipiente se deterioren), lavado con agua potable a
chorro y enjuagado con agua destilada. Tomar 5 litros de la muestra problema y
transportarla al laboratorio. La muestra debe estar correctamente etiquetada para evitar
cualquier posible confusión
Los tiempos de conservación deben reducirse al mínimo, manteniéndola refrigerada o bien
preservada con 10 mL de formaldehído del 4 al 10%. En caso contrario la muestra debe
procesarse dentro de las 48 horas de su toma.
Una muestra sólida debe refrigerarse y procesarse en el menor tiempo posible.
3.3.8 Interferencias
La sobreposición de estructuras y/o del detritus no eliminado en el sedimento, puede
dificultar su lectura, en especial cuando se trata de muestras de lodo. En tal caso, es
importante dividir el volumen en alícuotas que se consideren adecuadas.
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3.3.9 Precauciones
- El analista debe desinfectar el lugar de trabajo antes y después de haber realizado el
análisis, así como lavarse y desinfectarse las manos.
- Utilizar guantes y cubreboca para evitar contaminarse
- Utilice mascarilla cuando trabaje con éter etílico o de lo contrario trabajar en
campana de flujo laminar.
- Desinfecte con una solución de hipoclorito de sodio todo el material utilizado
durante el procesamiento de las muestras.
- Desinfecte con una solución de hipoclorito al 70% el material utilizado durante el
procesamiento de las muestras.
3.3.10 Procedimiento
3.3.10.1 Concentrado y centrifugado de la muestra
a) Dejar reposar la muestra de cinco litros durante tres horas o toda la noche.
b) Posteriormente con la ayuda de una bomba de vacío, aspirar el sobrenadante sin
agitar el sedimento.
c) Vaciar el sedimento final en un recipiente de plástico de 2 litros. Considerar también
de dos a tres enjuagues con agua potable (utilizar del volumen de 5 litros que se
ocupará en el enjuague completo) del garrafón que contenía la muestra (5 litros).
d) Filtrar el sedimento sobre un tamiz de 160 µm con la ayuda de un embudo.
e) Los enjuagues se realizan con 5 litros de agua potable y se recuperan en un recipiente
limpio y desinfectado de 5 litros.
f) Dejar sedimentar la muestra lavada durante tres horas o toda la noche.
g) Aspirar el sobrenadante al máximo con la ayuda de una bomba de vacío sin mover el
sedimento.
h) Depositar el sedimento en recipiente de 200 mL (o de mayor capacidad), agregando
de igual forma de dos a tres enjuagues del garrafón original. Todos los enjuagues a
partir de este momento se realizan con agua desionizada.
i)
Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos. Decantar el sobrenadante por vacío sin
agitar el sedimento
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j)
Resuspender las pastillas en 150 mL de ZnSO4 con una densidad de 1.3 y
homogeneizar las pastillas con ayuda de un vórtex o en su caso con aplicadores de
madera y agruparlas en un solo recipiente. Centrifugar a las mismas condiciones.
k) Recuperar el sobrenadante vertiéndolo en un recipiente de plástico de 2 litros.
l)
Romper la densidad diluyendo en un litro de agua desionizada y dejar
sedimentando tres horas o toda la noche. Aspirar al máximo el sobrenadante por
vacío (desecharlo), sin agitar el sedimento
m) Recuperar el sedimento (incluyendo de dos a tres enjuagues del recipiente original),
en un recipiente de 200 mL o en varios tubos de 50 mL (según el volumen) y
centrifugar a 2500 rpm/5 minutos.
n) Decantar y recuperar las pastillas en un solo tubo de 50 mL y centrifugar a 2500 rpm
durante 3 minutos. Decantar el sobrenadante del tubo por vacío sin agitar la pastilla.
o) Resuspender perfectamente la pastilla en 15 mL de solución ácida-alcohol, para ello
utilizar de preferencia un vortex.
p) Adicionar 10 mL de éter etílico, utilizando mascarilla de seguridad o si es dentro del
laboratorio campana de extracción de flujo laminar. Agitar suavemente los tubos y
abrir de vez en cuando para dejar escapar los gases. En este punto se puede observar
claramente la reacción bifásica. Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos.
q) Aspirar al máximo el sobrenadante (utilizar mascarilla de seguridad o una campana
de flujo laminar) dejando 1 mL o menos del líquido, proceder a la identificación y
cuantificación.
3.3.10.2 Identificación y cuantificación de la muestra
Distribuir todo el sedimento en una celda de Sedgwich-Rafter o bien en una cámara de
conteo de Doncaster. Sólo en el caso de muestras muy sucias y para evitar la sobrepoblación
de las estructuras y el detritus no eliminado, repartir la muestra en los volúmenes que se
consideren adecuados y faciliten la lectura.
Realizar el recorrido total del disco Doncaster o cámara Sedgwich-Rafter al microscopio en
aumentos de 10 y 40 X para confirmar estructuras.
3.3.11 Cálculos
Contar todos los huevos que aparezcan en la cámara y dividirlo entre 5 que es el volumen
de muestra utilizada. Por último reporte el número de huevos HH/L.
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Bibliografía
Biagi F. Enfermedades parasitarias, Segunda edición, 1976.
Cifuentes E., Gómez M., Téllez MM., Romieu I., Ruiz-Velazco S. Factores de riesgo de
infección por Giardia intestinalis en pueblos agrícolas que practican la irrigación con aguas
residuales en México. Instituto Nacional de Salud Pública.
Faust C. Sawitz., Odem V. And Peres C. 1993 “Comparative Efficiency of various
Techniques for the Diagnosis of Protozoa and Helminths in Faeces”. Journal Parasitology.
Instituto Nacional de Referencia Epidemiológicos (INDRE) , 1994. Manual de técnicas de
laboratorio, Volumen II. Identificación de especies parasitarias, Sección IV.
Irene de Haro Arteaga, Paz María Salazar Schettino, Margarita Cabrera Bravo. Diagnóstico
Morfológico de las Parasitosis, Segunda edición 1995.
Jiménez B., Chávez A., Barrios J. A., Maya C., Salgado V., Manual del curso determinación
y cuantificación de huevos de helminto.
Norma Mexicana. Análisis de Agua – Determinación de Huevos de Helminto – Método de
Prueba. NMX – AA – 113 SCFI – 1999.
Norma Oficial Mexicana NMX- AA- 113-SCFI-1999
Tay G., Velazco O., Aguilera R., Gutiérrez M. Parasitología Médica, quinta edición.
Soberón y Parra G., Peláez D., Parasitología Médica y Patología Tropical. 1980.
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