PRACTICA #3 DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN

PRACTICA #3
DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN MATERIAL VEGETAL
INTRODUCCIÓN
El análisis de algunas de las características físicas y químicas de las grasas y
aceites es necesario ya que de ellas derivan sus propiedades. En los productos
normales permite establecer adulteraciones e identificar productos nuevos. En
análisis de rutina las determinaciones de los índices de yodo, saponificación,
acidez, peróxido y la materia no saponificable, junto con las pruebas
cualitativas para adulteraciones son suficientes para confirmar la identidad y
comestibilidad de la mayoría de las grasas y aceites. Tanto el índice de yodo
como el de refracción indican el contenido de ácidos grasos no saturados; en
estos, el punto de fusión es más bajo que en los ácidos grasos saturados. El
índice de saponificación de una indicación del peso molecular de dichos ácidos;
mientras que el índice de peróxido es indicador del grado de rancidez oxidativa
de las grasas. Algunos de estos índices presentan grandes fluctuaciones en las
diferentes épocas del año. Por ej. la grasa de la leche tiene un 35% de ácido
oleico (índice de yodo 35, aproximadamente); sin embargo, este índice es más
elevado en verano y más bajo en invierno, según ha sido determinado en
países que poseen estaciones.
La determinación de ácidos grasos en aceites vegetales consiste en la
extracción del aceite de las semillas que se deseen analizar, por extracción
Soxhlet y su posterior análisis por cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas (CG/EM), es importante mencionar que previo al
análisis por CG/EM el extracto graso debe ser esterificado, para optimizar la
resolución y/o identificación de loa analitos de interés.
OBJETIVOS
El alumno comprenderá los siguientes conceptos:
 Extracción del aceite en semillas por el método Soxhlet.
 Determinación de porcentaje de aceite en material vegetal.
 Esterificación de una aceite de origen vegetal.
 Estándar interno.
 Determinación de áreas en un cromatograma.
 Comparación de patrones de fragmentación de las moléculas de ácidos
grasos.
 Aplicación de una curva de calibración en la cuantificación de ácidos
grasos en aceite vegetal.
 Análisis de un perfil de ácidos grasos de un aceite vegetal con los
perfiles obtenidos en trabajos publicados por otros autores.
MATERIALES Y REACTIVOS
Equipo de extracción Soxhlet
Mortero
Vasos de precipitado
Pipetas de 5 y 10 mL
Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g
Tubos de ensaye
Matraz aforado de 100 mL
Cartuchos para extracción Soxhlet
Viales para cromatografía
Hexano
Perlas de ebullición
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra
Pesar 2 g de la muestra que desee extraer (semillas).
A las semillas, se les debe retirar la cascarilla y triturarlas en un mortero para
obtener una mayor superficie de contacto.
Las semillas peladas y trituradas son vertidas en un cartucho (dedal) para
extracción en equipo Soxhlet.
Extracción del aceite
Se agregan aproximadamente 150 mL de hexano por la abertura de
refrigerante, garantizando que el volumen sea necesario para mantener la
recirculación del solvente por equipo de extracción.
El tiempo de extracción puede variar desde 4 h a velocidad de condensación
de 5 a 6 gotas por segundo, hasta 16 h, 2 a 3 gotas por segundo. Recuperar el
éter y evaporar el éter residual sobre baño maría en lugar bien ventilado, secar
el residuo a 100°C durante 30 minutos, enfriar en desecador y pesar.
Una vez terminado el proceso de extracción se elimina el exceso de solvente
colocando el matraz a baño maría.
El aceite recuperado se pesa para realizar los cálculos correspondientes.
La identificación de los ácidos grasos se llevara a cabo mediante cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas, para ello el extracto debe ser
esterificado para una mejor resolución cromatográfica. El procedimiento para la
esterificación de los ácidos grasos se describe a continuación.
Esterificación de ácidos grasos
1. Se pesan 0.2 g de aceite
2. Se disuelven en 4 mL de hexano y se agita hasta que se disuelva la
grasa.
3. Se adicionan 0.2 mL de una solución 2 M de KOH (en metanol)
4. Se agita para favorecer la reacción y se deja reposar durante 30 min
5. Se observa en los tubos la aparición de glicerina ocasionada por la
reacción con la solución de KOH con metanol, debido a esto los tubos se
centrifugan a una velocidad de 2000 rpm por 5 minutos, tiempo para
obtener una clarificación debido a la precipitación de la glicerina.
Análisis por CG/EM
Antes de ser analizado por CG/EM se adiciona al extracto un volumen de una
solución de estándar interno (trifenilamina) tal, que se obtenga una
concentración final de 1 ngµL-1.
Del extracto esterificado se inyecta 1 µL en el equipo con las condiciones
cromatográficas siguientes:
Cromatógrafo de gases CLARUS 680 (Perkin Elmer) acoplado a un
espectrómetro de masas CLARUS SQ8T de la misma firma, con una columna
capilar (AB5-MS de 30 m x 0.25mm ID, df 0.25 µm) y el siguiente programa de
temperaturas: temperatura inicial de 180°C, 15 min a esa temperatura y una
segunda rampa de 10 °min-1 hasta 280 °C.
Análisis de resultados
1. Determinación de áreas de los picos de ácidos grasos y el estándar
interno en una curva de calibración previamente preparada.
2. Elaboración de una gráfica de concentración contra relación de área, la
relación de área se obtiene al dividir el área del pico del ácido graso
entre el área del pico del estándar interno.
3. Obtención de la ecuación de la curva y coeficiente de correlación.
El análisis por cromatografía de gases del extracto se lleva a cabo de la
siguiente manera:
1. Se buscan los esteres de ácidos grasos que hayan sido detectados en el
equipo de CG/EM mediante el rastreo de las siguientes masas: 74,87 y
143.
2. Posteriormente se analiza el espectro de masas de cada uno de los
picos detectados en el cromatograma para determinar a qué ácido graso
corresponde cada uno de ellos.
3. Después de haber sido identificados los tiempos de retención, se
procede con la determinación del área de cada uno de los picos.
4. Se determina también el área del estándar interno (245 para la
trifenilamina) para poder calcular la relación de área de los analitos
detectados.
5. La concentración de analíto se determina en base a una curva de
calibración que se le suministrará.
Reporte de resultados
Reportar la concentración de ácidos grasos en mgg-1 de aceite, mgKg-1 de
semillas.
Graficar las concentraciones de cada uno de los ácidos grasos y comparar el
perfil del aceite analizado con el perfil reportado por otros autores.