Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a

Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
IJIYIVERSIDAD DE ALICANTE
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS
DErARTAMBNToS
DENnuRoeuÍurcl y FrsrolocÍ¡,
ESTUDTo
FIINCToNALDELA ct,rcopRorpÍNl-p
(TRANSpoRTADoR
nB uúr,TrpLES r¿huncos)
TRANSPLAhITADA
A ovocrros DB xenopuslaeuis.
José Antonb Ferragut Rodrfguez
Andr6 Morales CatMn
TESIS DOCTORAL
Jordi Aleu Vilafta
Alicante, Junio 196.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
rNsrrruro oe
NEURoCTENCÍAS
uNrvEltstDADDE AI-ICANTE.
'fel.
E-030floALIcAN',rc
96 / 565981 I
Fa-\ 96 / 51)4 li;1o
D. José Antonio Ferragut Rodríguez, Catedráticode Bioqqímica y Biología Molecular
de la Universidad de Alicante y D Andrés Morales Calderón. Profesor Titutar de
Fisiologíade la Universidadde Alicante.
CERTIFICAN:
Que el trabajode investigaciónconducentea la obtencióndel
gradode Doctortitulado:
"Estudio funcional de la Glicoproteína-P(transportadorde
múltiples fármacos) transplantadaa ovocitos de Xenopus
Iaevis", del que es autor D. Jordi Alet¡ Vilalta" ha sido
rediz¿do bajo su dirección en los Departamentosde
Neuroquímicay Fisiologíade la Universidadde Alicante.
Para que conste y surta los efectos oportunos, firman el presentecertificado en Alicante,
a29 de Abril de 1996.
: JoseAntonioFerragutRodríguez
Fdo: AndrésMoralesCalderón
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Fe no és esperar,
fe no és somniar.
Fe espenosalluita per l'awi i pel dema.
Fe és un cop de falg
fe és donar Ia ma.
Ia fe no és uiure d'utt record passat.
I{o esperemel blat
sensehaver sembrat,
no eq)eÍemque I'arbre doni fruits sensepodar-lo,
I'hem de treballar,
I'hem d'anar regant,
encaÍa que I'osada ensfaci maL.
Fragment de:.Cal que neixin flors a cada instant (üuís lJach).
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Als meuspares
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AGRAIMENTS
En primer lloc vull expresarel meu agraimental Dr. JoséAntonio Ferraguti
al Dr. Andrés Morales Calderón, directors d'aquesta Tesi Doctoral per I'ajuda
constant,I'ensenyanga,els consellsi, sobretotla amistat. Senseells no hauria estat
possibleaquesttreball.
De la mateixamanera,vull agrair en primer lloc la gran ajudaque he tingut en
tot momentdels meuscompanysde laboratori,desdels meusinicis amb Flori, Rosai
Jaumefins avui en dia amb Isabel, Mavi, Beaúiz, María i Mariló, i la dels meus
companysdel curs de doctorat i tota la gent que conforma els departamentsde
Neuroquímicai Fisiologia.
També vull agrair la col-laboració de la Dra. Carmen González i del
Dr.Valentín Ceñaen la consecuciódel resultatsde les mesuresdels nivels de ATp en
les cél-lules tumorals, i la dels Drs. Adolfo Campos i Javier Bauzá en els de
citometriade fluix.
Un agraiment especial per al Jaume, per la Maite i per a tota la colla del
balneari, amb qui he compartit fabulososValldarquesi nits inobtidablesde disbauxai
avenfures,i per a tots els qui, d'una manerao una altra, m'han donat suport durant
tots aquestsanys.
Finalment, vull donar les grácies als meus pares, pel seu suport i per la
paciénciaque han tingut amb mi, i un record especialper als qui em van animar a
realitzar aquestatasca, tot i que avui ja no puc comptar amb la seva companyia
(Gráciestatá i iaia).
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ABREVIATT]RAS
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Ahtcvínhttsc
'H-DNM:
Daunomicinatritiada.
ABC:
con sitio de uniónde ATP.
Familia de transportadores
ACh:
Acetilcolina.
ADNc:
complementario.
Ácido desoxirribonucleíco
AMP:
Adenosínmonofosfato.
AMPq
Adenosínmonofosfatocíclico.
ARNc:
Ácido ribonucleicocomplementarío.
ARNm:
Ácido ribonucleicomensajero.
ATP:
Adenosíntrifosfato.
BSA:
Albúmina séricabovina.
CF"TR:
de la FibrosisCística.
ReguladorTransmembrana
CIC-O:
Canalde cloruro de Tbrpedomarmorata.
CHO:
Célulasde Ovario de HamsterChino.
DIDS:
Ácido 4,4'-diisotiocianoestilbeno-2,2'-disulfónico.
DNM:
Daunomicina.
DPBS:
Tampón fosfato salino de Dulbecco.
EDTA:
Ácido etilentriaminotetraacético.
fm:
Fracción microsomal.
GTP:
Guanosintrifosfato.
HBS:
TampónHepessalino.
VV:
Corriente/Voltaje.
IC5s:
Concentraciónde fiírmaco que produce un 50Vo de la respuesta
máxima.
LL2IOz
Línea celular linfocítica de ratón.
L1210/S:
Sublíneaparentalsensiblede la cepaLl2t0.
Ll2l0l65z
Sublíneaderivadade las célulasL1210/S con fenotipo MDR, 65 veces
resistenteal fármaco inductor DNM.
LL21:O1L60: Sublíneaderivada de las células Ll2IOl65 con fenotipo MDR, 160
vecesresistenteal fármaco inductor DNM.
LDH:
EnzimaI¿ctato deshidrogenasa.
MDCK:
CélulasEpitelialesde Hígado de Perro Madin-Darby.
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6
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MDR:
a múltiplesfiírmacos.
Resistencia
nAChR:
Receptornicotínicode acetilcolina.
NAI)-:
Nucleótidode Nicotinamiday Adenina.
NAIIH:
Nucleótidode Nicotinamiday AdeninaReducido.
NPPB¡
Ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-benzóico.
ORCC:
Canalesde cloruro que rectificanhaciaafuera.
P-gp:
Glicoproteína-P.
P1:
Fracción insoluble obtenida tras la solubilización de la fracción
microsomalde las célulasL12101160por Colatode sodio.
P388:
Línea celular de neoplasmalinfoíde
Pti88/S:
Sublíneaparentalsensiblede la cepaP388.
P388/20:
Sublíneaderivadade las célulasP388/Scon fenotipo MDR, 20 veces
resistenteal f,írmacoinductorDNM.
P388/100:
Sublíneaderivadade las célulasP388120con fenotipoMDR, 100 veces
resistenteal fármacoinductor DNM.
pHi:
pH intracelular.
PMSF:
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo.
RH-45:
Ringer de Ranahipotónico,45 mM NaCl (95,5 mOsm).
RII-75:
Ringer de Ranahipotónico75 mM NaCl (150 mOsm).
RN:
Ringer de Rana(224,5 mOsm).
RPMI 1640¿ Medio de cultivo celular RoswellPark Memorial Institute 1640.
RVD:
Disminuciónreguladadel volumencelular.
52:
Fracción soluble resultante del tratamiento de la fracción Pl por
Zwittergent3-12.
SDS-PAGE: Electroforesisen gel de poliacrilamidaen presenciade dodecil sulfato
de sodio.
SDS:
Dodecil sulfatode sodio.
SITS:
Ácido 4-acetamido-4'-isotiocianoestilbeno-2.2'-disulfónico.
T¡o:
Corriente de entradade cloruro transitoria.
U.A.:
Unidadesarbitrarias.
YRP:
Verapamil.
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t
INDICE
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
ín¡lioe
Pás
INTRODUCCION
l4
generalesde la Glicoproteína-P.
1- Características
15
2- Implicacionesclínicas.. .
l7
en MDR.
2.1- Farmacología
19
3- Bstudiosfuncionalesde Ia P-gp.
2t
3. 1- Actividad ATP-ásica.
22
3.2- Actividadde transportede f¿írmacos.
23
de la P-gp. . . . .
3.2.I- Modelosde la actividadtransportadora
24
3,3- Actividad de canalde ATP.
26
3.4- Actividad de canalde cloruro.
26
3.4.1- Canalesde cloruro activadospor hipotonicidad.
26
3.4.2- Actividad de la P-gp como canal.de cloruro activado
por volumen. . .
28
OB.IETWOS
30
MATERIAT,ES Y I\,TÉTODOS
34
I- Metodologíareferentea los cultivos celulares.
35
1.-Mantenimientode los cultivoscelulares.
35
2- Extracción de célulasprocedentesde ratón.
35
3- Ensayosde viabilidad
36
4- Preparaciónde las disolucionesde DNM.
36
5- Ensayosde citotoxicidad..
37
6- Ensayosde acumulaciónde DNM.
47
II- Metodologfareferentea la incorporaciónfuncional de proteínasen la
membranade los ovocitosde knopus laevis.
39
1- Extraccióny aislamientode la membranacelularque contienela
proteínade estudio
que contienenel nAChR.
1-l Obtenciónde membranas
2- Purificación de la proteína
2.1- Membranasenriquecidasen nAChR: Extracciónalcalina..
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40
40
40
4l
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Ínüce
2.2- Purtficacióndel nAChR mediantecromatografíade afinidad
4l
2.3- Procedimiento
de reconstitución.
42
2.4- Caracterización
del nAChR purificado.
42
2.5- Determinaciónde proteína
43
3- Preparaciónde los ovocitos.. .
43
4- Microinyección.
44
5- Estudiofuncionalde la proteínainsertadaen la membranadel ovocito. 45
5.1-Registroselectrofisiológicos..
".
5.2- Estudiode las corrientesactivadaspor acetilcolina.
49
5.3- Aplicacioneslocalesde acetilcolina..
49
III- Metodologiareferenteal estudiofuncionalde la P,gp
1- Extracción y aislamientode la membranacelular que contienela P-gp
46
51
51
1.1- Obtenciónde la fracciónmicrosomal
51
1.2- Determinaciónde proteína
52
1.3- Fraccíonamiento
de proteína
52
1.4- Detecciónde la P-gp medianteWestern-inmunotransferencia52
2- Punftcaciónde la P-gp.
54
3- Estudiofuncionalde la P-gp insertadaen la membranadel ovocito. .
55
3.1- Detecciónde la P-gp en la membranade los ovocitos.. . . .
55
3.2- Medidasde actividadde hansportede fármacos.. .
55
3.3- Medidasde osmolaridad.
56
3.4- Estudiode las corrientesactivadaspor hipotonicidad.. . . .
IV- Metodología¡eferenteal requerimientoenergéticode las célulasP388. . . .
57
58
1- Consumode oxígeno.. .
58
2- Medidasde lactato
59
3- Medidasde ATP.
60
V- An¿flisisestadístrco.
6l
CAPITUI,O I
¿PRESENTA LA P-gp ACTTVIDAD DE CANAL DE CLORURO?. . . . . .
I- RESULTADOS.
1- Incorporacióndel nAChR en ovocitosde )bnopuslaevis.
1.1- Respuesta
nativaa ACh en ovocitos.. . .
62
63
&
&
1.2- Respuestas
a ACh en ovocitosinyectadoscon membranapurificada
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10
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
fndícc
procedentede Tbrpedomarmorata
del ovocito.. .
del nAChRen la membrana
1.2.1-Incorporación
65
65
del nAChRen la
I.2.2- Cursotemporalde la incorporación
membranade los ovocitos.
66
1.3- Respuestas
a ACh en ovocitosinyectadoscon el nAChR purificado
67
y reconstituido. .
del ovocito.. .
del nAChRen la membrana
1.3.1-Incorporación
68
de la variedadde los donadoressobrela
I.3.2- Dependencia
respuestade las muestras.
69
I.3.3- Dependencia
del volumende la muestrainyectadasobrela
amplitudde la corriente..
69
t.3.4- Cursotemporalde la incorporacióndel nAChR en la
membranade los ovocitos.
1.3.5- Propiedades
de1canaliónico asociadoal nAChR.
70
72
1.3.5.1-Curvadosis-respuesta.
.
72
t.3.5.2- Potencialde reversión.. . .
73
I . 3.5.3- Relacióncorriente-voltaje.
74
t.3.5.4- Desensibilización
del nAChR.
75
t.3.6- I-ocalizaciónde los nAChRsen la membranadel ovocito.
77
L.3.6.1-Distribuciónde los nAChRsen la membrana
del
ovocito.
77
1.3.6.2-Orientaciónde los nAChRsen la membrana
del
ovocito.
2- Punficaciónde la P-gp.
78
80
2.1- lL Etapade purificaciónde la P-gp.
80
2.2- 2a Etapade purificaciónde la P-gp.
83
2.3- BalanceGlobal de las dos etapasde purificaciónde la P-gp. . . . .
85
3- Medidas de Funcionalidadde la P-gp
87
3.1- Incorporaciónde la P-gp en Ia membranade ovocitos.. . .
87
3.2- Actividad de la P-g¡l como transportadorde fármacos. . .
88
4- Corrientesiónicasevocadaspor medio hipotónico
4.1- Corrientenativaactivadapor hipotonicidad.
90
90
4.1.2- Características
de la corriente
91
4.L.3- Efectode fármacosantitumoralessobrela corriente.. . .
94
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TI
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
índiap
por colagenasa
sobreIa
4.1.4- Efectode la desfoliculación
corriente.
95
4.2- Cornentesen ovocitosinyectadoscon la P-gp.
97
de la corriente
4.2.1- Características
99
4.2.2- Efectodel donadoren la apariciónde la corriente.. . . . .
101
II- DISCUSIÓN.
IO2
1- Inco¡poraciín funcionalde proteínaserl la membranadel ovocito
103
1.1- Incorporacióndel nAChR en la membranadel ovocito.
104
I.2- Cancterísticasfuncionalesdel nAChR incorporado.. . .
1.07
2- Purificaciónde la P-gp.
1@
3- Incorporaciónfuncionalde la P-gp en la membranadel ovocito.
111
3. 1- Incorporaciónde la P-gp en la membranadel ovocito
111
3.2- Actividadde la P-gp como transportadorde fármacos. . .
111
4- Actividad de la P-gp como canal de cloruro
4.1- Corrientenativade los ovocitosactivadapor volumen.. .
Tl4
4.2- Actividadde canalde cloruro de los ovocitosinyectados
conla P-gp.
116
CAPITTJLO tr
REQUERIMIENTOSENERGÉTICOSDE LAS CÉLIJLAS P388.
t20
I- RESULTADOS.
tzl
1- Requerimientos
energéticosde las célulasP388en condicionesbasales.
t22
2- Requerimientos
energéticosde las célulasP388en presenciade DNM
y/o VRP.
t23
II- DISCUSIÓN.
t27
l- Nivelesenergéticosde las célulasP388/S.
r28
2- Nivelesenergéticosde las célulasP388/100.
r28
3- Nivelesenergéticosde las célulasP388/20.
130
CONCLUSIONES.
133
APENDICES.
t36
I- Electrodo de Clark.
t37
II- Ovocitosde Xenopuslaevis.
t39
2.1- Generalidades.
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139
12
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
2.2- Morfología del folículo ovárico.
III- Receptornicotínicode acetilcolina.
l4l
3.1- Descripción.
r44
145
3.2- Aspectosfuncionales.
t47
IV- Principalespropiedadesde los detergentes
empleados.
t49
BTBLTOGRAIÍA.
150
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13
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
INTRODUCCION
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Infroútcción
1- CARACTERÍSTICAS GENE,RALESDE LA GLICOPROTEÍNA-P.
Se denomina con el nombre de
Glicoproteína-P (P-gp) a una familia de
fosfoglicoproteínasque se sobreexpresanen
la membranaplasmáticade las células que
presentan el
fenotipo de resistencia a
múltiplesfármacos(MDR).
Estasproteínasfueron descubiertas
en
t976 por Ling y cols. en la membrana
plasmáticade las célulasde ovario de hamster
Chino (CHO) que presentanun alto nivel de
resistenciaa fármacos(1, 2). [r pusieronel
nombre de Glicoproteína-P, en virfud a su
implicación con la barrerade Permeabilidada
una amplia variedad de fármacos que
F"rgura1: Esquemade la Glicoproteína-P.
(De Karher y Ling (3))
acompañaal fenotipo MDR.
I¿ estructura primaria de la P-gp se
obtuvo a partir de las secuencias
completasde los ADNc de los genesque la codifican
(genesmdr). I"a primerapublicaciónde las secuencias
de los ADNc de los genesmdr
de ratón (4) y humano(5), condujoa proponerel modelode la P-gp recogidoen la
Figura 2 (6). Se trata de una proteína de 1280 amino¿ícidos,con 12 segmentos
transmembrana(según postula el modelo), constituyendodos miades homólogas,
cada una de las cuales contiene seis regiones transmembrana y un laza
intracitoplasmáticoque codifica una zonade unión de ATP. Las secuencias
de las dos
mitades de la proteína tienen entre sí un 43Vo de homología, si bien la falta de
homologíaen los lugaresde los intrones(7), sugiereque cadauna de las dos mitades
de la molécula ha evolucionadode forma independienteo que han desarrolladoun
mayor movimientode intronesdespuésde un eventode duplicación(8). El hechode
presentaren su estructura 12 segmentostransmembrana
dificulta enormementesu
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$
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inlrnútrción
solubilizacióny es, junto a su condiciónde proteínaminoritaria, causade que aún no
haya podido ser purificaday reconstituida,a pesarde los enormesesfuerzosque los
diversosgruposde investigaciónesfín realizandopara alcanzaresteobjetivo.
Figura 2: Modelo de la estructura de la P-gp basado en la secuencia de aminoácidos deducida a partir
del ADNc.
I.os aminoácidos que son diferentes en las secuencias del gen humano y ratón están
representados en negro. Los sitios pot'enciales de gücosilación se señalan mediante espirales, y los sitios
de unión de ATP mediante círculos. (Adaptado de Gotüesmany Pastan (6))
I¿ P-gp pertenecea la superfamilia de los transportadoresABC, cuyas
gus incluye una gran variedad
iniciales provienendel inglés "ATP-binding-cassette",
de transportadoresde moléculas dependientesde ATP en procariotas y euc¿Iriotas.
Esta familia se caractÉrlzaestructuralmentepor ser un componenteintegral de
con estructurade cr-hélicey dos
membranacon 10 ó 12 segmentostransmemb¡ana
regionesde unión de ATP (9). Dentro de esta gran familia de transportadores,se
encuentranel reguladorde conductanciade la Fibrosis Cística (CFIR); la adenilato
ciclasa; transportadoresbacterianospara azúcares,aminoácidos,peptidos, e iones
inorgrínicos(10); los transportadoresTap que transportanpeptidosa través de la
parala unión a moléculasMHC de claseI (11)
membranadel retículoendoplasmático
y una proteínade membranaen peroxisomas(12).
experimentales
Desdeel punto de vista funcional, son variaslas observaciones
que apoyan el papel de la P-gp como transportadorde eflujo activo de f,írmacosa
travésde la membranaplasmática:
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16
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inhoútcción
i) Su localizaciónen la propia membranaplasmática(requisitoimprescindible
parapoder ser una bombacelular).
ii) El an¡flisis mutacional demuestraque modificacionesen aminoácidos
específicosalteranla especificidadde unión de la P-gp a determinadosfármacos(13,
14, 15) e inhiben la hidrólisis de ATP (fenómenonecesariopara que existaactividad
de eflujo).
iiÍ) Frírmacose inhibidoresdel eflujo se Lrnenmediantefotoafinidada la P-gp
( 1 6 ,1 7 ) .
iv) Anticuerposmonoclonalesanti-P-gpinhiben el eflujo de fármacos(18, 19,
20).
vl Vesículasde membranaplasmáticade célulasMDR que expresanla P-gp
muestranun mayor nivel de transporteque aquellasprocedentes
de las membranasde
(21).
lascélulassensibles
vil Ia prueba crucial y determinante de la P-gp como transportador de
fármacos,fue la demostraciónde que la sóla transfecciónde célulascon el gen mdr,
resultabasuficienteparaconferirel fenotipoMDR (22, 23).
El hecho de que la P-gp sea el transportadorresponsabtedel eflujo activo de
fármacosantitumoralesen células MDR y por tanto de la mayoría de los fracasosen
el tratamiento por quimioterapia, indica el grado de importancia que tendría el
conocer los mecanismosde actuaciónde la P-gp para el diseño de nuevos fármacos
antitumoralesque no fuesenreconocidoscomo sustratospor la bomba.
2. IMPLICACIONES CLÍMCAS.
El fracaso del tratamientode diversos tumores por quimioterapiase debe
fundamentalmentea la presenciao desarrollo de resistenciacelular a los fármacos
empleados.Existendos tipos de resistencia:la intrínsecay la adquirida.Se habla de
resistenciaintrínsecacuandolos tumoresno respondeninicialmentea la terapiacon el
fármaco o combinación de fármacos, y de resistenciaadquirida cuando los tumores
que inicialmente eran susceptiblesal tratamiento por quimioterapia, adquieren con
posterioridadresistenciaal fármaco inductor. Dentro de la resistenciaadquirida, se
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I7
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
presentala resistenciacelular a múltiples fármacos
en el que las células tumorales
presentanresistenciacruzadaa una gran variedadde
agentescitotóxicosque no tienen
unaestructuracomún. El fenómenode MDR representala
mayor causadel fracasode
la curación del cáncer por quimioterapia.r,a búsqueda
de las causasdel fenotipo
MDR ha ocupadola atenciónde numerososgruposde
investigadores
en el campodel
cáncerdurantemásde cuatrodécadas.
A parrir de estudiosmolecula¡esrealizadosen el genoma
de las célulasMDR,
se observóla presenciade una pequeñafamilia de genes
que codificabala p-gp. En
humanos,han sido identificadosdos genesque codifican p_gp:
la
MDR1 (5) y MDR3
(tambiéndenominado
MDR2) (5,24,25); y en ratonestres:mdrl (o mdrlb), mdr3 (o
mdrla) y mdr2 (4, 26,27), siendoel productodel gen
mdrl el objeto de estudiode
estaTesis.
un examen preliminar de más de 400 tipos
de cánceresen humanos
demostraronuna amplia expresión del gen MDR1
en los tumores con fenotipo
resistenteintúnsecoo adquirido(28). Las P-gp codificadas
por el gen humanoMDR1
o su coffespondienteen ratones,mdrl y mdr3, pueden
transportar,desdeel interior
de las células de mamífero al espacioextracelular,
una gran variedadde fármacos
hidrofóbicos(22,23,29,30). ra expresiónintrínseca
del gen MDR1 se encuenrra
en
cánceresderivadosde riñón, hígado,colon, páncreasy
glándulaadrenal(2g, 3r, 32,
33, 34), üejidosque expresande forma naturarel gen
MDRI. Los niveresde ARNm
del gen MDRI tambiénson elevadosen tumores
carcinoidesy feocromocitomas,en
leucemiasagudasy crónicas en niños y adultos,
linfomas del tipo no-Hodgkin,
leucemiamieloide crónica en faseblástica,cáncer
de pulmón de célulasno pequeñas
con propiedadesneuroendocrinas,
neuroblastomas,
sarcomasy astrocitom
as (2g, 35,
36, 37,39, 39, 40, 41.,42, 43, 44).
El incrementoen la expresióndel gen MDR1
es común en tumorestratados
con quimioüerapia
que han sufrido recaídaduranteel curso, o después
del tratamiento.
Ejemplo de ello lo constituye er cáncer de
mama, cáncer de ovario, linfoma,
leucemia,neuroblastoma,feocromocitoma,rabdomiosarcoma
y mielomamúttiple (2g,
43' 44, 45, 46' 47, 48, 49, 50,51). En estos
casos,se suponeque un pequeño
númerode célulasque expresaban
MDRI al inicio de la terapiahan sido seleccionadas
por el tratamientoy promuevenla recaída,
aunquetambiénes posibleque un efecto
directodel tratamientohubierainducidola expresión
del gen MDRI.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
I8
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inhnútcción
También se ha estudiadola distribución de la P-gp en diversostejidos no
(52, 53, 54,
tumorales.Por ejemplo,medianteel empleode anticuerpos
monoclonales
55), se han detectadoniveles de P-gp procedentedel gen MDR1 en la superficie
apical de célulasepitelialesen varios órganossecretoresy en célulasendotelialesde
los capilaressanguíneos.Basadoen estaszonasde localizaciónde la P-gp en tejidos
de humanosy roedores,seha propuestoque la principal función ñsiológicade la P-gp
procedentedel gen MDR1 seala defensanatural de las célulasfrente a compuestos
xenobióticos. También se ha especuladocon la posibilidad de que la P-gp esté
involucradaen el transportede esteroidesa travésde la membranaplasmática(56, 57,
58, 59, 60, 61).
Las P-gp codificadaspor el homólogode MDR3 en ratón, mdr2, a diferencia
de las codificadaspor MDRI, no presentanactividadde transportede antineoplásicos
y recientementese ha descubierto que esuín involucradasen el transporte de
fosfatidilcolinadesdeel hígadoa la bilis (62).
2.1- FARMACOITOGÍA EN MDR.
El patrón usualde MDR incluye una gran variedadde agentescitotóxicosque
no tienen una estructurao una diana infracelularcomún. Existendocenas,y quizís
cientos,de productoshidrofóbicosnaturales(derivadosde plantaso microorganismos)
(63), anáJogossemisintéticosde tales productosnatu¡alesy productosde síntesis
orgiínica(64) capac.es
de inducir la apariciónde MDR.
Entre los fármacos utilizados rutinariamentecomo agentesantitumorales,
destacanlos pertenecientesa la familia de las antraciclinas.l¿s antraciclinasse
empz:rron a estudiar en los años 50 como antibióúcos pigmentadosaisladosa partir
de diferentesespeciesde hongosdel géneroStreptomyces
(65). Sin embargo,el uso
extensivo de antraciclinas como agentes antineoplásicos no comenzó hasta el
aislamiento de Daunomicina (DMvf) en 1963, procedentede dos especiesde
Stteptomyces(5. coeroleorubidusy S. pucetius) (66). El descubrimientode este
compuestorepresentóel comienzodel estudiode un nuevo tipo estructuraldentro de
la familia de las antracicünas,ya que al confirmarseque tenía un efectoantineoplásico
potente, especialmenteen el tratamiento de leucemias,condujo al desarrollo de
nuevos análogos semisintéticos. Asimismo, fue el desencadenante
del estudio
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
T9
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Infin¡hrcción
intensivode los efectosbiológicosde estosagentesen animalesy humanos,en los que
de su acciónen tejidosnormalesy malignos.
seestudiaronlos mecanismos
oo,o
ffi}'=
,.."ó
6
¿"i
oaunorrcrnA
ñ= CX3
ADRIAIIICINA
R= Ctt2CH
..
oHCOOCH3
VlilALASTlttÁ R =CH¡
vlt{CRlSTtt{A R:CH3
.H
o
¡
c-o
t
o
R:CH3-
" =4 L
O-C{H¡
tl
o
VP- 16
vM-2 6
Bigura 3: Eskuchrra de algunos fármacos empleadosen el tratamienüode cáncer que conducena la
adquisicióndel fenotipo MDR. (Corúesíade Clnaves (67))
El descubrimientoen 1982 por Tsuruo y cols. (68) de que el bloqueantede
canalesde calcio verapamil (VRP), podía aumentarla üoxicidadde Vnca alcaloidesen
células P388 resistentes,representala primera de numerosasinvestigacionescuyo
objetivo es el hallazgode compuestosque seancapacesde revertir el fenotipoMDR.
Los quimiosensibilizadoresdescritos hasta el momento se pueden agrupar en seis
grandes categoías: Bloqueantesde canales de calcio; análogosde esteroidesy
hormonas; análogos no citotóxicos de antraciclinas y Vnca alcaloides; compuestos
catiónicoshidrofóbicos,ciclosporinasy antagonistas
de calmodulina.
Las distintas clases de fármacos con actividad quimiosensibilizadoraparecen
actuar mediante diferentes mecanismos,pero comparten caracteísticas esfructurales
comunes.Los parámetrosestructuralescompartidospor diversosagenties
reversoresde
resistenciahan sido estudiadosen detallepr T,amoray cols. (69).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
20
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inhnútcción
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VERAPAMIL
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T RI F L U O P E R IANZA
Figura 4: Estructuras moleculares de algunos de los fármacos más comrinmente usados como agentes
reversores de resistencia in vitro (Cortesía de Cánaves (67)).
3- ESTUDIOS FLINCIONALES DE LA P-gp
Las funcionesadscritasa la P-gp son tres: Ia de transportadorde fármacos
antineoplásicos,la de canal de ATP y la de canal de cloruro. P-gp constituye la
primera entidad molecularque supuestamente
presentafunción de transportadory de
canal. Esta bifuncionalidad hace incrementarmás, si cabe, el interés científico de su
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
21
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Intuvútcción
estudio,pero la asignacióninequívocade tal bifuncionalidad,así como su regulación,
requiere su purificación a homogeneidady reconstituciónfuncional en sistemas
vesicula¡esapropiados. Hasta el momento se han utilizado diversas estrategias
encaminadas
a la purificación de la P-gp, de entre las que destacan:la solubilización
parcial de P-gp por detergentes(70, 71, 72), inmunoprecipitación
(73, 74), y uso de
distintossistemasde purificaciónpor cromatografía:de afinidadcon lectinas(71, 75),
de intercambioiónico (71,76) y de inmunoafinidad
(76,77).
Las distint¿sestrategiasno han logrado la purificacióna homogeneidad
de la
P-gp, ya que cadauna de ellasadolecede algunalimitación. Así, la solubilizaciónpor
detergentes implica purificaciones parciales de la P-gp. I-os métodos de
inmunoprecipitaciónconllevan la pérdida de la estructuraespacialde la proteína con
la consiguientealteración de la funcionalidad. I.os métodos cromatográficosde
afinidad con lectinasresultande bajo rendimiento(75), mientrasque las resinasde
intercambio iónico unen de manera casi irreversible a la P-gp, originando la
autoasociación
de la misma(78).
El desarrollode anticuerposmonoclonalesespecíficosanti-P-gp(18, 79, 80,
81, 82, 83, 84, 85) ha abierto nuevasposibilidadesde purificación de la proteína.
Asl, los métodosde inmunoafinidadestiínsiendodesarrollados
en cuantoala ele¡;ción
de los detergentesa utilizar, disociación de la P-gp de los anticuerposusadoscomo
ligandosen cromatografía,etc.
Aunque aún no se ha conseguidola completarecnnstituciónfuncional de la
P-gp, si se ha conseguidocierto progreso en dos áreas:el estudio de la actividad
transportadorade f¿írmacosen vesículasaisladas y el estudio de su actividad
ATP-ásica.
3. 1- ACTMDAD ATP-ásica.
Poco despuésde la identificaciónde la P-gp, se descubrióque los inhibidores
metabólicos como cianuro de potasio, 2-4 dinitrofenol o azída de sodio,
incrementabanla acumulaciónintracelularde antineoplásicos
(86), y dado que éstos
entran en las células por difusión pasiva, pareoíaque la acción de los inhibidores
metabólicosimplicabaun bloqueodel eflujo de los fármacosque era dependientede
energía (87). Este hallazgo se consolidó con el clonaje de la P-gp confirmando la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
,t
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Intutútcción
existenciade dos lugaresde unión de ATP en su estructura,ademásde presentaruna
gran homologíacon la familia de proteínastransportadoras
ABC (5, 88).
En 1988, Tsuruo y cols. (77) purificaron la P-gp mediantecromatografíade
inmunoafinidad empleandoel anticuerpo monoclonal MRK-16 en presenciade1
detergente CHAPS y demostraronque dicha preparación presentabatrazas de
actividad ATP-ásica. l¿
actividad ATP-ásica de la P-gp se ha detectado
posteriormentemediantela sobreexpresión
del productodel gen MDR1 en celulasde
insectosSf9, presentandouna alta actividadespecíficaestimuladapor la presenciade
f¿írmacos
en la membranaplasmática(89, 90).
Recientemente,se ha demostradola presenciade altos niveles de actividad
ATP-ásica en las fracciones que contienen la P-gp parcialmente purificada,
observiíndoseque la presencia de ciertos sustratos de la bomba: daunomicina,
colchicina, progesterona,nifedipina, verapamil,eüc.,producenun incrementode la
actividadATP-ásicade las mismas(70,71,72).
3.2- ACTTVIDADDE TRANSPORTEDE FÁRMACOS.
El transporte de fármacos antitumoralespor la P-gp se ha demostrado,
mediante el empleo de vinblastina marcada con tritio, en vesículas de membrana
plasmáticaprocedentes
de célulasque sobreexpresan
la P-gp (21, 91, 92). Se observó
que el transporte no tenía lugar cuando las vesículasse preparabana partir de las
membranasprocedentesde células sensiblesque no expresanla P-gp. Además, el
transporte dependíadel constantesuministro de una fuente de energía(o ATP, o un
sistemade regeneraciónde ATP o GTP) y era inhibido por agentesque reviertenel
fenotipo de MDR (verapamil, quinidina y diltiazen). Se pudo comprobar mediante
experimentosde fotomarcajeque estosreversoresse unían a la P-gp, posiblemente
compartiendoel mismo sitio de unión que los fármacosantitumorales.En el caso de
verapamil, los estudiosrealizadospor Spoelstray cols. sugierenque este fármaco
actúacomo sustratono competitivo de DNM para su transportepor la p-gp (93).
Estudios realizadosen proteoliposomasque contienenla P-gp parcialmente
purifi.cada, han @ido demostrar conjuntamente la presencia de la actividad
transporiadorade fármacosy la actividadATP-ásíca(72).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
23
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
InAoútcción
3.2.1- Modelos de la actividad transportadora de la P-gp.
Se han propuestovarios modelos,todos especulativos,sobrelos mecanismos
de acción de la actividadtransportadorade la P-gp. Estosmodelos,ilustradosen la
Figura 5, son: el "convencional"de bomba,el de aspiradorahidrofóbica,flipasay el
de bombade protones(6, 94).
El Modelo "convencionalr de bomba consideraque los fármacos, vna vez
hubieranentradoen eI interior de la célula, se uniían a la porción citoplasmáticade la
P-gp y seríanexpulsadosal exterior celular a travésde la P-gp mediantela hidrólisis
de ATP.
Este simple modelo presenta un problema conceptual: requiere que los
f¿írmacoscitotóxicos se unan a la P-gp con mayor afinidad que a sus dianas
intracelulares.Este punto contrastacon el hecho de que estos fármacoshan sido
seleccionadosprincipalmente por su habilidad de unión a dianas intracelulares de
forma fuerte y selectiva(p.e. la citotoxicidadde colchicina y Vinca alcaloideses
como resultado de su fuerte unión a la tubulina). Además, puesto que la p-gp
reconoceun gran númerode compuestosno relacionadosentre sí que se unena ella,
resulüacontrovertido que su afinidad por cualquiercompuestoindividual seamuy alta.
El Modelo de aspiradora hidrofóbica, se basa en que los f¿írmacosserían
detectadosy expulsadostan pronto como se hubieran incorporado a la membrana
plasmática,explicandoasí el hechode la disminucidnen la acumulaciónde f,írmacos
en el citosol. Este modelo se apoyafundamentalmente
en:
i/ Datoscinéticosreferentesal eflujo de fiírmacos(95, 96).
iilfa
propiedadmásimportantede los fármacosa la hora de ser transportados
al exterior celularpor la P-gp, es su índicede hidrofobicidad(69,97).
¡¡r) Rhodaminat23, una sondafluorescenteutilizada para marcar mitocondrias
y que es un excelentesustratoparala P-gp (98), tiene diferenüeespectrode excitación
en células sensibles que en células resisüentes,siendo el espectro en las células
resistentesmás parecidoal de la sondaen medio acuoso,sugiriendoque éstaha sido
eüminadadesdela membranaplasmática(99).
iu) l-a evidenciafinal de esüemodelo viene dada por la detección,mediante
experimentosde transferenciade energía,de la presenciade Adriamicinadentrode las
membranasde las células sensibles,mientrasque en las membranasde las células
resistentesla antraciclina sólo se ha detectadoasociadaa la P-gp. Es decir, fármacos
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
24
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inütútcción
como Adriamicina son eliminadosdirectamentede la membranaplasmáticapor la
P-gp(100).
Modelo de flipasa. Segúnestemodelo,una moléculade fármacosituadaen la
capainternade la membranaplasmática,se uniría a la P-gp y seríallevadaa la capa
lipídica externa (donde difundiría al exterior celular) o directamenteal espacio
extracelularpor la P-gp, medianteun cambioconformacionalde la proteína(101).
Bomba de protones. En estemodelo, la hidrólisis de ATP estaríaasociadaal
transportede H* al exterior de la célula a travésdel transportador,lo que conllevaría
un movimientopasivo de iones Cl-. Estosiones arrastraríanmoléculasde H2O a su
pasoa travésde la P-gp y las expulsaríanal exterior celular. Los fármacosanfipáticos
que estuvierandentrode la membranase verían arrastradoscon el movimientode las
moléculasde H2O (6). El bombeo de H+ al exterior celular a través de la P-gp
produciría, además,un aumentoen el pHi observadoen determinadascélulas con
fenotipoMDR al exteriorcelular (102, 103).
B
lspacio Exbacehrlr
i Mry,_-h31,.,
l=?;¡t-rizliii.iiiifi
Citoplesma
D
figura 5: Modelos de l¿ actividadhansportadorade la P-gp: A) Convencionalde bomba,B) Aspiradora
hidrofóbica, C) Flipasay D) Bombade proúones.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
,<
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inl¡othrcción
3.3. ACTIVIDAD DE CANAL DE ATP.
En 1993, Abraham y cols. (104) observaronen las células CHO que
sobreexpresan
la P-gp, la existenciade un transportede ATP al exterior celular cuya
actividadem proporcionala la concentraciónde la P-gp en la membranaplasmática.
l,os autores especularoncon la posibilidad de una función autocrina del ATP
extracelular que se uniría a receptorespurinérgicos (105) y propusieronque los
movimientos de ATP observadosdentro del retículo endoplasmático(106) y en
vesículassecretoras(107) podríandebersea la P-gp.
3.4- ACTIVIDAD DE CANAL DE CLORURO.
3.4.1- C_anales
de cloruro activadospor hipotonicidad.
I-a mayoúa de las células, si no todas, respondencon una disminución
reguladade su volumen (RVD) ante un incrementoen el volumencelular producido
por su exposicióna un medio hipotónico. Esta disminuciónde volumen suele ser
mediadapor la salidade ionesK+ y Cl- del citoplasmaa travésde canalesespecíficos,
acompañadospor un flujo de moléculas de HzO. los principales mecanismos
involucradosen RVD se muestranen la Figura 6 y son (108, 109):
i) Cornenteproducidapor un flujo de ionesK+ ylo Cl-.
Se han descritocanalesde cloruro que se activanpor hinchamientocelular en
una gran variedadde tipos celulares:linfocitos, célulascromafines,neuroblastomas,
fibroblastos,célulasendoüeliales,
ovocitosde &nopus, etc., y se caracterizanpor su
inactivacióna potencialesmuy positivos ()+10
mV) y presentanuna moderada
rectificaciónhaciaafuera(110, 1ll, ll2, ll3, 174, 11.5,116).
En ovocitos de Xenopuslaeüs, sistemacelular experimentalutilizado en el
desarrollo de la Tesis que se presenta,Ackerman y cols. (115) han descrito una
corriente de cloruro activada por hrpotonicidaddenominadafcl-swe',que no depende
de voltaje, no es calcio dependientey no es sensiblea ácidoniflúmico, y por tanto, es
claramenüedistinta a las corrienüesde cloruro activadaspor calcio y ala de los canales
mecanosensoriales
no selectivos.[¿ corrientepresentauna inactivacióndependiente
de tiempo que se hacemásevidentea despolarizaciones
mayoresde +30 mV, y que
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inftoútcción
es sustancialmente
aceleradacon la disminucióndel pH extracelular.Presenüauna
dependenciaextracelular de cloruro y se bloquea de forma reversible por dos
antagonistasde transporteaniónico no selectivos,SITS y DIDS, por un bloqueante
más selectivo de cloruro, NPPB, y es sensiblea la presenciaexterna de cationes
lantánidostrivalentesy de nucleótidos.
ii) Cotransporteelectricamente
neutrode K+ y Ct-.
Este ha sido descrito en eritrocitos de varias especies,en célulasdel tumor
ascítico de Ehrlich y en células epiteliales,y se caracterizaWr el requerimiento
interdependiente
de K* y Cl-, y porquesu extrusióndel citoplasmano alterade forma
detectableel potencialde membrana.
fii) Intercambioeléctricamenteneutro de K+/H+ funcionalmenteacopladoa
uno de C|/HCO3- produciendouna perdidade KCl sin cambioen el pH intracelular.
El intercambiode K*/H* acopladoa la regulacióndel volumencelular ha sido
estudiadoextensivamenteen eritrocitos de Amphiuma.El sistemaes efe¡tivo siempre
que exista en la célula sistemasque tamponenel pHi, talescomo proteínasque fijan
H* o el intercambiadorCI-/HCO"-.
Sistcma Conductivo
Sistema de cotransporte
Sistcm¿sdc i¡fcrcanbio
Ftgura 6: Principales mecanismosimplicados en la regulación de volumen (RVD). i) Corrientes
producidas por un flujo de K* y/o Cl, ii) Cotransporteelectricamenteneutro de K* y Cl- y iii)
lntercasrbio electricamenteneutro de K*/H* funcionalmenteacoplado al intercambiador CI/HCOr'
(Adaptadode Hoffinanny Simonsen(109).
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Inhutú.tcción
3.4.2- Actividad de canal dq cloruro activado por volumen de la P-sp.
I-a P-gp y el CFTR son proteínaspertenecientes
a la misma superfamiliade
transportadores
ABC. Mediantela expresióndel gen CFTR en sistemasheterólogosy
por mutacionesen la proteína que alterabanla selectividadiónica de esos canales
(117,I18, 119), se ha podidodeterminarque el CFIR presentaactividadde canalde
cloruro dependientede AMPc. I¿ activacióndel canal requierede la hidrólisis de
nucleótidos trifosfato en al menos uno de los dos sitios de unión de ATP de dicha
proteína(120). Recientemente,
se ha descritopor Reisin y cols. (121) que CFTR
presenta;ademásde la actividadde canalde cloruro, una actividadde canalde ATP,
proponiendoque el transportede ATP por CFTR podría facilitar la conductanciade
Cf de CFTR, la activación de la conductanciade los canalesde cloruro con
rectiñcación hacia afuera (ORCC) (122) y posiblemente,la regulación de otros
canalesiónicos, como el de sodio, cuya actividadestáalteradaen la fibrosis cística
(r23).
I¿ P-gp y el CFTR tienen una similitud t¿nto en su estructuracomo en su
secuencia(124, t25), y presenüanpatronescomplementariosde expresiónen varios
tejidos epiteliales (126). El CFTR, como miembro de la superfamilia ABC, se
caractenz.aestructuralmente,al igual que la P-gp, por poseer 12 segmentos
transmembnnay dos dominiosque contienenlas secuencias
de unión de ATP, pero a
diferenciade P-gp, CFTR poseeentrelos dosgruposde segmentos
transmembrana
un
dominio R con varios sitios de fosforilación.Los genesde la P-gp y del CFTR en el
intestinoposeenpatronesde expresióncomplementarios,
el gen CI¡'[R estiíexpresado
en células de las criptas mientras que el gen MDR1 estií expresadoen células del
epitelio más diferenciadascomo son el villi (126). Curiosamente,en células HT-29
que noffnalmenteexpresanCFIR, cuando se cultivan en presenciade Colchicina se
les inducela expresiónde la P-gp y sereducela correspondiente
a CFTR (127).
Fundamentándose
en estoshechosexperimentales,
surgióla hipotesisde que la
P-gp presentaraactividad de canal de cloruro, y en 1992, apareció publicado en
Ilature el primer trabajo en el que se asociaa la P-gp con una acúvidadde canal de
cloruro reguladora de volumen celular. I-os autores, Valverde y cols. (128),
registraron una corriente de cloruro activada en medio hipotónico en fibroblastos
MH3T3 transfectadosde forma permanentecon el clon MDR-I humano, cuya
magnitud se reducíadrásticamentemedianteel bloqueode la expresiónde la P-gp por
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Inhtútcción
oligonucleótidosantisentido.Experimentosposterioresde transfeccióntransitoriade la
P-gp con{irmaronlos resultadosanteriores,puestoque sólo se evocabala corriente
activadapor hipotonicidaden las célulastransfectadas.
Por último, la farmacologíade
la corriente era consistentecon la observadapara la P-gp: compuestostales como
verapamil, didesoxoforscolina,nifedipina y quinidina, que inhiben el transportede
fármacosa travésde P-gp, tambiénbloqueabanlas corrientesde cloruro activadaspor
volumen.
Posteriormente,Gill y cols. (129) propusieronun modelobifuncionalpara la
P-gp, ba*índoseen las siguientesobservaciones
experimentales:
i/ t¿ unión de ATP a la P-gp era suficientepara que se produjeraactividadde
canal, mientras que el transporte de fármacos requería la hidrólisis de ATP por la
proteína.
ii) Ambas funciones, la de transportadory canal, se podían separarmediante
mutagénesisdirigida a los dominios de unión de ATP, donde la sustituciónde un
residuode lisina condujoa que la proteínaperdierasu capacidadde hidrólisisde ATP,
generandouna proteína que manteníasu actividad de canal de cloruro pero que había
perdido su actividad transportadorade fármacos.
iÍi) ta adición de sustratos de la P-gp en la pipea durante los registros
realizadosen configuración de célula entera inhibían la activación del canal de
cloruro, revirtiéndose dicha inhibición mediante la empleo de anáiogos no
hidrolizablesde ATP.
El modelo, ilustradoen la Figura 7, sugiereque una moléculade P-gp podría
funcionar, dependiendo de la osmolaridad del medio extracelular, como bomba
extrusorade fármacoso como canal, pero no simultáneamente.Acorde con el modelo
bomba-canal,la unión de sustratoconduciría a la molécula de P-gp a actuar como
bombae inhibiría la activacióndel canal.
CHANNE
HYPOIONIC¡IY
Pgp.ATP'
Figura 7: Esquemadel modelo bifuncion¿l propues&o
para la P-gp. (Ad¿ptadode Gill y cols. (129))
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OB.IETIVOS
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Obietiwts
Ler OB.IETIVO:
El primer y principal objetivo de estaTesises la dilucidaciónsobrela función
de canal de cloruro activado por hipotonicidad asignadaa la P-gp. En el casode que
la P-gp presentedicha actividad, seprocederáa su estudiofuncional,y se analizaráel
efecto de bloqueantesde canalesder.cloruroy sustratosde la bomba de P-gp sobre
dichaactividad.
JUSTIFICACIÓN
El hecho de que la P-gp pudiera presenüaractividad de canal de cloruro
ayudaría tanto a entender su papel fisiológico como al estudio de la regulación del
volumen celular, regulación de canales iónicos, mecanismosde MDR y al
conocimiento de una entidad molecular que presentala doble función de canal y
transportador.
La asignaciónde la actividadde canalde cloruro a la P-gp se encuentraen la
actualidadmuy controvertidaya que cuatro mesesdespuésde la asignaciónde dicha
actividad a la P-gp apareciópublicado un trabajo realizadoen célulasT84 en el que la
función transportadorade la P-gp era independientede la regulación de volumen
celular (130), resultadosque se contraponena los descritospor Valverdey cols. (128)
y Gill y cols. (129).
DISENO EXPERIMENTAL
El estudiode la posible actividad de la P-gp como canalde cloruro se efectuará
empleandouna metodología original que consiste en la incorporación funcional de
proteínas en la membranadel ovocito. Esta metodologíaaporta la ventaja de poder
estudiar la protefna tal como fue sintetizadapor la cétula origen, es decir, totalmente
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31
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Obietivns
procesada,en un sistema,el de los ovocitosde &nopus laevis, que tantasventajasha
aportado al estudio de proteínas expresadasmediante la inyección de su
correspondiente
ARNm o ADNc.
Ins principalesaspectosa estudiarsonlos siguientes:
1- Validación de la nueva metodologíautilizando una proteínade membrana
modelo, el receptornicotínico de acetilcolinaprocedentede la electroplaeade Tbryedo
marmorata.
2- Aplicación de la misma al estudio funcional de Ia P-gp. Este apartado
conllevala previa experimentaciónrelativaa:
2.1- Purificaciónde la P-gp procedentede célulastumorales.
2.2- Incnrpración y deúecciónde la P-gp en la membranadel ovocito
despuésde su inyecciónen el ovocito.
2.3- Actividad de transportede la P-gp incorporadaen la membranadel
ovocito.
2.4- Actividad de canal de cloruro activadapor hipotonicidadde la
P-gp en los ovocitos que han incorporadola proteína.
2.5- Estudioy modulaciónde la actividadde canal de cloruro asociada
a la P-gp.
2OOBJETIVO:
El segundoobjetivo propuestoconsisteen la monitorizaciónde los niveles
energéticos de las células que sobreexpresanla P-gp cuando éstas se incuban en
presenciade un fiírmacoantineoplásico.
JUSTIFICACIÓN
I-os datos bioquímicos, farmacológicosy estructuralesindican que la P-gp
presenta una actividad extrusora de fármacos citotóxicos (13, 18, 21, 22). Sin
embargo,se desconoceel mecanismoexactode eliminaciónde fármacospor la P-gp
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Obieüws
Y, Por tanto, la existenciade un acoplamientoentrela hidrólisisde ATP y la actividad
extrusorade fármacos.El estudiode los nivelesenergéticospermitirá profundizaren
el conocimientodel mecanismode bombeode los fármacosantineoplásicos.
DISENO EXPERIMENTAL
El estudiode los requerimientosenergéticosde las célulasque sobreexpresan
la
P-gp se rc,alizarámedianteel anrflisisde los nivelesde ATP, lactato y consumode
oxígeno de las células P388/100, y sus valores se contrastar¿íncon 1os
correspondientesa una sublíneaparental sensible (P388/S) y con otra sublínea
resistente(P388/20) que no sobreexpresala P-gp. Inicialmente se estudiaran1os
panímetrosenergéticosantes mencionandosen condicionesbasales,para proceder
posteriormentea su estudio cuandolas células se incubanen presenciade un inductor
de resistencia(DNM) y un reversorde la misma(VRP).
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
MATERIALES Y NIÉTOI}OS
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Mabrials
ytuIébdos
I.I\IETODOI,OGIA
REFERENTE A I,1OSCULTTVOS CELULARES.
En este apartado se incluye la metodologíaempleadapara la obtención y
mantenimientode las distintaslíneascelularesque se uttlizancomo maierial biolégico
en los diversosestudiosde estaMemoria.
1- MANTENIMM,NTO DE I,OS CT]LTIVOS CELTJLARES.
Las diversas sublíneascelulares, tanto de la cepa linfocítica de r, rtón LI2I0
como de la cepa de neoplasmalinfoíde P388, también de ratón, se mantuvieron en
cultivo con medio RPMI 1640 (BioWhittaker) suplementadocon 2 gl\ de
hidrógenocarbonato
de sodio (Merck), LO%de suerofet¿l bovino (BioWhittaker), 10
¡rM B-mercaptoetanol(Bio-Rad), 2 mM Glutamina (Biowhittaker), 50 U/ml
Penicilinay 50 p,glml Estreptomicina(BioWhittaker).El cultivo se mantuvoa 37oC
en atmósfera humidificada con el 5% de CO2 en una incubadora(B 5060 EK,
Heraeus). Diariamente se diluyeron las células hasta una densidadde 3 x 10s
células/ml(131).
Las sublíneasresistentesde ambas cepas fueron desarrolladasen nuestro
laboratorio a parar de las líneas parentalesLl2l0 y P388 medianüeexposición a
concentraciones
crecientesde la antraciclinaDaunomicina(132). Ia estabilidaddel
fenotipo resistenúese comprobó periódicamentey el cultivo se mantuvo homogéneo
mediante selección de la población celular por incubación a concentracionesde
ffrmaco apropiadas. I-a capacidadtumorigénica se preservó y comprobó mediante
pasespor ratón cadaZó 3 meses
2. EXTRACCIÓN DE CÉLULAS PROCEDENTESDE RATÓN.
Tanto para obtener células en grandes cantidadescomo pÍua comprobar el
caráctercarcinogénicode las células LI2LA y P388, se inocularon 1 x 10ócélulaspor
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Materials
v Méhtúx
ratón medianteinyecciónintraabdominalen ratonesjóvenesDBAlzlI de 6-8 semanas
suministradospor Iffa Credo (Barcelona). En un periodo de 10-12 días, tras el
desarrollo de tumores ascíticos masivos, se procedió a sacrificar los ratonespor
dislocaciónde las vértebrascervicales.El fluido ascíticose recogió mediantelavado
de la cavidad abdominal con 10-15 ml de disolución tampón DPBS sin calcio
(Biowhittaker)y 1 mM EDTA.
La disoluciónque contienelas célulasextraídasse centrifugóinmediaüamente
a
405 x g durante 7 min a 20oC (rotor de brazo basculanteGh-3.7, Beckman,
la50 rpm). Las células sedimentadasse resuspendieronen el mismo tampón, se
aplicaron a un gradiente discontinuo de Ficoll tipo 400 [Lymphoprep (Nycomed
Pharma)Jy se centrifugarona 450 x g durante25 min a 20oC. I¿ interfaseFicollPBS se recogió y mediantedilución 1:1 con tampón PBS se centrifugó a 405 x g
durante 10 min. El sedimento de células se resuspendió en tampón PBS
determinándoseel número de ellas así como su viabilidad.
3- ENSAYOS DE VIABILIDAD.
Previamente a cualquier ensayo celular, a fin de garantizar la buena
disponibilidad de las células se realizaron ensayosde viabilidad celular medianteel
métodode exclusióncon Azul Tripano (Kodak), coloranteazul que permeahastael
citoplasma en el caso de que la membranaplasmáticaesté dañaÁ:,,criterio utilizado
paraconsiderarla célulacomo no viable.
4 PREPARACION DE LAS DISOLUCIONES DE DNM.
Los niveles de resistenciay de acumulaciónde fármacos de las células
tumorales, así como los estudiosde funcionalidad de P-gp, se realizaron empleando
Daunomicina. [¿s disolucionesconcentradasde estefiírmaco se prepararona partir de
2-3 mg de DNM (Sigma) que se disolvieron en 5 ml de agua bidestilada.
Posteriormentese tomaron alícuotasde la disolución anterior, se diluyeron en metanol
(concentraciones
inferioresa 10 ¡rM para evitar la autoasociación
de las moléculasdel
fármaco) y se determinó su concentraciónmidiendo la absorbanciaa 480 nm usando
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
úIaterials
vMéhtdtx
como coeficientede extinción molar 11500M-tcm-r (133) en un espectrofotómetro
(DU 7500 Spectrophotometer,
Beckman).I¿s disolucionesse guardaronen atmósfera
de nitrógeno a -20oC y periódicamente se comprobó su pureza mediante
aromatografíaen capa fina en placasde silicagel 60, empleandocomo solventede
desarrollocloroformo:metanol:agua(80:20:3).
5- ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD.
Estos ensayostienen como objetivo el determinar el grado de resistenciaa
DNM de cada una de las sublíneasde las dos cepascelularesa travésdel panímetro
IC56, Que se correspondecon la concentraciónde fármaco que inhibe el crecimiento
celularen un 50V0.
L¿s célulasse sembraronen placas de24 pocillos a una densidadde 1 x 105ó
2,5 x 105 células/ml, según se tratasede la cepaLI2L0 o P388, en presenciade
concentracionescrecientesde DNM (cada una de ellas por duplicado). I¿s placas se
incubaron durante 48 h a 37oC y 5% de CO2, determinándosepor triplicado el
número de células por pocillo empleandoun contador electrónico (Counter HF-24,
Ibercell), basadoen cambios de conductividad,que lleva incorporadauna sonda
apropiadapara el tamañode las células.
A partir de los datosobtenidosseconstruyeronlas curvasde crecimientofrente
las distintas concentracionesde fármaco, obteniéndoselos valoresde IC56y a partir de
ellos, el grado de resistenciadefinido como cociente entre IC5s de las células
resistentese IC56de las sensibles.
G ENSAYOSDE ACUMULACTÓNDE DNM.
Células procedentesde las líneas parentales sensibles o de las sublíneas
resistentesfueron centrifugadasdurante7 min a 405 x g y lavadasen una disolución
compuestade: Hepes 10mM pH 7,2 NaCl 130 mM, KCI 5 mM, CaCl2 1,8 mM
(HBS). Tras una nuevacentrifugacióna 405 x g durante7 min, se resuspendieron
en
la misma disolución y se diluyeron a una densidadfinal de 1 x 10ó células/ml
incubándoseen presenciade DNM 3 pM, a20"C. Cuandolas célulasfuerontratadas
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Mabrtals v Mébús
con Verapamil (Sigma) 5 ¡rM, éste se adicionó 2 h antesde incubar con DNM. A
tiempos predeterminadosse extrajeron alícuotasde la suspensióncelular que se
analizaronpor citometríade flujo en un instrumentoEpics Profile I equipadocon un
láserde argóny conectadocon un sistemade adquisiciónde datosy análisisIBM.
Los datosanalizadosincluyen la cuantificacióndel-i) el númerode célulasque
tienen un contenido significativo de DNM (se excluye la autofluorescenciay el
fármacoasociadoa restoscelulares),y ii) la intensidadmedia de fluorescenciaque,
para una población dada,es proporcionala la concentraeiÍnde fármacoasociadoa
cadacélula. [,os histogramasresultantescorresponden
a medidasrealizadasen 10.000
células.Al final de los experimentosseanalizabala viabilidadcelular(134).
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
LIaMda vMtutu
tr. METODOLOGÍA RETERENID A LA INCORPORACIÓNFUNCIONAL DE
PROTEINASEN LA MEMBRANA DE L¡OSOVOCITOSDE Xe¿ap¡s/aens.
I^as actividad funcional de la P-gp se estudió en ovocitos de Xenopuslaeuis
medianteun método novedosoque consisteen la inyección de fraccionespurificadas
de la proteína.I"as principales etapasmetodológicasson:
L- Extracción y aislamientode la membranacelular que conúenela proúeínade
estudio.
2. Purificación de la protefna.
3. Preparaciónde los ovocitos.
4- Microinyección.
5- Estudio funcional de la proteínainsertadaen la membranadel ovocito.
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/ Crcrnatografia
deAfinidad
Diálisis
Frgura E: Esquema de las diversas etapas de la que consüala nueva metodología.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Maerials
vMébdos
Para la validaciónde estanueva metodología,se partió del estudiofuncional
del receptor nicotínico de acetilcolina, proteína mayoritaria en la electroplacadel
Tbtpedomarmoratay cuyaspropiedadesestánperfectamentecaracterizadas.
El esquemaque resumelas etapascorrespondientes
a la metodologíaempleada
se presentaen Ia Figura 8.
A continuaciónse detallanlas diversasetapasrecogidasen el esquemapara el
estudiodel receptornicotínicode acetilcolina:
1. EXTRACCIÓN Y ATSLAMMNTO DE LA MEMBRANA CELTILARQUE
CONTIENE LA PROTEÍNA NE ESTUDIO.
1.1- Obtención de membranasque contienenel nAChR.
Las membranasde receptor nicotínico de Acetilcolina (nAChR) se purificaron
a partir del tejido eléctrico de Tbrpedomarmorata. Ios peces fueron suministrados
por pescadoreslocalesy guardadosen el Acuario del ExcelentísimoAyuntamientode
SantaPola hastael momentode su uso en el laboratorio.
Se homogenizaron200 g de electroplacade Tbrpedomarmorata en baño de
hielo en tampón de extracciónTris 10 mM pH 7,4 EDTA (sigma) 5 mM, PMSF
(Sigma) 0,5 mM, Iodoacet¿mida(Sigma) 5mM. El homogeniz,ado
se centrifugó 10
min a 1900 x g (rotor JA-14, Beckman,3500 rpm). El sobrenadante
se filtró a través
de seis capasde gasa y el filtrado se centrifugó 30 min a 70.000 x g (rotor 35,
Beckman,30.000 rpm). El sedimento(fracciónde membranascrudas)se resuspendió
en 30 ml de tampónTris 10 mM pH 7,4 NaCl 100 mM para su posteriorpurificación
(135). Todaslas etapassellevarona caboa 4oC.
2- PI.JRIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA.
La purificación del nAChR a partir de las membranasobtenidasen el apartado
anüeriorcomprendelos siguientespuntos:
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
I|[abrials
v Mé,lnúts
2.1"-Membranas enriquecidasen nAChR: Extraccién alcaüna.
I-a fracciónde membranacrudase diluyó con H2Ohast¿obtenerA,6 mg/ml de
proteína total y se llevó a pH 11 con NaOH 0,1 M, agiuíndosedurante 2 h a
temperaturaambiente.l¿s membranasalcalinizadasse sedimentarona 70.000 x g
durante30 min (rotor 35, Beckman,30.000 rpm). El sobrenadante,
que contienela
mayor parte de las proteínasperiféricas extraídas,se descartóy la parte superior del
sedimento(pequeñovelo) se extrajo con 2 ml de tampón Hepes 10 mM pH 7,4
NaNO3 100 mM para eliminar la proteínaperiférica depositada(136). El resto del
sedimentocorrespondea la fracciónde membranaalcalinaenriquecidaen nAChR.
2.2- Purificación del nAChR mediante cromatoerafía de afrnidad.
[,a purificación de nAChR fue realizadapor el grupo de1Dr. Gonález*Rosy
se llevó a cabo¡rcr cromatografíade afinidadcon bromoacetilcolina(137).
I-a' fuacciónde membranascrudascorrespondientea la preparaciónde 200 g de
electroplaca,se diluyóa2 mglml con tampónDB-l (Tris 10 mM pH7,4 NaCl 100
nM,
EDTA 0,1 mM) y se solubilizó con Colato de sodio (Sigma) al L%
(concentraciónfinal). I.a, mez.clase agitó suavemente
durante20 min y se centrifugó
durante 50 min a 70.000 x g (rotor 35, Beckman,30.000 rpm). El sobrenadante
resultantese aplicó a una columna de Affigel 10 (ó a01) (Bio-Rad)derivatizadoy
equilibradocon tampónDB-z (DB-1 + colato l%), manteniendoun flujo constante
de 1-1,5ml/min.
Tras el lavadode la columnacon 100 ml de tampónDB-3 (DB-2 suplementado
con 1 mg/ml de lípidos de asolectina),la elución del receptorse llevó a cabocon 50
ml de tampón DB-4 (DB-3 + carbamilcolina (Aldrich) 10 mM), recogiendo
fraccionesde 1,5 ml y uniendo aquellascon mayor concentraciónde proteína. Ia
concentraciónde proteínaeluída se determinómidiendola absorbanciaa 280 nm (1
U.A. correspondeaproximadamente
a 0,6 mg/ml de proúefna(137)). El rendimiento
normal obtenido es de unos 12,5 mg de proteína purificada por 100 g de tejido
aproximadamente.
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Mabrials
vMéftiúts
2.3- kocedimiento de reconstitucién
Ia reconstitución de nAChR se reaJiza por eliminación progresiva de
detergentepor diálisissegúnlos métodosdescritosen (138, 139).
Inicialmentese prepararonlas vesículaspreformadasde asolectinaempleadas
en la reconstitucióndel nAChR. Para ello, lípidos de asolectinade soja (tipo II de
Sigma) se disolvieronen cloroformo, se secaronen rotavapory se sometierona vacío
durante 3 h para eliminar el solvente orgánico. ta película secade los lípidos, se
resuspendióen tampónTris 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM y se solubilizócon CHAPS
(Sigma) al 2-3Vo(concentraciónfinal). Medianteciclos de agitación, sonicaciónen
baño (15 min) y sonicacióncon sondade titanio (3 ciclos de 3 min) alternadoscon
enfriamiento en baño de hielo, se obtuvo un solubilirado transparentecompuesüo
básicamente
de micelasmixtas. Estasmicelassedializaronextensivamente
obteniendo
vesículas útiles para reconstitución (140), que se dividieron en alícuotas y se
congelarona -40oC.
El nAChR purificado, recién eluido de la columna, se meznlócon lípidos de
asolectina o con vesículas de asolectina preformadas según apartado anterior, en
presenciade Colato de sodio al 4%. Estasmezclassolubilizadasde lípido y proüelna
se dializa¡on exhaustivamente
frente a Tris 10 mM pH 7,4 NaCl 100 mM, EDTA
0,1 mM, NaN¡ 0,02% durante 36 h con 3 cambios de tampón (3 x 1 l). A
continuaciónse dializú frente Hepes 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM duranüe8 h en
condicionesde esterilidad. I-as vesículasresultantesson unilamelaresy contienen
incorporadoel nAChR con los sitios de unión de cr-Bungarotoxina
orientadosen m¿ís
de un W% hacíael medioextravesicular(1a1). l¿ muestrareconstituidase dividió en
alícuotas las cuales se utilizaron inmediatamentepara inyectar en ovocitos o se
congelaron a -198oC en presenciade trehalosa(Merck) (5mg de trehalosa/mg
proteína).
2.4- Caracterización del nAChR purificado.
Una cuantiñcación más rigurosa del nAChR purificado se realizó mediante
solubilizaciónde la muestracon SDS (Serva) tVo y post€rior precipitacióncon 10
volúmenesde la mez*la acetona:trietilamina:ácido
acético95:5:5 (v:v), formándose
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Mabrials vMfufus
un par iónico que permite que la proteína precipite quedandoen disolución el
detergentey la asolectina(142). Tras centrifugar a 3500 rpm durante 10 min, el
precipitado se lavó con acetonapara eliminar la trietilamina. Posteriormentela
acetona se eliminó mediante centrifugación a vacío. La proteína precipitada se
resuspendióen SDS I% y se determinósu concentraciónmedianteel métododescrito
por Peterson(143).
El perfil electroforético(en medio reductor)del nAChR purificado mostraba
las cuatro bandas prominentes coffespondientesa las subunidadesdel receptor,
apareciendoun componenteminorit¿rio, de alto peso molecular,adscritoa un canal
de cloruro que copurifica c¡n el mismo (L42).
2.5- Defenninacién de proteftra.
I¿ concentraciónde protelna de las diversasfraccionesde membranase realizó
segúnel método descrito por [,owry y cols. (144), con la leve modificación de tener
que centrifugar las muestraspara eliminar el detergente(Tritón X-100) utilizado en Ia
solubilización de las mismas,puestoque ésteinterfiere parcialmentecon el reactivo de
Folin (Merck).
3. PREPARACIÓN DE LOS OVOCITOS.
Las hembrasdel sapo sudafricanoXenopuslaeuiso suministradospor Blades
Biological en Edenbridge(Kent, G. B.) se anestesiaronmedianteinmersión en un
baño de hielo duranteunos 30 min. A continuación,y, en condicionesde asepsia,
medianteuna incision abdominal se les extraía parte del tejido ovárico. Tras finalizar
se les cosía la herida y se les despertabade la anestesiamediantela atemperacióndel
agua de lia cubet¿. El mismo animal podía volverse a utiliz:rr como donador en
perfectas condiciones al cabo de varias semanas.El tejido ovárico extraído se
colocabaen una placa Petri que conteníauna disolución modificada de Barth (145):
Hepes 10 mM pH 7,4 NaCl 88 mM, KCI I mM, NaHCO3 2,4 m}.4, MgSOr
0,82 mM, ca(No3)2 0,33 mM, caCl2 0,41 mM, suplementadocon Gentamicina
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l|[abrials
v Méfrtdos
(Sigma)0,1 mg/ml o con Penicilina100 U.I. y Estreptomicina
(Sigma)0,1 mg/ml
para limitar el crecimientode bacterias.
Una vez en disoluciónmodificadade Barth los folículosováricosen estadiosV
y VI de Dumont (146) se fueron separandomanualmentecon ayuda de unas pinz.as
finas de relojero. Se seleccionaron
los folículosque sehallabanen buenascondiciones
y se mantuvieronen una incubadora(Hotcold-S, Selecta)a l6-l8oC, en viales de
centelleode 5 ml que conteníandisoluciónde Barth estérilcon antibióticos.
En la mayoría de los casos, y salvo que se especifiquelo contrario, los
ovocitos utilizados en el registro fueron separadosenzimátícamentedel resto de las
capasde célulasfoliculares,con objeto de facilitar la introducciónde microelectrodos
para el registro electrofisiológicoy la microinyecciónde distintas sustanciasen el
interior del ovocito. Para ello, los folfculos previamenteseleccionadosse traspasaron
a viales de centelleoque conüenían0,8 ml de una disoluciónde colagenasa
(tipo IA,
Sigma) a una concentraciónfinal de 0,5 mg/ml disuelta en una disolución de
composicíón:Hepes5 mM pH 7,0 NaCl 115 mM, KCI 2 mM y CaCl21,8 mM
(Ringer). Durante el tratamiento, los viales fueron sometidosa una suaveagitación
(agitadorSBS,5 rpm) a temperaturaambienúe
duranteaproximadamente
50 min. Tras
esetiempo, con la ayudade un vorúex, se desprendieronlas diversasenvolturasde los
ovocitos (147, 148). Posteriormente,los foliculos se lavaron 3 vecescon disolución
Ringer y se guardaronen viales nuevoscon disolución modificada de Barth estéril a
16oC. En algunasocasionesel tratamientono fue del todo efectivo y los folículos
quedaron apatentementeintactos. En esos c¿lsos,con la ayuda de una lupa de
disección(Nikon) se pudieron desprenderfácilmentecon unas pinzasde relojero la
capaepitelial y con ella la tecadel folículo (149).
+ MICROINYECCIÓN.
Mediante la ayuda de un nanoinyector electrónico (A203XVZ, World
Precision Instruments), se inyectaron 50 ó 100 nl de muestra (1 ó 2 pulsos,
respectivamente)en cada uno de los ovocitos. El equipo de microinyecciónse
completacon una lupa de disección(Nikon) y una camaritapara inyectar de diseñono
comercial.
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Para la inyección se utilizaron capilares de vidrio específicospara el
nanoinyectorconvertidosen micropipetas(puntade 20-30 ¡^rmde Aext.) medianteun
estiradorde microelectrodos(PUL-I, world precisionInstruments).
Figura 9: Esquemadel sistemade microinyecciónen ovociüos.De izquierda a derechase prese,ntanla
fuenúede luz fría, la camaritade inyeccióny la lupa binocular, y el nanoinyecüorelechónico.
La inyección se efectuó en el hemisferio vegetal, normalmente cerca del
ecuadordel ovocito, evitando así inyectar en el núcleo de la célula localizado en el
polo animal. Al final de la inyección se desecharonaquellosovocitos que no sellaron
bien tras la inyección.
Cuando la microinyección se realiz¡ con muestraspreviamentecongeladas,se
efectuó una descongelaciónnlpida y las muestrasse homogenizaronmediante3 pases
a travésde unajeringuilla tipo t{amilton de 100pl.
5. ESTUDIO
FTINCIONAL
DE LA
PROIE,ÍNA
INSERTADA
EN LA
MEMBRANA DEL OVOCITO.
Paralos estudioselectrofisiológicos,los ovocitosse colocaronen una camarita
de registro de metacrilatoen dondepodfan ser contínuamentesuperfundidos,bien con
disolución Ringer de rana u otras disoluciones. La camarita de registro de forma
husifomey 150 y.l de capacidadtotal tiene situadoen su centro una pequeñabasede
aceroinoxidablecon forma de cono invertido (Aext : 1,2 mm) paraque el ovocito,
al ser una célulaesférica,quedefijo.
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Mabrials -vMéfttfus
En un lado de la camarita se sitúa la entradade las disoluciones,donde un
sistemade doble via permite superfundircontínuamente
al ovocito con dos tipos de
disolucionesdistintassin que ello implique una mezclade ambas.I-a disoluciónllega
a la camaritapor gravedaddesdelos reservoriossituadosa una altura de 1 m sobreel
lugar de registroa travésde tubosde Tygon y la velocidadde superfusiónse controla
mediante unos reguladoresde flujo (Dial-A-Flo, Abbottt). En la entrada de la
camarita, segúnlas condicionesdel laboratorio,se conectóuna célula de Peltier que
calentabao enfriabalas disolucioneshastallegar a la temperaturadeseada.
En el otro lado de la camarita,la disoluciénera extraídamediantesuccióna
través de un capilar de vidrio unido por un tubo de Tygon a una red de vacío a través
de doskitasatos.
La longitud de los tubos de entraday salidade las disolucionesde la camarita
se miniminiza en lo posible para amofiguar los movimientos y vibraciones
reduciéndose
así la posibilidadde introducir artefactosen el registro.Adicionalmente,
la camarit¿de registro esuífijada a la basede una lupa convencional(Nikon) colocada
sobre una mesaantivibratoria para evitar que posiblesvibracionesdañaranel ovocito
duranüeel registro electrofisiológico.
Una vez preparadala camaritapara el registro, se transferíael ovocito desdeel
vial de incubación a la base metálica de fijación medianteuna pipeta Pasteur,
colocándoseen la posición deseadamedianteuna varilla de vidrio.
5.1- Registroselectrofuiológicos.
I-os registroselectrofisiológicosse realizaronmediantela técnicade fijación de
voltaje (voltage-clamp)con dos microelectrodos(Figura 10). En estaté,cnicauno de
los electrodos,electrodode voltaje, se introduce en el ovocito y se conectaa un
preamplificador (VF-180, Biologic) y se utiliza para medir la diferencia de potencial
entre el interior del ovocito y la disolución de la camaritade registro que lo rodea, es
decir, el potencial de membrana. El otro elechodo, electrodo de corriente, se
introduce tambien en el ovociüoy se utiliza para pasarcorriente. El tercer elemento
fundamentalen el sistemaes un amplificador diferenciat (CA-100, Biologic) utilizado
para compararel voltaje que se quiere mantener(potencialcomando)y el que poseeel
ovocito; la diferencia, güo es el potencial de error, es la que va a hacer que el
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6
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
lVlabrials
vMé&túts
amplificador de corriente (VF-1800, Biologic) permita el paso, en función de |a
ganancia,de una determinadacorrienteal ovocito hastaque la señalde error seacero.
gananciadel amplificador
amplificador
electrodo de
registo de
voltaje
ue
electodo
corriente
registo de
voltaje
Figura 10: Esquemaelechónicodel sistemade regisho en "voltage-clampncon dos microelectrodosen
ovocitos.
Se utilizaron electrodosde Ag/AgCl para establecerel contactoeléctrico entre
la tierra y los microelectrodoscon la disolución salinade la cámara.Los electrodosde
tierra y del baño fueron de plata clorurada de lmm de seccióncon su extremo final
aplastadopara aumentar la superficie de contacto. La disolución de la camarita se
conectócon los electrodosde tierra y bañoa travésde un capilar de vidrio relleno con
una disolución de ag¿uosaal 2Vo en Ringer (puente de ágar); de esta forma la
composicióniónica del baño pudo cambiarsesin apenasmodificacionesen el potencial
de referencia.
[.os microelectrodos fueron preparados por medio de un estirador de
microelectrodosutilizando vidrio de borosiliato de ñext : 1,5 mm y con un
filamento interno para facilitar su posterior llenado (World PrecisionInstruments).El
electrodo utilizado para medir voltaje se rellenó con una disolución de KCI 3M y el
utilizado para inyectar corriente se llenó con una disolución de CH3COOK 3M, ya
que esteión permite pasarmejor grandescorrientes.
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
MabríalsyMébdos
[.a resistenciade los microelectrodosutilizadosfue baja (de 2 a 5 MO para el
electrodode voltajey de 0,5 a 3 MQ parael de corriente).Paraello, se rompieronlas
puntasde los electrodosrozánzolasligeramentecon la basede la camaritade registro
mientras se medía la resistencia.Resulta convenienteutilizar electrodosde baja
resistenciaporqueasí se minimiza el ruido eléctricointroducidoen el amplificadorde
voltaje y se puedeninyectargrandescorrientes(hastadecenasde microamperios).En
Ia ptáctica, el tamaño de la punta de la pipeta y por tanto la resistencia del
microelectrodo,fue un compromisoentre una mejorade las característicasdel registro
y el daño producido en la membrana del ovocito al introducir la punta del
microelecffodo. Ovocitos obtenidosde determinadosknopus resultaronmás frágiles
que los obtenidos de otros donadores, tolerando peor la introducción de los
electrodos. Normalmente el potencial de membrana y la resistencia de entrada
disminuyerontras la introducciónde los electrodosen el ovocito, por lo que antesde
iniciar los registros se dejó un tiempo de recuperación,en general de unos pocos
minutos hasta que se consiguió una línea de registro estable (147). En algunos
ovocitos al introducir los electrodos se evocaron oscilaciones espontáneasque
desaparecieron
al cabode unosminutos.
En general, y a menosque se indique 1ocontrario, el potencial de fijación fue
de -60 mV, por ser en el ovocito, un valor muy alejadodel potencialde equilibrio de
cualquierade los ionespresentesen el mediode superfusión.
Para analizar la dependenciade las corrientes objeto de estudio frente al
voltaje, se dieron pulsosdespolarizantes
o hiperpolarizantes
respectoal potencialde
fijación medianteel empleo de un generadorde pulsosprogramablecon salidaaislada
(SMP-310,Biologic) conectadocon el amplificadorde fijación de voltaje (Figura 10).
La señal de corriente se filtró a 30-500 Hz medianteun filtro pasabajostipo
Butterworth de 4 polos (VBF3, Kemo) y se monítonzí simultáneamente
con el
potencial de membrana en un registrador de plumillas, un osciloscopiodigital
(Nicoler3l0, Nicolet) y, medianteuna tarjeta analógico-digiral(DT-2801A, Data
Traslation), en un ordenador PC-compatible (procesador 80486DX2) para su
almacenajey posterioranrílisismedianteel uso de distintosprogramasinformáticos:
MCOLET ofrecido por Rico Miledi (University of California, Irvine), VCAN
ofrecido por J. Dempster (University of Stathclyde, GB), Sigma plot (Jandel
Scientific). En todos los casos,la frecuenciade muestreoutilizada fue el doble de la
frecuenciamáxima contenidaen la señal(frecuenciade firtrado).
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I
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Mabrials
vfuIéfrtúx
Por convenio, se han consideradocomo comientesde salida ("outward")
aquellasdebidasa la salidade cationesdel ovocito y se representancomo deflexiones
haciaarriba; mientrasque las corrientesde entrada("inward") son las producidaspor
la entradade cationesal ovocito y se muestrancomo deflexioneshaciaabajo.
5.2- Estudio de las corrientes activadas por acetilcolina.
Se estudiaronlas corrientesevocadaspor la aplicaciónde acetilcolina(ACh)
(Sigma) tanto en ovocitos sin inyectar como en ovocitos inyectadoscon membrana
purificada procedentede Tbrpedoo con el nAChR reconstituidoen vesículaslipídicas
de asolectina.
Los registros de las corrientes se realizaron entre 4 y ñ h despuésde haber
teahzada la inyección. Durante el registro los ovocitos se superfundieron
continuamentecon disolución Ringer a la que se le añadió sulfato de atropina (Fluka)
0,5 ¡,rM para evitar las respuestasmuscarínicasque presentanciertos donadores.[¿
concentración de ACh aplicada osciló entre 1 ¡¿M y 1 mM. I¿ velocidad de
superfusiónfue generalmenüe
de 3 mUmin.
5.3- Aplicaciones locales de acetilcoHna.
En algunosexperimentosse realizaronaplicacioneslocalesde ACh, mediante
micropipetasde vidrio con ACh lmM conectadas
a un sistemade inyecciónneumático
(Picospritzer, GeneralValve Co.). Ia aplicación se reabzómedianüepulsosde unos 2
x 105Pa durante40 ms.
Las aplicacionesextracelularesse realizabanmediante la aproximación de la
plpetla a la superficie del ovocito hasta que se podía observar una pe4ueña
deformaciónen su superficiea travésde la lupa (40 aumentos),entoncesse alejabael
microelectrodoaproximadamenüe
10 p,my se apücabael agonista.
En las aplicacionesintracelulares, la pipeta se acercabahasta la superficie y
con sumo cuidado se inhoducía en el interior, muy cerca de la superficiedel ovocito.
Tras esperarel sello de la pipeta se aplicabala disotución de ACh. Posteriormentese
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Wbriales v Mébdos
sacabala pipeta del interior del ovocito y se comprobabaque la pipeta no se había
obstruído.
En la siguientefigura seesquematizan
dichasaplicaciones.
APLICACION EXTRACELULAR APLICACION INTRACELULAR
Hgura 11: Esquema representativo de las aplicaciones locales de ACh en la membrana del ovociúo en el
espacio extracelular y en el espacio intracelular. El tamaño del ovociüo con respecüoa la pipeta no está
representado a escala.
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50
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Maferíalx
v Mé.tn¡*x
III- METODOLOGIA REFERENTE AL ESTUDIO FTINCIONAL DE LA P-gp.
Una vez demostradala validez del nuevo método de estudioen nAChR, se
procedió al estudio funcional de P-gp haciendouso de una estrategiaexperimental
similar. las etapasde dicho estudiosecorresponden
con:
1. EXTRACCIÓN Y AISLAMM,NTO DE LA MEMBRANA CELULAR QTIE
CONTIENE LA P-gp.
1.1- Obtención de la fracción microsomal.
Para la obtenciónde la fracción microsomalde las células LLZIA se utilizaron
indistintamentecélulaspropagadas
en cultivo o en ratonesDBN21J(150).
Las célulasse resuspendieron
en tampónde extracciónde composición:TrisHCI 10 mM pH 7,4 Nacl 200 mM, EDTA 5 mM, PMSF 0,5 mM e Iodoaceramina
5mM y se lisaron en una bomba de cavitación gaseosatipo Parr (Parr Instr.),
mediantenitrógenoa 5,5 x 106Pa durante60 min.
La suspensión
resultanteseprocesóen un homogenizadorde cuchillasPolytron
(Kynematica),durante3 periodosde 90 s al70% de potencia.Estehomogenizadose
sometióa un procesode centrifugacióndiferencial:
i) A 450 x g durante 5 min en una centrífuga refrigerada de mesa (GS-6R,
Beckman,2.000 rpm.) a fin de sedimentarcélulasenterasy fracciónnuclear.
ü) El sobrenadantede la fracción anterior se centrifugó a 25.N0 x g duranúe
20 min (rotor 35, Beckman,17900rpm.).
iii) EI nuevo sobrenadantese sometióa una terceracentrifugacióna 200.000 x
g durante60 min (rotor TFT-70.38, Kontron, 50.000rpm).
El sedimentoobtenido en estacentrifugaciónrepresentala fracción microsomal
(membranaplasmática, fragmentos de retículos endoplasmáticoliso y rugoso, y
complejo de Golgi básicamente). Dicho sedimento se resuspendióen tampón de
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fuIabriala
vMéhtúts
composiciónadecuada,dependiendodel tipo de procesoa que iba a ser sometido
posteriormente,y se homogenizómedianteun homogenizador
tipo Potüer-Elvehem.
1.2- Determinacién de proteÍna.
El contenidoen proteínade las distint¿smuestrasse determinó medianteel
métodode Bradford (151). Este métodose basaen el desplazamiento
del máximo de
absorbanciadel coloranteAzul CoomassieBrillanúeG-250 desde465 nm a 595 nm
cuando forma complejos con proteínas. Como patrón de proteínas se utilizó Gamma
Globulina(Bio-Rad).
1.3- Fraccionamiento de proteína.
El fraccionamiento del componenteproteíco de la fracción microsomal se
realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDSPAGE) según el método descrito por Laemmli (152), empleandoun equipo de
electroforesis Miniprotean (Bio-Rad). I-as muestrasse desnaturalizaronmediante la
adición de tampónde desnaturalización
Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8 glicerol 5%, SDS
2%, azul de bromofenol0,005% en condicionesreductoras(p-mercaptoetanol
5%).
El gradode reticulaciónfue de 7,5Voen el gel separadory del 4Voen el concentrador.
[¿ electroforesis se realizó empleando un voltaje constante de 80 V para el gel
concentradory 180 V para el gel separador.
Para el revelado de las bandas de proteína, los geles se tiñieron con una
disoluciónde Azul de CoomassieR-250 (metanol 40%, ácidoacético l0%, AzuI de
CoomassieR-250 A,LTo). I"a destinción se realizo medianterepetidoslavadoscon
metanol4A%, ácido ac'étíco7 Vo.
1.4- Dgtección de la P-gp mediante Western-Inmunotransferencia.
El análisis de la presencia de la P-gp se llevó a cabo por westerninmunotransferencia
medianteel métododescritopor Towbin y cols. (153) empleando
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Mahrínlx
vMé.lnúts
el anticuerpomonoclonalespecíficoC-2L9 (CentocorInc.) que reconoceun epítopo
interno de la P-gp cercano a la zona de unión de ATP (79). Finalizada la
electroforesis,las proteínasse transfirieron a soportesde nitrocelulosamedianteel
métodode elución electroforética,que consisteen sumergirel conjuntogel-membrana
en una cubetallena con tampónde transferenciaTris 50 mM, Glicina 380 mM, SDS
0,1% y Metanol20%. La transferencia
se realizóduranüe3,5 h a 4oCy a corriente
constantede 150 mA.
Posteriormentela membranase bloqueócon un tampóncompuestode DPBS
(Biowhittaker),Tween-2O(Bio-Rad)O,lVo,lechedesnatada
en polvo 0,5% y azidade
sodio0,01% durantet h a temperaturaambiente,para evitar la unión del anticue{poa
la superficie de la membrana.Tras el bloqueo, la membranase lavó con DPBS,
Tween-200,1%, azidade sodio 0,0I% y seguidamente
se incubócon el anticuerpo
monoclonal C-219 a una dilución I:250 en el tampón anterior suplementadocon
2 mg/ml de BSA (fracción V, Sigma)durantetoda la noche,a temperafuraambiente
y con agitzción contínua. La membranase sometió a cuatro lavados, de 5 min cada
uno, con el tampón de lavado anterior, y se procedió a la fase de detección del
anticuerpoprimario, que dependiendodel métodoutilizado (fosfatasaalcalinao ECL)
éstapodía desarrollarsecomo:
i) Fosfatasaalcalina: La membranase incubó con un segundoanticuerpoIgG
de cabra antirratón conjugado con fosfaüasaalcalina (Boehringer), a una dilución
1:3.000 (0,4 p.glml) en el mismo tampónque el primer anticuerpodurantet h a
temperaturaambientey con agitación. La membranase lavó con tampónTris-HCl
100 mM pH 8,8 NaCl 100 mM, Mgcl2 5mM durantetres periodosde 5 min. La
actividad enzimátícade la fosfatasa alcalina se detectó medianterevelado con una
disolución que contenía 4-nitro azul de tetrazolio 3,75% y 5-Bromo-4-Cloro-3Indolilfosfato (Boehringer) l5Vo. Ia" reacniónse detuvo lavando la membranacon
agua.
ii) Sistemade detecciónECL (Enhancedchemicalluminiscence,Amersham).
En estemétodo,la membranase incubó con un segundoanticuerpoanticueqpoIgG de
oveja antirratón marcadocon peroxidasade rábano(Amershan)a una dilución 1:1000
en el mismo tampónque el primer anticuerpodurante t h a temperaturaambientey
con agitación.A continuación,la membranase lavó con tamñn Tris-HCl 50 mM pH
7,5 NaCl 150 mM, Tween-2O0,1% duranteun periodode 15 min y dos de 10 min.
Seguidamente,la membranase incubó con los reactivosA v B del Kit de deteccióna
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Mabrials
vMéttús
una relación 1:1 y tras el secadode Ia misma, se puso la membranaen contactocon
una película de autoradiografía(Hyperfilm-Ecl, Amershan)duranteun tiempo que
oscilóentre1 v 20 min.
2- PIIRIFTCACTÓN DE LA P-gp.
La purificación de la P-gp requiere de la solubilización de la frapción
microsomalen la que se encuentra.Paraello, se procedióa un procesode dos etapas
sucesivasde solubilización.
En la primera etapa, se realizaronensayosde solubilidadcon tres detergentes
distintos: dos de tipo zwitteriónico, Zwittergent 3-12 (Calbiochem)y CHAPS (Sigma)
y uno aniónicoderivadode las salesbiliares, Colatode sodio (Sigma),frecuentemente
empleadoen la solublLizaciún
de diversasproteínasde membrana(137).
El tiempo de solubilización apropiado se determinó utilizando diversas
alícuoüas de fracción microsomal que se solubilizaron con distintas relaciones
proteína:deüergente,
desdeL:0,25 hasta1:15 (w:w), a intervalosde tiempode 30 y
60 min respectivamente.El proceso se realizó a 4oC y con suaveagitación durante
periodos de 15 min. Transcurrido el tiempo de solubilizacíón, las muestrasse
sometierona centrifugacióna 200.000 x g durante 2O min (TFT-70.38, Kontron,
50.C)00rpm) en una ultracentrífugarefrigerada (154). I-a, ftacción insoluble se
resuspendióen tampónTris 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM.
Las distintas fracciones(soluble e insoluble) obtenidasde la solubilizacióncon
los diversos detergentesse analiza¡onmediantela determinacióndel contenidode
proteína,por el métodode Bradford (151), y la detecciónde los nivelesde P-gp por
Western-Inmunotransferencia
( I 53).
I-a fracción que contenía la P-gp se sometió a una segunda etapa de
solubilizaciónen las que se utilizaron los siguientesdetergentes:CHAPS, Nonidet
P-40 (Sigma),N-Octilglucósido(Calbiochem)y Zwinergent3-L2.
Al igual que 1o descrito en la primera etapa, se analizaron las fracciones
obtenidastras centrifugar las muestrasen cuantoa su contenidorelaúvo en P-gp.
La reconstituciónde la P-gp parcialmentepurificada se realizó por eliminación
del detergentede las muestrassolubilizadasmediantediálisis exhaustivafrente a
t¿mÑn Hepes10 mM pH 7,0 KCI 140 mM. Previamentea la diáIisis.las muesrrras
se
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Mabrial*
vMéútúx
suplementa.ron
con 5 mg de lípidos de asolectinapor mg de proteínapara evitar la
precipitaciónde las proteínasde membranas,particularmentede Ia P-gp.
3- ESTUDIO FTINCIONAL DE LA P-gp INSERTA-DA EN LA MEMBRANA
DEL OVOCITO.
Tras la preparaciónde los ovocitos y la microinyección de las distintas
muestrasenriquecidasen P-gp (ver apartadosII-3 y II-4), se procedió al estudio
funcionalde la P-gp insertadaen la membranadel ovocito.
3.L- Detecciónde la P-gp en la membrana de los ovocitos.
Las membranasprocedentestanto de ovocitos sin ínyectarcomo de ovocitos
que fueron previamenteinyectadoscon fraccionesque conteníanlu P-gp, se aislaron
manualmentesegúnel procedimientodescrito por Sadlery Maller (155). Para 1ocual
los ovocitosse incubaronen una disoluciónhipotónicade composiciónHepes10 mM
pH 7,0, NaCl 10 mM en baño de hielo y se les efectuó un pequeñocorte para que el
contenido intracelular pudiera salir at exterior. Al cabo de 20-30 min se cogían las
membranascon la ayuda de unas pinzas de relojero el ovocito y se elevabanhasta
llegar a la superficie de la disolución donde la tensión superficial arrastrabael
citoplasma que aún se mantenía unido a la membranacelula¡. Tras lavado de las
membranas,éstasse sedimentaronmedianteuna centrifugacióna 15.000x g durante
5 min a 4oC (Biofuge 1"5,Heraeus,13.000rpm). Las membranasse resuspendieron
en tampón de desnaturahzacíóny alícuotas correspondientesa muestras de 20
membranas,se procesaronmediante Western-Inmunotransferencia
para la detección
de P-gp, tal como seha descritoanteriormenteen el apartadoIII-1.4.
3.2- Il,ledidas de actividad de transporte de fármacos,
A fin de deüeminar la capacidad transportadorade la P-gp, las diversas
alícuotas obtenidasen las dos etapasde purificación anteriores (apartadoIII, 2), se
sometierona ensayosde actividadde transportede fármacosantitumorales.
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JJ
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Mabrialu
vMétodtx
[¿s muestrasque contienenla P-gp: fracción microsomal,fracción insoluble
obtenidatras el tratamientocon Colato y fracción solubilizadapor Zwittergent3-L2 y
dializada,se microinyectaronen ovocitosde knopus. Muestrascontrol, procedentes
de célulasL1210/S fueron procesadas
en las mismascondicionesque las procedentes
de las célulasresistentesLl2l0llffi.
Transcurridas20-30 h de la inyección,gruposde 10 ovocitosse incubaroncon
DNM 0,6 pM conteniendo1 ¡rCi de H3-DMvI (NEN Products).La temperaturade
incubaciónfue de 25oC, el volumen total de muestrade 0,5 ml siendoel tampón
empleadoRinger pH 7,4. A los 90 min los ovocitos se trasvasarona viales de
centelleoconteniendo200 ¡rl de SDS al 27a. Una vez solubilizados,se les añadió5 ml
de líquido de centelleo [Ready Micro, (Beckman)] a cada viat y se procedió a su
medidaen un contadorB (LS 2800, Beckmann).En los experimentosde reversióndel
transpofte por VRP, éste se adicionó 60 min despuésde la DNM y se mantuvo
durante30 min.
Los niveles de acumulaciónde DNM se presentancomo el porcentajede
radioactividad del contenido intracelular de los ovocitos con relaeíón a la
radioactividadtotal añadidaen el pocillo respectivo.El transportede DNM al exterior
celular se expresacomo diferencia entre los niveles de DNM acumuladapor los
ovocitos inyectadoscon muestracont¡ol respectode los inyectadoscon muestraque
contieneP-gp.
3.3-Medidas de osmolaridad.
La osmolaridadde las disolucionesempleadasen el estudiode la actividadde
canal de cloruro activado por hipotonicidad se realizó en un osmómetroKnauer, que
se basaen el ciflculo de la conductividadeléctrica de una disotución cuandoésta pasa
del estadolíquido al sólido. Para calibrar el aparatose utiliza H2O desionizadacomo
valor 0 mOsmy una disoluciónde NaCl al1,2687% en H2O desionizadacomo valor
400 mOsm.
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Mnle¡ínls
v Mélndx
3.4- Estudio de las corrientes activadaspor hipotonicidad.
El estudiode las corrientesactivadaspor hipotonicidadse realizó medianteel
método de fijación de voltaje con dos electrodos.Tanto las células no inyectadas
como las inyectadascon muestrascontrol o con aquellascon P-gp, se sometierona un
protocolode pulsosdespolarizantes
de 800 ms de duración,desde-100 mV (potencial
de fijación) a -60 mV, -20 mV, +10 mV, +40 mV y +80 mV. I.os pulsos se
aplicaron en Ringer Normal isotónico (RI$, y en dos medios hipotónicosderivados
del anterior donde únicamentese disminuye la concentraciónde NaCl, pasandode
115 mM a 75 y 45 mM (RH-75 y RH-45, respectivamente).Los pulsos
despolarizantesse aplicaron tras 5-10 min de haber cambiadola disolución para
asegurarque el intercambio de los mediosen la camaritafuera tot¿l.
Las relacionescorriente/voltaje de la corriente activadapor hipotonicidad se
presentancomo el valor medio de las corrientes evocadasen medio hipotónico, eü€
previamentehabían sido normalizadasmediante la asignaciónde lffiVo al valor
máximo de corriente. Las corrientesnetasdebidasal medio hipotónico se calcularon
mediantela diferencia entre las corrientes evocadasen medio hipotónico y en medio
isotónico.En los pulsosa +4A y +80 mV aplicadosen mediohipotónico,el valor de
c¡rriente se extrapoló a t:
0, debido a que el componente capacitativo de la
membranadel ovocito impidió el registro de la corriente iónica en los primeros 5-20
ms.
El cálculo de las amplitudesde la corrienteevocadaWr medio hipotónico,se
efectuó en los pulsos a +80 mV, extrapolandola corriente a t: 0 para evitar su
inactivación. Esta determinación se realizó únicamente en aquellos experimentos
donde se aplicaron pulsos en medio isotónico anúesy despuésde su aplicación en
Ringer hipotónico.
En las corrientesnativasdel ovocito activadaspor hipotonicidad,se analizóel
efecto de diversos f,ármacossustraúoso moduladoresdel transportepor P-gp (DNM,
vRP).
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Mabrials
vMéb&ts
TV. METODOLOGÍA REFERENTE AL REQUERIMM,NTO ENERGÉTICO DE
LAS CÉLTJLASP38S.
I¿ P-gp transportaf¿írmacos
al exterior celular mediantela hidrólisis de ATP.
Para estudiarlos requerimientosenergéticosde la P-gp como bombaactiva del eflujo
de f¿írmacos,se han estudiadoalgunosaspectosrelativosal metabolismoenergéticoen
las célulasP388. Las determinaciones
experimentales
comprenden:
1- CONSUMO DE OXÍGENO.
I¿s medidas de consumo de oxígeno se realizaron de forma amperoméffica
mediante un oxígrafo (YsI-5331, Yellow Spring Instruments) que emplea un
electrodo de Clark, uno de los más selectivosque existen. Sus especificionesse
recogenen el ,Afrndice I.
Las muestrascelularesse mantuvieronaisladaspara prevenir el intercambiode
02 entre la cámarade muestrasy la atmósferamedianteel cierre entre el soportedel
electrodo y las paredes de la cámara de muestras. Antes de cada experimento se
procedió al calibrado del aparato. EI rcU% representaal tampón saturadode oxígeno
a la temperaturadel experimentoy el 0% a una disolución saturadade tiosulfito de
sodio en dicho tamprón.La temperaturade la cámarade muestray el dispositivo del
electrodo se manfuvieronconstantesa 37oC medianteel empleo de un baño de
temperaturacirculantede precisión* 0,1oC (K, Haake).
Las suspensiones
de célulasen HBS se llevarona una densidadfinat de 1 x 106
células/ml (condicionesbasales).Alícuotas de 6 ml en la cámarade muestra se
equilibraronal aire con agitaciónsuavey continuadurante7,5 min. A continuaciónse
introdujo el electrodoen la camaray se selló. Tras la esperade otros 7,5 min, tiempo
requerido para alcanz-arel equilibrio térmico de todo el sistema, se procedió al
registrocontínuodel consumode oxígenoduranüe10 min.
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Mabrials
vMéhtúts
La adición de glucosa(Merck) 10 mM o azidade sodio (Merck) 10 mM como
efectoresdel metabolismoenergético,se realizóinmediatamente
antesde introducir el
electrodoen la cámarade muestra.
Paraanalizarel efectode DNM en el metabolismoenergético,suspensiones
de
célulasen condicionesbasalesse incubaroncon el fármacoa una concentraciónfinal
de 3 ¡rM a 37oC y seprocedióal registrode consumode oxígenoa diversostiempos:
0, 30, 60 y 90 min. I-os experimentosen presenciasimultiíneade DNM y VRP se
llevaron a cabo preincubandocon VRP a una concentraciónde 5 pM durante
120 min. Al finat de cada experimento se efectuó el correspondienteensayo de
viabilidadcelula¡.
2- MEDIDAS DE LACTATO.
El procedimientoempleadofue de tipo enzimáticobasadoen la reducciónde
NAD+ por la enzima lactato deshidrogenasa(LDH) que tiene como sustratoal ácido
lactíco. La ecuaciónque rige el procesoes la siguiente(156):
Lactata+ NAD+.-
lactatodeshi4logt$3-
piruvato + NADH + H+
El NADH tiene un miíximo de absorbanciaa 340 nm, propiedadutilizada para
cuantificar la cantidadpresentede lactato en la reacciónmedianteespectrofotometría.
El ensayose llevó a cabo partiendode suspensiones
de 10 rnl de célulasde
densidad 1 x 106 celulas/ml en medio HBS a 37oC (condicionesbasales).Tras
centrifugacióna 405 x g durante 10 min a temperaturaambiente,el sedimentose
resuspendióen ácido perclórico aI l0% con el fin de liberar el contenido
citoplasmático y precipikr la proteína así como las diversas estructurascelulares.
Posteriormente,todo ello fue sedimentadomediantedos centrifugaciones
sucesivasa
15.000 x g durante 1 y 5 min respectivamenúe
(Biofuge 15, Heraeus,13.000rpm).
Del extracto citoplasmáticose tomaron diversasalícuotasque se incubarondurante
30 min a37oC con una disolucióntamponada
con glicina apH9,2 que contieneel
enzima(LDH de músculode conejo, Boehringer)y NAD+ (gradoII, Boehringer).I-a
absorbanciade NADH se registrócon un espectrofotómetro
(UltrospecIII, Pharmacia
LKB).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
59
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Ma@iak v Métutus
Las incubacionescon efectoresdel metabolismoenergéticoy las referidasa
VRP y DNM seefectuaronde la mismaforma como sedescribeen el apartadoIV-1.
3- MEDIDAS DE ATP.
Estasmedidasse realizaronmedianteun ensayobioluminométncoque se basa
en la luminiscenciade oxiluciferina que se generaen la siguiente'reaccióncatzlizada
por la enzimaluciferasaobtenidade Photinuspyralis ( Americanfirefly) (157):
ATP + D-luciferina*o.1-!y9lrgt1tl!'tg2t*
ppi + AMp + cor * luz
oxiluciferina+
L
El métodoes altamentesensibley permitela determinaciónde nivelesde ATP
comprendidosentrelos rangosde 1 x 10-8a 5 x 10-13M.
Para ello se parte de suspensiones
de célulascon una densidadde 1 x 106
células/ml en medio HBS a 37oC (condicionesbasales).Alícuotas de 50 f¿l se
incubaron con la mezrla de reacción 1:1 (v:v) [Kit ATP bioluminiscenceHS,
(Boehringer)1,y se midió la luminiscenciaal solubilizar la membranade las células
con Tritón-Xl00 (Bio-Rad)a una concentraciónfinal del lVo (w:v). I¿s medidasde
luminiscenciase realizaronen un luminómetroLKB-1250de alta sensibilidad.
I¿s medidasde ATP en presenciade glucosa,azidade sodio, vRp y DNM se
efectuaronen las mismascondicionesespecificadas
en el apartadoIV-l.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
60
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Volver al índice/Tornar a l'índex
Mabrialw vMébdos
v- eNÁr,rsrs
nsrloÍsrrco.
Los datosde los experimentosfueronanalizadossegúnel siguientetratamiento
estadístico:
i) Determinaciónde la mediaaritmética(;) y error esuíndardde la media (e.
s.m.).
iil Aplicación del criterio t de Studentpara determinarsi dos mediaseran o no
significativamentediferentes.
iiíl Construcciónde histogramasde distribuciónde frecuenciasde los valores
experiment¿Iesdentro de una población.
iv) Anrílisis de la varianzaANOVA para comprobarlas diferenciasentre los
valores de los distintos grupos. Si los grupos comparadosmostraban diferencias
significativas (p<
0,05), se utllirn la prueba de Student-Newman-Keulspara
discriminar entre qué grupos existían diferencias.Cuandolos valorespresentabanuna
variabilidad consíderableentre ellos, y no se ajustarona una distribución normal, para
comparardiferenciasentre grupos se utilizó el test de Wilcoxon. Cuandohubo que
establecer si más de dos grupos eran diferentes o ño, se utilizó el test de
Kruskal-Wallis. Las diferenciassignificativasentre grupos se han representado
según
la siguienúenomenclatura:
(*)
(**)
p ( 0,05
p ( 0,01
(***) p ( 0,001
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
61
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CAP.ITT]LOI
¿PRESENTALA P-gp ACTIVIDAD DB
CANAL DE CLORURO?
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REST]LTADOS
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CarútuIoI
1.1- RESPTJESTA
NATIVA A ACh EN OVOCITOS.
I-os ovocitosde algunosdonadoresrespondena la aplicaciónde ACh con una
reduccióndel potencialde membrana(158). En la Figura 12 se muestrala corriente
evocada por ACh debida a la activación de receptores muscarínicosnativos del
ovocito. El carácter muscarínicode esta respuestase demostró con el bloqueo
completo de la corriente al añadir sulfato de atropina 0,5 ¡rM a Ia disolución de
superfusión. La aplicación de pulsos hiperpotarizantesjusto despuésde la activación
de la corrienúemuscarfnicaevocó la corriente T¡oocomo consecuenciade la activación
de la cascada de los inositoles fosfato y del consiguienteincremento de La
concentraciónde calcio intracelular(149, 159). I¿ ausenciade estacorrientese utilizo
como control de que las respuestasproducidaspor la aplicación de ACh no eran
debidasa receptoresmuscarínicos.
Ar
f oo nAl_
2c
Ftgura 12: Corriente de cloruro evocada por ACh 100 pM en un ovociüo de Xenopus laevis a tn
potencial de me¡nbrana de -60 mV. La flecha indica la aplicación de Ach. El recuadro muestra la
corrienúe T¡" inducida por pulsos hiperpolarizanfes, desde {0 mV hasta -140 mV en incrernenüos de
20 mv, tras evocarse la respuesta muscarÍnica- El potencial de filación fue de -20 mv.
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úl
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer;ulkfus
r.2'RESPI.]ESTASA ACh EN OVOCITOSINYECTADOSCON MEMBRANA
PURIFICADAPROCEDENTEDE Toryetumamnrata.
1.2.1- [rcorporación del nAChR en Ia membrana del ovocito.
En ovocitospreviamenteinyectadoscon membranapurificadade electroplaca
de Tbrpdo marmoratay con el potencial de membranafijado a -60 mV, la aplicación
de ACh 100 ¡rM en el medio de superfusiónevocó en un 64% de las células(30 de
47),una respuestacompleja,como se muestraen la Figura 13A. Estacorrientepodría
estar formada por la suma de la corriente activadapor los receptoresmuscarínicos
nativos del ovocito y la corriente del canal iónico asociado al receptor nicofnico
inyectado, si bien el primer componentede la corriente podría ser, por su morfología,
el componenteD1 de la corriente muscarínica.
10 nAI
20E
Flgura 13: Corrientesevocadaspor la adiciÍn de ACh l0o pM al baño de superfrrsiónen un ovociüo
inyectado con membranapurificada. El potencial se fiió a -60 mV. A) En ausenciade sulfaüode
ahopina. B) Tras la incubación con zulfaüode akopina 0,5 ¡rM. I a* barras indican el tiempo de
aplicaciónde ACh 100¡rM.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
65
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capíútlo I
Para discernir entre si dicho componentepertenecíaal canal asociadoal
receptor nicotínico exógeno o bien era sólo parte de la corriente asociadaa la
activaciónde los receptoresmuscarínicosnativos, se incubó el mismo ovocito con
sulfato de atropina 0,5 ¡rM. En la Figura 138 se muestrala corrienteevocadapor
ACh tras la incubacióncon sulfatode atropina.Obsérveseque tras abolir la respuesta
muscarínicapermaneceuna corriente con las característicasde la descritapara el canal
asociadoal receptornicotínico de Tfupedo.
1.2.2- Curso temporal de la incorToración del nAChR en la membrana de los
ovocitos.
Despuésde comprobarque la membranapurificada fusionabacon la membrana
del ovocito, el siguientepunto de interésfue determinarla amplitudde las respuestas
en función del tiempo transcurrido tras la microinyecciónde la muestra.Para ello, se
registraronlas corrientesevocadaspor ACh 100 pM a un potencialde membranade
-60 mV a distintos tiempos tras inyectar la membranapurificada en el ovocito. I¿
Figura 14 muestraun histogramade frecuenciatridimensionalen el que se representa
la amplitud de la corriente nicotínica en función del tiempo de registro tras la
inyección.
Tt:ta)ri
il,1¿,,:,'
it;:I1
tlri:
!!i¿"]
ii,l*
IN
fonpl itu¿
(r¡A)
160
-ZOO O
20
Tierpo (horas)
Figura 14: Histogramade frecuencia3D en el que se expresala amplitud de las distintasrespuestascon
el tiempo hanscurrido has la inyección con membranapuriñcada. [¿ corriente se evocó con ACh 100
¡rM fljando el poúenciala -60 mV.
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6
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rutilhdm
Del histogramasededucenvariasobservaciones:
i) Ia mayoría de las respuestasfueron menoresde 40 nA, siendo el valor
mediode23 t 7 nA (n: 47).
ii)87 rangode las mismasoscilóentrelos 0 y los 178nA.
iii) I-as amplitudesmáximasselocalizaronentrelas 16 y Ias24 h.
De los experimentosde inyección de membranapurificada procedentede la
electroplacade Tbryedo nnrmorata se deduce que existe una fusión entre las
membranasinyectadasy la propia membranadel ovocito. I-os receptoresincorporados
en las membranasmantienensu c¿rpacidad
funcional, pero el tamañode las corrientes
(de sólo unasdecenasde nanoamperios),no permite realízarun estudioexhaustivode
las propiedadesde los receptorestransplantadosa la membranade los ovocitos en
cuantoa analizarsi éstashan sufrido algún tipo de modificaciónduranteel proceso.
Ello nos llevó a purificar el receptor nicotínico de ACh medianüecolumnas de
afinidad, reconstituirloen una matriz lipídica artificial de composicióndefinida e
inyectarlo en los ovocitos para su estudioelectrofisiológico.
1.3- RESPUESTAS
A ACh EN ovoclTos INYECTADOScoN EL nAchR
PI]RIFICADOY RECONSTITUIDO.
1.3.1: Incorpor?ción del nAChR en la membrana del ovocito.
En ovocitos inyectadoscon receptornicotínico purificado y reconstituidoen
lípidos totales de asolectina, se evocaron corrientes iónicas en presencia de ACh
100 ¡rM mientrasse mantenfael potencialde membranaa -60 mV. L¿ respuestase
observó en un 89Vo de los 200 ovocitos registrados, siendo el valor medio de la
corriente de 139 + 19 nA (Rango:0- 1,6 ¡¿A). Ia inyeccióndel receptornicotínico
purificado aportó valores de amplitud de corriente considerables,posibilitando los
estudios funcionales del receptor, hecho que no sucedía cuando el receptor se
inyectabamediantemembranaspurificadas.
En la siguiente figura se muestranlas corrientes obtenidasen un mismo
ovocito mediante la aplicación de dos concentracionesdistintas de ACh, donde se
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67
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
eaffitlo I
puede apreciar que al incrementar la concentracióndel agonista, se produce un
aumento tanto en la amplitud de la corriente como en la velocidad de
desensibilización.
ACh 10 ¡M
figura
ACh lo0 pM
15: Bjemplos representativos de corrientes evocadas por dos concenhaciones de ACh a un
poüencial de fijación de -60 mV en un mismo ovocito inyectado con nAChR reconstituido. En el baño se
adicionó zulf,ato de atropina 0,5 ¡r.M para abolir la respuestamuscarínica de receptores nativos.
1'3'2- Dependencia de la variedad de los donadores sobre la resmresfade lss
mu€stras.
Una de las posibles variablesque podría afectar a la incorporaciónde los
receptoresen la membranade los ovocitos, y por tanto, al valor de la amplitud de la
corriente evocadapor ACh, es el donador.Dicha posibilidadse analizó en diversos
donadores haciendo uso de una misma muestra en la inyección de receptores. En
todos los ovocitos se inyectó un mismo volumende muestrade 100 nl, y la corriente
fue siempreevocadapor ACh 100 ¡rM. [¿ muestrarecién procesadase utilizó en el
primer donador (Xenopus-rcm%) y se guardó congeladaen nitrógeno líquido en
presenciade un crioprotector (trehalosa)para ser usadaen los siguientesdonadores
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68
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Res¡ulá'dos
tras una descongelación
nípida y homogenización.En la siguientetabla se presentan
los datosde la corrientenicotínicaobtenidaen los diversosdonadores.
DONADOR
CORRJENTE (nA)
CONGELACIÓN
Xenopus-l60293
319+ 87 (n:4)
Xenopus-010693 307+ 77 (n:7)
Xenopus-l40693
209+ 54 (n:6)
425+ 163 (n:7)
NO
SI
SI
SI
Tabla 1: Corrientes evocadaspor ACh 100 ¡rM en ovocitos de diferenúesdouadoresmantenidosa
-60 mV. El volumen de invecciónfue de 100 nt.
El estudio estadísticode los resultadosde las amplitudesde las corrientes
señalaque no existen diferenciassignificativas(p> 0,05). Es decir, los diferentes
donadoresutilizados no influyen en Ia amplitud de la respuesta.Asimismo, no se
observarondiferenciassignificativas(p> 0,05) entrela muestrareciénobteniday tras
haber sido descongeladay homogeneizada.
1.3.3- Dependencia del volumen de la muestra inyectada sobre la amplitud de la
corriente.
Paraestudiarel efectodel númerode los nAChRsinyectadossobrela amplitud
de la corriente iónica, se emplearondos volúmenesdistintos, 50 y 100 nl, de una
misma muestra.Los ensayosse realizaronen un mismo donadoral que se le inyectó
el nAChR reconstituido en asolectina con una concentraciónfinal de proüeínade
0,34 mg/ml. Las corrientesobtenidasal aplicar ACh 10 ¡¿M a -60 mV a ovocitos
inyectadoscon 50 ó 100 nl de la muestrafueron de 79 + 24 nA (n: 13) y de 457 +
I37 nA (n: 9) respectivamente(p( 0,01). Debido al incrementoen la respuesta
obtenido al aumentarel volumen de inyección de 50 a 100 nl, en los siguienües
experimentosse tomó como volumen normal de invección este último. esto es.
100 nl.
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69
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CapítuIo I
1.3.4- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la membrana de los
ovocitos.
El estudiode las amplitudesde las corrientesinducidaspor ACh en función del
tiempo transcurridotras la microinyección, se realizó en 14 células de un mismo
donadore inyectadascon la mismamuestra.En todoslos experimentosla corrientese
evocó con ACh 100 ¡rM y fijando el potencial a -60 mV. Los tiempos estudiados
fueron de 4, 8, 12, 16, 24, 36 y 48 h tras la inyección.Se desecharontanto aquellos
ovocitosque no superaronlos 10 nA de respuestamáxima,como aquellosovocitosen
los que no se registraronmásde 4 tiemposdistintos.
+h
th
12 h
2+h
50 nAl_
l0 s
B
th
16 h
24h
\rT
lr
11
56h
20nol_
u
10 I
figura
16: Corrientes registradas en 2 ovociüos a distinúos tiempos has inyectar el receptor
reconstituido. I¿s barrx indican la apücaciónde ACh 100 pM. El potencialde fijación fue de -60 mV.
A) Ejemplo de ovocitos que presentanun pico de corrienüe.B) Ejemplo de ovociüosque presentandos
picos de corrienüe.
La respuestade los ovocitos aumentónormalmentehasta un máximo parÍr
luego disminuir, aunqueen algunosovocitos se observómásde un pico de respuesta,
es decir, la corriente presentaba fluctuaciones con el tiempo. Estos dos
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
70
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
comportamientosse presentanen la figura anterior, ilustrando en el panel A ia
respuestatípica de los ovocitosque dieron un sólo máximode corrientey en el panel
B un ovocito representativode una respuestacon doblepico de corriente.
Los valores de corriente obtenidos en esos 14 ovocitos se normalizaron
respectodel valor máximo de la corriente evocadaen cada ovocito (100%) y se
presentanen la Figura 17.
100
x
I
f75
a
l¡l
J
av,
l¡¡
É' go
¡¡¡
cl
l¡¡
?
É25
-
t4
(,
É,
o
IL
0
o
f0
20
50
50
T|ETPOTRAStNYECCtOt¡
(h)
Figura l7: Porcentajede la corriente máxima evocadacon ACh 100 pM frenúeal tiempo transcurrido
despuésde la inyección del receptor nicotínico purificado. El poúencialde membranase fijó a -60 mV
(n: 14).
Como se puedeobservaren la Figura anterior, la miíxima respuestase obtuvo
alrededorde las 16 h, valor que coincide con el obtenidocuandola microinyecciónde
los nAChRs se realizó con la membranapurificada (16 a 24 h). Además,se observa
despuésdel pico de amplitud una mesetade respuestade aproximadamente
un 25Vo
del valor máximo que perdurahast¿el final del tiempoestudiado.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
71
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Canítulo I
1.3,5- hopiedades del canal iónico asociadoal nAChR.
En este apartadose planteacomprobarsi las propiedadesfuncionalesde los
nAChRs transplantados
en el ovocito, eran similareso no a las descritasmediantelos
estudios de la inyección del clon o del ARNm correspondiente,puesto que la
composiciónlipídica de las vesículasen las que el receptorhabíasido reconstituido,
podía haber alterado sus propiedadescomo canal. Por ello, se analizaronla relación
dosis-respuesta,potencial de reversión, dependenciade voltaje de las corrientes
evocadaspor ACh y desensiblhz.aciún
del receptor.
1".3.5,1- Curva Dosis-Respuesta.
La primera propiedad que se estudió fue la dependenciade la corriente iónica
con la concentraciónde agonista utilizada. Para ello se aplicaron concentraciones
crecientesde ACh, desde1 ¡rM hasta 1 mM, en cuatro ovocitosinyectadoscon dos
muestrasdiferentes de nAChR. Las registros se realizaron fijando el potencial de
membranaa -60 mV. Los resultadosobtenidosse muestranen la Figura 18 donde se
representa el porcentaje de la corriente m¿íxima evocada por ACh frente a la
concentraciónde ACh utilizada. Tras ajustede los puntosa una curva sigmoidea,se
obtuvo un coeficientede Hill de 2,08 y un IC56de 72 ¡rM, valoresque concuerdan
con los datosdescritosen la bibliografíaparaestereceptor$6A, rcI, rcZ).
A partir de la amplitud máxima de las corrientes inducidas por una alta
concentraciónde ACh (1 mM), es posibleestimarel númerode receptoresnicotínicos
incorporadosen la membranadel ovocito, asumiendouna conductancia
del canalen la
disolución Ringer de 40 pS. (163, 164). Duranteel pico de corriente,el cambio de
conductancia observado (pico de corriente/(potencial de membrana-potencialde
reversión)) fue de 40 ¡rS lo que significa la presenciade al menos I x 106receptores
funcionalesen la membranadel ovocito en un momentodeterminado.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
7t
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Ruulhfus
=
.
=
Éoo
tn
l¡¡
3
ov,
É, +o
I
l¡¡
l¡l
ct
xza
t
-+
-6
-3
Loc [Ach]
Figura 18: Relacióndosis-respuesta.[¿ curva representael porcent4iede la mríximacorriente inducida
por diferen&esdosis de ACh a un potencialde fljación de -60 mV en 4 ovocitos (cadauno representado
por un sinbolo diferente)inyectadoscon nAChR reconstituido.
1.3.5.2- Potencial de Reversión.
Una de las propiedadesque caracterrza
a los canalesiónicoses su selectividad
iónica. La comprobaciónde que la selectividadiónica del canalno sealteróduranteel
proceso de transplanteal ovocito se efectuó mediantela estimacióndel potencial de
reversión de la corriente. Así, se registrarona diversospotenciales,las corrientes
evocadaspor ACh utilizandoaplicacionesbrevesy una baja concentración
de ACh (10
del receptor.
¡rM), para evitar la desensibilización
El valor medio del potencial de reversión obtenido fue de -5 mV, (el rango
osciló entre -17 y +4 mV) (n: 5), valor próximo a los descritoscon la inyeccióndel
ARNm o ADNc del nAChR en ovocitos(165, 166).
En la Figura 19 se representanlas corrientesevocadaspor ACh a diversos
potenciales de fijación en un ovocito. Si se inteqpolan los valores de corriente
obtenidosa -20 y + 10 mV se obtiene,que paraeseovocito, el potencialde reversión
esde -2 mV.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
73
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CaoítuIo I
ACh l0 ¡rll
*10
-2O
-¡f0
-80
-EO
-100
mV
mV
mV
mV
mV
mV
I roona
I
f0 ¡
Figura 19: Corrientes evocadasen un mismo ovociüo por aplicacionesbreves de ACh a distinüos
poüencialesde fijación (indicados en el lado izquierdo de cada regisro). Nóteseque el sentido de la
corrienúecambiaentre los valores de +10 y -20 mV. Labarl señalala aplicaciónde ACh 10 ¡rM. El
nivel de basede los registrosde corrientepara cadapotencialha sido desplazadoarbibariamente.
1.3.5.3- Relación Corriente-Voltale.
La relación corriente-voltaje(I/V) sirve para conocer en todo momento la
conductanciade los canalesionicos. Dicha relaciónse obtuvo medianteIa aplicación
de pulsoscortosa distintospotencialesantesy durantela mesetade corrienteinducida
por la aplicaciónde una baja concentraciónde ACh (10 pM).
En la Figura 20 se muestraen la parte superior del panel A la corrienúe
evocadapor la aplicación de ACh en el baño de superfusióny el lugar de aplicación
de los pulsosde voltaje; en la parteinferior, los diversospulsosde corrienteobtenidos
a distintos poüenciales(de -120 a 60 mV en saltosde 20 mV). En el panel B se
representanlas relacionescorriente-voltajetantoinstantánea
(t:
0) como estacionaria
(medidaal final del pulso).
Se observa que la relación coffiente instantánea-voltaje
sigue una relación
lineal, lo que significa que la conductanciadel canal no es voltaje dependiente.Sin
embargo,cuandose considerala corrienteen la faseestacionaria,seobseryauna clara
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
74
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
ResuIá.d¿ts
rectiftcaeiónhacia dentro, es decir, el canal pasa más corriente a potencialesmás
negativosde -60 mV. Estefenómeno,posiblementedebidoa un incrementode la vida
mediade aperturadel canalcon la hiperpolarizacíón,se observóen todoslos ovocitos
registrados,aunquesu magnitudfue bastantevariable.
Aü
II
re
Y
|
ñ-
fq
I'no
20s
Voltoje
5OO nA
Corriente (nA)
Ftgura 20: Dependenciade Voltaje de las corrienüesevocadaspor ACh 10 ¡rM. A) En la parte zuperior
se mueshala mesetade corrienüeevocadapor ACh donde se aplicaron los pulsosy e,lrla parte inferior,
las respuestasa pulsosde volt4ie antes(negro) y durantela mesetade corrienteinducidapor ACh l0
¡r.M
(rojo)' B) Representaciónde la corrienüeinstantínea(0) y estacionaria(o) frente al voltaje, en el mismo
ovociüoque A. Nótesela marcadarectificacióna potencialesnegativosen la corrienüeestacionaria.
1.3.5.G Desensibilizacióndel nAChR.
Otra característicabien conocida de los receptoresnAChR de Torpedoes su
rápida desensibiliracíóncuando se aplican pulsos de ACh de larga duración (167,
168). Esta propiedad se ha conservadoen los nAChRs reconstituidose incorporados
posteriormenteen la membranadel ovocito. [¿ desensibilizaciónde estosreceptores
inducida por aplicacionesprolongadasde ACh 100 ¡rM mostró al menos dos
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75
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CaoítuIo I
componentesy fue similar en magnituda la que ha sido previamentedescrita(167,
168).
La gentamicina, un antibiótico frecuentementeutilizado en el medio de
incubaciónaumentala desensibilizaciónde los nAChRs procedentesde clones de
ADNo de Tbrpedo(169). Su presenciaafectó la cinética de desensibilización
de los
nAChRs reconstituidos(compararA y B en la Figura 21). Por estarazón,la mayoría
de los registros se reaJizarcn en ovocitos cultivados en presencia de
penicilina/estreptomicina,antibióticos que tienen sólo un pequeño efecta sobre la
desensibilización
del receptornicotínico(compararA y C en la Figura 21).
A
B
c
Figura 2t": Efecúo de los antibióticos en la desensibilizaciónde las corrientes inducidas por ACh
(100¡rM). A) Regisko de un ovociüono expuesüoa antibióticos. B) Corriente evocadaen un ovocito
incubado con gentamicina (0,1 mg/ml). C) Ovocito incubado con penicilina (100 UI/ml) y
estreptomicina(0,1 mg/ml). D) Ovociúodel mismo donador, incubadoen las mismascondicionesque C,
e inyectadocon receptoresreconstituidoscongeladosen presenciade trehalosa(5 mg/mg proüelna).Las
barrasindican la aplicaciónde ACh.
Sorprendentemente, aquellos ovocitos que esfuvieron en presencia de
penicilina/estreptomicinay se inyectaron con muestrasde nAChR reconstituidasque
habían sido congeladasen presenciade trehalosa,mostraronuna desensibilización
significantemente
máslenta (ver C y D de la Figura 21).
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76
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer,ulá.dos
En la siguiente tabla se presentanlos valores de desensibilizaciónde los
diversosgrupos,calculadoscomo el porcentajede reducciónde la corriente,medidaa
dos tiemposdistintos,respectoal valor alcanzadoen el pico:
Medio de Incubación
Tiempo
10s
No de
40s
Ovocitos
Sin antibiéticos
78+17
94+4
12
Gentamicina
96+6*
N.D.
19
Penicilina/estreptomicina
83r9
75+ t3#
97+3
28
92+7#
2A
Penicilina/estreptomicina
* Trehalosa
Tabla 2: Porcentaje de la desensibilización del nAChR inducida por ACh 100 ¡iM. * p(
antibióticos y cualquier otro grupo. y p(
0,05 enhe Sin
0,05 enhe los grupos de penicilina. N. D. : No determinado.
1.3.6 Localización de los nAChRs en la membrana del ovocito.
1.3.6.1- Distribucién de los nAChRs en la membrana det ovocito.
Se analizó la distribución de los receptoresa 1o largo de la superficie del
ovocito para saber si se distribuían de forma homogéneao se localizabanen zonas
próximas al lugar de inyección. Para explorar este punto se realizaronaplicaciones
localizadasde ACh en la superficiedel ovocito.
La aplicación de ACh evocó corrientesen ambos hemisferiosdel ovocito.
animal y vegetal,obteniéndose
respuestas
cuyo rangode amplitudera de 7 a 2A5nA y
de 10 a 150 nA respectivamente,
para cada hemisferio(10-20 ensayospor ovocito,
n: 3). Un ejemplorepresentativose muestraenlaFigvra22.
Las respuest¿sa la aplicación de ACh no fueron homogéneasa lo largo de la
superficie del ovocito, existiendo zonas que presentabanclaras respuestasy zonas
cercanasa las anterioresque resultaron silentes. Este patrón de respuestasugeríauna
distribuciónde los receptoresen "parches"a 10largo de toda la superficiedel ovocito.
Analizando las respuestas,se encontró que algunasde las evocadascercadel lugar de
inyección tenían mayor duración que las evocadasen zonas más alejadas. Las
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77
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Caoítulo I
derivadasde las corrientesindicaron que las respuestasevocadascerca del lugar de
inyección tenían dos componentes,mientras que las evocadasen otros puntos
presentaban
un único componente.
A
B
j50nA
C
Figura 22: Aphcacionesde ACh en el hemisferio animal (A) o vegetal (B). C) Derivada de las
corrientesmostradasen A y B en una escalade tiempo expandida.Aparecendos picos en la derivadade
la corrienúeevocadaen el hemisferiovegetal,y uno cuandola aplicaciónsehizo en el hemisferioanimal.
[¿s flechasindican la apücaciónde ACh.
1.3.6.2- orientación de los nAChRs en la membrana del ovocito.
Una vez comprobadas las propiedades funcionales de los receprores
microinyectados,se procedió al estudio de la orientación de los mismos en la
membranadel ovocito.
Paraello, se aplicó en 3 ovocitos, medianteuna pipeta y de forma localizada,
ACh I mM en las proximidadesde la membrana,primero en el espacioextracelulary
despuésen el intracelular (ver lVkterialesy lWtodos, apartadoII-5.3). Un ejemplo
representativose presenüaen la Figura 23.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
78
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
RxuIbfu
Del experimento se deduce que, al menos la mayoría de los receptores
funcionalesesf,ínorientadosde la forma correcta,es decir, con la parte extracelular
del receptordirigida al espacioextracelular,ya que sólo se evocarespuestacuandola
aplicación se realiza en la superficieexternadel ovocito. La aplicaciónintracelular
originó unos picos en el registro de corriente, que representanartefactosdebidosal
incrementode la presiónen el interior del ovocitopor la aplicacióndel agonista.
A
B
C
20s
Figura 23: Aplicaciones locales de ACh en el hemisferio vegetal de un ovocito cuyo potencial de
membrana se flió a -60 mV. A) I¿s aplicaciones de ACh en el espacio exhacelular inducen una corriente
transitoria' B) Las aplicaciones de ACh en el espacio intracelular no producen ningún efecto. Nóúese los
nípidos arüefacúosque siguen a los pulsos de ACh. C) Las respuestasse repiten tras volver a aplicar ACh
en el espacio extracelular. I¿s flechas indican el momento de la aplicación de ACh.
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79
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CanítuIo I
La purificación de la P-gp utilizó como material biológico de partida la
sublíneaLl2t0/160 de leucemiade ratón, gu€ presentauna elevadaexpresiónde la
P-gpen su membranacelular(103).
La fracción celular de partida la constituyóla fracción microsomalde dichas
células obtenida de acuerdocon el procedimientodescrito en Iulaterialesy trulétodos,
apafiado III-1.1. I¿ selección de los detergentesempleadosen los estudios de
solubilizaciónse hizo atendiendoa aquellosque preservanla actividadATP-asade la
P- g p( 2 , 70 ,7 1 ,7 2 ,7 6 ).
2.t- 1" ETAPA DE PURIFTCACIÓN DE LA p-gp.
La elecciónde las condicionespara la solubilizaciónde la fracciónmicrosomal
se realizó en base a la eficacia de sotubilización por cada detergentede la proteína
total y de la P-gp.
El estudiode la solubilizaciónde la fracción microsomalde las célulasLI2l0
se inició con Colato de sodio, un detergentederivadode las salesbiliares y de carácter
iónico. Se eligió como tiempo de solubilización30 min, émpleandocriterios basados
en experienciasanteriores y en datos que aparecenen la literatura (154, 170).
Posteriormente,experimentospuntuales a 60 min, confirmaron que la eficacia
solubilizadoradel detergenteno mejorabacon el tiempo de incubación,si bien se
podla favorecer la desnaturalizaciónde la proteína debido al carácter iónico del
detergente.
Seguidamente se procedió al estudio del efecto de la relación
proteína:detergente(w/w) en la solubilización. Alícuotas a concentracionesde
proteína de l,
2 y 5 mg/ml se solubiüzaron empleando distintas relaciones
proteína:detergente
(w/w) en un rango entre 1:0,25 y 1:15. De forma global, la
representacióndel porcentajede proteínasolubilizadapor Colato de sodio utilizando
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8t)
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
muestras con distinta concentración de proteína y
proteína:detergente
sepresentaen la siguientefigura:
a distintas relaciones
pmt:det (w:rv)
I
l:l
N
Fl
.ls
v
y
-^^
lf
f-r
-¡
a
t¡r
^-JtÉ
a
¡tr¡
a
a
a
Y
l:10
1:15
z
t r'l
F
s
IPROTEINAI(mglml)
F gura 24: Represenüación
del porcentajede proteínasolubilizadapor Colaüode sodio de la frawión
microsomal de las células LI2LalL6a, a distintas concenhacionesde proteína y diversas relaciones
proteína:detergente(dw).
I-a' ptoteína solubilizada represenüaalrededor del 20 7o cuandose utiliza una
baja relación proteína:detergente
(1:1). Conforme se incrementala proporción del
detergenteen dicha relación, el porcentaje de proteína solubilizada aumentay para
valores de 1:10 y 1:15, el porcentajede proteínasolubilizadase situa entre el
75-80%.
En base a los resultadosanteriores,se escogiópara solubilizar la fracción
microsomal,una relación 1:10 (protefna:detergente)
debidoa que si se empleamenos
detergente, el porcentaje de proteína solubitizadadisminuye. por el contrario,
relacionesmayorespodían favorecerlos procesosde desnaturalización.
A continuaciónse determinósi la P-gp se tocalizabaen la fracción solubilizada
por Colato de sodio o por el contrario permanecíaen la fracción insoluble. En la
Figura 25 se presentanlas inmunotransferenciascorrespondientesa los sobrenadantes
y sedimentosde muestrasde la fracción microsomalde las élulas Ll2\Ollffi tras el
tratamientocon el detergenteen una relaciónproteína:detergente
de l:10 y posterior
centrifugación.
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E1
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CanltuIo I
f-
h
$'p
**$'ll
Figura 25: Deúecciónde la Fgp por inmunotransferenciausandoel anticuerpomonoclonalC-219 en la
fracción microsomal (fm) y en las fracciones soluble (S) e insoluble (P) de Colato de sodio
correspondiente
alas célulasLIAAlrc0. Las callescontienen1O¡rg de proteínay fueron solubilizadas
con una relaciónproúeína:detergente
de 1:10. (*) indicala bandaque corresponde
a la P-gp.
En la Figura 25 se puede observar que toda la P-gp presenteen la fracción
microsomalapare,c,e
enla fraccióninsoluble,no detectándose
la presenciade la misma
en la fase solublede Colato, a pesarde la elevadarelaciónproteína:detergente
(1:10)
(w/w) capazde solubilizar un 80% de la proteínatotal de la fracción microsomal.
A continuaciónse probaronotros dos detergentes,CHAPS y Zwittergent3-12,
detergentesde tipo zwitteriónico con escasoefecto sobre la desnaturalízaciínde las
proteínas.Los estudiossebasaronen los experimentospreviosde la solubilizaciónpor
Colato de sodio, de este modo se eligió el tiempo de incubaciónde 30 min y el
procesoserealizóa 4oC.
Alicuotasde 2 mg/ml se solubilizarona distinfasrelacionesproteína:detergente
(w/w) que oscilabanentre 1:1 y 1:10. Los resultadosde la solubilizaciónde la P-gp
contenidaen la fracción microsomalde las célulasLL2lDlLffi por cada uno de los
detergenües
en función de Ia relaciónproteína:detergente
se muestranen la Figura 26,
donde se presentanlas alicuotasmás representativasde dicho estudio.
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82
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer,ulá.dm
ün l':m
-,Ft
P2
;
m*gtt
figura 26: Detección de la P-gp por inmunotransferenciaen la fracción microsomal (frn) y en las
distintas fraccionessolubles(S) e insolubles(P) obüenidastras la solubilizacióncon: A: CHAPS a las
relaciones proteína:deiergente:1:0,5 (1) y 1:10 (2) y B: Zwittergent 3-12 a las relaciones
proüeína:detergente
1:1 (1) y 1:3 (2). I.as callescontienen10 pg de proteína.(*) indica la bandaque
correspondea la P-gp.
De la Figura 26 *, desprendeque tanto CHAPS como Zwittergent 3-12
solubilizan sólo parcialmente la P-gp en todo el rango de las relaciones
proteina:detergente(w/w) estudiadas,no produciéndoseen ningún momento una
solubilización preferencialde la P-gp en una de las dos fases.
Consecuentemente,
de los tres detergentesutilizados, CHAPS, Zwittergent312 y Colato, el escogidova a ser Colato de sodio, debido a que toda la p-gp
detectable aparece exclusivamenteen Ia fraccíón insoluble del. detergente, que
representaaproximadamente
eI2O% de Ia protefnatotal.
2.2- 2 ETAPA DE PIIRTFICACTÓNDE LA p-gp.
Despuésde haber solubilizadoel 80% de la proteína inicial en la fracción
microsomaly haber "concentrado"toda la P-gp en el sedimentoinsolublepor Colato
de sodio, se procedióa la búsquedade un detergenteaapazde solubilizu la P-gp. En
esta etapa se volvieron a emplearlos otros dos detergentes,CHAPS y Zwittergent
3-12, usadosen la primeraetapade purificación.
Las condicionesfueron las mismasque se emplearonen la primera etapa,es
decir, 30 min de incubacióna 4oC. Iá concentraciónde proteínainicial se mantuvo
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
E3
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capíútlo I
entre 1 y 2 mglml a distintasrelacionesproteína:detergente
en un rangoque iba desde
l : I h a s t a1 :1 5 .
A continuación se presentan en las siguientes inmunotransferenciaslos
resultadosmásrepresentativos
de la solubilízaciónde la P-gp por cadauno de los dos
detergentes:
rsr#iE
f;ii *
Flgura 27: Inmunodeüecciónde la P-gp en distintas fracciones solubles (S) e insolubles (P) por: A:
CHAPS a relaciones1:5 (1), 1:10 (2) y 1:15 (3). tás callescontienen10 ¡rg de proteína.B: Zwittergent
3-12. Ia primera calle contiene Q pg y la segunda 10 pg de proteína. Se empleó una relación
proúeína:detergenúe
de 1:5. (*) indica la bandaque correspondea la p-gp.
Tal como seobservaen la Figura 27, la incubaciónde la fraccióninsolublepor
Colato con CHAPS solubilizamuy poca P-gp, y no se consiguemejorarel grado de
solubilizacióncuandosedisminuyelarelaciónproteína:detergente
(panelA, calles2 y
3). En cambio, cuandola incubaciónse realizacon Zwittergent3-12, aparecela P-gp
exclusivamente
en el sobrenadante,
no detectándose
en la fraccióninsoluble(panelB).
El empleo de N-octilglucósidoo Nonidet P-40, dos detergentesde tipo no
iónico utilizados también en el aislamientode complejos proteícosy estudiosde
reconstitución,no mejoró el rendimientode solubilizaciónde la P-gp de la fracción
resulüante
del primer pasode purificación.
Por tanto, de los detergentesestudiadospara la solubilizaciÍn de la P-gp
procedentede la fracxión insolublepor colato, se elige Zwittergent3-12, por ser el
único capazde conseguirsolubilizarcon un alto rendimientola p-gp.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
M
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer¡uIfa.d¿ts
2.3. BALANCE GLOBAL DE LAS DOS ETAPASDE PURIFICACIÓNDE LA
P-gp-
En la siguientefigura se esquematiza
el resultadode la purificaciónparcial de
la P-gp a partir de la fracción microsomal(fm) de las célulasLl2l0ll60.
La primera
etapasuponeun tratamientopor Colato de sodio (relaciónproteína:detergente
de 1:10
(w/w)) y obtención de la P-gp en ta fracción insoluble del detergente(P1). I¿
segundaetapa de solubilizaciónde la fracción Pl por Zwittergent 3-12 (relación
proteína.detergente
de 1::5(w/w)) rindió la P-gp en la fracciónsoluble(S2).
12
3 4 5 6
kDa
1."'
- 200
-
116
*97
66
Figura 28: Inmunodeüección
de la P-gp en las distintas fraccionesempleadasen la purificación de la
P-Sp. 1) fracciónmicrosomalde las célulasL1210/S,2) fracciónmicrosomalde las célulasLI2LO/I60,
3 y 4) fracciones insoluble y soluble procedentesde la la etapa de purificación (solubilización con
Colato de sodio), 5 y 6) fraccionesinsoluble y soluble procedentesde Ia 27 etapa(solubilizacióncon
Zwittergent3-12).I.as,callesL-4 contienen5 ¡*g de proteínay las S y 6lO p"g.
El balanceglobal del contenidorelativo de la P-gp en cadaunade las etapasde
purificaciónse recogeen la siguientetabla:
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(aoúhtlo I
Contenidorelativo Contenido relativo Factor de purificación
FRACCION
de proteína
fm
1,0
P1
0,2
*l
=5
S2
0,1
:YI
^,10
de P1
aparente de P
I
Tabla 3: Valores relativos de proüeínaüotaly P-gp en cada una de las etapasde purificación de la P-gp.
I-os resultadosde la purifiqción parcial de la P-gp concluyen que en la
fracción solubilizadacon Zwittergent 3-12 (S2), la P-gp se encuentrapurificadaunas
10 vecescon respectoa la fracción microsomalde partida (fm). Dado que no se
detectala presenciade la P-gp por Western-Inmunotransferencia
en ningunade las dos
fraccionesdesechadas
en la purificación (S1 y P2), el rendimientoconseguidoen la
purificaciónpuedeconsiderarsesatisfactorio.
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86
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Reslulá.dos
3- MEDIDAS DB FUNCIONALIDAD DE LA P-gp,
3.1- TNCORFORACTÓNOn LA p-gp EN LA MEMBRANA DE OVOCTTOS.
El anrílisisde la funcionalidadde la P-gp se efectuó a través de la nueva
metodologíaque se presentaen estaMemoria (apartadoII de Materialesy luIétodos)y
cuya efectividadha sido comprobadaen otra proteínade membrana,el nAChR (ver
págs64-79 del apartadode Resultadosde esteCapítulo).
I-as muestrasprocedenúestanto de la fracción microsomal de células L1210
(fm) como de la primera etapade purificacióncon Colato de sodio (Pt) (ver páginas
80-83) se inyectarondirectamenteen los ovocitos, mientrasque las procedentes
de la
solubilización por Zwittergent 3-12 (S2) (ver páginas 33-84) se sometieron,
previamentea ser inyectadas,a dirflisis exhaustivapara eliminar el detergentede la
muestra.
Inicialmente se procedió a determinar la inco¡poraciónde la P-gp en la
membranadel ovocito, púa lo cual, la membranaplasmáticadel ovocito se aisló
siguiendoel métododescritopor Sadlery Maller (155). La presenciade la P-gp se
detectómedianteWestern-Inmunotransferencia,
tal como seha venidodescribiendoen
el apartadode Purificaciónde la P-gp.
2Mw
_ 200
t ' ' r 't {
ü
9
.
-
l16
-97
-66
_45
Figura 29: Irrmunodeüecciónde la P-gp en las Buestras de las membranasde: 1) 20 ovocitos sin
nyetat. 2) 2O Ovociüosinyectadoscon 450 ng de proteínade Ia fracción Pl. (*) indica la bandaque
correspondea la P-gp.
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CanítuIoL
Se puede observar en la figura anterior la presencia del marcaje
correspondientea la P-gp únicamenteen la calle 2, que es la que correspondea los
ovocitos inyectadoscon la fracción Pl. De esteresultadose desprendendos hechos
importantes:
i) la membranade los ovocitosno presentanivelesdetectables
de la P-gp.
ii) la P-gp inyectadase incorporaen la membranadel ovocito.
Además,aparecemarcadaunaproteínade unos90 kDa en las dos muestras,es
decir, una proteínaperteneciente
a la membrananativa de los ovocitos. Se ha podido
comprobarque el marcaje se debe a que el anticuerposecundariose une a dicha
proteína.
3.2- ACTTVIDAD DE LA p-gp COMO TRANSPORTADOR DE FÁRMACOS.
I¿ actividadde la P-gp como transportadorde f¿írmacos
se comprobómediante
la incubación de los ovocitos inyectadoscon la fuaeciónmicrosomal, P1 o 52
procedentesfanto de las células L121.0/160(expresanP-gp) como de las células
L121.0/S(ovocitoscontroles),con una mezcladeDNM y 3H-DNM.
En el 71,43 % de los ovocitos inyecadoscon fm, 85,7I% de los inyectados
con Pl y en el 83,33% de los inyectadoscon 52, se obtuvo una menoracumulación
de DNM en aquellosovocitos que fueron inyectadoscon muestrasque conteníanla
P-gp. Los niveles de acumulaciónde DNM en ovocitos control (inyectadoscon
muestrassin la P-gp) y en ovocitossin inyectar,fueron similares.
La adición de vRP (10-100 ¡rM), un reversor de Ia acumulación de
antraciclinasen las célulasMDR (68) al mediode incubación,provocóun incremento
en los niveles de acumulaciónde DNM en los ovocítos inyectadoscon la P-gp
respectoa los ovocitoscontroles.Curiosamente,los nivelesde acumulaciónde DNM
en los ovocitos inyectados (independientemente
de que la muestra inyectada
contuviera o no la P-gp) y tratadoscon VRP eran menoresque los referentesa los
ovocitossin inyectar.
A partir de los nivelesintracelularesdel fármaco, se calcularonlos valoresde
DNM transportadapor la P-gp mediantela diferenciade los nivelesintracelularesde
la antraciclinaentre los ovocitoscontrolesy los ovocitosinyectadoscon la P-gp. Tras
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88
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rxulbdt¡^s
la norrnalización de estos valores frente a la cantidad de proteína inyectada se obtiene
Ia siguientetabla:
Transporte de DNM
(pmolesDNNf/mg proteína)
MUESTRA
fm
P1
S2
DNM + VRP
DNM
236+ 33
(n: 5)
(n:10)
707t 123
1554+ 336***(n: 4)
153+ 55 (n:4)
259+ 165(n:2)
N.D.
Tabla 4: Eflujo de DNM por la P-gp en ausencia y presencia de VRP (10-100 ¡rM) en ovocitos
inyecüados con fm (fracción microsomal), Pl (muestra procedente del ler paso de purificación) y 52
(muestra producto del 20 paso de purificación). N. D. : No Deüerminado
I-os datospresentados
en la Tabla 4 indicanque:
i) los ovocitos inyectadoscon fraccionesde membranaque contienenIa P-gp
presentanactividadde transportede DNM.
ii) Ia actividad transportadorase incrementacon el enriquecimientode P-gp
en las muestrasinyectadas:los ovocitos inyectadoscon la fracción 52 presentanuna
mayor actividadtransportadora
que los inyectadoscon P1, y éstosa su vez una mayor
actividadque los inyectadoscon ftn (en esteúltimo casoel nivel de significaciónentre
los dos gruposse sitúamuy cercade 0,05 concretamente
p: 0,053).
iü) El transportede DNM por la P-gp se ve reducidopor la presenciade VRP
en el medio, confirmando un efecto específico del reversor sobre la actividad
transporüadora
de la P-gp.
Una vez confirmada que las diversas muestrasenriquecidasen P-gp y
posteriormenteinyectadasen ovocitosde knopus presenüan
actividadde transportede
fármacos, se procedió al estudio de la actividad de canal de cloruro reguladorade
volumencelular asignadaa la P-gp (128).
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89
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Caoftub I
4.I.- CORRIENTES NATTVAS ACTIVADAS POR HIPOTONICIDAD.
El aniílisis de la actividad de la P-gp como canal de cloruro activado por
volumen, seinició con el estudiode las corrientesnativasque sepodíaninducir en los
ovocitosde Xenopuslaeuisen respuestaa cambioshipotónicos.
Las disolucionesempleadaspara la activación de corrientesde cloruro por
hipotonicidadderivande la disoluciónRinger de Rana(RN), dondese ha disminuído
la concentracióninicial de NaCl, de 115 mM en RN a 75 y 45 mM y de ahora en
adelantese denominaftínRH-75 y RH-45 respectivamente.
En primer lugar se calculó
el valor de las osmolaridades
de estastres disoluciones,obteniéndose,
para n: 2, los
siguientesvalores: 220,5 + 3,5 mosm para RN; 150,0 + 0,0 mosm para RH-75 y
95,5 + 0,5 mOsmparaRH-45, con 1oque sedisponede dos medioshipotónicoscuyas
osmolaridadesse correspondenrespetivamente
con eI70Vo y 45% de la osmolaridad
del medio isotónico(RI.D.
El 48Vo(9 de 20) de los ovocitos a los que se les eliminó el epitelio ovárico
interno respondieronante la exposicióna un medio hipotónico(RH-75 o RH-45) con
la activaciónde una corrienteiónica que, en general,se inicia con un componentede
salida, debido fundamentalmente
al movimientoa travésde la membranaplasmática
de iones potasio (único ión cuyo potencial de equilibrio se sitúa a un valor más
negativo que el potencial de fijación de la membrana)seguido por un segundo
componentede entrada.Tanto la amplitudcomo los tamañosrelativosde las dos fases
de la corriente fueron muy variablesentre los ovocitos de diferentesdonadores.[¿s
corrientes eran totalmente reversibles cuando el medio volvfa a ser RN y podían
evocarsevarias vecesen el mismo ovocito, aunquela amplitud en algunosovocitos
disminuíatras las contínuassuperfusiones
con medio hipotónico.["a Figura 30 ilustra
un registro contínuo del nivel de corriente y el cambio de conductanciade la
membranade un folículo cuandose exponeal medio hipotónico RH-45. Se pueden
observar en esta fi.gura los dos componentesde la corriente, el incrementode la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
90
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Res;ulk&x
conductanciaen la membranaen el medio hipotónicoy cómo la corrienteregresaal
nivel inicial cuandosevuelvea superfundircon el medioisotónico.
RH-45
0mV
Figura 30: Cambio en la conductanciade la membranade un folículo ovárico al c¡mbiar el medio de
superfusiónde RN a RH-45. El potenciatde membranaosciló continuamenteen pulsos cuadradosentre
-50 y -70 mV.
4.1.2- Característicasde Ia corriente.
En la Figura 31A se presentaun folículo al que se le aplicaron pulsos
despolarizantesde voltaje desde -100 mV hasta *80 mV, primero en el medio
isotónicoRN y a continuaciónen los medioshipotónicosRH-75 y RH-45 en los que
se observauna corrienteque desaparece
cuandose vuelve a superfundircon el medio
isotónico (RN post.). Nóteseque la amplitud de la corriente se incrementacon el
gradode hipotonicidaddel mediode superfusión.
La Figura 318 representael porcentajede la corrientem¿íximaen función del
voltaje aplicadoen dos medioscon distinto grado de osmolaridad(RH-45 y RH-75).
Como se puedeobservaren la curva UY,la corrienteexhibe una cierta rectificación
haciafuera.
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91
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
RItlpost
%CDRRIB{TEMAXIMA
-r-RH-75
-oRH45
Flgura 31: A) Corrienüesevocadaspor pulsos de voltaje de 800 ms en un ovociüosuperfrrndidocon
Ringer Normal (RN), Ringer Hipotónico (RH-75) y tras su vuelta a Ringer Normal (RN post) se
superftrndiócon Ringer Hipotónico (RH-45). En estafigura y en las que siguen,el nivel de basede los
registros de corriente en los medios hipotónicos ha sido desplazadohasta el misno nivel de los
correspondienúes
a los medios isotónicos. B) Relación I/V de las corrienüesnehs evocadasen medios
hipotónicosen 4 ovociios.
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92
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Res¡ulkús
El umbral de activación de la corriente se situó por encima del valor de
osmolaridaddel medio RH-75 (150 mosm) puesto, de estar presente,pudo ser
siempreevocadaen dicho medio.
El valor medio de la conductanciade la corriente activada por medio
hipotónico,calculadaentre-50 y -70 mv, fue de 4,10 + 1,00 pS (Rango:2,65- 6,g0
pS) en 4 ovocitos superfundidosen el medio hipotónicoRH-75 y de 7,80 + 1,83 pS
(Rango:4,65- lz,w pS) en 4 ovocitossuperfundidos
en el medioRH-45 (p< 0,05
test t de Studentpareado).
'', La amplitud miíxima de las cofrientesactivadaspor RH-75 y RH-45 a *g0
mV fue calculadamediantela extrapolacióna t: 0, incluyéndoseúnicamenteaquellos
ovocitos que fueron superfundidosprevia y posteriormentecon RN. El valor medio de
la amplitud nr¡íximafue de 1859 + 31.1nA (Rango: 1134- 2997 nA) en 5 ovociros
superfundidosen el medio hipotónicoRH-75 y de 2326+ 4I9 nA (Rango:1015-3760
nA) en 6 ovocitossuperfundidosen el medioRH-45.
I'a cornentepresentauna inactivación tiempo-voltaje-dependiente
a potenciales
más positivos de + 10 mV (Figura 31A), es decir, su inactivacióncon el tiempo se
incrementacon el aumentodel potencial de membrana.La constantede tiempo de
inactivación(c) calculadaa +80 mV, es de 367 ms (n: l) en RH-75 y de 510t 170
ms (n: 4) en RH-45.
El potencialde reversiónfue de -54 t 4 mv (n:4) para RH-45 y de -4g + 3
mV (n: 4) par:aRH-75, (p< 0,05 test t de Studentpareado).Esfosvaloresse sitlían
entre los valores de los potencialesde reversiónde los iones potasio (-105 mV) y
cloruro (próximo a 0 mV), 1oque implica la contribuciónde al menosdos canalesen
estacorriente, uno de potasioy otro de cloruro. I-os valoresdel potencialde reversión
obtenidosindican que la corrientepresenüa
una mayor conductanciarelativaa potasio
en el medio máshipotónico.
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93
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CapíAlo I
4.1.3- Efecto de fámracosantitulrroralessol¡rela corriente.
La adiciónen el baño de superfusiónde VRP 100 FM, o Quinidina100¡rM,
sustratosque sontransportados
por la P-gpy que han sidodescritoscomo inhibidores
de las corrientesactivadaspor volumen en las célulasNIH-3T3 que sobreexpresan
P-gp (128), no alteró las corrientes generadasen los folículos por el medio
hipotónico.Del mismo modo, la adición de otros sustratostransportados
por P-gp
como DNM 3 ¡rM o Forskolina100 pM, tarnpocoalteraronla corriente,aunqueen el
caso de la Forskolina se observó una pequeñareducción en la amplitud de la
corriente. En la Figura 32 se ilustra un ejemplorepresenlativo
de un ovocito al que se
aplicó DNM 3 ¡rM despuésde haberactivadola corrientemediantela superfusióndel
mismo en RH-45. Posteriormente
y tras lavadocon el medioRN, el mismoovocito se
superfundiópor segundavez en el medio RH-45 y entoncesse aplicó VRP 100 ¡rM.
Nótese que la presencia de estos sustratosno alteró la corriente activada por
hipotonicidad.
a.II-4s
DNM
5oo
nA
l_
fll mV
70 mV
l min
Figura 32: Carnbio de conductancia de la membrana de un folículo ovárico al pasar de RN a RH-45. l¿
aplicación de DNM 3 ¡,cM o VRP 100 pM en el medio RH-45 no produjo alúeracionesen la corriente
activada por hipotonicidad. El potencial de membrana se hizo oscilar entre -50 y -70 mV me<liante
pulsos de corüaduración.
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94
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Besulttúts
4.1.4- Bfecto de la desfoliculaciónpor colagenasa
sobrela corriente.
Los folículosde knopus laeuissufrenun procesode desfoliculación
mediante
un tratamientoenzimáticopor colagenasa(apartadoII-3 de lVfaterialesy lWtodos)
antesde ser microinyectados
con las distintasmuestras.
Una vez tratados con colagenasa,se redujo tanto el porcentaje de los
donadores
comoel de los ovocitosquerespondieron
anteun mediohipotónico(RH-75
o RH-45) con la activaciónde una corrienteiónica: de un 69% al25% (8 de 32) en
los donadores
y de un46Voall9Vo (15 de 77) en el casode los ovocitos.Tambiénla
amplitud de la corriente disminuyó con respectoa los folículos, así, a + 80 mV y
t:0
ésta pasó desde 1859 + 311 nA hasta 752 +254 nA en 3 ovocitos
superfundidos
en el medioRH-75, y desde2326 + 419 nA hasta939 +226 nA en 6
ovocitos superfundidosen el medio hipotónicoRH-45, es decir, la amplitudse redujo
en un 6AVodebidoal tratamientode desfoliculaciónpor colagenasa.Se han excluído
del cálculode la amplitudde coniente, los ovocitosde un donador(XEN-250496)que
tuvieroncorrientesespecialmente
grandes(hasta8,8 ¡rA).
Las demáscaracterísticas
de la corrienteno se alteraroncon la desfoliculación
enzímática.En la siguientefigura se ilustra en el panel superiorun ejemplo de los
registrosde corrientede dos ovocitosdesfoliculadosenzimáticamente
a los que se les
aplicaronpulsosdespolarizantes
de voltaje, desde-100 mv hasta +80 mV, en el
medio isotónico RN y en el medio hipotónicoRH-45. En A se presentaun ovocito
que no respondióante la exposiciónal medio hipotónico con la activaciónde una
corrienteiónica, y en B un ovocito que si la presentó.Obsérveseque en esteúltimo
caso, la corrientepresentala misma morfologíaque la evocadaen un ovocito al que
se le eliminó manualmente
el epiteliooviírico,como se muestraen la Figura31A. En
el panel inferior de la Figura 33, se presentanlas curvasVV de ambosovocitos, en
las que no se aprecia una variación de la conductanciadel ovocito A ante la
exposicióndel mismoa un medio hipotónico,mientrasque si se apreciaen el casodel
ovocito B. Nóteseque la curva I/V correspondiente
al ovocito del panel inferior es
similara la obtenidaen los folículos(Figura31B).
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9s
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
{:asihtfuI
VOLTAJE(mV)
F¡gur¿ 33: Corrientes evocadaspor pulsos de voltaje de 800 rns en dos ovocitos desfoliculados
enzimáticamentey superfundidoscon Ringer Normal (RN), Ringer Hipotónico (RH-45) y vuelta a
Ringer Nonnal (RN post). Obsérvesela aparición de una corriente activada por cambio de volumen
cuando se superfrrndeel ovocito A con el medio RH-45 y la ausenciade ta misma cuando es
superfundidocon el mismo medio el ovocito B. C) RelaciónVV de las corrientesevocadaspor medio
hipotónico en los dos ovocitos A y B.
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96
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
RcsulA&s
4.2- CORRIENTES EN OVOCITOS INYECTADOS CON LA P-gp.
Despuésde haberestudiadolas corrientesnativasactivadaspor hipotonicidad,
se procedióal estudiode estetipo de corrientesen ovocitospreviamenteinyectadosen
muestrasque contienenla P-gp y los resultadosse compararoncon los obtenidoscon
el estudio de las corrientesnativas. El estudio se amplió a ovocitos inyectadoscon
muestraprocedentede las células sensiblesque no conúenela P-gp, (control) y a
ovocitos inyectadoscon muestrade diversosgradosde riquezaen P-gp (Pgp+). El
medio hipotónico empleadoen la rnayoríade los,estudiosfue RH-45 puestoque el
tamañode las corrientesevocadasson mayoresen estemedio que en el medio RH-75.
En el 90Vo(36 de 40) de los ovocitoscontrol y en el 94% (169 de 179) de los
ovocitos Pgp+ no hubo activación de una corriente cuando las cáulas se
superfundieron en el medio RH-45. Este hecho podría debersea que las muestras
inyectadashubieranperdido su funcionalidaden el procesode obtención,purificación
o se hubieranhidrolizado en el interior del ovocito.
\ih:-100mV
40mVl
250ms
RH-75
RH.45
25onAL
500 rrs
Figura 34: Ausencia de la acüvación de rna corrriente por cambio de volumen en un ovocito inyectado
con fracción Pl, zuperñrndido con medio isotónico (RN) y con dos medios hipotónicos (RH-75 y
RH-45). l:s corrientes se registraron mediante la aplicación de pulsos de voltaje desde -l0O mV hesta
* 80 mV (margen zuperior derecho).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
97
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
eaúailo t
No obstante, se pudo comprobar que las muestras mantenían al menos la
funcionalidad transportadora de la P-gp mediante registros simult-¿íneos
de transporte
de fármacos y de corriente activada por hipotonicidad. Así, en 6 experimentos donde
se obtuvo una menor acumulación intracelular de DNM en los ovocitos inyectados con
la P-gp (74% de acumulación) con relación a los ovocitos controles (100% de
acumulación), hecho que evidenciaba la incorporación funcional de la P-gp en el
ovocito, no se evocó corriente alguna en el medio hipotónico. En la Figura 34 se
ilustra un ejemplo de un ovocito Pgp+ perteneciente a un grupo en el que se
comprobó la actividad transportadora de DNM y que no se evocan corrientes de
membrana al superfundir la célula con medios hipotónicos.
Vl¡= -lfi) mV
RII45
Rl{ post
Figura 35: Corrientes evocadas por cambio de volumen en: (A) ovocito control y @) ovocito inyectado
con fracción Pl en RH-45. l¿s corrientes se registraron mediante la aplicación de pulsos de voltaje
desde -100 mV hasta + 80 mV (margen superior derecho).
A pesarde que el resultadorecogidoen la Figura 34 es el mayoritariamente
obtenido, en algunos casos se pudo observar una corriente inducida por choque
hipotónico.Así, en el 6% (8 de L25), 4% (2 de 50) y 0% (0 de 4) de los ovocitos
tratadoscon colagenasae inyectadoscon muestrasde las fraccionesfm, Pl y 52
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
98
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rxulkdos
respectivamente,
y en el l0% (4 de 40) de los inyectadoscon muestracontrol, se
evocó una corriente activadapor el medio hipotónico RH-45. En la Figura 35 se
ilustra un ejemplo de un ovocito control y uno Pgp+ que respondieronante la
superfusiónen un rnedio hipotónico con un incrementoen la conductanciade la
membrana.
4.2.1"-Característicasde 14corriente.
Las característicasde la corriente evocadaen medio hipotónico en los ovocitos
Pgp+ sonindistiguiblesde las de la corrientenativa, tal como sepuedecomprobaren
la Figura 36.
%ORRIA\TEMÁXIMA
-r-Noiny.
-O*tgr+
Ftgura 36: Relación VV de las corrientes netas evoc¿das en medios RH-45 en ovocitos tratados con
colagenasay no inyectados (n: 13) y en ovoci0osPgp+ (n: 8).
[¿s dos curvasI/V se solapana 1olargo de todo el rangode voltaje analizado.
I-a constantede tiempo de inactivación(t) en medio RH-45 a *80 mV fue de 621X
57 ms (n* 2) y 354 + 63 ms (n: 10) respectivamente
para los ovocitoscontrol y
Pgp+. Estosvaloresno difieren significativamente
(p> 0,05) de los obtenidosen los
ovocitosno inyectados(331 + 47 ms, n: 13), lo que significaque las características
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
99
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capífrtlo I
del canal sllpuestamenteadicionado en las muestrasinyectadascoinciden con las del
canal nativo de los ovocitos.
Como la arnplitud de las corrienteses directamenteproporcional al número de
iones que cruzan la membrana celular, la cantidad de corriente debería ser
proporcional al número de canalesexistentes. De acuerdo con ello, si la P-gp fuese un
canal, la amplitud de la corriente evocada en medio hipotónico debeía ser mayor en
los ovocitos inyectados con la P-gp y ademásdebería correlacionarsecon el grado de
riqueza en P-gp de las muestrasinyectadas.
Para comprobar si realmente la amplitud de la corriente se veía afectadapor la
presencia de la P-gp en la membrana de los ovocitos, se inyectaron muestras con
distinto grado de contenido en P*gp, (fm y Pl) y se calculó la amplitud de la corriente
en medio RH-45, en las mismas condiciones en las que se determinó la corriente
nativa. Los resultadosobtenidos se muestran en la Tabla 5:
FRACCIÓN
AMPLITUD (nA)
control
793x lW
(n: 2)
fm
893L269
(n: 7)
P1
788x253
(n: 2)
Tabla 5: Valores de arnplitud de la corriente (nA) evocada en medio hipotónico RH-45 a un potencial de
+ 80 mV y a t:0 en función del grado de riqueza en P-gp de las mueshas inyectadasen los ovocitos.
Los valores de la amplitud de la corriente en los ovocitos inyectadoscon
fracción fm o Pl no difieren significativamente(p> 0,05) de los obtenidosen los
ovocitosinyectadoscon muestracontrol y los no inyectadosy tratadoscon colagenasa
(939 t 247 nA). Es decir, la incorporaciónde la P-gp en la membranadel ovocito no
alteraen absolutola amplitud de la corrientenativa. Consecuentemente
se deduceque
la P-gp no representeun canaliónico activadopor volumen.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
r00
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer¡ul&tfus
4.2.2- Efecto del donador en la aparición de la corriente.
En el pequeñoporcentajede ovocitosinyectadoscon la P-gp en los que se
indujo una corrientepor hipotonicidad,se analizóla respuestaen funcióndel donador
(ovocitosextraídosde un sapoen una fechadeterminada).L,osresult¿dosse recogen
en la siguientetabla:
DONADOR
NO
INIYECTADO
INYECTADO
INYECTADO
CONTROL
Pgp+
xEN-28/09/92
0(0de2)
2(2de3)
3(3de6)
xEN-12/10/92
0(0de1)
1(1de3)
2(2de3)
xEN-19/10/92
0(0de3)
0(0de5)
2 (2 de23)
xEN-23/11/92
0(0de2)
0(0de1)
2(2de9)
XEN-03/10/94
2 (2 de2)
1(1de5)
2Qdea)
Tabla 6: Número de casos entre diversos donadores en que se evocó corriente activada por
hipotonicidad.Sólo se tabulanaquellosdonadoresque dieron corrienteen ovocitosinyectadoscon la
P-gp.
En 3 de los donadores,aparececorrienteactivadapor hipotonicidadademásde
los ovocitosinyectadoscon la P-gp, en los ovocitosde uno o los dos otros grupos.En
cambio, en 2 de los donadores,XEN-1yrc192 y XEN-23111192
sólo aparecela
corriente activada por hipotonicidaden los ovocitos inyectadoscon muestra que
contienela P-gp. Pero, dadaque la probabilidadestimadade apariciónes del 9% para
XEN-19/10192y del 22Vopara XEN-23111192,
se deberíande haberanalizadoun
mínimo de 11 y 5 ovocitoscontrol o no inyectadosen cadauno de los donadorespara
poder estadísticamente
detectarla corriente activadapor medio hipotónicoen algún
ovocito.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
101
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
DISCUSIÓN
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
&pítuIa I
DEL OVOCITO-,
La incorporaciónde proteínasde membranaa travésde sistemasvesicularesen
células huespedpor microinyección representauna vía original que abre nuevas
posibilidadesen la caracterizaciónde la actividad funcional de las proteínas de
membranay de susmecanismos
de regulación.
Esta vía de incorporaciónfuncional de proteínasen células huésped,como
alternativa a la inyección del correspondienteADNc o ARNm puede resultar
especialmente
útil en:
i/ El estudio de los receptoresheteroméricos,donde se requieretanto de la
expresiónde cada una de las diferentessubunidadesque 1o componencomo de su
posterior correcto ensamblaje con la estequiometla adecuadapara que sean
funcionales(1.71, 172). Existenen laliteratura cont¡adiccionesen resultadosa partir
de experimentosaparentemente
similares,de expresiónde receptoresheteroméricos,
por ejemplo distinto númerode conductancias
en ovocitosinyectadoscon los ARNm
de las subunidadeS
cr, F, y y 6 del nAChRde ratón(173, 174).
ii) Aquellos casosdondeel procesadodel productofinal, esto es la proteína,
pueda experimentarmodificacionespostransduccionales.
El sistemade los ovocitos
ampliamenteutllizadoen experimentosde transfección(175), podríano disponero no
suministrarla requeridamaquinariacelular para la elaboracióncorrectade la proteína
a expresar.Esto podríaconducira que las propiedadesde la proteínaexpresadaen los
ovocitos fueran distintasde las de la proteínanativa. Por ejemplo, el nAChR de la
electroplacade Tbrpedoexpresadoen ovocitoscontienemenornúmerode residuosde
manosay oligosac¿{ridos
complejosque el receptornativo, desconociéndose
si estos
alteranlas características
funcionalesdel canal(176). Por otra parte,el canalde sodio
de Electrcphorusno puede ser funcionalmenteexpresadoen ovocitos debido a una
deficienciaen el procesamiento
(177). Otro ejemplo1oconstituyeel canalde sodio de
cerebro de rata que presentadiferenciasen la cinética de inactivación una vez
expresado
en ovocitos(178, 179, 180).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
103
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
iii) El estudiode los mecanismosimplicadosen los procesosde fusión de
membranasen una célula viva, ya que la proteínaexógenaa incorporar utiliza un
vehículolipídicoa tal fin.
La validación de esta nueva estrategiaexperimental de transplantar proteínas se
ha realizado mediante el empleo del nAChR. La elección de este receptor se basó en
los tres siguientes hechos: ser el mejor canal iónico catacterizado; tratarse de una
proteína mayoritaria en la electroplaca del pez Tbrpedo marmorata, lo que facilita su
purificación; y poder ser ser aislado y reconstituído en membranas artificiales
manteniendosuspropiedadesfuncionales(181, 182, 183).
1.1- INCORPORACIÓN DEL NAChR EN I,A MEMBRANA DEL OVOCITO
La incorporacióndel nAChR en la membranadel ovocito se demuestrade
forma explícita medianteel bloqueo con atropina de los receptoresmuscaínicos
nativos (Figura 13). Este procesose efectúaen pocashoras,puestoque la presencia
de los nAChRspuedeser detectadaelectrofisiológicamente
transcurridas4 horasde la
microinyección,no descaruíndose
la presenciade algunosreceptoresen la membrana
con anterioridada ese tiempo. De hecho, Marsal y cols. (184) describen,de forma
paralelaa nuestrosresultados,la presenciade los nAChRsentre 1 y 2 horasdespués
de la inyecciónde membranasenriquecidasen los ovocitos.La razónpor la cual no se
realizaronregistrosanterioresa las 4 horasestribaen la fragilidad de las célulaspor
presentaraún la heridade la inyeccióny en la necesidadde que presenüasen
una larga
supervivenciapara poder realizarel estudiotemporalde la incorporaciónen la misma
célula.
Se obtuvieron respuestasa ACh en los ovocitos inyectadoshasta 60 horas
despuésde haber inyectadola muestra,observándose
un máximo en las respuestas
entre las 16 y 24 horas (membranaalcalina) y 16 horas (nAChR reconstituído),
valoresque no se diferenciande los obtenidospor Marsal y cols. quienesdescriben
que las respuestas
permanecendurantevarios díasproduciéndoseun incrementode la
amplitud a 1o largo de las primeras L6 horas (184). Estosresultadossugierenque la
composiciónlipídica de las diversasmuestrasinyectadasno pareceser determinante
del curso temporal de la incorporación,puestoque las distintasmuestraspresenran
unadiferentecomposiciónlipídica.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
r04
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Canítulo I
Las amplitudesde las respueslas
evocadas
por ACh en los ovocitosfueronmuy
variables,tanto en los ovocitos inyectadoscon membranapurificadacomo en los
inyectadoscon receptorreconstituído,
coincidiendotambiéncon los datosde Marsaly
cols. (184). Se observa,sin embargo,que éstasdependendel gradode purezade las
muestrasy de la cantidadde muestrainyectada:al duplicar tanto la concentracióndel
nAChR (de 4 a 8 nmoles de a-bungarotoxina(142)), como el volumen de las
muestras (de 50 a 100 nl), el tamaño de las respuestasse multiplica por 6.
Adicionalmente,no todos los ovocitos presentaronun sólo máximo de corriente,
observándoseen algunos de ellos la presenciade dos máximos relativos. Por el
momento se desconocenlos motivos que implican tal diversidaden la respuesta,
pudiendoser la heterogeneidad
de las vesículasinyectadas,tanto en su tamañocomo
en la cantidadde receptor, uno de los factoresque influiían en la amplitud de las
respuestas,puesto que se ha demostradoque ovocitos de distintos donadoresse
comportande forma similar (Tabla 1).
Aunque las amplitudesde la corriente asociadaa los receptoresincorporados
songrandes,usualmentede cientosde nanoamperios,las respuestas
corresponden
sólo
a un número pequeñode los receptoresmicroínyectados.De hecho, el número
estimado de receptores funcionales incorporados a partir de los registros
electrofisiológicosse correspondencon unos pocosmillones de los aproximadamente
6 x 1010receptoresque se inyectan en el ovocito (determinadospor la unión de
o-bungarotoxina).Es decir, sólo 1 de cada 105receptoresinyectadosaparececomo un
receptorfuncionalen la membranadel ovocito. Estaobservaciónpuededebersea:
i) Infuaestimación
del númerototal de los receptoresfuncionalesincorporados
debido a la nípida desensibilizacióninducida por altas concentracionesde ACh.
Usandola ecuaciónde Hill y asumiendoun coeficientede Hill de 2 (i85) se puede
estimar una mayor amplitud de la corriente, entre 2 y 3 vecesmayor que la medida
directamente.
iil fa' inserción de algunos nAChRs en diferentesorganelasintracelulares
puedeconducira registroselectrofisiológicossilentes.
iiil Que una vez que los receptoresse insertanen la membranacitoplasmática
pueden sufrir una r:ípido recambio que resultaríaen una menor respuestade la
esperada tras la simultiínea incorporación de todos ios receptores inyectados
(recordemos que las respuestaspermanecenmás de 60 horas después de la
microinyección).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
10s
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Díscusíón
irl Quealgunosde los nAChRspuedenser "silentes",Íro filncionales,tal como
ha sido propuestopara los nAChRs de músculoexpresadosen la membranadel
ovocitodespuésde la inyecciónde poli-A (160)o a que han sufridodesnaturalizacíón
durantelos procesosde purificacióny reconstitución.
v) Una tápida degradaciónde los receptoresdentro de la célula, por 1o que
sólo una pequeñafracciónde ellos alcanzaríala membrana.
Desde luego, es posible que más de uno de estos factorescontribuyana la
discrepanciaobservada.Estasy otras posibilidadesvan a requerir un mayor estudio,
pero es evidenteque el númerode receptoresincorporadoses suficienteparapermitir
su estudiofuncionalen detalle.
:
Está perfectamentedemostradoque los nAChRsresultantesde la inyecciónde
los correspondientes
ARNm, se orienüancoraectamente
en la membranadel ovocito y
no se distribuyende forma aleatoriaen la superficiede la célula (136). Cuando se
mapeóla incorporaciónde los nAChRs reconstituidosen la membranadel ovocito se
encontróque aparecencomo pequeñosparchesdistribuídosde forma desigualen los
dos hemisferiosdel ovocito, apareciendouna mayor densidadde parchescercade la
zona de inyección, probablementedebido a la mayor concentraciónde vesículasque
contienen el receptor en esa zona. La densidadde nAChRs en cada parche fue
probablementesimilar en amboshemisferiosdebidoa que las corrientesevocadaspor
aplicacioneslocales de ACh en las ¿íreasestudiadas,mostraron las pendientes
máximassimilares.
Aunque los ensayos con ACh inyectada indican que los receptores se
incorporancon la orientacióncorcecta,no se excluyecompletamente
la posibilidadde
que se presenteuna incorporaciónerróneaen aquellasáreasdondela respuestaa ACh
extracelularresultómuy pequeñao nula. Se descarta,sin embargo,que la ausenciade
respuestaal inyectarACh en el interior del ovocito se debaa la hidrólisisde la misma
por esterasas
intracelulares,puestoque no seconocela presenciade acetilcolinesterasa
en los ovocitos. Además,la hidrólisis por esterasas
inespecíficasdel ovocito, debido
tanto a su baja especificidadrelativapor la ACh como a la cantidadque se inyecta,no
sería 1o suficientementerápida como para impedir la aperturade aquelloscanales
iónicosasociadosa los receptoresque estuvieranpróximosal lugar de aplicación.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
IM
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Caoíútkt I
1.2- CARACTERISTICASFUNCIONALESDEL nAChR INCORPORADO.
Las propiedades
funcionalesde los nAChRsincorporadosresultansimilaresa
las previamentedescritaspara los nAChRsde Tbrpedoexpresados
en ovocitosa partir
de sus ARNm o ADNc (160, 164). Así, de la curva dosis-respuesta
se obtieneun
coeficientede Hill cercanoa 2 lo que implica una cooperatividad
de unión de ACh a
cada una de las dos subunidadesc[ presentesen cada receptorpara la aperturadel
canal(161). El potencialde reversiónde -5 mV indicaque la permeabilidad
del canal
es similar a la previamentedescritapara los nAChRs procedentestanto de ADNc
como de ARNm de Tbrpedoen ovocitos(165, 166),confirmandoque la mayorparte
de la corrienteparecedebidaal paso de iones sodio y potasio.Podría tambientener
cierta permeabilidada iones calcio pero éstapareceser menor que la que describen
Mishina y cols. (187) quienesactivabanuna corriente nativa de cloruro dependiente
de calcio y aumentaban
el potencialde reversióna valoresmásnegativos.
La relación I/V obtenidadurantela mesetade la corriente inducida por una
baja dosisde ACh (Figura 20B) muestraun potencialde reversiónsimilar al obtenido
en el pico de la corriente, indicandouna selectividadiónica similar en ambasfasesde
la respuesta.Por otra parte, es de destacarla marcadarectificaciónde los canalesde
los nAChRs a potencialesmás negativosde -60 mV, hecho que no se ha descrito
previamenteen los nAChRs expresadosen ovocitos a partir det ADNc de Tbrpedo,
que presentanuna relacióncasi lineal (164). Sin embargo,una rectificaciónsimilar se
ha descritopara los nAChRsprocedentesde músculocuandose expresanen ovocitos.
Estehechoha sido adscritoa una dependencia
de voltaje del tiempomediode apertura
del canal (160, t64). La razón por la que se presentauna alta variabilidad en la
relación I/V esüí aún por determinar.No obstante,es muy sugerenteespecularque
esta diferencia funcional entre los nAChRs sintetizadosen el ovocito a partir del
ADNo y aquellosdirectamente"transplantados"
de la electroplacapudieradebersea la
distintaglicosilaciónque poseanambos(176, 188).
La rápídadesensibiliz.ación
de los nAChRsde Tbrpedo(168) ha sido asimismo
observadaen los nAChRs incorporadosvía vesicular. De manerainteresante,los
efectos de los antibióticos como Gentamicinao Penicilina-Estreptomicina
en las
corrientes inducidas por ACh, fueron similares a las descritasen el caso de los
receptoresprocedentesde ADNc (169). Este hecho podía debersea una directa
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
107
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
acciónsobreel mismonAChR, o sobreun efectorque reguleal receptor,en lugar de
algunaalteraciónen el procesamiento
del receptorpor partedel ovocito.
El efectodelatrehalosaen la desensibtlización
de la corrientese observósólo
en aquellosovocitosincubadoscon Penicilina-Estreptomicina.
Puestoque la trehalosa
sin la presenciade antibióticosno produjo ningúnefectoen la desensibilización,'se
sugiere que el crioprotector podría actuar sobre el mismo mecanismopor el cual
Penicilina-Estreptomicina
inducenuna rápidadesensibilización.
Finalmente,el sistemade incorporaciónde proteínasde membranaa travésde
sistemas vesiculares admite el uso de muestras recién procesadasy muestras
congeladas,ya que no se han observadodiferenciassignificativasentre las respuestas
obtenidascuandola muestrase inyectóreciénobteniday cuandoseinyectódespuésde
ser congeladaen nitrogenolíquido en presenciade un crioprotector(trehalosa).Así, a
partir de variasalícuotasde una mismamuestrasepuedenrcalizarun gran númerode
ensayossin la incomodidadde tenerque inyectarmaterialreciénprocesado.
Los resultadosobtenidoscon el nAChR de Tbrydo inyectadovía vesicularen
ovocitos posibilita el estudio de la función y regulaciónde proteínasde membrana
(enzimas, canaleso receptores)en un sistemacelular distinto del nativo. Como
ejemplo de ello, en la presente Memoria, se recogen los estudios funcionales
efectuadoscon la Glicoproteína-P,proteínainvolucradaen el fenotipode resistenciaa
múltiples fármacosque presentanlas célulastumorales.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
r08
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capltulo I
2- PURIFICACION DE LA P-sp.
Los diversosgruposde investigacióndedicadosa la purificaciónde la P-gp se
han encontradocon numerosasdificultadespara su consecución:desdela formación
de agregadosy unión irreversible(en el casode columnasde intercambioiónico (77,
78)); a una pobre eficacia(cromatografíade inmunoafinídad(77)); heterogeneidad
en
la glicosilación(cromatografíade afinidadcon lectinas(2)). Por todo ello, se escogió
como estrategiade purificación una solubilízaciónsecuencialcon dos detergentes
distintos.
Se utilizó como material de partida la fracción microsomalde las células
Ll2l0/160 resistentesa Ia antraciclina Daunomicinaen lugar de la fracción de
membranaplasmáticapara minimizar tantolas pérdidasen proteínacomoel tiempo de
experimentación.I¿ elecciónde los detergentes
empleadossebasóen estudiosprevios
de purificaciónde la P-gppor otrosgrupos(2,70,71,72,76), en los queseconcluye
que los detergentes
que mejor preservanla funciónATP-ásicade la P-gp son CHAPS,
Colato de sodio, Tritón x-100, Lubrol PX, c12E8, Zwittergent3-lZ, quedando
controvertidala acción de N-octilglucósido(71). Por nuestrapafie, los detergentes
utilizados fueron CHAPS, Colato de sodio y Zwittergent3-12 cuya acción sobre la
actividadtransportadora
de la proteínaes desconocida.Zwittergent3-12 aparccecomo
un detergenteprometedor,dadoque se ha determinadosu gran eficaciasolubilizadora
de P-gpen membranas
de célulasCHRB3O(76).
Los resultadosde la solubilizaciónde Ia P-gp por CHAPS a partir de fracción
microsomalcoincidencon los obtenidospor ei grupo de Doige y cols. (70) en cuanto
a que no se consiguela solubilizacióntotal de la P-gp (Figura 26A), a pesar de
utilizar altasconcentraciones
de detergente.Los datosde solubilizacióncon Colato de
sodio discrepande los obtenidospor Hamaday Tsuruo (77) en cuantoa que esros
autoreslogtan una cierta solubilizaciónde la P-gp, hechono reproducidoen nuestro
caso.Del mismo modo, Zwittergent3-12que parecesolubilizartotalmentea la P-gp a
partir de membranasde célulasCHRB3O,sólo consiguesolubilizarlaparcíalmente
de
la fracción microsomalde las célulasLl2l0lt60 (Figura 268). Estasdiferenciasen la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
109
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
solubilizaciónde la P-gp son probablemente
debidasa la diferentecomposición
lipídica de las membranasde las células empleadascomo material biológico de
partida.
De todo el procesode purificación,cabereseñarque:
il Se ha obtenido en dos etapas sucesivasde solubilización una muestra
enriquecida=10 vecesen P-gp, lo que suponeun notableavancedebidoal hechode
que se trata de una proteína minoritana y fuertementeancladaen la membrana
(recuérdese
que presentaen su estructura12 segmentos
transmembrana).
iil Se disponede tres fraccionescon distintogradode riquezaen P-gp, con las
que se puede estudiar la funcionalidadde la misma mediantela nueva técnica de
incorporaciónfuncionalde proteínasen ovocitos.
iu) EI coste de la purificación no es elevado,puestoque se reaJízaen poco
tiempo y económicamenteresulüaapropiado comparativamenteal empleo de, por
ejemplo,anticuerposmonoclonales.
v) La fracción 52 se presentacomo un buen material de partida para la
purificación de la P-gp mediantecromatografíade inmunoafinidad:la proteínaesüí
solubilizadaen presenciade un detergentetipo zwittery se ha eliminadogran partede
la proteínainicial.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
110
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capítulo I
ovocrTo.
3.1- TNCORPORACTÓNnn LA p-gp EN LA MEMBRANA DEL OVOCITO.
':' Antes de realizar cualquier estudio funcional de la P-gp, se procedió a
demostrarque la membranade los ovocitosno inyectadosno contienela P-gp y que
su presenciaes debida a la microinyecciónen los ovocitos de membranasque la
contienen.
Para la detecciónde la P-gp, las membranasaisladasdel ovocito se aislaron
manualmenteen lugar de utilizar procesosde centrifugacióndiferencial.El métodosi
bien es más tedioso,suponeuna garantíacon respectoal aislamientode la membrana
por centrifugaciónen gradientesde densidad, dado que en este último caso, la
fracción de membranaaisladapudiera verseconüaminada
con las vesículasutilizadas
en la inyección,dandofalsosresultadospositivosrespectode la presenciade la P-gp.
3.2- ACTIVIDAD DE LA P-gP COMO TRANSPORTAD{ORDE FIíRMACOS.
Una vez demostradala incorporaciónde la P-gp en la membranade los
ovocitos, se procedió a Lacomprobaciónde la funcionalidadde la misma mediante
estudiosde acumulaciónintracelularde ffumacos.
En nuestrocaso, y considerandoque el accesodel f¿írmacoal citoplasmadel
ovocito no se ve alteradopor el trpo de muestrainyectada,y que ademásse produce
por difusión pasiva(190), como se ha descritoen otros sistemascelulares(191), la
asignaciónde que la proteína responsabledel eflujo de DNM en los ovocitos es la
P-gp, seha fundamentado
en las siguientesobservaciones:
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Iil
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
i) La acumulaciónde DNM es menor en aquellosovocitos que fueron
inyectadoscon la P-gp, incrementándose
la actividad transportadora
de DNM a
medidaque las muestrascon las que seinyectaban
los ovocitosseenriquecían
en P-gp
No obstante, el incremento de la actividad de transportede fármacos no
siempre se correspondecon el incrementoen los nivelesde la P-gp en dichas
muestras:mientrasque en el segundopaso de la purificación,la fracciónSZ es 2
veces más concentradaen P-gp y presentauna actividad transportadora2 veces
superiorque la fracciónPl, en el primer paso,la fracciónPl presenta5 vecesmás
P-gp que fm, pero su actividadde transportees sólo 3 vecessuperior.Esta falta de
correlación:ipodría debersefundamentalmentea procesosde desnaturalizacíónylo
hidrólisis parcial de la bombapor parte de Colato de sodio, acontecimientos
que en
presenciade Zwittergent 3-12 quedaríanmás preservadospor la naturalezadel
detergente.A pesar de una pérdida en la actividadtransportadora
duranteel primer
paso de purificación, ésta es inferior a la descrita por Sharon y cols. quienes
estimaronuna pérdida del 60% durantela solubilizaciónde la P-gp por CHAPS y la
reconstituciónde la mismaen proteoliposomas
(72).
Aunque en principio se pudiera pensaren diferenciasdebidasa una distinta
cinética de incorporación de la P-gp en la membranadel ovocito, bien por las
características
de las vesícuias,bien por presentaruna distintacomposiciónlipídica, la
hipótesis o parece sustentarsecon mucha fuerza. Primero porque los tiempos
escogidospara el estudio de la actividad transportadorade la P-gp se situaron
alrededorde las 24 horastras la inyección(en baseal estudioreaiizadocon el nAChR
cuya respuestamáxima se situó alrededorde las 16-24horas,independientemente
del
tipo de muestrainyectada:membranaalcalina, vesículasde asolectina).Esta premisa
sugiere que la incorporaciónde las distintas muestrasenriquecidasen P-gp van a
presentaruna cinéticaparecidade inco¡poración.Segundo,se ha podido comprobar,
en una serie de experimentoscon el nAChR reconstituídoen vesículascon distinta
composiciónlipídica, la incorporaciónfuncional del receptor en la membranadel
ovocito, sin que seobservasen
diferenciasen las amplitudesde las respuestas
(192).
ii) gt empleode VRP, un reversorde acumulaciónde antraciclinasen células
con fenotipo MDR, incrementala acumulaciónde DNM en los ovocitosinvectados
con P-gp.
Si bien en estosestudiosde reversión,se ha observadouna disminuciónen los
nivelesde DNM en todos los ovocitos inyectados,tanto con P-gp como con muesm
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
t12
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Canftulo I
controi, la acumulaciónintracelularde DNM en presenciade VRP resultómenoren
los primeros. [,a explicacióna este hecho no es clara si bien es posible que
alteraciones
en la dinámicade las bicapasinducidaspor VRP pudierandar cuentade
las modificacionesen la permeabilidadde las membranasde los ovocitos a DNM
(1e3).
l,os resultadosponen de manifiestoque tanto en los procesosde purificación
como en los de fusión con ia membranadel ovocito, se preservaen alto grado, la
actividad de la P-gp, pudiendodemostrarseque se ha producidouna incorporación
funcionalde la mismarenla membranadel ovocito. Por ello, no se puededescartarla
existenciaen la membranade las célulasLl2l0ll60 de otras moléculascon actividad
extrusora de fármacosque ademáspudieran copurificar con P-gp, si bien por el
momento no hay evidenciasde la existencia de tales bombas. No obstante, la
asignacióninequívoca de que la función transportadoraobservadaen el ovocito
inyectadoes específicade P-gp, requiere de la purificación a homogeneidadde la
proteínay su posteriorreconstituciónfuncional.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
113
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
4- ACTIVIDAD DE LA P-ep COMO CANAL DE CLORURO.
4.L.
CORRIENTE
NATIVA
DE
LOS
OVOCITOS ACTIVADA
FOR
VOLUMEN.
Una vez demostradala incorporaciónfuncionalde la P-gp en la membranadel
ovocito, se procedió al análisisde su controvertidaactividadcomo canal de cloruro
activadopor volumen (128). Para ello, se inició el estudiode la corrientenativa
activadapor volumenen el ovocito.
Los folículos de Xenopuspresentanuna corrientenativaactivadapor volumen
cuyascaracterísticas
hemospodid<lcomprobarque concuerdancon las descritasen la
bibliografía(115, 116). Esta corrientefue someramente
descritaen los folículosde
Xenopuspor primera vez en 1993 por Arellano y Miledi (116), quienesobservaron
corrientes de cloruro y potasio inducidas en folículos superfundidoscon medios
hipotónicos, cuyas propiedadesfueron detalladasen 7994, por Ackerman y cols.
(115). En nuestrosexperimentos,iniciadospreviamenea la apariciónde los trabajos
antes mencionados,(Figura 30) se observandos fasesen la corriente inducida por
hipotonicidad.La primera fase la constituyeuna corrientede salida, que sólo puede
debersea iones potasiodebido a que es el único ión cuyo potencialde reversiónes
más negativoque -70 mV (valor al que se fijó el potencialde membranadel ovocito).
La segundafase, que no siempreaparece,es una corrientede entradaque sueleser de
mayor amplitud que la primera y se debea tantoa la entradade ionescloruro como a
la salida de iones potasio, debido a que el potencialde reversiónde la corrienteen
estasegundafase, alrededorde -50 mV, se sitúaentrelos potencialesde reversiónde
potasio (-105 mV) y cloruro (-25 mV determinadoexperimentalmente
en nuestros
ovocitos),y lejos del potencialde reversiónde sodio.
Curiosamente,el potencialde reversiónen lugar de desplazarse
hacia valores
menosnegativosa medidaque disminuyela concentraciónde cloruro, lo hizo desde
-48 mV a -54 mV al pasar desdeel medio RH-75 at RH-45. Este cambio en el
potencial de reversión sugiere la existenciade una diferente contribución de las
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
114
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
eapífrilo I
conductancias
a los iones potasioy cloruro en los dos medioshipotónicos,en el
sentidode que permeanproporcionalmente
másionespotasioque cloruro en RH-45
respectoa RH-75. Ello suponela activaciónpor choquehipotónicode al menosdos
tipos de canales,uno de ellos para iones potasioy otro para cloruro, cuyo grado de
activaciónvariaríaen función de la osmolaridaddel medio.
La corrientesepudo evocartantoen folículoscomo en ovocitosdesfoliculados
mediantecolagenasa,aunquetanto el porcentajede aparicióncomo la amplitud de la
corrientedisminuyócon la desfoliculación.Estaúltima observacióndiscrepaen cierto
modocon la descritapor otros grupos(115, 1,16)quienesdicenabolir completamente
la corriente con el tratamientoenzimático,si bien las diferenciasse puedandeber
posiblementea una baja eficacia en la eliminaciónde las célulasfolicularespor la
enzima.
El hechode que la corrienteactivadapor volúmendependadel tratamientode
desfoliculación(manualo por colagenasa)así como del tiempo transcurridodespués
de la obtenciónde los ovocitos (sueledesaparecer
a los 2-3 días), sugiereque su
actividad est¿írelacionadacon la presenciade las células foliculares. Este hecho
parececonfirmarsecon los resultadosobtenidosen el amplio estudiorealizadopor
Arellano y Miledi (116, 194) quienes inhibieron mayoritariamentela corriente
activadapor volumenmedianteei empleode un bloqueantede las unionesde tipo gap.
A pesarde estasevidencias,todavíase desconocesi los canalesestín localizadosen
las célulasfoliculareso en la membranadel ovocito, puestoque existeta posibitidad
de que laproteína que conformael canaly la que constituiríael sensorosmóticosean
diferentesy esténlocalizadasen compartimientos
separados.
Las identidadesmoleculares, tanto de los canales que intervienen en la
regulacióndel volumenintracelularcomo las de algunasproteínasreguladorasde los
mismos, se desconocenhasüael momento.Se ha propuestopor diversosautoresque
un homólogo de la proteína de mamífero plcm podría intervenir en el proceso de
regulacióndel volúmen intracelular. pI6¡,,es una proteínade pequeñotamaño(235
aminoácidos)que se clonó a partir de las célulasde hígadode perro Madin Darby
(MDCK), cuyosprimerosestudiosse realizaronmediantesu expresiónen ovocitosde
knopus (195) y a la que se le ha propuestouna estructurade cuatrohojasB sin que
se le haya podido predecir la presenciade hélices transmembrana.El papel que
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
I6
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusüq
tendría esta proteínadentro de los procesosde regulaciónde volírmenestá siendo
debatidoen la actualidad.Así, Krapivinskiy cols. (196) proponenque pI.6 es un
regulador,basándose
en los hechosde que la proteínase localizaen el citoplasmay
forma cornplejoscon otrasproteínascitosólicas,incluyendola actinay que además,la
sobreexpresión
de dichaproteínaen célulasSf9 no proporcionauna actividadde canal
de cloruro. En cambio, Gschwentnery cols. (197) apoyanel papel de pl6¡ncomo
canal de cloruro, basándoseen consiguenabolir las corrientesde cloruro inducidas
por hinchamientocelular medianteel empleode oligonucleótidosantisentido.
La falta de efecto bloqueante de sustratos transportadospor la P-gp
(daunomicina, verapamil, forskolina o quinidina) sobre la corriente activada por
hipotonicidad,es consistentecon lo descrito en varios tipos celulares:folículos de
knopus, fibroblastos y en células epiteliales de intestino delgado de humanos,
independientemente
de la presencia
de la P-gp (115, 116, 197, lg9, Z0I, ZI7).
4.2.
ACTIVIDAD
DE CANAL
DE
CLORURO DE
I,OS OVOCITOS
INYECTADOS CON LA P-gp.
Los resultadospresentadosson concluyentesrespectode que la P-gp NO
presentaactividadde canalde cloruro activadapor volumen,en basea que:
i) No se ha observadola aparición de una nueva corriente en los ovocitos
inyectadoscon la P-gp.
iil No hay un incrementoen la amplitudde la corrientenativa al inyectara la
P-gp (Tabla5).
iii) Cuandoaparece,la corriente detectadaen ovocitos inyectadoscon la P-gp
presentaidénticascaracterísticas
a las observadasen ovocitos sin inyectar y en los
ovocitosinyectadoscon membranas
control desprovistas
de la p-gp.
Si la P-gp fueseun canalde cloruro, hubierasido esperableque el aumentoen
el número de canalesactivadospor volumen en la membranadel ovocito tras la
incorporaciónde la P-gp, se hubieracorrespondidocon un incrementoen la amplitud
de la corriente macroscópicaen medio hipotónico y modificacióndel potencial de
inversiónde la corrientedesplaz¡índose
a un valor máspróximo al de cloruro.
El bajo porcentajede los ovocitos Pgp+ que presentanla corrienteactivada
por volumen no parecedebido a que la proteína hubiera perdido su funcionalidad
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
IT6
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CapítuIo I
durantelos procesosde purificación,inyeccióny fusiónen la membranadel ovocito,
puestoque la actividadtransportadorade la P-gp se mantiene.De hecho, de ser un
canal de cloruro, la actividaddel mismo se hubierapuestode manifiestocon mayor
nitidez que la actividadcomo bomba,puesdebidoa los gradientesiónicosa un lado y
otro de la membrana,el númerode iones/sque puedenatravesarla membranaa través
de canaieses muy superior al eflujo de f:írmacos.Además, se disponede técnicas
electrofisiológicasde excepcionalsensibilidad(nuestrosistemaposiblementesea capaz
de detectar la actividad sincrónicade 103 moléculas(canales),asumiendouna
conductancia
unitariade 20-40pS).
En relación con la discrepanciaentre nuestrosresultadosy los obtenidospor
Valverde y cols. (128), es interesanteindicar que Mastrocolay cols. (200)
demostraronla activaciónde una corrientede potasioy cloruro por shockhipotónico
en fibroblastosde humanosmediantela superfusiónde suscélulascon un medio de la
misma osmolaridadque el utilizado por Valverde y cols. (128). Posteriormente,en
1994, Ehring y cols. (201) registraron una corriente de cloruro activada por
hipotonicidadtanto en los fibroblastosMH3T3 transfectados
con MDR-1 como en no
transfectados(control), empleandola mismascondicionesexperimentalesque otros
autores(728, 129, 198). Recientemente
Gschwentnery cols (197) tambiéndescriben
en sus experimentosla presenciade una corrienteendógenainducidapor cambio de
volumen en las mismas células. Estas observacionesindican la existenciade una
corriente nativa en los fibroblastosy por tanto oscurecenel papel de la P-gp como
canalde cloruro tras la transfecciónde los mismoscon el gen mdrl.
Por otro lado, nuestrosresultadosconcuerdancon otros estudiosque han sido
realizadosde modo simultiíneoal tiempo de realizaciónde estaTesis. Así, Rasolay
cols. (202), no encontrarondiferenciasentre las corrientesde cloruro activadaspor
hipotonicidaden cuatrolíneasdistintasde célulasde epitelio que presentaban
distintos
niveles de P-gp. McEwan y cols. (130) mostraronvalores similaresde secreción
transepitelialde vinblastina,fármacotransportable
por la P-gp, independientemente
de
la activación o no del canal de cloruro activado por volumen en células de
adenocarcinoma
de colon T84, que expresanla P-gp (203). Altenbergy cols, (204) no
encontraroncanalesde cloruro activadospor volumen en fibroblastosde hamster
Chino con fenotipo MDR y altos nivelesde P-gp. [,os mismosautoresdescribenque
en célulashumanasde cáncerde mamatransfectadas
con el gen MDR1 se evocauna
corriente en respuestaa un choquehipotónico, pero concluyenque su presenciano
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117
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
puedecontribuirde forma significativaala regulacióndel volumencelular(205). En
célulasde eritroleucemia
y resistentes
sensibles
a vinbiastinatampocoseha observado
una correlacióndirectaentre los nivelesde expresiónde la P-gp y la corrientede
cloruro activadapor volumen(206,207,208). Recientemente
Morin y cols. (209),
concluyen resultadossimilares utilizando ovocitos de Xenopus para estudiar la
funcionalidadde la P-gp, pero a diferenciadel presenteestudio,la expresiónde la Pgp se llevó a cabovía la correspondiente
inyeccióndel ARNc.
Kirk y Kirk Qrc) sugieren que sería la existencia de proteínas como
calmodulinao componentescelularesque presentancaracterísticas
similaresa éstay
no la P-gp tal como se habíasugeridopor otrosgrupos(128, 2lI, 212, 213), las que
interaccionaríancon inhibidores de la P-gp controlandola actividad de canal de
cloruro reguladorde volumen.
Quizás el paralelismo (homología estructural, localización, etc.) entre la
proteínaproductodel gen de la Fibrosis Cística(CFTR) y la Glicoproteína-P,ambos
miembros de la superfamiliade transportadoresABC (214), haya contribuído a ia
adscripciónde ciertasfuncionesa estaúltima sin el suficienteapoyoexperimental.
En la actualidad, la evidencia experimentalde diversos grupos apoya la
conclusiónrecogidaen la presenteMemoria en cuantoa que la Glicoproteína-Pno es
por sí misma un canal de cloruro reguladordel volumen celular. Su posible papel
como regulador de tales canalesmediantela fosforilación de la P-gp vía proteína
quinasaC (2L5,216) resuitamáscontroverfido,si bien nuestrosestudiosindicanque
üampocola P-gp modulaía los canalesnativosdel ovocito implicadosen la regulación
de volumen. No obstante,dada la inherentedificultad experimentalpara elucidar
dicha actividad que razonablementeimplicaría interacciones proteína-proteína,
posiblementeinteraccionescon proteínasde citoesqueleto,etc., la adscripciónde una
función reguladorade canalesde cloruro a la P-gp necesitaun estudiomásdetallado.
Aunque, los resultadosobtenidospor Tominagay cols. (199) descartantambiénesta
posibilidad,puestoque la utilizaciónde activadoresde la proteínaquinasaC no tuvo
ningúnefectosobrela corrienteactivadapor hipotonicidad.
Finalmente,señalarque recientemente,durantela redacciónde estaMemoria,
nuestrogrupo ha conseguidoincorporarfuncionalmenteen la membranadel ovocito el
canal de cloruro de TbrpedoCIC-0 (284), mediantemicroinyeccióncon vesículas
lipídicas. El hecho de que tres proteínas distintas tanto estructural como
funcionalmentese incorporeneficazmentea la membranadel ovocito, confirma la
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1r 8
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Volver al índice/Tornar a l'índex
CaoítuIo I
potencialidad de esta nueva metodología en el estudio de proteínas de membrana en
ovocitos de Xenopus.
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119
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CAPITULO II
REerrBRril{rENTos
Er\ERcÉrrcosDELAS
cÉr,ur,Asp3gg.
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
RESI]LTADOS
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Caoiútlo II
CONDICIONES BASALEü
El estudiode los requerimientosenergéticosde las célulasde la línea P388 se
ha realizadomedianteel an¿flisis
de los nivelesde ATP, consumode oxígenoy niveles
de lactato. [,os experimentosse realizaronen un medio salinoisotónico,en ausencia
de sustratosmetabólicoscomo glucosay glutaminapresentesen RPMI-1640 (medio
habitualde cultivo). [,os resultadossepresentana continuación:
O
a
4000
F
o,o4
x
'E
0.03
,4
's
91
q
N
3000
0-05
x
0,02
oor
0,00
P388/SP388/20P388/100
2ooo
E
-
:
7.
1000
U
P388/SP388/20P388/100
6
1,50
^5
1,25
=
l,oo
t
*o¡v
11
9
u_/J
o50
0,2s
0.00
P388/SP388/20P388/100
Figura 37: Medidasde los nivelesde ATP, lactatoy consumode oxígenode la línea P388 en
condiciones
Basales.
[¿s barr¿sdeerrorrepresentan
la e. s. m. de 1l ( n ( 79.
De esta figura se deduce que:
i) Las células que sobrexpresanP-gp, P388/100, manifiestan niveles de ATP
mayores que las células sensiblesindicando que poseen una mayor disponibilidad de
esta molécula, suministradora de la energía necesaria para el eflujo activo de
fármacos. (Recordemos que P-gp tiene dos centros de unión de ATP). Además, los
niveles de ATP de las células resistentes P388/20 son indistinguibles de las células
P388/100 y significativamente mayores que los de las células sensibles.
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122
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer,ulá.dos
ii) El patrón de consumo de oxígeno entre las distintas sublíneascelulares es
paralelo al de los niveles de ATP: las células resistentesconsumenmás oxígeno que
las células sensiblesmientras que no se aprecian diferencias significativas entre las dos
sublíneasresistentes.En ensayosrealizados en presenciade azída, se comprobó que se
reducía drásticamenteel consumo de oxígeno en todas las sublíneas.
iiil No existen diferencias significativas en los niveles de lactato entre las
células resistentesy sensibles,con 1o que se desprendeque la víaanaeróbica no parece
influir de modo relevante en las diferencias establecidasen los niveles de ATP entre la
sublínea sensibley las sublíneasresistentes.
PRESENCIADE DNM Y/O VRP.
Inicialmentese realizaronuna seriede experimentosdirigidos a monitonzarel
efectoaisladodel fármacoVRP sobrelos nivelesenergéticosde las célulasP388. Para
ello, las célulasP388seincubaroncon VRP 5 ¡rM a37oC y transcurridos120 min se
extrajerondiversasalícuotasen los que se estudiaronlos parámetrosenergéticosantes
mencionados.Los resultadossepresentanen la siguientefigura:
a
0,05
e8 0,04
vá
x
o
It
vY!
c)
a
V
3000
x
0,03
0,02
0,0r
q00
P388/S P388,20 P388/100
2000
7
^ 1000
,0
a
9i
1,50
1)S
Y
1,00
l<
oo
:L
fj
<l
0,75
q50
0,25
0,00
P388/20
figura
38: Niveles de ATP, lactato y consumo de oxígeno de la línea P388 en condiciones Basales
(barras blancas) y tras incubación con VRP 5 ¡rM durante 120 min. (barras grises). Las barras de error
representanla e- s. m. de 11 1 n 1 79.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
123
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capítulo II
De la Figura38 sedesprende
que:
il La incubaciónde las célulassensibles
con VRP durante120 min no produce
alteracionessignificativasen el metabolismoenergéticode las mismas.En cambio,
altera los correspondientes
a las célulasresistentes:incrementalos nivelesde lactatoy
disminuyelos nivelesde ATP y consumode oxígeno.
ii) VRP anula las diferenciasen los niveles de ATP y consumode oxígeno
entre las sublíneasresistentes,que de este modo se igualan ademása los niveles
mostradospor las célulassensibles.
---r-DNM
---¡-vf,P+
888/5
I
Hts8/100
ü ¡ooo
l------L.t. +
.9 zooo
\
k rO{n
60
ffi
0,04
\-j
J--T
t --t-i-l
ffi
T
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I-I-I==_I
Y
x
0,01
I
rs
Y
x
I,u
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ffi
0306090
T
¡-l----l-------¡
-_-1-.-¡-¡
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-T
-rI5?.--.-....-{..--
'-r
I.-I=-\
_\!.-!
lE*
tt \
1
ot)
ffiffiffi
IIDltFo(mn)
Figura 39: Niveles de ATP, lactaúoy consumode oxígenode las célulasP388 en función del tiempo de
incubación con DNM 3 pM, en presencia o no de VRP 5 ¡rM preincubado durante 120 min.
(4<n< 16). Los símbolosque representanlos diferentesgradosde signiñcanciacolocadosencimade un
punüode la gnifica denota diferencias entre ese valor y el correspondienüsa t=0, mientras que los
situadosen el eje de abcisasindicandiferenciasentre los valoresen presenciao no de VRP.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
121
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Rer,ultudos
Despuésde haber determinadolos parámetrosenergéticosmencionadosen
presenciade VRP, se procedióal an:ílisisde los requerimientos
energéticosde las
célulasP388en presenciade DNM en las mismascondicionesen las que se realizan
los ensayosde acumulaciónde fármacos(131).
De los resultadosrepresentados
en la Figura 39, se deduceque:
i) La incubacióncon DNM no afectade forma significativa,al menosen los
primeros 90 minutos, el nivel de ATP en las células sensiblesni en las células
P388/20,1oque hacesuponerque DNM no activaningúnprocesoque requieragasto
energético.En la sublíneamás resistente(P388/100)la incubacióncon DNM reduce
de forma significativa, a partir de los 60 min, los niveles de ATp, 1o que
tazonablementepodría asignarsea la actividad extrusora de fármacospor parte de
P-gp.
d) DNM no altera significativamenteel consumode oxígenoen ningunade las
líneas celulares. No obstante, los valores en los distintos intervalos de tiempo
pertenecientes
a las célulasP388/100presentan
una p:0,08 con lo que posiblemente
un incremento en el número de casos estudiadoshubiera permitido obtener una
disminuciónsignificativadel consumode oxígenocon el tiempode incubación.
iii)ta' incubacióncon DNM tampocoafectade forma significativalos niveles
de lactato en las célulassensiblesni en 1asresistentes.Sólo apareceuna disminución
estadisticamente
significativa(p< 0,01) en las célulasP388/100a los 90 min.
Tras determinar los requerimientosenergéticosde las células P388 en
presenciade DNM, se estudióa continuaciónel efectode unapreincubacióncon VRP
en los mismos.l,os resultadosse presentanen la Figura 39, ftazo tojo, e indican que
la presenciade DNM tras la preincubacióncon VRP durante t20 min, no modificó
los nivelesde ATP, consumode oxígenoy nivelesde lactatoen ningunade las líneas
celulares. Las diferencias entre la preincubación o no con VRP se centran
fundamentalmenteen las células resistentes,que salvo ciertas excepciones,se
producendurantelos primerosminutosen las célulasp3B8/20y durante60 min en las
P388/100.
Como resumende los resultadosobtenidos,se ha confeccionadola siguiente
tabla dondese esquematízan
los efectosaisladosde DNM (60 min), VRP (120 min) y
DNM (60 min) traspreincubación
con VRP (120min):
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
r2s
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CapítuIo II
P388/S
P388/20
P388/r00
BASAL
rtrl¡
IIIIIII
Itlrtll
NIVELES
DNM
rTIII
trlltlt
IIIII
ATP
VRP
rIIII
IITII
ITTII
DNM + VRP
IIIII
llrtr
¡ltrr
BASAL
trttaao
.<)tlt
o<).aaao
t(}a,ioaa
aaaaa
(}aaaa
DNNI + VRP
oaaoo
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aaaaa
aa,oaa
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BASAL
el}{t{'ü
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NTvELES
DNM
f ütlrl|l
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LACTATO
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{tütc{}{}!
¡$*txttt{}
DNM + VRP
{}{}{} tl{} üü
{r*f {}ttc
üc{ t$ct{ t
CONSUMO
DNM
DE'Az
VRP
Tabla 7: Esquemade los resultadosobtenidosdurante el estudio los niveles energéticosde las células
P388, en condicionesbasales,en presenciade DNM (60 min), VRP (120 min) y DNM (60 min) has
preincubacióncon VRP (120 min).
I-a tabla pone de manifiesto que:
i) La incubacióncon DNM disminuyó de forma significativalos niveles de
ATP en las célulasP388/100manteniendoinalterablestanto el consumode oxígeno
como los nivelesde lactato. Por otro lado, produjo una disminucióndel consumode
oxígenoen las célulasP388/20que no se refleja en los nivelesde ATP y que tampoco
se ve compensado
por un incrementoen el nivel de lactato.
ü) L'a incubacióncon VRP disminuyó los nivelesde ATP sólo en las células
resistentes, no observándosevariaciones en dichos niveles cuando se realizó
posteriormenteuna incubacióncon DNM. L¿ disminucióndel consumode oxígeno
por VRP en las células resistentesse acompañade un incrementodel metabolismo
anaeróbico.
iii) L'as células sensiblessólo sufren una alteraciónen el nivel de lactato
cuandose incubancon DNM despuésde habersido preincubadas
con vRP.
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126
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
DISCUSIÓN
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Capítulo II
El estudio de los requerimientosenergéticosde las distintassublíneasde las
célulasP388 va a permitir profundizaren el conocimientode los mecanismos
de
resitenciaa múltiples fármacos.El estudiose ha realizadomedianteel an¿ílisisde los
nivelesde ATP, consumode oxígenoy nivelesde lactatode las célulasP388/1@y su
valor se ha contrastadocon el obtenidotanto en las célulasP388/S(célulastumorales
que no presentanel fenotipo MDR) como en las célulasP388/20(célulasresistentes
que no sobreeexpresan
en su membranala P-gp).
1- NTVELES ENERGÉTTCOSDE LAS CÉr,rN¡.S P388/S.
La incubaciónde las célulasde la sublíneaparentalsensiblecon los diversos
efectoresantitumoralesno ocasionavariacionesen los niveles basalesenergéticos
estudiados(AT?, consumode oxígenoy lactato),lo que indica que esiascélulasno
present¿nmecanismosactivosde destoxificaciónde fármacos.
2- NTVELES ENERGÉTTCOSDE LAS CÉr,UI,NS P3E8/1OO.
Las células P388/100 requieren de un mayor aporte energético que las
parentalessensibles,lo que significaque estascélulaspresentanprocesosactivos(que
requieren energía) para eliminar a los fiírmacos antitumoralescomo DNM. Ia
principal fuentesuministradorade esteaporteextra de energíava a ser la vía aeróbica
del metabolismoenergético,de igual forma como se ha establecidoen otros tipos
celularescon fenotipoMDR (218, 219, 22A,221, 222).
Al contrario de 1o observadoen las célulassensibles,la presenciade DNM
disminuyó de forma significativa los niveles de ATP, indicando que el fi{rmaco
promuevela activaciónde procesosque requierenenergía.Teniendoen cuentaque
estasublíneaes la que presentauna menoracumulaciónintracelulardel fármacoy una
sobreexpresión
en su membranade la P-gp, parecerazonablesuponerque al menos
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
128
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusión
parte del aporteenergéticoextra de estascélulasse debaal bombeoextracelularde
DNM Wr partede la P-gp con la hidrólisisconcomi¿ante
de ATP.
[¿s vías aeróbica y anaeróbicadel metabolismoenergético no presentan
variacionessignificativascon la incubaciónde DNM. El consumode oxígenopresenta
ligeras variaciones tendentesa diminuir, al igual que las otras dos sublíneas,
mimetizandoun efecto "veneno"de la vía aeróbica.Tal disminución,sin embargo,no
parececompensarse
por la formación de ATP vía lactato cuyos nivelespermanecen
prácticamenteinalterados.No parecefácilmenteexplicableel mayor gastode ATP en
estascélulas, sin que exisüaun incrementoen la actividad de las vías aeróbicao
anaeróbica.Es posibleque las sensibilidades
de los métodosempleadosen el an:ílisis
del contenidode lactatoo consumode oxígenoseanmenoresque la correspondiente
a
la medidade ATP por bioluminiscencia.
El incrementoobservadodel consumode ATP por parte de VRP descritoen
varias líneascelulareshumanascon el fenotipo MDR (223,224), confirma su papel
de sustratode la bomba (225). No obstante,a diferenciade recientesobservaciones
realizadaspor Spoelstray cols (93), nuestrosresultadossugierenque VRP representa
un sustratocompetitivode DNM para su transportepor P-gp, ya que su coincubación
con DNM no incrementasignificativamente
el consumode ATp.
La disminuciónde los nivelesde ATP por parte de VRP se acompañóde una
reducciónen el consumode oxígeno,esto es, de la actividadde la vía aeróbica,de
igual forma como se ha descritoen célulasP388 resistentes
a Adriamicina (218) y en
microsomasde hígadode rata (226). El aporteenergéticopara el transportede VRP
por P-gp parecesuministrarsepor vía anaeróbica,que compensaría
así la disminución
del metabolismoenergéticooxidativo al igual que se ha descritova¡iaslíneascelulares
humanasMDR (223, 227, 228).
Aunquela adscripcióndel principal mecanismode resistenciacelular se debaa
la sobreexpresión
de la P-gp en la membranade estascélulas,no sepuededescartarla
presenciade otras proteínasextrusorasde fiírmacosantitumorales,como pudieranser
las proteínasMRP descritasrecientemente
en célulaspequeñasde pulmón (229,23q.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
129
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Caoítulo II
3- NIVELES ENERGÉTTCOSDE LAS CÉLULAS P3E8I2O.
El mayor nivel de ATP determinadoen las célulasP388/20sugiereque éstas
han desarrollado,al igual que las célulasP388/100,unossistemas
de resistencia
a los
fármacosque no presentanlas células sensibles,y para los cualesrequierende un
aporteextra de energía.
El empleodel reversorde resistenciaa múltiplesfármacosVRP, disminuyóen
estascélulaslos nivelesde ATP, cuya reposiciónpareceimplicar la formaciónextra
de lactato,al igual que sucedíacon la sublíneamásresistenteP388/100.
A diferenciade 1oque ocurre en las célulasP388/1m, h presenciade DNM
no alteró de forma significativalos nivelesde ATP, aspectointeresantepuestoque
estascélulasno sobreexpresan
en su membranaal transportadorP-gp.
El hechode que las célulasP388/20no sobreexpresen
P-gp en su membrana,
conlleva a plantear que el requerimientoextra de ATP con respecto1as células
sensiblesdeberáasignarsea mecanismosde resistenciadistintosde la expresióndel
transportador.Nuestro grupo ha descrito modificacionesdel pH intracelular (pHi)
(103) en estascélulas,habiendoest¿blecidoque éstastienenun pHi más alcalino que
las P388/S(103), alteraciónobservadaasimismoen otraslíneascelulares(231, 232,
233,234). Roepey cols. investigandolos mecanismos
que causanla alcalinizacióndel
pHi, observaronque la actividaddel intercambiadorNa*/H* era mayor en las células
resistentesque en las célulasparentalessensibles,lo que en un principiojusüficaría el
mayor pHi de las primeras. Sin embargo,la expresiónde esteintercambiadorno se
correlacionabacon el incremento del pHi, que a su vez parecíahacerlo con la
expresiónde la P-gp (235), indicandoque esta última podía actuar también como
bomba extrusorade H+. Posteriormente,observaronque la sobreexpresiónde los
genesque codifican estasproteínasdependíadel grado de resistenciade las células:
cuandoel nivel de resistenciaera bajo, se sobreexpresaba
principalmenteel gen de
Na*/H* y en célulascon mayoresriivelesde resistencia,el correspondiente
a P-gp
(235). Estos datos apuntana que parte de los requerimientosextra de ATP que
presentanlas célulasP388/20sedediquena una mayor actividadbiosintéticapor parte
de las célulasresistentesentre los que se puedeencontrar,entre otros, la expresión
acentuada
del intercambiadorNa*/H*.
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1"30
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Discusi6n
_
La trascendencia
del incrementodel pHi sobrela actividadfarmacológica
de
DNM se pone de manifiestoal analizarque DNM presentaen su estructuraun grupo
amino ianizablecon un pKa entre 7,6 y 8,2 (236), con lo que variaciones
en el pH
puedenalterarla proporciónentrelas especiescargadasy neutrasdel fármaco.De este
modo, la alcalinizacióndel pHi podía favorecerla menor acumulaciónde DNM en
las célulasresistentesmediante:
i) Disminución del influjo de los fármacos: L¿s antraciclinaspermean la
membrana por difusión pasiva (236). Habida cuenta de que el gradiente
electroquímicode DNM va a ser la fuerzamotriz para la entradadel fármacoen las
células, y puesto que los experimentosde acumulaciónde DNM realizadospor
nuestro grupo en las células P388 se establecenen condicionesde gradiente de
aproximadamente
0,3 unidadesde pH en el casode las célulassensibles
(P388/S),0,1
unidadesde pH en las P388/20 y practicamente
0 en las P388/100(103), es de
esperarque la facilidad de captaciónde DNM por las célulassensiblesresultemayor
que la que presentenlas célulasresistentes.Estasconsideraciones
concuerdancon las
aportadaspor Skovsgaardy Nissen(236) quienesseñalanque un incrementoen el pH
del medio extracelularcon relaciónal del citoplasma,favoreceríael influjo de DNM,
incrementándose
la acumulaciónde f¿írmaco,un hecho que ha sido observadoen
vesículas lipídicas artificiales que presentanun gradiente transmembranade pH
(interior acídico) (237). Aunque controvertido, se ha descrito que VRp puede
disminuir el pHi (234) en una línea resistentede célulasde cáncerde pulmon humano
Sw-1573, provocandoun aumentoen el influjo de los fármacos,y por tanto un
incrementointracelulardel fármacoantineoplásico.
ü) Aumento del eflujo de los fármacos: Se ha establecidoque las
antraciclinasse acumulanen el interior de organelasacídicas(238, 239), un evento
que severía favorecidoen las célulasresistentes
por el mayorgradientede pH entreel
citoplasma y dichas organelas. También se ha descrito que los compartimentos
endosomalesacídicos de las células P388 resistentesson mayoresque los de las
células P388 sensibles(240). Como consecuencia,se favoreceríael mecanismode
reducciónde fármacointracelularpropuestopor Sehested
y cols. (24I), por el cual los
fármacosatrapadosen el complejoendosomal-lisosomal
seían expulsadosal exterior
celular medianteexocitosis,reduciendoel nivel intracelulardel mismo, pudiendoser
este último procesodependientede energía.Por otra parte, se ha descritoen células
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T3I
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Volver al índice/Tornar a l'índex
Capítulo II
MDR que VRP inhibede forma significativala exocitosis(242),1oque disminuiríael
eflujo de los fármacos,por tanto,incrementando
su concentración
intracelular.
iii) Menor unión de DNM en las distintas organelas: Se ha descritoque la
afinidad de unión de los f¡írmacosa las organelasintracelulareses mayor en las
especiesprotonadasde los mismos. En las célulasque presentanun mayor pHi, el
equilibrio entre las formas protonaday neutra de DNM se ve desplazadohacia la
formación de especiesneutras,con 1o que el fármaco ve disminuídasu afinidad de
unión en estascélulas.
Nuestrasobservaciones
de que la incubaciónde las célulasP388/20con VRP
incrementela hidrólisis de ATP, implicaríanmecanismos
distintosa la sobreexpresión
de la P-gp. Entre ellos podríamoscitar: inhibición del tráfico vesicularintracelular
(ver iÍi ), implicaciónde otras proteínasextrusorasde fármacosantitumorales(MRP),
incrementoen los procesosde destoxificaciónmediadospor el sistemadel Glutation
(243,244,245), procesosde reparaciónde DNA por Topoisomerasas
(246,247), etc.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
r32
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
CONCLUSIONES
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Canclusions
1- l,a microinyecciónde vesículasde membranade Tbrpedomarmorataconteniendo
el receptor nicotínico de acetilcolinaen ovocitos de knopus laevis, conducea la
incorporaciónfuncional del mismo en la membranadel ovocito. Tal aproximación
experimentalsuponeuna alternativaoriginal y eficaz a la expresiónde proteínasde
membranaen el ovocito mediadapor los correspondientes
ADNc o ARNm.
2'Ia metodologíaanteriores extensivaa la microinyecciónde proteínasde membrana
reconstituídasen vesículaslipídicas de composicióncontrolada,como vehículosde
incorporaciónala membranadel ovocito.
3- El número de receptoresnicotínicos de acetilcolina incorporadospor esta vía
resultalo suficientemente
grandeasí como su estabilidaden la membranadel ovocito,
como para poder realizarestudiosdetalladosde suspropiedadesfuncionales.
4 Ins receptoresse distribuyenpor toda la superficiedel ovocito, agrupiíndoseen
"parches"y orientándosecorrectamenteen Ia membrana,si bien pareceexistir una
tendencia a localizarre preferentemente en lugares próximos aI sitio de
microinvección.
5- IA microinyecciónen ovocitos de vesículasconteniendoproteínasde membrana
minoritarias resulta asimismo útil en estudios funcionales de las mismas. Esta
posibilidad se ha exploradoutilizando membranasde célulastumoralescon fenotipo
resistentea antineoplásicos,que expresanGlicoproteína-P,proteína ausenteen la
membranadel ovocito.
6La incorporaciónvia vesicularde la Glicoproteína-Pen la membranadel ovocito se
ha llevado a cabo con fraccionesde membranaprogresivamenteenriquecidasen la
proteína.I¿ actividadtransportadora
de f¡írmacosde la Gticoproteína-Pen el ovocito
se incrementa con el nivel de enriquecimientode la proteína en las muestras
inyectadasy es moduladapor el reversorde resistenciaverapamil.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
t34
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Volver al índice/Tornar a l'índex
Canclusionx
7-Los folículos de Xenopuslaevisposeencanalesde potasioy cloruro que se activan
por hipotonicidad.La desfoliculaciónde los mismoscon colagenasa
disminuyeo
eliminaestascorrientes.
8- En los ovocitos que no respondenante un medio hipotónicocon la activaciónde
una conductanciaiónica, la incorporaciónde la Glicoproteína-Pno suponeun cambio
en la respuestasilente del mismo a condicionesque promuevenel hinchamiento
celular.
I En los casosen los que el ovocito presentaactividadiónica de cloruro y potasioen
medios hipotónicos, la posterior presenciade la Glicoproteína-Pen el mismo, no
alteraen absolutolas propiedadesnativasde las mencionadas
conductancias.
10'De las conclusionesanterioresse deduceque la Glicoproteína-Pno representaun
canalde cloruro reguladordel volumencelular.
II- Las sublíneasde la cepa P388 con fenotipo de resistenciaa múltiples fármacos
presentanunos requerimientosenergéticossuperioresa los de la sublíneaparental
sensible.El hechode que la presenciade daunomicinapromuevauna disminuciónde
los niveles energéticosen las célulasmás resistentes(P388/100),resultacompatible
con: i) el bombeo del ftírmaco al exterior celular por la Glicoproteína-Pcon la
hidrólisis concomitantede ATP; ii) Ia disminuciónintracelularde daunomicinacon
respectoal nivel presentadopor las célulassensibles.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
135
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
npÉworcES
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
ANnüca;
I- ELECTRODO-DE CLARK
El electrodode Clark es uno de los electrodosmás selectivosque existen.
Como se muestraen la Figura 40, el conjuntodel electrodoestácompuestode: los
elementosdel electrodo moldeadosen un tapón de epóxido y cubierto por una
membrana de
+-
teflón,
un
soporte de lucita que ajusta
SOPORTE
DE LUCITA
BLOQUEDE EPO)O
CANAL DE ESCAPE
BURBUJAS
CAMARADE VIDzuO
PARALA MUESTRA
cómodamenteen una cámara
de muestras de vidrio.
la
cámarade muestrasde vidrio y
un
agitador magnético de
forma de disco plano que se
ajustaal fondo de la cámarade
muestra. El mismo electrodo
KCI
posee un cátodo de platino y
MEMBRANA DE TEFLON
dos ánodos de plata, bañados
MUESTAA
por
una
disolución
semisaturadade cloruro de
AGITADORMAGNÉTICO
Figura 40: Electrodode clark y montajede la cámarade
muestra.(Modificadode Brown y Mebine(248)).
potasio.
Una
delgada
membrana de teflón se sujeta
tensamente sobre el final
del
electrodo por una junta tórica
de goma, que aíslaasí la disoluciónde cloruro de potasiodel electrodode la muestra
y sirve como dispositivo de selectividad.El teflón es permeablea algunos gases,
permítiéndolespasara travésy tomar contactocon el cátodode platino.
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137
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
AÉndics
Si un potencialpolarizadorde 0,8 V se aplicaa travésde los elementosdel
electrodo,el oxígenoreaccionacon el cátodode acuerdocon la siguientereacción:
02 + 2e- + 2H3O+<> [H2O2]+ 2H2O
[ H z O z*] 2 € + 2 H 3 O + e 4 H r O
suma: 02 + 4e- + 4H3O- <f 6H2O
El circuito se completapor la siguientereacciónque ocurre en el ¿ínodode
plata:
4Ago + 4Cl-e
4AgCl * 4e-
total: 4Ag0 + 4Cl- + 4H+ + Oz <> 4AgCl + 2:HzO
El flujo de corrientees, por tanto, directamenteproporcionala la cantidadde
oxígeno que difunde a través de la membrana de teflón, dependiendode la
temperaturade la membranade teflón y de la presiónparcial de oxígenoen la cámara
de muestra.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
138
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Apénücq
II- OYOCITQS DE Xenopts laevis.
2.1--GENERALIDADES.
Fgura 41: Fotografíade un sapohembraknopus laeuis.
Xenopuslaeuis (Daudin) es un sapo sudafricanode la familia Pipidae y de la
subfamiliaXenopiae,que se caractenza.a diferenciadel resto de anuroscriados en
laboratorio, por ser capazde iniciar ciclos reproductoresen cualquierépocadel año y
mediante la administraciónde gonadotrofinacoriónica (HCG) a hembrasadultas
prov@ar la ovulacióny ovoposiciónsin dependencia
esüacional.
Ofra característica
es
que poseeun desarrolloasíncronode ovocitospor lo que se puedenencontraren un
sóLoXenopusovocitos en distintos estadiosdel desarrollo. Estas característicashan
hechoque los ovocitos de knopus sean,desdehace varias décadas,muy utilizados
por embriólogospuesa partir de ovocitosde una sola hembrase puedeninvestigarla
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
139
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Aúndics;
morfologíay cambioscitológicosque ocurrenduranteel crecimiento,maduracióny
ferttlizacióndel ovocito y posteriordesarrollodel embrión(249).
En la décadade los 60 y 70 se utilizaron como células para estudiar los
mecanismos
de regulaciónde divisióncelular(250,25I). A partir de los estudiosde
reiniciación meiótica, maduraciónde los ovocitosy su fertllizaciónse descubrióque
tanto el potencial de membrana,como las concentraciones
iónicas intracelularesy
ciertascaracterísticas
de la membranadel ovocito cambiancon el desarrollode éste.
El conocimiento de estos fenómenosestimuló a los electrofisiólogosa realízar
registrosen ovocitospara conocersuspropiedadesde membranay el tipo de canales
iónicos responsables
de estoscambiosduranteel desarrollo.Esto llevó a conocerque
los ovocitosademásde canalesdependientes
de voltaje, poseenen su membranaotros
activadospor neurotransmisores
(252). De estaforma el ovocito se convirtió en un
excelente modelo donde estudiar los mecanismos celulares en respuesta a
neurotransmisores
y entreellos los mediadospor segundosmensajeros.
Con el enorme desarrollode la biología molecularde los últimos años, los
ovocitos se comenzaron a utilizar en los estudios de expresión genética. El
descubrimientode que el ovocito es capaz de sintetizar adecuadamente
proteínas
exógenasa partir de la inyección de ARNm foráneo (253) abnó las puertasa su
utilización, fundamentalmenteen neurociencias,en la década siguiente. Así, a
principios de los años 80 se demostróen ovocitos eI ensamblajecorrecto de las
distintas subunidadesdel nAChR (188) y la expresión funcional de receptoresa
neurotransmisores
y a canalesiónicos(165,255).
En la actualidadel ovocito de knopus laeuis es un modelo experimental
ampliamenteutilizado para estudiarcanalesdependientes
de voltaje o activadospor
ligandosbien propiosde su membranao bien incorporadosa ella tras la inyecciónde
materialgenéticoexógeno(tantoARNm como ADI.[). La proliferaciónen los últimos
años de grupos que utilizan el ovocito como modelo para el estudio de las
característicasde canales iónicos se debe a sus ventajas experimentales:fácil
adquisición, manejabilidad,célula eléctricamentecompacta,interrelacióncon otras
célulasde su entorno,etc. Ademáslos ovocitossoncélulasgrandes(hasta1,3 mm de
diámetro), y su gran tamañopermite utilizar distintastécnicasen una célula única:
microdisecciónde ovocitos aislados;penetracióncon diversosmicroelectrodostanto
para registro electrofisiológico(fijación de voltaje con dos microelectrodos)como
para inyectar distintas sustanciasy de esta forma controlar la concentración
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
140
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Aúndics
intracelularde diversoscomponentescelulareso de fármacos;utilización de técnicas
bioquímicasasí como registrosópticosen célulaaislada.
2.2- MORFOLOGÍA DEL FOLÍCUIJO OVÁRICO.
El ovario de una rana se halla constituidopor diversos lobulillos o sacos
ováricos (ver Figura 42), los cuales se hallan unidos por diversos tejidos,
principalmenteconectivo. En estos lobulillos se encuentranlas células germinales
femeninas.Estascélulas entran en meiosiscuandola rana se encuentraen estadío
larvario tardío, pero la meiosisquedaintemrmpidaen la primera profase(arrestode
la primera meiosis)y es cuandoestascélulasgerminalesfemeninaspasana llamarse
ovocitos u ovocitos inmaduros. Cuando la rana se hace adulta estos ovocitos
comienzana crecery en esecrecimientosepuedendiferenciardiversosestadíos.
Figura42:Fotografía
deun lobulilloprocedenüe
delovariodevn Xenopus
taevis(Adzptado
deIvorra
(14e)).
Como se ha comentadopreviamentey se puedeobservaren la Figura 42 en
knopus laevis es posible encontrarovocitos en distintos estadíosde crecimiento.
Existendiversosestadiajesrealizadospor variosautorespero en &nopus laeuisel más
utilizado es el de Dumont (146) que clasificaa los ovocitosinmadurosen seisestadíos
según su morfología, relación con otras capas celulares o acelulares,tamaño y
captaciónde distintastincioneso substancias.
Parala mayor parte de los estudiosde
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
141
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Apénücu
expresiónde proteínasexógenasse utilizan ovocitosinmadurosque han alcanzadosu
mayorgradode crecimiento,estadíosV y VI de Dumont.En eslasetapaslos ovocitos
(Figura43A) tienenun tamañode I a 1,3 mm y su superficiese hallarecubiertapor
un gran número de microvellosidades;se caracteizan por tener dos mitades o
hemisferios bien diferenciadosy separadospor una banda central clara que se
denomina ecuador. El hemisferio llamado animal posee un color marrón oscuro
debido a la gran concentraciónde melanosomas
justo por debajode la superficiedel
ovocito, debajode una zona submembranosa
y agranular;en estehemisferiose halla
su gran núcleo o vesículagerminal. Ademáses la zona del ovocito en la cual los
lípidos de membranaposeenmayor movilidad, exigtenmayor númerode estructuras
contráctilesy, cuandoel ovocito ha maduradoes el lugar donde el espermatozoide
puede introducirse. El hemisferio vegetal, de color amarillento, careceo poseeun
escasonúmerode vesículascon vitelo (queconfierenal ovocito energíasufi.ciente
para
su maduración);en estehemisferioexisteuna mayor concentraciónde ARN que en el
animal. Estasdiferenciasestructuralesconfieren al ovocito una polaridad funcional
que se manifiestaen una distribución espacialirregular de los canalesiónicos y
receptoresde membrananativos.
B
he¡riefsr*¿o
4nirmI
hecicfecí1o
YEgetat
E@bÉf¡n¡
plɀ.r{tica
BeEbrs¡lá
vitr¡1ir¡a
cé!"ula
iolicular
Ftgura 43: (A) Foüograffade un folículo ovárico de Xenopuslaevis. (B) Esquemade las diversascapas
que componenun folículo ovárico (Adaptadode Ivorra (149).
Es importante mencionar, sin embargo, que los ovocitos tanto en el ovario
como cuando son separadosmanualmentedel tejido ovárico no son célulasaisladas
sino que se hallan conformandolos folículos ováricos. El folículo ovárico cuandoel
ovocito está en su estadíoV-VI se halla formado por diversascapas(véaseFigura
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
142
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
AÉaüces
43B) que convienetener en cuentatanto por su importanciaen el desarrollodel
ovocito como experimentalmente.
Estascapasson:
i) MembranaVitelina: es una capa acelular fibrosa que se halla unida a la
membranaplasmáticadel ovocito y recubretoda su superficie.
ii) Capade célulasfoliculares:estascélulas,que son nucleadasy poseengran
númerode nucleolos,present¿nnumerososcontactoscon la membranadel ovocito. A
través de la membranavitelina, los microvilli de estas células contactancon los
microvilli del ovocito estableciendounionescomunicantestipo gap (254, 256) que
permitenel pasode moléculasde hastá1000Da y por supuestola conexióneléctrica
directa con el ovocito. Estasuniones"gap" se hallan controladashormonalmente,su
permeabilidady númeroaumentanal ser estimuladoel folículo ovárico con hormona
luteinizante o con gonadotrofinacoriónica que sirve al ovocito para reiniciar su
procesomeiótico (254,256). Ademáslas célulasfolicularesposeenen su membrana
una gran variedadde canalesy receptoresa neurotransmisores
y hormonasasociadosa
dichos canales.Graciasa las unionestipo "gap", que permiten el paso a través de
ellas de segundosmensajeros,la informaciónrecibidapor las célulasfolicularesva a
ser transmitidaal ovocito.
iii)ta, Teca: es una capade tejido conectivoque poseecolágeno,fibroblastos,
célulasmusculareslisas, vasossanguíneos
y fibras nerviosas.Ademásen su interior
puedenestar embebidascélulasgerminalesque no han iniciado su división meiótica
(2s7).
iu) Capaepitelial o tejido ovárico interno: cubriendotodaslas capasanteriores,
es una continuacióndel resto del epitelio ovárico que constituyeel lobulillo ovárico
(2s7).
[¿ existenciade estascapasenvolventesdel ovocito, en ocasionessuponeun
doble problema para el estudio de canalesiónicos en ovocitos, por una parte va a
dificultar la aplicaciónde algunastécnicasde registro electrofisiológicoy por otro
lado pueden "contaminar" con sus corrientes nativas aquellas originadas en la
membranadel ovocito. Por ello, (véaseen el apartadoII-3 de kíaterialesy Métodos)
se utilizan métodosenzimáticos(colagenasa)
o mec¿ínicos
u osmóticospara aislar el
ovocito del restode las capasenvolventes.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
143
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
ANndices
los canalesmediadospor ligandosestánespecializados
en mediar las nípidas
transmisionesen las sinapsis químicas. Estos canales se activan por un
químicoespecífico,como puedeser la acetilcolina,glutamato,glicina
neurotransmisor
o ácidoy-aminobutírico,siendolos activadospor acetilcolinalos mejor estudiados.
Existen dos tipos básicos de receptores de acetilcolina: Nicotínicos y
Muscarínicos.Ambos unen acetilcolina,pero los dos receptoresse puedendistinguir
farmacológicamentemediante el empleo de agonistas (fármacos que imitan las
accionesde la acetilcolina,p.e. nicotinao muscarina)que se unende forma exclusiva
a un tipo de receptor (258). Asimismo, los canalesnicotínicosse puedenclasificar
segúnsu localizaciónen: musculary neuronal.El tipo muscularse encuentraen la
placaneuromuscularde vertebradoso en el órganoeléctricode ciertospeces,mientras
que el neuronalse localiza en ganglios del sistemasimpáticoo parasimpáticoy en
varios tipos de neuronasdel cerebro.
Los receptoresnicotínicosde acetilcolinafueron los primerosen ser descritos
en términosmoleculares,solubilizadosa partir de sus membranas,purificadoshasta
casi homogeneidad
molecular(259, 260) y reconstituídosmediantela reinserciónde la
macromoléculapurificadaen membranaslipídicas(261). Tambiénfueronlos primeros
canalesen los que se determinólas secuencias
de aminoácidosy nucleótidos(262), y
en ser expresadosen célulasforáneasmedianteinyección de los ARNm en ovocitos
(186, 188). Finalmentefueron los primeros en los cualesse analizó su corriente
unitaria mediantela técnicade análisisde canalúnico (patch-clamp)(189).
El hecho de que el nAChR sea el receptorde membranamejor conocidose
debefundamentalmente
a dos factoresque han facilitadosu caracterizacíón:
i/ El nAChR se encuentraen abundanciaen las electroplacasde diversas
especiesde peceseléctricos (Tbrpedomarmorata, Tbrpdo californica, Electrophorus
electricus).
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lrÍ4
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Apénüces
ii) La presenciade cr-neurotoxinas
que resultanser
en venenosde serpientes,
ligandos muy específicosdel nAChR y que aportan un modo fácil de realizar
cuantitativas
determinaciones
medianteensayosde unióna equilibrio.
3.1. DESCRIPCION.
El receptor nicotínico de acetilcolinaes una glicoproteínatransmembrana
de
pesomolecularde 294 kD, compuestode cuatrodistintassubunidades
ensambladas
en
un pentiímeroheterólogoa2py6. Las cuatro cadenaspolipeptídicastienenunos pesos
molecularesaparentesde 40 kD (a), 48 kD (P), 58 kD (6) y 64 kD (6). Só1ola
subunidadct, une ACh con alta afinidad. Las cuatro subunidadesdel AChR estiín
glicosiladas,presentandorestosde manosa,galactosa,glucosa,n-acetilgalactosamina
y ácido n-acetilsi:ílicoen un total de sesentay cinco residuosde hidratosde carbono
por molécula de receptor (260). La inhibición de la glicosilación durante la
biosíntesis,asícomo la mutagénesis
dirigidadel Asn-141de la cadenaa, posiblesitio
de glicosilación, hacenque el AChR pierda su funcionalidad.I¿s cinco subunidades
del AChR se encuentranfosforiladasen distintasregiones,pero principalmenteen el
dominio intracitoplasmástico.
Hay un total de sietegruposfosfatoen la moléculadel
AChR (263).
Citoplasma
Figura 44: A) Estructuratridimensionaldel receptorde ACh, donde se mueshanlas 5 subunidades.B)
Imagenreconstruídade la seccióntranversala travésdel tubo. C) Imagena gran ampliacióndel nAChR,
mostrandosu posicióny tamariorespectoa la bicapalipídica.(Adaptadode Toyoshimay Unwin (264).
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145
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Aúndices
El nAChR poseedos sitiosde uniónparala ACh que puedenser ocupadospor
agonistas,antagonistas
y c{,-neurotoxinas.
los agonistasy antagonistas
se unen al
nAChR de forma reversible y
mutuamente excluyente, mientras que las
c¿-neurotoxinasse unen de forma prácticamenteirreversible (265). Mediante
experimentosde mutagénesisdirigida y marcajequímico se han determinadoque los
sitios de unión de ACh se encuentrancercade dos residuosde cisteínalocalizadosen
la región hidrofóbicade la subunidada expuestaal espacioextracelular(266).
Las reconstruccionesde las imágenes obtenidas mediante microscopía
electrónicaa una resoluciónde 1,7 nm por Toyoshimay Unwin (264) confirmaron
que el canal consta de un poro central cuyas paredesestaríanformadaspor las
distintas subunidadesdel receptor. El complejo canal-receptoresÍí dividido en 3
regiones:una gran región de entradaen la superficieexternade la membrana,una
región estrechatrartsmembrana
que puededeterminarla selectividadcatiónicay una
gran región de salidaen la superficiede la membranainterna.
Figura
45:
Cada una de las subunidades que configuran
el nAChR
contienen 4 fragmentos
transmembrana, Ml, M2, M3 y M4. (Adaptado de Kandel y Siegelbaum(267)).
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146
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Aúndics
Examinandola distribuciónde los aminoácidospolaresy no polares,se han
obtenidoirnportantespistassobrela unión de las distintassubunidades
en la bicapa
Lipídica.Cadauna de las cuatro subunidades
presentacuatro regioneshidrofóbicasde
20 aminoácidosdenominadasMl, M2, M3 y M4. Sus secuencias
aminoacídicas
sugierenque las subunidades
estánsimétricamenteunidasde tal forma que crean un
canal central. Numa y cols. (268) propusieronque cada una de las cuatro regiones
hidrofóbicasformabanuna hélice cr que atravesaraIa membrana.Posterioresanálisis
realizadospor Numa y Sakmann(269) índícaronque las paredesdel poro del canal
estánformadaspor las regionesM2 y los segmentosque conectanM2 con M3. Se
piensaque la selectividadcatiónicadel canalderiva de 3 anillosde carganegativaque
flanqueanla región M2. Un primer anillo, cerca de la boca interna, formado por
aminoácidosen la región citoplasmáticaque conectalos segmentosM1 y M2; un
anillo central formado por aminoácidosdentro del segmentotransmembrana
M2; un
terceranillo pertenecieiitea la caraexternade la membrana,formadopor aminoácidos
enlarcgión extracelularque conectalos segmentos
M2 y M3 (270).
3.2. ASPECTOSFt.]NCIONALES.
Cuando un potencial de acción actúasobre los terminalesnerviososde una
placa neuromuscular,libera ACh al espaciosinápticoa una concentraciónlocal de
0 , 1 - 1m M .
Para abrir el canal es necesariala unión de dos moléculasde ACh (27I), de
hecho, una moléculade ACh se debeunir a cadauna de las dos subunidades
cr para
que el canalseabra eftcazmente.Si bien la unión de los ligandosno es cooperativa,si
lo es la apertura del canal, como 1o indica el valor del coeficiente de Hill,
aproximadamenteigual a 2 (272). En cada subunidadcr se encuentraun lugar de
unión de agonistas,que uneACh con relativabajaafinidad(KD : 0,1-l mM) (273).
Ambos lugaresde unión no presentanpropiedadessimétricas,diferenciándose
en las
cinéticasde unión de agonistasQ7Q y antagonistas
(275). La presenciacontinuadade
agonistamodifica la consüante
de afinidadpara el mismo, disminuyendola Kp de 3 a
5 órdenesde magnirud(276).
La unión de ACh al receptorproducepequeñasrotacionesde las subunidades
en el dominio extracelularque disparaun cambioen la configuraciónde las hélicesa
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147
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Aúnüces
que constituyenel poro (217). La aperturaocurre en unos 2A ps (278) y está
provocadapor la unióncooperativade dos moléculasde ACh al receptor.La apertura
del canal es un fenómenoque parecerespondera la ley del todo o nada,con lo que
sólo se deberíanobservarestadosabiertoso cerrados.Sin embargose han observado
algunossubestados
de conductanciaQ4AD.La duraciónmediade aperturadependedel
potencial de membrana,de 1a temperaturay, sobre todo, del tipo de agonista
utilizado: 1 ms para carbamilcolina,2,4 ms paÍa acetilcolinay 5,6 ms para
suberildicolina.Las aperturasse ven interrumpidaspor cierres muy brevesde 50 ¡rs
que son transiciones
a estadosno conductivos(164). A travésdel canaltienelugar un
influjo neto de cargas positivas que despolartzala fibra muscular produciéndose
finalmentela contraccióndel músculo(162). La translocaciónde los cationeses un
fenómenopuramentepasivo:Na*, K* y algo de Caz* fluyena travésdel poro acuoso
de acuerdoa su gradientede potencialelectroquímico.Ia conducüancia
del canalen la
disoluciónde Ringer es de 40 pS, lo que, a un potencialde membranade -60 mV,
correspondea unos 1,45 x 104ionestransportados
por ms, asumiendoun potencialde
reversión de -2 mV. El cierre del canal es esponláneoy está producido por la
disociaciónde una de las dos (o las dos) moléculasde ACh. El neurotransmisorse
elimina por difusión o por la acciónde la acetilcoiinesrerasa
(266).
La presencia continua de agonistasinduce el fenómeno conocido como
desensibilización,que es un estadono conductordel nAChR dondeno hay respuesta
para los agonistas.El procesode desensibilización
se acompañapor un incrementode
la afinidad haciael ligando, probablemente
producidopor un cambioconformacional
receptor (desensibilización específica). Este fenómeno es reversible,
recuperándose
la actividad completadel receptorcuandose elimina el agonista.El
del
fenómenode la desensibilizaciónse observatanto en membranasnativasenriquecidas
en nAChR (279) como extraídode su ambientenativo (280), o si se expresamediante
ingenieríagenética,inyectandoen ovocitos los diferentesARNm de las subunidades
(281), indicandoque la desensibilizaciúnes una propiedadintrínsecadel AChR, así
como de otros receptoresde membranaactivadospor ligando, como el nAChR
neuronal, AChR muscarínico, receptoresde GABA, glutamato, etc. (282). El
significadofisiológico del estadodesensibilizado
es desconocido:seproponeque es un
mecanismodefensivode las célulaso tejidosfrentea una sobreexposición
del agonista
(283).
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I4¿t
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Apéndices
IV. PROPTEDADESDE LOS DETERGENTES UTILIZADOS.
En la siguiente tabla se resumen las propiedadesmás importantesde los
diversosdetergentes
empleados
en los estudiosde purificaciónde la P-gp:
Detergente
Tipo
CMC
(mM)
Mw
Número de
Agregación
CHAPS
zrvitteriónico
4
614.9
4-14
10
430.6
2-4.8
Estruchrra
*-1,,^.J,2.,-,-..[_o
Colato
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20-25
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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