Técnicas de caracterización de suelos y abonos orgánicos Cipriano García Gutiérrez Jaime Alberto Félix Herrán Presentación Esta obra es una compilación de métodos para el análisis físico, Primera edición: Fundación Produce Sinaloa, A.C., 2014 D. R. © 2014 Cipriano García Gutiérrez Jaime Alberto Félix Herrán D. R. © 2014 Fundación Produce Sinaloa, A.C. Gral. Juan Carrasco, núm. 787 norte, Culiacán, Sinaloa, C. P. 80000 www.fps.org.mx [email protected] Tel. (667) 7120216 y 7120246 Colección: Tecnologías para el productor ISBN Prohibida la reproducción parcial o total de la presente publicación por cualquier medio, sin la previa autorización por escrito de los propietarios de los derechos reservados. Editado y hecho en México químico, microbiológico y molecular de suelos y abonos orgánicos. La intención principal es proveer a investigadores, estudiantes y técnicos, el acceso a técnicas básicas para la caracterización de suelos y abonos orgánicos, ya que la información contenida en los diferentes capítulos es de utilidad para profesionales que trabajan en campos como la ecología, agronomía, microbiología, biología y geología. Los análisis incluidos actualmente pueden efectuarse con diferentes equipos de manera automatizada; no obstante, las técnicas básicas que aquí se presentan son realizables con equipo y materiales de bajo costo en un laboratorio común. Los métodos incluidos son fácilmente reproducibles, y las técnicas son relativamente sencillas de realizar por profesionales con conocimientos teóricos básicos de suelos y abonos orgánicos. También se incluyen métodos que requieren experiencia en el manejo de técnicas, conocimientos más profundos y equipo moderno. Contiene además sugerencias para orientar al usuario en la interpretación de los resultados que se obtengan a partir de estos análisis. Confiamos en que la obra sea de utilidad a profesionales y técnicos que se desempeñan en el manejo de suelos, así como a los productores interesados en la conservación y el aprovechamiento de suelos de uso agrícola, para mejorar la producción en los cultivos de hortalizas, granos y frutales. Cipriano García Gutiérrez Jaime Alberto Félix Herrán Índice Pág. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y ORGÁNICA 11 DE SUELOS Y ABONOS ORGÁNICOS MUESTREO Y ANÁLISIS DE SUELO Y ABONO ORGÁNICOS SÓLIDOS 11 Muestreo de suelos 6 Preparación de muestras de suelo para su análisis 12 PROPIEDADES FÍSICAS DE SUELOS Y ABONOS ORGÁNICOS SÓLIDOS 18 Capacidad de retención de agua Contenido de humedad 19 20 Textura del suelo 21 PROPIEDADES QUÍMICAS DE SUELOS Y ABONOS ORGÁNICOS SÓLIDOS 25 pH 25 Conductividad eléctrica Nitrógeno inorgánico (Kjeldahl) Fósforo extraíble por el método Olsen Fósforo extraíble por el método Bray y Kurtz modificado Capacidad de intercambio catiónico (K+, Na+, Mg+2 y Ca+2). 27 28 31 PROPIEDADES ORGÁNICAS DEL SUELO Y ABONOS ORGÁNICOS SÓLIDOS Contenido de materia orgánica Relación C/N y % de S Contenido de ácidos húmicos, fúlvicos y carbono orgánico de suelos y abonos orgánicos sólidos 35 39 50 50 53 56 7 8 Medición de la tasa de respiración de la biomasa microbiana en suelos y abonos orgánicos sólidos. 60 Determinación del CH4 y N2O liberados por la microflora del suelo y la degradación aerobia de la materia orgánica 63 Bibliografía 67 TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA, BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR PARA EL ANÁLISIS DE SUELOS Y ABONOS ORGÁNICOS 73 BIOMASA MICROBIANA DE SUELOS Y ABONOS ORGÁNICOS SÓLIDOS 73 Determinación de Carbono de la biomasa microbiana del suelo y de un abono orgánico por el método de fumigación-incubación. Determinación de Carbono de la biomasa microbiana del suelo y de un abono orgánico por el método de fumigación- extracción. Cuantificación de nitrógeno inorgánico ( NO 2 3, Extracción de esporas de Hongos MicorrícicoArbusculares de suelo Clarificación-tinción de raíces y estimación de la colonización radical por hongos micorrícicoarbusculares Determinación de la proteína inmunoreactiva (Glomalina) por ELISA 112 113 113 115 121 Técnicas de biología molecular 125 Extracción de DNA total del suelo 125 74 Purificación del DNA total por electroforesis en gel de agarosa 127 80 Extracción de RNA de suelo Amplificación del DNA por reacción en cadena de la polimerasa Amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPDs) 84 4) NO y NH Determinación de la actividad de la deshidrogenasa EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS DE SUELOS Y ABONOS ORGÁNICOS SÓLIDOS Método común de siembra microbiológica Cuenta viable de bacterias totales Cuenta viable de actinomicetos Cuenta viable de propágulos de hongos Cuenta viable de levaduras Medio para grupos fisiológicos Método para solubilizadores de fósforo Método para fijadores de nitrógeno Información del análisis Ensayo in vitro de actividad supresiva contra fitopatógenos Hongos Micorrícico-Arbusculares 92 94 95 96 100 102 103 106 107 108 111 Análisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción Análisis de diversidad genética de la comunidad microbiana en suelo por electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante PCR-DGGE Glosario de unidades Bibliografía 129 130 132 134 136 139 141 9 Jaime Alberto Félix Herrán1 Cipriano García Gutierréz2 Adolfo Dagoberto Armenta Bojórquez3 10 Muestreo y análisis de suelo y abono orgánico sólido La interpretación de los resultados obtenidos del análisis de muestras de suelo o abonos es más completa cuando cuenta con información del sitio de muestreo: topografía, tamaño y tipo de partícula, cobertura vegetal, productividad, material parental y análisis químicos previos, así como antecedentes sobre el manejo del sitio, presencia animal, temperatura media, precipitación pluvial, materia orgánica, pH del suelo, entre otras. El muestreo de suelos y abonos orgánicos sólidos tiene como objetivo obtener una muestra representativa cuya composición puede usarse para caracterizar un sitio con respecto a la variable medida que pueda ser tratada estadísticamente. Mediante este proceso la heterogeneidad de estos parámetros del suelo pueden ser estimados en su valor promedio, colectando un determinado número de muestras simples o submuestras para obtener una muestra compuesta. 1 Profesor de los programas educativos de Ingeniería Forestal e Ingeniería en Desarrollo Sustentable de la Universidad Autónoma Indígena de México. Benito Juárez No. 39, Mochicahui, El Fuerte, Sinaloa. C. P. 81890. E-mail: [email protected] 2 Profesor investigador del departamento de biotecnología agrícola CIIDIR (COFAA) IPN Unidad Sinaloa. Juan de Dios Bátiz Paredes No. 250, Guasave, Sinaloa. C.P. 81049, E-mail: [email protected] 3 Profesor investigador del departamento de biotecnología agrícola CIIDIR (COFAA) IPN Unidad Sinaloa. Juan de Dios Bátiz Paredes No. 250, Guasave, Sinaloa. C.P. 81049, E-mail: [email protected] 11 Para muestras de suelo que serán utilizadas para análisis químicos se recomienda que se congelen o sequen lo antes posible. Para análisis microbiológicos se recomienda analizar la muestra lo más pronto posible, o bien se pueden almacenar las muestras de suelo húmedo a temperatura ambiente o a 4 °C cuando no se puede analizar inmediatamente. El análisis de suelo con fines de fertilidad inicia con la toma de muestra, la cual debe ser representativa del suelo en estudio. Si la muestra no es representativa de lo que hay en el campo, los resultados carecerán de importancia. El mayor riesgo de error en el análisis de suelo está en la toma de la muestra, por lo que es necesario tomar en cuenta los siguientes aspectos: 12 Época de muestreo La época de muestreo y la mejor fecha para la toma de muestra es después de cosechar y antes del siguiente ciclo agrícola. Para realizar el muestreo se requieren los siguientes materiales: • Una barrena de cilindro cerrado o pala recta. La herramienta debe garantizar que la muestra obtenida tenga el mismo volumen en espesor y profundidad, de un tamaño suficiente que facilite y permita la formación de las muestras compuestas, que sea fácil de limpiar, resistente al desgaste, útil en suelos arenosos secos y en arcillosos húmedos, y que no contamine las muestras con impurezas. • La barrena debe ser fácil de manejar y permitir rápidez en el muestreo. • Bolsas de plástico transparente con capacidad para 2 kg de suelo. • Marcadores de tinta indeleble. • Libreta de notas y bolígrafo. • Plano, mapa o fotografía aérea de la zona de muestreo. Delimitación de área Es necesario evitar el exceso de superficie en la unidad de muestreo. Algunos estudios indican que dependiendo de su homogeneidad no debería ser de más de 20 ha. Incluso en suelos considerados relativamente homogéneos es recomendable disminuir a 10 ha la unidad de muestreo. En general se puede decir que mientras mayor superficie considere la unidad de muestreo, menor será la representatividad del análisis de suelos. Antes de iniciar el muestreo es importante: dividir el terreno, cuando sea necesario por su diferencia en contenido de sales, cultivo anterior, manejo, pendiente drenaje, color, textura, entre otros, se deben omitir pequeñas áreas no representativas que antes de ser terreno de cultivo tuvieron otro uso como corrales, basureros y construcciones. Para la toma de muestra en el campo se indican las siguientes instrucciones: a)En una hoja trazar un plano de terreno y colindancias, con el fin de saber exactamente la localización del área muestreada. b)Localizar y situar los puntos de muestreo del terreno en el interior del plano previamente trazado. Esto es para que la persona pueda localizar y efectuar las indicaciones que en el laboratorio se le recomienden para cada muestra. 13 Toma de submuestras Las técnicas aprobadas para tomar muestras representativas de un área son varias y el uso de una técnica o de otra dependerá del criterio de la persona que realice dicho muestreo, las técnicas más usuales son: muestreo en zig-zag y muestreo en esquinas y el centro. Este tipo de muestreo se realiza solo en terrenos homogéneos se recomienda tomar un mínimo de veinte submuestras por muestra de suelo en 10 ha. Para muestrear el terreno en caso de haber muchos residuos orgánicos, se limpia la superficie con la pala para retirar estos residuos y con ello evitar errores en las determinaciones químicas. En cuanto al procedimiento de muestreo es recomendable no tomar muestras cercanas a las orillas del predio donde suele haber exceso o falta de fertilización, debido a las vueltas y operación de la maquinaria en tales sitios. Se recomienda retirarse de las orillas del predio al menos 20 m, así como de árboles, cercos o sitios inusuales. Las submuestras normalmente se colocan en una cubeta de plástico marcada con la profundidad de muestreo, cuando se toman muestras de más de un estrato. 14 Profundidad de muestreo a)La profundidad del muestreo se determina en función del objetivo que se persigue. b)Cuando el muestreo es para evaluar la fertilidad de los suelos se puede hacer a la profundidad de máxima exploración radical del cultivo en. Sin embargo, en la mayoría de los cultivos anuales se recomienda realizarlo a una profundidad entre 0–20 o 0–30 cm. c)En el muestreo de suelos con pastos o prados se sugiere hacer un muestreo a una profundidad entre 5–10 cm. d)En frutales la recomendación es hacer un muestreo a intervalos de 30 cm hasta el sitio de máxima densidad de raíces. e)En el caso de suelos con sales, el muestreo se realiza a la profundidad donde germina la semilla, que es entre 0 y 5 cm. f)Para determinar la actividad microbiana del suelo, el muestreo se realiza en los primeros 10 cm. g)Es importante señalar que las profundidades a las que se ha hecho referencia, comienzan a contar después de haber removido los residuos orgánicos no descompuestos. Es importante la profundidad de muestreo deba contemplar todo el perfil de suelo señalado, debido a que las propiedades de los suelos cambian considerablemente a pequeñas profundidades. Muestra compuesta a)La homogeneización de las submuestras debe realizarse dentro de una cubeta o tina de plástico con capacidad para 30 kg de suelo, evitando la contaminación con otros materiales. b)El mezclado dentro de la cubeta o tina de plástico se realiza con una pala de aluminio o de acero inoxidable, generalmente es suficiente mezclar con las manos. c)Después del mezclado de las muestras, estas se vacían sobre una superficie limpia y se forma una torta circular, la cual se divide en cuatro partes iguales, de las cuales se desechan dos cuartos opuestos y con los dos restantes se repite el proceso de mezclado. d)Repetir el proceso tantas veces como sea necesario, hasta que la muestra final tenga un peso de 1.5 kg. e)La homogeneización de las submuestras puede realizarse en campo cuando se tienen muchas submuestras, o en el laboratorio si la cantidad de submuestras es pequeña. Información del análisis Debe incluir: 1.Nombre del productor o interesado. 2.Lugar donde fue colectada la muestra (poblado más cercano), si fuera posible sobre un plano o mapa referenciado. 3.Nombre del cultivo anterior y cultivo a establecer y el motivo del muestreo. 4.Fecha de colecta de la prueba. 5.Fuente de agua y fertilización anterior. Comentarios 1.Es importante conocer más acerca de la historia del terreno a muestrear y del cultivo, datos como fórmula de fertilización edáfica o foliar, dosis aplicadas, época de aplicación, manejo en general del suelo y del cultivo, rendimientos promedios del cultivo y características climáticas y de relieve de la región. Cuando esta información se obtiene previa al muestreo, es de gran utilidad para definir las unidades de muestreo. 2.Se debe cuidar que los materiales y herramientas utilizados en el muestreo no adicionen sustancias o elementos extraños que puedan aumentar la concentración de algún nutrimento en la muestra o que los sustraigan. Preparación de muestras de suelo para su análisis Este método de preparación de muestras de suelo tiene el propósito de caracterizarlo y/o almacenarlo para su análisis posterior. Una vez obtenida la muestra de suelo debe ser llevada al laboratorio en donde deberá ser preparada, para luego someterla a los procesos de análisis correspondientes. La preparación de la muestra es tan importante como el muestreo y análisis de la misma, ya que los errores cometidos pueden invalidar el resultado del análisis químico. La preparación de la muestra de suelo incluye el traslado, recepción, registro, secado, molienda, tamizado, homogeneizado, y el almacenamiento para su conservación. Con el propósito de evitar la contaminación de la muestra de suelo y asegurar mayor precisión y exactitud en el resultado del análisis, esta operación se debe realizar en un lugar especial y limpio. 15 • Etiquetas • Hojas de plástico de 40 x 70 cm • Mazo de madera • Cilindro de madera • Libreta de registro • Tamices de acero inoxidable de malla <2 mm • Frascos de vidrio de 1 L (Litro) o cajas de cartón de 2 kg de capacidad 16 Traslado de la muestra al laboratorio a.Una vez obtenida la muestra en el campo, esta debe ser cuidadosamente mezclada y las partículas más grandes reducidas de tamaño. b.Cada muestra debe ir acompañada de una identificación donde se indique claramente su procedencia, nombre del interesado, profundidad de colecta, relieve, cultivo, historial de fertilización, aplicación de mejoradores, así como las determinaciones requeridas, según el propósito del estudio. c.Durante el traslado es necesario evitar el efecto de factores como la humedad exterior, O2, CO2, luz, calor y otros materiales que puedan cambiar la naturaleza de la muestra. d.Se debe evitar manejar la muestra con materiales que puedan contaminarla, por ejemplo recipientes que se oxiden y cintas adhesivas, entre otros. Recepción y registro a.Cuando llegan las muestras al laboratorio deberán registrarse con la identificación de campo y una lista de las determinaciones requeridas, incluyendo los métodos. b.La identificación de campo de la muestra debe incluir los siguientes datos: nombre del interesado, procedencia, fecha del muestreo, número de muestras o submuestras, profundidad de colecta, pendiente del terreno, manejo del terreno, entre otros. c.El laboratorio asignará un número de registro a cada muestra, el cual se sugiere hacer con números seriados para facilitar el manejo interno. Secado a.El secado se realiza con el propósito de facilitar el manejo de la muestra, mejorar la homogeneización y disminuir los cambios químicos indeseables. b.Las muestras de suelo se secarán al ambiente. c.El secado debe realizarse extendiendo la muestra de suelo sobre una superficie que no contamine. Puede secarse sobre charolas de plástico, vidrio, aluminio, fibra de vidrio o sobre una superficie de polietileno o papel. d.La muestra debe extenderse logrando un espesor inferior a 2.5 cm, colocarse a la sombra a una temperatura no mayor a 35 °C y una humedad relativa entre 30 y 70%. Molienda a.Para realizar la molienda deben retirarse, las rocas y el material orgánico visible. b.La molienda se realiza con un mazo de madera o con un molino para suelos. Tamizado a.El suelo molido se hace pasar por un tamiz con aberturas de 2 mm de diámetro (malla 10) de acero inoxidable. Este grado de fineza es conveniente para la mayoría de los análisis requeridos con el propósito de diagnosticar el estado del suelo. b.Una vez tamizado el material se separan 1.5 kg de suelo, cantidad suficiente para realizar las determinaciones químicas y físicas que permitirán caracterizar el suelo desde el punto de vista de su fertilidad. Homogeneizado a.Este paso es necesario para evitar sesgo en la selección de la submuestra que va a ser destinada para las determinaciones analíticas. b.El homogeneizado puede lograrse utilizando bolsas de plástico (pueden ser las mismas donde estaban originalmente las muestras), haciendo girar la muestra en todas direcciones. Pesaje a.Una vez tamizada y homogeneizada la muestra de suelo, se extrae la submuestra que va a ser utilizada para cada una de las 17 18 determinaciones analíticas. b.Esto debe realizarse con espátulas y con la ayuda de pinceles de pelo de camello para limpiar completamente la espátula. c.La submuestra extraída debe ser pesada con balanza de precisión, de preferencia con aproximación de ± 0.1%. profundo, para fracturar las capas más resistentes a fin de mejorar las condiciones para el desarrollo de las raíces, pero no es fácil cambiar características físicas como la textura, el color y las relacionadas con las características del perfil. Almacenamiento a.Una vez que las determinaciones analíticas han sido realizadas, las muestras deben almacenarse para posteriores comprobaciones u otros usos. Para esto pueden ser utilizados los frascos de vidrio o de plástico perfectamente cerrados, para disminuir los cambios químicos. b.Los recipientes deben permanecer herméticamente cerrados y debidamente etiquetados. Para esto se recomienda conservar el número de registro en el laboratorio. c.La muestra almacenada puede sufrir cambios lo cual debe tomarse en cuenta para usos posteriores. En todo caso, es conveniente especificar si los resultados analíticos provienen de muestras recientes o con cierto tiempo de almacenamiento. La determinación de la capacidad de retención de agua (CRA) es un modelo de base física ampliamente utilizado por los investigadores, ingenieros y técnicos para estimar la disponibilidad de agua para las plantas y la calidad del suelo. Propiedades físicas de suelos y abonos orgánicos sólidos Las propiedades físicas del suelo, determinan principalmente la rigidez, la permeabilidad, la facilidad de penetración de las raíces, retención de humedad y resistencia al laboreo. Es necesario conocer las propiedades físicas del suelo para entender como influyen estas en el desarrollo de las plantas, y estas propiedades están estrechamente relacionadas con las propiedades químicas y las biológicas, aunque las propiedades físicas pueden contribuir a compensar las propiedades químicas o biológicas deficientes, la productividad del suelo no depende solamente de las características físicas. Las propiedades físicas de un suelo se alteran con menor facilidad durante el manejo del mismo que sus propiedades químicas. Sin embargo, la estructura y porosidad del suelo pueden alterarse en determinadas condiciones de manejo. En los suelos inundados, el agricultor puede provocar cambios en propiedades indirectas como son la humedad, la aireación y la temperatura del suelo. El drenaje también puede aumentar la profundidad efectiva del arraigo radical. A menudo se utilizan técnicas de labranza como el arado Materiales y métodos • Frasco de vidrio de 250 mL • Estufa con circulación forzada de aire y temperatura controlada • Balanza con aproximación de 0.01 g • Pinzas • Desecador • Piseta • Papel filtro • Embudo Procedimiento Para determinar la CRA de un suelo o abono orgánico sólido, la cantidad de agua retenida por unidad de suelo seco, se puede seguir el siguiente procedimiento. 1.Pesar 10 g de muestra por triplicado y secarlo a 105 °C durante 48 h (horas). 2.Se deja enfriar y se pesa nuevamente (A). La diferencia de peso entre peso inicial y peso seco nos indica la humedad relativa de la muestra. 3.Por otro lado, se corta un papel filtro el cual se coloca en un embudo. Se humedece el papel y se pesa el embudo con el papel (B). 4.Posteriormente se pone la muestra sobre el papel filtro humedecido. 5.Por último se agrega agua lentamente para saturar la muestra y el excedente de agua se drena. 6.Una vez drenada el agua se pesa nuevamente la muestra húmeda más el papel y embudo (C). 19 7.La fórmula para el cálculo de la CRA (en % p/p) es: CRA % = C B A 100 10 g A= peso seco B= peso del embudo + papel filtro húmedo C= peso embudo + papel filtro + muestra húmeda 20 Interpretación de resultados La CRA de un suelo o abono orgánico sólido indica la capacidad que tiene de retener agua, a lo que también se le conoce como capacidad de campo, estando relacionada con el contenido de humedad del mismo. Es recomendable que sea alta, para que pueda ser reservorio de agua para la planta y funciones metabólicas de los microorganismos nativos. La CRA es importante cuando se va a establecer un experimento, por ejemplo en la determinación de la tasa de respiración de un suelo o abono orgánico sólido, y también en la determinación de biomasa microbiana del suelo. El método gravimétrico para la determinación de humedad de los suelos, sean estos orgánicos o minerales. El método se basa en la medición o determinación de la cantidad de agua expresada en g (gramos) que contiene una muestra de suelo. Esta masa de agua se referencia de la masa de suelo seco de la muestra. La determinación de la masa de agua se realiza por la diferencia en peso entre la masa de suelo húmedo y la masa de suelo seco. Se considera como suelo seco al secado en la estufa a 105 °C, hasta obtener un peso constante. Materiales y métodos • Botes de aluminio para humedad • Estufa con circulación forzada de aire y temperatura controlada • Balanza con aproximación de 0.01 g • Pinzas • Desecador Procedimiento Para determinar el contenido de humedad de un suelo o abono orgánico sólido, o cantidad de agua presente por unidad de suelo seco, se sigue el siguiente procedimiento: 1.Para determinar el contenido de agua expresado como porcentaje de humedad. Se pesan 20 g de la muestra (Psh) en un bote de aluminio de peso conocido (PB). 2.La muestra en el bote se coloca en un horno a 105 °C por 24 h. 3.Los botes se dejan enfriar en un desecador, registrando el peso (PB + PSS). 4.Para calcular el contenido de humedad (% p/p) en relación a suelo seco se usa la siguiente fórmula: %H= PB Psh PB Pss 100 PB Pss PB PB= Peso del bote con tapa (g). Psh = Peso de la muestra húmeda (g). Pss = Peso de la muestra seca (g). La textura del suelo se define como la proporción relativa de arena, limo y arcilla presente en una muestra. Da una idea general de las propiedades físicas del suelo. Su determinación es rápida y aproximada. En general el problema más común es separar los agregados y analizar solo las partículas. En el presente método se elimina la agregación debida a la materia orgánica y la floculación por los cationes calcio y magnesio. No se eliminan otros cementantes como carbonatos. El tiempo de lectura es de 40 s (segundos) para la separación de partículas mayores de 0.05 mm (arena) y de 2 h para partículas de diámetro mayores de 0.002 mm (limo y arena). Estos límites han sido establecidos por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés) y se han usado para construir el triángulo de texturas. A continuación se detalla el método para la determinación de la textura del suelo por el procedimiento de Bouyoucos. 21 Materiales y métodos • Hidrómetro de Bouyoucos con escala de 0–60 • Probetas de 1000 mL • Cilindro de Bouyoucos • Agitador con motor para dispersión • Agitador magnético • Termómetro de -10–110 °C • Piseta Reactivos Tomar 208.3 mL de peróxido de hidrógeno o si es sólido pesar 300 g de peróxido de hidrógeno y aforar a 1 L (Litro) con agua destilada. Este reactivo se utiliza cuando la muestra de suelo presenta alto contenido de materia orgánica. 22 Pueden utilizarse cualquiera de los siguientes dispersantes de suelo Disolver 30 g de oxalato de sodio en 1 L de agua destilada. Disolver 50 g de metasilicato de sodio en 1 L de agua destilada, ajustar la solución hasta que se obtenga una lectura de 36 g/cm3 con el hidrómetro. Disolver 50 g de (Na3PO3)6 en agua destilada y aforar a 1 L. Procedimiento 1.Pesar 60 g de suelo de aspecto fino o 120 g de suelo de aspecto grueso en un vaso de precipitados de 500 mL, agregar 40 mL de agua oxigenada y dejar que se evapore hasta sequedad, agregar otros 40 mL y observar la reacción. Evaporar nuevamente a sequedad. Repetir hasta que no haya efervescencia al agua oxigenada. 2.En general dos veces son suficientes para la mayoría de los suelos. Después de eliminar la materia orgánica y llevar a sequedad del suelo, pesar 50 g si es suelo de textura arcillosa o 100 g si es suelo de textura arenosa y ponerlos en un vaso de precipitado de 250 mL. Adicionar agua destilada hasta cubrir la superficie con una lámina de 2 cm. Agregar 5 mL de oxalato de sodio y 5 mL de metasilicato de sodio y dejar reposar durante 15 min. Si el suelo tiene mucha arcilla puede prolongarse el tiempo hasta 30 min. 3.Pasar las muestras de los vasos de precipitado al recipiente del agitador mecánico, pasando todo el material con la ayuda de una piseta. Activar el agitador a velocidad alta y dispersar por 5 min. Al finalizar el tiempo de agitación, bajar la copa del dispersor y pasar el contenido a una probeta de 1000 mL o al cilindro de Bouyoucos, enjuagando la copa con una Piseta. 4.Con el hidrómetro dentro de la suspensión, agregar agua destilada hasta completar 1 L en el caso de la probeta y si utiliza el cilindro de Bouyoucos llevar a la marca inferior (1113 mL). Sacar el hidrómetro y suspender el suelo con un agitador de mano operando durante un minuto. 5.Tomar las lecturas del hidrómetro a los 40 s (segundos) y después de 2 h de terminada la dispersión con el agitador de mano. 6.Para hacer una lectura, colocar el hidrómetro dentro de la probeta 20 s antes del momento de la determinación, cuidando de alterar lo menos posible la suspensión. Después de hacer la lectura se saca el hidrómetro, se lava, se seca y se toma la temperatura. Si, por alguna razón al hacer la lectura se acumula espuma alrededor del hidrómetro, agregar unas gotas de alcohol etílico al 97%. Cálculos Corregir las lecturas del hidrómetro agregando 0.36 por cada °C arriba de 19.5 °C restando la misma cantidad por cada °C debajo de dicha temperatura (Cuadro 1). Si la muestra de suelo es de 50 g, la lectura a los 40 s, multiplicada por 2, es igual al % de arcilla más limo. Restando del 100% se obtiene el % de arena. La lectura obtenida a las 2 h multiplicada por 2 es igual al % de arcilla. El % de limo se obtiene por diferencia. Cuando se usan 100 g de muestra no debe multiplicarse por 2, ya que el hidrómetro está calibrado considerando 100 g de suelo. Con los % de limo, arena y arcilla se determina la textura correspondiente con el triángulo de texturas (Figura 1). 23 Cuadro 1. Corrección de lectura del hidrómetro para la determinación de textura de suelos. Temp. °C 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 24 Corrección - 1.62 1.44 1.26 1.08 0.90 0.72 0.54 0.36 0.18 0 0.18 0.36 0.54 Temp. °C 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 Corrección + + + + + + + + + + + + + + Figura 1. Triángulo de texturas. 0.18 0.90 1.08 1.26 1.44 1.62 1.80 1.98 2.15 2.34 2.52 2.70 2.858 3.06 Propiedades químicas de suelos y abonos orgánicos sólidos El suelo es una estructura dinámica formada por materiales orgánicos y minerales que se encuentra en constante cambio por los procesos físicos, químicos y biológicos que en el ocurren. La química del suelo es una de las ramas que estudia las condiciones químicas o bioquímicas por ejemplo los procesos de adsorción, intercambio iónico y quelación, al igual que el estudio de la estructura, composición y funciones del humus (materia orgánica humificada) que están relacionadas con el crecimiento de las plantas. El estudio de las fracciones coloidales, inorgánicas, orgánicas o mixtas. Los procesos químicos dirigidos a modificar las condiciones naturales de los suelos para lograr una mayor producción vegetal, y en los que están involucrados aspectos como el pH y la fertilización. El conocimiento de la dinámica química de los elementos esenciales para las plantas y sus interrelaciones. Los procesos químicos y biológicos que se desarrollan en el suelo, son aspectos en cuyo conjunto pueden incluirse derivaciones de importancia para el estudio del mismo. En esta sección se explicará la metodología para las siguientes determinaciones: pH, nitrógeno inorgánico por el método Kjeldahl, fósforo extraíble por el método Olsen, fósforo extraíble por el método Bray y Kurtz modificado, y la capacidad de intercambio catiónico. La acidez afecta la disponibilidad de nutrimentos en el suelo dependiendo del tipo de microorganismos que habitan en los sustratos. Si el pH es alto (de neutro a alcalino, entre 7 y 8) y el contenido de nitrógeno es alto (relación C/N baja entre 10 y 15) las bacterias y actinomicetos tendrán un desarrollo más favorable; y para los hongos es favorable el pH bajo (entre 5 y 6) y bajo contenido de nitrógeno (alta relación C/N más de 50). Muchos nutrimentos tienden a ser menos disponibles a pH de 7.5–8.0, ejemplos de esto son Fe++, Mn++ y Zn++, por el contrario la disponibilidad de molibdeno es mayor a pH alcalino, el fósforo no es soluble en el suelo, pero a pH 6.5 su disponibilidad es alta. Esta medición se basa en la determinación de la actividad del ión + H mediante el uso de un electrodo cuya membrana es sensitiva al pH. En el caso de los suelos y composts el pH se mide de la suspensión sobrenadante de una mezcla de relación muestra: agua (1:2). 25 26 Materiales y métodos Los reactivos utilizados en esta determinación deben ser grado analítico y el agua utilizada en la precipitación de las soluciones debe ser destilada o desionizada. • Agua destilada • Soluciones reguladoras de referencia, pH 4.00, 7.00 y 10.00, las cuales se adquieren preparadas o concentradas para diluirse de acuerdo a la instrucción. Estas soluciones deben estar a temperatura ambiente al momento de calibrar el medidor de pH. • Potenciómetro o medidor de pH equipado con electrodo de vidrio en combinación con electrodo de referencia. • Balanza con 0.1 g de sensibilidad. • Frascos de vidrio o plástico transparente de boca ancha con capacidad de 50 a 100 mL. • Pipeta volumétrica de 20 mL. • Varilla de vidrio que sirva como agitador manual. • Piseta. • Cinta métrica. Procedimiento 1.Se pesan 10 g de muestra y se le agregan 20 mL de agua destilada. 2.Se agita manualmente durante 30 min y se deja en reposo por tres horas. 3.Se calibra el potenciómetro a pH 4.0 y 7.0 o bien a 7.0 y 10.0 dependiendo si medirá acidez o alcalinidad. 4.Introduzca el electrodo en el sobrenadante y registre el pH medido. Interpretación de resultados En el Cuadro 2 se observa la clasificación del suelo en cuanto a su valor de pH. Cuadro 2. Clasificación del suelo según su pH. Clasificación Fuertemente ácido Moderadamente ácido Neutro Medianamente alcalino Fuertemente alcalino pH <5.0 5.1-6.5 6.6-7.3 7.4 - 8.5 > 8.5 La conductividad eléctrica de una muestra de suelo o abono orgánico se mide del extracto de pasta saturada. El término extracto de saturación se usa en este método para designar al extracto acuoso que se obtiene por filtración al vacío de una pasta de suelo saturada hecha con agua destilada. El término sales solubles del suelo se usa para referirnos a los constituyentes inorgánicos del suelo que son apreciablemente solubles en el agua. La conductividad eléctrica del extracto de pasta saturada es uno de los índices más difundidos para evaluar la concentración salina del suelo a nivel de laboratorio. Se puede emplear en suelos con diferente grado de salinidad, en caso de que el valor obtenido este fuera de las categorías de clasificación se puede diluir el extracto. La conductividad eléctrica es una medida de la capacidad de un material para transportar la corriente eléctrica. Una solución acuosa que contiene iones tiene esa propiedad. La conductividad de una solución electrolítica depende de la concentración total de iones presentes en el agua, de la movilidad de cada uno de los iones disueltos, su valencia y de la temperatura a la que se hace la determinación. Se prepara una pasta de suelo saturada con agua, se filtra al vacío y en el extracto se determina la conductividad eléctrica. Este método proporciona la medida más representativa del total de sales solubles del suelo debido a que se relaciona estrechamente con el contenido de agua del suelo bajo condiciones de campo. Materiales y métodos • Medidor de conductividad de lectura directa (conductímetro) • Agua destilada Solución estándar de KCl 0.01 N. Disolver 0.7455 g de KCl en agua destilada y aforar a 1 L. La conductividad eléctrica de esta solución a 25 °C es 1.412 dS/m. Procedimiento Preparación de la pasta saturada 1.Colocar entre 100 y 400 g de suelo en un vaso plástico con tapa. 2.Mientras mayor es el contenido de arcilla del suelo menor es la 27 cantidad de muestra necesaria. 3.Agregar agua suficiente para saturar la muestra. 4.Revolver suavemente con una espátula y agregar agua o suelo hasta alcanzar el punto de saturación. Los criterios para este punto son: • Cuando se golpea al vaso contra el mesón no debe acumularse agua en la superficie • La pasta brilla por reflejo de la luz • La pasta fluye lentamente cuando el vaso se inclina • La pasta se desliza libre y limpiamente de la espátula (excepto en los suelos con alto contenido de arcilla). • Evitar el exceso de agitación, especialmente en los suelos arcillosos, porque la incorporación de aire dificulta la visualización del punto de saturación. 28 Obtención de extracto de saturación • Transferir la pasta a un embudo Büchner provisto de un filtro de tamaño de poro ≤ 3 m. • Aplicar vacío y colectar el filtrado. Si el filtrado inicial sale turbio, devolverlo al embudo. Interpretación de resultados Por su conductividad eléctrica los suelos se clasifican como se indica en el Cuadro 3. Cuadro 3. Clasificación de la salinidad de suelos en función de su conductividad eléctrica. Categoría C.E. (dS/m) S.I. (%) Normal <4 <15 Salino >4 <15 Salino Sódico >4 > 15 Sódico <4 > 15 C.E.= conductividad eléctrica. S.I.= sodio intercambiable expresado en %. La determinación del contenido de nitrógeno de muestras de suelos y abonos orgánicos sólidos se hace por Kjeldahl. Este método se utiliza como índice de disponibilidad de nitrógeno en suelos. Se realizará su evaluación para generar recomendaciones de fertilización. El nitrógeno inorgánico determinado con este procedimiento ha mostrado una alta relación con la respuesta de la planta en estudios de correlación de métodos químicos. Se basa en la extracción del amonio intercambiable por equilibrio de la muestra con KCl 2 N y su determinación por destilación mediante arrastre de vapor en presencia de MgO. La adición de la aleación de Devarda (NOM-021-RECNAT-2000) permite incluir la determinación de nitratos y nitritos. Materiales y métodos • Balanza analítica • Matraz de destilación • Destilador con arrastre de vapor • Microburetas de 5 mL, graduadas a intervalos de 0.01 mL • Matraces Erlenmeyer de 125 mL • Agitador horizontal regulado a 180 opm (oscilaciones por minuto) Mezcla de ácidos Se pesan 12.5 g de ácido salicílico y se disuelven en 500 mL de ácido sulfúrico concentrado. NaOH 50% Pesar 250 g de NaOH y aforar a 500 mL con agua destilada (hervir el agua para eliminar el CO2). H3BO3 40% Se pesan 200 g de ácido bórico y se afora a 500 mL con agua destilada. H2SO4 0.05 N Tomar 1.4 mL de ácido sulfúrico concentrado y aforar a 1000 mL con agua destilada. Valoración del ácido sulfúrico con carbonato de sodio. 1.Se pesan 0.05 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y se disuelven en 10 mL de agua destilada (hervir el agua para eliminar el CO2 que haya absorbido y dejar enfriar). 2.Agregar 9 gotas de mezcla de indicadores (ver abajo) y titular con ácido sulfúrico. 29 3.La normalidad real del ácido sulfúrico se calcula con la fórmula: N= NH2SO4 = PesoNaHCO3 (g) P-eqNaHCO3 Vol.tituladoH2SO4 kgss= kg de suelo seco Vol. muestra= Volumen de la muestra Vol. Bco= Volumen del blanco Nácido= Normalidad del ácido valorado 14= miliequivalentes de nitrógeno 10= vol. de digestado que se usa en la destilación PesoNaHCO3 = Peso del bicarbonato de sodio. P-eqNaHCO3 = Peso equivalente del bicarbonato de sodio= 0.053. Vol. tituladoH2SO4 = Volumen titulado del ácido sulfúrico. Mezcla de indicadores Se pesan 0.5 g de verde bromocresol y 0.1 g de rojo de metilo, se afora a 100 mL con alcohol etílico. 30 Procedimiento 1.Se pesan 0.1 g de muestra previamente tamizada (malla < 5mm), se agregan 6 mL de mezcla de ácidos para predigerir la muestra. Se deja en reposo 24 h. 2.Se agregan 1.1 g de mezcla catalizadora a base de sulfatos con catalizador de selenio. Se calienta a 150 °C por 20 min. 3.Después se sube la temperatura a 390 °C y se calienta por 3 h. 4.Se baja la temperatura a 150 °C y se calienta por 1 h. La coloración de la solución cambia a azul claro. 5.Se deja enfriar, posteriormente se agregan 10 mL de agua destilada. Se filtra la solución y se guarda en viales. A esta solución se le llama digestado. 6.Se toman 10 mL del digestado y se le agregan 10 mL de NaOH 40%, y se colocan en el matraz para destilación. 7.El destilado se recibe en 20 mL de ácido bórico 40% (la manguera debe estar sumergida en el ácido bórico para asegurar que se condense la mayor cantidad de la muestra, con 9 gotas de mezcla de indicadores). 8.El destilado se debe titular con ácido sulfúrico valorado. 9.Para calcular el porciento de nitrógeno, se usa la siguiente fórmula: (Vol.muestra Vol.Bco ) (Nácido ) (14) %N (Pmuestra ) (10) Si el resultado es en miligramos de N por kg de suelo seco, mg-N/kgss, use la siguiente fórmula: N= (Vol.muestra Vol.Bco ) (Nácido ) (14)(1000 mg)(1000 g) mg N / kgss (Pmuestra ) (10)(1 g)(1 kg) Si ocupa el resultado en partes por millón o centimoles por kg de suelo seco, Cmol(+)/kgss, use la siguiente fórmula: N= 31 (Vol.muestra Vol.Bco ) (Nácido ) (14) (71.428) Cmol( ) / kgss (Pmuestra ) (10) Interpretación de resultados Los resultados de los análisis de nitrógeno inorgánico pueden interpretarse conforme al Cuadro 4. Cuadro 4. Clases de suelo de acuerdo al contenido de N inorgánico para cereales. Clase N inorgánico en el suelo (mg-N/kgss) Muy bajo Bajo Medio Alto Muy alto 0-10 10-20 20-40 40-60 > 60 Se le llama así a esta técnica porque se utiliza una solución para extraer el fósforo presente en la muestra de suelo. El fósforo es extraído con una solución de NaHCO3 0.5 M ajustada a pH 8.5. En suelos neutros, calcáreos o alcalinos, que contienen fosfatos de calcio, este extractante disminuye la concentración de calcio en solución a través de una precipitación del CaCO3, por lo tanto la concentración de fósforo en solución se incrementa. En suelos ácidos que contienen fosfatos de aluminio y fierro tales como la variscita y estrengita, la concentración de fósforo en solución se incrementa conforme el pH se eleva. Este extractante evita que se presenten reacciones secundarias en suelos ácidos y calcáreos, debido a que el nivel de aluminio, calcio y fierro se mantiene muy bajo en dicha solución. Para esta determinación se usa el método de Olsen (1965). 32 Materiales y métodos • Tubos de polietileno de 100 mL • Papel Whatman núm. 42 o equivalente • Agitador mecánico recíproco, ajustado a 180 opm • Balanza analítica • Matraces volumétricos de 50 mL • Bureta de 10 mL • Espectrofotómetro UV-Visible para leer a 882 nm y celdas de vidrio NaOH 1 M Pesar 5.26 g de NaOH y disolverlo en 100 mL de agua destilada hervida (el NaOH reacciona con el CO2 al hervir el agua se libera CO2). NaHCO3 0.5 M Disolver 42 g de NaHCO3 en 1 L de agua destilada. Ajustar el pH de esta solución a 8.5 mediante la adición de NaOH 1 M. Llevar a volumen con agua destilada. Guardar la solución en recipiente de plástico y revisar el pH de la solución antes de usarse, volver a ajustar a pH 8.5. Tartrato de antimonio y potasio al 0.5% Pese 0.5 g de K(SbO)C4H4O6½H2O y afore a 100 mL con agua destilada. Molibdato de amonio Disolver 20 g de (NH4)6Mo7O244H2O en 300 mL de agua destilada. Agregue lentamente bajo agitación constante y con cuidado 450 mL de H2SO4 14 N (194.9 mL de H2SO4 concentrado diluido a 500 mL con agua destilada). Agregue 100 mL de una solución al 0.5% (p/v) de tartrato de antimonio y potasio. Afore las mezclas a 1 L con agua destilada. Este frasco se debe tapar con papel aluminio para protegerlo de la luz. Solución reductora Disolver 0.5 g de ácido ascórbico con un poco de molibdato de amonio y aforar a 100 mL con la misma solución. Esta solución se debe preparar cada vez que se va a realizar la prueba. Solución estándar de fósforo (200 mg/L= 200 ppm) Pesar 0.8786 g de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) seco al horno a 105 °C, Disolver en agua y aforar a 1 L. Guardar en envase de plástico o vidrio (no Pyrex) y conservar en refrigeración. Algunos autores recomiendan adicionar 25 mL de H2SO4 7 N (97.8 mL de H2SO4 concentrado aforado a 500 mL con agua destilada) antes de aforar para conservar la solución libre de contaminantes biológicos. Procedimiento 1.Se pesan 2.5 g de muestra, previamente tamizada (malla 2 mm). Se le añaden 50 mL de solución extractante. 2.Se coloca en un agitador horizontal a 180 opm durante 30 min. 3.La solución se filtra con papel whatman núm. 42, o bien la solución se puede centrifugar a 2500 rpm (revoluciones por minuto) por 10 min. 4.Del filtrado se toma una alícuota de 5 mL y se coloca en un matraz aforado de 50 mL. A este volumen se le adicionan 30 mL de agua destilada. 5.Se agregan 5 mL de solución reductora, se agita manualmente y se afora a 50 mL con agua destilada. 6.Se deja en reposo 30 min. 7.Leer la absorbancia en espectrofotómetro de luz visible a 882 nm. Después de 30 min y antes de 60 min. 8.Se compara el resultado con la curva estándar (ver más abajo), y se calcula la concentración de fósforo, en mg-P/kgss, con la siguiente fórmula: 33 Vol.inicial Vol.final mg-Pextraible /kgss = CC 100 Peso alícuota muestra CC= mg/L de P en la solución. Se obtiene graficando la curva de estándar (absorbancia contra mg/L) e interpolando en la misma los valores de absorbancia de las muestras analizadas a las cuales previamente se les ha restado el valor promedio de los blancos o por medio de una regresión simple. Vol. inicial= volumen del extractante (NaHCO3). Vol. final= volumen al que se afora con H2O destilada. Alícuota= volumen de filtrado. Pesomuestra= g de muestra. 34 Se lee después de los 30 min porque el bicarbonato efervesce al mezclarse con la solución reductora a base de ácido ascórbico, por lo que al esperar este período de tiempo se asegura de que se hayan salido las burbujas de aire. Además al agregar la solución reductora se forma un complejo fosfo-molibdato, el cual da una coloración azul, dependiendo de la concentración de fósforo será la intensidad del color, pero este complejo empieza a precipitar a los 60 min, por lo que después de este tiempo la medición no será exacta. Para realizar la curva estándar (Figura 2), se requiere información, que se obtiene de la siguiente forma: 1.Se toman volúmenes de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 y 20 mL de solución estándar (5 ppm), en un matraz aforado de 50 mL. 2.Se agregan 5 mL de solución extractora, y 30 mL de agua destilada. 3.A este volumen se agregan 5 mL de solución reductora de ácido ascórbico, y se afora a 50 mL con agua destilada. 4.Agitar manualmente y leer después de 30 min pero antes de 60 min en espectrofotómetro de luz visible a 882 nm. 5.Se realiza una regresión simple utilizando la información obtenida. Figura 2. Curva de la solución estándar de fósforo (5 ppm) a 882 nm. Interpretación de resultados Los resultados de los análisis pueden interpretarse de forma aproximada con el Cuadro 5. Cuadro 5. Clases de suelo de acuerdo a la concentración de P extraíble-Olsen. Clase Bajo Medio Alto mg-P/kgss <5.5 5.5-11 > 11 Debe recordarse que para cada condición climática y cultivo se genera un nivel diferente de aprovechamiento del fósforo del suelo. Si se conocen los criterios de interpretación para algún suelo y cultivo, estos se reportarán junto con el resultado del análisis. Este método se utiliza para la determinación de fósforo extraible en suelos o abonos orgánicos sólidos con pH de neutro a ácido. El fósforo determinado por este método esta relacionado con la 35 respuesta de los cultivos. A contrario del método Olsen donde se utiliza bicarbonato de sodio como solución extractora, en esta técnica se emplea una combinación de HCl y NH4F, esta mezcla remueve formas de fósforo ácido soluble como los fosfatos de calico y una porción de los fosfatos de aluminio y hierro. El NH4F disuelve los fosfatos de aluminio y hierro al formar un ión complejo con estos iones metálicos en solución ácida. Reactivos Pesar 37 g de NH4F y aforar a 1 L. Conservar esta solución en botella de polietileno. Diluir 20.59 mL de HCl concentrado en agua destilada, y aforar a 500 mL. 36 Mezclar 30 mL de la solución de NH4F 1 N con 50 mL de la solución HCl 0.5 N, y aforar a 1 L con agua destilada. La solución resultante contiene la siguiente concentración NH4F 0.03 N y HCl 0.025 N, esta mezcla es estable por más de un año si se conserva en frasco de polietileno. Pese 0.5 g de K(SbO)C4H4O6½H2O, disuelva en agua destilada y afore a 100 mL. Tomar 194.4 mL de H2SO4 concentrado y aforarlo a 500 mL con agua destilada. Pese 20 g de (NH4)6Mo7O244H2O y disuelva en 300 mL de agua destilada. A esta solución vierta 450 mL de H2SO4 14 N lentamente y bajo constante agitación y con cuidado, posteriormente agregue 100 mL de tartrato de antimonio y potasio 0.5%. Afore la mezcla a 1 L con agua destilada. Este frasco se debe mantener tapado y con papel aluminio y protegido de la luz. Solución reductora Pese 0.50 g de ácido ascórbico y disuelva en 30 mL de la solución de tartrato de antimonio y potasio 0.5% y afore a 100 mL con la misma solución. La solución debe prepararse cada vez que se realiza la prueba. Solución estándar de fósforo (200 mg/L de P= 200 ppm) Pesar exactamente 0.8786 g de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) seco al horno a 105 °C, Disolver en agua y aforar a 1 L. Guardar en envase de plástico o vidrio (no Pyrex) y conservar en refrigeración. Algunos autores recomiendan adicionar 25 mL de H2SO4 7 N (97.8 mL de H2SO4 concentrado aforado a 500 mL con agua destilada) antes de aforar para conservar la solución libre de contaminantes biológicos. Solución estándar de fósforo (5 mg/L de P= 5 ppm) Disolver 1 mL (medidos con bureta) de la solución de 200 ppm en 200 mL con agua destilada. Procedimiento 1.Se pesan 2.5 g de muestra, previamente tamizado (malla 2 mm). Se le añaden 25 mL de solución extractante. 2.Se coloca en un agitador horizontal a 180 opm durante 5 min. 3.La solución se filtra con papel Whatman núm. 42 o bien la solución se puede centrifugar a 2500 rpm por 10 min. Debe recordarse que el papel filtro puede tener cantidades altas de fósforo. 4.Tomar una alícuota de 5 mL de extracto y colocarla en un matraz aforado de 50 mL, verter 40 mL de agua destilada. 5.Agregar 5 mL de la solución reductora, agitar y aforar a 50 mL con agua destilada 6.Se deja en reposo 30 min, y se lee la absorbancia en un espectrofotómetro de luz visible a 882 nm. Después de 30 min y antes de 60 min. 7.Se compara el resultado con la curva estándar (ver más abajo), y se calcula la concentración de fósforo, con la siguiente fórmula: Vol.inicial Vol.final mg-Pextraible /kgss = CC 100 ì g) muestra Peso( ícuota al alícuota Peso 37 CC= mg/L de P en la solución. Se obtiene graficando la curva de estándar (absorbancia contra mg/L) e interpolando en la misma los valores de absorbancia de las muestras analizadas a las cuales previamente se les ha restado el valor promedio de los blancos o por medio de una regresión simple. Vol. inicial= volumen del extractante. Vol. final= volumen al que se afora con H2O destilada. Alícuota= volumen de filtrado. 38 Se lee después de los 30 min porque el bicarbonato bulle al mezclarse con la solución reductora a base de ácido ascórbico, por lo que al esperar este período de tiempo se asegura de que se hayan salido las burbujas de aire. Además al agregar la solución reductora se forma un complejo fosfo-molibdato, el cual da una coloración azul, dependiendo de la concentración de fósforo será la intensidad del color, pero este complejo empieza a precipitar a los 60 min, por lo que después de este tiempo la medición no será exacta. Para realizar la curva estándar (Figura 3) se requiere información que se obtiene de la siguiente forma: 1.Se toman volúmenes de 0, 1, 2, 3, 4 y 6 mL de solución estándar (5 ppm), en un matraz aforado de 50 mL. 2.Se agregan 5 mL de solución extractora. 3.A este volumen se agregan 5 mL de solución reductora de ácido ascórbico, y se afora a 50 mL con agua destilada. 4.Agitar manualmente y leer después de 30 min pero antes de 60 min en espectrofotómetro de luz visible a 882 nm. 5.Se realiza una regresión simple utilizando la información obtenida. Figura 3. Curva de la solución estándar de fósforo (5 ppm) a 882 nm. Interpretación de los resultados Los resultados se reportan en mg-P/kgss, y pueden ser interpretados de manera aproximada con el Cuadro 6. Cuadro 6. Clases de suelo de acuerdo a la concentración de P extraíble. Clase Bajo Medio Alto kgss= kg de suelo seco. mg-P/kgss < 15 15-30 > 30 Este método consiste en la saturación de la superficie de intercambio de las partículas minerales con un catión índice, el ión amonio; el lavado del exceso de saturante con alcohol etílico; el desplazamiento del catión índice con K+ y la determinación del amonio mediante destilación. En esta determinación se emplea el acetato de amonio como reactivo saturante. 39 Materiales y métodos Diluir 57 mL de ácido acético glacial (99.5%) con agua destilada a un volumen de 500 mL. Agregar 60 mL de hidróxido de amonio concentrado, diluir con agua a un volumen de 990 mL, mezclar completamente, ajustar a pH 7.0 y diluir a un volumen final de 1 L con agua destilada. Una alternativa consiste en pesar y disolver 77 g de acetato de amonio en 900 mL de agua destilada y de ser necesario ajustar a pH 7.0 y entonces completar 1 L con agua destilada. Se usa el alcohol etílico grado industrial. Pesar 100 g de cloruro de sodio grado analítico y aforar a 1 L con agua destilada en un matraz aforado. Usar H3BO3 al 2% en agua destilada (pesar 20 g y aforar a 1 L con agua destilada) que contenga 10 mL del indicador mixto por L de solución. Para preparar HCl 0.01 N se toma un volumen de 0.8264 mL de HCl concentrado y se disuelven en 1 L de agua destilada. Valoración del HCl Tomar 5 mL de HCl que se desea valorar, agregar tres gotas de anaranjado de metilo, adicionar la solución de NaHCO3 1 N (pesar 84.01 g de NaHCO3 anhídrido y disolver en 1 L de agua destilada). El vire de color es de canela a amarillo. Para determinar la normalidad real del bicarbonato de sodio, se emplea la fórmula: N= 40 Pesar 53.50 g de NH4Cl y disolver en agua destilada. Ajustar a pH 7.0 con hidróxido de amonio y aforar a 1 L con agua destilada en un matraz aforado. (PNaHCO3 )(NNaHCO3 ) P-eq PNaHCO3 = peso de bicarbonato de sodio para 1 L. NNaHCO3 = normalidad calculada. P-eq= peso equivalente del sodio. Pesar 13.38 g de NH4Cl y disolver en agua destilada. Ajustar a pH 7.0 con hidróxido de amonio y aforar a 1 L con agua destilada en un matraz aforado. Para calcular la normalidad real del HCl valorado NHCl = Mezclar volúmenes iguales de rojo de metilo 0.66% y de verde de bromocresol 0.99%. Ambos disueltos en alcohol etílico al 95%: • Rojo de metilo: disolver 0.66 g de rojo de metilo en 100 mL de alcohol etílico al 95%. Aforar a 100 mL con etanol. • Verde de bromocresol: disolver 0.99 g de verde de bromocresol en 100 mL de alcohol etílico al 95%. Aforar a 100 mL con etanol. Disolver 0.1 g de anaranjado de metilo en 100 mL de agua destilada y aforar a 100 mL con agua destilada. (NNaHCO3 )(Vol. promedio) Alícuota alicuota NNaHCO3 = normalidad real del bicarbonato de sodio. Vol. promedio= volumen promedio gastado de NaHCO3 para titular el HCl. Alícuota= volumen usado para la titulación. Disolver 400 g de NaOH en agua destilada previamente hervida y aforar a 1 L. 41 Disolver 16.98 g de nitrato de plata en agua destilada y aforar a 1 L. Pesar 7.742 g de La(NO3)36H2O en un matraz aforado de 250 mL con agua destilada y añadir 17.5 mL de HNO3 concentrado y aforar a 250 mL. Tomar 50 mL de la solución de lantano acidificado en un matraz aforado de 500 mL y aforar con agua destilada. Disolver 11.12 g de CsCl y 250 mL de Al(NO3)9H2O en 500 mL de agua destilada en un matraz aforado de 1 L, añadir 20 mL de HNO3 2 M y aforar con agua destilada. 42 Disolver 12.5 mL de HNO3 concentrado en agua destilada, aforar a 100 mL en un matraz aforado. Procedimiento 1.Pesar 5 g de muestra secada al aire y tamizada (malla 2 mm) en un tubo para centrífuga de 50 mL con 33 mL de solución de acetato de amonio. Se coloca en un agitador horizontal a 180 opm (oscilaciones por minuto) durante 10 min. Después se centrifuga a 2500 rpm por 10 min, para que el sobrenadante se aclare. El sobrenadante se decanta en un matraz de 100 mL y se repte la extracción otras dos veces, aforar con acetato de amonio y guardarlo para la posterior determinación de las bases intercambiables (solución A). El suelo se guarda para continuar el proceso. 2.A la pastilla de suelo se le agregan 30 mL de la solución de cloruro de amonio 1 N; agitar durante 10 min y luego centrifugar a 2500 rpm por 10 min, hasta que el sobrenadante esté claro y desecharlo. Adicionar 30 mL de la solución de cloruro de amonio 0.25 N, agitar durante 10 min, centrifugar a 2500 rpm durante 10 min y desechar el sobrenadante. El suelo se lava con porciones de 30 mL de alcohol etílico 97% agitando durante 10 min, centrifugar a 2500 rpm durante 10 min y eliminar el sobrenadante cada vez. El lavado termina cuando la prueba de cloruros en el decantado sea mínima. 3.Prueba de cloruros: pipetear 10 mL del sobrenadante alcohólico en un tubo de ensaye y agregar 4 o 5 gotas de nitrato de plata, si se observa un ligero precipitado blanco, la reacción es positiva y se debe continuar el lavado hasta que la prueba de cloruros sea negativa. 4.Se reemplaza el amonio absorbido con tres porciones de 33 mL de cloruro de sodio 10%, en agitación horizontal a 180 opm durante 10 min y después se centrifuga a 2500 rpm durante 10 min cada vez. 5.Cada reemplazo se decanta en un matraz volumétrico de 100 mL y se afora el volumen graduado con agua destilada. Determinar el amonio a partir de una alícuota de 5 mL la cual se transfiere a un matraz Kjeldahl de 300 mL, se le agregan 10 mL de NaOH 40% y se conecta al aparato de destilación. Recoger el producto de la destilación en un matraz Erlenmeyer que contenga 20 mL de ácido bórico y gotas de indicador. Para determinar la capacidad de intercambio catiónico expresada en Cmol (+)/kgss por titulación con HCl 0.01 N se emplea la siguiente fórmula: CIC = (200)(V)(N) = Cmol /kgss kgss= kg de suelo seco. V= Vol. (mL) de HCl empleado al titular el destilado. N= Normalidad del HCl. 100 100 100 mL 100g 200 = = alícuota Psuelo 10 mL 5g Para determinar el contenido de Ca y Mg intercambiables 1.Preparar una curva estándar a partir de una solución de 100 ppm (ver más adelante). 2.Se colocan 10 mL de la solución A en un tubo de ensaye. 3.Se agregan 2.5 mL de cloruro de lantano acidificado. Para leer Mg a 285.2 nm. 4.Tomar 2 mL de la primera dilución (2:50) y aforar a 25 mL. Se toma una alícuota de 10 mL y se agregan 2.5 mL de cloruro de lantano para leer Ca a 422.7 nm. 5.Leer en espectrofotómetro de absorción atómica, usando una flama aire-acetileno. Comparar el resultado con la curva estándar para determinar la concentración con la siguiente fórmula: 43 Ca = (ppmCC)(Dm)(Dv)(100) = Cmol(+)/kgss (P-eq)(1000) 1. 3.Se toman alícuotas de 0, 1, 2, 3 y 4 mL de esta solución. Aforar a 50 mL con agua destilada. 2. 4.Leer en espectrofotómetro de absorción atómica a 422.7 nm en flama aire-acetileno. kgss = kg de suelo seco ppmCC = ppm en curva estándar = Lectura Pendiente Dm = dlución de masa = Aforoinicial Pmuestra Aforo1era dilución Aforo2da dilución Dv = dlución de volumen = Alícuota era Alícuota da 1 dilución 2 dilución P-eq = peso equivalente del Ca = PM valencia 44 (ppmCC)(Dm)(Dv)(100) Mg = = Cmol(+)/kgss (P-eq)(1000) kgss= kg de suelo seco ppmCC = ppm en curva estándar = Lectura Pendiente Dm = Dilución de masa = Aforoinicial Pmuestra Figura 4. Curva de la solución estándar de Ca (100 ppm) a 422.7 nm. Para la curva estándar (0–0.5 ppm de Mg; Figura 5) 1.Pesar 1 g del estándar de Mg y disolver en 1000 mL de agua destilada, para una concentración de 1000 ppm. 2.Se toman 10 mL de la solución estándar de 1000 ppm de Mg y se afora a 100 mL con agua destilada. 3.Se pipetean 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL de esta solución. Aforar a 50 mL con agua destilada. 4.Leer en espectrofotómetro de absorción atómica a 285.2 nm en flama aire-acetileno. Aforo1era dilución Dv = Dilución de volumen = Alícuota era 1 dilución P-eq = Peso equivalente del Ca = PM valencia Si se lee directa (sin diluir), la dilución de volumen se anula. Para la curva estándar (0–0.4 ppm de Ca; Figura 4) 1.Pesar 1 g del estándar de Ca y disolver en 1000 mL de agua destilada, para una concentración de 1000 ppm. 2.Se toman 10 mL de la solución estándar de 1000 ppm de Ca y se afora a 100 mL con agua destilada. Figura 5. Curva de la solución estándar de Mg (100 ppm) a 285.2 nm. 45 Determinación de Na y K intercambiables 1.Se añade 1.0 mL de la solución A en un tubo de ensaye. 2.Añadir 1.0 mL de la solución de cloruro de cesio acidificada. 3.Añadir 8 mL de agua destilada y agitar manualmente. 4.Leer en espectrofotómetro de emisión de flama. Comparar el resultado con la curva estándar para determinar la concentración con la siguiente fórmula: Para la curva estándar (5–40 ppm de Na; Figura 6) 1.Pesar 1 g del estándar de Na y disolver en 1000 mL de agua destilada, para una concentración de 1000 ppm. 2.Se toman 10 mL de estándar de 1000 ppm de Na y se afora a 100 mL. 3.Se pipetean 5, 10, 20, 30 y 40 mL de esta solución. Aforar a 50 mL con agua destilada. 4.Leer en espectrofotómetro de emisión de flama. (ppmCC)(Dm)(Dv)(100) = Cmol(+)/kgss (P-eq)(1000) kgss = kg de suelo seco Na = ppmCC = ppm en curva estándar = Lectura Pendiente Dm = Dilución de masa = 46 Aforoinicial Pmuestra 47 Dv = Dilución de volumen = Aforo Alícuota P-eq = Peso equivalente del Ca = PM valencia K= (ppmCC)(Dm)(Dv)(100) = Cmol(+)/kgss (P-eq)(1000) kgss = kg de suelo seco ppmCC = ppm en curva estándar= Lectura Pendiente Dm = Dilución de masa = Aforoinicial Pmuestra Dv = Dilución de volumen = Aforo Alícuota P-eq = Peso equivalente del Ca = PM valencia Figura 6. Curva de la solución estándar de Na (100 ppm). Para la curva estándar (5–30 ppm de K; Figura 7) 1.Pesar 1 g del estándar de K y disolver en 1000 mL de agua destilada, para una concentración de 1000 ppm. 2.Se toman 10 mL de la solución de 1000 ppm de K y se afora a 100 mL. 3.Se pipetean 1, 10, 20 y 30 mL de esta solución. Aforar a 50 mL con agua destilada. 4.Leer en espectrofotómetro de emisión de flama. Cuadro 7. Cuadro de Grim para inferir el tipo de arcilla en una muestra de sustrato según su CIC. Grupo de arcillas CIC (Cmol(+)/kgss) Caolinitas 3-15 Esmectitas 80-150 Micas hidratadas 10-40 Vermiculitas 100-150 Cloritas 10-40 Figura 7. Curva de la solución estándar de K (100 ppm). 48 Interpretación de resultados de la capacidad de intercambio catiónico (CIC) La CIC no deberá expresarse como meq/100gss, ya que las unidades en el Sistema Internacional son Cmol(+)/kgss, por lo tanto los valores de la CIC se dividirán entre 100, para que la CIC se exprese como Cmol(+)/kgss. El signo (+) es añadido para indicar que la CIC deberá ser expresada como moles de cationes monovalentes; por lo tanto los iones divalentes cuentan el doble. La CIC es una propiedad química a partir de la cual es posible inferir acerca del tipo de arcilla presente, de la magnitud de la reserva nutrimental y del grado de intemperismo de los suelos. El resultado numérico de la determinación sirve además como base en el cálculo del porcentaje de saturación de bases que es un dato ampliamente usado en los estudios pedológicos y de fertilidad. Para poder inferir sobre los minerales arcillosos presentes en los suelos hay que considerar la medición hecha por Grim 1953, (Cuadro 7) en los silicatos laminares del tipo 1:1 y 2:1 empleando acetato de amonio 1 N pH 7.0. Con respecto al grado de intemperismo se considera que un valor de CIC inferior a 10 Cmol(+)/kgss en un horizonte B con más de 30–40% de arcilla indica la ausencia de minerales primarios intemperizables y la acumulación de minerales secundarios del grupo caolinítico y óxidos libres. Por lo que respecta a la reserva nutrimental se considera que esta es abundante cuando la CIC es mayor de 25 Cmol(+)/kgss (Cuadro 8). La fertilización se realizará de conformidad con la clasificación elaborada con los resultados analíticos obtenidos con métodos apropiados tanto en suelos ácidos como alcalinos. Cuadro 8. Fertilidad del suelo según su capacidad de intercambio catiónico (CIC). Fertilidad del suelo CIC (Cmol(+)/kgss) Muy alta Alta Media Baja Muy baja > 40 25-40 15-25 5-15 >5 Interpretación de resultados de calcio, magnesio y potasio (Ca, Mg y K) Los resultados de los análisis de las bases intercambiables pueden interpretarse en el Cuadro 9. 49 Cuadro 9. Fertilidad del suelo según su capacidad de intercambio catiónico (CIC). Cmol(+)/kgss Muy baja <2 <0.5 <0.2 Baja 2-5 0.5-1.3 0.2-0.3 Media 5-10 1.3-3.0 0.3-0.6 Alta > 10 > 3.0 > 0.6 Análisis de propiedades orgánicas del suelo y abonos orgánicos sólidos 50 Se realiza por el método estequiométrico de Walkley y Black, que se basa en la oxidación del carbono orgánico del suelo por medio de una disolución de dicromato de potasio y el calor de reacción que se genera al mezclarla con ácido sulfúrico concentrado. Después de un cierto tiempo de espera, la mezcla se diluye y se adiciona ácido fosfórico para evitar interferencias de Fe3+ y el dicromato de potasio residual (que no reaccionó) es valorado con sulfato ferroso, utilizando difenilamina como indicador. Por este procedimiento se detecta entre 70–84% del carbón orgánico total, por lo que es necesario introducir un factor de corrección, el cual varía dependiendo del suelo. Se puede utilizar el valor obtenido para el carbono orgánico total, multiplicando este valor por el factor de Van Brenmelen (1.724). Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) El manejo del ácido concentrado se hace en campana de flujo laminar, con sus debidas precauciones. Ácido fosfórico concentrado (H3PO4) El manejo del ácido concentrado se hace en campana de flujo laminar, con sus debidas precauciones. Indicador de difenilamina Pesar 0.5 g de difenilamina y disolverlos en 20 mL de agua destilada, añadir 100 mL de H2SO4 concentrado. Sulfato ferroso (FeSO4·7H2O) 1 M Pesar 278 g de sulfato ferroso y disolverlos en agua destilada a la que previamente se le añaden 80 mL de H2SO4 concentrado. Dejar enfriar y aforar a 1 L con agua destilada. Esta solución debe ser valorada con K2Cr2O7 1 N antes de realizar la determinación (normalidad exacta del sulfato ferroso). Para titular el sulfato ferroso Se toman 10 mL de sulfato ferroso que se desea valorar, y se le agregan 5 a 10 gotas de indicador de difenilamina, y se titula con K2Cr2O7 1 N. NFeSO4 7H2Oreal Vol. FeSO 4 7H2O N K 2Cr2O 7 Vol. gastadoK 2Cr2O7 Vol.FeSO4 7H2O = alícuota empleada NK2Cr2O7 = normalidad del dicromato de potasio Dicromato de potasio (K2Cr2O7) 1 N o 0.166 M Pesar 48.83 g de K2Cr2O7 (para 0.166 M) o pesar 147.09 g de K2Cr2O7 (para 1 N) y aforarlo a 1 L, con agua destilada. Esta medición debe ser muy precisa y el recipiente debe estar seco, porque el dicromato reacciona con el carbono orgánico del suelo y un peso impreciso puede afectar el resultado. Vol. gastadoK 2Cr2O7 = volumen de dicromato de potasio gastado para la titulación Procedimiento Se pesan 0.5 g de muestra tamizada (0.5 mm) y se añaden 10 mL de K2Cr2O7 1 N y se agita; posteriormente se agregan 20 mL de H2SO4 concentrado y se agita otra vez. Se deja en reposo 30 min sobre una lámina de asbesto o sobre 51 una mesa de madera, con el fin de aprovechar al máximo el calor generado de la reacción. Se añaden 200 mL de H2O destilado y 5 mL de H3PO4 concentrado para eliminar las interferencias por Fe, para después adicionar de 5 a 10 gotas de indicador de difenilamina, dándole una coloración rojo oscuro (ladrillo) a la solución, al titularla con sulfato ferroso vira a verde claro. Simultáneamente correr un blanco por cada serie para obtener el factor de corrección, para lo cula se toman 10 mL de K2Cr2O7 y se le agregan 20 mL de H2SO4, finalmente titular con sulfato ferroso valorado. Para calcular el porciento de materia orgánica se utiliza la siguiente fórmula: VSFBCO VSFM %Corgánico NFeSO4 7H2O 0.39 mcf Peso muestra 52 VSFBCO = Volumen de sulfato ferroso usado en el blanco (mL). VSFM = Volumen de sulfato ferroso usado en la muestra (mL). NSF = Normalidad del sulfato ferroso. Pesomuestra = peso de la muestra empleada (g). mcf = factor de corrección de humedad 100 peso seco %Materia orgánica Corgánico 1.724 Si al añadir el dicromato de potasio al suelo la solución se torna verdosa o si se gastan menos de 2 mL de sulfato ferroso al titular la muestra, se debe reducir el peso de la muestra a la mitad. de la suposición de que la materia orgánica contiene un 58% de C, 100 58 1.72413793 . Alternativamente puede emplearse una solución de sulfato ferroso amoniacal 0.5 N, pesar 196.1 g de Fe(NH4)2(SO4)26H2O, disolverlos en 800 mL de agua destilada con 20 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 1 L. Interpretación de resultados Los valores de referencia para clasificar la concentración de la materia orgánica en los suelos minerales y volcánicos se presenta en el Cuadro 10. Cuadro 10. Clasificación de suelos según su origen en función de su contenido porcentual de materia orgánica. 53 Muy bajo Bajo Medio Alto Muy Alto Suelos volcánicos Suelos no volcánicos ≤ 4.0 4.1-6.0 6.1-10.9 11.0-16.0 ≥ 16.1 ≤ 0.5 0.6-1.5 1.6-3.5 3.6-6.0 ≥ 6.0 El factor 0.39 resulta de multiplicar 12 100 12 4000 77 100 0.38961039 . Donde: es 4000 100 el peso miliequivalente del C, es un factor de corrección 77 debido a que se supone que el método solo oxida el 77% del C, y 100 es la conversión a porcentaje. En la mayoría de los laboratorios se sigue usando el factor de Van Brenmelen de 1.724 para estimar la materia orgánica a partir del carbono orgánico, el cual resulta Carbono total por combustión seca Para determinar el contenido de carbón y nitrógeno total de una muestra de suelo o abono orgánico, así como el porcentaje de azúfre se puede utilizar el método de combustión seca, que se basa en la oxidación del carbono orgánico y la descomposición térmica de los carbonatos minerales en un quemador de temperatura media. El CO2 liberado es atrapado en un compuesto y la determinación se puede hacer por titulación o por gravimetría. Los procedimientos por volumetría y conductimetría se usan en instrumentos comerciales para determinar el CO2 de la muestra de suelo o abono orgánico sólido. Alternativamente el CO2 liberado se puede reducir a CH4 usando 54 H2 y un catalizador a base de Ni, la cuantificación se hace por cromatografía de gases acoplada a un detector de ionización de flama. En el método por combustión seca, la muestra se mezcla con un catalizador (CoO y/o MnO) y se calienta con una resistencia, en presencia de O2 purificado, el CO2 es absorbido por ascarita o algún otro absorbente. Otros gases absorbibles que se forman durante la combustión son removidos del O2 antes de alcanzar el bulbo de absorción del CO2. El O2 (comercial comprimido) primero se pasa por un tren con H2SO4 concentrado para remover el NH3 e hidrocarburos, un absorbente como cal sodada para remover el CO2, y perclorato de magnesio anhidro Mg(ClO4)2 para remover el vapor de agua. La tasa de flujo de O2 es controlado por una válvula de aguja y se mide con un medidor de flujo. El tren para determinar el C total por combustión seca se compone de lo siguiente (Figura 8): • Cilindro de oxígeno y regulador de presión (A). •Tren de purificación del oxígeno (limpia impurezas en la corriente de O2) que consiste de H2SO4 concentrado para remover el NH3 e hidrocarburos, un absorbente como cal sodada para remover el CO2, y perclorato de magnesio anhídroMg(ClO4)2 para remover el vapor de agua (B). • Indicador de flujo y válvula de aguja para controlar el O2 (C). • Resistencia o inductor de combustión (D) a)Resistencia del quemador equipada con un control de temperatura y un indicador para operar de 900 a 1000 °C. b)Insertador de muestras. c)Tubo para la combustión, de 2.5 cm de diámetro por 75 cm (cerámica de zirconio o equivalente). • Trampa para el polvo insertada en la salida del tubo para combustión (E). • Trampa para azufre llena con MnO2 activado (F). • Horno de catálisis (G), oxida el O2 a CO2. • Limpiador del gas (H), remueve óxidos de nitrógeno y azufre, halógenos, y vapor de agua de la corriente de gas: a)Torre de ácido sulfúrico para remover el vapor de agua y para prolongar la vida útil de la trampa de perclorato de magnesio anhídro. b)Trampa para vapor de agua llena con perclorato de magnesio anhidro. • Bulbo para absorber el dióxido de carbono (I) (absorbe el CO2 para pesarlo), es un tubo de Nesbitt, Fleming o Turner empacado con un absorbente de CO2 y perclorato de magnesio anhidro. El bulbo contiene lo siguiente de abajo para arriba: fibras finas de vidrio, capa de 3 cm de absorbente de 8 – 14 mm de malla (por ejemplo ascarita), capa de 2 cm de absorbente de 14 – 20 mm de malla, capa de 1 cm de perclorato de magnesio anhi dro, y fibra fina de vidrio. • Trampa de grasa (J)-sella el equipo de la atmósfera en caso de presión trasera generada por una excesiva demanda de oxígeno durante la combustión, y para indicar el flujo de gas de salida. Figura 8. Diagrama de bloques del tren de combustión seca (Allison y cols., 1965) Materiales y métodos • Gas oxígeno. • Ácido sulfúrico concentrado. • Dióxido de manganeso activado. • Asbesto platinizado, 5% Pt, u óxido cúprico (alambre o en granulos) bajo en C para el catalizador del tubo de combustión. • Óxido cúprico en polvo, bajo en C, que sirve como acelerador cuando se mezcla con la muestra de suelo o abono orgánico sólido. • Alundum o siderita o equivalente, grado refractario, tamaño de malla 60–0, libre de C. • Perclorato de magnesio anhidro. • Dióxido de carbono, tamaño de malla de 14–20, por ejemplo ascarita, caroxita e indicarb. • Estándar de C (dextrosa o ácido benzoico). Procedimiento Se coloca la muestra en un tubo de 7.5 cm, adicionando asbesto platinizado y CuO granular como catalizadores. Se calienta la muestra a una temperatura de 950 °C se conecta el aparato al flujo 55 de corriente de oxígeno (O2) a una velocidad de 100 mL/min durante 10 min. Se quita el tubo y se pesa ya que la materia orgánica en presencia del oxígeno es convertida en CO2, el incremento en el peso del bulbo que absorbe el CO2 comparado con un blanco, nos permite calcular el contenido de carbono total en la muestra, así como también emite los resultados para el porcentaje de nitrógeno total y el porcentaje de azufre. gCO2muestra - gCO2Bco %CTotal 0.2727 100 gmuestra seca 56 Interpretación de resultados La relación C/N, aporta un dato importante de la materia orgánica, pues los microorganismos para desplegar su actividad necesitan primariamente del nitrógeno. Las leguminosas llegan a una C/N entre 10–15 (baja), pues contienen una mayor cantidad de proteínas en sus tejidos. Debido a esta baja relación C/N las leguminosas son más fácilmente mineralizables por la microflora del suelo que los cereales. Contenido de ácidos húmicos, fúlvicos y carbono orgánico Las sustancias húmicas representan la mayor parte de la materia orgánica del suelo, tambien conocida como humus, estas se dividen en tres componentes: los ácidos fúlvicos, ácidos húmicos y las huminas. Los ácidos húmicos y los fúlvicos son los fragmentos del humus, solubles en álcalis, mientras que las huminas son la fracción insoluble. Las sustancias húmicas se componen de grupos carboxilo e hidroxilo, con gran potencial de oxido-reducción y asociacióndisociación. Algunos de los usos de estas sustancias son: en agricultura influyen significativamente en la calidad y productividad del suelo, mejorando las propiedades físicas, las condiciones de humedad y la capacidad de intercambio catiónico; los ácidos húmicos reaccionan con el fósforo y calcio, formando complejos fosfohúmicos y calcio-húmicos respectivamente; el primer complejo mejora la disponibilidad para la planta, mientras que el calcio le confiere estabilidad a los ácidos húmicos; por lo tanto se podría pensar que el abono orgánico sólido con alto contenido de ácidos húmicos presentan un mayor contenido de fósforo disponible para las plantas y un menor contenido de calcio en su forma catiónica; tambien forma complejos con el amonio, formando humato de amonio, el cual estimula significativamente el crecimiento en plantas; las sustancias húmicas reducen los metales pesados a sus formas menos reactivas, lo que favorece la biorremediación de suelos contaminados. Existen muchas teorías sobre cómo se forman las sustancias húmicas, como son la teoría de la condensación de amino-azúcares, la teoría de la lignina y la teoría de los polifenoles. Hoy en día, algunos investigadores suponen que se producen a partir de la lignina. La materia orgánica se compone de carbohidratos (celulosa, hemicelulosa, almidón, azúcares, entre otros), lignina, polifenoles (taninos, entre otros), proteínas, lípidos, pigmentos, alcaloides y otros compuestos menores. Los compuestos más complejos de la materia orgánica fresca son la lignina y taninos, los cuales se descomponen muy lentamente: la lignina se compone de unidades de fenilpropano, estas unidades al degradarse producen ácidos y aldehídos fenólicos, los cuales por demetilación producen polifenoles, estos al oxidarse mediante las enzimas feniloxidasas pasan a quinonas, estas últimas por condensación con unidades de aminoácidos formarán los ácidos fúlvicos, y estos evolucionarán a ácidos húmicos; los taninos son polímeros polifenólicos que al degradarse liberan unidades de polifenoles, de ahí el proceso es igual al de la lignina, hasta la formación de ácidos fúlvicos, debido a esto se pueden considerar a los polifenoles como los precursores de los ácidos húmicos. La relación ácidos húmicos:fúlvicos (AH/AF) indica un grado de polimerización de la materia orgánica humificada y puede utilizarse como un índice de madurez o evolución del humus, debido a que provee de información relacionada con la formación de moléculas complejas (AH) a partir de moléculas sencillas (AF). En el abono orgánico sólido la predominancia general de ácidos húmicos orienta a inferir una evolución del humus. Materiales y métodos Pesar 4 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada previamente calentada. 57 Se pesan 147.09 g de K2Cr2O7 y aforar a 1 L de agua destilada. Pesar con precisión y en un recipiente seco. destilada y 5 mL de H3PO4 conc., adicionar de 5 a 10 gotas de indicador de difenilamina, para titular con sulfato ferroso 1 M. Vira de color a verde claro. Cálculos Pesar 278.01 g de sulfato ferroso, agregar 80 mL de ácido sulfúrico concentrado y aforar a 1 L con agua destilada. Corg. = V SFBCO N K 2Cr2O7 58 V VSFM NSF 1.2 VTotalextracto alicuota Pmuestra = mgC/gss Pesar 0.5 g de difenilamina en 20 mL de agua y añadir 100 mL de ácido sulfúrico concentrado. gss = gramos de suelo seco Procedimiento Por la técnica de Sánchez-Monedero y cols. (1996) se toma 1 g de muestra al cual se le adicionan 20 mL de NaOH 1 M, posteriormente se pone en agitación constante por 4 h, centrifugar por 15 min a 8000 g (gravedad) (3000 a 4000 rpm), al recuperar el sobrenadante por decantación se separa en dos volúmenes iguales. A la fracción 1 de sobrenadante se le determina el contenido de carbono orgánico extraíble total. La fracción 2 se utiliza para conocer el contenido de carbono orgánico de los ácidos fúlvicos, para lo cual hay que adicionar ácido sulfúrico concentrado al sobrenadante hasta ajustar a pH 2.0 (si la muestra proviene de un abono orgánico maduro, adicionando de 10 a 15 gotas de ácido sulfúrico concentrado se logra ajustar el pH a 2.0), al entrar en contacto el H2SO4 con el NaOH se produce una reacción exotérmica, por lo que se debe agitar el recipiente para que la muestra no se derrame, cuando se forman coágulos de color café pardo. Almacenar a 4 °C por 24 h (el precipitado que se forma son los ácidos húmicos), centrifugar 15 min a 8000 g (3000 a 4000 rpm) y medir el contenido de carbono orgánico del sobrenadante (si no se forma bien el coágulo, puede deberse a la falta de ácido sulfúrico o bien de tiempo en la centrifugación). VSFM = Volumen de sulfato ferroso usado en la muestra Determinación del carbono extraible de la muestra Se toma una alícuota de 5 mL del sobrenadante de la muestra, al que se le adicionan 5 mL de K2Cr2O7 1 N y 20 mL de ácido sulfúrico, agitar, posteriormente dejar en reposo 30 min sobre una lámina de asbesto o sobre una mesa de madera, añadir 200 mL de agua VSFBCO = Volumen de sulfato ferroso usado en el Blanco NSF = Normalidad del sulfato ferroso amoniacal NK 2Cr2O7 = Normalidad del dicromato de potasio 1.2 = 1 mL de K2Cr2O7 oxidan 1.2 mg de C VTotal extracto = 20 mL VAlícuota = 5 mL Pmuestra = 1 g CAH CET CAF CAH = Carbono extraíble de los ácidos húmicos CET = Carbono extraíble Total CAF = Carbono extraíble de los ácidos fúlvicos Interpretación de resultados El contenido de sustancias húmicas y carbono orgánico está en función del contenido de materia orgánica de la muestra. Al haber un alto contenido de materia orgánica se espera un alto contenido de carbono orgánico y sustancias húmicas. En el abono orgánico sólido el contenido de sustancias húmicas varía en función de la relación C/N, contenido de lignina y taninos, el contenido de Ca y Mg, y el contenido de humedad de la materia vegetal a utilizar. 59 60 Dependiendo de estos contenidos se acelerará o retardará la degradación de la materia orgánica hasta humus. Por ejemplo, las leguminosas presentan una baja relación C/N (10 – 15), un bajo contenido de lignina y taninos, y un alto contenido de Ca y Mg, lo que hace que la descomposición sea más rápida, sin embargo al final el humus tendrá muy bajo contenido de materia orgánica y sustancias húmicas, pero tendrá un alto contenido de minerales (Ca y Mg). Los cereales presentan un elevado contenido de lignina y taninos, al igual que relación C/N, por lo que conlleva un proceso de humificación más lento con mayor contenido de materia orgánica y mayor contenido de ácidos húmicos y fúlvicos pero con bajo contenido de nutrimentos disponibles para la planta. Es importante recordar que el contenido de humedad del sustrato es un factor clave en la degradación de la materia orgánica debido al papel tan importante que juega el agua en las funciones metabólicas de los microorganismos y en los cambios físicos que produce. Se utilizó la técnica de Jenkinson y Powlson (1976), la cual permite cuantificar el contenido de carbono del suelo (expresado como CO2) que fue respirado por los microorganismos del suelo en diferentes períodos de tiempo. Materiales y métodos Pesar 40 g y disolver en medio litro de agua destilada hervida, aforar a 1 L. Valoración del HCl 1 y 0.1 N Tomar 5 mL de HCl que se desea valorar agregar 3 gotas de anaranjado de metilo, adicionar la solución de NaHCO3 1 N (pesar 84.01 g de NaHCO3 anhídrido y disolver en 1 L de agua destilada). El vire es de canela a amarillo. Para determinar la normalidad real del bicarbonato de sodio: NNaHCO3 = (PNaHCO3 )(NNaHCO3 ) P-eq PNaHCO3 = Peso de bicarbonato de sodio para 1 L NNaHCO3 = Normalidad calculada P eq = peso equivalente del sodio Para calcular la normalidad real del HCl valorado: NHCl = (NNaHCO3 )(Alícuota) vol. promedio NNaHCO3 = Normalidad real del bicarbonato de sodio Vol. promedio = volumen promedio gastado de NaHCO3 para titular el HCl Alícuota = volumen usado de HCl para la titulación Tomar 82.64 mL de HCl concentrado al 37.5% de pureza y disolverlo en 1 L de agua destilada. Indicador anaranjado de metilo Si está en forma ácida pesar 0.1 g de anaranjado de metilo en 100 mL de agua; si está como sal, pesar 0.1 g de anaranjado de metilo y disolverlo en 100 mL de agua destilada, al final agregar 1.5 mL de HCl 0.1 N. HCl 0.1 N Tomar 8.264 mL de HCl concentrado al 37.5% de pureza y disolverlo en 1 L de agua destilada. Indicador fenolftaleína Pesar 0.5 g de fenolftaleína y disolver en 50 mL de alcohol etílico, aforar a 100 mL con agua destilada. 61 Procedimiento Se utiliza la técnica de Jenkinson y Powlson (1976), la cual permite cuantificar el contenido de carbono del suelo (expresado como CO2) que fue liberado por la respiración de microorganismos del suelo en diferentes períodos de tiempo. Se toman 25 g de muestra al cual se le ajusta la capacidad de retención de agua (CRA) al 40%. Al completar lo anterior al frasco donde se procesa la muestra humedecida se introduce en un frasco de aproximadamente 960 mL en cuyo fondo se agregan 50 mL de agua destilada para mantener la atmósfera húmeda. Junto con el frasco de muestra se introduce otro frasco con 20 mL de NaOH 1 N. El frasco de 960 mL se cierra herméticamente y se incuba en condiciones de oscuridad y a 25 °C durante 1, 3, 5 y 7 días. Al cabo de cada período de incubación, el frasco con NaOH 1 N se saca e inmediatamente se cierra hasta su análisis por titulación. 62 Titulación del NaOH Primero se titula una alícuota de una muestra de NaOH 1 N recién preparado para tomarlo como blanco en el tiempo cero de la incubación. Luego, se toma una alícuota de 5 mL de la muestra (NaOH 1 N) para colocarla en un frasco con 20 mL de agua destilada. A la cual se le adicionan una o dos gotas de fenolftaleína y se procede a titular con HCl 1 N, adicionando ácido hasta que el líquido vira de rosa intenso a transparente. Posteriormente se agregan cinco gotas de naranja de metilo (con esto tornará el líquido un color amarillo-claro, de no ser así habrá que repetir el procedimiento) y se adiciona HCl 0.1 N hasta que se vira del color amarillo-claro a canela. Anotar la cantidad de HCl 0.1 N consumido para lograr el cambio de color. Los resultados se expresan como mg-C/kg de muestra seca. 0.1 N pH 11 8 vire de rosa a transparente Anaranjado de metilo 3. NaHCO3 + HCl NaCl + CO 2 + H2O pH 7 4 0.01 N 4 x VHCl VHCl x NHCl x 12 1000 mg 1000 g M BCO ss mgC CO2 /kgss = Pmuestra 1 g 1 kg muestra ss kgss = suelo seco VHClM = mL de HCl consumidos por la muestra VHClBCO = mL de HCl consumidos por el Bco. NHCl = Normalidad del acido clorhídrico 4 = volumen utilizado de NaOH, de 20 mL iniciales se toman 5 mL. 12 = equivalente químico del C Pmuestra = Peso de la muestra Interpretación de resultados La cantidad de carbono mineralizado que se mide en la retrotitulación está en función de la abundancia y actividad de microorganismos aerobios de la muestra. En este parámetro también influye la humedad de las muestras, porque de esta depende el desarrollo de las funciones metabólicas de los microorganismos. La tasa de respiración se puede utilizar como un parámetro de actividad microbiana en muestras de suelos y en suelos enriquecidos con abonos orgánicos. Determinación del CH4 y N2O liberados por la microflora del suelo y la degradación aerobia de la materia orgánica 1. CO 2 + 2NaOH Na 2CO 3 + H2O fenolftaleina 2. 2Na 2CO3 + 2HCl 2NaHCO3 + 2NaCl Para calcular el contenido de carbono mineralizado por la microflora de la muestra, en mgC-CO2/kgss, se utilizará la siguiente fórmula: vire de amarillo a canela neutralización Un gas de efecto invernadero es aquel que absorbe radiación en determinadas longitudes de onda del espectro de radiación infrarroja que es emitido por la superficie y por las nubes. El gas, a su vez, emite radiación infrarroja desde un nivel en el 63 64 que la temperatura es más baja que en la superficie. El calentamiento ocurre, porque parte de la energía absorbida queda atrapada, por lo que la superficie tiende a calentarse. En la atmósfera, los gases de efecto invernadero son, básicamente: vapor de agua (H2O), dióxido de carbono (CO2), óxido nitroso (N2O), metano (CH4) y ozono (O3). Más aún las concentraciones atmosféricas globales de CO2, CH4 y N2O han aumentado como resultado de las actividades humanas desde 1750, y ahora han excedido los valores previos a la revolución industrial obtenidos de muestras de hielo de hace cientos de años, los incrementos globales en la concentración de CO2 se deben a la quema de combustibles fósiles y al cambio de uso del suelo, mientras los incrementos del CH4 y N2O se deben principalmente a la agricultura. En términos de impacto en el ambiente, de acuerdo al Panel Intergubernamental de Expertos sobre el Cambio Climático (IPCC) creado en 1988 por la Organización Meteorológica Mundial (OMM) y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), el CH4 y el N2O contribuyen 21 y 310 veces, respectivamente, más que el CO2 al calentamiento global. La agricultura es una fuente y a la vez un sumidero de gases de efecto invernadero (GEI) y el uso intensivo del suelo ha aumentado el intercambio de carbono (C) y nitrógeno (N) entre el suelo y la atmósfera, siendo responsable de al menos el 20% de las emisiones totales de GEI, y de cerca del 50% de las emisiones de metano y del 70% de las de óxido nitroso, en cuanto a las emisiones de dióxido de carbono, la agricultura juega un papel relativamente pequeño. Los suelos con alto contenido de materia orgánica presentan una mayor absorción o retención de CO2, 15 a 20% mayor contenido que en suelos convencionales, equivalente a sacar 3500 lb-CO2/ha (lb de CO2 por ha), además favorecen la eliminación del metano por medio de su oxidación biológica por organismos metanotróficos. El nitrógeno contenido en la materia orgánica mineralizable se libera gradualmente, lo que permite que los niveles de nitrógeno libre y en forma de nitratos y amonio sea más bajo, y por consiguiente las emisiones de óxido nitroso son menores; pero al incorporar residuos vegetales, especialmente los que provienen de plantas fijadoras de nitrógeno, emiten cantidades significativas de óxido nitroso, pero no al nivel generado por los fertilizantes químicos. El proceso de compostaje provoca un impacto en la calidad del aire, por la producción de: NH3, CH4 y N2O. La liberación de estos gases esta directamente ligada a la relación C/N de los materiales originales, si presentan un alto contenido de proteínas, la relación C/N será baja, por lo que la descomposición será rápida, liberando más metano y dióxido de carbono, pero se liberará poco óxido nitroso, por el contrario si el material esta muy lignificado, la relación C/N será alta, por lo tanto la descomposición será lenta, en este caso se liberará menos dióxido de carbono y metano, pero se liberará más óxido nitroso, por lo que es necesario tener materiales con relación C/N intermedia. Condiciones de corrida en cromatografía de gases para cuantificación de metano • Detector de Ionización de Flama (FID) • Temperatura inicial del horno: 55 °C • Temperatura del detector: 65 °C • Temperatura final del horno: 100 °C • Columna: stainless steel4 (ss) • Soporte: aluminio activado • Capilar: 10 m CP-Sil 5 CB (0.25 mm de diámetro interno) Long5: 1 m OD 1/8 • Empaque: 1 m 10% SE-30 (2 mm de diámetro interno) • Ancho del tubo: 10 m CP-Sil 5 CB (0.53 mm de diámetro interno) • Rango de malla: 100-120 • Gas acarreador: H2 30 mL/min • Aire 250 mL/min Procedimiento 1.Pesar 30 g de suelo y colocar en frasco de 250 mL, ajuste la CRA al 40%. Deje airear y tape herméticamente con tapón de goma. 2.Incube a 25 °C y realice muestreos periódicos a los 0, 7, 14 y 28 días, tomando muestras a su vez a las 0, 24 y 48 h después de cada período de incubación. Los muestreos se harán tomando 1 mL de gas en cada frasco con una jeringa e inyectando este en el cromatógrafo. Abrir a los 15 días para evitar anaerobiosis. 3.Las concentraciones del gas se calculan a partir de una curva estándar elaborada con CH4 50 ppm usando 0, 250, 500 y 1000 ppm del gas. 65 Condiciones de corrida en Cromatografía de Gases para cuantificación de óxido nitroso • Detector de captura de electrones (DEC) • Temperatura inicial del horno: 35 °C • Temperatura del detector: 250 °C • Temperatura del inyector: 65 °C • Temperatura final del horno: 100 °C • Columna: Stainless steel4 (ss) Porapack Q • Soporte: aluminio activado • Capilar: Long5: 1 m OD 1/8 • Rango de malla: 80/100 • Gas acarreador: He flujo 55 mL/min 66 Procedimiento 1. Pesar 30 g de suelo y colocar en frasco de 250 mL, ajuste la CRA al 40%. Deje airear y tape herméticamente con tapón de goma. 2.Incube a 25 °C y realice muestreos periódicos a los 0, 7, 14 y 28 días, tomando muestras a su vez a las 0 y 48 h después de cada período de incubación. Los muestreos se harán tomando 1 mL de gas de cada frasco con una jeringa e inyectando este en el cromatógrafo. Abrir a los 15 días para evitar anaerobiosis. Las concentraciones del gas se calculan a partir de una curva estándar elaborada con N2O 50 ppm usando 0, 250, 500 y 1000 ppm del gas. 4 Acero inoxidable. 5 Largo. Aguilar S. A. 1988. Materia orgánica. En: Aguilar S. A. (ed.). Métodos de análisis de suelos. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo, A. C., Departamento de Suelos, Universidad de Chapingo. México. 88 p. Alexander, M. 1994. Introducción a la microbiología del suelo. AGT Editor, S. A. 2ª Ed. México, pp: 13–26. Algaidi, A. A. A. 2009. Predicting NO, N2O and CO2 emission from agricultural soil through related environmental parameters. PhD Thesis in Environmental Science, Institute of Environmental Science, Hungria. 181 p. Allison L. E., W. B. Bollen y C. D. Moodie. 1965. Total Carbon. In : C. A. Black et al. (eds.) Methods of soil analysis, Part 2. 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Agradecimientos: Al CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, por las facilidades dadas para la realización de este libro, a través del proyecto: SIP Diseño y evaluación de bioinsecticidas micro y nanoencapsulados para el control de plagas del tomate en Sinaloa. Clave 20140490. A la Fundación Produce Sinaloa A.C., por su valioso apoyo en la redacción de estilo y el cuidado en el proceso de edición. A la Fundación Produce Sinaloa A.C., por el apoyo económico para la publicación y distribución de este libro. A los miembros del comité de arbitraje por su revisión y sugerencias y aportaciones a la obra. A los participantes, por sus aportaciones y entusiasmo para la realización de la obra.