Control del crecimiento bacteriano. Acción de los agentes físicos

TRABAJO PRÁCTICO No. 3
ACCIÓN DE LOS AGENTES FÍSICOS SOBRE LAS BACTERIAS
ESTERILIZACIÓN
I. ACCION DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS BACTERIAS
OBJETIVOS
1. Demostrar los efectos de la temperatura de crecimiento en bacterias mesófilas, psicrófilas
y termófilas.
2. Demostrar los efectos letales del calor sobre las bacterias.
3. Demostrar e interpretar la acción de los rayos ultravioleta sobre el desarrollo bacteriano.
GENERALIDADES
El efecto que ejercen los factores físicos como la temperatura, las radiaciones y la
deshidratación sobre el crecimiento bacteriano, varía de acuerdo a cada especie y de acuerdo a
ciertas propiedades intrínsecas que podrán expresarse de acuerdo a las condiciones en las cuales se
está desarrollando la población bacteriana. Cuando las condiciones son favorables las bacterias se
multiplican alcanzando grandes masas de crecimiento, pero cuando esos factores físicos se alteran y
varían considerablemente de lo óptimo, las bacterias por lo general mueren o pueden permanecer en
estado latente hasta tanto se restablezcan las condiciones óptimas para su multiplicación.
Los factores físicos pueden producir varios efectos sobre las bacterias, como son,
estimularlas en su metabolismo, alterarlas en su virulencia, inducir variantes genéticas y destruirlas
por alteración del medio donde se encuentran.
1. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
La temperatura a la cual se desarrollan los microorganismos o a la cual son expuestos por
determinados periodos de tiempo, ejercen diversos efectos sobre ellos. Las temperaturas a las cuales
crecen los microorganismos varían según la especie y los rangos de temperaturas en los cuales se
desarrollan pueden ser amplios o estrechos. El rango de temperatura en la cual se desarrollan los
microorganismo esta compuesto por una temperatura optima, una temperatura mínima y una
temperatura máxima de crecimiento. Se considera como temperatura optima de crecimiento, la
temperatura a la cual los microorganismos alcanzan su máxima velocidad de crecimiento ya que su
metabolismo se encuentra acelerado; la temperatura mínima de crecimiento, es la temperatura a la
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cual el metabolismo se desacelera hasta su mínima expresión y el crecimiento bacteriano es casi
imperceptible. La temperatura máxima de crecimiento, es la mayor temperatura a la cual un
microorganismo puede crecer pero, igualmente, en forma lente ya que pueden iniciarse procesos de
desnaturalización proteica y desestabilización de la membrana. Es importante señalar que a
temperaturas menores a la mínima no ocurre crecimiento y por encima de la temperatura máxima los
microorganismos son destruidos.
MATERIAL
a) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Bacillus subtilis en caldo nutritivo.
c) Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo.
d) 4 tubos de agar nutritivo inclinado.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular los 4 tubos de agar nutritivo con el cultivo bacteriano seleccionado.
2. Cada tubo inoculado será incubado a una temperatura diferente: 0º C (refrigerador), temperatura
del laboratorio, 37º C y 55º C durante 24 - 48 horas.
3. Una vez finalizado el periodo de incubación, efectuar la lectura de los resultados e interpretar.
4. Determinar si la especie bacteriana utilizada se clasifica como psicrófila, mesófila o termófila.
2. EFECTO LETAL DEL CALOR (Demostrativa)
Las bacterias son rápidamente destruidas por el calor cuando se someten a tratamientos
térmicos, utilizando temperaturas muy elevadas o superiores a la temperatura máxima de
crecimiento por periodos de tiempo relativamente cortos.
MATERIAL
a) Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
c) Cultivo de Bacillus subtilis en caldo nutritivo.
d) 12 tubos estériles.
e) Baño maría a 65ºC
f) Baño maría a 55ºC
g) Agua hirviendo (100° C)
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h) Autoclave (121° C x 15 lbs de presión)
i) 1 placa de Petri
j) Pipetas estériles de 1 ml.
PROCEDIMIENTO
1. Se trasvasará 1ml de cada cultivo bacteriano a cuatro tubos de ensayo estériles.
2. Cada tubo de cada cepa bacteriana será sometido a un tratamiento térmico en particular: 55° C x 5
minutos; 65° C x 30 minutos; 100° C x 10 minutos; 121° C x 15 minutos.
3. Dividir la placa en 4 cuadrantes y sembrar cada uno de los cultivos tratados en cada cuadrante.
4. Incubar la placa a 37º C durante 24 - 48 horas.
5. Una vez finalizado el periodo de incubación efectuar la lectura e interpretación de los resultados.
4. EFECTOS DE LOS RAYOS ULTRAVIOLETA
Las radiaciones ultravioleta (UV) del espectro de luz ejercen un efecto letal sobre las
bacterias. Este efecto letal puede ocurrir por la aparición de mutaciones incompatibles con la
supervivencia bacteriana debido a la formación de dímeros de pirimidinas (específicamente timina)
en la molécula de ADN o a través de otras alteraciones en como cortes de enlaces fosfodiéster de
una de las bandas que componen la doble hélice de ADN (producen un “nick”). Además pueden
desencadenar en el medio de cultivo la producción de ciertas sustancias tóxicas como peróxido de
hidrógeno, que hacen al medio menos apropiado para el desarrollo bacteriano. Aún cuando la
exposición directa a radiaciones UV ocasiona un efecto desfavorable o letal no solamente sobre las
bacterias, sino también sobre todos los organismos vivos, se ha demostrado que poseen poco poder
de penetración y únicamente ejercen su efecto por exposición directa.
MATERIAL
a) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Bacillus subtilis en caldo nutritivo.
c) 1 placa de agar nutritivo.
d) 1 cuadrado de papel de aluminio con un orificio central.
e) Lámpara de luz ultravioleta.
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar por diseminación con hisopo, una placa con Escherichia coli o Bacillus subtilis.
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2. Retirar la tapa de la placa y cubrirla con el cuadrado de papel de aluminio, doblando las puntas
hacia el fondo de la placa. Colocar la placa sobre la tapa en forma tal que las puntas del papel
queden prensadas.
3. Exponer la placa a la acción de la luz UV durante 15 minutos.
4. Después del tiempo de exposición a los rayos UV, remover el papel de aluminio y colocar
nuevamente la tapa de la placa.
5. Incubar la placa a 37º C por 24 - 48 horas.
6. Comparar el número de las colonias desarrolladas en el área expuesta con las desarrolladas en el
área cubierta con el papel de aluminio.
II. ESTERILIZACIÓN
OBJETIVOS
1. Describir los principios de los diferentes métodos de esterilización.
2. Formar criterio para seleccionar los métodos de esterilización de acuerdo al material a
esterilizar.
3. Entender la importancia del control de esterilidad.
GENERALIDADES
En todo estudio microbiológico es indispensable disponer de todo el material a utilizar y de
todos los medios de cultivo en condiciones estériles. La esterilización es un procedimiento que tiene
por objeto la muerte o eliminación de todos los microorganismos existentes en un sitio u objeto
determinado. Se refiere a la inactivación de manera irreversible de toda forma de vida microbiana,
destrucción de todas las formas viables. La condición “estéril” en microbiología se refiere entonces,
a la ausencia total de cualquier microorganismo. La palabra estéril es un término absoluto, es decir,
que no existen términos medios en esterilización, el material o el medio de cultivo esta estéril o no lo
está. Los procesos de esterilización pueden llevarse a cabo utilizando agentes físicos y agentes
químicos.
A. AGENTES FÍSICOS
Los agentes físicos utilizados para la esterilización son el calor, la filtración y la radiación.
Cada uno de estos agentes físicos será seleccionado de acuerdo a la naturaleza del material que se
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desea esterilizar y a su vez la aplicación de cada uno, se llevará a cabo bajo condiciones específicas
determinadas también por la naturaleza de material a esterilizar.
1. CALOR
La aplicación de calor como agente esterilizante puede usarse bajo dos formas: Calor seco y calor
húmedo.
1.1. Calor Seco. Cuando se utiliza esta forma de calor la muerte de los microorganismos
ocurre por oxidación de los productos celulares vitales. Se puede aplicar de diferentes maneras y la
forma de aplicación será seleccionada de acuerdo a la naturaleza del material que se desea esterilizar.
Las formas de aplicación de calor seco como agente esterilizante son las siguientes:
a) Calor Directo de la llama (Flameo): Consiste en poner en contacto directo al objeto a
esterilizar con la llama del mechero de Bunsen. Es de uso corriente en bacteriología para esterilizar
el asa de platino y otros instrumentos metálicos que no se dañan con el calor directo. Se alcanzan
temperaturas de hasta 1550º C en la zona de máxima oxidación de la llama del mechero. La muerte
de los microorganismos ocurre por incineración.
b) Hornos de Aire Caliente: Es el método más utilizado para esterilizar material de vidrio. El
calentamiento del material ocurre por circulación de aire caliente en el interior del horno, por lo
general la esterilización se logra con temperaturas entre 160° C - 180º C durante una hora.
Entre los aparatos más usados se encuentra el antiguo horno de Pasteur, el cual posee una de
triple pared, un tubo de escape o chimenea, un termómetro para medir la temperatura interna del
horno y una cesta para colocar el material a esterilizar. También existen hornos de calefacción
eléctrica con regulación automática de la temperatura y que alcanzan hasta 190º C. Para lograr la
esterilización por este método, el material es sometido a tratamientos de 170º C por una hora.
También puede utilizarse a 80º C para el secado de materiales pero no es un proceso de
esterilización y por lo general, se aplica a ciertos materiales que han sido esterilizados previamente
con calor húmedo.
1.2. Calor húmedo: Es un medio muy eficaz para esterilizar ya que provoca la coagulación
de las proteínas celulares a temperaturas relativamente bajas (100° C a 120º C). La mayoría de los
procesos se aplican en forma continua, aunque existen otros que deben aplicarse en forma
discontinua.
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1.2.1. Procesos aplicados en forma continua
a) Vapor Bajo Presión: El vapor saturado a presión es el método más confiable de
esterilización, ya que, la presión eleva el punto de ebullición del agua resultando el vapor liberado
más caliente en el interior del recipiente. Esta forma de esterilización se realiza en un aparato
denominado autoclave. El autoclave tiene propiedades muy similares a una olla de presión, pero a
una escala mayor. Se obtienen temperaturas superiores a la temperatura de ebullición del agua. La
temperatura de esterilización en el autoclave es entre 115° C y 121° C, aplicando 15lbs de presión
por un periodo de tiempo entre 15 y 20 minutos. Esta forma de esterilización se utiliza para
esterilizar medios de cultivo, objetos de caucho, material contaminado, etc. Los envases tapados con
algodón, se deben proteger con papel impermeable. Las soluciones que contienen sustancias que se
deterioran con las temperaturas de autoclave, no pueden ser esterilizadas por este método.
El autoclave consta de una caldera cilíndrica sobre el cual reposa una tapa de metal que lleva
un termómetro, un manómetro y una válvula de seguridad. En el interior de la caldera, hay una cesta
donde se coloca el material a esterilizar. La fuente de calor es eléctrica. Los autoclaves modernos
vienen equipados con controles automáticos del tiempo, interruptores, horarios, termostatos y
alarmas que permiten la regulación previa de todo el ciclo de esterilización.
b) Vapor Fluente: Se aplica vapor de agua dentro de un recipiente cerrado que pueda
retenerlo, sin aumento de presión, lo cual hace que la temperatura no exceda de 100º C. Puede
utilizarse para esterilizar azúcares, gelatina, leche, por lo general se usa el autoclave, dejando abierta
la válvula de escape del vapor para evitar que aumente la presión.
c) Ebullición: Es un método muy útil cuando no se dispone de otro más seguro, dado que no
destruye rápidamente las formas esporuladas. Se emplea la temperatura de ebullición del agua a
nivel del mar (100º C), el material es sumergido en el agua hirviendo y debe mantenerse a esta
temperatura al menos durante 20 minutos. Por lo general se recomienda utilizar agua destilada.
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CONDICIONES PARA LA ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE
MATERIAL
TEMP (º C)
TIEMPO (MIN)
PRESION (LBS)
CALDOS
115
15
10
AGAR
121
15
15
MATERIAL Y CULTIVOS
121
30
15
CONTAMINADOS
1.2.2. Proceso aplicado en forma discontinua
d) Tindalización: Es un método de esterilización fraccionada, que se utiliza para esterilizar
medios de cultivos y soluciones de ciertos azúcares que puedan descomponerse cuando se le somete
a temperaturas superiores a 100º C por un período prolongado de tiempo. Con esta forma de
esterilizar se aplican corrientes de vapor de agua durante 20 ó 30 minutos, con intervalos de 24 horas
entre cada aplicación de vapor. Este proceso se lleva a cabo durante tres días consecutivos. Este
intervalo de 24 horas permite la germinación de las esporas que pueden estar presentes, revirtiendo a
la forma vegetativa, la cual es fácilmente destruida por la acción del vapor fluente de la subsiguiente
aplicación. La temperatura del vapor aplicado es de 100º C. Se realiza en un baño María o en el
autoclave con la llave de escape del vapor abierta.
2. FILTRACIÓN
Es un método muy útil para la esterilización de líquidos termolábiles (que son alterados o
destruidos por acción del calor). Consiste en separar de un líquido las partículas o bacterias en
suspensión por su paso a través de un cuerpo poroso. Los microorganismos son retenidos dadas las
pequeñas dimensiones de los poros del filtro y además, porque son adsorbidos en las paredes de los
poros a medida que atraviesan el filtro.
Las principales indicaciones son: esterilización de agua, esterilización de medios líquidos
alterables por el calor como suero sanguíneo, caldos o soluciones azucaradas; separación de
bacterias de los medios líquidos que las contienen y aislamiento de virus y bacteriófagos.
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a) Filtro Seitz: Consiste en discos de asbesto sostenidos por soportes metálicos, los cuales
tienen un orificio de entrada y de salida que se adapta a un frasco Kitasato. La filtración se hace por
vacío o presión.
b) Filtros de membrana o ultrafiltros: Son hechos de colodión, acetato de celulosa u otra
sustancia semejante. Generalmente en un disco que mide aproximadamente 50 mm de diámetro y
0,1 mm de espesor. Los poros de la membrana pueden variar desde 1 um a menos de 0,005 um,
suficientemente finas para separar los virus más pequeños del líquido que pasa a través de la
membrana del filtro.
Los filtros de membrana, a diferencia de los de yeso o porcelana tienen su eficacia
supeditada a la acción tamizante de su estructura perforada y a la finura de sus poros. Presenta la
ventaja de poder recoger todas las bacterias presentes en un volumen grande de líquido (agua, leche,
orina, sangre diluida) en un pequeño disco. El mejor ejemplo de los filtros de membrana son los
filtros Millipore, en los que adicionalmente se emplea un disco de carbón poroso únicamente como
soporte de la frágil membrana del filtro Millipore, pero no que desempeña ningún papel en el
proceso de la filtración. Estos dispositivos Millipore tienen diferentes presentaciones, desde los
utilizados para la filtración de grandes cantidades de líquido hasta
los
empleados
para
filtrar
pequeñas cantidades como son los filtros Millipore que se adaptan a las jeringas corrientes.
Los filtros se esterilizan por calor, antes de usarlos, con sus aditamentos y envases
receptores, de manera que las bacterias existentes en el filtro o cristalería no puedan contaminar el
filtrado (producto esterilizado). La filtración puede efectuarse por presión o vacío.
3. RADIACIONES
Pueden usarse distintas clases de radiaciones para destruir microorganismos. Las más
comunes son: la luz ultravioleta, luz infrarroja, rayos gamma y radiaciones electrónicas de alta
energía.
a) La luz Ultravioleta (UV): El efecto más importante es el que ejerce directamente sobre la
molécula de ADN, en la cual provoca ruptura de enlaces fosfato en una de las cadenas que forman la
doble hélice (nick) y además favorecen la formación de dímeros de timina (unión de dos timinas), lo
cual conlleva a errores durante la replicación y por consiguiente pérdida de la viabilidad de la célula.
La luz ultravioleta tiene bajo poder de penetración, por lo que debe aplicarse directamente
sobre el material a esterilizar por períodos considerables de tiempo. Es de gran utilidad como agente
esterilizante para las superficies de mesones de trabajo en el laboratorio, ambiente general de
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laboratorio, salas de operaciones, salas de inoculación, etc., por lo general superficies lisas donde los
rayos puedan incidir directamente. Se debe recordar que la luz ultravioleta es nociva para la piel y
los ojos del usuario, por ello debe trabajarse protegido con bata, guantes y lentes.
b) Los Rayos Infrarrojos: Se emplean para reducir la contaminación de alimentos durante su
procesamiento y/o envasado. Estos rayos esterilizan al impartir energía térmica que oxida los
componentes carbohidratados de microorganismos.
c) Las Radiaciones Ionizantes: Como son los rayos gamma y las radiaciones electrónicas son
sumamente eficaces para esterilizar alimentos, pero a menos que se controlen adecuadamente
representan un peligro para la salud del operador y además son muy costosas.
B. AGENTES QUIMICOS
Hay ciertos gases que ejercen una poderosa acción letal sobre las bacterias destruyendo
varias enzimas esenciales y estructuras químicas vitales para los microorganismos.
La utilidad de algunos de ellos, como el cloro, formaldehido y el dióxido de azufre, se han
reconocido durante años. Actualmente se usa el óxido de etileno, el cual es altamente tóxico para las
partículas virales, para las células bacterianas y fúngicas y para la mayor parte de las endosporas
resistentes al calor. El uso de sus vapores (esterilización gaseosa) viene siendo empleado en la
esterilización de materiales de laboratorio elaborados a base de plástico y caucho, los cuales no
soportan las temperaturas alcanzadas en el autoclave. Se puede combinar el óxido de etileno con
CO2, mezcla llamada "carboxid" menos peligrosa por cuanto disminuye la inflamabilidad del óxido
de etileno. También es de utilidad la esterilización gaseosa en ciertos ambientes como las
incubadoras de huevos fértiles, galpones, etc.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Después que los materiales de laboratorio han sido sometidos al proceso de esterilización
necesariamente no significa que están estériles, por consiguiente es indispensable proceder a realizar
un control de esterilidad.
1. Material de Vidrio: Tubos, placas, matraces, vasos de precipitado, etc. A una muestra
representativa de este material ya esterilizada y tomada al azar, se le adiciona medio de cultivo
estéril, sólido o líquido según sea el caso, y se incuba a 37º C por 48 horas.
2. Medios de cultivo Líquidos y Sólidos: Se toman muestras al azar, en tubos o en placas y se
incuban a 37º C por 48 horas.
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3. Útiles: Pinzas, inyectadoras, tijeras, etc. Una muestra de este material se pone en contacto
con el medio de cultivo estéril el cual se incuba a 37º C por 48 horas.
RESULTADOS
El material de laboratorio se considerará estéril cuando no exista evidencia de crecimiento
bacteriano. Este control de esterilidad está referido para bacterias mesófilas. Si se quiere realizar
para bacterias psicrófilas se utilizará temperatura de incubación de 4º C durante una semana, para
bacterias termòfilas temperatura de 55º C durante 48 horas y para hongos, temperatura de laboratorio
durante 8-10 días.
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