m - Revistas Científicas de la Universidad de Murcia

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SEPARACI~NDE SOLUTOS NO ENCAPSULADOS EN LIPOSOMAS.
COMPARACI~N
DE LA: FILTRACI~NEN GEL CON LA CENTRIFUCACI~NEN
MINICOLUMNAS DE GEL
Ortiz López, A. y Gómez Fernández, J. C.
Departamento de Bioqhiea. Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia.
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Abrevi&tums: MLV. veda~labm u h i l ~ r n i m ;SUV, vesfeiilas uirilemehres smio#kB; LUV; ve&&&
uniknelares &es:
DCP. dicsttlfbsfato; EDTA. ácido atilendiamiao-tet&tico;
TES. W bM-FriQ*
x i & ) - m e t i ~ 2 - a ~ ~ 1 i a ~ ~ ~ .
ABSTRACT
We describe the g e - W i o n of dan-&ni~?ped
m q r i a l fram a ~i&~oaae prcparation, fh by
by cuitrifugation in $&!mdvx O-JO mhkolumns. Both mthods M adpamd a
c&
R>
% of phouphdfipld recoVery, $&&npled l h i o n 4 &ulation of the trapped volume for thres difkenf
.g;t
vesicles: rnultilamellar lipo~omes(MLV), soaicated unilamellar liposomes (SUV) and large unilameliar lipmmes (LUVI.
%wapmdwer m similar, but there a
..eseaitiaüy, I$ai msthod is considerably
e& and s e v d ~ m W $G
w ~s
the two mWr are sSraik ir h y
te,e n c q s u W vohime.
!pr vesicbs; SW, ssrrhpred *en
XDTA, e.evten ,&mino tdtra~etyewio,
El uso de lipommas en biotecnología y biomedicina se ha visto muy incrementado en los
últimos d o s (Id), Así, los liposomas se están
mostrando corno vehículos idóneos para la incorporación de mol6culas a las dlulas tanto uin
vitro* como uin vivo*. Cuando se trabaja uin
vitrom, con células en cultivo tanto animales
como vegetales o microorganismos, para incorporar, esencialmente, material genético a las
mismas e inducir la transformación genktica (5,
6). Cuando se usan uin vivom, como vehículos
transportadores de @macos. enzioias, hoirmonas, etdtera, para el tratamiento de enfermedades y como &todos de diagnóstico, tanto en
animales como en el hombre (7).
Se han encapsulado una amplia variedad de
sustancias en liposomas, entre ellas agentes
quimioterap6uticos (&14), nucleótidos y ácidos
nucteicos (15) y enzimas (16-19) y se han desar r d & rnktodos para la preparación de diferentes tipos de liposomas (32), vesículas multih-s
(MLV); vesículas unilamelares soni(SUV) y ved~ulasunilamelares grandes
(LUV).
Es obvio, por b tanto, que todos estos estudios con sustancias encapsuladas se verán muy
favorecidos si se diqone de un método rhpido,
sencillo y e f i pm la s a p m i ó s l cid material
que no ha sido mcaps~tladoen los kipowmas.
Usu&nmte se hm utilizado b fdtraeiBn en gel
(20-m, diMrsís Cm,21, 23) y ñItwión por Millipore &4, 251. Tambgn se ha descrito un método sewiiio y eficaz que utiliza la centrifugaci6R ea miqicoLwanas de S e p W e x G-50 (261.
EB. d psente artí~ulose m m p x a dicho métadQ ant el de filtración en gel para los tres
tipos de liposomas que se han descrito, MLV,
SUV y LUV. Para ello se ha encapsulado ferrie k r o en la35 i i i m ,d& que es una sustzm& con un pw mleculai. medio y que se
puede determinar fácilmente por medidas de
absorbancia en el espectro visible.
Se establece la validez del método para los
tres tipos de liposomas estudiados, en términos
de la eiiminacibn del material no encapsulado y
&i ~&ulo del volunen encapsulado por 10s li-
pmm.
MATERIALES Y M&?.TODQS
FaosfatidilcoIina (Lecitina) de yema de huevo
se aisb y purificó de acuerdo al método desc h por Papahadjopoulos y Miller (27). Dicebilhs&o y p-Dodilglucbsido se obtuvieron de
mi&*
Paob, U. K., Bio-be& SM-2 de BioRad, Sephdex G-50 (fine) de Fharmacia, Upp-
sala, Sweden y femkiaauro p & s b de Uerck,
Darmstadt, FRG. Todos los demas reactivos y
productos fueron de grado analítico.
Para la preparación de liposomas y de tampones se usó agua bidestilada y desionizada en
aparato Milli-Q de Millipore.
MLV se prepararon esencialmente de
acuerdo al método descrito por Bangham y col.
(20). 10 pmol de lecitina y 1 pmol de dicetilfosfato disueltos en cloroformo se depositaron en
forma de una fina película en el fondo de un
tubo de ensayo, por evaporación del disolvente
bajo corriente de nitrógeno (g). Las últimas trazas de disolvente se eiiminaran par evaporación
a vacio durante 3-5 horas. Se añadió 1 m1 de
tampóti NaCl 150 mM, EDTA 50 pM, TE9 10
mM pH 7'4, conteniendo ferricióuiuro potásico
0'2 M y la mezcla se agitó en un Vortex-mixer
hasta obtener una suspensión homogénea de liposomas.
Los SUV se prepararon según se describe en
(28). Una suspensión de MLV preparada según
se describió anteriormente se sometió a ultrasonidos en sonicador de sonda MSE, a 12 pm
de amplitud, durante 5 minutos a 4 O C , obteniéndose una suspensión ópticamente transparente. Esta suspensión se centrifugó a 19.000 xg
durante 15 minutos en el rotor SS34 de una
centrífuga refrigerada Sorvall, para eliminar
restos de titanh desprendidos de la sonda y loposomas grandes.
Los LUV se prepai-aron por el mktodo de
dihlisis de detergente (29). 10 pmol de lecitina y
I pmol de dicetitfosfeito se despositaron en el
fondo de un tubo tal y c m o se describió anteriormente. Se añadió 1 m1 de tampón conteniendo octilgiucósido en relación molar 6: 1 con
respecto al fosfoüpicb y se agitó el tubo hasta
que todo el líquido quedó disuelto. El detergente se eliminó por di5ilisis contra 201) ml de
tampón exento de detergente, a 4 O C . El tamp6n se cambió 4 veces a intervalos de 12 hora8
y se añadieron 2 gramos de Bio-beads activados
en el último cambio, prolongándose la dlálisis
hasta obtener una suspensión lechosa de LUV
(aprox. 17 horas).
Todas las preparaciones de liposomas se dejaron estabilizarse un tiempo no menor de 30
minutos a temperatura ambiente antes de ser
utilizadas.
Para la preparación de la minicolumna, se
dejó hinchar Sephdex G-SO (fine) duran& una
noche a 4 O C en el tampón descrito anteriormente. Se situó un pequeño disco de tela de
nylon de poro fino en el fcindo de una jeringa de
insuiina de 1 m1 y la jeringa se llenó con Sephadex hasta obtener un volumen de lecho de
aproximadamente 1 ml. La columna se situó
dentro de un tubo de centrífuga de fondo cónico
y se centrifugó a 1.250 xg durante 4 minutos en
una centnfuga de mesa P-Selecta (radio=lO
cm). para eliminar el exceso de tampón del gel.
La jeringa se transfirió a otro tubo y se aplicaron muestras de 100 pI de la preparación de
liposomas que contenía tanto ferricianuro libre
como encapsulado. La columna se centrifugó
ahora a 1.250 xg durante diferentes tiempos
(apartado RESULTADOS Y DISCUSION)
obteniéndose los eluidos de liposomas libres de
ferricianuro no encapsulado en el fondo del
tubo. El material retenido en la columna se recogió lavando ésta con 100 p1 de tampón sin
liposomas en las mismas condiciones anteriores.
La concentración de ferricianuro se midió a
420.nm, de acuerdo con un coeficiente de extinción molar de 1.040 M-' cm-'. Para medir
el ferricianuro encapsulado en los liposomas se
solubilizaron éstos por adición de Tritón X-100
al 2%.
El fósforo lipídico se determinó de acuerdo al
método de Bartlett (30).
Las microfotografias electrónicas se realizaron por la técnica de tinción negativa con heptamolibdato sobre soporte de Formvar (31) en
un microscopio electrónico Zeiss EM 10.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las preparaciones de liposomas utilizadas en
el presente trabajo se caracterizaron por tkcnicas de microscopía electrónica. La figura 1
muestra una microfotografia obtenida por tinción negativa de MLV, SUV y LUV, que se
usaron para los estudios posteriores. Como se
observa, los MLV presentan múltiples bicapas
concéntricas con un tamaño medio entre 0'2 y
0'3 pm de diámetro. Los SUV obtenidos por
sonicación de MLV presentan una sola bicapa
pero son considerablemente menores que los
MLV, con un diámetro medio de 0.1 pm. La
microscopía electrónica de liposomas por tinción
negativa es muy utilizada para comprobar la
bondad de las preparaciones y debe de ser
siempre un paso previo a la utilización de liposomas en otros estudios.
Para determinar el tiempo óptimo de centrifugación de las minicolumnas se utilizaron
MLV conteniendo ferricianuro encapsulado y
ferricianuro libre y se centrifugaron a 1.250 xg y
diferentes tiempos. Para un tiempo de centrifugación de 4 minutos en el eluido apareció un
máximo en la concentración de fosfolípido que
coincidió con un mínimo en la de ferricianuro
(ferricianuro encapsulado). Cuando estos eluidos se recentrifugaron de nuevo en las mismas
condiciones en una nueva columna, se obtuvo
FIGURAl. Microfotografias electrónicas de diferentes tipos de liposomas, por tinción, negativa con
heptamolibadato. a) MLV (~96000); b) suv
(~195000);c) LUV (~20000).
en el eluido la misma concentración de fosfolípido y de ferricianuro que antes, lo que indica
que en la primera centrifugación todo el ferri-
L m c h u m : melwmspundienpe d fbdciaaun, the, cj@ deduye
Feaca*
y stm ri
cpefiwcantidtid & ~ e M m r oque earrespMe
ti# fmkisnure encapswo. L r d ~~siguieas-eslavado1 de te d m a mi&&tm
dad&Wk @tmo5
kmtras que k e n @ a m r M de fo
centrac* de
va a ~ ~ t a n Cfed0
rricimüm fib*).
Las figuras 3 y 4 mueéltnui las resubdos sbtenidos para SUV y LUV que son prácticamente similme@ia las de&rits para MLV. vacrríuneite;tiwmente, pws cada tZpo
tiene una cwklrrrl de emawulamid@wenie.
El % dd ree~rpewcibnde fbdolfpido ¶b
' e del
orden del %% para el mbtodo de fdtrxih en
gel y M!%%
p$iarkzicenWu@&n iffiniko-
1
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; 2 4 ' m
I
Fraecibn No.
cianuro m encapsulado había sido retirado. &@
los experimentos que siguen todas las prepa*
cianea se cenh%Qpnm a 1.250 x$ durante-4
mihutas a tcmperíatura ambiente.
a.
La f ~ r 2A
a muestra el perfil cromato&
fim para la mtrwi6n m gel (SephaIex G-50)
una prepmcih de MLV c<.~?teniendo
f&c
num pc&b. La f d t ~ a c i hse malizó del m~dgg
canwe-mioartl, en una columna de 1 x 20 cm, %
temperatura atnbtente p con una velocidad &
flujo de 50 rnVhr. La &$usa2B muestra ia.s@&
ración del fPnichm ria eneapsulad&i@@
wtribgación en minicolumna de Sephfox
L mima muestra. Lat% fragcion- si"%%
ad-@%iera GLobft¡vEKn p6r
a lat~&u&raa & lOdll4 de a;amph sin fenicianum g m
wn las m h & s ccodkioes!' En I d
bbtenidw por ambos
métodos se d
corr~@ntracibn
de fosfolipido y la de fenicianuro, aííadiéndose Triton
ZL-W placa-.
el k~rkianui.0eitcapsulmh en íw 4pcwmaa.
E3S b í?&wa32tA ris
rwihpiu~panír
E
F@URA3. SemrwiSn .de ÉQmcium no c n g a y lado en SUV por m&raci6nm @ (A] y r wntnhpdda
en rnhiic01rnna8 at gd
Commhaci6n de Mhni.0;
(
t
dc'-wo.
m). $d---e 1
c-. PConcen-
El volumen encapsulado
lhfk 't&'&@
liposomas se calculó midiendo la cantidad de
femcianuro encapsulado en liposomas, tras sepaar el forficianuro libre p r los dos dtodos.
Dicha cantidad se p u d e trahsfbrmat &v.~ o l u men p u s se ~ Q R W el coeficie~tede e~tidc5n
molar de4 ftrriciaeu~ay la concentw&a a k
que se encuentra el
Lw tabla 1 meskm
dos, expresados en
Fracción! Pls.
.
-
FIQURA
4. Separacibn de femicianuro no encapsu~&W&&II %
gel
h[A) y por osmrikiLIrao m LUV
gacibn m
!de g
d 8). ( o=-+ )
Concentracibn de fenicianuro; (
) Concentracibn de fosfolípido.
lumnas, resultados tan similares que no se decantan a favor ni de uno ni de otro método.
Una de las ventajas fundamentales del método de centrifugación en minicolumnas de gel
es su rapidez. Una filtración en gel puede durar
20 6 25 minutos mientras que la centrifugación
en minicolumnas se realiza en tan sólo 4 minutos. Otro factor muy importante es que en el
metodo de centrifugación en minicolumnas se
pueden procesar varias muestras a la vez
mientras que en la filtración en gel se han de
procesar una tras otra, con lo que esto supone
en cuanto al tiempo necesario.
Un punto decisivo a favor de la centrifugación en minicolumnas es que no hay dilución de
la muestra. Al realizar la filtración en gel de una
muestra de liposomas de 1 m1 el eluido de liposomas tiene un volumen del orden de 5 ml. En
la centrifugación en minicolumnas se pueden
procesar muestras de hasta 25 pI y no hay dilución de las mismas, lo cual es muy importante
cuando se trabaja con muestras biológicas que
son muy dificiles de preparar.
la centrifugación en minicolum&s cmeao. &mica
p a a separar solutos no e t l c a ~ W
en liposomas.
F-ente,
a las ven*
ya ."frmdla#tais
del
metodo de ce?Ntrifligacii$n
en mintcofuehnaa coa
respect9 a Oltms m6todos y en particulw con
respecta a 4 fjltrasi6n qn gel, pQdEpnos b t a car que el mismo as .sr$81:hmeate v W a p w
cualquier tipo Be l i p s ~ m i a s ,
l
q%
' mPO
puestos en el presente trabajo.
El proredbbnto parjrfa expndwss &,sdutos
de n i a y ~ r@JQ nN3leqí'dr utilizado ufi'pi con
el tm&o dkipart16ulaardeguado. Por otra parte
pssibles es, c o m psr
presenta QW
drian ser el estudio t m A l a W n camol de la
captura de sustancias por liposomas, tras la separación rhpida de las mismas que queden libres.
V O L ~ M E N E SENCAPSULADOS PARA
DIFERENTES TIPOS DE LIPOSOMAS,
MEDIDOS TRAS SEPARAR EL FERRZCZANURO
EN GEL Y POR
U B R E POR FZLTRACZ~N
CENTRIFUGACZ~N
EN MZNZCOLUMNAS DE
GEL (SEPHADEX G50 FZNE). EL VOLUMEN
ENCAPSULADO SE EXPRESA EN UTROSImol
DE FoSFOL~PIDO
PROCEDIMIENTO
MLV
LUV
SUV
Filtración en gel 1.25t0.10 2.16t0.15 0.99t0.10
Centrifugación en
minicolumnas
de gel
1.2920.12 2.2410.09 1.06~0.08
Este trabajo se realizó como parte de un
Proyecto de Investigación financiado por la
CAICYT (n.' 3401-83003-01).
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