Suplemento XXXIV - Sociedad Española de Inmunología

Inmunología
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COMITÉ DIRECTOR
J.M. Rojo (Madrid), Director Ejecutivo, Á. Corbí (Madrid), A. Ferreira (Santiago de Chile), M.
Fresno (Madrid), M. López-Botet (Barcelona), F. Lozano (Barcelona), I. Melero (Pamplona), A. Nieto
(Montevideo), F. Sánchez-Madrid (Madrid).
COMITÉ EDITORIAL
J. Alberola-Ila (Pasadena), P. Aparicio (Murcia), J. Aramburu (Barcelona), C. Ardavín (Madrid),
A. Arnaiz-Villena (Madrid), J.A. Brieva (Cádiz), E. Carosella (Paris), E. Cuadrado (San Sebastián),
M. de la Fuente (Madrid), M. del Val (Madrid), G. Dighiero (Paris), P. Engel (Barcelona), G. Ercilla
(Barcelona), E. Fernández-Cruz (Madrid), G. Fontán (Madrid), T. Gallart (Barcelona), F. GarcíaCozar (Cádiz), F. Garrido (Granada), M.L. Gaspar (Madrid), A. Gayá (Palma de Mallorca), C. Gelpí
(Barcelona), R.F. González-Amaro (México), Á. González (Vigo), D. Jaraquemada (Barcelona), C.
López-Larrea (Oviedo), M. López-Trascasa (Madrid), J. Madrenas (New London), A. Madrigal
(Londres), R.A. Margni (Buenos Aires), E. Martínez-Naves (Madrid), N. Matamoros (Palma de
Mallorca), F. Merino (Bilbao), F. Mollinedo (Salamanca), E. Osinaga (Montevideo), P. Patiño
(Medellín), J. Peña-Martínez (Córdoba), G. Rabinovich (Buenos Aires), J.R. Regueiro (Madrid), M.
Rincón (Burlington), J.L. Rodríguez-Sánchez (Barcelona), J. Sancho (Granada), M. Santamaría
(Córdoba), L. Santos-Argumedo (México), R. Solana (Córdoba), J.L. Subiza (Madrid), M.L. Toribio
(Madrid), C. Vilches (Madrid), R. Vilella (Barcelona), J. Yagüe (Barcelona).
SECRETARÍA EDITORIAL
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Telf: 91 636 29 30
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TARIFAS DE SUSCRIPCIONES
Miembro SEI:
Gratuitos
Médicos:
42,07 euros
MIR y Estudiantes:
30,05 euros
Organismos y empresas:
66,11 euros
Ejemplar suelto atrasado:
17 euros
Precio extranjero:
200 $
Incluida en las base de datos EMBASE,
Índice Médico Español e IBECS.
Maria Luisa del Pozo, Departamento de Inmunología, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC,
Ramiro de Maeztu, 9, E-28040 Madrid, España. Tel: +34 91 837 3112; Fax: +34 91 536 0432;
E-mail: [email protected]
SECRETARÍA DE REDACCIÓN
Maria Rosa Sarrias i Fornés
Inmunología
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SUMARIO
PROGRAMA CIENTÍFICO . . . . . . . . . . . . . . . . 6
COMUNICACIONES ORALES . . . . . . . . . . . 15
Vol. 27, Supl. 1, Mayo 2008
Sesión 7: Inmunologia tumoral - II . . . . . . . . . 37
Moderadores: Federico Garrido,
Luis Álvarez Vallina
Sesión 1: Autoinmunidad - I . . . . . . . . . . . . . . . 15
Sesión 8: Inmunidad e infección . . . . . . . . . . . 40
Moderadores: Joana Ferrer, Julia Sequí
Moderadores: Francisco Lozano, Margarita Bofill
Sesión 2: Inmunogenética . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Sesión 9: Células dendríticas . . . . . . . . . . . . . . 43
Moderadores: Estela Paz Artal, Jordi Yagüe
Moderadores: Ángel Corbí, Francisco Borrás
Sesión 3: Inmunología y trasplante . . . . . . . . . 21
Sesión 10: Células T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Moderadores: Joan Milá, Alfredo Minguela
Moderadores: Manel Juan, Mª Luisa Toribio
Sesión 4: Inmunología tumoral - I . . . . . . . . . 25
Moderadores: Francisco Ruiz-Cabello,
Ignacio Melero
Sesión 5: Inmunodeficiencias: alergia y
complemento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Moderadores: Margarita López-Trascasa,
Núria Matamoros
Sesión 11: Autoinmunidad - II . . . . . . . . . . . . . 48
Moderadores: Carmen Gelpí, Mª Rosa Julià
POSTERS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Sesión 1: Autoinmunidad - I . . . . . . . . . . . . . . . 55
Moderadores: Joana Ferrer, Júlia Sequí
Sesión 6: Células B y NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Moderadores: África González,
Miguel López-Botet
Sesión 2: Inmunogenética . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Moderadores: Estela Paz Artal, Jordi Yagüe
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SUMARIO
Sesión 3: Inmunología y trasplante . . . . . . . . . 66
Moderadores: Joan Milá, Alfredo Minguela
Sesión 4: Inmunología tumoral - I . . . . . . . . . 72
Moderadores: Francisco Ruiz-Cabello,
Ignacio Melero
Vol. 27, Supl. 1, Mayo 2008
Sesión 8: Inmunidad e infección . . . . . . . . . . . 96
Moderadores: Francisco Lozano, Margarita Bofill
Sesión 9: Células dendríticas . . . . . . . . . . . . . 104
Moderadores: Ángel Corbí, Francisco Borrás
Sesión 10: Células T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Sesión 5: Inmunodeficiencias: alergia y
complemento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Moderadores: Núria Matamoros,
Margarita López-Trascasa
Sesión 6: Células B y NK . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Moderadores: África González, Miguel López-Botet
Sesión 7: Inmunología tumoral - II . . . . . . . . . 90
Moderadores: Luis Álvarez Vallina,
Federico Garrido
Moderadores: Manel Juan, Mª Luisa Toribio
Sesión 11: Autoinmunidad - II . . . . . . . . . . . . 114
Moderadores: Mª Rosa Julià, Carmen Gelpí
Índice de Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Inmunología
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PROGRAMA CIENTÍFICO
MIÉRCOLES, 21 DE MAYO
10.00-14.00
ENTREGA DE DOCUMENTACIÓN
COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala Termas)
1. Autoinmunidad I
2. Inmunogenética
13.00-14.00
REUNIÓN DE LA JUNTA DIRECTIVA
15.00-16.15
TALLER DE INMUNOQUÍMICA (Sala Ramón Llull)
Coordinadores: Cándido Juárez, Hospital Sant Pau (Barcelona). Juan José Rodríguez Molina,
Hospital G. Universitario Gregorio Marañón (Madrid). Julia Sequi Navarro, Hospital Carlos
III (Madrid). Luisa Mª Villar, Hospital Ramón y Cajal (Madrid)
16.15-17.30
TALLER DE AUTOINMUNIDAD (Sala Luis de Molina A)
Coordinadores: Rita Álvarez, Hospital Universitario La Paz (Madrid). Marcos López Hoyos,
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander)
17.30-19.00
SIMPOSIUM DIASORIN: ENFERMEDAD CELÍACA (Sala Magna)
Inmunopatogenia de la enfermedad celíaca
Eduardo Arranz, Universidad de Valladolid, Presidente de la Sociedad Española
de Enfermedad Celíaca.
La detección de la enfermedad celíaca, una labor multidisciplinar
Carme Farré, Hospital Sant Joan de Deu (Barcelona)
19.00-20.00
CONFERENCIA INAUGURAL (Sala Magna)
Complexity and complementarity of cellular and humoral innate immunity
Alberto Mantovani. Instituto Clinico Humanitas (Milán)
20.00
BIENVENIDA E INAUGURACIÓN OFICIAL (Sala Magna)
Cóctel de bienvenida
JUEVES, 22 DE MAYO
08.30-10.00
COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala Termas)
1. Autoinmunidad I
2. Inmunogenética
PROGRAMA CIENTÍFICO
09.00-11.00
SIMPOSIUM PLENARIO: INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (Sala Magna)
Patrocinador: BAXTER
Emilio Gómez de la Concha. Hospital Clínico San Carlos (Madrid)
Common Variable Immunodeficiency-genetic dissection of a complex disorder
Ulric Salzer. University Hospital Friburgo
Síndromes de hiper-IgM
Mari Cruz García. Hospital Universitario la Paz (Madrid)
Mecanismos etiopatogénicos de un nuevo grupo de inmunodeficiencias primarias.
Enfermedades autoinflamatorias sistémicas
Jordi Yagüe. Hospital Clínico (Barcelona)
Up to date: REDIP: Registro Español de inmunodeficiencias primarias
Natalia Martínez Pomar. Hospital Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca)
11.00-12.00
CAFÉ Y VISITA A PÓSTERS
1. Autoinmunidad I
2. Inmunogenética
12.00-13.30
COMUNICACIONES ORALES 1. AUTOINMUNIDAD I (Sala Luis de Molina A)
Moderadores: Joana Ferrer (Palma de Mallorca). Julia Sequi (Madrid)
COMUNICACIONES ORALES 2. INMUNOGENÉTICA (Sala Ramon Llull)
Moderadores: Estela Paz Artal (Madrid). Jordi Yagüe (Barcelona)
TALLER HLA (Sala Luis de Molina B)
Coordinadores: Mª Rosario De Pablo y Carlos Vilches, Hospital Puerta de Hierro (Madrid).
José Luis Vicario, Centro Regional de Transfusiones (Madrid)
SIMPOSIUM BECTON DICKINSON (Sala Magna)
¿ALGO MÁS EN HIV?
Actualización en los aspectos patogénicos de la infección por HIV
Rosa García Delgado, Servicio de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz (Madrid)
Vacunas terapéuticas en HIV. Perspectivas actuales y futuras
Montse Plana. Grupo de Investigación de Enfermedades Infecciosas. Hospital Clínic/ IDIBAPS
(Barcelona)
INMUNIDAD Y ADHESIÓN
Dianas y Terapias anti-adhesión en enfermedades autoinmunes y neurodegenerativas
Francisco Sánchez Madrid, Servicio de Inmunología. Hospital La Princesa (Madrid)
13.30-15.00
ALMUERZO DE TRABAJO
15.00-16.30
SIMPOSIUM PLENARIO CONJUNTO: INMUNIDAD INNATA (1ª PARTE) (Sala Magna)
Società Italiana Immunologia, Immunologia Clinica e Allergologia y Sociedad Española de
Inmunología.
Moderadores: Miguel López-Botet, IMIM-Hospital del Mar (Barcelona). Francisco Lozano,
Hospital Clínic (Barcelona)
Epithelial cell-dendritic cell cross-talk in bacterial handling
María Rescigno. Department of Experimental Oncology. European Institute of Oncology (Milan)
Gene expression profiling on human macrophages: identification of LSECtin as a novel
pathogen-attachement factor in alternatively activated macrophages
Angel Corbí. Centro de Investigaciones Biológicas. CSIC (Madrid)
Advances in neutrophil-derived cytokines
Marco Cassatella, Department of Pathology. University of Verona (Italy)
16.30-17.00
CAFÉ Y VISITA A PÓSTERS
PROGRAMA CIENTÍFICO
17.00 -19.00
SIMPOSIUM PLENARIO CONJUNTO: INMUNIDAD INNATA (2ª PARTE) (Sala Magna)
Società Italiana Immunologia, Immunologia clinica e Allergologia y Sociedad Española de
Inmunología
NK cells at the interface between innate and adaptative immunity
Alessandro Moretta, Molecular Immunology Laboratories. University of Genova (Italy)
Negative regulation of macrophage activation
Lisardo Boscá. Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (Madrid)
Matricellular protein SPARC at the interface of macrophage-tumor cell interaction
Mario Colombo. Fondazione IRCCS. Istituto Nazionale Tumori (Italy)
19.00
ACTIVIDAD LÚDICO-CULTURAL
Visita guiada a la Catedral de Palma de Mallorca.
VIERNES, 23 DE MAYO
08.30-10.00
COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala Termas)
3. Inmunología y trasplante
4. Inmunología tumoral I
5. Inmunodeficiencias, alergia y complemento
6. Células B y NK
7. Inmunología tumoral II
12.00-13.30
15.00-17.00
VOTACIONES SEI
09.00-11.00
SIMPOSIUM PLENARIO: HOMENAJE AL PROFESOR JEAN DAUSSET (Sala Magna)
Moderadora: Rocío Álvarez. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia)
Jean Dausset. Un visionario del siglo XX
Edgardo Carosella, Hospital Saint Louis (Paris)
La serología HLA como fundamento del trasplante
Guadalupe Ercilla. Hospital Clínic (Barcelona)
Papel de los sistemas menores de histocompatibilidad en los trasplantes de órganos sólidos
Antonio Núñez. Hospital Virgen del Rocío (Sevilla)
De la supresión de la respuesta alogénica in vitro al estudio del proceso de tolerancia
en trasplantes
Rocío Alvarez. Hospital Virgen de la Arrixaca (Murcia)
Functional characterization of killer cell Ig-like receptors expressed by normal and
malignant human CD4+ T lymphocytes
Armand Bensussan. Directeur de Département. INSERM U841. Faculté de Médecine de Créteil.
Président de la Société Française d’Immunologie (París)
09.00-10.30
SIMPOSIUM IZASA (Sala Luis de Molina A)
La tecnología de los tetrámeros de CMH: herramientas para el estudio de la respuesta T
específica
Félix A. Montero-Julian. Directeur du Departement Analyse Cellulaire. Beckman Coulter
Immunotech (Marseille)
Flow Cytometric Analysis of Signal Transduction Pathways
T. Vincent Shankey. Advanced Technology Center. Beckman Coulter, Inc. (Miami)
Células Madre Hematopoyéticas: algo más que hematopoyesis
José Carlos Segovia Sanz. Jefe de la Unidad de Diferenciación y Citometría.
División de Hematopoyesis. CIEMAT (Madrid)
PROGRAMA CIENTÍFICO
11.00-12.00
CAFÉ Y VISITA PÓSTERS (Sala Termas)
3. Inmunología y trasplante
4. Inmunología tumoral I
5. Inmunodeficiencias, alergia y complemento
11.15-12.00
SIMPOSIUM ANÁLISIS Y GENÉTICA (Sala Ramon Llull)
Designers antigens as diagnostic targets for autoantibody determination
W. Schlumberguer. Member of Board of Directors. Division Immunobiochemical Diagnostics.
Euroimmun (Lübeck)
12.00-13.30
COMUNICACIONES ORALES 3. INMUNOLOGÍA Y TRASPLANTE (Sala Luis de Molina B)
Moderadores: Joan Milà (Palma de Mallorca). A. Minguela (Murcia)
COMUNICACIONES ORALES 4. INMUNOLOGÍA TUMORAL I (Sala Ramon Llull)
Moderadores: I. Melero (Navarra). Francisco Ruiz-Cabello (Granada)
COMUNICACIONES ORALES 5. INMUNODEFICIENCIAS, ALERGIA Y COMPLEMENTO
(Sala Luis de Molina A)
Moderadores: Margarita López Trascasa (Madrid). Núria Matamoros (Palma de Mallorca)
MESA REDONDA: PROTOCOLOS CLÍNICOS EN AUTOINMUNIDAD
Consenso europeo. Experiencias españolas (Sala Magna)
Moderadora: María Rosa Julià (Palma de Mallorca)
Comités de enfermedades autoinmunes en los hospitales: una utopía que puede ser realidad
Lucio Pallarés, Servicio Medicina Interna. Hospital Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca)
Grupo de trabajo en autoinmunidad: Propuestas y posibilidades
Aresio Plaza. Servicio Inmunología. Hospital Puerta de Hierro (Madrid)
Protocolos clínicos en autoinmunidad: nuestra experiencia
Mª Rosa Julià. Servicio Inmunología. Hospital Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca)
13.30- 15.00
ALMUERZO DE TRABAJO
15.00-16.30
COMUNICACIONES ORALES 6. CÉLULAS B Y NK (Sala Luis de Molina B)
Moderadores: África González (Vigo), Miguel López-Botet (Barcelona)
COMUNICACIONES ORALES 7. INMUNOLOGÍA TUMORAL II (Sala Ramon Llull)
Moderadores: Luis Álvarez-Vallina (Madrid), Federico Garrido (Granada)
SIMPOSIUM MENARINI: INMUNOLOGÍA OCULAR (Sala Magna)
Moderadores: José Mª García Ruiz de Morales (León).
Autoimmunity in the eye: pathogenic and regulatory T cells
Rachel Caspi. Laboratory Immunology. NEI. NIH (Bethesda)
Protocolos clínicos en uveitis
José Luis Olea. Servicio Oftalmología. Hospital. Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca)
Uveitis autoinmune: avances en el diagnóstico e inmunoterapia
José Mª García Ruiz de Morales. Servicio Inmunología Hospital de León / Laboratory Immunology.
NEI. NIH (Bethesda)
TALLER DE CITOMETRÍA (Sala Luis de Molina A)
Coordinadores: Natalia Maruri, Hospital de Cruces (Bilbao). Francisco Ruiz-Cabello (Granada)
16.30-17.00
CAFÉ Y VISITA A PÓSTERS
17.00-18.30
ASAMBLEA DE LA SEI (Sala Magna)
21.00
CENA DE CLAUSURA
Autobuses hoteles
PROGRAMA CIENTÍFICO
SÁBADO, 24 DE MAYO
08.30-10.00
COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala Termas)
8. Inmunidad e infección
9. Células dendríticas
10. Células T
11. Autoinmunidad II
09.00-10.30
COMUNICACIONES ORALES 8. INMUNIDAD E INFECCIÓN (Sala Luis de Molina A)
Moderadores: Margarita Bofill (Barcelona). Francisco Lozano (Barcelona)
COMUNICACIONES ORALES 9. CÉLULAS DENDRÍTICAS (Sala Ramon Llull)
Moderadores: Francisco Borrás (Barcelona). Angel Corbí (Madrid)
COMUNICACIONES ORALES 10. CÉLULAS T (Sala Luis de Molina B)
Moderadores: Manel Juan (Barcelona). Mª Luisa Toribio (Madrid)
COMUNICACIONES ORALES 11. AUTOINMUNIDAD II (Sala Magna)
Moderadores: Carmen Gelpí (Barcelona). Mª Rosa Julià (Palma de Mallorca)
10.30-11.45
MESA REDONDA: PRESENTE Y FUTURO DE LA INMUNOLOGÍA (Sala Magna)
Moderadores: Eduardo Fernández-Cruz. Presidente de la Comisión Nacional de Inmunología.
Miguel López-Botet. Presidente de la Sociedad Española de Inmunología
Inmunología en los Hospitales: situación actual y nuevos modelos
Margarita López-Trascasa. Vocal de la Junta Directiva de la Sociedad Española de Inmunología
Formación Especializada: Mapa de Unidades docentes y Plan de futuro
María José Herrero. Representante de la Sociedad Española de Inmunología en la Comisión
Nacional de Inmunología
La Troncalidad en las Especialidades de Laboratorio
Adolfo Campos. Vicepresidente de la Comisión Nacional de Inmunología
11.45-12.15
CAFÉ Y VISITA A POSTERS (Sala Termas)
8. Inmunidad e infección
9. Células dendríticas
10. Células T
11. Autoinmunidad II
12.15-13.15
CONFERENCIA DE CLAUSURA (Sala Magna)
State of the art: class switch recombination and DNA repair activity
Q. Pan-Hammarstrom. Karolinska Institute (Estocolmo)
13.15
PRESENTACIÓN DE LOS PRÓXIMOS CONGRESOS (Sala Magna)
CÓCTEL DE DESPEDIDA
Comunicaciones Orales
Inmunología
Vol. 27 / Supl. 1/ Mayo 2008: 15-53
SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD - I
Moderadores: Dra. Joana Ferrer (Palma de Mallorca),
Julia Sequí (Madrid)
TLRs EN EL SISTEMA INMUNE INTESTINAL. De Andrés A, Marín
N, Mirete S, Camarero C, Roy G. Hospital Ramón y Cajal de Madrid.
En la enteropatía celíaca (EC) tiene lugar una respuesta inmune
innata a nivel del epitelio intestinal, cuyo estímulo y mecanismos patogénicos son prácticamente desconocidos.
Dentro de los receptores del sistema inmune innato intestinal, se
hallan los PRRs (pattern recognition receptors), amplios sensores de
componentes microbianos filogenéticamente conservados. Actualmente se especula que una disfunción de los toll-like receptors (TLRs) reconoce a los péptidos del gluten como “no propios/tóxicos”, generando
una respuesta inflamatoria inicial innata. Ningún estudio ha examinado el papel de los TLRs y de sus ligandos específicos en el fenotipo de
la EC.
Objetivo. Analizar la expresión de los TLRs, tanto en el epitelio
como en las distintas subpoblaciones de linfocitos intraepiteliales (LIEs),
en mucosa intestinal control, para conocer los niveles de expresión normales, o en celíacos, con objeto de definir un estadío inicial en la patogenia de la enfermedad celíaca.
Metodología. Se han analizado un total de 34 biopsias de duodeno: 14 celíacos activos y 19 controles. Expresión y cuantificación por
citometría de flujo, de los TLR2 y TLR4 en superficie y de los TLR3 y
TLR9 intracelulares, en los distintos subtipos celulares.
Resultados
Celíacos activos (n = 14)
TLR2
TLR4
TLR3
TLR9
No celíacos (n = 19)
LIEs
Media ± ES
Epitelio
Media ± ES
LIEs
Media ± ES
Epitelio
Media ± ES
13 ± 1.5
34.5 ± 5.1
66 ± 9.1
61.4 ± 6.1
1.5 ± 0.5
22 ± 3.9
51.8 ± 6.1
48.4 ± 5.5
11.3 ± 2.3
29.5 ± 2.5
56.7 ± 8
45.6 ± 7.1
1.5 ± 0.5
16.8 ± 2.7
70.2 ± 3.4
48.3 ± 4.0
Conclusiones: No parece que una diferencia en la expresión de
los sensores TLRs analizados esté implicada en el inicio de una respuesta inflamatoria innata en el compartimento epitelial del intestino.
PERFIL DE LINFOCITOS INTRAEPITELIALES EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD CELIACA. Sánchez M, Gutierrez EI,
Toca M, Gonzalo Ocejo-Vinyals J, Leyva-Cobián F, López-Hoyos M.
Servicio de Inmunología, Hospital Universitario “Marqués de Valdecilla”, Servicio Cántabro de Salud. Santander.
Introducción. La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatía crónica mediada por el sistema inmunitario caracterizada por alteracio-
nes histológicas en la mucosa intestinal, principalmente atrofia vellositaria y aumento de linfocitos intraepiteliales (LIEs).
Objetivo. Estudio del perfil de LIEs en pacientes con sospecha clínica de EC en nuestro medio.
Métodos. De 97 biopsias remitidas de junio del 2006 a febrero del
2008 para el estudio del linfograma por citometria, seleccionamos 70
con datos valorables, para realizar una revisión prospectiva de las historias clínicas de los sujetos (40 mujeres, 25 hombres).
Resultados. EC activa: 66%, EC. Silente: 6%, EC potencial: 15%,
EC latente: 1% .
EC activa
Clínica
Distensión abdominal
Diarrea
Retraso del crecimiento
Anemia
Hipertransaminemia
Trombocitosis
Frecuencia
78%
72%
59%
54%
50%
46%
Biopsia
Atrofia total
Atrofia subtotal
Atrofia parcial
Cambios mínimos
Frecuencia
9%
67%
20%
2%
Marcadores serológicos y genéticos (HLA-II)
Ac antigliadina +
Ac antitransglutaminasa +
DQ2
DQ8
Frecuencia
79%
88%
90%
7%
Linfograma
1.LIEs totales ≥ 10%
2.LIEs γ δ ≥ 10%
3.LIEs CD3- ≤ 10%
1+2+3
Porcentaje de pacientes
92%
89%
60%
54%
LIEs en pacientes ≤ 3 años
LIE totales
LIE Á‰
LIE CD3-
Xm ± DE %
27 ± 14%
29 ± 15%
13 ± 8%
LIEs en pacientes > 3 años
LIE totales
LIE γ δ
LIE CD3-
Xm ± DE %
22 ± 13%
29 ± 19%
10 ± 5%
EC silente. Hipertransaminemia 75%.
Marcadores serológicos Ac antigliadina +: 33% Ac antitransglutaminasa + 75%.
Linfograma, 1+2+3: 100%.
EC latente y potencial. 1+2+3: 20%.
Conclusiones. En la población estudiada el perfil: LIEs totales
≥10% - LIEs γδ LIE ≥ 10% -LIEs CD3- ≤ 10% constituye un marcador
útil tanto para el diagnostico de la EC activa como silente. En este último caso, podría ser el mejor marcador de esta forma de presentación.
15
COMUNICACIONES ORALES
Para la EC latente y potencial, el infiltrado linfocitario suele ser < 10%
pero los LIEs γδ se mantienen elevados y los LIE CD3- disminuidos.
PAPEL DEL GEN PXR EN ENFERMEDAD INFLAMATORIA
INTESTINAL. Márquez Ortiz AM1, Martínez Doncel A1, Mendoza JL2,
Taxonera C2, Fernández-Arquero M1, Díaz-Rubio M2, Gómez de la Concha E1, Urcelay E1. 1Servicio de Inmunología Clínica, Hospital Clínico San
Carlos. 2Servicio de Gastroenterología, Hospital Clínico San Carlos.
Recientemente, se ha descrito una asociación del gen del receptor
de pregnano (PXR/NR1I2) con la susceptibilidad a padecer enfermedad inflamatoria intestinal (EII). PXR es un receptor nuclear que regula genes involucrados en procesos de detoxificación, entre ellos MDR1.
Nuestro objetivo es investigar el impacto de este locus en la predisposición a padecer EII en población española.
Para el estudio caso-control se utilizaron 365 enfermos de CU, 331
pacientes de EC y 550 controles. Se analizaron mediante sondas TaqMan tres polimorfismos en el gen PXR así como los seis haplotipos
conformados por ellos. Incluimos el marcador -25385C/T (rs3814055)
por ser el más fuertemente correlacionado con la enfermedad en el
estudio inicial y otros dos polimorfismos (rs6784598 y rs2276707) con
el fin de cubrir toda la variabilidad.
Al comparar las frecuencias genotípicas y alélicas entre enfermos y controles no encontramos diferencias significativas. Sin embargo, al estratificar los enfermos de colitis por extensión observamos que
el alelo -25385T era más frecuente en pacientes con la forma extensa
que en los pacientes con colitis izquierda (p=0.049), y que en los controles (p=0.009). Este efecto se debe principalmente al haplotipo de
riesgo TCC significativamente aumentado en colitis extensa con respecto a colitis izquierda [p=0.032; odds ratio (95% IC)=1.51 (1.02-2.24)]
y controles [p=0.001; odds ratio (95% IC)= 1.66 (1.20-2.30)].
Posteriormente, analizamos la posible interacción entre los genes
PXR y MDR1 encontrando que un polimorfismo del gen MDR1
(rs3789243), localizado en el intrón 3 y previamente asociado a colitis
ulcerosa, presentaba una distribución genotípica significativamente diferente al comparar portadores y no portadores del alelo de riesgo -25385T
(p=0.005). Nuestro estudio confirma la asociación del gen PXR con la
enfermedad inflamatoria intestinal, concretamente con colitis extensa,
y encontramos evidencias de interacción entre este gen y MDR1.
ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO DEL GEN MBL2 EN ENFERMEDAD DE CROHN. Rodríguez Gutiérrez JF1, Rodríguez Bayona B1,
Piñero A2, Rodríguez C1, Correro F2, Brieva JA1, Nieto A1. 1Hospital Puerta del Mar. 2Servicio de Digestivo, Hospital Puerta del Mar.
Introducción. Genes de la inmunidad innata intervienen en la susceptibilidad y forma de presentación de la enfermedad de Crohn (EC).
La lectina de unión a manosa (MBL) codificada por el gen MBL2 es un
importante componente de la inmunidad innata que se une a un amplio
rango de microorganismos y activa complemento por la vía de las lectinas. Los niveles séricos de MBL y su actividad funcional están parcialmente regulados por variaciones genéticas, las cuales se han asociado a otros procesos relacionados como la enf. de Beçhet.
Objetivo. Analizar la posible influencia del polimorfismo en la
región 5’ del gen MBL2 en la forma de presentación de EC.
Pacientes y Métodos. Se han determinado en 120 pacientes los
siguientes SNPs: -550 H/L y -221 Y/X en la región promotora; +4 P/Q
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VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
en la región 5'UTR y tres variantes en los codones 52, 54 y 57 (exón 1)
conocidas como alelos D, B y C, respectivamente, mediante PCR-SSO
inversa (Innogenetics). A todos los pacientes se les realizó además determinación de acs anti-S cerevisiae (ASCA) mediante técnica de ELISA
(Aeskulisa) El análisis estadístico se realizó mediante los programas
SPSS (v.11.0) y EpiInfo (v.6.0); se analizaron tanto los SNPs como los
haplotipos comunes en los que éstos se organizan.
Resultados. Las características clínicas estudiadas fueron sexo,
tabaquismo, edad al dco, localización, patrón evolutivo, manifestaciones extradigestivas, necesidad de cirugía, tratamiento con inmunosupresores y presencia de ASCA. En el análisis por SNPs se ha
observado una mayor tendencia a desarrollar un patrón fistulizante (B3 de clasif. de Viena) en los pacientes portadores del alelo 550L
(p=0.027; OR=4.97, IC95% 1.02-47.31). Asimismo, dicho alelo se asocia con una mayor necesidad de cirugía (p=0.009; OR=9.97, IC95%
1.38-432). En el análisis por haplotipos encontramos que en portadores del haplotipo secretor HYPA la enfermedad se limita al colon (L2
de clasif. de Viena) con menor frecuencia (p=0.02; OR=0.31, IC95%
0.08-0.99).
Conclusión. El polimorfismo en el gen MBL2 puede influenciar
la forma de presentación de la EC.
GENES IL12B E IL23R: ANÁLISIS DE SUSCEPTIBILIDAD E INTERACCIÓN EN ARTRITIS REUMATOIDE. Varadé López J1, Perdigones
N1, Fernándes-Arquero M1, Jover JA2, Gómez de la Concha E1, MartínezDoncel A1, Fernández Gutiérrez B2, Urcelay E1. 1Inmunología Clínica Hospital Clínico San Carlos. 2Reumatología Hospital Clínico San Carlos.
La artritis reumatoide (AR) es una patología de genética compleja que afecta aproximadamente al 1% de la población. Se ha postulado que existen genes comunes a distintas enfermedades autoinmunes.
Recientemente se han descrito polimorfismos de un solo nucleótido
(SNP) en los genes IL12B e IL23R asociados a la enfermedad de Crohn.
La IL23 es un heterodímero compuesto por las cadenas p19 y p40, codificadas por IL23 e IL12B respectivamente; su receptor es también un
heterodímero compuesto por los productos de dos genes diferentes
IL23R e IL12RB. Nuestro objetivo es dilucidar si dichos polimorfismos
de IL12B e IL23R están asociados al desarrollo de AR, tanto de forma
individual como combinada.
Analizamos 550 pacientes de AR y 546 individuos control. Todos
ellos se genotiparon para 4 SNPs con sondas TaqMan. Dos SNPs están
localizados en el gen IL2B (rs688765 y rs3212227) y los otros dos en el
gen IL23R (rs7517847 y rs11209026). Las frecuencias genotípicas y alélicas de los cuatro SNPs se compararon por el test de c2 o el test exacto de Fisher. La Odds ratio (OR) y los valores de p se calcularon con el
paquete estadístico Epi Info v. 6.02.
Los alelos minoritarios de los dos polimorfismos de IL23R son más
frecuentes en AR que en controles (rs7517847, p=0.019; rs11209026, p=
0.026), contrariamente a los descrito en Crohn. Por el contrario no encontramos ninguna asociación de los dos polimorfismos IL12B con AR.
También observamos una interacción entre los marcadores
rs7517847 (IL23R) y el rs3212227 (IL12B) [GG/CC vs
(TT+TG)/(AA+AC) p=0.004]. Esto se ve reflejado en que un 13% de
los enfermos rs7517847-GG son a su vez rs312227-CC siendo la frecuencia de este último genotipo en controles del 5%, lo que supone un
incremento del 8% (p=0.006).
Nuestros datos sugieren que los alelos minoritarios de los polimorfismos estudiados en IL23R (rs7517847 y rs11209026) incrementan
INMUNOLOGÍA
la susceptibilidad a AR. También apuntan a la existencia de una interacción entre los genes IL12B e IL23R.
INTERACCIONES GENÉTICAS: MIF COMO FACTOR DE SUSCEPTIBILIDAD EN ENFERMOS DE ARTRTITIS REUMATOIDE.
Perdigones Borderías MN1, Varadñe J1, Núñez C1, Fernández-Gutiérrez
B2, Jover JA2, Urcelay E1, Martínez A1. 1Unidad de Inmunología Clínica,
Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Departamento de Reumatología, Hospital Clínico San Carlos, Madrid.
La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crónica e inflamatoria de etiología desconocida que afecta al 1% de la población mundial.
El carácter poligénico de esta inmunopatía ha suscitado en el último año
varios estudios de asociación genómica (GWA, genome wide association).
Mientras, investigaciones en otros ámbitos como son las interacciones
intergénicas o genético-ambientales se encuentran aún en sus comienzos.
En este trabajo analizamos polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)
potencialmente implicados en enfermedades inflamatorias, en busca de
interacciones genéticas involucradas en la susceptibilidad a AR.
Se genotiparon 45 SNPs correspondientes a 17 regiones cromosómicas en 528 pacientes con AR y 518 controles sanos españoles. Para
detectar interacciones genéticas evaluamos el desequilibrio de ligamiento (LD) entre loci no ligados con el programa Haploview©.
Se observaron tres interacciones estadísticamente significativas (p
MIF se perfila como un potente factor de susceptibilidad en un
determinado grupo de enfermos de AR. Este hecho implica que el efecto de protección o susceptibilidad de una mutación depende del contexto o “background” genético de cada individuo.
MAPEO DE LA REGIÓN 3 ' UTR DEL GEN CTLA4 EN ARTRITIS
REUMATOIDE Y LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO. Escalera
A1, Torres B1, García-Lozano JR1, Abad C1, Fernández O1, Orozco G2,
Sánchez E2, Núñez-Roldán A1, Martín J2, González-Escribano MF1.
1Servicio de Inmunología. HU Virgen del Rocío. Sevilla. 2Instituto de Parasitología y Biomedicina "Lopez Neyra". Granada.
Introducción. La respuesta inmunológica mediada por células T
está regulada por una serie de moléculas coestimuladoras y coinhibidoras que intervienen en la sinapsis inmunológica. Entre los coinhibidores de la respuesta T se encuentra la molécula de CTLA4. El gen
CTLA4 es un candidato para determinar la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y aunque no se ha determinado completamente
la región del gen responsable de la asociación, estudios anteriores de
nuestro grupo y otros la han situado en la región 3' UTR del mismo.
Objetivo. Acotar la región de susceptibilidad encontrada en la
región 3' UTR del gen CTLA4 en artritis reumatoide (RA) y lupus eritematoso sistémico (SLE).
Material y métodos. Se incluyeron 455 pacientes con RA y 459 con
SLE que cumplían los criterios de la ACR para ambas enfermedades.
El grupo control incluía 463 donantes voluntarios de médula ósea. Se
genotiparon 12 SNPs localizados en la región 3' UTR del gen CTLA4
que abarcaban una región de 86.367 bp. El genotipado se realizó utilizando sondas Taqman. Para el cálculo de haplotipos se utilizó el programa Haploview. La comparación de la distribución de frecuencias
genotípicas, alélicas y haplotípicas se realizó mediante ?2.
Resultados. Se analizaron 11 de los 12 SNPs incluidos en un principio, ya que uno de ellos resultó no polimórfico. Estos 11 SNPs pre-
COMUNICACIONES ORALES
sentaban una distribución de frecuencias del alelo minoritario que oscilaba entre el 14 y el 49% en controles. Varios SNPs resultaron asociados en una o ambas patologías. Se detectó un haplotipo asociado con
ambas patologías con frecuencias del 24.7% en RA, 28.2% en SLE y
18.4% en controles (OR 1.45, 95%CI 1.15-1.83 para RA y OR 1.74, 95%
CI 1.38-2.20 para SLE). La región de asociación se localiza en las primeras 33 Kb rastreadas y se detectó un SNP marcador que sólo se
encuentra en el haplotipo de riesgo.
Conclusión. El presente estudio confirma asociación entre la región
3' UTR del gen CTLA y la susceptibilidad a padecer RA y SLE.
MAPEO DEL GEN TIM1 EN ARTRITIS REUMATOIDE Y LUPUS
ERITEMATOSO SISTÉMICO. Abad C1, Torres B1, García-Lozano JR1,
Escalera A1, Fernández O1, Sánchez E2, Orozco G2, Núñez-Roldán A1,
Martín J2, González-Escribano MF1. 1Servicio de Inmunología. HU Virgen del Rocío. Sevilla. 2Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra". Granada.
Introducción. La respuesta inmunológica mediada por células T
está regulada por una serie de moléculas coestimuladoras y coinhibidoras que intervienen en la sinapsis inmunológica. TIM1 es una molécula coestimuladora que influencia la diferenciación de las células T y
la activación dependiente de TCR y puede estar involucrada en diferentes fases del desarrollo de las enfermedades autoinmunes.
Objetivo. Mapear el gen TIM1 para determinar la existencia de
posibles regiones de susceptibilidad en artritis reumatoide (RA) y lupus
eritematoso sistémico (SLE).
Material y métodos. Se incluyeron 289 pacientes con RA y 398
con SLE que cumplían los criterios de la ACR para ambas enfermedades. El grupo control incluía 371 donantes voluntarios de médula ósea. Se genotiparon 6 SNPs que abarcaban una región de 22.000
bp. El genotipado se realizó utilizando sondas Taqman. La comparación de la distribución de frecuencias genotípicas y alélicas se realizó mediante ?2.
Resultados. Los 6 SNPs incluidos resultaron polimórficos con una
distribución de frecuencias del alelo minoritario que oscilaba entre el
2 y el 37% en controles. Se detectó un SNP (A/T) asociado a ambas
patologías, si bien, el sentido de la asociación sería contrario en RA y
SLE. En RA la asociación se ajustaría a un modelo recesivo, en el que
los homocigotos AA fueron mas frecuentes en RA (14.9%) que en SLE
(5.6%) y controles (9.2%, p=0.02, OR=1.73 95%CI 1.05-2.82); mientras
que en SLE se encontró elevada la frecuencia del alelo T (73%) comparado con RA (67%) y controles (68%, p=0.03, OR=1.27, 95%CI 1.01-1.59).
Conclusión. El presente estudio sugiere asociación entre el gen
TIM1 y la susceptibilidad a padecer RA y SLE.
ASOCIACIÓN ENTRE EL HLA Y LOS NIVELES DE ANTICUERPOS ANTI PÉPTIDOS CITRULINADOS CÍCLICOS Y DE FACTOR
REUMATOIDE EN PACIENTES CON ARTRITIS DE RECIENTE
COMIENZO. Cabezón Sánchez A1, Ramiro Latienda S1, Cobo Ibáñez
T1, Orozco G2, Balsa Criado A1, San José Valiente B1, Martín Ibáñez
J2, López-Nevot MA3, Pascual-Salcedo Pascual D1. 1Hospital Universitario La Paz de Madrid. 2Hospital Virgen de las Nieves de Granada. 3Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra, CSIC, Granada.
Introducción. La producción de anticuerpos anti péptidos citrulinados (ac anti-CCP) se asocia con la presencia de los alelos HLA DRB1
17
COMUNICACIONES ORALES
con el epítopo compartido (EC) y con la artritis reumatoide (AR). El
HLA DR3 se asocia con la AR seronegativa para Factor Reumatoide
(FR) y los alelos HLA DRB1 que codifican la secuencia DERAA protegen del desarrollo de AR.
Pacientes y Métodos. En pacientes de una consulta de artritis de
reciente comienzo se estudió la presencia de alelos HLA DRB1 con el
EC, el HLA DR3 y alelos que codifican la secuencia DERAA. En el suero de estos pacientes se cuantificaron los ac anti-CCP y FR. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante los test de Kruskal-Wallis
y U de Mann-Whitney con la corrección de Bonferroni.
Resultados. De los 322 pacientes incluidos en el estudio, un 71,4%
fueron diagnosticados de AR y un 28,6% de otras artropatías. El FR y
los ac anti-CCP fueron positivos respectivamente en el 72,6% y 62,3%
de los pacientes con AR y en el 9,2% y 3,5% de pacientes con otras artropatías. Se encontraron diferencias en el título de ac anti-CCP y de FR
según el número de alelos con el EC, obteniendo los niveles más bajos
en los pacientes que no tenían ningún alelo con el EC (p
No observamos diferencias en la producción de ac anti-CCP y
FR según el alelo HLA DRB1 con el EC aunque sí se encontró un efecto de inhibición de la producción de ac anti CCP de los alelos que codifican la secuencia DERAA o del HLA DR3, sobre el efecto producido
por el EC (p
Conclusión. La presencia del EC está asociada con la producción
de ac anti-CCP y con la magnitud de esta producción. Observamos un
efecto inhibitorio de la producción de ac anti-CCP cuando el alelo HLA
DR3 o los alelos que codifican la secuencia DERAA están presentes
junto a otro alelo con el EC.
EFFECTS OF DISEASE MODIFYING DRUGS IN THE DISTRIBUTION AND MIGRATORY PROPERTIES OF PERIPHERAL BLOOD MONOCYTES IN RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS.
Chara L1, Chevarría J1, Díaz D1, Sánchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Prieto A1, Turrión A2, León MJ2, Álvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada
UAH/CNB-CSIC, IMMPA, Departamento de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid, España. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune, Hospital Universidario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, Madrid, España.
Background. Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic inflammatory disease characterized by a massive synovial infiltration of
lymphocytes and macrophages. Functionally altered blood monocytes are associated with joint inflammation and higher disease activity. Disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs) have been
shown to reduce disease activity with excellent clinical results. OBJECTIVES: To determine the effect of traditional DMARDS and anti-TNFa
agents in the distribution of the different peripheral blood monocytes from RA patients compared with healthy controls, and to relate
that subset distribution with their migratory properties and disease
activity.
Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 46 rheumatoid arthritis patients and 15 healthy controls were purified and characterized in a FACSCalibur cytometer using fluorochrome-labeled
monoclonal antibodies to label CD14, CD16, CD62L and CX3CR1
antigens. The DAS28 score was calculated in each patient in order to
determine the disease activity (active disease was considered when
DAS28> 3.2). Comparisons between patients and healthy controls
were carried out using the Student`s T test and considered significant when p<0.05.
18
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Results. Treated and untreated non active RA patients showed a
significant decrease in the percentage of classical CD14+highCD16monocytes respect to healthy controls without relationship with disease activity. On the other hand we found a significant increase in the
inflammatory CD14+lowCD16+ monocytes in active RA patients treated with anti-TNFa agents with respect to healthy controls and untreated and treated with methotrexate RA patients. We did not find differences in non active disease RA patients. Inflammatory monocytes
showed a significant decrease in the expression of CX3CR1 (Fractalkine) in non active untreated patients compared with healthy controls.
The Treatment with anti-TNFa agents normalized this altered fractalkine expression.
Conclusions: There is an altered distribution of the different
monocytic cell subsets in peripheral blood of RA patients that is characterized by a decrease in the “classical” monocytes and an increase
of inflammatory monocytes, as well as changes in their migratory properties. This phenomenon is related with the disease activity and the
patient treatment.
POLIMORFISMOS DE Fc RIIA (CD32A) Y Fc RIII A (CD16A) EN
LA RESPUESTA A LA TERAPIA CON INFLIXIMAB EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. Suárez B 1, Cañete JD2,
Hernández MV, Rego I3, Sanmartí R2, Pinto JA3, Blanco FJ3, Lozano
F1. 1Servicio de Inmunología, Hospital Clínico de Barcelona. IDIBAPS,
Facultad de Medicina, Univ. de Barcelona. 2Servicio de Reumatología,
Hospital Clínico de Barcelona. IDIBAPS, Facultad de Medicina, Univ.
de Barcelona. 3Servicio de Reumatología, Hospital Juan Canalejo.
A Coruña.
El polimorfismo de los receptores of Fc gamma (Fc R) influye en
su afinidad por las inmunoglobulinas (Ig) y ello puede afectar la eficacia de las terapias basadas en Ig. En el presente trabajo analizamos
la relación entre polimorfismos funcionales de los genes Fc R IIA
(CD32A) y IIIA (CD16A) y la respuesta a la terapia con infliximab (antiTNF ) en pacientes con artritis reumatoide (RA). Para ello se analizaron 91 pacientes (89% mujeres; 76.7% Factor Reumatoide positivo). Los
pacientes fueron evaluados a las semanas 0, 6 y 30 usando los criterios
de respuesta ACR y EULAR. El genotipado de los polimorfismos de
CD16A (F158V) y CD32A (R131H) se realizó por PCR-SSP y secuenciación, respectivamente. Se aplicaron los test Chi-square and Fisher's
exact test para mostrar diferencias en las variables analizadas. Los individuos homo y heterocigotos para las variantes de alta afinidad de los
dos Fc R analizados se agruparon en una sola categoría para realizar
comparaciones más robustas con los individuos homocigotos para alelos de baja afinidad.
Se encontraron diferencias estadísticamente significativas a
las 6 semanas en el ACR50 en función del genotipo CD16A (baja afinidad o F/F: 24.1%; alta afinidad o F/V-V/V:2.2%; p =0.003) y a las
30 semanas en el ACR20 en función del genotipo CD32A (baja afinidad o RR: 60 %; alta afinidad o R/H-H/H: 33.3%;p= 0.035). La
reducción de los niveles de proteína C reactiva durante la terapia
fue siempre mayor en los portadores de variantes de baja afinidad
(CD16A-F/F; CD32A-R/R). En conclusión, la respuesta al tratamiento anti-TNF (infliximab) en pacientes con RA está influenciada por
los genotipos tanto de CD16A como de CD32A y este efecto se observa a diferentes tiempos del seguimiento (6 y 30 semanas, respectivamente) reflejando la naturaleza dinámica de la interación Fc R
versus Ig.
INMUNOLOGÍA
COMUNICACIONES ORALES
SESIÓN 2: INMUNOGENÉTICA
Moderadores: Dra. Estela Paz Artal (Madrid),
Dr. Jordi Yagüe (Barcelona)
IDENTIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN COMPLETA DE 17 NUEVOS ALELOS HLA DE CLASE. Balas Pérez A1, Sánchez-Gordo F2,
Sánchez-García F3, Bustamante L1, García-Sánchez F1, Vicario JL1.
1Centro de Transfusión de Madrid. 2Centro de Transfusión de Málaga. 3Hospital Doctor Negrin. Gran Canaria.
Diecisiete nuevos alelos HLA clase I fueron detectados y posteriormente completamente caracterizados mediante secuenciación:
A*020115, *0281, *0289, *9224, *0326, *0339, *2631, *68020103, *6836,
B*0829, *3579, *4077, *9523, Cw*0220, *030203, *0736, *0742.
La detección de nuevas variantes alélicas se realizó en el tipaje de
intermedia resolución mediante PCR-SSO y tecnología Luminex debido a patrones anómalos de hibridación así como en el tipaje mediante secuenciación de los exones 2/3/4. Las muestras portadoras de los
nuevos alelos fueron unidades de cordón umbilical, pacientes y donantes no emparentados. La detección de nuevos polimorfismo en los exones 2/3/4 se confirmo posteriormente mediante clonaje y secuenciación de las regiones codificantes restantes.
La tabla compara las nuevas secuencias con las secuencias de los
alelos más homólogos, así como la étnia de los individuos portadores y el haplotipo que contiene a los nuevos alelos. Los residuos en
negrita corresponden con nuevos residuos polimórficos.
Nuevo alelo
Alelo más
homólogo
Cambios de
codón
Cambios
aminoacid.
A*020115
A*0281
A*0289
A*9224
A*0326
A*02010101
A*9224
A*02010101
A*0281
A*03010101
245GCG>GCC
265GGT>GTT
192CAC>CAA
265GTT>GGT
268AAG>GAG
Gly>Val
His>Gln
Val>Gly
Lys>Glu
A*0339
A*03010101
A*2631
A*260101
A*68020103 A*68020101
102GAG>TAC
62CGG>CCG
Deleción ocho
nucleotidos en
el intron 2
76GTG>GAG
77GAG>AAG
79GGG>CGG
80ACC>ATC
81CTG>GCG
82CGC>CTC
83GGC>CGC
82CGC>CAC
211GCG>GAG
116TAC>TTC
131AGC>CGC
147TTG>TGG
167TGG>TCG
152GAG>GTG
169CGC>CAC
271ACC>ACT
17CGC>CAC
113TAT>TTT
A*6836
A*680101
B*0829
B*3579
B*4077
B*080101
B*3543
B*401401
B*9523
B*1591
B*1503
Cw*020202
Cw*030201
Cw*070101
Cw*070201
Cw*0220
Cw*030203
Cw*0736
Cw*0742
Asp>Tyr
Arg>Pro
Val>Glu
Asp>Asn
Gly>Arg
Leu>Ala
Arg>Leu
Gly>Arg
Arg>His
Ala>Gly
Tyr>Phe
Arg>Ser
W>Leu
Ser>Trp
Glu>Val
Arg>His
Arg>His
Tyr>Phe
Raza
Haplotipo/Tipaje HLA I
Cau.Español
Cauc.Aleman
Cauc.Español
Cauc.Español
Cauc.Español
A*020115-B*5002-Cw*060201
A*0281-B*440201-Cw*050101
A*0289-B*3701-Cw*0602
A*9224,*23 ; B*40,*56
A*0326,*24020101;B*3701,
B*400201; Cw*04010101,*06020101
Cauc.Español A*0339-Cw*070101-B*080101
Cauc.Español A*2631-B*440201-Cw*050101
Cauc.Español A*01,*68020103;B*530101,*5601
Cw*010201,*04010101
Ecuatoriano
A*02,*6836; B*40,*51; Cw*06,*15
Desconocida A*01,A*-;B*0820,*1402
Ecuatoriano A*24020101-B*3579-Cw*010201
Cauc.Español A*01,*02; B*08,*4077
Cauc.Español No definido
Cauc. Español
Desconocida
Cauc.Español
Cau. Hungaro
A*3301-B*440301-Cw*0220
A*020104-B*5801-Cw*030203
A*020101-B*180101-Cw*0736
B*070201-Cw*0742
Se definieron dos nuevas variantes caracterizadas por mutaciones
no productivas, A*020115 y Cw*030203. Asimismo se han definido dos
variantes de A*02, *0281 y *9224 que presentan un epítopo Bw4 equivalente al presente en alelos A*25 y A*32. De forma similar, se ha caracterizado y detectado en dos muestras procedentes de donantes ecuatorianos un nuevo alelo, A*6836, que presenta el epítopo Bw4 presente en alelos A*23 y A*24.
El alelo A*68020103 presenta variabilidad intrónica debido a una
deleción de ocho nucleótidos en el inicio del intron 2. Esta variación
no afecta, sin embargo, a su expresión en superficie.
ESTUDIO DE ALGUNOS ALELOS HLA EN ENFERMOS DE ALZHEIMER. Leon Moya V1, Cacho Gutierrez J2, Chong Espino Y2. 1Serv
Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Serv. Neurologia.
Hospital Universitario de Salamanca.
Introducción. Los alelos HLA relacionados con la susceptibilidad
ó resistencia a ciertas enfermedades, hacen que su presencia module
la presentación antigénica, inhibiendo ó activando la respuesta inmune frente a exo ó auto antígenos. Hemos aplicado el análisis individualizado de los alelo HLA A3, B7, DR2 y DR4, mediante PCR, habiendo
selecionado estos alelos por su relación con ciertas enfermedades autoinmunes.
Material y Métodos. 62 pacientes de Alzheimer,EA, de acuerdo
con los criterios de NINCDS-ADRDA, y 84 sujetos sanos como grupo control, GC, fueron estudiados. El ADN fue extraído mediante el
kit DNA Direct II (Dynal), fundamentado en una resina con núcleo
metálico que permite separar el complejo ADN-resina mediante un
imán.
Los primers para el estudio del gen HLA A3 : For 5’ AgC gAC gCC
gCg AgC CA 3’, Rev 5’ CAC TCC Acg CAC gTg CCA 3’ ; para HLA
B7: For 5` ggA gTA TTg ggA CCg gAA C 3`, Rev 5´ TAC Cag CgC gCT
CCA gCT 3’; para DR2 : For 5´ TCC TgT ggC AgC CTA AgA g 3´, Rev
5´ CgC TgC ACT gTg AAg CTC TC 3´ y DR4: For 5´gTT TCT Tgg AgC
Agg TTA AAC A 3´, Rev 5´ CgC TgC ACT gTg AAG CTC TC 3´.
Las condiciones de PCR fueron: 95º, 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 53º
30 s, 72º 30s 34 ciclos, y 72º 10 min. Los amplicones fueron visualizados en electroforesis de agarosa al 2%
Resultados. La frecuencia génica de alelo HLA A3 fue 21,3 EA (
13,6% en GC), el alelo HLA B7 se un 18,3 EA ( 12,5 % en GC) el alelo
DR 2 17,6 %EA (15,5 % en el GC), El DR4 32,4% EA ( 15,6% GC).
Las diferencian estatisticas entre las frecuencias génicas , Chi Cuadrado, entre enfermos y controles fueron significativas , p> 0.001, en todos
los alelos. Poniendose de manifiesto la posbilidad de emplearl como marcadoes genicos los alelos HLA estudiados en enfermos de Alzheimer.
EL ORIGEN DE LOS HABITANTES DE LAS ISLAS ALEUTIANAS
(ESTRECHO DE BERING) SEGÚN LOS GENES HLA. Moscoso J1,
Vicario JL2, Crawford M3, Serrano-Vela JI1, Reguera R1, Ferri A1, AbdEl-Fatah-Khalil S4, Millan P1, Arnaiz-Villena A1. 1Dept. Inmunología,
Universidad Complutense, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid,
Madrid. 2Dept. Inmunología, Centro de Transfusión de la Comunidad de
Madrid, Madrid. 3Dept. Anthropology, University of Kansas, Lawrence, USA.
4Dept. Hematología, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid,
Madrid.
Los Aleutianos son una población que vive en las Islas Aleutianas
situadas entre las actuales Alaska y Rusia, en la zona Sur del Estrecho de Bering. Su lengua no pertenece a ninguna familia conocida,
incluidas las lenguas Amerindias, Na-Dene (Atabascos), Eskimales o
Siberianas.
Se han identificado los alelos de los genes HLA-A, -B, -C y -DRB1
mediante técnicas estándar de alta resolución en 58 individuos Aleutianos no emparentados.
19
COMUNICACIONES ORALES
Los resultados se compararon con poblaciones de todo el mundo,
que incluían Amerindios, Eskimos, NaDene (Atabascos), Europeos,
Asiáticos, Africanos y Australianos; en total, se analizaron 12.298 cromosomas.
No se encontraron los alelos HLA característicos de Amerindios.
Los cálculos realizados usando distancias genéticas, dendrogramas
Neighbour-Joining, análisis de correspondencia y haplotipos HLA
extendidos muestran que genéticamente, los Aleutianos están estrechamente relacionados con los actuales Europeos Finlandeses y Lapones, que emigraron hacia el Oeste desde los montes Altai de Siberia
hasta los lugares que actualmente ocupan en Escandinavia. Se discute la hipótesis de que los Aleutianos representen una migración
hacia el Este de las poblaciones originarias de los montes Altai Siberianos.
LA IgD DE EUBLEPHARIS MACULARIUS. UN GEN GENERA
MÚLTIPLES ANTICUERPOS. Magadán Mompó S1, Sánchez Espinel
C2, Gambón-Deza F2. 1Hospital Meixoeiro. 2Instituto Superior de Saúde do
Alto Ave.
Al igual que la IgM, la IgD se expresa en la membrana de los linfocitos B maduros como receptor para el antígeno. La ausencia de IgD
en aves y su descripción en peces óseos contribuyó a la confusión relativa a sus orígenes evolutivos. Recientes estudios han establecido la
presencia de IgD en el anfibio Xenopus tropicalis, siendo esencial el
estudio genético en reptiles para conocer mejor el proceso evolutivo
de la IgD en vertebrados. En trabajos realizados por nuestro grupo describimos en el reptil Eublepharis macularius (Gecko leopardo) el gen
para la IgD. Está constituído por 11 dominios Ig y un dominio TM. En
el presente estudio describimos diferentes ARNs mensajeros generados a partir del gen de la IgD, indicando la presencia de varias formas
secretadas y de membrana. El gran número de dominios Ig y la diversidad de ARNs mensajeros sugiere una actividad funcional de la IgD
relevante.
Metodología. Se obtuvo ARNm a partir de sangre periférica, bazo
y tracto digestivo. Se realizaron RT-PCR con primers específicos para
diferentes dominios variables (V) y constantes (C) de inmunoglobulina y TM. Los amplificados obtenidos fueron clonados utilizando el
vector pGEM®-T y/o secuenciados. Las secuencias obtenidas fueron
analizadas utilizando el software DNAstar.
Resultados. El análisis de las secuencias de ADNc obtenidas
mediante RT-PCR y/o posterior clonación, indican la expresión de
múltiples ARNm generados, a través de splacing, a partir del gen de
la IgD. A su vez, los resultados indican la producción de ARNm que
codifica para dos formas de IgD secretada. Ambas presentan tallo secretor en el dominio CH11, el cual tiene un menor número de aminoácidos que el descrito en la IgM e IgA , y no presenta cisteínas, sugiriendo que no polimeriza en formas múltiples. Con respecto a la forma
transmembrana, hemos descrito al menos 4 formas de ARN mensajero, siendo los dominios CH4, CH9 y CH11, los que realizan splicing
con el exón TM.
Conclusiones. Un único gen de anticuerpo IgD puede generar
numerosos anticuerpos con capacidades funcionales diferentes, lo
que debe conferir ventajas evolutivas que condicionan la permanencia de la IgD en los reptiles. Estos mismos resultados podrían
obtenerse en otras especies, como peces y anfibios, en los que se
encuentran Igs con un gran número de dominios, como la IgW e
IgY.
20
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
DIVERSIDAD ALELICA DEl gen MICA Y HAPLOTIPOS mica/hlab EN UNA POBLACIÓN DE LA REGION DE MURCIA. Lucas D,
Campillo JA, López M, Salgado G, Botella C, López-Hernández R, Sanchís MJ, Alemany JM, Minguela A, Álvarez-López MR, Muro M. Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia,
CIBERehd, Spain.
MICA esta localizado a 46 kb centromérico a HLA-B. Su estructura genómica es similar a los genes HLA de clase I, aunque no se asocia a β2-microglobulina. Los exones 2, 3 y 4 del gen codifican los 3
dominios extracelulares (α1, α2 y α3, respectivamente), y el exón 5
codifica el dominio transmembrana. MICA es muy polimórfico y se
han descrito hasta ahora 63 alelos. El significado funcional de estos
polimorfismos no se conoce aún, aunque cambios en la secuencia aminoacídica de MICA influencian la afinidad de la interacción con
NKG2D, su ligando en la células NK, Tγδ y T CD8. Así, la presencia de
metionina o valina en el codón 129 del dominio α2 confiere fuerte o
débil afinidad, respectivamente.
Nuestro propósito fue establecer la diversidad alélica de MICA y
su ligamiento a HLA-B (gen HLA próximo) en nuestra población. DNA
fue extraído con el extractor Maxwell16 (Promega, WI). Genotipaje de
MICA y HLA-B se realizo por PCR-SSO y PCR-SSP alelo específica.
Las frecuencias génicas y haplotípicas se analizaron mediante el programa Arlequin (Universidad de Ginebra).
El alelo MICA*008 fue el más frecuente (25.3%), seguido por
MICA*002 (15.6%), MICA*004 (14.9%), MICA*001 (7.8%), MICA*009
y MICA*016 (7.2%), y MICA*010 (4.6%). Los alelos menos representados fueron MICA*005, MICA*007, MICA*017, MICA*023, MICA*030,
MICA*033, MICA*046, MICA*050 y MICA*052.
En el análisis de haplotipos, el más frecuentemente observado es
MICA*008-B*07 (9.4%), seguido de MICA*004-B*44 y MICA*001-B*18
(8.1%), MICA*002-B*35 (6.7%), MICA*008-B*44 y MICA*004-B*49 (4.7%)
y, MICA*008-B*08 y MICA*002-B*38 (4.1%). Combinaciones no vistas ocasionalmente y no reportadas en población española serian
MICA*010-B*1501, MICA*015-B*45, MICA*008-B*13 y MICA*008B*4001.
En conclusión, la diversidad alélica de nuestra población es similar a otras poblaciones ibéricas, aunque encontramos una serie de alelos poco frecuentes, así como determinadas asociaciones haplotípicas no descritas en otras poblaciones de la Península Ibérica.
EFECTO DE LOS RECEPTORES KIR EN LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO COMBINADO EN PACIENTES CON HEPATITIS
CRÓNICA C. Vidal-Castiñeira JR1, López-Vázquez A1, Díaz-Peña R1,
Pruneda L1, Alonso-Árias R1, Pérez R2, Rodrigo L2, López-Larrea C1.
1Servicio de Inmunología, Unidad de Histocompatibilidad y Transplantes,
Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo. 2Servicio de Digestivo,
Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Los receptores KIR (killer immunoglobulin-like receptors) están
relacionados con la activación e inhibición de las células NK, y pueden jugar un papel muy importante en la respuesta innata frente a
infecciones virales, tales como el HCV. El propósito de este estudio era
investigar la posible implicación de los receptores KIR en la respuesta al tratamiento con interferon pegilado (Peg-IFN-α-2b) y ribavirina.
Para ello se seleccionó un grupo de 186 pacientes diagnosticados
de infección por HCV crónica. Todos los pacientes recibieron tratamiento combinado a lo largo de 6-12 meses y fueron clasificados en
INMUNOLOGÍA
función de su respuesta al finalizar el periodo de seguimiento posttratamiento: 77 fueron no respondedores (NR) y 109 alcanzaron una
respuesta viral sostenida (RVS). Todos fueron tipados para HLA-B,
HLA-Cw y KIR mediante PCR-SSOr por la tecnología Luminex.
Se observó que la presencia KIR2DL3 estaba significativamente
incrementada en pacientes RVS (61.93% vs. 45.46%, p= 0.001). Además
este receptor en homocigosis también se encontraba aumentado en este
grupo (p=0.05). Por otro lado, la frecuencia de KIR2DL2 era mayor en
pacientes NR (54.54% vs. 38.07%, p=0.001, OR= 1.95). Este receptor en
homocigosis también se encontraba significativamente aumentado en
NR (p=0.005, OR=2.52). También se analizaron las distintas interacciones de estos receptores con sus ligandos HLA. Se observó que el genotipo KIR2DL2/KIR2DL2-HLA-C1C2 estaba aumentado en el grupo
NR (p=0.007, OR=3.15) frente al genotipo KIR2DL3/KIR2DL3-HLAC1C1 que se encontraba aumentado en el grupo RVS (p= 0.028).
Como conclusión hemos observado que la mayoría de los pacientes con el genotipo KIR2DL3/KIR2DL3-HLA-C1C1 responden adecuadamente al tratamiento antiviral. Este genotipo “buen respondedor” parece facilitar la consecución de una respuesta viral sostenida.
En cambio, la mayoría de los pacientes con el genotipo
KIR2DL2/KIR2DL2-HLA-C1C2 no responden adecuadamente al tratamiento y no pueden eliminar el RNA viral.
ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO ALÉLICO DE KIR3DL1 Y SU
ASOCIACIÓN CON ESPONDILITIS ANQUILOSANTE EN LA
POBLACIÓN ESPAÑOLA. Díaz Peña R, Blanco Gelaz MA, Vidal
Castiñeira JR, López Vázquez A, Suárez Álvarez B, López Larrea C.
Hospital Universitario Central de Asturias.
Los diferentes loci de receptores KIRs (Killer cell immunoglobulin-like receptors) y antígenos leucocitarios humanos (HLA) son altamente polimórficos, y algunas moléculas HLA de clase I se unen a estos
receptores KIRs. En el presente estudio se ha realizado un análisis
del polimorfismo alélico del loci KIR3DL1 y se ha examinado si la combinación de los diferentes subtipos junto con genotipos HLA-B27 está
asociado con susceptibilidad a desarrollar espondilitis anquilosante
(EA). Para llevar a cabo el estudio, fue seleccionada una población española HLA-B27 positiva (56 pacientes con EA y 55 controles sanos).
Nuestros resultados mostraron que la diferente distribución de
KIR3DL1 en la población española se debe principalmente al descenso de los subtipos KIR3DL1*001 y KIR3DL1*004 en pacientes EA (15.6%
vs. 4.5%, p<0.05 y 31.8% vs. 15.2%, pc<0.05; respectivamente). Puesto
que existen indicios que sugieren que la fuerza de la señal inhibitoria
generada por el reconocimiento de HLA-B Bw4 por KIR3DL1 también
varía dependiendo del alelo presente, también se analizó si el ligando
natural de KIR3DL1 podría estar involucrado en la susceptibilidad a
desarrollar EA junto con algún subtipo o algún grupo de subtipos, clasificados éstos en alelos con alta expresión en membrana, con baja
expresión y con ausencia de expresión (KIR3DL1*004). Por una par te,
se observó que no existían pacientes EA que tuviesen formas homocigóticas 3DL1/3DL1 que se expresen en membrana junto con Bw4I80,
mientras que su presencia en controles era significativamente mayor
(pc<0.005). Además, también se observó un aumento significativo de
la frecuencia de KIR3DL1*004 junto con Bw4I80 en pacientes EA
(pc<0.05). De esta manera, la susceptibilidad a desarrollar EA podría
estar determinada por un balance de activación e inhibición compuesto de genotipos KIR-HLA, en el que la interacción 3DL1-Bw4I80 parece ser decisiva.
COMUNICACIONES ORALES
REGULACIÓN EPIGENETICA DEL MHC EN LINEAS EMBRIONARIAS HUMANAS. Lopez-Larrea C, Bravo-Mendoza C, SuarezAlvarez B. Hospital Central de Asturias.
Las células embrionarias humanas (hESC) son capaces de diferenciarse a la mayoria de tipos celulares y cultivarse durante largos periodos de tiempo. Estas caracteristicas las hacen ser una fuente importante de células capaces de ser utilizadas para el futuro del trasplante y la
medicina regenerativa. Uno de los problemas principales es el reconocimiento alogénico del injerto y la activación del sistema inmune conduciendo al rechazo del órgano transplantado.
Las hESC expresan niveles muy bajos de MHC-I, pudiendo incrementarse pero núnca alcanzando los niveles detectados en una células somáticas. No existe expresión de MHC-II y HLA-G. Los mecanismos epigeneticos (metilación del ADN y modificación de histonas) son
claves en la regulación de genes en eucariotas, implicando la activación o silenciamientos de los mismos. Las hESC presentan patrones de
metilación y acetilación únicos que afectan a la regulación de genes
implicados en su pluripotencialidad y diferenciación.
Todos esto nos ha llevado a estudiar la expresión de MHC en la
línea de hESC Shef-1 (Sheffield, UK) en diversos estadios, así como las
moléculas implicadas en la maquinaria de procesamiento antigénico,
factores de transcripción y los mecanismos epigeneticos que podrian
regular su expresión.
Hemos observado una deficiencia en los niveles de expresión del
MHC-I en hESC como consecuencia de la disminución de expresión
en los genes implicados en la maquinaria de procesamiento antigénico (Tapasina, TAP y Erp57), además de la ausencia de expresión de
HLA-DR y de los factores de transcripción CIITA y RFX-5. Mediante
técnicas de secuenciación de bisulfito, detectamos hypermetilación en
los genes HLA-DR, CIITA, LMP7 y HLA-G. Adicionalmente, y mediante ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) se observó que modificaciones especificas en las histonas H3 y H4 participan
tambien en la regulación de estos genes. Tratamiento de las hESC con
inhibidores de deacetilasas de histonas (HDACs), sólo o en combinación con agentes desmetilantes del ADN, inducen la reexpresión en
superficie de las moléculas MHC.
En conclusión, determinamos que la expresión del MHC-I y II en
lineas embrionarias humanas puede estar regulada mediante mecanismos epigenéticos.
SESIÓN 3: INMUNOLOGÍA Y TRASPLANTE
Moderadores: Dr. Joan Milá (Palma de Mallorca),
Dr. Alfredo Minguela (Murcia)
FRECUENCIAS ALÉLICAS Y HAPLOTÍPICAS HLA EN PACIENTES ESPAÑOLES EN BÚSQUEDA DE DONANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS. IMPLICACIONES EN LA OBTENCIÓN DE DONANTE HLA COMPATIBLE 12/12. Balas Pérez A, García-Sánchez F, Bustamante L. Centro de Transfusión de Madrid.
El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas de donante no emparentado (DNE) es la mejor opción cuando no existe un
donante familiar HLA idéntico. Los resultados para este tipo de trasplante han demostrado ser mejores cuando existe identidad a nivel alélico para los genes HLA-A, -B, -C, -DRB1 y –DQB1.
21
COMUNICACIONES ORALES
A pesar de la expansión de los registros de donantes, la identidad
a nivel alélico sigue siendo un obstáculo debido a la gran diversidad
de alelos y haplotipos HLA. Pacientes con variantes HLA comunes
sobre haplotipos conservados presentarían mas ventaja a la hora de
encontrar donantes con compatibilidad 12/12 (HLA-A, -B, -C, -DRB1DRB3/4/5, -DQB1), que aquellos con alelos raros o haplotipos infrecuentes. En éstos últimos, aproximaciones alternativas han demostrado ser mejores que el mantenimiento del paciente en búsqueda durante un periodo de tiempo prolongado.
Los registros de donantes no emparentado están compuestos por
donantes tipados para HLA-A, -B, -DRB1 a resolución baja/media. Es
imprescindible por tanto el conocimientos de las frecuencias de cada
una de las poblaciones con el fin de evaluar en cada caso la estrategia de búsqueda a seguir.
En el presente estudio incluimos 253 pacientes españoles caucasoides en búsqueda de DNE entre los años 1992-2008 de los que se tienen datos de segregación familiar con el fin de conocer la distribución
haplotípica de clase I o clase I y II. Todos ellos fueron tipados para
los genes HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5, y –DQB1 mediante
secuenciación. A partir de este grupo de pacientes se obtuvieron 506
haplotipos HLA de clase I y 436 incluyendo también los genes HLA
de clase II.
Para este grupo de pacientes se recibió, y tipo al mismo nivel de
resolución, un total de 493 DNE. De los 253 pacientes en búsqueda, 172
recibieron al menos un donante, obteniéndose en 81 casos al menos un
donante compatible 12/12.
El análisis de frecuencias alélicas de clase I demostró la presencia en población española de 33, 57 y 31 alelos para los genes HLAA, -B y –C, lo cual representa un 5,5%, 5,8% y 9,1% de las variantes descritas para estos tres genes respectivamente. Asimismo, entre 6-8 alelos representan para los tres genes de clase I, entre un 55% y un 75%
del total de alelos encontrados. Esta limitada variabilidad contrasta sin
embargo con los datos obtenidos de frecuencias alélicas, ya que aparecen un total de 245 haplotipos de clase I distintos, de los cuales 169
(69%) aparecen una sola vez. Dieciséis haplotipos de clase I presentan
una frecuencia superior al 1%. Cuando se analizan haplotipos completos, únicamente son 11 los que presentan una frecuencia superior al
1%.
El análisis de las asociaciones haplotípicas HLA-B-C demostró la
distribución atípica que presenta el antígeno B*510101 pudiéndose
encontrar asociado hasta con 10 diferentes alelos HLA-C.
La comparación de las poblaciones de pacientes que recibieron al menos un donante compatible 12/12 y aquellos para los que
no se obtuvo ningún donante completamente idéntico demostró
que:
1. Se encuentra una diferencia significativa en la frecuencia de haplotipos con frecuencia superior al 1% (p<0,0001).
2. Existe una diferencia significativa en la frecuencia del alelo B*510101
entre ambas poblaciones (p= 0,004).
3. Existe una diferencia significativa en la frecuencia de alelos HLA
con una frecuencia inferior al 1% entre ambas poblaciones
(p<0,0001).
4. Se encuentra una mayor frecuencia de asociaciones haplotípicas
infrecuentes B-C y DRB1-DQB1 en la población de pacientes sin
donante HLA idéntico.
Por lo tanto, considerando todos estos factores asociados al paciente, junto con los datos obtenidos de la búsqueda en el Bone Marrow
Dornor Worldwide, es posible realizar una predicción sobre la posibilidad de obtener un DNE HLA 12/12 idéntico.
22
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
PIG CHONDROCYTES TRIGGER A XENOGENEIC CELLULAR
IMMUNE RESPONSE. Sommaggio R, Máñez R, Costa C. Institut d'Investigació Biomédica de Bellvitge (IDIBELL).
Xenotransplantation may be a solution to the shortage of human
cells, tissues and organs for transplantation. In particular, transplantation of porcine chondrocytes may benefit patients who suffer articular, nasal or other cartilage defects. Cartilage is an avascular tissue with
very low regenerative capacity that is subjected to a not well understood process of xenograft rejection. In this work, we sought to elucidate the molecular bases of cell-mediated rejection of xenogeneic cartilage. To this end, we isolated pig costal chondrocytes (PCC) and conducted a series of functional studies that included treatment with
human inflammatory cytokines and xenogeneic cell-based assays. First,
we determined by flow cytometry the cell surface expression of SLAI, SLA-II, VCAM-1, ICAM-1, E-selectin, CD86 and CD40 in resting conditions or after treatment with 10 ng/ml TNF-alpha, IL-1-alpha−fnfnor
IL-1-beta for 24 hours. Some molecules were not expressed (SLAII,
E-selectin), or barely detected (CD40), at any of the conditions assayed. On the contrary, TNF-alpha and to a lesser extent IL-1-alpha led
to a marked upregulation of SLA-I, VCAM-1 and ICAM-1 on PCC.
CD86, constitutively expressed at moderate levels, was only slightly
elevated by these cytokines. We next studied the interaction of the
human monoblastic cell line U937 with untreated or cytokine-activated porcine chondrocytes in an adhesion assay testing various
effector:target ratios. U937 demonstrated significant adherence to the
PCC in resting and cytokine-stimulated conditions. VCAM-1 played
a role in this process, as demonstrated with a specific blocking antibody. Finally, coculture of PCC with Jurkat for various days led also
to an increase in IL-2 secretion. In summary, porcine chondrocytes respond to human inflammatory cytokines and trigger a xenogeneic cellular immune response.
AFFINITY STUDIES OF PORCINE TUMOR NECROSIS FACTOR
RECEPTOR 2 TO ELUCIDATE ITS ROLE IN XENOGRAFT REJECTION. Bosch L, Uribe-Herranz M, Costa C. Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL)
Clinical xenotransplantation is precluded by a strong immune
response in which innate immunity plays a role. In particular, tumor
necrosis factor (TNF) produced by NK cells and macrophages contributes to xenograft rejection by promoting endothelial cell activation and recruitment of inflammatory cells. To elucidate its molecular mechanism, we previously cloned the cDNA of porcine TNFReceptor 2 (pTNFR2) and obtained two isoforms. The longest one
comprised the 4 TNFR cysteine-rich domains conserved between species, whereas the short variant lacked the sequence corresponding to
exon 4 and one of the cysteine-rich repeats. We have now assessed
their affinity for TNF. We produced two recombinant proteins containing the extracellular domain of each pTNFR2 variant fused to
GST at the carboxyterminal end and examined their ability to bind
pig and human TNF-alpha (pTNF and hTNF) by surface plasmon
resonance. In one set of experiments, the GST-fusion proteins were
immobilized directly on a CM5 chip and the pig and human TNF
were injected at multiple concentrations. It generated very robust
results and calculated a comparable KD for pTNFR2 binding to either
pTNF or hTNF (2,5E-9 and 2,4E-9 M, respectively) with a 1:1 binding
fit. The dissociation was slightly faster for hTNF. In this experiment,
INMUNOLOGÍA
we also obtained the KD for hTNFR2 binding hTNF (4,2E-9 M) and
pTNF (9,9E-9 M) for comparison. In a second series, we orientated
the receptor with an anti-GST antibody bound to the chip and obtained one-order-of-magnitude higher affinities overall but with lower
reproducibility. In this setting, the pTNFR2 variant lacking exon 4
showed no binding to hTNF and very little to pTNF. In conclusion,
pTNFR2 binds hTNF with high affinity, whereas the shorter isoform
does not. We continue to work on further elucidating the potential
biological function of these variants, which may participate in the
process of xenograft rejection.
CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES ILT-3
(INMUNOGLOBULIN LIKE TRANSCIPT-3) E ILT-4 EN RECEPTORES DE TRASPLANTE RENAL SEGÚN LA EDAD DEL DONANTE Y RECEPTOR. Benito Almazan MJ1, Fernández Fresnedo G2, Ruiz
JC2, Benito A2, San Segundo D1, Alamillo C2, Arias M2, López Hoyos
M1. 1Servicio de Inmunologia. 2Servicio de Nefrología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.
Entre los nuevos mecanismos tolerogénicos con relevancia en la
evolución del trasplante de órganos se ha implicado la generación de
células dendríticas con fenotipo y función tolerogénica. Este mecanismo está muy estudiado en modelos animales pero existen pocas evidencias en humanos. Además, es posible que la edad pueda influir en
la generación y/o mantenimiento de estas células presentadoras de
aloantígenos.
Objetivo. Determinar el fenotipo de las células dendríticas sanguíneas en receptores de trasplante renal a los 12 meses del trasplante, con especial atención a las diferencias de edad entre receptor y
donante.
Métodos. Se incluyeron 49 receptores de trasplante renal consecutivos de nuestro centro. Se analizó el número de células dendríticas
inmaduras y maduras en sangre mediante tinción con anticuerpos
monoclonales específicos y citometría de flujo, junto con la expresión
de receptores inhibidores de la función de las células dendríticas (ILT3, ILT-4). Para el estudio se seleccionaron cuatro grupos de parejas
receptor/donante según la edad avanzada (M: >60 años) o joven (J:
Resultados. A los 6 meses del trasplante se encuentra un aumento significativo de la frecuencia de células dendríticas que expresan
ILT-3 en el grupo DJ/RM respecto a DM/RM. No hay cambios en los
receptores jóvenes donde la expresión es incluso menor que en los
receptores mayores. En cambio, ILT-4 aumenta en las células dendríticas a los 6 meses del trasplante en la combinación DJ/RJ respecto a
la DM/RJ pero no hay diferencias en los receptores mayores. Observamos además una correlación significativa entre el número absoluto de células dendríticas ILT-4+ y las células T reguladoras
CD4+CD25high tanto en el momento pre-trasplante (r=0,476; p=0,004)
como a los 6 meses post-trasplante (r=0,408; p=0,013) y a los 12 meses
(r=0,517, p=0,041).También encontramos correlación significativa de
estas células con la subpoblación CD8+CD28- en el momento pre-trasplante (r=0,540; p=0,001) y a los 12 meses post-trasplante (r=0,609;
p=0,012).
Conclusión. El trasplante renal con un injerto joven, tanto en receptor mayor como joven, parece inducir más células dendríticas con fenotipo tolerogénico (definido por la expresión de ILT-3 e ILT-4) que el
donante mayor.
Financiación: FIS, Fundación Mutua Madrileña, Fundación Marqués de Valdecilla-IFIMAV.
COMUNICACIONES ORALES
INFLUENCIA DEL GENOTIPO MBL2 (MANNOSE BINDING LECTIN) DE DONANTE Y RECEPTOR EN LA EVOLUCIÓN DEL
TRASPLANTE HEPÁTICO. Pascal M1, Cervera C2, Suarez B1, Balderramo D3, Prieto J3, Fuster F3, Moreno A2, Navasa M3, Lozano F1. 1Servicio Inmunología. 2Servicio Enfermedades Infecciosas. 3Servicio Hepatología. Hospital Clinic i Provincial de Barcelona.
Introducción. MBL es una colectina sérica de producción hepática que se fija a la superficie de múltiples patógenos contribuyendo a
su eliminación por opsonofagocitosis y/o lisis mediada por complemento. Sus niveles plasmáticos están determinados por polimorfismos
del promotor/exón 1 del gen MBL2. El objetivo del trabajo fue evaluar
los genotipos MBL2 de donante y receptor de un injerto hepático y
su influencia en las infecciones y evolución del trasplante.
Métodos. Se determinaron por secuenciación los genotipos de
MBL2 de donante y receptor correspondientes a trasplantes hepáticos
realizados en nuestra institución entre 2003 y 2007. Los genotipos se
dividieron en silvestre (A/A) y variante (A/O; O/O). Se analizaron
variables pre y peri trasplante, incidencia de infecciones, rechazo y
supervivencia post-trasplante con objeto de identificar variables relacionadas con el desarrollo de infecciones y supervivencia.
Resultados. Se analizaron 96 parejas donante-receptor de trasplante hepático. La frecuencia de genotipo variante fue del 38% en donantes y 48% en receptores. No existieron diferencias significativas entre
las características del trasplante en función del genotipo del donante
o del receptor. La tasa de incidencia total de infecciones fue similar en
los receptores de un donante con genotipo salvaje o variante (p= 0.835).
Los receptores de un injerto hepático de genotipo variante presentaron una mayor tasa de mortalidad por infección. No se observaron
diferencias en cuanto a tasa de infecciones o evolución en función
del genotipo del receptor. En el análisis multivariado, genotipo variante del donante (HR 2.83, IC95% 1.00-7.95), puntuación MELD (HR 1.13,
IC95% 1.05-1.22) e infección bacteriana post-trasplante (HR 11.0, IC95%
2.8-43.0) fueron factores independientes predictivos de mortalidad.
Conclusión. El genotipo MBL2 variante del donante se asocia de
forma independiente con una peor evolución del trasplante, fundamentalmente por una mayor severidad de las infecciones.
IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS DIANAS ANTIGÉNICAS EN
PACIENTES TRASPLANTADOS DE CORAZÓN Y DIAGNOSTICADOS DE ENFERMEDAD VASCULAR DEL INJERTO. Acevedo
Calado MJ1, Álvarez Márquez A1, Aguilera I1, Caro Oleas JL1, Lage
Gallé E2, Wichmann Schlipf I1, Nuñez Roldan A1. 1Servicio Inmunología. 2Servicio de Cardiología. Hospital Universitario Virgen del Rocío.
La Enfermedad Vascular del Injerto (EVI) se caracteriza por un
engrosamiento progresivo de la íntima arterial. Es la causa principal
de morbilidad y mortalidad después del primer año del trasplante.
Aunque de patogenia desconocida, la EVI podría ser la manifestación
de una respuesta inmunitaria crónica, entre otras posibles causas.
Objetivos. El objetivo principal de nuestro trabajo es identificar
nuevas dianas antigénicas, presentes en el suero de los pacientes, que
puedan tener relevancia en la EVI post-trasplante cardiaco.
Pacientes y Métodos. Se seleccionaron 22 pacientes trasplantados
de corazón con más de un año de evolución y con EVI diagnosticada
por IVUS (ecografía intravascular). Se estudió la presencia de anticuerpos anti-endoteliales en sueros previos y posteriores al trasplante
mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) en portas de células
23
COMUNICACIONES ORALES
HUVEC y la identificación de los antígenos se realizó mediante el rastreo inmunológico de una genoteca de expresión de arteria coronaria
humana.
Resultados. Dieciocho de los 22 pacientes presentaban un patrón
nuclear similar, sólo o en combinación con otros patrones citoplasmáticos. Se seleccionó el suero de uno de estos pacientes para efectuar
el rastreo y se obtuvieron 4 clones positivos que, tras ser secuenciados,
correspondían a las siguientes proteínas: hnRNP K, IFI16, TYMS y
ZIP14. El antígeno hnRNP K es una ribonucleoproteína nuclear heterogénea que está implicada en la regulación de la expresión génica. Su
patrón nuclear, se confirmó en IFI con un anticuerpo monoclonal comercial frente a ésta proteína y en WB de lisado de células HUVEC en el
que da una banda de 64KDa también reconocida por el suero motivo
del rastreo.
El resto de los antígenos se encuentran bajo estudio.
Conclusiones
1. Hemos descrito la presencia de anticuerpos frente a 4 nuevos antígenos en trasplantados de corazón.
2. El antígeno hnRNP K es reconocido por anticuerpos presentes
en el suero de al menos 7 de estos pacientes.
IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS INUSUALES EN PACIENTES POST-TRANSPLANTE HEPATICO. Alvarez Doforno R1, Alvarez L2, Yañez F1, Diaz MC3, Larrauri J4, Jara P3, Fontan G1. 1Servicio
Inmunología. Hospital La Paz. Madrid. 2Unidad Investigación. Hospital La
Paz. Madrid. 3Servicio Hepatología. Hospital Infantil La Paz. Madrid. 4Servicio Anatomía Patológica. Hospital La Paz. Madrid.
Introducción. La hepatitis autoinmune de novo (HAI) tras transplante hepático es una patología inflamatoria del hígado caracterizada por hipergammaglobulinemia, presencia de autoanticuerpos y buena respuesta a dosis crecientes de inmunosupresores. Caso 1 Paciente de 13 años de edad en la actualidad, que a los 3 años de vida se somete a transplante hepático por una colestasis crónica. A partir de los 3
años y medio posttransplante sufre varios episodios de disfunción del
injerto. Caso2 Paciente de 7 años que a los dos años de vida se somete a transplante hepático con diagnostico previo de enfermedad de
Jarabe de Arce. A los 5 años post transplante presenta una disfunción
hepática.
Objetivos. 1) Estudiar la presencia de autoanticuerpos en dos niños
transplantados que presentan episodios de disfunción hepática. 2) Identificar los antígenos reconocido 3) Determinar si los episodios de disfunción están relacionados con los anticuerpos.
Materiales y Métodos. Las técnicas empleadas fueron inmunofluorescencia indirecta (IFI) sobre triple tejido de rata
(hígado/riñón/estómago), Inmunoblot (IMB) sobre extracto de hígado y/o proteínas purificadas ó recombinantes.
Resultados. Caso 1, Biopsia patrón histológico con colestasis y
transformación gigantocelular. Se detecta anticuerpos anti-canalículos
biliares a título alto, que van dirigidos contra la proteína BSEP. En ensayos in vitro de transporte de ácidos biliares, se observa que estos anticuerpos son capaces de inhibir la funcionalidad del BSEP. Caso 2, Biopsia: Tejido hepático con lesiones de rechazo agudo ligero con moderada fibrosis portal. Se detecta Ac anti Mitocondriales a titulo alto tipo
M2. Estos Ac reconocen al complejo deshidrogenasa de los α cetoácidos de cadena ramificada.
Conclusiones. En algunos pacientes sometidos a transplante hepático se generan anticuerpos que pueden ser bloqueantes contra una
24
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
proteína del órgano donante y que pueden llegar a reproducir en algunos casos la enfermedad original. Es fundamental detectar y caracterizar cualquier anticuerpo aunque sea inusual en pacientes tras transplante con el fin de predecir las disfunciones y poder entender el mecanismo que las produce.
ANÁLISIS DE LA EVOLUCION DE LA RESPUESTA HUMORAL
EN UN RECEPTOR CON DOS TRASPLANTES RENALES. Marin
Crespo N, Andres Martin A, Mirete Bachiller S, Castañer Alabau JL.
Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Caso clínico. Varón de 43 años con IRC secundaria a GMN mesangial IgA, sin sensibilización previa anti-HLA. Recibe un primer trasplante renal en 1996 con prueba cruzada negativa e incompatibilidades A29, A11, B57, B08, DR4, DR8. Rechazo agudo tardío y nefrectomía a los 6 años post-trasplante. Segundo trasplante renal en marzo
de 2000 con prueba cruzada negativa e incompatibilidades A31, B51,
DR7. Recidiva de GMN mesangial IgA diagnosticada a los cuatro años
y diagnóstico AP de nefropatía crónica del injerto en 2006. Transplantectomía del segundo injerto en 2007.
Objetivos. Estudio de la evolución de las especificidades antiHLA a lo largo del tiempo y análisis estructural de la respuesta de anticuerpos.
Materiales y métodos. Detección de anticuerpos anti-HLA-I, HLAII y MICA y estudio de sus especificidades mediante citometría de flujo. Análisis de tripletes incompatibles mediante el algoritmo Matchmaker.
Resultados. Tras el rechazo del primer injerto se detectan anticuerpos dirigidos frente a la incompatibilidad A1 y frente a antígenos con reactividad cruzada, esta respuesta estaría dirigida frente a las
regiones relacionadas con los tripletes incompatibles 9f y 90D. No se
detectan anticuerpos frente a las otras incompatibilidades del injerto.
Tras la nefrectomía se detectan anticuerpos frente a las incompatibilidades A29, B8 y B57 así como las especificidades comentadas anteriormente. El nuevo espectro de especificidades se correlaciona como mínimo con las regiones relacionadas con los tripletes 62RMN/66ASA,
62 qif y193av/207s/253q.
Tras el rechazo del segundo injerto aparece un patrón de reactividad similar al anterior. Destaca la detección de reactividad frente a la incompatibilidad A31 del segundo injerto tanto en los sueros pre- como post-TX2 y que se explica por la región que comparte con A29. No aparecen sin embargo anticuerpos frente al resto de incompatibilidades del segundo injerto. En el suero posterior
a la nefrectomía no se observan variaciones con respecto a los sueros previos.
Conclusiones: Tras el rechazo del primer injerto solo se detectan anticuerpos frente a la incompatibilidad A1, aunque la retirada
del injerto evidencia la presencia de anticuerpos frente a todas las
incompatibilidades del trasplante. El tratamiento inmunosupresor
con acondicionamiento previo ha sido efectivo en la supresión de
la respuesta humoral frente al segundo injerto. La presencia preTX2 de anticuerpos frente al antígeno A31 del segundo injerto plantea su implicación en el rechazo tardío de éste, aunque los datos
anatomo-patológicos no permiten confirmarlo. Las intensidades de
fluorescencia de los anticuerpos anti-A31 post-nefrectomía indicarían el secuestro de éstos en el injerto. La pérdida del segundo
injerto, así como su posterior extirpación no altera el patrón de anticuerpos anti-HLA.
INMUNOLOGÍA
PERFIL DE ANTICUERPOS DONANTE ESPECÍFICOS EN
PACIENTES TRASPLANTADOS RENALES CON RECHAZO
MEDIADO POR ANTICUERPOS Y DEPÓSITOS DE C4d. Caro Oleas JL1, Álvarez Márquez A1, Aguilera García I1, Gentil MA2, Acevedo
Calado MJ1, Cabello V2, Fernández J3, Wichmann Schlipf I1, González Escribano MF1, Núñez Roldán A1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio
de Nefrología. 3Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario
Virgen del Rocio
Objetivos. La producción de anticuerpos anti-HLA donante específicos post-trasplante se asocia con rechazo y fallo del injerto. Sin embargo, otros anticuerpos no HLA se asocian también al rechazo. Por otro lado,
los anticuerpos anti-GSTT1 fueron descritos por nuestro grupo en 2001 en
el suero de pacientes con trasplante hepático. Son muy específicos frente
al antígeno del donante y aparecen en pacientes que carecen del gen de la
GSTT1 cuando reciben un injerto de un donante positivo, dando lugar a
una hepatitis inmune de novo. GSTT1 se expresa además en riñón. Por
otra parte la presencia de anticuerpos frente a MICA se ha relacionado con
una menor supervivencia del injerto renal. El objetivo principal de nuestro trabajo es identificar el perfil de anticuerpos donante específicos en
pacientes con rechazo mediado por anticuerpos (RMA), que se pone de
manifiesto por la detección de anticuerpos circulantes donante específicos (ADE) y el depósito de C4d en biopsias del injerto renal
Pacientes y métodos. Se seleccionaron 19 pacientes que cumplían
los criterios histopatológicos de RMA y que presentaban depósitos de
C4d en biopsias renales. Se estudió la presencia, en sueros previos y
posteriores al trasplante, de anticuerpos anti-HLA clase I, clase II y
MICA específicos del donante mediante tecnología Luminex. Los anticuerpos anti-GSTT1 se analizaron mediante IFI y/o ELISA.
Resultados. En el momento de la biopsia, 4 pacientes (21%) tenían anticuerpos anti-HLA de clase I, tres (15.8%) anti-GSTT1, dos (10.5%)
tenían anti-HLA de clase II y dos (10.5%) tenían anti-MICA; 4 pacientes tenían una combinación de anticuerpos: HLA+MICA (n=1); HLAI + GSTT1 (n=2) y GSTT1+MICA (n=1). En 4 pacientes (21%) no se
encontró ningún anticuerpo. La presencia de anti-GSTT1 se asociaba
significativamente con RMA (p=0.026).
Conclusión. Además de los anticuerpos anti-HLA, los anticuerpos anti GSTT1 y MICA pueden estar implicados en el rechazo mediado por anticuerpos en el trasplante renal.
INMUNOSUPRESION SISTEMICA AMPLIADA EN TRASPLANTE CORNEAL CON ALTO RIESGO DE RECHAZO. Sarmiento E1,
Balado P2, Baeza A2, Vicario JL3, Acero A2, Palka M4, Carbone J1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio de Nefrología. 3Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Virgen del Rocio
1Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón. Madrid. 2Servicio
de Oftalmología. Hospital Gregorio Marañón. Madrid. 3Centro de Transfusiones. CAM. 4Facultad de Medicina. UCM. Madrid.
Introducción. Sin inmunosupresión sistémica los trasplantes corneales (TCor) de alto riesgo presentan más del 50% de rechazo en el
primer año.
Objetivo. Evaluar los riesgos y utilidad de la implementación
de un protocolo individualizado de profilaxis y tratamiento de rechazo en pacientes sometidos a TCor de alto riesgo.
Métodos. Resultados preliminares del estudio de 14 pacientes. Etiología del TCor: rechazo crónico (7; 1-3 queratoplastías previas), rechazo
agudo (1), perforaciones corneales (4), otros (2). PROTOCOLO: Pre-TCor:
COMUNICACIONES ORALES
Inmunoglobulinas séricas, subclases de IgG, complemento, proteína C
reactiva, ANA, tipaje HLA y ac citotóxicos, subpoblaciones linfocitarias,
Rx tórax, prueba tuberculínica y booster, hemograma, bioquímica, marcadores tumorales. Profilaxis de rechazo: Micofenolato mofetil (1-3g/24h
VO) profiláctico durante 1-2 años. Esta terapia es complementaria al tratamiento habitual con ciclosporina y corticoides tópicos y prednisona
oral (4-6 semanas tras el TCor). Tratamiento de rechazo: Tacrolimus (niveles 2-8 ng/ml) o Ciclosporina (niveles 125-175 ng/ml) según perfil de
efectos adversos, y prednisona a bajas dosis según respuesta. Profilaxis antiinfecciosa: Isoniacida (si riesgo de TBC) y TMP-SMX.
Resultados. Excluídos: 7, en lista de espera: 2, tratados: 5. Motivos de exclusión: tumores activos (3), enfermedad sistémica descompensada (1), infección grave activa (1), otros (2). Estudio pre-TCor:
Prueba tuberculínica o booster positivo: 4/9 pacientes; hipogammaglobulinemia: 4/14, 451-746 mg/dl; ac citotóxicos positivos: 1/12. Evolución: En 2 retrasplantes nuevos: los 2 libres de rechazo (1 en paciente con 3 injertos previos rechazados y anticuerpos anti-HLA elevados,
se realizó selección de donante sin los Ag HLA que reconoce). En 3
TCor con rechazo: 1 injerto transparente sin vascularización y buena
AV, 1 injerto transparente con persistencia de vascularización y buena
AV, 1 sin mejoría. Complicaciones: 2 episodios de infecciones respiratorias sin consolidación.
Conclusión. La aplicación del protocolo descrito podría impactar
positivamente en el resultado del TCor de alto riesgo.
SESIÓN 4: INMUNOLOGÍA TUMORAL - I
Moderadores: Dr. Francisco Ruiz-Cabello (Granada),
Dr. Ignacio Melero (Navarra)
THERAPEUTIC ANTI-TUMOR EFFICACY OF ANTI-CD137 AGONISTIC MONOCLONAL ANTIBODY IN MOUSE MODELS OF
MYELOMA. Murillo O2, Dubrot J2, Arina A2, Hervás-Stubbs S2, Melero I1. 1CIMA, Clínica Universitaria. 2CIMA.
Purpose. Eradication of post-treatment residual myeloma cells is needed to prevent relapses and immunostimulatory monoclonal antibodies
(mAbs) such as anti-CD137, CTLA-4, CD40, etc, that enhance the immune response against malignancies represent a means of achieving this purpose. This study explores anti-CD137 mAbs for mutiple myeloma (MM)
treatment in preclinical models of the disease because they safely augment
tumor immunity and are in clinical trials for other cancers.
Experimental design. The anti-tumor effect of anti-CD137 mAb
on mouse plasmacytomas derived from HOPC and NS0 cell lines was
studied and compared with that of anti-CTLA-4, anti-CD40 and antiICAM-2 mAbs. The anti-tumor effect of anti-CD137 mAb was also examined in a mouse syngeneic disseminated myeloma (5TGM1) model,
which more closely resembles human MM. Depletions of specific cell
populations and gene-targeted mice were used to unravel the requirements for tumor rejection.
Results. Agonistic mAb against CD137 and blocking anti-CTLA4 mAb showed activity against intra-peritoneal HOPC tumors, resulting in extended survival of mice that also became immune to re-challenge. Anti-CD137 mAbs induced complete eradications of established subcutaneous NS0-derived tumors that were dependent on IFNÁ, NK cells and CD8+ T lymphocytes. NK cells accumulated in tumor
draining lymph nodes (TDLNs) and showed increased IFN-γ produc-
25
COMUNICACIONES ORALES
tion. Anti-tumor efficacy of anti-CD137 mAb was preserved in CD28deficient mice, despite the fact that CD28 signaling increases the expression of CD137 on CD8+ T cells. Importantly, anti-CD137 mAb treatment significantly decreased systemic tumor burden in the disseminated 5TGM1 model.
Conclusions. Anti-CD137 mAb’s immune-mediated anti-tumor activity in mouse models holds promise for myeloma treatment in humans.
IN VIVO DEPLETION OF DENDRITIC CELLS IMPAIRS BUT
DOES NOT COMPLETELY ABROGATE THE ANTI-TUMOR
EFFECT OF AGONISTIC ANTI-CD137 MONOCLONAL ANTIBODIES. Murillo O2, Arina A2, Azpilicueta A2, Pérez-Gracia JL3, HervásStubbs S2, Melero I1. 1CIMA, Clínica Universitaria. Universidad de Navarra. 2CIMA. 3Clínica universitaria.
Anti-CD137 monoclonal antibodies (mAbs) are capable of inducing
tumor rejection in several murine syngeneic tumor models. This antitumour effect is thought to involve the activation of naive CD8 T cells
that are specific for tumor antigens cross-presented by dendritic cell
(DCs). However, whether DCs are required for the efficacy of anti-CD137
treatment has never been examined. This study investigates the involvement of DCs in the rejection of EG7-OVA tumors upon treatment with
anti-CD137 agonistic mAb. This thymoma expresses chicken ovoalbumin (OVA) as a traceable antigen to which specific immune responses
can be monitored in vivo and in vitro following anti-CD137 mAb treatment. The administration of anti-CD137 mAbs cause the eradication
of EG7-OVA derived tumors by a CD8+ T cell-dependent mechanism
that correlates with increased cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity
against the immunodominat OVA epitope. Although tumor cells are
detectable in the tumor draining lymph nodes (TDLNs) of EG7-OVAbearing mice, tumor antigen presentation to OVA-specific CD8+ T
lymphocytes in this model depends primarily on cells derived from the
host. Ex vivo analyses to determine the identity of the cell type(s) responsible for tumor antigen cross-presentation has revealed that CD11c+
cells, most likely DCs, mediate this function. Using DTR-GFP → C57BL/6
bone marrow chimeric mice, which allow for sustained in vivo ablation
of DCs with diphtheria toxin, we confirmed the involvement of this cell
subset in tumour antigen cross-presentation and in CTL induction against
EG7-OVA. However, exhaustive depletion of DCs incompletely abrogates antitumor efficacy of anti-CD137 mAb indicating that DC-mediated
cross-presentation is not an absolute requirement.
LA INMUNIZACIÓN CON VECTORES LENTIVIRALES EN RATONES TRANSGÉNICOS INDUCE RESPUESTA CELULAR Y HUMORAL FRENTE AL ANTÍGENO TUMORAL NY-ESO-1. Casado JF1,
Janda J2, Colombetti S2, Lévy F2. 1Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura. 2Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne Branch.
Los vectores lentivirales infectan células dendríticas permitiendo la expresión estable de un gen y el desarrollo de una repuesta inmune cuantitativa y cualitativamente superior. En este trabajo hemos analizado la respuesta inmune en ratones transgénicos HLA-A2+ inmunizados vía subcutánea con vectores lentivirales que codifican para el
antígeno tumoral NY-ESO-1. La inmunización subcutánea con lentivectores disparó una respuesta de células T CD8+ específicas para diferentes epítopos. Esta respuesta fue mayor y más duradera que la obtenida mediante inmunización con péptidos. Las células T CD8+ antí-
26
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
geno-específicas mostraron un fenotipo efector/memoria (CD127pos,
CD62Lneg). El análisis del repertorio de TCRs demostró un uso predominante de las cadenas Vbeta4 y Vbeta6 para el reconocimiento del
epítopo NY-ESO-1 (157-165). Se observó además una potente respuesta de células T CD4 específicas para NY-ESO-1, que incrementó significativamente la respuesta CD8 así como una fuerte respuesta humoral frente a diferentes epítopos lineales de NY-ESO-1.
En conclusión, la inmunización con el antígeno tumoral NY-ESO1 en ratones transgénicos usando vectores lentivirales estimula una
respuesta celular y humoral similar a la observada en pacientes con
tumores NY-ESO-1+.
INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR AGENTES DESMETILANTES
EN CÉLULAS T LEUCÉMICAS. Ruiz Magaña MJ, Morales Camino
JC, Ruiz Ruiz MC. 1Centro de Investigaciones Biomédicas.
La hipermetilación del ADN es un mecanismo epigenético relacionado con el desarrollo del cáncer que provoca el silenciamiento
de genes supresores de tumores. Al contrario de lo que ocurre con
los cambios genéticos, esta alteración epigenética se puede revertir
mediante agentes farmacológicos que inducen la hipometilación del
ADN, lo que sugiere el uso de las llamadas drogas epigenéticas, solas
o en estrategias combinadas, en la terapia del cáncer.
El objetivo de este trabajo es conocer el efecto que tienen los agentes desmetilantes decitabine y zebularine, solos o en combinación con
el ligando de muerte TRAIL, sobre líneas de células leucémicas T y
sobre células T no transformadas. Hemos analizado la inducción de
apoptosis por ambos agentes desmetilantes, así como la posible sensibilización a la muerte mediada por TRAIL, tanto en células T leucémicas como en T normales, mediante determinación del ciclo celular con
yoduro de propidio. También se han estudiado las señales implicadas
en la inducción de apoptosis por decitabine y zebularine y la regulación de genes pro- y anti-apoptóticos por dichos agentes, mediante las
técnicas de Western-blot y RT-PCR.
Los resultados obtenidos indican que tanto el decitabine como el
zebularine inducen apoptosis dependiente de caspasas y de la activación de la ruta mitocondrial en líneas de células T leucémicas. Sin
embargo, no son capaces de potenciar la muerte mediada por TRAIL
en este modelo tumoral. Por otro lado, se ha observado que estos agentes desmetilantes no presentan efectos sobre la viabilidad de células T
normales lo que sugiere su baja toxicidad y por tanto su posible utilización en terapia anti-turmoral.
CORRELACIÓN ENTRE LA EXPRESIÓN DE HLA DE CLASE I Y
LA PROGRESIÓN/REGRESIÓN DE LAS METÁSTASIS DE MELANOMA EN DOS PACIENTES SOMETIDOS A INMUNOTERAPIA.
Carretero R1, Romero JM1, Rodriguez AB1, Maleno I1, Camacho F2,
Rodriguez F2, Real LM3, Ruiz-Cabello F1, Garrido F1, Cabrera T1. 1Hospital Universitario Virgen de las Nieves. 2Hospital Universitario Virgen Macarena, 3Neocodex.
A pesar de los buenos resultados obtenidos por la inmunoterapia en estudios preclínicos, solo se ha conseguido una regresión tumoral significativa en una pequeña proporción de pacientes. Estos pobres
resultados pueden deberse a mecanismos de escape inmunitario por
parte de las células tumorales, uno de ellos es la alteración en la expresión de HLA de clase I.
INMUNOLOGÍA
Hemos estudiado la expresión de MHC de clase I en 16 metástasis obtenidas de dos pacientes con melanoma sometidos a inmunoterapia. Seis fueron obtenidas de un paciente tratado con vacunación
autóloga más BCG (M-VAX) y 10 de otro paciente sometido a dos tratamientos inmunoterápicos, 5 tras interferón-alfa-2b y 5 tras vacunación autóloga más BCG (M-VAX). Once de las metástasis estaban en
regresión en el momento de la extirpación mientras que 5 estaban en
progresión, según los PET y TAC realizados. Las metástasis en regresión mostraban altos niveles de expresión de HLA de clase I mientras que las metástasis en progresión tenían niveles bajos de HLA de
clase I, estos estudios se realizaron mediante técnicas inmunohistoquímicas con anticuerpos monoclonales específicos frente a diferentes
moléculas de HLA de clase I y cuantificación de la beta 2 microglobulina, cadena pesada y los locus A,B y C mediante PCR a tiempo real.
Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que la alteración en la
expresión de moléculas HLA de clase I juega un papel esencial en el
escape tumoral del sistema inmunitario que puede ser determinante
en la progresión o regresión de las metástasis. La diferente expresión
de moléculas HLA de clase I en los dos grupos de metástasis puede
ser debida a la modificación del microambiente tumoral por la inmunoterapia, la cual podría aumentar la expresión de clase I solo en las
metástasis con alteraciones reversibles.
CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES: VEHÍCULOS Y FACTORÍAS DE ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS. Compte Grau1, Sanz
Alcober L2, Vicario JL1, Álvarez-Vallina L1. 1Unidad de Inmunología Molecular, Hospital Universitario Puerta de Hierro. 2Unidad De Histocompatibilidad, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid.
Las células madre mesenquimales (MSC, del inglés Mesenchymal
Stem Cells) son células multipotentes y con alta capacidad regenerativa. En los últimos años se han desarrollado distintos ensayos para
evaluar su utilidad y su potencial terapéutico en protocolos de terapia
regenerativa y terapia celular antitumoral.
Estudios recientes han demostrado que MSCs se incorporan y
sobreviven en el microambiente tumoral donde contribuyen activamente a la formación del estroma tumoral, constituyendo así un modelo potencialmente útil para la liberación local de agentes terapéuticos.
En este trabajo nos planteamos modificar genéticamente MSCs humanas (hMSCs), obtenidas de médula ósea, para estudiar su potencial como
“factorías” de un anticuerpo biespecífico recombinante con formato diabody, con especificidad frente a la cadena epsilon del complejo TCR/CD3
humano y frente al antígeno carcinoembrionario (CEA) humano (antiCEA/antiCD3). Para llevar a cabo esta estrategia, generamos un vector
lentiviral (pRRL-dAb-IRES-GFP), derivado del HIV-1, tricistrónico que
contiene los genes del diabody biespecífico (dAb cadena 1 y dAb cadena 2) y el gen de la proteína verde fluorescente (eGFP) unidos a través de
secuencias IRES derivadas del virus de la encefalomiocarditis.
En ensayos in vitro, comprobamos que hMSCs infectadas expresaban, de forma estable, altos niveles de eGFP (85%) durante más de
un mes y secretaban niveles apreciables de diabody antiCEA/antiCD3
funcional. Empleando técnicas de imagen molecular in vivo, observamos que hMSCs se distribuían de forma homogénea en el depósito
tumoral y expresaban eGFP al menos 30 días postimplantación de una
mezcla (1:2) de hMSCs modificadas genéticamente con células tumorales gástricas humanas. El estudio inmunohistoquímico de las piezas
tumorales demostró la presencia de diabody antiCEA/antiCD3 en el
estroma peritumoral. El uso de hMSCs ofrece ventajas potenciales debi-
COMUNICACIONES ORALES
do: (i) al tropismo selectivo de este tipo celular por ciertas clases de
tumores sólidos, (ii) a la producción local y mantenida de agentes terapéuticos que, en muchos casos, presentan importantes limitaciones farmacocinéticas y de toxicidad sistémica.
ANTICUERPOS RECOMBINANTES TRIVALENTES PARA LA
IMAGEN MOLECULAR DEL CÁNCER. Cuesta Martínez A, Sánchez López M, Sanz L, Álvarez-Vallina L. Hospital Universitario Puerta
de Hierro.
El descubrimiento de los anticuerpos monoclonales y el desarrollo
de las técnicas de ingeniería genética, ha propiciado que los anticuerpos
recombinantes (AcR) se conviertan en una sólida tecnología de plataforma para producir moléculas diagnósticas, con utilidad para localizar
depósitos tumorales in vivo. Los AcR que carecen de la región Fc, como
los fragmentos scFv (del inglés, single chain Fv), ofrecen ventajas: 1) son
fáciles de producir en sistemas bacterianos, 2) se extravasan más eficazmente y 3) tienen una mayor capacidad de penetración tisular. Sin embargo, su vida media es muy corta, ya que las proteínas recombinantes con
un tamaño inferior a 60 Kd son filtradas por el glomérulo y excretadas
por la orina rápidamente. Para aumentar su vida media se han propuesto diferentes sistemas, siendo el más obvio su oligomerización. Los AcR
mas utilizados son los bivalentes con formato: diabody (scFv con linkers
cortos se impiden el apareamiento intramolecular entre dominios VH y
VL intracatenarios) y minibody (scFv unido a un dominio CH3/Fc).
En este trabajo proponemos un nuevo AcR trivalente (AcR-T) formado por un scFv unido al dominio de trimerización del colágeno
XVIII. Empleando esta estrategia se generaron AcR-Ts a partir de los
scFv: B1.8 (anti-hapteno NIP), L36 (anti-laminina) y MFE-23 (anti-CEA
humano). Todos los AcR-Ts se comportaron como trímeros en solución
y fueron muy estables. Para los ensayos de localización tumoral (tumor
targeting) los AcR-Ts se conjugaron con el fluorocromo cianina 5 (Cy5)
que emite en el infrarrojo cercano, y se emplearon técnicas de imagen molecular, que permiten una visualización no invasiva en organismos vivos, y un seguimiento continuado en tiempo real. La conjugación de los AcR-Ts con Cy5 no alteró sus características moleculares
y funcionales. Después de su administración sistémica, en ratones portadores de tumores humanos, el AcR-T B1.8 no demostró localización tumor-específica, el AcR-T MFE23¬ demostró localización específicamente en tumores CEA+, y el AcR-T L36 demostró localización
tumor-específica en todos los modelos estudiados.
Estos datos indican que el formato AcR T es un armazón con propiedades farmacocinéticas muy favorables y que equipado con un scFv
adecuado presenta una excelente capacidad de localización tumoral.
Nuestros resultados abren nuevas vías para el desarrollo de procedimientos diagnósticos no invasivos del cáncer humano.
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MODELO DE ANGIOGÉNESIS HUMANA IN VIVO MONITORIZABLE MEDIANTE TÉCNICAS DE IMAGEN MOLECULAR. Sanz Alcober L1, Santos-Valle
P1, Vicario JL2, Serrano A3, Álvarez-Vallina L1. 1Hospital Universitario
Puerta de Hierro. 2Unidad de Histocompatibilidad, Centro de Transfusión de
la Comunidad de Madrid. 3Servicio de Inmunología, Hospital Universitario
Doce de Octubre, Madrid.
El proceso angiogénico, clave en el crecimiento tumoral, implica
complejas interacciones moleculares y celulares que no pueden ser
27
COMUNICACIONES ORALES
recapituladas in vitro. Sin embargo, no disponemos de modelos in vivo
de angiogénesis humana validados para el screening de agentes potencialmente antiangiogénicos.
Recientemente se ha descrito, en ratones inmunodeficientes, la formación de vasos humanos mediante la coimplantación de células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) y células madre mesenquimales (MSC) murinas, capaces de diferenciarse en células murales
de soporte. Con el fin de desarrollar un modelo de angiogénesis humana, simple y no invasivo, células HUVEC fueron transducidas con
un vector lentiviral que codifica el gen reportero de la luciferasa. La
detección de la bioluminiscencia, producida tras la administración
intraperitoneal del sustrato, permite la monitorización no invasiva de
la actividad angiogénica de las células HUVECluc. Con el objeto de
que este modelo fuera completamente humano, las células endoteliales fueron coimplantadas con MSC humanas (HMSC) derivadas de
médula ósea.
La actividad luciferasa de las células HUVECluc implantadas en
ratones atímicos pudo ser detectada durante más de 120 días, y se correlacionó, a nivel histológico, con la formación de una vasculatura humana madura y estable. La presencia de células HMSC resultó crítica para
la maduración de la vasculatura neoformada. Para estudiar la utilidad
de este modelo de angiogénesis humana, en el screening de compuestos antiangiogénicos, un grupo de ratones portadores de estos implantes vasculares recibió el fármaco antiangiogénico SU5416. La monitorización seriada de la actividad luciferasa demostró una disminución
estadísticamente significativa de la actividad luciferasa en el grupo tratado, en comparación con el grupo control.
En conclusión, este modelo ofrece nuevas oportunidades para el
estudio longitudinal de mecanismos implicados en el proceso de neoformación vascular y la monitorización de las respuestas a agentes
inhibidores de angiogénesis.
LOS LINFOCITOS CIK (CYTOKINE-INDUCED KILLERS) EXPANDIDOS A PARTIR DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL Y SANGRE PERIFÉRICA PUEDEN SER REDIRIGIDOS MEDIANTE
ANTICUERPOS BI-ESPECÍFICOS. Bustamante L, García-Sánchez
F, Vicario JL, Balas A. Centro de Transfusión de Madrid.
Las células CIK (Cytokine-Induced Killer) son un grupo heterogéneos de linfocitos que incluyen fundamentalmente células CD3+CD8+
CD56+. Los linfocitos CD3+CD56+ están presentes tanto en sangre
periférica (1-5%), como en sangre de cordón umbilical (0,1%). Presentan capacidad antitumoral mediante mecanismos independientes
del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), habiendo demostrado especificidad por un número limitado de células diana (K562,
Jurkat), incluyendo leucemias mieloides agudas y crónicas, así como
linfomas B.
Partiendo de unidades de cordón umbilical y sangre periférica de
individuos sanos se han realizado expansiones 'in vitro'. Mediante el
empleo de IFNγ, OKT3 e IL-2, se ha conseguido expandir en 21 días 1.461
veces la población inicial de células CD3+CD56+ presente en sangre periférica, y hasta 3.000 veces en 14 días, la misma población presente en
unidades de cordón umbilical. Todas las poblaciones incrementan la
intensidad de expresión del receptor de activación NKG2D, así como de
perforina, indicando un incremento en la capacidad citotóxica de las
células. Tras 14-21 días de expansión los cultivos se componen de células CD3+ 96,2 ± 0,9, CD8+ 60% ± 12, CD4+ 40 ± 10. La población
CD3+CD56+ no demostró uso preferencial de ninguna cadena V.
28
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Se estudió la citotoxicidad de las células expandidas y de las diferentes sub-poblaciones mediante ensayos de liberación de 51Cr. No se
observaron diferencias en la capacidad de lisis entre cultivos expandidos a partir de células de cordón umbilical y sangre periférica.
La comparación de la citotoxicidad exhibida por las sub-poblaciones CD8+CD56+ y CD8+CD56- demostró que si bien ambas presentan capacidad citotóxica, esta es superior en la población CD56+. Se
evidenció citotoxicidad frente a líneas celulares con ausencia o disminución en la expresión de moléculas HLA de clase I, sugiriendo el
empleo de mecanismos TCR independientes de citotoxicidad.
Las células CD8+CD56+ presenta capacidad lítica frente a un número determinado de células diana. Con el fin de determinar si las células CD3+CD56+ pueden ser re-direccionadas frente a células dianas
no susceptibles, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales biespecíficos, empleamos tetrámeros bi-específicos CD3:CD20 y
CD3:CD19. Utilizando esta aproximación hemos conseguidos incrementar de forma significativa la citotoxicidad de los cultivos de células totales así como de poblaciones CD3+CD56+ tanto frente a líneas
tumorales CD19+ y CD20+ como a células leucémicas primarias.
UTILIDAD Y RIESGOS DE LA DETECCIÓN DEL FENOTIPO ABERRANTE CD19+CD10+CD38-/+ EN LA ENFERMEDAD MÍNIMA
RESIDUAL. Alcalá Peña MI, Rodríguez Martín E, Martínez Viñambres E, Coll Martí J, Roldán E. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Introducción. La detección de fenotipos aberrantes en los blastos
de las leucemias agudas (LA) al diagnóstico resulta fundamental en el
seguimiento de la enfermedad mínima residual (EMR). Sin embargo,
no siempre se tienen datos disponibles sobre la aparición de tales poblaciones en otro tipo de patologías o en médulas óseas (MO) en reconstitución.
Objetivos. Estudiar la expresión de distintos antígenos de superficie en precursores B de pacientes con leucemia linfoide aguda (LLA),
otras patologías y MO sanas, con el fin de determinar si dicha expresión es útil en el estudio de la EMR.
Métodos. Detección de linfocitos B (LB) CD10+CD38-/+ (baja intensidad) en MO por citometría de flujo (CTF). Se tuvieron en cuenta aquellos eventos que por tamaño, granularidad e intensidad de CD19 podían considerarse LB viables. Determinación de la capacidad proliferativa de LB CD10+ por BrdU.
Resultados. Se estudiaron por CTF muestras de diez pacientes
con el objeto de detectar un fenotipo considerado clásicamente aberrante: CD19+, CD10+, CD38-/+ (baja intensidad). Cinco fueron controles sanos, dos leucemias mieloides agudas en remisión completa, dos leucemias crónicas y un LNH. En 5 de ellos no se detectaron
células con dicho fenotipo, mientras que en los casos restantes sí se
detectaron estas células, con un porcentaje comprendido entre
0,0034%-0,029% sobre la celularidad total (media de 0,015%). Por otro
lado, el índice proliferativo de esta subpoblación de precursores B
(células BrdU+) fue variable (5,79%-23,88%), al igual que el observado en enfermos con LLA (1,48%-13,54%), por lo que tal característica no diferenció a las células de enfermos con LLA de las de los otros
grupos.
Conclusiones. Aunque el fenotipo aberrante CD19+CD10+CD38/+ (baja intensidad) puede considerarse como un fenotipo útil en el
seguimiento de la EMR, su detección en enfermos de LLA en porcentajes inferiores al 0,03% de la celularidad total medular no excluye la
posibilidad de que se trate de blastos linfoides normales.
INMUNOLOGÍA
DETECCIÓN DE CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES EN UN
LINFOMA DE EFUSIÓN PRIMARIA. Alcalá Peña MI, Martínez
Viñambres E, Villar Guimerans ML, Benito Berrinches A, Coll Martí
J, Roldán Santiago E. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Introducción. El linfoma de efusión primaria (PEL), un tipo de linfoma de cavidades, se caracteriza por efusiones y crecimiento en fase
líquida de células tumorales dentro de cavidades corporales, en ausencia de un tumor sólido, además de infección por herpesvirus 8. Aunque se ha descrito que el PEL posiblemente se origine en los centros
germinales o postgerminales de los ganglios, hasta el momento no se
ha descrito la presencia de células tumorales circulantes.
Objetivos. Descripción inmunofenotípica de un caso de PEL en
líquido ascítico (LA) en varón VIH- y detección de células clonales
en sangre periférica (SP) como posibles células precursoras.
Métodos. Muestras de SP, médula ósea (MO) y LA. El estudio de
las poblaciones se llevó a cabo por citometría de flujo.
Resultados. Paciente diagnosticado desde 2001 de una leucemia
mielo-monocítica crónica (LMMC). En 2007 el paciente desarrolló ascitis en la cavidad abdominal. En la muestra de LA estudiada se detectó una población mayoritaria (87% de la celularidad total) con características citológicas aberrantes y cuyo perfil antigénico no correspondía con el de la LMMC original. Los resultados inmunofenotípicos descartaron población blástica, de estirpe mielo-monocítica o linfoide. Sin
embargo, dicha población presentaba fenotipo de célula plasmática
(CP), con fenotipo CD38+ high, CD138+, CD19-, inmunoglobulina (Ig)
de superficie -, kappa citoplásmica+. Mediante la técnica de inmunofijación no se detectó Ig clonal ni en LA ni en suero.
Además de la población descrita, se detectó tanto en SP como en
MO una población de linfocitos B (LB) CD19+ con una intensidad de
CD79b inferior a lo habitual y kappa de superficie +.
Conclusión. Por vez primera se detecta una población tumoral circulante en un PEL, cuyo perfil antigénico (LB con una pérdida parcial
de CD79beta) sugiere una fase madurativa previa a la población mayoritaria que se detecta en LA (célula plasmática o pre-plasmática).
SESIÓN 5: INMUNODEFICIENCIAS: ALERGIA Y COMPLEMENTO
Moderadores: Dra. Margarita López-Trascasa (Madrid),
Dra. Núria Matamoros (Palma de Mallorca)
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS SOCS EN LINFOCITOS CD4+ Y EOSINÓFILOS DE PACIENTES CON PATOLOGÍA
RESPIRATORIA. López Cernada ME1, Sastre B1, Gámez C1, Chacártegui M1, del Álamo C1, Cárdaba B1, Palomino P2, Lahoz C2, del Pozo
V2. 1Fundación Jiménez Díaz-Capio y Ciberes (ISCII). 2Fundación Jiménez
Díaz-Capio.
Introducción. Los supresores de la señalización de citocinas (SOCS)
representan una familia de proteínas descubierta recientemente que están
implicadas en la regulación negativa de la señalización de citocinas, asociada a la ruta JAK-STAT. Se ha visto que la señal reguladora a través de
miembros SOCS puede tener un papel importante en el balance de citocinas que determinan las respuestas mediadas por Th1 y Th2. SOCS-3
y SOCS-5 son principalmente expresadas en Th2 y Th1 respectivamente y ejercen una inhibición recíproca sobre la diferenciación de dichas
células Th. Estudios recientes han descrito a SOCS-3 como un nuevo
COMUNICACIONES ORALES
marcador de enfermedades alérgicas, ya que la expresión de dicha proteína se relaciona directamente con la severidad de la enfermedad.
Objetivo. Estudiar la expresión de las proteínas SOCS-1, 3 y 5 en
linfocitos CD4+ y eosinófilos de sangre periférica de pacientes con patología respiratoria Th2 (asma extrínseco y bronquitis eosinofílica) e individuos sanos.
Metodología. Se analizó por PCR cuantitativa a tiempo real, los
niveles de expresión génica de SOCS-1,3 y 5 en los linfocitos CD4+ y
eosinófilos de sangre periférica de pacientes con patología respiratoria (asma extrínseca y bronquitis eosinofílica) y donantes sanos. También se realizó un análisis inmunohistoquímico y por inmunofluorescencia en los eosinófilos para corroborar la expresión de la proteína SOCS-3 en dichas células.
Resultados y conclusiones. Los resultados en los linfocitos CD4+
indican que hay diferencias en la expresión de los genes de SOCS-1 y
SOCS-3, siendo este último mayor en el grupo de sujetos enfermos
frente a los individuos sanos. Sin embargo, no existen diferencias estadísticamente significativas, entre los grupos de sujetos, en la expresión
de SOCS-5. En el caso de los eosinófilos, se encuentran diferencias en
la expresión de SOCS-3, siendo más elevada en los eosinófilos de los
pacientes. Por lo tanto, se describe por primera vez la expresión de las
proteínas SOCS en los eosinófilos humanos, existiendo una correlación en los niveles de SOCS-3 en linfocitos CD4+ y eosinófilos de pacientes, postulando a SOCS-3 como un marcador de enfermedad.
MUTACIONES EN STAT3 EN EL S. DE HIPER IgE. Español Boren1,
Garces P1, Caragol I1, Hernández M1, Soler P2, Woellner C3, Grimbacher B3. 1U. Immunologia. H. Vall d´Hebron.Barcelona. 2U. Infecciosas e
Inmunodeficiencias pediatricas. H. Vall D´Hebron. Barcelona. 3Immunology
and Molecular Pathology. Dept. Royal Free Hospital. Londres.
Objetivos. El síndrome de Hiper Ig E (HIES) es una inmunodeficiencia primaria (IDP) caracterizada por infecciones recurrentes por hongos y bacterias, eczema, fracturas óseas espontáneas, lesiones intraorales, eosinofilia y niveles elevados de Ig E > 2000 IU/ml. Los patrones clínicos, inmunológicos y hereditarios son altamente heterogéneos, y el
diagnostico diferencial difícil en muchas ocasiones.
Se presentan datos clínicos de nuestra serie de casos con los primeros análisis mutacionales.
Material y Métodos. Revisión de antecedentes clínicos, familiares
e inmunológicos de cinco pacientes diagnosticados de HIES desde 1979
y el posterior análisis mutacional.
Resultados. Los pacientes (3 hombres y 2 mujeres) de entre 4 y 40
años de edad, se diagnosticaron de HIES. La infección por Cándida y/o
Aspergillus fue detectada en cuatro de cinco casos. Dos pacientes presentaron neumonia por Staphylococcus aureus con neumatoceles secundarios y fallecieron a los 4 y 14 años de edad. Las dos mujeres se diagnosticaron a los 2 y 30 años de edad. Actualmente ambas presentan secuelas pulmonares y reciben tratamiento antibiótico profiláctico y gammaglobulina ev en la primera paciente.
Los niveles de IgE oscilaron entre 2500 y 32000 IU/ml. Se han demostrado dos mutaciones diferentes en el gen STAT3 (cambios aminoacídicos N466T y R382Q) según estudio realizado en el Royal Free Hospital de Londres, en un caso familiar (herencia autosómica dominante) y
en uno aislado, respectivamente. Los demás casos están en estudio.
Conclusiones. HIES es una IDP muy poco frecuente y de clínica
muy heterogénea. Los estudios genéticos abren una puerta importante
para facilitar el diagnóstico específico y permitir el consejo genético.
29
COMUNICACIONES ORALES
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS ALERGENOS
DEL EXTRACTO DEL POLEN DE SENECIO JACOBEA. Gámez
Gámez C1, Luengo O2, Mollá R1, López E1, Sastre B1, Lahoz C1, del Pozo
V1. 1Fundación Jiménez Díaz-Capio y Ciberes. 2Hospital Vall d´Hebrón. Barcelona.
Introducción. La familia de las Asteraceae es una de las familias
más representadas con más de 1100 géneros y 20000 especies. Aunque
cosmopolita, principalmente se localiza en las regiones templadas y
subtropicales; en la Península Ibérica han sido descritas más de 1500
especies siendo Senecio vulgaris y Senecio jacobea las más comunes.
Objteivos. Determinar la importancia alergénica de S. jacobea e
identificar sus alergenos principales; así como estudiar si presenta reactividad cruzada con otras plantas.
Material y Metodos. Se reclutan 50 pacientes con rinoconjuntivis y
prueba cutánea positiva frente a extracto de S. jacobea. La identificación
de sus alergenos se ha llevado a cabo mediante SDS-PAGE, geles 2D e
inmunodetección. Posteriormente, la identificación de estos alergenos ha
sido realizada por espectrometría de masas y los resultados obtenidos
comprobados por inmunoblot y microarray. Se realizan inmunoblot y
ELISA de inhibición para estudiar la reactividad cruzada de S. jacobea
con otras especies de la misma familia y con Parietaria judaica.
Resultados. El extracto del polen de S. jacobea presenta bandas de
proteínas entre 14-100KDa. Se han identificado 3 alergenos mayoritarios de 59, 39-42, y 31KDa. El análisis 2D revela 8 spots de alrededor
de 59KDa y 39-42KDa. Estos spots han sido identificados como malato deshidrogenasa y pectato liasa por espectrometría de masas. Se ha
comprobado que la malato deshidrogenasa y la pectato liasa son alergenos de S. jacobea ya que son reconocidos por los sueros de los pacientes alérgicos. Los ensayos de inhibición demuestran la existencia de
reactividad cruzada entre S. jacobea y Artemisia vulgaris, así como entre
S. jacobea y P. judaica.
Conclusión. Se ha demostrado que S. jacobea es una nueva fuente
alergénica y presenta reactividad cruzada con A. vulgaris y P. judaica.
Se han identificado dos alergenos mayoritarios, una pectato liasa
(alergeno ya descrito en Artemisia y Ambrosía) y una malato deshidrogenada, siendo la primera vez que esta enzima se describe como
alergeno en plantas.
PAPEL DEL GEN TACI EN PACIENTES CON DEFICIENCIA DE
IgA EN POBLACIÓN ESPAÑOLA. López Mejías R1, del Pozo N1,
García-Rodríguez MC2, Ferreira A2, Gómez de la Concha E1, Fontán
G2, Núñez C1, Fernández-Arquero M1. 1Servicio Inmunología Clínica. Hospital Clínico San Carlos. 2Servicio de Inmunología Clínica. Hospital La Paz.
La deficiencia selectiva de IgA (DIGA) es la inmunodeficiencia primaria más común en caucásicos. Presenta un importante componente genético pero hasta el momento sólo se ha descrito asociación con
diversos alelos del HLA, que explican el 40% de la influencia genética. TACI (transmembrane activator and CAML interactor), codificado
por TNFRSF13B, es un receptor de la superfamilia de TNFR, presente en la superficie de linfocitos B periféricos. La unión de su ligando,
APRIL (a proliferation-inducing ligand), induce el cambio de isotipo
(fundamentalmente a IgA e IgG) independientemente de las células T.
Mutaciones funcionales en TNFRSF13B se han visto asociadas al síndrome variable común (SVC), y se ha postulado un posible papel en
DIGA. Nuestro objetivo fue analizar la posible influencia de polimorfismos en este gen en pacientes españoles con DIGA.
30
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Realizamos un estudio caso-control con 199 enfermos y 389 controles sanos. Se estudiaron con sondas Taqman 3 mutaciones funcionales descritas (C104R, A181E, R202H) y 8 SNPs adicionales (rs3751988,
rs34562254, rs3818716, rs2274892, rs4985700, rs8074984, rs4985762,
rs8079130) para estudiar la variabilidad del gen. Las diferencias en frecuencias genotípicas y alélicas fueron comparadas por el test chi-cuadrado o test exacto de Fisher. Las frecuencias haplotípicas se estimaron mediante el algoritmo EM (Expectation-Maximization).
Todos los polimorfismos se ajustaron a las proporciones HardyWeinberg en nuestra muestra control. Ningún polimorfismo mostró
diferencias significativas entre casos y controles. Sin embargo, se encontró un haplotipo constituido por esos 8 SNPs cuya frecuencia estaba
incrementada en pacientes: 8,9% en enfermos vs. 5,1% en controles,
p=0,002; pc.
Nuestros datos preliminares sugieren que algún elemento en
TNFRSF13B, distinto de los asociados a SVC, puede modular la predisposición a padecer DIGA. En la actualidad, pretendemos confirmar
esta asociación en una muestra familiar de DIGA y pacientes con SVC.
LA MUTACIÓN GLY90SER EN EL GEN CD8A, CAUSANTE DE
INMUNODEFICIENCIA DE CD8, SE CONFINA EN POBLACIÓN
GITANA ESPAÑOLA. Mancebo Sierra ME1, Moreno Pelayo MA2,
de la Calle Martín O3, Allende Martínez LM1, Kalaydjieva L4, Bertranpetit J5, Coto E6, Calleja Antolín S1, Ruiz Contreras J7, Paz Artal E1.
1Servicio de Inmunología. Hospital Universitario 12 de Octubre. 2Unidad de
Genética Molecular. Hospital Ramón y Cajal. 3Servei d'Immunologia. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. 4Western Australian Institute for Medical
Research and Centre for Medical Research. University of Western Australia.
5Unitat de Biologia Evolutiva, Departament de Ciencies Experimentals i de
la Salut. Universitat Pompeu Fabra. 6Unidad de Genética. Hospital Universitario Central de Asturias. 7Unidad de Inmunodeficiencias. Hospital Universitario 12 de Octubre.
En este trabajo se describe el segundo caso de inmunodeficiencia
de CD8, confirmando que el efecto patogénico de la mutación
p.Gly90Ser consiste en una ausencia completa de linfocitos T CD8+,
aunque las manifestaciones clínicas varían en severidad. Al igual que
el primer caso descrito, este paciente es de origen gitano español y
homocigoto para la mutación p.Gly90Ser en la cadena alpha del CD8.
El paciente sufrió infecciones respiratorias de repetición desde la infancia pero con conservación del parénquima pulmonar, al contrario que
el primer paciente, que murió debido al daño respiratorio. Se ha desarrollado un método de screening de la mutación por PCR-RFLP con la
enzima de restricción AluI, para el estudio de un total de 1127 controles no relacionados: 734 de origen gitano y de diferentes localizaciones geográficas de Europa, y 393 controles españoles (no gitanos).
Los resultados indican que p.Gly90Ser está confinada a la población
gitana española, donde la tasa de portadores es del 0,4%. El análisis de
microsatélites flanqueantes del gen CD8A mutado (D2S2232, D2S388,
D2S417, STSCD8A, STSCD8B, D2S2216, D2S2181), reveló un único
haplotipo polimórfico lo que sugiere un origen común para la mutación p.Gly90Ser que causa la deficiencia de CD8 en la población gitana española. La inmunodeficiencia de CD8 debe tenerse en cuenta en
el diagnóstico de gitanos españoles con infecciones recurrentes, para
establecer recomendaciones específicas en vacunación y en hábitos de
salud y para el consejo genético de familias afectadas.
Molecular Immunology 45(2):479-84; 2008.
Financiación FIS PI06/0170 y PI06/0614
INMUNOLOGÍA
SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH CAUSADO POR UNA
MUTACIÓN PREVIAMENTE ASOCIADA A XLT. Martínez-Martínez L1, González-Santesteban C1, Ribes S2, Badell I3, de la Calle-Martín O1. 1Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. 2Hospital Sant Joan de Deu.
3Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Pediatría).
El Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enfermedad ligada al X que se caracteriza por trombocitopenia con microplaquetas,
eczema e infecciones recurrentes, y que está causada por alteraciones
en el gen WASP. Mutaciones en este gen también son responsables
de la trombocitopenia ligada al X (XLT), que cursa sólo con trombocitopenia y microplaquetas.
Presentamos el caso de un niño de 1 año de edad, segundo hijo de
padres no consanguíneos, que a partir de los 3 meses padece diarreas sanguinolentas sin relación clara con infección y un eczema mediosevero. El examen hematológico reveló trombocitopenia con plaquetas pequeñas. Los estudios de función linfocitaria mostraron una respuesta aloreactiva alterada, mientras que la respuesta a mitógenos estaba conservada. El análisis de las inmunoglobulinas mostró una IgE elevada (764 UI/mL).
El estudio de la proteína WASP en linfocitos T activados del paciente mediante citometría de flujo y western blot mostró una ausencia
completa de dicha proteína. El estudio del cDNA de WASP reveló la
falta de tránscrito normal y la presencia de uno de mayor tamaño que
contenía un fragmento del intrón 6. La secuenciación del gen WASP
determinó que el paciente tenía la mutación IVS6+5:G>A, que provoca una alteración en el splicing, incorporando 38 nucleótidos con un
codón stop. La madre era la única portadora de la mutación (mutación
de novo).
La mutación IVS6+5:G>A ha sido reportada en pacientes con XLT
asociada a tránscritos normales residuales que comportan una expresión disminuida de la proteína. Nuestro paciente presenta una ausencia total de tránscrito normal y, con ella de proteína, lo que explicaría
el fenotipo de WAS y no de XLT.
El paciente fue sometido a un trasplante de progenitores hematopoyéticos procedentes de su hermano mayor, HLA idéntico. El análisis de la expresión de la proteína WASP en linfocitos T activados
mediante citometría de flujo ya mostraba una reexpresión de dicha
proteína 3 semanas después del trasplante.
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA PRIMERA MUTACIÓN DE NOVO EN UN PACIENTE CON DEFICIENCIA DE C5.
López Lera A1, Garrido S1, Mena de la Cruz R1, Ramos JM2, Fontán G1,
López Trascasa M1. 1Hospital Universitario La Paz. 2Hospital General Universitari d'Elx.
El componente C5 del sistema del complemento es esencial para
la formación del complejo de ataque a membrana en las rutas clásica,
alternativa y de las lectinas. Su deficiencia causa una enfermedad autosómica recesiva que se asocia generalmente con episodios de meningitis recurrentes por N. meningitidis.
Aquí presentamos el caso de un paciente que sufrió varios episodios de meningitis bacteriana durante la infancia, con ausencia total
de C5 en suero y perteneciente a una familia sin historia de consanguinidad.
Por nefelometría se obtuvieron valores normales de C3 y C4 para el
propositus, así como para sus padres y sus dos hermanos. La actividad hemolítica de las rutas clásica y alternativa (CH50, AP50) era nor-
COMUNICACIONES ORALES
mal en todos los miembros de la familia excepto en el propósitus, en el
que era indetectable y se reconstituía con la adición de C5 purificado.
Se analizó el gen de C5, localizado en el cromosoma 9, mediante
RT-PCR de 6 fragmentos solapantes a partir de RNA total obtenido de
sangre periférica, detectándose la sustitución AG>CTCT en el exón 15
del propósitus y en su padre. Esta mutación afecta a una putativa
secuencia exónica reguladora del splicing (ESE) y causa skipping del
exón 15, generando una proteína truncada en el extremo C-terminal
de la cadena alfa, que no es secretada. La secuenciación del DNA genómico de los 41 exones de C5 reveló una segunda mutación de novo y
en trans respecto a la anterior, Y846H, presente solo en el propósitus.
En conclusión, aquí describimos el primer caso de un deficiente
de C5 heterocigoto compuesto para dos mutaciones, de las que una es
de novo.
EL FACTOR NEFRÍTICO (C3Nef), UN AUTOANTICUERPO DIRIGIDO FRENTE A LA C3 CONVERTASA DEL COMPLEMENTO:
ASOCIACIONES CLÍNICAS Y ANÁLISI DE FACTORES QUE PUEDEN MODULAR LA APARICIÓN DE ESTE AUTOANTICUERPO.
Domínguez MA1, Garrido S1, Vlagea A1, Martínez Ara J1, Fontán Casariego G1, Lutz H2, Harris C3, Rodríguez de Córdoba S4, López Trascasa M1. 1Hospital Universitario La Paz. Madrid. 2Institute of Biochemistry
Eth, Zurich. 3School of Medicine, Cardiff University. 4Centro de Investigaciones Biológicas. CSIC. Madrid.
La Glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP) es una nefropatía caracterizada por depósitos de C3, en la que a menudo se detecta la presencia de un autoanticuerpo (autoAc), C3Nef asociado a la activación de la vía alternativa del sistema del complemento. Recientemente se ha puesto de manifiesto la existencia de mutaciones/polimorfismos en genes reguladores de la C3 convertasa de la vía alternativa, tanto en el Síndrome Hemolítico Urémico (SHU) como en la
GNMP. Se desconoce si este autoAc puede estar relacionado con la aparición de la enfermedad o con la evolución clínica de la misma.
En la presente comunicación se presentan varios pacientes con este
autoAc.
1. Paciente diagnosticado de GNMP tipo II hace más de 25 años, en
el que se detectó la presencia de este autoAc durante 10 años. Un
análisis detallado de su especificidad ha mostrado la existencia de
Ac anti-C3 y anti-idiotipo. Recientemente, estudios genéticos en
este paciente han mostrado la existencia de dos mutaciones en el
gen de factor H, análogas a las encontradas en pacientes con SHU.
2. Paciente diagnosticado de GNMP tipo II, presentaba además del
autoAc un polimorfismo en factor B. En este paciente se observó
que el efecto estabilizador en la C3 convertasa sólo se debía al C3Nef.
3. Se ha encontrado la presencia de C3Nef en al menos dos pacientes sin ninguna evidencia de glomerulonefritis. Una de las pacientes había sufrido meningitis y la segunda una neumonía con derrame pleural.
4. Paciente con un pico monoclonal y un consumo elevado de todos
los componentes iniciales del complemento. La IgG purificada del
suero de esta paciente no es capaz de estabilizar la C3 convertasa de la vía alternativa por lo que vamos a explorar si pudiera estar
dirigido frente a la C3 convertasa de la vía clásica o del complejo
de ataque.
Estos resultados nos llevan a considerar que la desregulación inducida por C3Nef podría tener distintos efectos fisiopatológicos lo que
explicaría su asociación con patologías variadas.
31
COMUNICACIONES ORALES
DEFICIENCIA RECESIVA PARCIAL DE IFN-GAMMAR1 (IFN-GR1).
Sologuren I1, García-Laorden I1, Santiago E1, Hernández-López J1, Domínguez A1, Gonzalez-Quevedo N1, Chapgier A2, Florido Y1, Casanova J-L2,
Rodríguez Gallego JC1. 1Servicio de Inmunología. Hospital Universitario
de Gran Canaria Dr. Negrín, Las Palmas de Gran Canaria. 2Dpto. de Genética Humana de Enfermedades Infecciosas, Universidad René Descartes, Paris.
La deficiencia de IFN-γR1 se ha descrito en pacientes con infección grave por micobacterias ambientales, BCG, o raramente por Mycobacterium
tuberculosis. No suele observarse otro tipo de infecciones, excepto salmonelas en algunos casos. La mayoría presentan un defecto recesivo completo (RC, 27 pacientes) o dominante parcial (DP, 54 pacientes). El defecto DP
expresa receptores anómalos que ejercen un efecto dominante, y responden a antimicobacterianos, y a IFN-γ. En ocasiones presentan recidivas. En
el defecto RC no se expresa el receptor o expresan receptores mutados que
no unen IFN-γ, la micobacteriosis es crónica y no se resuelve con el tratamiento; el único tratamiento efectivo es el TMO, en su ausencia los pacientes fallecen antes de los 12 años. Se han descrito 3 pacientes con defecto
recesivo parcial (RP) debido a la mutación I87T, clínicamente menos severos que el defecto RC. Se presenta el estudio inmunológico y clínico de 6
pacientes homocigotos para la mutación I87T y 4 pacientes homocigotos
para V63G, la cual se creía que causaba un defecto RC. Se han desarrollado diversas técnicas que permiten afirmar que los homocigotos para V63G
presentan un defecto RP. De los 10 pacientes, 4 presentaron BCGosis tras
vacunación y 1 tuberculosis clínica. Los 6 pacientes con infección por micobacterias no-BCG presentaron la enfermedad con una media de 11±9 años
(1,8-22 años). No se han observado recurrencias, y todos los pacientes han
sobrevivido hasta una edad media de 15,6±11,4 años (5 son mayores de 21
años). Sólo 1 paciente ha presentado salmonelosis. Como en el defecto DP,
es frecuente la osteomielitis como única presentación, lo que no ha ocurrido en ningún paciente con defecto RC. Esta IDP es más frecuente de lo sospechado inicialmente, puede debutar en edad adulta y no se aconseja TMO.
En vista de las importantes implicaciones de pronóstico y tratamiento es
indispensable un meticuloso diagnóstico inmunológico y molecular en
pacientes con deficiencia de IFN-γR1.
AUTOINMUNIDAD Y CÁNCER EN LA DEFICIENCIA DEL RECEPTOR BETA-1 DE LA IL-12 (IL-12RB1). ESTUDIO DE LINFOCITOS
TH1, TH2 Y TH17. García Laorden MI1, Sologuren I1, Santiago E1, Caragol I2, Hernández-López J1, Florido Y1, Domínguez A1, Fieschi C3, Casanova J-L3, Rodríguez-Gallego C1. 1Servicio de Inmunología. Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, Las Palmas de Gran Canaria. 2Servicio de Inmunología. Hospital Vall d'Hebron, Barcelona. 3Laboratory of Human
Genetics of Infectious Diseases, University of Paris René Descartes, Paris.
IL-12RB1 forma parte del receptor de la IL-12 y de la IL-23. Los pacientes con deficiencia de IL-12RB1 son susceptibles a infección grave por
micobacterias. La recurrencia es muy rara y la vacunación con BCG parece prevenir de posteriores infecciones por micobacterias, sugiriendo la
existencia de repuesta secundaria. La salmonelosis es menos frecuente.
En ratón, IL-12 e IL-12R son necesarios para la generación de linfocitos
Th1, la IL-23 es necesaria para la expansión de linfocitos Th17, e IL-12/IFNγ e IL-23/IL-17 están implicados en autoinmunidad y cáncer.
Se estudiaron 6 pacientes de dos familias con deficiencia de IL12RB1. Cuatro presentaron infecciones diseminadas por salmonellas
y uno por M. avium. Dos padecieron infección por M. tuberculosis
(MTBC), y su hermana de 21 años, con la deficiencia, nunca ha presentado infecciones reseñables. Un paciente falleció a los 7 años con ane-
32
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
mia y trompocitopenia autoinmunes, y otro a los 29 años por carcinoma epidermoide de esófago. Los pacientes producían cantidades
normales de IFN-γ en respuesta a PHA y BCG, aunque no respondían
a IL-12, y prácticamente no se observó producción de IL-17. El análisis de Th1 y Th2 también mostró valores normales. Por otra parte, la
paciente sana presentó una alta producción de IFN-gamma y TNF-α.
El estudio de linfocitos de memoria mostró que no se producía IFN-γ
en respuesta a S. enteritidis, toxoide tetánico y Cándidas, y el análisis
de producción de IFN-gamma en repuesta a antígenos de M. tuberculosis (Quantiferon TB-Gold) fue negativo en los tres pacientes de la
familia con dos afectos de MTBC. La presentación de autoinmunidad y cáncer amplia el espectro clínico de la deficiencia de IL-12RB1.
En humanos con ausencia de señalización IL-12 e IL-23, se observa tras
activación policlonal un número normal de linfocitos Th1, un profundo defecto de Th-17, y no se observa incremento de Th2. No se ha detectado la presencia de células de memoria productoras de IFN-γ.
ESTUDIO DEL GEN TNFRSF13B EN LA INMUNODEFICIENCIA
VARIABLE COMÚN. PAPEL DE LA MUTACIÓN p.C104R. Martínez-Pomar N1, Detkova D2, Arostegui JI3, Escobar D1, Ferrer J1, Serra
A1, Vidaller A4, Soler P5, Vendrell M6, Alvarez A6, de Gracia J6, Caragol I2, Español T2, Yagüe J3, Matamoros N1, Hernández M2. 1Servicio
de Inmunología. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. 2Unidad de Inmunología. Hospital Vall d'Hebron. Barcelona. 3Servicio de Inmunología. Hospital Clinic. Barcelona. 4Servicio de Medicina Interna. Hospital Bellvitge. Barcelona. 5Unidad de Inmunología Pediátrica. Hospital Vall d'Hebron. Barcelona. 6Servicio de Neumología. Hospital Vall d'Hebron. Barcelona.
La inmunodeficiencia variable común (IVC) es la inmunodeficiencia predominante de anticuerpos sintomática de mayor prevalencia.
Aproximadamente el 10% de pacientes presentan mutaciones en
TNFRSF13B que codifica para la proteína TACI. Se han identificado 17
variantes alélicas, si bien, sólo se ha demostrado alteración en la expresión y/o funcionalidad de TACI en algunas de ellas (p. ej. p.C104R).
Objetivo. Analizar el gen TNFRSF13B en pacientes con IVC.
Material y métodos. Secuenciación directa del gen de TNFRSF13B
en 98 IVC y en 198 controles sanos.
Resultados. El análisis mutacional entre los pacientes identificó 4
individuos homocigotos y 2 heterocigotos sencillos para la mutación
p.C104R y 1 individuo heterocigoto compuesto p.C104R/p.A181E. Entre
otras variantes describimos 1 homocigoto y 2 heterocigotos para p.L171R;
3 heterocigotos sencillos para cada una de las variantes: p.C89Y, p.E117G,
p.E140K. El análisis de 29 familiares de primer grado de pacientes con
la mutación p.C104R reveló dicha variante en 19 individuos sin patología infecciosa (16 heterocigotos, 3 homocigotos y 1 heterocigoto compuesto p.C104R/p.A181E). Los niveles séricos de IgG en 2 familiares
homocigotos y en el heterocigoto compuesto se hallaron en el límite inferior de la normalidad. El análisis de 198 controles sanos (Igs normales), reveló 5 individuos heterocigotos para p.C104R.
Discusión. Células B de pacientes homocigotos para p.C104R presentaron alteraciones en su función (Saltzer et al). Garivan et al. sugirieron un efecto dominante-negativo para esta mutación en heterocigosis. Sin embargo, en nuestra serie de controles sanos y familiares de primer grado, observamos un elevado porcentaje de heterocigotos (n=21)
y homocigotos (n=3) sin expresión clínica, lo que indicaría que la mutación p.C104R tiene una penetrancia variable, secundaria a un sistema
redundante de señalización. Se está estudiando la posible relación de
las variantes p.C89Y, p.E117G y p.E140K y la funcionalidad de TACI.
INMUNOLOGÍA
ASOCIACIÓN FENOTIPO-GENOTIPO EN DOS CASOS DE SÍNDROME DE INMUNODISREGULACIÓN, POLIENDOCRINOPATÍA Y ENTEROPATÍA LIGADA AL CROMOSOMA X (IPEX). Escobar D1, Álvarez Doforno R2, Julià MR1, Delgado Cerviño E2, Martínez-Pomar N1, Melgosa M2, Lamas R2, Rosell A3, Fontan Casariego
G2, Matamoros N1. 1Servicio de Inmunología. Hospital Son Dureta. Palma
de Mallorca. 2Servicio de Inmunología. Hospital La Paz. Madrid. 3Servicio de
Pediatría. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca.
Introducción. IPEX es un síndrome secundario a mutaciones en FOXP3,
ligado al cromosoma X, caracterizado por poliendocrinopatía autoinmune en el primer año de vida, enteropatía y dermatitis eczematosa.
Caso 1. Varón: a los 2 meses enteropatía grave de evolución tórpida
y dermatitis eczematosa. Requiere: corticoides, gammaglobulina intravenosa (IVIG) y tacrolimus. A los 6 meses: bacteriemias múltiples e hiperglucemia ocasional controlada con insulina y posterior normalización.
Evolución favorable. Tratamiento de mantenimiento: IVIG. A los 3 años
retraso pondoestatural, debut brusco diabetes insulino-dependiente.
Caso 2. Varón: a los dos meses enteropatía secretora; a los 5 años
diagnóstico enteropatía autoinmune. Tratamiento: corticoides y ciclosporina. Desaparición de la sintomatología digestiva, que reaparece al
retirar la inmunosupresión. A los 19 años insuficiencia renal aguda.
Materiales y métodos. Secuenciación directa de FOXP3. Inmunofluorescencia, ELISA, nefelometría y citometría de flujo.
Resultados. Caso 1 linfopenia T, CD4CD25 1%. Hipogammaglobulinemia. IgE elevada (pico 13200 UI/ml); ANCA y AntiGAD: positivos. Biopsia intestinal: atrofia de vellosidades. Mutación p.R397Q.
Caso 2 CD4CD25 2%. Hipogammaglobulinemia. Antienterocito y antimembrana basal tubular positivos. Biopsia renal: nefritis tubulointersticial aguda y nefropatía membranosa con IR. Mutación p.E249K.
Conclusiones. Presentamos 2 casos de IPEX con distinto fenotipo
clínico. Caso 1. Enteropatía, dermatitis y diabetes mellitus. Evolución tórpida desde la infancia. Inclusión en lista para TMO. Caso 2.
Enteropatía desde la infancia, con evolución a brotes. Larga supervivencia. A los 19 años nefropatia autoinmune. Diagnóstico IPEX. Posible relación fenotipo-genotipo: Caso 1: fenotipo severo, la mutación
afecta al dominio forkhead que regula la transcripción. Caso 2: fenotipo leve, larga supervivencia, una mutación en el motivo CC, posible
alteración parcial de la función proteica.
MUTACIÓN p.V131F EN LA REGIÓN TRANSMEMBRANAL DE
CD3G: ¿FACTOR DE RIESGO O POLIMORFISMO? Recio Hoyas
MJ1, Busto E1, Crespo A1, Pérez V1, Reiné J1, Allende L2, Moreno-Pelayo MA3, Van Montfrans J4, Lefranc G5, Regueiro JR1. 1Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. 2Inmunología. Hospital 12 de Octubre. Madrid. 3Unidad de Genética Molecular. Hospital Ramón
y Cajal. Madrid. 4Wilhelmina Children's Hospital. Utrecht. Holanda. 5Institut de Génétique Humain. Montpellier. Francia.
Casos: 1) Paciente con clínica SCID, homocigoto para la mutación
p.V131F en CD3G, familia consanguínea de origen libanés, fallece a los
7 años de edad. La hermana, heterocigota para la mutación, presenta una
clínica y analítica similares. Respuesta T normal a mitógenos, pero disminuida frente a OKT3 y antígenos. Padres sanos, heterocigotos para la
mutación. 2) Niño de 2 años de edad, heterocigoto para la mutación, familia no consanguínea, que ingresa con un episodio severo de neumonía
por HHV-6. Niveles disminuidos de Igs y una leve linfopenia TCD4. Respuesta T defectuosa frente a antígenos pero normal a mitógenos.
COMUNICACIONES ORALES
Filogenia. El hecho de que la mutación se encuentre en una posición muy conservada a lo largo de la evolución desde peces y en una
zona crucial para el ensamblaje del TCR, plantea la posibilidad de que
pudiera ser un factor de riesgo. Por otro lado, el único individuo fallecido al empezar el estudio era homocigoto para la mutación y además,
aparece en heterocigosis en otro paciente de familia no relacionada,
aunque con una clínica menos severa.
Fenotipo. Analizamos la conformación del TCR/CD3 en los linfocitos T de los heterocigotos disponibles y observamos los niveles de
expresión de CD3 disminuidos. Este inmunofenotipo es similar al
encontrado en los heterocigotos para mutaciones deletéreas en el gen
CD3G, lo que sugiere que p.V131F pudiera serlo también.
Genotipo. El estudio poblacional realizado en controles españoles
sanos muestra la presencia de p.V131F en homocigosis, lo que la descarta como causa de enfermedad, aunque no como factor de riesgo.
DESARROLLO DE VECTORES LENTIVIRALES TRANSCRIPCIONALMENTE REGULADOS PARA LA TERAPIA GÉNICA DEL SÍNDROME DE HIPER IgM LIGADO AL CROMOSOMA X(XHIM1).
Romero Z1, Unciti JD1, Carranza D1, Cobo M2, Martín F2, Molina IJ1.
1Centro de Investigación Biomédica. Universidad de Granada. 2IPB "López
Neyra" CSIC. Granada.
La terapia génica de las inmunodeficiencias primarias requiere
el desarrollo de vectores seguros y eficientes que minimicen los efectos adversos de una expresión incontrolada del transgen. Esto es crítico en el desarrollo de terapia génica en el Síndrome de Hiper IgM
(XHIM1). En efecto, la reconstitución de los progenitores hematopoyéticos de ratones deficientes en CD40L con vectores retrovirales constitutivos consiguió una expresión del transgen en células periféricas
que logró reconstituir la respuesta humoral y celular: No obstante,
estos animales desarrollaron una severa enfermedad linfoproliferativa tímica, de causa no definida pero ligada a la expresión no regulada
del transgen terapéutico. Por ello, nos hemos propuesto desarrollar
vectores lentivirales transcripcionalmente regulados que produzcan
una expresión fisiológica y tejido-específica en células CD4+ de CD40L.
Como punto inicial, hemos modificado nuestro vector lentiviral WW,
que dirige la transcripción regulada hematopoyético-específico del gen
WAS a través de un fragmento proximal de 500 bp del promotor endógeno del gen WAS. Hemos reemplazado en este vector el cDNA de
WAS por el de CD40L, amplificado a partir de mRNA de linfocitos T
activados, obteniendo así el vector lentiviral WCD40L. Como control, hemos generado el vector lentiviral constitutivo SCD40L, en el
que la expresión del trangen es controlada por el promotor constitutivo SFFV. El empaquetamiento viral se realizó mediante cotransfección
en células 293T del plásmido terapéutico más el plásmido conteniendo la envuelta VSVg y un tercero con gag-pol. Los sobrenadantes virales fueron titulados y se utilizaron para translucir un panel de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, a fin de comprobar si el
promotor proximal de WAS es capaz de mantener la transcripción tejido-específica de CD40L. El análisis de la expresión se realizó mediante citometria de flujo sobre células en las que en paralelo se determinó el número de inserciones del transgen mediante PCR en tiempo real.
Los resultados obtenidos sugieren que el promotor proximal de WAS
consigue su máxima regulación tejido-específica dirigiendo la transcripción del propio gen WAS, pero su eficacia para dirigir la expresión
regulada de otros genes específicos del linaje hematopoyético, como
CD40L, es menor.
33
COMUNICACIONES ORALES
EXPRESIÓN DE WASP EN LINFOCITOS T DE PACIENTES CON SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH TRAS EL TRATAMIENTO CON
INHIBIDORES DE LA CALPAÍNA Y EL PROTEASOMA. Zaldivar G1,
Torres S1, Srivastava GK1, Vidal C2, Matamoros N2, Molina IJ1. 1Instituto
de Biopatología y Medicina Regenerativa, Centro Investigación Biomédica. Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud. Universidad de Granada. 2Servicio de
Inmunología. Hospital Universitario "Son Dureta". Palma Mallorca.
El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enfermedad ligada
al cromosoma X caracterizada por eczema, trombocitopenia e inmunodeficiencia progresiva. El gen mutado, WASP, codifica para la proteína WASP que es específicamente degradada por calpaína. La proteína WIP (WASP Interacting Protein) se une a WASP en su dominio
EVH1, presente en el extremo N-terminal de WASP, y se ha demostrado que las mutaciones por cambio de sentido que afectan a la zona de
unión WASP-WIP dan como resultado que WIP no pueda unirse a
WASP. Hemos postulado, por tanto, que WIP podría proteger a WASP
de una degradación acelerada, y que por consiguiente, aquellos pacientes con mutaciones por cambio de sentido que afectan a la zona de
interacción con WIP podrían alcanzar niveles apreciables de WASP
tras el tratamiento con inhibidores de la calpaína. Igualmente, WIP
actúa como chaperona protegiendo a WASP a su paso por el proteasoma, por lo que estos mismos pacientes podrían beneficiarse de un tratamiento con inhibidores del proteasoma. Por ello, hemos secuenciado a una serie de pacientes con sospecha de WAS y generado líneas
celulares aloespecíficas de aquellos que presentaban mutaciones que
daban lugar a cambios de aminoácidos en la zona de interacción WASPWIP. El análisis de la expresión de WASP se realizó mediante Western
Blot cuantitativo, encontrando niveles ausentes o muy reducidos de
WASP. Las células T fueron tratadas con calpeptina (inhibidor de la
calpaína) o con Velcade o MG-132 (inhibidores del proteasoma). La
expresión de WASP fue examinada por Western Blot tras 6 horas de
tratamiento con los mencionados agentes. Hemos podido comprobar
que estos tratamientos conseguían alcanzar niveles de expresión de
WASP en dos de los tres pacientes estudiados equivalentes al 25% de
la cantidad de WASP encontrada en individuos sanos. El tercer paciente tiene una mutación en el nucleótido 336 T>G, lo que da lugar a un
cambio en el AA 101 Leu>Prol. Esta mutación afecta a la zona final del
dominio EVH1, y probablemente se encuentre fuera del lugar de acoplamiento de WIP. Por tanto, el tratamiento con inhibidores de la calpaína y proteosoma sólo sería efectivo en pacientes con mutaciones
que afecten directamente a la zona de interacción WASP-WIP.
INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMUN CON DISFUNCIÓN
T, SÍNDROME LINFOPROLIFERATIVO, PANCITOPENIA Y SHUNT
HEPATO-PULMONAR: ¿INDICACIÓN DE TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO? Sampalo A, Rodriguez-Gutierrez JF, Bernal MJ, Nieto A, Fernandez-Valle C, Giron JA, Español T, Barrenechea C, Juliá A,
Brieva JA. Servicios de Inmunología, Hematología y Medicina Interna. Hospital Puerta del Mar (Cádiz), Hospital Vall d´Hebron (Barcelona).
Mujer de 32 años diagnosticada hace 11 de IDVC por infecciones otosinusales de repetición que comienzan a partir de una mononucleosis
infecciosa de evolución torpida. Al diagnóstico presenta panhipogammaglobulinemia (IgG 258 mg/dl; IgA: < 5 mg/dl, IgM: 9 mg/dl, IgE: <
2 UI/ml), incapacidad de producción de anticuerpos, baja respuesta proliferativa T y ausencia de linfocitos B (<0.2%) . Tiene una hermana con
deficiencia de IgA. El estudio fenotípico inicial confirma un perfil MB0
34
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
y una expansión de linfocitos T CD8 CD57+ DR+. Se inicia tratamiento
sustitutivo con IGIV, con adecuado control de las infecciones. A los dos
años debuta con episodios recurrentes de fiebre sin foco, plaquetopenia,
neutropenia y anemia, coincidentes con expansiónes de T CD8 y con
adenopatías, gran esplenomegalia e infiltración nodular en higado y riñones. Se realiza esplenectomía en un intento de controlar la plaquetopenia. Dos años después desarrolla una neumonía por P. carinii (linfocitos
T CD4: 723/mmc), corroborandose la disfunción T (muy bajas respuestas proliferativas a PHA, IL2 y anti-CD3). Se detectan asimismo concentraciones séricas muy elevadas de IL6, TNFalfa, IFNgamma y CD95L.
En Diciembre de 2007 la paciente desarrolla una insuficiencia hepatorenal severa tras un episodio de diarrea, fiebre, pancitopenia y síntomas B, coincidentes con infiltración sistémica por linfocitos T CD8 de
carácter oligoclonal. Los síntomas se atenuan con corticoides y se plantea la posibilidad de un Tx hematopoyético de hermano HLA-identico,
como posible solución teórica a la inmunodeficiencia B y T y a la expansión de linfocitos T clínicamente agresiva. Se traslada al hospital
Vall´d´Hebron para valoración, y se diagnostica un shunt hepato-pulmonar añadido. El shunt hepato-pulmonar es una patología de mal pronostico, habitualmente asociada a cirrosis y/o hipertensión portal, y que no
se ha descrito en la IDVC. En este punto se replantea la idoneidad de
Tx hematopoyético versus inmunosupresión.
SESIÓN 6: CÉLULAS B Y NK
Moderadores: Dra. África González (Vigo),
Dr. Miguel López-Botet (Barcelona)
LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA B MIGRA EN RESPUESTA A LOS LIGANDOS DE CCR7 A TRAVÉS DE UN MECANISMO
DEPENDIENTE DE PI3K Y RHO. Cuesta Mateos C, Alfonso Pérez M,
López Giral S, Muñoz Calleja C. Hospital Universitario de la Princesa.
Nuestro grupo de investigación ha demostrado que las neoplasias
de células B con amplia diseminación a ganglio linfático expresan altos
niveles de los receptores de quimioquinas CCR7, CXCR4 y CXCR5,
que median la entrada de los linfocitos en los órganos linfoides secundarios. Los índices de migración de la leucemia linfática crónica de
células B (LLC-B) en respuesta a los ligandos de CCR7, CCL19 y CCL21,
correlacionan con la presencia de linfadenopatía clínica y mediante
experimentos in vitro demostramos que anticuerpos anti-CCR7 eliminan células de LLC y bloquean su migración.
El objetivo de este estudio es estudiar las vías de señalización que
median la migración de células de LLC en respuesta a CCL19/21 dada
la posible relevancia de CCR7 como diana terapéutica. Así, mediante
ensayos de inmunoblot y quimiotaxis in vitro, analizamos la participación de las MAPKs, de PI3K y de la familia Rho de pequeñas GTPasas, que se encuentran entre los principales mediadores de la quimiotaxis linfocitaria.
Los ligandos de CCR7 indujeron una fuerte activación de ERK1/2,
y en menor medida de p38 y JNK, que sin embargo no jugaron ningún
papel en la migración de células LLC. En cambio, las vías PI3K y Rho
sí regularon la quimiotaxis dependiente de CCR7 de esta leucemia.
Así, inhibidores de PI3K y del efector de Rho, ROCK, redujeron notablemente la migración celular de LLC en respuesta a los ligandos de
CCR7. Ensayos de inmunoblot evidenciaron niveles de Akt constitutivamente fosforilado que aumentaron tras estimulación con CCL19/21.
INMUNOLOGÍA
Confirmamos el papel de PI3K y Rho en la migración de LLC-B mediada por CCR7 mediante nucleofecciones transitorias con mutantes dominante negativo y constitutivamente activo de ambas moléculas.
Por tanto, la serín/treonín quinasa PI3K y la pequeña GTPasa Rho
juegan un papel primordial en la migración in vitro de la LLC en respuesta a las quimioquinas homeostásticas CCL19/21, apoyando su
posible participación en la infiltración ganglionar de esta leucemia.
AID, LA DEAMINASA INDUCIDA POR ACTIVACIÓN, ES
HAPLOINSUFICIENTE. Vidal Sernández I, Rodríguez Ramiro A. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO).
En respuesta al antígeno, los linfocitos B tienen la capacidad única de remodelar somáticamente los genes de inmunoglobulinas (Igs)
mediante dos mecanismos: hipermutación somática (SHM) y cambio
de isotipo (CSR). Ambos son iniciados por la enzima Deaminasa Inducida por Activación (AID) a través de la deaminación de citosinas en
el loci de Igs. Además, AID promueve la generación de translocaciones cromosómicas (TCs) linfomagénicas lo que tiene una enorme relevancia clínica, ya que la gran mayoría de los linfomas diagnosticados
en occidente se originan a partir de células B maduras. El estudio de
la regulación de AID es por ello de vital importancia. Nuestro objetivo ha sido determinar si los niveles de expresión de AID son limitantes para su actividad.
Analizamos el efecto funcional de la dosis de AID usando linfocitos B de bazo de ratones AID+/+, AID+/- y AID-/- cultivados in vitro
en condiciones que promueven el CSR. Observamos por citometría
que las células B que portan una copia única de AID reducen la eficiencia de CSR un 50% respecto a cuando existen dos copias. Ocurre tanto para el CSR a IgG1 como a IgG3.
Para conocer el efecto de la dosis de AID en la generación de lesiones linfomagénicas, estudiamos la generación de TCs c-myc/IgH en
animales transgénicos para IL6 y deficientes en p53. Nuestros resultados indican que los ratones IL6tgAID+/-, a diferencia de los controles
IL6tgAID+/+, carecen de TCs distales Salfa y que la frecuencia de TCs
proximales Smu está reducida al 50% en animales AID+/-p53+/-, con
respecto a ratones con dos alelos funcionales de AID (AID+/+p53+/–).
Concluímos que AID es haploinsuficiente, lo cual es excepcional
en genes que codifican actividades enzimáticas. Los niveles fisiológicos de AID están sometidos a una regulación estricta, probablemente
para asegurar una respuesta humoral eficiente sin comprometer la estabilidad genómica de la célula B.
LOS MICRORNAS REGULAN LA GENERACIÓN DE CÉLULAS
B. Belver Miguel L, Rodríguez Ramiro A. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO).
Los microRNAs (miRNAs) son moléculas pequeñas de RNA no
codificantes que actúan como reguladores de la expresión génica, inhibiendo la traducción o induciendo la degradación de mRNAs. Los miRNAs controlan importantes funciones celulares y su expresión aberrante se ha ligado a procesos de transformación celular y linfomagénesis.
Los miRNAs se generan a partir de precursores de RNA de mayor
longitud que son procesados por la RNAsa Dicer. Para estudiar el papel
de los miRNAs en la diferenciación y función de células B, hemos generado ratones en los que el gen Dicer está eliminado específicamente en
células B (Dicer-flox/flox CD19-Cre ki/+).
COMUNICACIONES ORALES
Nuestros resultados indican que la ausencia de miRNAs 1) bloquea parcialmente la diferenciación de células B en la médula ósea, lo
que da lugar a una reducción de la población B en los tejidos linfoides
periféricos, 2) las proporciones de las distintas poblaciones de linfocitos B en bazo se encuentran alteradas, existiendo un incremento de
la población de zona marginal y una reducción de la población folicular, 3) las células deficientes para Dicer muestran también patrones de
hiperactivación en placas de Peyer. Estos datos indican que los miRNAs tienen un papel crucial en la diferenciación del linaje B y en la
generación de sus distintas subpoblaciones.
CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS DE LOS CUERPOS NUCLEARES EN LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA DE LINFOCITOS B. Góngora Fernández R, Martín Martín N, Alonso Chamorro L.
Universidad de Salamanca.
Objetivos. Los cuerpos nucleares (NBs) son complejos proteicos
cuyo significado funcional permanece todavía mal conocido, aunque
pueden regular la expresión génica, y en consecuencia aspectos tan
esenciales como el control de ciclo celular y la apoptosis. PML, el componente prototípico de estos NBs es esencial en la ontogenia y apoptosis de progenitores mieloides, y por otra parte, la proteína de fusión
PML-RXR es el agente causal de la leucemia promielocítica aguda, una
leucemia aguda mieloide. Nosotros hemos visto en ratón que PML no
es esencial para el desarrollo y apoptosis de progenitores B, mientras
que Daxx otro componente de los NBs, si es esencial para la apoptosis
inducida por interferón en estos progenitores. Nuestro interés actual
se centra en estudiar la dinámica de los NBs en el crecimiento y apoptosis de células con leucemia linfoblástica aguda (B-ALL) en el hombre, la vertiente tumoral de una normal ontogenia B.
Métodos. Nuestro interés se centró en el análisis de la línea celular EU-12, que muestra distintas subpoblaciones de linfocitos B en continua diferenciación. Se estudió la expresión y localización de proteínas de PML y Daxx en estas células, así como su comportamiento en
apoptosis, mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal.
Resultados. No se observó una obvia colocalización nuclear de
Daxx y PML (como en progenitores mieloides), y la expresión y localización de estas proteínas no se vio alterada en los mecanismos de
apoptosis analizados. El interferón no indujo apoptosis ni la expresión
de Daxx (como en progenitores primarios de ratón).
Conclusiones. Los componentes de los NBs no se vieron afectados en expresión/localización durante la diferenciación y apoptosis
de estas células leucémicas. Los NBs podrían estar involucrados en
el crecimiento aberrante de estos progenitores, pero se hace necesario el estudio de progenitores leucémicos “frescos” obtenidos de pacientes y de progenitores normales en médula ósea.
CD38 IS RELEASED IN ASSOCIATION WITH CD81 AND HSC-70
IN EXOSOMES IN HUMAN LYMPHOBLASTOID B CELLS. Zumaquero Martínez EC1, Muñoz Fernández P1, Pavón Castillero EJ1, García Pérez A1, García Veguillas A1, Sancho López J1, Zubiaur Marcos
M1,2. 1Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra". CSIC. 2Instituto de Salud Carlos III.
CD38 a type-II transmebrane protein is specifically recruited to
membrane rafts in human lymphoblastoid B cell lines. We have identified several cellular proteins that preferentially associate with CD38
35
COMUNICACIONES ORALES
in the B cell membrane rafts: 1) CD38/CD19/Lyn; 2) CD38/CD81; and
3) CD38/HSC70. These associations are dependent of membrane rafts
integrity since they are disrupted in the presence of 60 mM n-octyl[beta]-D-glucopyranoside. Stress and tetrapanin proteins, including
HSC-70 and CD81, have been identified in a discrete population of
nano-vesicles (40-90 nm in diameter) called exosomes, which are secreted by a variety of cells including B cells. We set for to isolate exosomes from Namalwa B cells and demonstrate that CD38 is released in
association with these vesicles. Examining multiprotein complexes
from CD38-exosomes vesicles we found that are enriched in HSC-70,
Lyn and CD81. Our results present evidence supporting i) the exportation of CD38 out of the cells through the exosome pathway, and ii)
the identification in membrane rafts and in exosomes of key signaling
components of CD38-protein complexes.
LA DUPLICACIÓN DE LOS GENES KIR2DL5-KIR2DS3 FACILITA LA GENERACIÓN DE HAPLOTIPOS CON NUEVAS DELECIONES Y DUPLICACIONES DE VARIOS GENES KIR. Ordóñez del
Valle D1, Meenagh A2, Gómez-Lozano N1, Castaño J1, Middleton D2,
Vilches C1. 1Inmunología. Hospital Universitario Puerta de Hierro. 2N.
Ireland Regional Histocompatibility and Immunogenetics Laboratory, Belfast, UK.
En el complejo KIR (19q13.4), los genes KIR2DL5 y KIR2DS3 están
localizados de manera consecutiva y muestran una fuerte asociación
entre ellos. A lo largo de la evolución, se han producido recombinaciones que han resultado en la duplicación de ambos genes, formándose un grupo centromérico y otro telomérico de 2DL5-2DS3 separados
por otros cinco genes KIR. La duplicación debió haberse producido en
un periodo reciente de la historia evolutiva humana, ya que ambos
grupos 2DL5-2DS3 difieren uno de otro en pocos cambios de nucleótido. La casi total identidad en las secuencias de ambos grupos de genes
probablemente facilite que se produzcan nuevas recombinaciones entre
ellos.
En este trabajo presentaremos la existencia de dos haplotipos
inusuales (uno en una familia española y otro en una irlandesa), cuyo
origen aparente es una misma recombinación entre los dos grupos
2DL5-2DS3. En el haplotipo de la familia española hay una deleción
de siete genes KIR localizados en la region central (100 kb aproximadamente), que yuxtapone el gen 2DL5 centromérico con el gen 2DS3
telomérico. El otro haplotipo presenta la duplicación de los mismos
genes que están delecionados en la familia española, formando un
haplotipo largo de 18 genes KIR.
CMV-SPECIFIC CD8 T CELLS ARE EXPANDED IN THE ELDERLY:
EXPRESSION OF COSTIMULATORY MOLECULES AND NK
ASSOCIATED RECEPTORS. Pita ML1, Gayoso I1, Alonso C1, Peralbo E1, de la Rosa O1, Casado JG2, Tarazona R2, Solana R1. 1Inmunología. Hospital Universitario Reina Sofia, Universidad de Córdoba. 2Unidad de
Inmunología, Universidad de Extremadura, Cáceres.
Immunosenescence is a complex series of alterations that are dependent not only on chronological ageing itself, but also on exogenous factors such as persistent antigenic stress leading to chronic activation of
the immune system. Ageing is associated with immunological changes in the T cells primarily due to thymus involution resulting in a
decreased production of naive cells. The decrease of naïve CD8 cells
36
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
in the elderly, likely as a consequence of thymus involution, accompanied by the expansion of effector and effector-memory cells is well established. Moreover, recent evidences also support that many alterations
observed in the CD8 T cell compartment can be explained by the chronic activation of the immune system by latent viruses such as CMV.
The possibility that this abnormal subset distribution is the consequence of chronic antigen stimulation by latent viruses as CMV has been
previously proposed by ourselves and others. The relevance of CMV
in this process is underlined by the demonstration of oligoclonal expansion of CMV-specific CD8 T cells. However, it is unclear to what extent
the accumulation of CMV-specific CD8 T cells is a major factor contributing to the phenotypic changes found in CD8 T cells. The phenotypic analysis of CMV-specific CD8 cells has demonstrated that the proportion of cells coexpressing CD27 and CD28 is strongly decreased
in the elderly when compared with young individuals. Furthermore,
the analysis of the differentiation stages defined by the combined use
of CCR7 and CD45RA also showed that in elderly donors CMV-specific CD8 T cells exhibit a phenotype associated with effector-memory
(CCR7? CD45RA low) or effector (CCR7? CD45RA+) T cells, whereas
in young individuals a significant proportion of CMV-specific CD8
cells are included in the naïve subpopulation (CCR7+CD45RA+). These results indicate that the majority of CMV-specific CD8 cells in elderly
individuals have effector-memory 2 and terminally differentiated effector phenotypes. These cells also have an increased expression of NK
associated receptors. The findings that CMV-specific CD8 T cell phenotype in elderly individuals is similar to the predominant phenotype of CD8 T cells in the elderly and that the accumulation of CD28null
T cells expressing CD57 and CD56 is preferentially observed in CMVseropositive elderly suggest that the latent infection with CMV can be
considered a major factor contributing to the differentiation of CD8 T
cells to poorly functional senescent cells with an effector-memory 2
phenotype.
LOS iNKRs REGULAN LA PRODUCCIÓN DE IFN-γ INDUCIDA
TRAS LA ACTIVACIÓN DE CÉLULAS NK CON DENDÍTICAS
INMADURAS O PRODUCTOS VIRALES. Morel Bárcena E, Bellón
Heredia T. Hospital Universitario La Paz.
Las células Natural Killer (NK) se activan en respuesta a patógenos, tumores y transplantes de células hematopoyéticas alogénicas.
Sus funciones principales son: citotoxicidad y producción de citoquinas, principalmente IFN-γ. Se ha descrito que la interacción de células
NK y dendríticas inmaduras (iDCs) conduce, a través de la señalización de NKp30, a una importante liberación de esta citoquina. Además, las células NK pueden participar en la respuesta contra infecciones virales mediante el reconocimiento directo, a través de los Toll-like
receptors (TLRs), de productos virales. Así, el agonista de TLR3 poly
I:C sinergiza con IL-12 para inducir la secreción de IFN-γ. La respuesta NK se regula a través de receptores específicos de moléculas del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. En humanos existen tres familias: KIRs (killer cell Ig-like receptors), LIRs/ILTs
(leukocyte Ig-like receptor/ Ig-like transcripts) y los heterodímeros de
la familia de las lectinas CD94/NKG2. El papel que desempeñan los
receptores NK inhibidores (iNKRs) en el control de la citotoxicidad ha
sido ampliamente estudiado; pero existen pocos trabajos acerca del
efecto que puedan tener en la liberación de citoquinas. Por tanto, se
estudió el posible papel regulador de los iNKRs sobre la producción
de IFN-γ inducida en células NK tras la interacción con iDCs alogé-
INMUNOLOGÍA
nicas o mediante el tratamiento con poly I:C. La concentración de IFNγ liberado al medio se cuantificó mediante Cytometric Bead Array Flex
Set (CBA). Los resultados indican que CD94/NKG2A e ILT2/CD85j
regulan la producción de IFN-γ inducida tras el cocultivo con iDCs alogénicas o estimulada específicamente a través de NKp30 en un sistema libre de células. Finalmente, se comprobó que los iNKRs modulan
la producción de IFN-γ en NKs estimuladas con poly I:C y dosis subóptimas de IL-12. Los resultados sugieren los iNKRs participan en la regulación de la producción de IFN-γ inducida por iDCs o ligandos de TLRs
a través del reconocimiento de moléculas del MHC de clase I.
EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DE LAS PROTEÍNAS v-SNARE DE LA VÍA EXOCÍTICA EN LAS CÉLULAS NK
HUMANAS. Delgado-Pérez L, Campos-Caro A. Hospital U. Puerta del Mar.
El principal mecanismo por el que las células NK ejercen su actividad citotóxica es la exocitosis de los lisosomas de secreción. Existen varias
enfermedades hereditarias en las que este proceso se encuentra alterado y entre ellas la causada por la mutación del gen de la sintaxina 11 un miembro de la familia de proteínas SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptors)- y la causada por
la mutación del gen de la munc13-4 –un regulador de las proteínas SNARE-. Sin embargo, y a pesar de que las proteínas SNARE se consideran
en eucariotas los mediadores universales de la fusión entre membranas,
se desconoce qué miembros de esta familia de proteínas participan en
la exocitosis citotóxica de las células NK. Este trabajo se centró en la familia VAMP (vesicle-associtated membrane protein) cuyos miembros constituyen habitualmente el componente v del complejo SNARE. Se estudiaron células NK aisladas de sangre periférica así como líneas celulares NK. Se identificaron los transcritos primarios (RT-PCR) y las proteínas (western blot) correspondientes a varios SNARE previamente identificados como elementos de la vía exocítica en otros tipos celulares de
origen hematopoyético: VAMP-2, 7 y 8. Además, se confirmó su expresión y se determinó su localización mediante microscopía de fluorescencia confocal. Destaca la localización ampliamente coincidente de VAMP7 con los gránulos citotóxicos, en consonancia con estudios previos de
otros autores. En conclusión, las células NK humanas expresan las proteínas v-SNARE VAMP-2, VAMP-8 y VAMP-7, y la localización intracelular de esta última sugiere un posible papel de la misma en la exocitosis de los lisosomas de secreción.
SESIÓN 7: INMUNOLOGIA TUMORAL - II
Moderadores: Dr. Federico Garrido (Granada),
Dr. Luis Álvarez Vallina (Madrid)
REGULACION PROTEOLITICA DEL FACTOR DE TRANSCRIPCION STAT6 POR AGENTES ALQUILANTES. Perez-G M, Cortes
JR, Rivas MD, Borrega P, Zamorano J. Hospital San Pedro de Alcantara.
El factor de transcripción STAT6 se ha implicado en diversas enfermedades por lo que la investigación de compuestos capaces de regular su activación tiene importancia biológica y médica. La activación
de STAT6 está estrechamente regulada por quinasas, fosfatasas y proteasas. En este estudio, se pretendió inicialmente investigar la utilidad
de inhibidores de proteasa en la regulación de STAT6. Entre los inhi-
COMUNICACIONES ORALES
bidores analizados, se encontró que la clorometilcetona TPCK inhibía
la activación de STAT6 dependiente de IL-4. Sorprendentemente, esta
inhibición estaba acompañada por la pérdida de proteína de STAT6
por un mecanismo sensible al inhibidor de serina-proteasas AEBSF.
Sin embargo, este efecto de TPCK no parecía estar mediado por la inhibición de proteasas puesto que múltiple inhibidores de proteasas no
tenían efecto en la expresión de STAT6. Los datos encontrados indican
que el efecto de TPCK fue mediado por su actividad alquilante. Así,
compuestos reactivos con cisteínas y tiol antioxidantes previenen la
degradación de STAT6 inducida por TPCK. Además, otros agentes
alquilantes como la mecloretamina también inducen la pérdida de
STAT6. De hecho, tratamientos conteniendo ciclofosfamida disminuyen la expresión de STAT6 como se observó en células obtenidas de
pacientes con cáncer de mama. Análisis de otras moléculas indican que
los agentes alquilantes promueven la pérdida de otros miembros de la
familia STAT pero no de Shc y c-Rel. Estos datos revelan un novedoso
mecanismo por el que agentes alquilantes pueden promover la degradación de factores de transcripción STAT, lo que podría ser relevante
para comprender su mecanismo de acción.
ACTIVACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS UL16-BINDING PROTEINS POR HDAC2 Y REPRESIÓN POR HDAC3 EN TUMORES
EPITELIALES. González Rodríguez S, Rodríguez Folgueras A, Seto E,
López Soto A. Universidad de Oviedo.
Las ULBPs son ligandos del receptor activador NKG2D presente
en las células T y NK. La expresión de las ULBPs se induce en células
estresadas, infectadas y transformadas, marcando a estas células para
ser eliminadas por el sistema inmune. En este trabajo caracterizamos
que los mecanismos epigenéticos desempeñan un papel esencial en la
represión de la expresión de ULBP1-3. Nuestros resultados muestran
que los promotores de las ULBP1-3 no están metilados, pero que la
estructura de la cromatina desempeña un papel crucial en su expresión. Hemos caracterizado que la desacetilasa de histona HDAC3 se
une a los promotores de ULBP1-3 y reprime de una forma muy significativa la trascripción de estos genes. La sobreexpresión de HDAC3,
que se observa frecuentemente en tumores de pacientes con cáncer de
colon y diversos tumores epiteliales, reprime la expresión de ULBP13; mientras que el bloqueo de su expresión usando siRNA induce significativamente su expresión. Mediante análisis de sus regiones promotoras y técnicas de inmunoprecipitación de cromatina caracterizamos que HDAC3 reprime la expresión de las ULBP1 por la interacción
con los factores de trascripción Sp1/Sp3. Significativamente, HDAC2
desempeña un papel opuesto al de HDAC3, ya que induce la expresión de las ULBPs. Esto sugieren que dado que diferentes desacetilasas de histonas desempeñan un papel opuesto en la expresión de las
ULBPs sería necesario desarrollar inhibidores específicos para cada
HDAC para mejorar su eficacia terapéutica.
ERp5 SE ASOCIA EN LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS TUMORALES CON MICA Y PARTICIPA EN SU LIBERACIÓN COMO
FORMA SOLUBLE. González Rodríguez S1, Kaiser BK2, Yim D2, Chow
I-T2, Dai Z2, Mann HH2, Strong R2, Groh V2, Spies T2. 1Universidad de
Oviedo. 2Fred Huthcinson Cancer Research Center, Seattle, USA.
MICA es un ligando del receptor activador NKG2D. La expresión
de MICA se induce en células tumorales por el daño genotóxico y el
37
COMUNICACIONES ORALES
estrés celular, causando la activación de las céluas NK y la coestimulación de los linfocitos T. En tumores avanzados, MICA es liberado en
forma soluble de la superificie celular por proteolisis. MICA soluble
inhibe la respuesta inmune mediada por NKG2D y favorece la activación de linfocitos T NKG2D+CD4+ con características inmunosupresoras, lo que favorece la evasión inmune de las células cancerígenas.
En este trabajo demostramos que MICA está asociado en la superficie de las células tumorales con la isomerasa disulfuro ERp5. La inhibición farmacológica de la actividad tioreductasa y el silenciamiento
de la expresión de ERp5 indican que la actividad de ERp5 es esencial
para la liberación o “shedding” de MICA soluble. ERp5 y MICA forman complejos transitorios mediante la formación de enlaces disulfuro en la membrana de las células tumorales, de los cuales es liberado
MICA soluble después del procesamiento proteolítico en el dominio
α3 próximo a la membrana celular. La reducción de un enlace disulfuro aparentemente inaccesible en el dominio α3 de MICA por ERp5 produce un cambio conformacional que permite la digestión proteolítica
de MICA. Estos resultados describen un nuevo mecanismo por el que
se forma MICA soluble, promoviendo de esta manera la evasión de la
respuesta inmune. Además identifica ERp5 como una diana.
INTERACCIÓN ENTRE REGULADORES DEL CICLO CELULAR
Y DE LA APOPTOSIS EN EL DESARROLLO DE AUTOINMUNIDAD Y LINFOMA. Santiuste I1, Iglesias M1, Buelta L3, Sánchez M2,
Tamayo E4, Merino J4, Merino R4. 1Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria. 2Sección de Inmunología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. 3Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas, Universidad de Cantabria. 4Departamento de Biología Molecular, Universidad de
Cantabria.
En el desarrollo de enfermedad autoinmune participan conjuntamente múltiples factores genéticos, epigenéticos y ambientales. El
acúmulo de un número suficiente de estos factores por encima de un
determinado umbral impacta sobre los mecanismos que regulan la
tolerancia inmunológica hacia lo propio. Además, muchas de las anomalías genéticas que promueven el desarrollo de patologías autoinmunes, también están involucradas en la aparición de neoplasias linfoides. Sin embargo, la relación causa-efecto entre autoinmunidad y
cáncer aun no se ha clarificado. En el presente estudio, se ha analizado la posible interacción entre anomalías en la regulación del ciclo celular y de la apoptosis linfocitaria sobre el desarrollo de autoinmunidad
y linfomas en ratones C57BL/6 (B6), no susceptibles a autoinmunidad.
Para ello, ratones B6 deficientes en p21 (CIP1/WAF1) (B6-p21-/-), que
desarrollan espontáneamente un cuadro autoinmune ligero, se cruzaron con ratones B6 que sobre-expresan un transgén (Tg) de la molécula anti-apoptótica Bcl-2 humana (hBcl-2) en linfocitos B, obteniéndose
4 tipos de ratones B6: p21+/+-hBcl-2-; p21+/+-hBcl-2+; p21-/--Bcl-2y p21-/--Bcl-2+. Se ha analizado el desarrollo de lupus en los 4 grupos, estudiando los niveles séricos de autoanticuerpos en suero, la aparición de nefropatía y la supervivencia de los animales. Nuestros resultados muestran que, en comparación con los ratones B6 normales o los
mutantes simples, los mutantes dobles p21-/--hBcl-2+ presentan títulos elevados de anticuerpos anti-DNA circulantes a los 8 meses de edad
y desarrollan una glomerulonefritis severa a los 10 meses de edad, lo
que acelera su mortalidad. Así mismo, los ratones B6 mutantes dobles
p21-/--hBcl-2+, a diferencia de los Tg simples y no Tg, presentan una
incidencia muy alta de linfomas de células B. Estos tumores son policlonales, de aspecto plasmocitoide, tienen desregulada la expresión de
38
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
c-myc y presentan traslocaciones cromosómicas t(12:15). En conclusión, nuestro estudio muestra la existencia de sinergias entre alteraciones en la regulación del ciclo celular y de la apoptosis linfocitaria en el
desarrollo de patologías autoinmunes y linfoproliferativas.
ANTICUERPOS ANTI-SOX1 COMO MARCADOR DE PARANEOPLASIA EN EL SÍNDROME MIASTÉNICO DE LAMBERT
EATON. Sabater L, Titulaer M, Saiz A, Verschuuren J, Gure AO, Graus
F. Servicio de Neurologia, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona, Institut d' Investigació Biomèdica August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Department
of Neurology, Leiden, University Medical Center, The Netherlands Molecular Biology and Genetics Department, Bilkent University, Ankara, Turkey
El síndrome miasténico de Eaton-Lambert (LEMS) es un desorden
de la transmisión neuromuscular mediado por anticuerpos contra canales de calcio. El origen de la enfermedad, en el 50% de los pacientes,
es paraneoplásico, esto es, existe una neoplasia subyacente que provoca el síndrome neurológico, generalmente cáncer de pulmón de célula pequeña (CPCP).
Actualmente no existe ningún marcador biológico eficaz para predecir los pacientes de LEMS que desarrollarán cáncer.
Previamente encontramos que el 43% de pacientes con LEMS y
CPCP tenían un anticuerpo, que llamamos AGNA (anti-glial nuclear
antibody), definido por la inmunoreacción con los núcleos de la glia
de Bergmann del cerebelo. Este estudio se abordó para identificar el
antígeno reconocido por AGNA y para confirmar la asociación con el
LEMS paraneoplásico en una serie mayor de pacientes. Cribamos una
genoteca de cDNA de cerebro fetal con sueros positivos para AGNA.
La presencia de anticuerpos contra el antígeno aislado se detectó por
inmunoblot de calvas de lisis de fagos de dos clones positivos. Estudiamos 105 pacientes con LEMS (55 con CPCP). Como resultado del
cribaje de la genoteca de expresión de cerebro fetal con sueros AGNA
aislamos el gen SOX1, un antígeno tumoral altamente inmunogénico
en CPCP. La elución de la IgG que se unía a los clones SOX1 producía la misma immunoreactividad cerebelar que los sueros AGNA. Los
anticuerpos SOX1 estaban presentes en el 64% de los pacientes con
LEMS y CPCP y en ninguno de los pacientes LEMS idiopáticos
(p<0.0001). La detección de los anticuerpos SOX1 en pacientes con
LEMS predice la presencia de CPCP y puede usarse para un seguimiento más preciso de aquellos pacientes con LEMS sin evidencia de
cáncer al inicio de la enfermedad.
GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS
RECOMBINANTES HUMANOS FRENTE AL RECEPTOR DEL
DOMINIO GLOBULAR DEL SUBCOMPONENTE DEL COMPLEMENTO 1Q (GC1QR). Sánchez-Martín D1, Fogal V2, Ruoslahti E2,
Álvarez-Vallina L1. 1Unidad Inmunología Molecular, Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid. 2Burnham Institute for Medical Research (at
UCSB), University of California, Santa Barbara, CA, USA.
El receptor para el dominio globular de C1q (gC1qR/p33) es una
proteína celular expresada de forma ubicua que también se encuentra
en el plasma y en la matriz extracelular. Además de su implicación en
la modulación de la activación del sistema de complemento y la cascada de quinina, gC1qR se ha identificado como un ligando putativo
de patógenos endovasculares y como potencial diana antitumoral en
un modelo experimental con ratones inmunodeficientes portadores de
INMUNOLOGÍA
tumores humanos —MDA-MB-435— en los que, al ser tratados con
anticuerpo policlonal de conejo frente a la región aminoterminal de
gC1qR (obtenido por la inmunización con secuencias peptídicas correspondientes a esa región), se observó una disminución significativa del
crecimiento tumoral.
El presente estudio tiene como objetivo la obtención de una colección de anticuerpos humanos en formato de fragmentos variables de
cadena única (scFv – single chain Fragment variable) empleando la
tecnología de exposición de bibliotecas combinatorias en la superficie
de fagos filamentosos. Tras dos rondas de selección con la biblioteca
Griffin.1 (de origen humano y con una diversidad de 1.2x109 clones
distintos) frente a gC1qR recombinante humano se obtuvo un sesenta
por ciento de clones con capacidad de reconocimiento del antígeno,
seleccionándose diez anticuerpos distintos –con representantes de las
principales familias de cadenas: IGHV1, IGHV3, IGLV1 e IGLV3, así
como un clon perteneciente a la familia IGHV4– para estudios preliminares de especificidad y características de unión mediante ELISA.
Tres anticuerpos, sintetizados en formato soluble y purificados, han
mostrado su capacidad para detectar la proteína en la superficie de
líneas celulares por citometría de flujo. Actualmente se está estudiando el posible efecto terapéutico en modelos animales portadores de
tumores humanos así como su valor diagnóstico empleando herramientas de imagen molecular in vivo.
EL CANCER RENAL SE ASOCIA A UN INCREMENTO EN LA
EXPRESION DE MOLECULAS HLA DE CLASE I. Sáenz-López
Garrocha P, Vazquez F, Rodríguez AI, Jiménez P, Cózar JM, Tallada M.
Hospital Universitario Virgen de las Nieves.
Una de las características de las células tumorales es la adquisición de un estado de baja inmunogenicidad al que contribuyen factores intrínsecos de la célula tumoral y factores extrínsecos, por un
deterioro progresivo, al menos “in situ”, de la respuesta inmune antitumoral. El mecanismo mejor estudiado, y que contribuye a esta baja
Inmunogenicidad son las alteraciones en la expresión de antígenos
HLA de clase I y en la maquinaria de presentación antigénica.
Hemos observado que la transformación celular en el epitelio tubular renal, lleva aparejada un incremento en la expresión de los niveles de mRNA de la cadena pesada y de b2m . Este incremento de expresión se correlaciona con la mayor expresión de citoquinas proinflamatorias. Estos hallazgos en cáncer renal difieren de lo encontrado en una
variedad amplia de tumores, que cursan con alteraciones frecuentes
en la expresión de antígenos HLA de clase I. En nuestro estudio hemos
querido analizar, por inmunohistoquímica, la expresión HLA de clase
I en tejido normal y neoplásico en 93 casos de tejidos tumorales de
riñón de pacientes y 29 muestras de tejido normal.
Nuestros resultados confirmaron, el análsis previo a nivel de RNA
sobre muestras microdisectadas: la mayoría de los tumores expresaron moléculas HLA de clase I en la superficie. La expresión detectada en tejido neoplásico, contrastó en intensidad y homogenidad con
lo observado a nivel de los túbulos en las muestras de riñon normal.
Sólo en un 16% de las muestras de tejido normal, se detectó expresión
de moléculas HLA. Es probable que el incremento en la expresión de
moléculas HLA de clase I sea inducido por la mayor infiltración linfocitaria en el tejido neoplásico. Si el incremento en la expresión observada es una estrategia para evadir la respuesta de células NK (que se
encuentran en un número elevado en el infiltrado del cáncer renal)
es algo que quedaría por demostrar.
COMUNICACIONES ORALES
POLIMORFISMO DE LA REGIÓN TRANSMEMBRANA DEL GEN
MICA EN CÁNCER DE MAMA ESPORÁDICO. Lavado Valenzuela R1, Bravo Romero MJ1, Benavides Orgaz M2, Alés Díaz I2, Cobos
Dols M2, Alonso Ortiz A1, Caballero González A1. 1Servicio de Inmunología. 2Sección de Oncología Médica. Hospital R. U. Carlos Haya.
Introducción. La respuesta antitumoral la realiza sobre todo la
inmunidad innata (NKT, NK y células T ?/?). Las células tumorales
son reconocidas por el sistema inmune a través de receptores como
NKG2D. MICA es un ligando de este receptor y se expresa en células
estresadas, tales como células transformadas. MICA es muy polimórfico. Su exón 5 codifica el dominio transmembrana que tiene un STR
(repeticiones GCT), que da lugar a los alelos A4, A5, A6 y A9. El alelo
A5.1 produce una forma soluble de la proteína.
Objetivo. Analizar el polimorfismo de la región transmembrana
de MICA en pacientes con cáncer de mama esporádico.
Material y método. Se incluyeron 110 pacientes de la provincia de
Málaga y 121 controles sanos de la misma región geográfica. El análisis del STR se hizo por PCR y análisis de fragmentos en secuenciador
automático.
Resultados. Al comparar pacientes y controles, sólo se observaron diferencias en la frecuencia del alelo MICA-A5, la cual se
encontró reducida en pacientes frente a controles (11% vs 20%, X2
(1 d.f.)=6.971; p=0.008). Dado que se había descrito una asociación entre HLA-B7 y cáncer de mama en nuestras pacientes, se analizó la frecuencia de los alelos MICA en pacientes con HLA-B7 frente a controles HLA-B7. Se encontró que la frecuencia del alelo MICAA5.1 era mayor en pacientes que en controles (58% vs 16%, X2 (1
d.f.)=15.776; p=0.0002). Al comparar la frecuencia del alelo MICAA5.1 en pacientes HLA-B7 y pacientes con otros alelos de HLA-B,
los resultados mostraron que se encontraba aumentada en pacientes HLA-B7 (58% vs 22%, X2 (1 d.f.)=20.837; p=0.00005). Esta diferencia no se encontró en controles sanos. Se observó que el 100% de
las pacientes que portaban el alelo HLA-B7 también tenían el alelo MICA-A5.1.
Conclusiones. El alelo MICA-A5 parece conferir protección frente al cáncer de mama esporádico en nuestras pacientes. La combinación HLA-B7/MICA-A5.1 parece conferir susceptibilidad al cáncer de
mama esporádico en nuestra área geográfica.
CÉLULAS TUMORALES CON PÉRDIDA TOTAL DE EXPRESIÓN
DE MOLÉCULAS MHC DE CLASE I MUESTRAN BAJA EXPRESIÓN DE LOS GENES: AP-2·, MYC, GLIS Y FHIT. Romero García I,
Stefanski J, Berruguilla Pérez E, Linares Dickler I, Garrido C, Garrido Torres-Puchol F, García Lora AM. Hospital Universitario Virgen de
las Nieves.
En nuestro laboratorio, hemos generado un modelo tumoral muríno compuesto por diferentes líneas celulares metastásicas derivadas
de metástasis espontáneas generadas a partir de un mismo clon tumoral obtenido desde un fibrosarcoma inducido por metilcolantreno. Estas
líneas celulares metastásicas presentan diferente expresión en superficie de moléculas MHC de clase I, mostrando dos diferentes fenotipos: el primero presenta expresión en superficie de las moléculas de
clase I Kd, Dd y Ld; el segundo fenotipo H-2 se caracteriza por la pérdida total de expresión de moléculas de clase I debida a una baja regulación coordinada a nivel transcripcioonal de varios componentes de
la maquinaria de presentacion y procesamiento antigénicas (APM). En
39
COMUNICACIONES ORALES
este estudio, teniendo en cuenta que todas las líneas metastásicas derivan del mismo clon tumoral, analizamos los posibles genes que pueden estar implicados en esta pérdida de expresión de varios componentes de la APM.
Se ha realizado una librería de sustracción de cDNAs, así como
microarrays, comparando las metástasis H-2 positivas con las H-2
negativas. Los genes encontrados expresados diferencialmente, han
sido analizados mediante RT-PCR cuantitativa utilizando sondas Taqman.
En la librería de sustracción encontramos 12 genes expresados diferencialmente, entre los que debemos destacar cuatro: AP-2·, Myc, Glis1
y Fhit. Estos genes eran expresados en las metástasis H-2 positivas y
su expresión disminuía en las metástasis H-2 negativas. Esta expresión
diferencial fue corroborada por RT-PCR a tiempo real. Estos resultados podrian indicar una relación directa en tre la perdida de expresión
de estos genes y la perdida de expresión de los componentes de la APM
y de las moéculas MHC de clase I. a continuación realizaremos estudios de transfección y de bloqueo de estos genes mediante siRNA para
poder determinar claramente su implicación en la expresión de moléculas MHC de clase I.
SESIÓN 8: INMUNIDAD E INFECCIÓN
Moderadores: Dr. Francisco Lozano (Granada),
Dra. Margarita Bofill (Barcelona)
LOS FAGO-RECEPTOSOMAS DE IFN-GAMMA/IL-6 SON COMPARTIMIENTOS DE SEÑÁLIZACIÓN Y LISTERICIDAS. Fernández Prieto L, Gomez Lopez MT, Madrazo Toca F, del Cerro Vadillo E,
Alvarez Domínguez C, Carrasco Marin E. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla-IFIMAV.
Los fagosomas son compartimientos intracelulares de destrucción
de Listeria monocytogenes; así si dichos fagosomas pertenecen a macrófagos activados con ciertas citocinas su potencial listericida es más exacerbado. Aquí describimos una nueva ruta de señalización mediada
por Stat1 que implica a las citocinas: IFN-gamma e IL-6 y que se compartamentaliza en fago-receptosomas de IFN-gamma/IL-6. Esta compartimentalización permite que tanto la destrucción del patógeno, la
respuesta immune específica y la regulación de la IL-6 queden ligados
en el mismo microambiente. La ruta listericida y compartimentalizada induce dos ondas de señalización Stat1-Rab5a dependientes y ligadas a la acción listericida de dos proteínas lisosomales; la esfingomielinasa ácida y la catepsina-D. Como parte de estas dos señales Stat1dependientes se regulan positivamente los mediadores de la phox:
p67phox/Rac2-GTP y se activa la iNOS fagosomal. Por otro lado, la
activación de Rab5a en esta vía, induce la transformación de dichos
fago-receptosomas listericidas IFN-gamma/IL-6 en compartimientos
de MIIC, donde se localizan moléculas MHC-II cargadas con péptidos,
se degrada el antígeno listeriolina O y se detectan otros marcadores
MIIC como Lamp-2 y Limp-2, pero de forma independiente a Stat1.
Nuestro grupo ha verificado la existencia de esta vía de compartimentalización en macrofagos deficientes geneticamente en los posibles
mediadores iniciales de esta vía como Stat1 y Stat3 y mediadores finales como esfingomielinasa ácida, catepsina-D, Lamp-2 y Limp-2; lo
cuál ha confirmado el papel de estos últimos en la inmunidad innata
frente a este patógeno.
40
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
NFAT5 PARTICIPA EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN
GÉNICA EN RESPUESTA A LA ACTIVACIÓN DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL. Minguillón J1,2, Buxadé M1,2, Berga R1, Aramburu J1,
López-Rodríguez C1. 1Unidad de Inmunología, Departamento de Ciencias
Experimentales y de la Salud (DCEX), Universitat Pompeu Fabra (UPF),
Parc de Recerca Biomédica de Barcelona (PRBB), Barcelona. 2Estos autores
han participado por igual en el trabajo presentado.
Los receptores tipo Toll (TLRs) participan directamente en la respuesta inmune innata ya que, tras su activación por reconocimiento de patrones moleculares asociados a los patógenos, desencadenan una cascada
de señales intracelulares destinada a la inducción de los genes responsables de la respuesta inflamatoria contra los patógenos. Aunque el control
transcripcional de la expresión de genes proinflamatorios en respuesta a
patógenos resulta clave, nuestro conocimiento de las interacciones moleculares que ocurren a este nivel es todavía relativamente limitado.
En respuesta a la activación de los TLRs en células inflamatorias
–macrófagos-, NFAT5 no sólo se induce, sino que además es reclutado
específicamente a las regiones que regulan la expresión de diferentes
genes proinflamatorios. Asimismo, los macrófagos derivados de médula ósea que carecen de NFAT5 son deficientes en la expresión (mRNA
y proteína) de diferentes mediadores inflamatorios y antimicrobianos
que se inducen tras la activación de los TLRs. Nuestro trabajo revela que
NFAT5 actúa como un regulador transcripcional durante la activación
de los TLRs y por lo tanto incrementa el conocimiento de los mecanismos moleculares que actúan durante esta respuesta.
VACUNAS: EL DIRECCIONAMIENTO AL RECEPTOR DE LA SIALOADHESINA MEJORA LA PRESENTACIÓN DE ANTÍGENO A
LAS CÉLULAS T. Poderoso García T, Revilla Calvo C, Álvarez Vega
B, Chamorro Pérez S, Martínez de la Riva S, Alonso Moreno F, Ezquerra Martínez A, Domínguez Juncal J. INIA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria).
El principal objetivo de una vacuna es inducir una respuesta inmune capaz de proteger de forma duradera frente un determinado patógeno. Una de las estrategias que se están investigando para potenciar la respuesta frente antígenos poco inmunogénicos es el direccionamiento de éstos a células presentadoras de antígeno (APCs), mediante su conjugación con anticuerpos específicos. La sialoadhesina (Sn) es
un miembro de la familia de proteínas Siglec (sialic acid binding Iglike lectins) cuya expresión está restringida a subpoblaciones de macrófagos tisulares, monocitos inflamatorios y algunas células dendríticas.
En este estudio hemos analizado la expresión de la sialoadhesina en
tejidos porcinos, su regulación por citocinas y su potencial como receptor para el direccionamiento antigénico. En el cerdo, la sialoadhesina
se expresa en macrófagos de la zona marginal del bazo y en células
dendríticas derivadas de monocitos cultivados con GM-CSF y IL-4
(MoDC). Los monocitos sanguíneos (Mo) no expresan esta molécula
pero puede inducirse mediante un tratamiento previo con IFN-a. Para
analizar si el direccionamiento de antígeno hacia este receptor favorece la presentación a las células T, comparamos la respuesta proliferativa obtenida con un anticuerpo monoclonal anti-Sn (1F1) con la obtenida con una Ig control del mismo isotipo (1D9). Como células respondedoras se utilizaron células T sanguíneas de cerdos inmunizados con
un pool de Igs de ratón y, como APCs, MoDc o Mo incubados con IFNa. Para obtener niveles similares de proliferación se necesitaron de 100
a 1000 veces menos cantidad de Ig control que de Ab anti-Sn. En con-
INMUNOLOGÍA
sonancia con estos resultados, la incubación de macrófagos y MoDC
con mAb 1F1 y 1D9 marcados con Alexa 488 a 37ºC durante 30 minutos, demostró que la Sn es un receptor endocítico. Estos datos sugieren que el direccionamiento de antígenos hacia la molécula de Sn podría
mejorar la eficiencia de su captación y/o procesamiento por las APCs.
Actualmente se está evaluando el potencial in vivo de esta molécula
como diana del direccionamiento de antígenos.
MECANISMOS DE ADYUVANCIA INMUNOLÓGICA: PAPEL DE
GITR EN EL EFECTO PROADYUVANTE DE LA ENTEROTOXINA
TERMOLABIL DE ESCHERICHIA COLI. Tamayo E1, Postigo J1, Santiuste I2, Riccardi C3, del Giudice G4, Merino R2, Merino J1. 1Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria. 2Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN. 3Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de
Perugia. 4Research Center, Novartis Vaccines.
La administración de antígenos proteicos en superficies mucosas
induce tolerancia sistémica a los mismos. Este efecto se evita administrando determinados “adyuvantes orales”, como la enterotoxina termolabil
de Escherichia Coli (LT) junto al antígeno vacunal. No obstante, el uso de
LT en vacunación en mucosas se ve lastrado por su gran toxicidad y por
el desconocimiento de los mecanismos inmunológicos implicados en su
efecto adyuvante. Para investigar estos mecanismos se analizó la capacidad de LT para inducir la activación y proliferación de los linfocitos a diferentes periodos tras su administración por vía parenteral. El análisis de
la expresión de diferentes marcadores de activación linfocitaria y de la
incorporación de BrdU en linfocitos, muestra que LT induce selectivamente la expresión de GITR en linfocitos T, pero no su proliferación. Este
efecto es dependiente de la actividad mono-ADPribosiltransferasa de LT,
dado que LTK63, un mutante atóxico de LT carente de esta actividad y
con un efecto pro-adyuvante reducido, no es capaz de inducir GITR en
linfocitos T. Así mismo, otro adyuvante inmunológico ampliamente utilizado en animales de experimentación como el adyuvante completo de
Freund, tampoco induce la expresión de GITR en linfocitos T.
El tratamiento de ratones adultos con gammaglobulina humana
monomérica (GGHM) induce un estado de tolerancia linfocitaria que
impide la respuesta frente a la forma inmunogénica del antígeno, la gammaglobulina humana agregada (GGHA). Usando este modelo experimental, observamos que LT, pero no LTK63, bloquea la inducción de
tolerancia a la GGH. Un bloqueo similar se observa si se administra DTA1, un AcM agonista anti-GITR, al mismo tiempo que la GGHM. Por el
contrario, LT no bloquea la inducción de tolerancia a la GGH en ratones
deficientes en GITR. En conjunto, nuestros resultados demuestran que
la inducción de GITR en linfocitos T por LT constituye uno de los mecanismos implicados en la actividad adyuvante de esta toxina.
RESPUESTA CELULAR INMUNE ESPECÍFICA AL VIRUS DE LA
HEPATITIS C (VHC) EN PAREJAS HETEROSEXUALES DE PACIENTES INFECTADOS. Roque Cuellar MC1, Aguilar Reina J1, Alvarez
Máquez MA2, García Lozano JR2, González Escribano MF2, Nuñez Roldan A2, Sánchez Sánchez B2. 1Sección de Hepatología. Servicio de Aparato
Digestivo. 2Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgen del Rocio.
En algunas series se ha encontrado respuesta inmune celular específica al VHC en parejas y familiares de pacientes con infección aguda
o crónica.
COMUNICACIONES ORALES
Objetivo. Conocer la prevalencia de la respuesta inmune de células T frente al VHC en parejas heterosexuales de pacientes con hepatitis crónica VHC.
Método. Se han incluido 30 parejas heterosexuales, sin Anticuerpos-VHC ni ARN-VHC (PCR a tiempo real, Taqman, Roche y Elisa,
Bep III, Dade Behring). Se realizó encuesta sobre riesgos de exposición.
Además se estudiaron 15 pacientes en diferentes situaciones respecto
al VHC (infección activa, respondedores y aclaramiento espontáneo)
y 10 controles sanos. Para la detección de una población de células T
memoria que responden a antígenos del VHC solubles, se partió de
sangre completa, que se enfrentó a los siguientes 6 péptidos del VHC:
1)NS3 (aa 1241-1260); 2)NS3 (aa 1531-1550); 3 NS3 (aa 1581-1600);
4)NS4b (aa 1771-1790); 5)NS5b (aa 2571-2590); 6)NS5b (aa 2941-2960).
Tras 6 horas de incubación en presencia de moléculas coestimuladoras y brefeldina A (BFA), se lisaron los hematíes y fijaron los leucocitos, para proceder al análisis mediante citometría de flujo, donde se
analizaron la siguientes combinaciones: CD69/CD3; CD69/CD4;
CD69/CD8; IFN?-IL-4/CD3; IFNγ-IL-4/CD4; IFNγ-IL-4/CD8. Todos
estos datos se analizaron estadísticamente mediante el programa SPSS
v.14.0 (H de Kruskal-Wallis y U de Mann Whitney).
Resultados. Los valores mayores que la media de los 10 controles,
y mayores que la media más dos desviaciones estándar de los 10 controles para cada mezcla, fueron considerados positivos.
Se comprobó mayor activación de CD4+ frente al péptido 5) en parejas que en controles. Estos signos de respuesta inmune son significativamente mayores en pacientes que en controles, y se comprobó mayor porcentaje de células CD3+ y CD8+ que secretan IL-4 frente al péptido 3).
Conclusiones. Las parejas de pacientes infectados crónicamente por
VHC muestran signos de haber entrado en contacto con el virus y de respuesta inmune celular específica a péptidos VHC. El papel potencial de esta
respuesta en la protección contra la infección por VHC es de gran interés.
LA APOPTOSIS DE LINFOCITOS MADUROS INDUCIDA POR
LA TOXINA TERMOLABIL DE E. COLI IMPLICA TANTO A LOS
RECEPTORES DE MUERTE EN MEMBRANA COMO A LA VIA
MITOCONDRIAL. Postigo J1, Tamayo E1, Fernández-Rey M1, Merino R2, Merino J1. 1Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria. 2Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN.
En estudios previos hemos demostrado que la enterotoxina termolabil de Escherichia Coli (LT) promueve apoptosis en linfocitos T y B inmaduros en el timo y médula ósea, respectivamente. Esta apoptosis no
implica a las vías de membrana de Fas o TNF, pero es inhibida tras la
hiperexpresión de Bcl-2. Así mismo, demostramos que LT induce la secreción por las glándulas suprarrenales de niveles elevados de glucocorticoides que son los responsables directos de la apoptosis en linfocitos
inmaduros. En vista de estos hallazgos, nos planteamos analizar en primer lugar la posible participación de receptores de muerte diferentes de
Fas y TNFR, o de mecanismos independientes de la activación de caspasas mediados por AIF, en el efecto pro-apoptótico de LT sobre los timocitos inmaduros (como ejemplo de linfocitos inmaduros). En segundo
lugar, analizamos si LT promueve también apoptosis en linfocitos T y B
maduros y sus posibles mecanismos. Para ello, estudiamos el efecto proapoptótico de LT sobre timocitos y linfocitos T maduros en ratones deficientes AIF en linfocitos T o en Bim así como en animales transgénicos
para un dominante negativo de FADD (FADD-DN Tg) en linfocitos T,
que bloquea la apoptosis inducida por todos los receptores de muerte.
41
COMUNICACIONES ORALES
Nuestros resultados muestran que la ausencia de AIF o la sobre-expresión de FADD-DN en timocitos no bloquea la apoptosis inducida por
LT. La ausencia de Bim reduce significativamente esta apoptosis en concordancia con el papel regulador de Bcl-2 en la misma. Por el contrario,
la apoptosis inducida por LT en linfocitos T maduros esta reducida en
los animales FADD-DN Tg a un nivel similar al observado en ratones
que sobre-expresan Bcl-2 en linfocitos T o adrenalectomizados. En este
sentido, la inhibición fue completa en ratones FADD-DN/Bcl-2 dobleTg. Estudios preliminares con ratones lpr o tratados con un mAb antiTRAIL sugieren que el receptor Fas es el responsable de la muerte inducida por LT mediada a través receptores de membrana. En conclusión,
nuestro estudio demuestra que LT promueve apoptosis de linfocitos
maduros e inmaduros mediante mecanismos diferentes.
CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS PRODUCTORAS DE IL10 EN ÓRGANOS LINFOIDES DE CERDOS AFECTADOS NATURALMENTE POR CIRCOVIROSIS PORCINA. Crisci E1, Domínguez
J2, Segalés J1,3, Montoya M1. 1Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona. 2Departamento de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación
y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Madrid. 3Department de Sanitat i d’Anatomia Animals, Facultat de Veterinaria, Universitat Autònoma de
Barcelona (UAB), Barcelona.
La circovirosis porcina es una enfermedad de distribución mundial que afecta a los cerdos. Se considera un proceso multifactorial causado esencialmente por circovirus porcino tipo 2 (PCV2). Esta enfermedad se caracteriza patológicamente por depleción linfocitaria e inflamación granulomatosa en los órganos linfoides, y actualmente se sabe
que el sistema inmune es clave en la patogénesis de la enfermedad.
Estudios previos han revelado un perfil de citoquinas indicativo de
inmunosupresión de células T, una discapacidad en la respuesta innata y sugieren que la interleuquina 10 (IL-10) tiene una importante función durante el curso de la infección. El objetivo principal de este estudio fue caracterizar y localizar las subpoblaciones de células inmunitarias involucradas en la secreción de IL-10. Para ello, se usó la inmunofluorescencia indirecta en criosecciones de órganos linfoides (bazo
y linfonodo mediastínico) de 4 animales sanos y 4 animales afectados con la enfermedad. Los resultados obtenidos mostraron que las
subpoblaciones linfocitarias CD4+ y CD8+ producen IL-10 en los tejidos estudiados, mientras que en las células presentadoras de antígeno (MHCII+), los macrófagos/monocitos (CD163+) y los granulocitos
no se detectó co-localización con la IL-10. Mediante el contaje visual
de las células doblemente positivas, los resultados indicaron que el
número de células productoras de IL-10 es aproximadamente el doble
en los animales enfermos en comparación con los sanos. Este es el primer estudio de caracterización de las células productoras de IL-10 en
animales con circovirosis porcina. Actualmente se está estudiando su
correlación con la presencia de PCV2 en las mismas secciones.
NIVEL, FENOTIPO Y ACTIVACIÓN DE LAS CÉLULAS T REGULADORAS FOXP3+CD4+ EN PACIENTES CON INFECCIÓN POR LOS
VIRUS DE LA HEPATITIS C Y/O VIH. Ibón Rallón N, López M, Soriano V, García-Samaniego J, Romero M, Labarga P. Hospital Carlos III.
Introducción. Las infecciones por VIH y VHC pueden alterar
la población de células T CD4+ reguladoras (Treg). Esta población
42
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
contribuye a la persistencia viral inhibiendo la respuesta inmune
celular específica. En este estudio se analiza el nivel, fenotipo y grado de activación de las Treg en pacientes con infección por VHC
y/o VIH.
Métodos. Se estudiaron 91 pacientes: 20 controles, 20 pacientes
VHC-/VIH+, 20 VHC+/VIH- y 31 coinfectados VHC+/VIH+. Las Treg
se definieron como CD4+Foxp3+. El nivel, fenotipo (basado en CD25,
CD45RA, CD27 y CD127) y el grado de activación (basado en CD38)
de estas células fueron analizados por citometría de flujo de 5 colores.
Las diferencias entre grupos se evaluaron con pruebas estadísticas
no paramétricas.
Resultados. El nivel de Treg fue mayor en pacientes VIH+ que en
controles y que en pacientes VHC+/VIH- (p=0.01). Tanto en pacientes
como en controles sólo el 50% de las Treg expresaron CD25. El 95% de
las Treg CD25+ tenían fenotipo CD45RA-CD127- en todos los grupos,
mientras que las Treg CD25- fueron más heterogéneas en su fenotipo. El 65% de las Treg fueron CD45RA- CD27+ (memoria central),
sin diferencias entre controles y pacientes. Sin embargo, las Treg
CD45RA+CD27+ (naive) fueron menos frecuentes en pacientes que en
controles (p=0.04). La activación de las Treg fue mayor que la de células CD4+ totales en todos los grupos (p<0.0001).
Conclusiones. La infección por VIH induce un incremento de las
Treg activadas. CD25 define dos poblaciones de Treg con diferente perfil fenotípico. El nivel de Treg aumenta en paralelo a la disminución
de CD4, lo que podría contribuir al curso acelerado de la lesión hepática en pacientes VHC+/VIH+.
ESTIMACIÓN DE LA INFECCIÓN TUBERCULOSA EN DONANTES DE SANGRE DE LA COMUNIDAD DE CANTABRIA
MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE IFN-GAMMA TRAS ESTIMULACIÓN CON ANTÍGENOS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Villegas N1, Gonzalo Ocejo-Vinyals J1, Amunárriz C2, Ausín
F1, Leyva-Cobián F1, Arroyo JL2. 1Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. 2Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria.
Introducción. Las comunidades del norte de España, como
Cantabria, junto con Portugal tienen la mayor incidencia y prevalencia de infección tuberculosa en Europa. En los últimos años,
la introducción de un ensayo para medir mediante enzimoinmunoanálisis (ELISA) la producción específica de IFN-gamma (interferon-gamma release assay, IGRA) tras estimulación de las células
linfoides con antígenos de Mycobacterium tuberculosis, ha contribuido a aumentar la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico inmunológico de la infección tuberculosa. Nuestro objetivo ha
sido utilizar el IGRA para conocer la prevalencia de la infección
por M. tuberculosis en la población sana donante de sangre de nuestra Comunidad.
Materiales y Métodos. Se incluyeron en este estudio 167 donantes de sangre (111 varones, 56 mujeres) con edades comprendidas
entre 19-65 años y que tras ser adecuadamente informados consintieron participar en este estudio. Todos fueron sometidos a los cuestionarios y análisis habitualmente establecidos en un Banco de Sangre. Para este estudio, el IGRA utilizado fue el comercialmente conocido como QuantiFERON®-TB Gold In-Tube. Se obtuvieron tres muestras de sangre circulante en tubos estériles con vacío previo. Un tubo
contenia antígenos de M. tuberculosis (ESAT-6, CFP-10 y TB 7.7), otro
una concentración óptima de fitohemaglutinina y un tercero sin aditivos. Todos los tubos se incubaron (37ºC, 16-24 hr) y tras centrifuga-
INMUNOLOGÍA
COMUNICACIONES ORALES
ción (4oC, 15 min, 2,000 X g), se determinó la concentración de IFNgamma presente en el plasma recogido mediante ELISA. Los resultados se interpretaron con un soporte informático proporcionado por
el proveedor. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de Chi 2
con corrección de Yates o la prueba exacta de Fisher cuando fue necesaria.
Resultados. De los 167 individuos analizados, 27 presentaban concentraciones elevadas de IFN-gamma y fueron considerados positivos (16,17%). No se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre sexos (20 varones, 7 mujeres). Sin embargo, si que existían diferencias significativas cuando se agruparon
los donantes en tres grupos de edad (18-35, 36-50 y 51-65 años) siendo la prevalencia mayor en el grupo de más edad (prueba de homogeneidad entre niveles, p = 0.02; prueba de tendencia lineal, p =
0.006).
Conclusión. La utilización del IGRA supone una ventaja para el
despistaje de la infección por M. tuberculosis frente al método clásico
de la intradermorreacción de Mantoux, pues aporta mayor sensibilidad y especificidad. Los resultados de este estudio apuntan a una elevada prevalencia de infección tuberculosa en la población sana donante de sangre de Cantabria.
SESIÓN 9: CÉLULAS DENDRÍTICAS
Moderadores: Dr. Ángel Corbí (Madrid),
Dr. Francisco Borrás (Barcelona)
MHC DE CLASE I PROTEGE DEL RECORTE POR AMINOPEPTIDASAS DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO IN VITRO. Infantes S1,
Samino Y2, Lorente E1, Jiménez M1, del Val M2, López D1. 1Unidad de
Proteómica. 2Unidad de Inmunología Viral. Centro Nacional de Microbiología. ISCIII.
En la denominada vía clásica de presentación antigénica asociada
a moléculas MHC de clase I, las proteínas virales sufren diversos cortes proteolíticos que generan péptidos de diferente longitud, algunos
de los cuales pueden ser posteriormente transportados al lumen del
Retículo Endoplásmico (ER) en donde se encuentran expuestos a la
actividad de aminopeptidasas del ER (ERAAP).
Actualmente, se han propuesto dos modelos diferentes para explicar el mecanismo de acción de ERAAP. El primero denominado "molecular ruler" propone la unión del sustrato largo por sus extremos a la
enzima. El carboxilo terminal interacciona con un “pocket” hidrofóbico y el amino terminal queda accesible al sitio activo de la enzima que
va eliminado los residuos de forma no procesiva. Los productos finales de 9-10 aminoácidos se unirían después a MHC. El segundo modelo propuesto o “template model” supone que los precursores peptídicos largos se unen primero a MHC por su extremo carboxilo, dejando accesible su extremo amino protuberante a la actividad de la enzima.
Hemos estudiado la degradación por ERAAP de un ligando natural de 16 aminoácidos que es reconocido por linfocitos T citolíticos. Los
datos in vitro obtenidos indican que este péptido amino-protuberante es eficientemente recortado por ERAAP hasta el epítopo mínimo de
9 residuos mientras se encuentra soluble y que su unión a la molécula de histocompatilibidad lo protege de la actividad proteolítica de la
enzima.
LA EXPRESION DE LA MOLECULA MR1 (MHC-RELATED 1)
HUMANA EN LA SUPERFICIE CELULAR NECESITA LIGANDOS
QUE SON INDEPENDIENTES DE LA ACTIVIDAD DEL PROTEASOMA. Abos Gracia B, Gómez del Moral M, Gozalbo López B, Cedenilla Horcajuelo M, Martínez Naves E. Universidad Complutense. Madrid.
Introducción. MR1 (MHC-related 1) es una molécula HLA de clase I no clásica que restringe el desarrollo de los linfocitos MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells), caracterizados por poseer un TCR
invariante. La función de las células MAIT se desconoce, pero parecen
tener propiedades inmunoreguladoras. Tampoco se conoce el ligando
presentado por MR1 a los MAIT.
Objetivos. Analizar la expresión de MR1 en la superficie celular,
su dependencia de temperatura (como marcador de dependencia de
ligando) y de la actividad del proteasoma.
Metodología. La expresión celular de MR1 se analizó mediante
técnicas de citometría de flujo e inmunohistoquímica utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales anti-MR1. Se analizaron líneas
celulares de diferente linaje incluyendo L721.221 y C1R transfectadas
con MR1 y denominadas MR1.221 y MR1.C1R respectivamente.
Resultados. Las líneas transfectadas MR1.221 y MR1.C1R expresaron altos niveles de MR1 en la superficie, a diferencia del resto de líneas analizadas. Sin embargo a 26 ºC MR1 fue detectable en todas las líneas linfoblastoides y las células transfectadas también incrementaron la
expresión de MR1. Esto sugiere que la expresión de MR1 en la superficie celular está limitada por la disponibilidad de ligandos ya que su comportamiento es similar a las moléculas HLA de clase I clásicas.
También estudiamos la dependencia de la expresión de MR1 del
proteasoma. Para ello analizamos la re-expresión en superficie de MR1
en la línea MR1.221 después de someterla a condiciones de “elución”
a pH ácido. Hemos observado que MR1 es sensible al tratamiento ácido, al igual que lo son las moléculas HLA de clase I clásicas. Sin embargo, al contrario de lo que sucede con éstas, la re-expresión de MR1 en
la superficie después de la elución ácida no es bloqueada por inhibidores específicos del proteasoma.
Conclusión. La expresión de MR1 en la superficie celular necesita de ligandos que son independientes de la actividad del proteasoma.
FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE IREM-2 RECEPTOR (CD300e)
IN HUMAN MONOCYTES. Brckalo T1, Cassatela MA2, López-Botet
M1. 1Universitat Pompeu Fabra. 2University of Verona.
The CD300e (IREM-2) was originally reported to be expressed
by mature monocytes and peripheral blood myeloid dendritic cells
The receptor was associated with the DAP-12 adaptor in co-transfected cells and was capable of inducing NFAT transcriptional activity
upon engagement by a specific mAb (Aguilar et al. 2004. J. Immunol.
173:6703-6711). In this study we have investigated the functional effects
of CD300e ligation in various responses of human monocytes. Upon
engagement by an agonistic mAb, CD300e triggered an intracellular
calcium mobilization and the release of reactive oxygen intermediates
in freshly isolated cells. Stimulation via CD300e triggered the release
of pro-inflammatory chemokines and cytokines (i.e. IL-8/CXCL8 and
TNF·), up-regulated the expression of cell surface activation markers
(i.e. CD25, CD83 and CD86) and promoted cell survival. Primary
monocytes differentiated into alternatively activated macrophages
following the activation through CD300e, as evidenced by higher
expression of CD14, CD16 and CD163 cellular markers. Monocytes sti-
43
COMUNICACIONES ORALES
mulated by IL-4, GM-CSF, but not M-CSF modulated CD300e expression within the first 24h of culture. Overall, our data demonstrate that
CD300e is a functional activating receptor in human monocytes involved in regulating the innate immune response.
CARACTERIZACIÓN DE MACRÓFAGOS PERITONEALES
ALTERNATIVAMENTE ACTIVADOS (MAA): IMPLICACIONES
PARA UN PAPEL EN MECANISMOS DE FIBROSIS RELACIONADOS CON ANOMALÍAS EN LA MEMBRANA PERITONEAL. Martínez Cabeza V, Lucendo B, Auxiliadora Bajo M, Castro MJ, del Peso
G, Selgas R, Bellón T. Hospital Universitario La Paz, Madrid.
La diálisis peritoneal puede desencadenar un proceso de fibrosis
peritoneal que finalmente condiciona el estado funcional de la membrana peritoneal. Las infecciones peritoneales y la composición de los
líquidos de diálisis influyen en el estado del peritoneo. Los macrófagos peritoneales (Mp) no han sido asociados con capacidades defensivas eficientes contra infecciones en pacientes de diálisis peritoneal.
Esto sugiere que los Mp podrían haber desarrollado otras funciones
como las que presentan los macrófagos alternativamente activados
(M2/MAA) cuya capacidad para participar en fibrosis de órganos ha
sido demostrada. Se ha usado citometría de flujo, RT-PCR y qRT-PCR
para analizar el fenotipo de los macrófagos de efluente peritoneal en
pacientes a los que se les realiza diálisis peritoneal, y se ha probado su
capacidad para estimular la proliferación de la línea celular de fibroblastos humanos IRM90 y de fibroblastos primarios de piel. Se han
comparado Mp de pacientes con y sin peritonitis activa. Los resultados muestran la presencia de M2/MAA en el peritoneo y sugieren que
distintas subpoblaciones de M2/MAA podrían participar en fibrosis
peritoneal produciendo citoquinas y quimioquinas profibrogénicas y
estimulando el crecimiento de fibroblastos.
VISUALIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS POR LA TÉCNICA DE
SEM-FIB EN EL INTERIOR DE MACRÓFAGOS. Díaz-Freitas B1,
Méndez J2, Pastoriza I3, Sánchez-Espinel C1, Faro J1, Magadán S5, Líz
Marzán L3, González-Fernández A1. 1Área de Inmunología -Campus Lagoas Marcosende, Universidad de Vigo (Pontevedra). 2Centro de Apoyo Científico-Tecnológico a la Investigación (CACTI)-Campus Lagoas Marcosende, Universidad de Vigo (Pontevedra). 3Grupo de Química Coloidal- Campus Lagoas
Marcosende, Universidad de Vigo (Pontevedra). 4Estudos Avançados de Oeiras, Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras, Portugal. 5Instituto Superior de
Saude do Alto Ave (ISAVE), Quinta de Matos, Geraz do Minho, Portugal.
Antecedentes. La nanotecnología ha irrumpido con fuerza en el
campo biomédico especialmente en el campo del diagnóstico, pero en
los últimos años también se está evaluando su gran potencial en terapia
humana. La mayoría de las nanoparticulas (Nps) son reconocidas y rápidamente fagocitadas por los macrófagos del sistema retículo endotelial (fundamentalmente en hígado y bazo). Este proceso depende del
tamaño, cobertura e hidrofobicidad de las Nps. Las Nps pequeñas (inferiores de 90 nm de diámetro) son fácilmente visualizables mediante
microscopía electrónica de transmisión (TEM), pero ésta es una técnica
costosa y tediosa, mientras que la técnica de microscopía electrónica de
barrido (SEM), no permite visualizar el interior de las células. Por todo
ello, el desarrollo y uso de nuevas técnicas de microscopía electrónica
podrían ayudar a conocer las rutas de internalización de estas nanoestructuras, proporcionando mapas intracelulares.
44
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Objetivos. Implementar una metodología “Dual Beam System”
(SEM/FIB) - que combina las técnicas ya conocidas de microscopía
electrónica de barrido (SEM) con aquellas derivadas del uso de un
cañón de iones (FIB), como la obtención de cortes en láminas muy finas
(técnica de milling)- que permita la localización y el seguimiento de
nanopartículas de oro en el interior celular.
Metodología. Se incubaron macrófagos peritoneales durante 24h
con Nps de oro recubiertas con sílice (NPs de 50nm de diámetro). Se
fijaron y se incluyeron en resina Epoxy y se realizaron cortes de dichas
preparaciones mediante la técnica de miling. Las preparaciones fueron visualizadas mediante SEM (detector de electrones retrodispersados) y se realizó una composición tridimensional del conjunto de las
observaciones.
Resultados. Las Nps de oro aparecen fundamentalmente en los
fagosomas y endosomas de los macrófagos, sin observarse la llegada
de ninguna Np al núcleo celular. El estudio de diversos cortes realizados con un Dual Beam System y la posterior composición tridimensional, muestra varias Nps en el interior del mismo fagosoma, y hasta un
total de 14 vesículas mostraron en su interior nanopartículas. No se
observó una polarización del proceso de fagocitosis, observándose NPs
distribuidas bastante homogéneamente por el interior de los macrófagos. El estudio se completó mediante la técnica de TEM, que permitió
confirmar los datos obtenidos por SEM-FIB.
Conclusiones. La combinación de las técnicas de SEM y FIB puede
ser empleada con éxito para la visualización intracelular de nanopartículas de oro en el interior de distintos compartimentos celulares.
TLR-TRIGGERING ON TOLEROGENIC DENDRITIC CELLS
RESULTS IN TLR2 ENHANCEMENT AND AN IMPAIRED PROINFLAMMATORY PROGRAMME. Chamorro Pérez S1, García-Vallejo JJ1, Unger W2, Fernandes R1, Bruijns S CM1, Laban S2, Roep BO2,
T´Hart BA3, Van Kooyk Y1. 1VUmc, Ámsterdam, 2 LUMC, Leiden, 3 BPRC,
Rijswijk.
Dendritic cells modulated with either cytokines or pharmacological mediators offer a therapeutic potential to ameliorate or prevent
autoimmune diseases. These modulated tolerogenic cells (TDC) inhibit adaptative immune responses by using immunosuppressive mechanisms as anergy induction or Treg generation. However, little is know
about their TLR repertoire and how TLR agonists different than LPS
modulate their responses.
We here have made a full analysis and comparison of the innate
characteristics of three types of human tolerogenic DC obtained by
addition of either IL10 (IL10-DC), dexamethasone (DX-DC) or calcitriol (1,25(OH)2D3-DC) to monocyte-derived dendritic cells. A detailed analysis of TLR mRNA expression (TLR1-TLR10) was performed
by qRT-PCR. Likewise we investigated the effects on maturation, cytokine release, allostimulatory capacity and T cell driven differentiation
on TDC triggered by TLR2, 3, 4 and 5 agonists.
We show that TDC are endowed with the same TLR set as monocyte-derived dendritic cells although responding differently to TLRmediated stimulation. Strikingly, only tol-DC upregulated the expression of TLR2 (mRNA and protein) in response to specific TLR agonists
(pam3CSK4, poly I:C, LPS and flagellin). TLR2 increase decodes TDC
to further pam3CSK4 restimulation and it is partially modulated by
p38MAP kinase. TDC expressed low/no IL12-related cytokines and
remarkably elevated IL10 levels. Nevertheless differences among stimulated-TDC were detected, DX-DC and 1,25(OH)2D3-DC upregula-
INMUNOLOGÍA
ted TLR2 irrespective the TLR triggered whereas LPS-mediation was
observed on IL10-DC. Likewise DX-DC and 1,25(OH)2D3-DC exhibited reduced allostimulatory properties, impaired ability to maturate and hampered capacity to differentiate naïve T cells to effector Th1
cells. Therefore both DX-DC and 1,25(OH)2D3-DC display the strongest tolerogenic and anti-inflammatory features and might be beneficial for the treatment of autoimmune diseases.
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA, MORFOLÓGICA Y FUNCIONAL DE LOS PRECURSORES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMOCITOIDES EN MÉDULA ÓSEA DE
ADULTOS SANOS. Martín Martín L1,2, Almeida Parra J1,2, Hernández Campo PM2, Sánchez García ML2, Lécrevisse Q1, Orfao de Matos
A1,2. 1Centro de Investigación del Cáncer (CSIC/USAL), Salamanca. 2Servicio de Citometría y Departamento de Medicina, Universidad de Salamanca.
Introducción. Actualmente se desconoce la secuencia de maduración de los precursores de células dendríticas plasmocitoides (preCDp). Objetivo: analizar las características fenotípicas, morfológicas y
funcionales de los pre-CDp durante su maduración en médula ósea
normal (MON) de adultos.
Metodología. El estudio fenotípico (n=33 MON) se realizó mediante citometría de flujo con combinaciones séxtuples de anticuerpos monoclonales; la caracterización morfológica (n=4) sobre pre-CDp purificados, teñidos con May-Grümwald-Giemsa; la secreción de IFN-alfa (n=3)
se determinó mediante ELISA, tras estimulación de poblaciones purificadas con CpG, y la capacidad de endocitosis (n=3), mediante captación de dextrano.
Resultados. Sistemáticamente se identificaron tres estadios madurativos de pre-CDp, de acuerdo a la expresión de HLA-DR/CD34/
CD45/CD123. La expresión de moléculas presentadoras de antígeno
se mantuvo alta a lo largo de la maduración, mientras que la de las
moléculas asociadas a CDp aumentó progresivamente. Curiosamente, CD86 se expresaba en las células más inmaduras, siendo indetectable en las más maduras, mientras que CD40 sólo se detectó en el estadio más maduro. El análisis morfológico de las subpoblaciones purificadas de pre-CDp de MON reveló un aumento progresivo de la indentación nuclear y una disminución de la basofilia citoplasmática con
la maduración. Sólo se observaron prolongaciones citoplasmáticas
en los pre-CDp estimulados con CpG. La única población capaz de
secretar IFN-alfa tras estimulación fue la más madura, mientras que la
de mayor capacidad endocítica fue la más inmadura.
Conclusiones. En MON de adultos existen al menos tres estadios
de diferenciación de la línea de CDp, con características fenotípicas,
morfológicas y funcionales distintas; además, nuestros hallazgos señalan que los pre-CDp más inmaduros tendrían capacidad de endocitosis y/o presentación antigénica, lo que sugiere que podrían tener un
papel relevante en la inducción de tolerancia.
EXPRESIÓN DE FAS, FASL E ILT2 POR LAS CÉLULAS DENDRITICAS DE DECIDUA HUMANA NORMAL Y DE ABORTO
ESPONTÁNEO. Tirado González I, Muñoz-Fernández R, Blanco O,
Leno E, de Lamata Espinosa C, Ortiz-Ferrón G, Abadía Molina AC,
Olivares G. Centro de Investigación Biomédica.
Introducción. La decidua es el tejido materno que se encuentra en
íntimo contacto con el trofoblásto fetal. Es un lugar privilegiado en el
COMUNICACIONES ORALES
que la actividad inmunitaria está disminuida. La apoptosis de las células inmunitarias ha sido propuesta como un mecanismo para el mantenimiento del privilegio inmunológico, participando no solo el sistema TRAIL-TRAIL-R sino también el sistema FAS-FASL. Por otro lado
la expresión de receptores inhibidores, como el ILT2, participarían en
la deshinibición de las funciones citotóxicas. La actividad inmunológica materna frente al feto podría ser un mecanismo biológico eficiente para eliminar fetos cuando se presente algún problema con la gestación, determinándose que solo los fetos en un estado adecuado llegarán al final de la gestación.
Objetivo. El objetivo del presente trabajo es determinar la expresión de FAS, FASL e ILT2 en decidua de aborto espontáneo y decidua
normal.
Materiales y métodos. Las muestras de decidua normal (ABI) y
de aborto espontáneo (ABE) fueron procesadas y tratadas por gradiente de Ficoll-Histopaque. Las células dendríticas fueron estudiadas
mediante citometría de flujo en base a la expresión de DC-SIGN (marcador característico de las DC inmaduras, iDC), estudiándose mediante doble marcaje la expresión de FAS, FASL e ILT2.
Resultados. La población DC-SIGN+ (marcador de iDC) indica una población principal de iDC, confirmada por la baja expresión de CD83 (marcador de mDC). Se ha podido ver la co-expresión de FAS, FASL e ILT2 tanto en ABI como en ABE, siendo esta
expresión inferior en ABE y con diferencia estadísticamente significativa.
Conclusiones. Las DC de ABE participarían en menor grado en
los mecanismos de apoptosis que tiene lugar en la decidua, y serían
menos susceptibles a ella en comparación con las DC de ABI. Además
estarían menos protegidas de la actividad citotóxica celular debido a
la menor expresión del receptor inhibidor ILT2.
CONTRIBUCIÓN DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMACITOIDES INTRATÍMICAS A LA GENERACIÓN DE CÉLULAS T
REGULADORAS NATURALES. IDENTIFICACIÓN DE PROGENITORES FISIOLÓGICOS. Martin Gayo E, Toribio García ML. Centro de Biología Molecular.
El timo constituye un órgano clave en la educación de los linfocitos T. Durante el desarrollo intratímico, los progenitores de los linfocitos T generan timocitos CD4+CD8+ (DP) que expresan por primera
vez un TCR·‚, que participa directamente en los procesos de selección positiva y negativa mediante el reconocimiento de antígenos presentados por células del epitelio cortical (TEC) o por células dendríticas medulares (DCs), respectivamente. Además, el timo es también
el lugar de generación de las células T reguladoras naturales (Treg),
caracterizadas por el fenotipo CD4+ CD25+ Foxp3+. Estas células son
potentes inmunosupresoras, que pueden inhibir la proliferación de linfocitos periféricos vía la secreción de citoquinas tales como IL-10 y
TGF‚. Actualmente, el origen de las Treg intratímicas es desconocido,
aunque algunos estudios sugieren que estas células podrían proceder
de timocitos auto-reactivos que logran escapar de la selección negativa. En el timo humano habitan dos tipos de DCs: DCs convencionales
(cDCs) y DCs plasmacitoides (pDCs). Estudios previos sugieren una
implicación de las cDCs intratímicas en la generación de Treg, mientras que la capacidad de las pDCs en dicho proceso no ha sido analizada. En este estudio demostramos que las pDCs intratímicas activadas con CD40L e IL3 (MpDCs), pero no las pDCs inmaduras, son capaces de inducir la generación de células CD25+Foxp3+, con caracterís-
45
COMUNICACIONES ORALES
ticas funcionales idénticas a las descritas para células Treg, a partir de
timocitos 4SP y linfocitos CD4+ periféricos alogénicos. Además, hemos
identificado una población de timocitos DP TCRhiCD69hi que contiene progenitores capaces de generar células Treg en respuesta a MpDCs
autólogas.
Por último, hemos descrito la expresión de la molécula HLA-G
en las pDCs intratímicas y su implicación en el proceso de inducción
de Treg. Por tanto, estos resultados indican que las pDCs intratímicas podrían desempeñar una importante función en el establecimiento de la tolerancia central vía la generación de Treg naturales en el
timo.
SESIÓN 10: CÉLULAS T
Moderadores: Dr. Manel Joan (Barcelona),
Mª Luisa Toribio (Madrid)
LA PROTEÍNA ADAPTADORA AKAP450 REGULA LA TRANSLOCACIÓN DEL MTOC, LA ORGANIZACIÓN DE LA SINAPSIS
INMUNE Y LA SEÑALIZACIÓN TRAS LA ACTIVACIÓN DEL TCR
EN CÉLULAS T. Robles Valero J1, Martín-Cófreces NB1, Lamana
Domínguez A1, Ríos RM2, Sánchez-Madrid F1. 1Hospital Universitario
La Princesa. 2Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla.
La translocación del centro organizador de microtúbulos (MTOC)
es un evento temprano que tiene lugar cuando una célula T o NK interacciona con una célula presentadora de antígeno (APC), con la consiguiente formación de la denominada sinapsis inmune. Sin embargo,
es ahora cuando se empiezan a conocer los mecanismos moleculares
implicados en la polarización del MTOC al área de contacto. AKAP450,
miembro de la familia de las proteínas de anclaje a PKA (AKAPs) localizada fundamentalmente en el centrosoma, es una proteína adaptadora de gran peso molecular capaz de ensamblar y compartimentalizar múltiples moléculas señalizadoras y estructurales, además de servir de nexo entre el MTOC y el aparato secretor.
En el presente estudio abordamos el posible papel que podría
desempeñar AKAP450 en la polarización del MTOC, la organización
de la sinapsis inmune y la activación de la célula T. La sobreexpresión del dominio C-terminal de AKAP450 unido a GFP, que actúa
como dominante negativo, y oligos de interferencia (siRNA) específicos que reducen considerablemente la expresión de la proteína,
previenen el anclaje del MTOC en la zona de contacto entre la célula T y la célula presentadora, llegando a evitar la propia translocación, utilizando tanto un sistema antígeno como superantígeno específico. Además, AKAP450 es requerida para una correcta señalización tras la activación del TCR en respuesta a presentación de antígeno, ya que el silenciamiento de la proteína provoca un descenso
considerable de la fosforilación de proteínas tales como LAT, PLCÁ1
o PKCı. Este defecto en señalización corrobora con una reducción
considerable de la producción de IL-2 medida mediante ELISA. Igualmente, AKAP450 es necesaria para la polarización a la sinapsis de
ciertas moléculas básicas para la formación correcta de la misma, tales
como PKCı.
Por ello, nuestros resultados sugieren un papel fundamental de
AKAP450 en la organización de la sinapsis inmune y en la reorientación antígeno específica del MTOC.
46
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
NOTCH1 CONTROLA LA EXPANSIÓN DE LOS PROGENITORES
HUMANOS DE CÉLULAS T Y DE CÉLULAS LEUCÉMICAS A
TRAVÉS DE LA REGULACIÓN DEL RECEPTOR DE IL-7. González García S1, García Peydró M1, Martín Gayo E1, Ferrando AA2, Toribio ML1. 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid. 2Institute for
Cancer Genetics, Columbia University. New York, USA.
La diferenciación de los linfocitos T implica la adquisición de un
patrón de expresión génica específico, el silenciamiento de genes de desarrollo de linajes no-T y la expansión de los progenitores T. En este proceso participan coordinadamente las vías de señalización de Notch1 y
del receptor de interleuquina 7 (IL-7R). Recientemente mostramos que
la cadena alfa de IL-7R (IL-7R·) es una diana transcripcional directa de
Notch1, vía el factor de transcripción CSL. En este estudio hemos analizado el papel funcional de la vía de Notch y de IL-7R durante el desarrollo intratímico humano. Estudios de expresión génica muestran una
alta correlación en el patrón de expresión de ambas vías durante la maduración de los linfocitos T. En ensayos funcionales de diferenciación de
células T, demostramos que la inhibición de la señal de Notch provoca
una drástica reducción en los niveles de expresión en membrana de
IL-7R, bloqueando la proliferación de células pre-T. Sin embargo, este
bloqueo en proliferación es rescatado tras la sobre-expresión de IL-7R·
mediante vectores retrovirales, indicando que el papel de Notch durante los estadios más inmaduros de diferenciación T es el mantenimiento
de la proliferación en respuesta a IL-7. Así mismo, mostramos que este
mecanismo de regulación del IL-7R mediado por Notch ocurre también
en leucemias linfoblásticas agudas T dependientes de Notch, en las cuáles la sobre-expresión del IL-7R es capaz de rescatar el bloqueo en proliferación consecuente a la inhibición de Notch. Por tanto, proponemos que la señalización por Notch1 contribuye a la proliferación de
los precursores T y de células T leucémicas regulando los niveles de
expresión del receptor de IL-7 y la capacidad de respuesta a IL-7.
ICOS (CD278) ES NECESARIO PARA LA HOMEOSTASIS PERIFÉRICA DE LAS CÉLULAS Treg CD4+CD25+FoxP3+. Ojeda G1, Pini
E1, Bello R2, Portolés P1, Rojo JM2. 1Centro Nacional de Microbiología, I.S.
Carlos III. 2Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC.
ICOS (CD278) es una molécula coestimuladora de la familia de CD28,
expresada de modo característico por los linfocitos T activados. Comparando linfocitos de ratones genéticamente deficientes en ICOS (ICOSko)
y de ratones normales, se ha examinado el posible papel de ICOS en el
desarrollo y las funciones de la población de células T reguladoras naturales CD4+CD25+FoxP3+ derivadas del timo. En primer lugar, se ha
observado que las células CD4+CD25+ de ratones deficientes en ICOS
son plenamente funcionales, de acuerdo con los datos de ensayos de Treg
“in vitro”. Así, la capacidad para suprimir la proliferación o la producción de IL-2 en células CD4+CD25- es comparable usando Treg de ratones ICOSko o de ratones normales, independientemente del origen (ICOSko, o normales) de las células respondedoras y accesorias. Esto indica
que ICOS no es necesario para la función supresora de estas células. En
cambio, el número de células Treg CD4+CD25+ se encuentra significativamente reducido en el bazo de ratones ICOSko, si se compara con el
bazo de ratones normales de la misma edad y sexo. Esta reducción no es
debida ni a una expresión más baja de CD25 por las células Treg
CD4+FoxP3+ en los ratones ICOSko, ni a una generación deficiente en el
timo de las células Treg CD4+CD25+FoxP3+. Además, las células T CD4+
de ratones ICOSko pueden recibir eficientemente coestímulos de CD28
INMUNOLOGÍA
y producir IL-2, que son dos factores muy importantes en la generación
eficiente de células Treg CD4+CD25+. En cambio, sí se ha observado una
mayor susceptibilidad a la apoptosis espontánea en las células Treg
CD4+CD25+ procedentes de ratones deficientes en ICOS. Esto podría
contribuir a su menor número en estos animales y a explicar algunos
fenómenos ligados a ICOS, incluyendo la mayor sensibilidad de los ratones ICOSko a enfermedades autoinmunes como EAE.
CARACTERIZACION FUNCIONAL DE CELULAS TH17/1 INTESTINALES EN PACIENTES CELIACOS. Santamaria Ossorio M2, Fernandez S1, Ortega C1, Carillo J2, Rodriguez F2, Sánchez F2. 1Unidad de
inmunologia Facultad de Medicina Universidad de Cordoba. 2H.U. Reina Sofia.
Se ha estudiado la presencia de celulas productoras de IL-17 en biopsias de duodeno distal de pacientes con enfermedad celiaca. Las biopsias
fueron cultivadas en presencia de Il-2 (20UI) durante 12 dias. Las poblaciones de celulas T obtenidas clonadas mediante dilucion limite y los clonos resultantes fueron testados mediate RT-PCR para determinar si expresaban señal especifica de Il-17 e IFNgamma. Se encontraron clonos productores de cada una de ellas de manera aislada y conjunta. El analisis de
los clonos positivos indica que son celulas memoria/efctoras, con un fenotipo caracterizado por la expresion en superficie de CCR6 y receptor de
IL-23. las celulas resultaron Th17/1 en base al patron de citounas que secretan y que se determinaron mediante ELISA y marcaje intracelular. Es interesante que ademas d las citoquinas mencionadas, las celulas Th17/1 de
pacientes celiacos expresan TGF beta 1. Il17 se ha demostrado estar regulada por el factor de transcripcion RORA y C en humano. Tambien se necesita IRF4 para su diferenciacion en el raton. Nosotros encontramos expresion elevada de RORC y aun mas marcada de IRF4. Esta es la primera
demostracion de que en humanos IRF4 se encuentr upregulado en celulas diferentes de Th2. Funcionalmente se trata de celulas capaces de responder a estimulos mediados por CD3/TCR, no son citotoxicas ni reguladoras y tampoco sensibles a regulacion al igual que sucede con este tipo
celular en enfermedades autoinmunes digestivas como enfermedad inflamatoria intestinal. Nuestros datos indican que el papel de TGF beta secretado por ellas parece ser facilitar la regulacion positiva de RORC e IRF
siguiente a la estimulacion CD3/TCR.
EXPANSIONES MONOCLONALES DE LINFOCITOS GRANDES
GRANULARES (LGG)-T CD4+ RECONOCEN ANTÍGENOS DE
CITOMEGALOVIRUS (CMV). Rodríguez Caballero MA1, García
Montero AC1, Bárcena P1, Almeida J1, Ruiz-Cabello F2, Tabernero MD3,
Garrido P4, Muños-Criado S5, Balanzategui A6, Orfao A1. 1Centro de
Investigación del Cáncer/IBMCC. CSIC-Universidad de Salamanca. 2Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario Virgen de Las Nieves. Granada. 3Unidad de Investigación, IECSCYL. Hospital Universitario de Salamanca. 4Servicio de Hematología. Hospital Universitario Virgen de Las Nieves. Granada. 5Servicio de Microbiología, Hospital Universitario de Salamanca. 6Servicio de Hematología, Hospital Universitario de Salamanca.
Introducción. Estudios recientes sugieren que las linfocitosis monoclonales LGG-TCD4+ se originarían por una estimulación antigénica
crónica, como se ha demostrado en otros síndromes linfoproliferativos cuyo desarrollo está favorecido por infecciones víricas persistentes (p.ej. HTLV-1, EBV, HHV8). El hecho de que en individuos sanos
seropositivos frente a CMV, se hayan detectado expansiones (oligo)clonales de células T CD4+ con fenotipo de LGG en respuesta a CMV,
COMUNICACIONES ORALES
apunta a un posible papel de este virus en el origen y expansión de las
linfocitosis monoclonales LGG-TCD4+.
Objetivo. Analizar la especificidad de la respuesta inmunológica frente a CMV de las células T clonales de pacientes con distintos síndromes linfoproliferativos crónicos T, SLPcT.
Metodología. Se analizó “in vitro” la respuesta funcional frente a
CMV y EBV en 30 sangres periféricas de pacientes con linfocitosis LGGTCD4+TCRalphabeta+ (n= 12) u otros SLPcT (n= 18). En 4 pacientes
con expansión monoclonal de LGG-TCD4+TCRVbeta13.1+ se evaluó
la respuesta al péptido de CMV “MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK” complementario de HLADRB1*0701. Mediante microarrays de expresión
se identificaron los genes que experimentaban cambios en los LGGTCD4+ en respuesta a CMV.
Resultados. Los casos con linfocitosis LGG-TCD4+ mostraron una
respuesta funcional frente a CMV característica y específica, que no se
encontró en otros SLPcT. Esa respuesta se reprodujo frente al péptido
“MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK” en los pacientes con haplotipo
HLADRB1*0701+ y expansión monoclonal de LGG-TCD4+TCRVbeta13.1+. Además la respuesta a CMV en los LGG-TCD4+ clonales se
asociaba a cambios específicos en la expresión de genes implicados en
respuesta inflamatoria e inmune, progresión de ciclo celular, resistencia a apoptosis e inestabilidad génica.
Conclusiones. Por primera vez se demuestra que las células clonales de un grupo de neoplasias de células T (LGG-TCD4+) son específicas de antígenos de CMV, que podrían ser responsables de la iniciación y mantenimiento de la enfermedad.
REEVALUACIÓN DE LA CONTRIBUCIÓN DE HLA-DRB3 EN LA
RESPUESTA CELULAR T. Faner Canet MR1, James E2, Yang J2, Houston L2, Pujol-Borrell R1,3, Kwok WW2,4, Juan M5. 1Laboratory of Immunobiology Research and Applications to Diagnosis (LIRAD). Banc de Sang
i Teixits. 2Benaroya Research Institute at Virginia Mason, USA. 3Department
of Cell Biology, Physiology and Immunology. Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). Badalona, 4 Department of Immunology, University of Washington, Seattle, USA. 5Servei d’Immunologia. Centre de Diagnòstic Biomèdic. Hospital Clínic. Barcelona.
En la región HLA hay diversos loci DRB (DRB1/3/4/5) que codifican para diferentes cadenas DR beta. Dichas cadenas beta se combinan con la misma cadena alfa y forman las diferentes moléculas HLADR que se encuentran en la superficie de las células presentadoras de
antígeno. La funcionalidad y relevancia de la molécula DRB1 ha sido
extensamente estudiada, pero habitualmente se ha despreciado la contribución de las moléculas DR generadas a partir de los loci DRB3/
4/ 5 a la presentación de antígenos. Tanto es así que aún hay cierta controversia en referencia al nivel de expresión de dichos loci DRB secundarios. Por ello hemos cuantificado los niveles de mRNA producidos
por DRB3 y comparado con los producidos por el DRB1 de su haplotipo DR52 [DRB1(52)]. Esta comparación se ha realizado en células
CD19+ y CD14+, observando en ambos tipos celulares una menor producción de DRB3 en relación a su DRB1, pero una muy diferente distribución de la abundancia relativa de dichos transcritos, mostrando en
las células CD14+ una proporción mayor de DRB3 respecto a DRB1.
Estos resultados se han corroborado a nivel proteico analizando la
tinción de superficie de ambas moléculas en dichos tipos celulares.
Para analizar el papel funcional de DRB3 hemos generado tetrámeros de HLA-DRB3 y usado TGEM (Tetramer-guided epitope mapping) en la valoración de la contribución de DRB3 a la respuesta inmu-
47
COMUNICACIONES ORALES
ne T frente a antígenos altamente inmunogénicos como el toxoide tetánico y la proteína de la matriz del virus de la gripe. En ambos antígenos hemos identificado epítopos presentados por DRB3 y al evaluar el
número de linfocitos T CD4+ que responden a ellos, hemos observado que es similar al descrito para DRB1.
Todos nuestros resultados sugieren que DRB3 juega un papel en
la presentación de antígenos equivalente al atribuido a DRB1 pero con
un repertorio de epítopos que al ser diferente se complementa. De este
modo DRB3 parece ampliar y completar el repertorio peptídico que
puede ser presentado por HLA-DR.
Financiado por ayuda FIPSE 36487/05, FIS 07/0329 y Profit FIT
010000-2006-38.
EPH/EPHRINAS B COMO REGULADORAS DE LA MADURACIÓN DE LOS TIMOCITOS Y LA MORFOGÉNESIS EPITELIAL
TÍMICA. Cejalvo Goyanes T1, García-Ceca J1, Alfaro Sánchez D1, Jiménez Pérez E2, Muñoz Oliveira JJ3, Zapata González A1. 1Dpto. Biología
Celular, Facultad de Biología, UCM. 2Dpto. Biología Celular, Facultad de
Medicina, UCM. 3Centro de Citometría y Microscopia, UCM.
Resultados previos de nuestro grupo demuestran que los receptores EphB2 y EphB3 son expresados tanto por timocitos como por células epiteliales tímicas (TECs) y participan tanto de forma autónoma como
no autónoma en la diferenciación y el desarrollo de ambos tipos celulares así como en las interacciones que los dos realizan entre si.
Con el fin de definir la importancia de las señales trasmitidas por
estos receptores y profundizar en el conocimiento de su papel en las
interacciones celulares tímicas se analizó el efecto de diferentes mutaciones en las ephrinas B1 y B2, ligandos de Eph B2 y Eph B3, sobre los
distintos componentes celulares del timo
El análisis de la diferenciación T, en animales con timocitos deficientes en la ephrina B1 o en la ephrina B2, mutantes condicionados generados mediante tecnología LoxP-Cre, revela una reducción en la celularidad
tímica y alteraciones en la diferenciación T con diferente grado de severidad dependiendo del background genético de la cepa de ratón utilizada, lo que confirma un papel autónomo de estas moléculas sobre la maduración del timocito. Sin embargo, al menos en el caso de los mutantes para
la ephrina B2, la red epitelial no presenta alteraciones importantes.
Por otro lado, animales ephrinaB2 LacZ/+ y ephrina B2 LacZ/LacZ
en los que el alelo ephrina B2 LacZ codifica para una forma de ephrina B2 que carece del dominio citoplásmico, mostraban nuevamente
menor celularidad tímica pero, en este caso, también alteraciones histológicas en la red epitelial tímica indicando la necesidad de estas proteínas no solo como estimuladoras de Ephs sino como receptores, así
como su participación autónoma en el establecimiento de la red epitelial. El presente trabajo discute finalmente el papel global de las interacciones Eph-ephrinas B en la modulación de las interacciones celulares tímicas homo y/o heterotípicas que determinan la histogénesis del
órgano y la diferenciación de los linfocitos T.
ESTUDIO DE NFAT5, UN FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE LA
FAMILIA REL, EN EL DESARROLLO Y LA HOMEOSTASIS DE
LOS LINFOCITOS T. Berga Bolaños R, López Rodríguez C. Parc de
Recerca Biomèdica de Barcelona.
El NFAT5 es un factor de transcripción que pertenece a la familia
de proteínas Rel (NF-kB y proteínas NFATc) (Aramburu et al., 2006).
48
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
De este modo, el NFAT5 selecciona los mismos elementos de DNA que
unen in vivo las proteínas NFATc (López-Rodríguez et al., 1999) y, por
otra parte, el NFAT5 conserva la estructura presente en todas las proteínas NF-ÎB para controlar su dimerización, unión a DNA y transactivación (López-Rodríguez et al., 2001; Stroud et al., 2002). Aunque el
NFAT5 se caracterizó inicialmente como un importante regulador de
un programa de expresión de genes osmoprotectores (López-Rodríguez et al., 2004; Aramburu et al., 2006), también regula la migración
de células de carcinoma, participa en la miogénesis de músculo esquelético, y actúa como factor huésped para el HIV (Jauliac et al., 2002;
O´Connor et al., 2006; Ranjbar et al., 2006). La expresión del NFAT5 en
células primarias y órganos está bastante restringida a ciertos tejidos
proliferantes (Aramburu et al., 2006), como linfocitos T activados y
timocitos (Trama et al., 2000; López-Rodríguez et al., 2001; López-Rodríguez et al., 2004), donde los niveles de NFAT5 son relativamente altos
y su distribución subcelular es predominantemente nuclear (Trama et
al., 2000; López-Rodríguez et al., 2001; datos de nuestro laboratorio).
Modelos de ratón desarrollados recientemente (Trama et al., 2002;
López-Rodríguez et al., 2004; Go et al., 2004) apoyan la idea de un papel
de NFAT5 durante el desarrollo de los linfocitos T y sugiere su implicación en la proliferación de células T y su supervivencia. Los ratones
deficientes en NFAT5 presentan una inmunodeficiencia consistente en
una linfopenia de células T que es más acusada para las células CD8+.
Estas observaciones son de relevancia sustancial ya que, in vivo, los
ratones deficientes en NFAT5 son incapaces de producir una respuesta inmune mediada por células CD4+ (Go et al., 2004) o CD8+ (datos
de nuestro laboratorio).
Datos recientes de nuestro laboratorio indican que los ratones deficientes en NFAT5 sufren de hipernatremia en plasma como resultado
de su incapacidad de inducir un programa de expresión de genes osmoprotectores a nivel sistémico (López-Rodríguez et al., 2004). Para analizar selectivamente los efectos intrínsecos de las células T derivados
de la falta de NFAT5, y con ayuda de la tecnología CRE-LOX, hemos
llevado a cabo un modelo de ratón que elimina la expresión de NFAT5
en estadíos tempranos (Lck-CRE NFAT5Flox/Flox) o más tardíos (CD4CRE NFAT5Flox/Flox) del desarrollo de los timocitos. El análisis de
estos ratones revela que NFAT5 participa en la ontogenia de las células T en estadíos tempranos. Asimismo, nuestros datos indican que
la falta de NFAT5 altera la homeostasis de diferentes poblaciones de
células T en periferia.
SESIÓN 11: AUTOINMUNIDAD - II
Moderadores: Dra. Carmen Gelpí (Barcelona),
Dra. Mª Rosa Julià (Palma de Mallorca)
ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO DE ANTICUERPOS DE CLASE IgG, IgM Y COMPLEMENTO EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE.
Sádaba Argaiz MC1, Tzartos J2, Sloan C2, González-Porqué P1, Espiño Martínez M1, Álvarez-Cermeño JC1, Villar-Guimerans LM1, Esiri
M2. 1Servicio Inmunología. Hospital Ramón y Cajal. 2Neuropathology Department. John Radcliffe Hospital.
Introducción. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria de posible etiología autoinmune. Su principal característica
patológica es la placa de desmielinización, aunque también se ha
demostrado daño axonal desde los primeros estadios. Si bien se ha con-
INMUNOLOGÍA
siderado clásicamente a la EM como una enfermedad Th1, existen evidencias de la importancia de los anticuerpos y el complemento en su
fisiopatología.
Objetivos. Estudiar la presencia de IgM, IgG y complemento en
cortes de pacientes con EM.
Materiales y métodos. Bloques de tejido del sistema nervioso central incluidos en parafina y fijados con paraformaldehido. Se analizaron 62 cortes de 15 pacientes y 5 cortes de 2 controles. Se pusieron a
punto las técnicas inmunohistoquimicas correspondientes para analizar la presencia de IgG, IgM y C3B en las muestras obtenidas. Se realizaron mediante inmunofluorescencia dobles marcajes IgG/C3b e
IgM/C3b.
Resultados. Se pudo observar heterogeneidad en las lesiones dentro de un mismo paciente. Un 20% no mostraban depósitos de anticuerpos ni complemento, en un 90% se detectó IgG y un 60% presentaban IgM. Algunos cortes con sustancia blanca aparentemente normal (SBAN) también presentaban dichos depósitos. En las placas que
mostraban anticuerpos se determinaron los siguientes patrones de reconocimiento: 1. Axonal. 2. Oligodendrocitos. 3. Mielina. Al analizar el
factor C3b del complemento se vieron los mismos patrones y mediante doble inmunofluorescencia se demostró que anticuerpos y complemento colocalizan. También se observó la presencia de macrófagos con
anticuerpos fagocitados junto a los depósitos de anticuerpos.
Conclusiones. Anticuerpos, complemento y macrófagos intervienen en la desmielinización y en el daño axonal. Además, la presencia
de anticuerpos en la SBAN indica que podrían ser el mecanismo efector primario en la enfermedad.
INFLUENCIA DEL LOCUS IL23R EN LA SUSCEPTIBILIDAD A
ESCLEROSIS MÚLTIPLE Y ENFERMEDAD CELÍACA EN LA
POBLACIÓN ESPAÑOLA. Cénit MC1, Dema B1, Núñez C1, Polanco
I2, Maluenda C3, de las Heras V4, Arroyo R4, de la Concha EG1, Urcelay E1, Martínez A1. 1Servicio de Inmunología Clínica, Hospital Clínico San
Carlos (Madrid). 2Servicio de Gastroenterología Pediátrica, Hospital la Paz
(Madrid). 3Servicio de Pediatría, Hospital Clínico San Carlos (Madrid). 4Unidad de Esclerosis Múltiple, Hospital Clínico San Carlos (Madrid).
Introducción y objetivos. El receptor de IL-23 está formado por
dos cadenas, una de ellas compartida con el receptor de IL-12, denominada IL-12R‚1, y otra cadena específica denominada IL-23R. El gen
IL23R codifica dicha subunidad específica y está ubicado en la región
1p31. IL-23 interviene en el desarrollo de los linfocitos Th17, implicados en procesos de autoinmunidad. Estudios recientes han mostrado
asociación de algunos alelos de IL23R con enfermedad inflamatoria
intestinal (EII), psoriasis y espondilitis anquilosante. Nuestro objetivo
es el estudio de la implicación del gen IL23R en enfermedad celiaca
(EC) y esclerosis múltiple (EM).
Material y métodos. Realizamos un estudio caso-control incluyendo 598 pacientes con EC, 414 pacientes con EM y 546 controles españoles blancos. Tras extraer el DNA de todos los individuos, todas las
muestras fueron genotipadas para dos SNPs (single nucleotide polymorphisms), rs7517847 (localizado en un intrón) y rs11209026
(Arg381Gln) mediante sondas Taqman (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA). El análisis estadístico fue llevado a cabo mediante la
prueba Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher (si los valores observados eran menores de 5) utilizando el programa EpiInfo.
Resultados. Observamos que la frecuencia del alelo minoritario
del SNP exónico está incrementada significativamente en EC y EM
COMUNICACIONES ORALES
con respecto a controles (8% en EC vs 6% en controles, p=0.02; 9% en
EM, p=0.006). En EM se observó un efecto más fuerte en pacientes
con la forma clínica primaria progresiva (PP) (16%, p=0.004). Además, la frecuencia de heterocigotos para el SNP rs7517847 es significativamente mayor en este grupo de pacientes (81% PP vs 48% controles, p=0.0002).
Conclusión. El alelo minoritario del polimorfismo funcional
Arg381Gln (rs11209026) aumenta la susceptibilidad a EC y EM, resultado opuesto al descrito anteriormente para EII. En EM se observa
un efecto más fuerte en pacientes con la forma clínica primaria progresiva.
ANÁLISIS DE RECEPTORES DE QUIMIOCINAS ASOCIADOS
CON LA RESPUESTA CLÍNICA AL TRATAMIENTO CON IFNB
EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. López García C1, Rio J1, Nos C1,
Deishenhammer F2, Espejo C1, Montalban X1, Comabella M1. 1Institut
de Recerca, Unitat de Neuroimmunologia, Hospital Universitari Vall d'Hebron. 2Clinical Department of Neurology. Innsbruck Medical University.
Introducción. El tratamiento con interferon-beta (IFNb) ha demostrado tener un efecto beneficioso en pacientes con esclerosis múltiple
remitente-recurrente (EMRR). Actualmente existe una ausencia de marcadores biológicos que correlacionen de forma fiable con la respuesta
al tratamiento. Diversos estudios han implicado a los receptores de
quimiocinas en la patogenia de la EM ya que intervienen en el paso de
leucocitos a través de la barrera hematoencefálica.
Objetivo. Identificar receptores de quimiocinas asociados con la
respuesta al tratamiento con IFNb.
Métodos. Se incluyeron 41 pacientes con EMRR en tratamiento
con IFNb clasificados como respondedores (27) y no-respondedores
(14) en base criterios clínicos. La expresión de receptores de quimiocinas (CCR1-5, CXCR2-4, CXCR6) se analizó mediante citometría de flujo en células T y monocitos antes del tratamiento, y tras 3, 6, 12, y 24
meses.
Resultados. El IFNb aumentó el porcentaje de células T y monocitos que expresaban CCR4, CXCR2, y CXCR4, y disminuyó la expresión de CCR2 en monocitos. Los pacientes no-respondedores mostraron mayor expresión de células T CD8+CXCR2+ que los pacientes
respondedores. Finalmente, se observó una tendencia hacia una mayor
expresión de CCR4 en células T de pacientes no-respondedores.
Conclusiones.El IFNb podría modular los niveles de expresión de
receptores de quimiocinas en células T y monocitos. Las diferencias de
expresión de CXCR2 y CCR4 en células T de pacientes respondedores
y no-respondedores podrían utilizarse como potenciales marcadores
de respuesta clínica.
VARIANTES GENÉTICAS DEL GEN TSHR QUE AFECTAN A SU
EXPRESIÓN EN EL TIMO CONFIEREN SUSCEPTIBILIDAD A LA
ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW. Colobran Oriol R, Armengol Barnils MP, Ruiz Riol M, Martínez Cáceres E, Otero MJ, PujolBorrell R. Banc de Sang i Teixits (BST) / Universitat Autònoma de Barcelona (UAB).
La enfermedad de Graves como modelo de tiroiditis autoinmune,
y causa de hipertiroidismo más común, está mediada por la producción de anticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de
la tiroides (TSHR). La hipótesis de este trabajo es que variaciones gené-
49
COMUNICACIONES ORALES
ticas del gen TSHR que modifiquen su expresión pueden afectar a su
proceso de tolerización central. Recientemente nuestro grupo ha descrito un conjunto de SNPs y haplotipos de este gen que presentan una
distribución significativamente diferente entre los pacientes con enfermedad de Graves y la población control, destacando algunos de ellos
por su elevada significación (p<0,0008 y ORs de hasta 5,94). Para determinar el posible papel de estos polimorfismos en la expresión del TSHR
en el timo, se ha optimizado un protocolo de cuantificación específica
de alelo utilizando PCR a tiempo real. La cuantificación específica de
alelo se aplica en muestras de individuos heterozigotos para la variante de estudio, asegurando que las diferencias sean debidas a variaciones del propio gen y no por variaciones del resto del genoma (como
puede suceder cuando se comparan grupos de individuos). Se ha realizado la cuantificación específica de alelo del mRNA del TSHR proveniente de timo total de 44 individuos donantes heterozigotos para
la variante de interés (SNP11 A/G), que es el marcador más significativamente asociado a la enfermedad y que, a su vez, representa los
principales haplotipos asociados a la enfermedad. Los resultados indican que el alelo protector (G) produce claramente una mayor expresión de TSHR en el timo respecto el alelo de susceptibilidad (A). La
ratio media de expresión del alelo G vs A en las 44 muestras es de 1,65.
Este efecto es específico del timo ya que en los tiroides analizados no
se observa este fenómeno. Estos resultados muestran que existen variaciones del gen TSHR que confieren susceptibilidad a la enfermedad de
Graves posiblemente a través de un proceso deficiente de tolerización
central.
PATRÓN DE EXPRESIÓN DEL GEN DEL RECEPTOR DE LA TSH
EN EL TIMO HUMANO: IMPLICACIONES PARA LA PATOGENIA DE LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW. Armengol
Barnils MP, Ruíz Riol M, Colobran Oriol R, Martínez Cáceres EM,
Pujol Borrell R. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol (Badalona),
Facultat de Medicina, Universitat Autonònoma de Barcelona.
Se acepta que el timo es el órgano en el que se imparte la tolerancia a los linfocitos T y recientemente se considera que esta función incluye la tolerancia a los antígenos expresados en tejidos muy diferenciados o periféricos. Se conoce la participación del gen AIRE como factor
regulador de la expresión de algunos de ellos en el timo. El timo, aunque de forma decreciente, contribuye a mantener hasta edad avanzada el pool de células T circulantes y su diversidad, por tanto variaciones en el nivel de expresión de autoantígenos y en la cantidad y calidad de los linfocitos T exportados por el timo influyen en la aparición
y curso clínico de las enfermedades autoinmunes. La enfermedad de
Graves-Basedow (GB), está mediada por la presencia de autoanticuerpos contra el receptor de la tirotropina (TSHR). Para valorar la variabilidad interindividual de la expresión del TSHR se ha cuantificado
mediante qRT-PCR con sondas Taqman los niveles de expresión tímica de las dos isoformas del TSHR y su correlación con los niveles de
AIRE, GAPDH, Leptina, Keratina-14 en 200 timos humanos (4 días a
82 años). Los resultados obtenidos muestran una variabilidad interindividual de los niveles de TSHR en el timo que se mantienen en todos
los rangos de edad. A pesar de que la abundancia en células epiteliales medulares tímicas aumenta con la edad respecto al peso total de la
glándula, la falta de correlación con los niveles del TSHR indicaría una
menor transcripción del gen por célula epitelial y una reducción en
la eficiencia de las células medulares epiteliales tímicas en la selección
negativa a partir de una cierta edad.
50
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA DE GLÁNDULAS TIROIDEAS
DE PACIENTES DE CORTA Y LARGA EVOLUCIÓN CON GRAVES-BASEDOW. IMPLICACIÓN DE LAS SEÑALES DE PELIGRO
Y MECANISMOS PERPETUADORES. Ruíz Riol M1, Armengol Barnils MP1, Colobran Oriol R1, Martínez Cáceres E1, Lucas Martín AM2,
Pujol Borrell R1. 1Hospital Universitari Germans Trias i Pujol (Badalona), Facultat de Medicina, Universitat Autonònoma de Barcelona. 2Servei d'
Endocrinologia i Diabetes.
La enfermedad de Graves-Basedow (GB) es una de las patologías
autoinmunes órgano específicas más frecuentes. Se desconocen los
mecanismos que desencadenan y cronifican esta enfermedad, pero
se postulan las señales de peligro como moléculas importantes en este
proceso. Para valorar la contribución de éstas en el inicio y en la perpetuación de la enfermedad, hemos estudiado el perfil de expresión
génica diferencial por microarrays en 6 tiroides agrupados según el
tiempo de evolución de la enfermedad (corta < 9 meses y larga > 36
meses) y en 2 controles sanos. Los genes diferencialmente expresados relacionados con el sistema inmune fueron clasificados en: 1/ señales de peligro/receptores y daño celular, 2/ homing a HEV y zonas de
inflamación, 3/ inflamación, 4/ inmunidad innata, 5/ inmunidad adaptativa, y 6/ neogénesis de tejido linfoide. De los 297 genes diferencialmente expresados entre controles vs corta evolución, aproximadamente el 20% de los del sistema inmune estaban en el grupo de señales
de peligro/receptores y respuesta a daño celular (ej: Hsp90, AGER,
MT1G). Precisamente en la comparación corta vs larga evolución, 212
genes se hallaron diferencialmente expresados, principalmente incluidos en las categorías de homing hacia HEV, IFN “signature” e inmunidad adaptativa. Entre controles vs larga evolución (n=540 genes), se
repartían entre todos los grupos establecidos (quimiocinas y receptores, moléculas relacionadas con procesamiento y presentación de antígeno, y reordenamiento de Igs). Para validar los resultados del primer
grupo, los genes seleccionados (OAS2, NOD27, IRF8, HSP90, MT1G,
AGER, CD36, CD163, SERPINA, AIF1, ISG15, IFN-alpha, -beta, -gamma) han sido estudiados por inmunofluorescencia y RT-qPCR. Los
resultados obtenidos hasta el momento apuntan a la participación de
macrófagos y células dendríticas en el inicio y en la evolución de la
patología.
LAS HORMONAS SEXUALES INFLUYEN EN EL EFECTO PROTECTOR DE LA AUTOINMUNIDAD MEDIADO POR LINFOCITOS T QUE SOBRE-EXPRESAN BCL-2. Iglesias M1, Santiuste I1,
González J2, Postigo J2, Ferández-Rey M2, Merino J2, Merino R1. 1Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria, CSIC-Universidad de
Cantabria-IDICAN. 2Departamento de Biología Molecular, Universidad de
Cantabria.
Recientemente nuestro grupo ha demostrado que la sobre-expresión de Bcl-2 humano en linfocitos T (hBcl-2-T) de ratones transgénicos (Tg), protege contra el desarrollo de autoinmunidad. Este efecto
protector esta mediado por linfocitos T reguladores CD4+ CD25+. Dada
la asociación de algunas enfermedades autoinmunes con el sexo de los
pacientes, estudiamos la influencia de las hormonas sexuales sobre
la capacidad moduladora de Bcl-2 en el desarrollo de artritis inducida
por colágeno (AIC), tras inmunización con colágeno bovino de tipo
II (articular). Para ello, se comparó en primer lugar el desarrollo de
AIC entre ratones (DBA/1 x C57BL/6)F1-hBcl-2-T (F1.Tg) y (DBA/1
x C57BL/6)F1 (F1.no-Tg) machos y hembras. Como se ha descrito ante-
INMUNOLOGÍA
riormente, los machos F1.no-Tg desarrollan una AIC más acelerada e
intensa que las hembras y las hembras F1.Tg están protegidos contra
el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, los machos F1.Tg desarrollan una AIC similar a la observada en las hembras F1.no-Tg. En
segundo lugar, se observó que la castración de los machos F1.Tg inhibe el desarrollo de AIC y que la administración de 5alfa-dihidrotestosterona a hembras F1.Tg bloquea el efecto protector observado en los
controles no tratados. En conclusión, nuestros resultados muestran que
las hormonas sexuales condicionan la capacidad de Bcl-2 para modular la actividad de los linfocitos CD4+CD25+ reguladores y el desarrollo de AIC.
SOBREEXPRESION DE CITOCINAS TH17 EN LA FIBROSIS PULMONAR INDUCIDA POR ADMINISTRACIÓN ENDOTRAQUEAL DE ADRIAMICINA. Fernandez Rey M1, Buelta L2, Tamayo
E1, Iglesias M3, Merino J1, Merino R3. 1Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria. 2Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas Universidad de Cantabria. 3Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN.
La bleomicina es un antibiótico genotóxico con actividad antitumoral, que induce fibrosis pulmonar cuando se administra por vía
i.v., endotraqueal e incluso subcutánea. Por ello es el modelo experimental de esclerodermia más utilizado. La administración subcutánea de adriamicina o doxorrubicina, otro antibiótico empleado en el
tratamiento de múltiples tumores, también provoca fibrosis cutánea
en el sitio de punción, pero no afecta al pulmón. No existiendo reportes previos, hemos puesto a punto un modelo de fibrosis pulmonar
mediante inyección endotraqueal de adriamicina y hemos analizado
los mecanismos inmunológicos que intervienen en el desarrollo de
las lesiones.
Los resultados de expresión (Q-PCR) de distintos tipos de colágenos, de citocinas y de factores de transcripción específicos de linaje de
diferenciación de células T-CD4, muestran un marcado aumento en la
expresión de colágeno-I (fibrilar) y colágeno IV (membranas basales)
en relación con el incremento en la expresión de citocinas asociadas a
células TH17 y del factor de transcripción RORgT, específico de este
linaje. En las células obtenidas mediante lavado broncoalveolar en estos
animales hemos constatado un incremento en la frecuencia de linfocitos CD4+ activados productores de IL-17.
Estos resultados sugieren un papel destacado de los linfocitos TH17
en la producción de fibrosis pulmonar por adriamicina.
EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE LA CUATRO ISOFORMAS DE LA
PROTEÍNA DE UNIÓN A CALCIO S100A9 (CALGRANULINA B)
EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA DE
PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO RESPECTO A CONTROLES SANOS. Pavón Castillero EJ1, Callejas Rubio
JL2, Ortego Centeno N2, Zubiaur Marcos M1,3, Sancho López J1. 1Instituto de Parasitología y Biomedicina. Consejo Superior de Investigaciones
Científicas. 2Hospital Clínico Universitario San Cecilio, 3 Instituto de Salud
Carlos III.
La S100A8 y la S100A9 pertenecen a la familia S100 de proteínas
de unión a calcio. Normalmente forman un heterodímero
(S100A8/S100A9) llamado Calprotectina. Se expresan preferentemente en células de origen mieloide. Se han descrito incrementos en la
COMUNICACIONES ORALES
expresión de S100A8 y S100A9 en procesos inflamatorios. Se analizaron 30 muestras de pacientes con lupus previamente diagnosticados
según los criterios de reumatología americano, y 16 muestras de personas sanas voluntarias que sirvieron como controles. Las PBMCs se
obtuvieron por centrifugación en gradiente de densidad con Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich química S.A Spain) de sangre periférica a la
que se le ha añadido el anticoagulante K2-EDTA (BD Vacutainer). La
separación de las proteínas en geles 2-DE se realizó utilizando el sistema Protean IEF (Bio-Rad) en la primera dimensión y el sistema CRITERION (Bio-Rad) en la segunda. Los geles se tiñeron secuencialmente con Pro-Q-Diamond, Sypro-Rubi y Bio-Safe Coomassie. La identificación de proteínas por MALDI-TOF MS o por secuenciación utilizando nano(n)ESI. IT MS/MS se realizó de forma idéntica a la de nuestro
trabajo previo. Hemos podido identificar por espectrometría de masas
S100A9 wild-type (spot 7), S100A9 truncada en su extremo N-terminal (spot 6 inferior), S100A9 wt fosforilada en la Thr C-terminal (spot
6 superior) y S100A9 truncada y fosforilada en la Thr C-terminal (spot
19). La expresión de las variantes del spot 6 está aumentada en pacientes con lupus eritematoso sistémico respecto a controles sanos. La utilización de geles 2-D, tinción secuencial con Pro-Q-Diamond y SyproRuby e identificación de las proteínas por MS y posterior secuenciación de péptidos específicos por MS/MS permite identificar modificaciones postraduccionales como fosforilación en treonina o truncaciones “naturales”, así como determinar cambios relativos de estas modificaciones en situaciones patológicas (enfermedad autoinmune vs controles sanos).
TRATAMIENTO CON IL-4 INCREMENTA LA ACTIVACIÓN DE
STAT6 POR IFNββ. Cortes JR, Perez-G M, Rivas MD, Zamorano J. Hospital San Pedro de Alcantara.
El interferón β es una citoquina con numerosas actividades biológicas lo que explica sus aplicaciones clínicas. La respuesta celular
está mediada por la activación de la vía JAK/STAT, principalmente
STAT1, 2 y 3. Recientes estudios indican que interferones tipo I también pueden activar STAT6. La regulación de STAT6 por IFNβ podría
tener importantes consecuencias biológicas debido al papel propuesto de STAT6 en enfermedades autoinmunes donde IFNβ es empleado.
Puesto que STAT6 está principalmente regulado por la IL-4, nuestro
objetivo fue investigar la interacción entre IL-4 e IFNβ en la activación
de STAT6. Nuestros resultados confirman que el IFNβ puede inducir
la activación de STAT6. Sin embargo, la fosforilación de STAT6 inducida por IFN‚ es muy inferior a STAT1 o a la inducida por IL-4, indicando que STAT6 no es un principal sustrato para IFNβ. Sin embargo,
cuando las células fueron pre-tratadas con IL-4, la activación posterior
de STAT6 por IFN‚ fue considerablemente aumentada llegando a niveles de fosforilación similares a los inducidos por IL-4. El empleo de
inhibidores descarta un papel de fosfatasas o raft de lípidos en este
proceso. Los resultados obtenidos sugieren la regulación por la IL-4
de una proteína adaptadora implicada en la activación de STAT6 por
el IFNβ puesto que: 1) inhibidores de la síntesis de proteínas inhiben
el efecto de la IL-4 sobre la activación de STAT6 por el IFNβ, 2) la unión
de STAT6 al receptor del IFN‚ está aumentada tras el tratamiento con
IL-4, 3) IL-4 induce la síntesis de RACK1, una proteína adaptadora que
facilita el reclutamiento de STATs por el receptor de interferones. La
interacción entre IL-4 e IFNβ en la activación de STAT6 podría ser relevante para enfermedades como la esclerosis múltiple donde tienen un
papel destacado.
51
COMUNICACIONES ORALES
PREVENCIÓN DE LA DIABETES TIPO 1 EXPERIMENTAL
MEDIANTE ADMINISTRACIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
Y CUERPOS APOPTÓTICOS. Marín Gallén S1, Clemente X1, Planas
R1, Ampudia RM1, Carrillo J2, Carrascal J2, Pujol-Borrell R3, Verdaguer J2, Borrás FE1, Vives-Pi M1. 1Lirad-BST. Fundacio Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol. Badalona. 2Unitat d'Immunologia. Universitat de Lleida. 3Banc de SAng i Teixits. Badalona.
La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmune causada por la destrucción selectiva de las células beta pancreáticas. Dada
su etiología desconocida, hasta el momento no se ha desarrollado una
terapia preventiva o curativa para esta enfermedad. Nuestro objetivo
es valorar la eficiencia de las células dendríticas singénicas pulsadas
con cuerpos apoptóticos de células de islote pancreático, como tratamiento preventivo de la DT1.
El estudio se ha llevado a cabo en un modelo experimental de DT1,
el ratón NOD (Non Obese Diabetic) que expresa la citocina IFN-beta
en las células productoras de insulina. Este modelo desarrolla diabetes acelerada a partir de las tres semanas de edad con una incidencia
del 60%. Hemos generado células dendríticas (DCs) inmaduras a partir de médula ósea de ratón NOD mediante cultivo con GM-CSF. La
terapia ha consistido en administrar DCs pulsadas con cuerpos apoptóticos de la línea celular beta pancreática murina NIT-1 (DCs-NITapo) a ratones de 12-14 días por via intraperitoneal. Como controles, se
han transferido: 1) DCs; 2) Cuerpos apoptóticos de células insulares
NIT-1; 3) ‘Sham’ o suero fisiológico. El seguimiento de los ratones se
ha llevado a cabo durante 30 semanas para determinar el efecto de la
inmunoterapia en la incidencia de la DT1.
Los resultados indican una prevención de la diabetes con DCsNITapo (incidencia 15%). El análisis de la insulitis muestra una disminución de la intensidad de infiltración leucocitaria con esta terapia. El
tratamiento con DCs no pulsadas no varía la incidencia de la enfermedad respecto a la colonia (60%). Por otro lado, la administración de
cuerpos apoptóticos de NIT-1 resulta en una disminución en la incidencia de DT1 (25%) aunque sin alcanzar los valores obtenidos con
DCs-NITapo. La determinación de los mecanismos implicados en el
establecimiento de tolerancia mediante este tratamiento contribuirá
a valorar su futura aplicación.
LA DEXAMETASONA INCREMENTA LA EXPRESIÓN DE FOXP3
INDEPENDIENTEMENTE DE LA ACTIVIDAD SUPRESORA. Prado C1, Gómez J2, López P1, de Paz B1, Gutierrez C1,2, Suárez A1. 1Dpto.
Biología Funcional. Universidad de Oviedo) 2Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Central de Asturias.
Dado que los pacientes de LES tratados con corticoides presentan
un mayor porcentaje de células Treg, nos planteamos si estos agentes
eran capaces de generar células Treg in vitro. Para ello se trataron células CD4+CD25- durante 24 h con dexametasona y se expandieron con
anti-CD3/CD28 en presencia de IL-2 durante 14 días. En las células
obtenidas se analizó el fenotipo, la expresión génica de FoxP3, GITR y
CTLA-4 y la actividad funcional. Igualmente se analizó el efecto de la
dexametasona sobre las células Treg generadas con TGF . Las células
expandidas tras el tratamiento con dexametasona presentaron un fenotipo similar al de las células Treg (CD4lowCD25highCD127GITR+iCTLA4+CD69lowFoxp3+), mientras que los linfocitos sin dexametasona poseían una expresión significativamente menor de FoxP3 y
iCTLA-4 (mRNA y proteína) y mayor de CD69. Es de destacar que este
52
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
efecto de la dexametasona incrementado la expresión de Foxp3 fue
mucho más pronunciado en el caso de las células Treg generadas con
TGF . Todas las células generadas con el esteroide eran anérgicas, sin
embargo, al estudiar la capacidad antiproliferativa, se observó que sólo
aquéllas generadas con TGF? eran capaces de inhibir la proliferación,
y que el incremento en la expresión de FoxP3 no suponía un aumento
significativo del porcentaje de inhibición (25.2% vs 32.6%). Estos resultados están de acuerdo con los encontrados en el estudio de pacientes
de LES, en los que la actividad supresora de los linfocitos T CD4+CD25+
aislados de pacientes con tratamiento esteroideo fue similar a la de
las células aisladas de pacientes sin este tratamiento. Estos resultados
indican que aunque los esteroides incrementan significativamente la
expresión de FoxP3, tanto in vivo como in vitro, no son capaces de generar células con función reguladora y sugieren que FoxP3 no es un buen
marcador de células Treg en humanos, apoyando las diferencias descritas entre humanos y ratones en la regulación de la actividad
supresora/reguladora de esta población celular.
EFICACIA TERAPEUTICA DE LA POLINEUROPATIA MIXTA SENSITIVO-MOTORA CON FATIGA INCAPACITANTE EN EL SINDROME DE SJÖGREN TRAS TRATAMIENTO CON RITUXIMAB.
Velastegui Ordoñez A, Oliver D, Rodríguez-Mahou M, Gil J, Fernandez-Cruz E, Sanchez-Ramon S. Hospital Gregorio Marañon. Madrid.
Introducción. Las manifestaciones neurológicas en pacientes con
Síndrome de Sjögren Primario (SSP) pueden aparecer hasta en el 20%
de los casos, sin embargo su diagnóstico en muchas ocasiones puede
resultar difícil.
Presentamos un caso clínico de SSP refractario al tratamiento convencional (corticoides, inmunosupresores, IGIV) cuyo síntoma principal es la fatiga incapacitante en el contexto de Polineuropatía Mixta
Sensitivomotora y con sintomatología leve de síndrome seco tratado
con Rituximab en monoterapia.
Objetivos. Determinar la correlación entre evolución de síntomas
y signos clínicos con niveles de anticuerpos asociados al SSP tras el tratamiento con Rituximab en monoterapia. Y evaluar la mejora en la calidad de vida del paciente.
Método. Administración de Rituximab (375 mg/m2 I.V. cada 4
semanas) con seguimiento de parámetros de laboratorio, estudio isotópico de gandulas salivares, test de Schirmer, biopsia glandular, estudio neurofisiológico y TAC craneal. Se monitorizaron en tiempo basal,
1º mes, 6º mes, 9º mes, 1 año.
Periódicamente se evaluó la respuesta subjetiva del paciente en
relación al grado de incapacidad para actividades cotidianas mediante los Test de calidad de vida SF-36 y WHOQOL-100 de la OMS.
Resultados. Se objetivó mejoría progresiva y mantenida principalmente de los síntomas de fatiga incapacitante y debilidad en miembros inferiores, asociado con una mejoría leve de la conducción nerviosa en los estudios neurofisiológicos. A pesar de la evolución favorable de los síntomas clínicos neurologicos y de la xerostomía/xerotalmía, comprobado por estudio isotópico de glándulas salivares y Test
de Schirmer, no existió cambio en los títulos séricos de FR y Ac. AntiRO/SSa. No se objetivaron efectos adversos en la terapia con Rituximab, ni fue necesaria la administración concomitante de IGIV ni otros
tratamientos. Con mejoría de la calidad de vida del paciente.
Conclusiones. En este paciente se comprobó la efectividad de rituximab en monoterapia con control del cuadro tipico de SSP y de las
complicaciones atribuibles a la Polineuropatía mixta sensitivo-motora.
INMUNOLOGÍA
RESPUESTA CLINICA FAVORABLE DE UVEITIS REFRACTARIA
TRAS USO DE INFLIXIMAB. Carbone J, Sarmiento E, FernándezCruz E. Hospital Gregorio Marañon. Madrid.
La uveitis agrupa a una serie de enfermedades inflamatorias oculares que afectan la capa media del ojo (iris, cuerpo ciliar y coroides)
pudiendo causar pérdida visual grave. Un subgrupo de uveitis de causa no infecciosa es de etiología autoinmune.
Objetivo. Evaluar la respuesta a infliximab (anticuerpo monoclonal anti-TNF alfa) en pacientes con uveitis refractaria.
Métodos. Revisión del curso clínico de 2 pacientes con pan uveitis bilateral refractaria a terapia convencional tratados con infliximab
en la Unidad de Inmunología Clínica del HGUGM. Respuesta terapéutica: incidencia de recurrencias de uveitis, evidencia oftalmológica de disminución de la actividad inflamatoria ocular, agudeza visual,
reducción de la dosis de glucocorticoides sistémicos y efectos adversos; a mes 0, 3, 6 y 12. Protocolo: 3 infusiones de infliximab las semanas 0, 2, y 6. Se evaluó respuesta clínica en semana 10. Si había respuesta clínica se continuaba con una infusion en semana 14 y luego cada
8 semanas hasta el año.
COMUNICACIONES ORALES
Resultados. Dos pacientes [1H (29a), 1M (46a)]. Ambos habían
utilizado distintas combinaciones de corticoides sistémicos, azatioprina, ciclosporina y gammaglobulina intravenosa a alta dosis. Tiempo de enfermedad: 60 m y 41 m. Tratamiento de base al comenzar
infliximab: prednisona 50 mg/d + azatioprina 100 mg/d y prednisona 90 mg/d. Tiempo de seguimiento tras primera dosis de infliximab:
24 m y 18 m. A sem 10 ninguno de los pacientes tenía actividad inflamatoria ocular y completaron el protocolo hasta el año. Al año ninguno tenía actividad inflamatoria ocular. A 12 m y 6 m tras última
infusion de infliximab ambos siguen libres de uveitis. No se registraron efectos adversos salvo un episodio de prurito transitorio en la
penúltima infusión en la paciente. El tratamiento inmunosupresor se
pudo reducir en ambos pacientes: El paciente varon suspendió azatioprina y redujo prednisona hasta dosis actual de 5 mg de prednisona cada semana; la paciente redujo la dosis de corticoides hasta
dosis actual de deflazacort 7.5 mg cada 48 horas. Durante el seguimiento tras uso de infliximab la paciente tuvo ANA positivo a título bajo.
Conclusiones. Infliximab fue bien tolerado y efectivo en 2 pacientes con uveitis refractaria de larga duración.
53
Posters
Inmunología
Vol. 27 / Supl. 1/ Mayo 2008: 55-120
SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD - I
Moderadores: Dra. Joana Ferrer (Palma de Mallorca),
Dra. Júlia Sequí (Madrid)
1. ASOCIACIÓN INDEPENDIENTE DE LOS GENES IL23R E
IL12B CON ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL:
NO EVIDENCIA DE INTERACCIÓN. Márquez Ortiz AM1, Mendoza JL2, Taxonera C2, Díaz-Rubio M2, Gómez de la Concha E1,
Urcelay E1, Martínez-Doncel A1. 1Servicio de Inmunología Clínica,
Hospital Clínico San Carlos. 2Servicio de Gastroenterología, Hospital
ClÍnico San Carlos.
Estudio genómicos recientes han identificado a los genes IL23R e
IL12B como loci de susceptibilidad a enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Nuestro objetivo es dilucidar si estos genes también se asocian a la enfermedad en nuestra población así como analizar la posible interacción genética entre polimorfismos localizados en los genes
IL12B e IL23R, ligando y receptor r espectivamente.
En este estudio se incluyeron 707 pacientes con EII, 344 con enfermedad de Crohn y 363 con colitis ulcerosa, y 547 controles sanos caucásicos. Se analizaron cuatro polimorfismos de un solo nucleótido
(SNPs), dos de ellos localizados en el gen IL23R (rs7517847 y rs11209026)
y otros dos en el gen IL12B (rs3212227 y rs6887695). Las frec uencias
genéticas se analizaron mediante un test CHI-CUADRADO.
Nuestros datos muestran una asociación con EII de los dos SNPs
localizados en el gen IL23R, siendo estadísticamente más fuerte para
el marcador rs7517847 (OR=0.79, frecuencias del alelo minoritario: 0.355
in pacientes con EII vs. 0.410 en controles; p=0.005). Ambos polimorfismos presentaban un efecto mayor en los pacientes de Crohn
(OR=0.74) que en los enfermos de colitis (OR=0.84). Uno de los marcadores analizados en el gen IL12B (rs6887695) mostró una asociación
débil con EII (OR=1.24, frecuencias del alelo minoritario: 0.375 in pacientes con EII vs. 0.326 en controles; p=0.012), con un efecto más fuerte en
colitis ulcerosa (OR=1.31, p=0.007). La estratificación de los pacientes
atendiendo a características clínicas no mostró diferencias significativas. No se observó interacción entre ninguno de los polimorfismos
estudiados en los genes IL12B e IL23R.
Nuestro estudio confirma la asociación de los genes IL23R e IL12B
con EII en población española, no encontrando evidencias de interacc
ión entre los dos genes analizados.
2. COMPARACION DEL LOS POLIMORFISMOS DE GENES DE
INTERLEUCINAS EL PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE Y UN GRUPO CONTROL. Leon Moya V1, Leon Arroyo
A2, Montilla C3, Gomez S3. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Laboratorio Pediatria e Inmunologia. Universidad de Valladolid. 3Serv. de Reumatologia, Hospital Universitario
de Salamanca.
Hemos estudiado polimorfismos de IL en 22 pacientes diagnosticados de artritis reumatoide y 28 controles. Los polimorfismos fueron analizados empleando el kit Citokine genotiping Kit (Pel-freez).
No hemos encontrado diferencias significativas enter los grupos
de pacientes de artritis reumatoide y el control.
Los polimorfismos hallados para el grupo control fueron:
IL-1alpha/ - 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/ 45
CT/15 TT), IL-1beta/ 396 (60 CC/35CT/5 TT),IL-1RA/mspa 11100 (5
CC/47.5 CT/47,5 TT), IL1R/psti 1970 (50 CC/40 CT/10 TT), IL-2/ - 330
(15 GG/ 45 GT/40 TT), IL-2/ 166 (50 GG/40 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10
GG/ 27.5 GT/ 62,5 TT), IL-4/ - 590 (72.5 CC/25 CT/ 2,5 TT), IL-4/ - 33
(75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (60 AA/35 AG/5 GG), IL-6/ - 174
(20 CC/ 40CG/40 GG), IL-6/ 565 (12.5 AA/52,5 AG/35 GG), IL-10/ - 592
(5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (50 CC/40 CT/10 TT) IL-10/ - 1082 (25
AA/50AG/25 GG), IL-12/ - 1188 (62.5 AA/32.5 AC/5CC), IFN gamma/utr
5644 (32.5 AA/42,5 AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80 GG),
TNF alpha/ - 308 (10 AA/25 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (25 CC/50
CT/25 TT), TGF beta1/codon 25 (0 CC/15 CG/85 GG)
Grupo Pacientes Artritis Reumatoide: IL-1alpha/ - 889 (57.5 CC/40
CT/2.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/ 50 CT/10 TT), IL-1beta/ 3962 (50
CC/32.5CT/7.5 TT),IL-1RA/mspa 11100 (0CC/50 CT/50 TT), IL1R/psti
1970 (45 CC/52.5 CT/7.5 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 50 GT/35 TT), IL2/ 166 (55 GG/35 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/ 22 GT/ 70 TT), IL4/ - 590 (75CC/25 CT/ 0 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R
alpha/1902 (75 AA/15 AG/10 GG), IL-6/ - 174 (15CC/ 45CG/40 GG),
IL-6/ nt 565 (10 AA/50 AG/40 GG), IL-10/ - 592 (5 AA/45 AC/50 CC),
IL-10/ - 819 (55 CC/35 CT/10 TT) IL-10/ - 1082 (20 AA/50AG/30 GG),
IL-12/ - 1188 (65 AA/35 AC/0 CC), IFN gamma/utr 5644 (35
AA/40AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80 GG), TNF
alpha/ - 308 (5 AA/30 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (20 CC/50
CT/30TT), TGFbeta1/codon 25 (0 CC/15CG85 GG).
3. ICAM-1 NO MUESTRA EVIDENCIAS DE ASOCIACIÓN A
ENFERMEDAD CELÍACA EN POBLACIÓN ESPAÑOLA. Dema
Jiménez B1, Martínez Doncel A1, Polanco I2, Malvenda C1, Figueredo MA1, Fernández-Arquero M1, Gómez de la Concha E1, Urcelay E1, Núñez Pardo de Vera C1. 1Hospital Clínico San Carlos. 2Hospital La Paz.
La enfermedad celíaca (EC) es una enfermedad inflamatoria crónic
a intestinal que se desarrolla en individuos genéticamente susceptibles
tras exposición al gluten. El gen ICAM1, localizado en la región de ligamiento a EC 19p13, codifica la molécula de adhesión intercelular-1
(ICAM-1). En celíacos se ha observado mayor expresión de ICAM-1 en
el subepitelio intestinal y en suero. Además, la gliadina induce la expresión de ICAM-1 en cultivos de biopsias de pacientes. Recientemente,
polimorfismos en ICAM1 se han asociado a EC en población franc esa.
Nuestro objetivo es estudiar si polimorfismos en ICAM1 están asociados a EC en la población española. Para ello se llevó a cabo un estudio
caso-control, con 608 pacientes y 535 individuos sanos, todos españoles
blancos. La mayoría de los enfermos fueron pediátricos (debut anterior
a 15 años). Estudiamos 4 polimorfismos de un único nucleótido (SNPs)
de ICAM1: rs281432 (intrónico), rs1799969 (G241R), rs1801714 (P352L)
y rs5030400 (R478W), con sondas Taqman. Los haplotipos se estimaron con el algoritmo EM (“Expectation-Maximization”). La comparación de frecuencias genotípicas, alélicas o haplotípicas caso-control no
mostró diferencias estadísticamente significativas. La subdivisión de
pacientes por edad de debut tampoco mostró diferencias significativas
entre ambos grupos, ni la estratificación por el principal factor genético
de susceptibilidad a EC conocido, HLA-DQ2. Esto nos permite concluir
55
POSTERS
que, en contra de lo descrito en población francesa, en la que el polimorfismo G241R parecía conferir susceptibilidad a EC, con mayor efecto en
población adulta, nosotros no observamos que ninguno de los 4 polimorfismos estudiados aumente el riesgo a padecer EC, a pesar de tener
más del 99% de potencia para detectar el efecto de G241R descrito en
pacientes pediátricos. Nuestra escasa muestra de pacientes con debut
de la enfermedad en edad adulta (posterior a 18 años) no permite descartar que ICAM1 afecte sólo a este subgrupo de enfermos.
4. EPÍTOPO COMPARTIDO Y ANTICUERPOS ANTI PÉPTIDO
CITRULINADO: RELACIÓN CON EDAD DE COMIENZO Y
TIEMPO DE EVOLUCIÓN DE LA ARTRITIS REUMATOIDE.
Varadé López J1, Loza-Santamaría E2, Perdigones N1, FernándezArquero M1, Figueredo MA1, Rodríguez L2, Gómez de la Concha E1,
Fernández-Gutiérrez B2, Urcelay E1, Martinez-Doncel A1. 1Inmunología Clínica Hospital Clínico San Carlos. 2Reumatología Hospital ClÍnico San Carlos.
Introducción. La artritis reumatoide es una patología compleja
con un fuerte componente autoinmune; el principal factor genético de
riesgo conocido hasta ahora son ciertos alelos del complejo principal
de histocompatibilidad (HLA). Los alelos de susceptibilidad en DRB1
comparten una secuencia común; denominada epítopo compartido
(SE). Los anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (anti-CCP) son
uno de los mejores marcadores predictores del desarrollo de AR.
En este estudio queremos analizar la relación entre SE, anti-CCP
y edad de inic io de los síntomas de AR, teniendo en cuenta el posible efecto de la duración de la enfermedad.
Materiales y métodos. Analizamos, en un estudio transversal, 411
pacientes de AR que fueron genotipados para HLA-DRB1 con el kit
Lifecodes HLA-SSO; los anticuer pos anti-CCP se determinaron por
ELISA con el ensayo Immunoscan Euro-Diagnostica. El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico STATA v9.0.
Resultados. Como esperábamos, SE y anticuerpos anti-CCP estaban fuertemente correlacionados (p<10-5). Observamos una modesta
correlación entre la edad de inicio de los síntomas y ambos marcadores (SE: p=0.12; anti-CCP: p=0.07). Observamos que existe una correlación entre la edad de inicio de los síntomas y el tiempo de evolución
de la enfermedad (p<10-7, r=-0.43). Al corregir este efecto mediante
un análisis multivariado, se pone de manifiesto que los anticuerpos
anti-CCP están correlacionados con el tiempo de evolución de la enfermedad (p=0.009) pero no con la edad de inicio de los síntomas (p=0.52).
Conclusión. Nuestros datos sugieren que los anticuerpos anti-CCP
no sólo son detectables antes de que aparezcan los primeros síntomas
de la enfermedad, como se describe en la literatura, sino que también
pueden aparecer durante el desarrollo de la misma como resultado del
proceso inflamatorio en los pacientes genéticamente proclives.
5. RESPUESTA Th17 FRENTE A Th1 EN LA ENFERMEDAD DE
CROHN. Veny M1, Closa D1, Esteller M1, Pique JM2, Panés J2,
Salas A1. 1Departament d'Isquèmia i Inflamació, IIBB-CSIC-CIBEREHD, Barcelona. 2Departament de Gastroenterologia, Hospital Clínic,
IDIBAPS-CIBEREHD, Barcelona.
Introducción. La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crónica del tracto digestivo caracterizada por un exceso de respuesta linfocitaria Th1. Recientemente se ha descrito una nueva pobla-
56
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
ción linfocitaria efectora, las células Th17. Esta población y sus mediadores (IL-17, IL-22, así como también la citocina activadora de esta respuesta, IL-23) se han identificado como determinantes en la patología
de diversas enfermedades inflamatorias así como en modelos experimentales de colitis.
Objetivo. Caracterizar la contribución de la respuesta Th17 frente a la Th1 en la enfermedad de Crohn.
Métodos. Aislamiento de linfocitos CD4+ de sangre de controles
sanos y pacientes con enfermedad de Crohn activa o en remisión. Cultivo de estas células y determinación de la proporción de células productoras de citocinas por marcaje intracelular y citometría de flujo.
En algunos experimentos, activación de las células con a-CD3/aCD28 y adición de IL-12, IL-23 o medio de cultivo.
Cuantificación por ELISA de la producción total de IFN-γ, IL-17
e IL-22 en el sobrenadante de los cultivos.
Resultados. Los pacientes con enfermedad de Crohn activa presentan un mayor porcentaje de células IL-17+ (p-valor<0.05) así como
un aumento en la secreción de IL-17 con respecto a los enfermos en
remisión y a los controles. El porcentaje de células IL-22+, y también
la cantidad de esta citocina, en los enfermos activos es mayor que en
los inactivos. Por el contrario, tanto el porcentaje como la cantidad
de IFN-γ no se correlacionan con la enfermedad ni con su actividad.
Además, los enfermos que presentan su primer o segundo brote de
actividad no se comportan como los activos con antecedentes sino que
sus niveles de IL-17 son más bajos y comparables a los de los enfermos
inactivos y los controles.
En respuesta a activación los linfocitos CD4+ producen más IFN-γ
y más IL-17. La adición al cultivo de IL-23 no afecta a la secreci ón de
IFN-γ pero en cambio pone de manifiesto una mayor sensibilidad de los
enfermos de Crohn a esta citocina ya que provoca un incremento en la
producción de IL-17 (p-valor<0.01) no observado en los controles.
Conclusiones. Nuestros experimentos muestran que la respuesta
linfocitaria tipo Th17, y no la Th1, se correlaciona con la actividad de
la enfermedad de Crohn. Además esta subpoblación Th17 aparece
aumentada en los enfermos crónicos pero no en los primeros brotes de
la enfermedad sugiriendo que este tipo de respuesta puede jugar un
papel importante en los estadios crónicos pero no en el debut de la
enfermedad.
6. EL GRADO DE INFLAMACIÓN MODIFICA EL FENOTIPO DE
LAS CÉLULAS T REGULADORAS EN PACIENTES CON
ARTRITIS REUMATOIDE. Marín Alberca MG1, Pérez García V1,
Peris Pertusa A1, Navarro Blasco FJ2, Sempere Ortells JM1. 1Universidad de Alicante, Departamento de Biotecnología, División de Inmunología. 2Hospital General Universitario de Elche, Unidad de Reumatología.
Introducción. Las células T reguladoras (Treg) participan en la
tolerancia periférica evitando la activación y correcto funcionamiento
de clones autorreactivos y, por tanto, la aparición de enfermedades
autoinmunes como la Artritis Reumatoide (AR). Objetivos: Caracterizar de manera más completa el fenotipo de membrana de Treg de
sangre periféric a de pacientes con AR, para buscar posibles cambios
dinámicos en estos parámetros según el grado de actividad de la enfermedad (DAS28) y los periodos de actividad/remisión. Metodología:
Se analizaron muestras de sangre periférica de 58 pacientes con AR y
38 controles sanos. 22 pacientes estaban en remisión (DAS28?3.2), 21
presentaban una actividad moderada (>3.2 DAS28?5.1) y 15 se encontraban muy activos (DAS28>5.1). Se analizó la expresión de los mar-
INMUNOLOGÍA
cadores de membrana CD28, CD45RA, CD45RO, CD45RBlow, CD38,
CD62L, CD134, CD152 y CD154 en linfoci tos CD4, CD8 y CD19, con
o sin baja, intermedia o alta expresión de CD25. El análisis se realizó
por citometría de flujo. Resultados: Descenso del porcentaje de
CD4+CD25+ en pacientes (p<0.0005), especialmente CD4+CD25high
y CD4+CD25int. Pacientes más activos presentan menor porcentaje de
células CD4+CD25high y CD4+CD25int (p=0.007). También descienden CD4+CD38+ (p<0.0001), CD4+CD62L+ (p<0.005),
CD8+CD25highCD45RA+ y CD8+CD25intCD45RA+ (p<0.01) en
pacientes. Aumenta la expresión de diferentes antígenos como CD134
(p<0.05), CD45RBlow (p<0.0001) o CD152 (p<0.000001) en células
CD4+CD25+, y la proporción de otras Treg como las CD4+CD152+
(p<0.05) o las CD8+CD28- en pacientes. Demostramos que la mayoría
de estos cambios guardan relación con el grado de inflamación, alcanzando sus menores o mayores niveles en pacientes moderados/activos respecto a controles y, en algunos casos, frente a inactivos. Conclusiones: Un balance apropiado de estas poblaciones de Treg, podría
determinar el grado de inflamación y, por tanto, podría r elacionarse
con los periodos de actividad/remisión.
7. DETECCIÓN DE FOXP3 EN CÉLULAS T REGULADORAS DE
PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE A DIFERENTES
GRADOS DE INFLAMACIÓN. Pérez García V1, Marín Alberca G1, Peris Pertusa A1, Navarro Blasco F2, Sempere Ortells JM1.
1Universidad de Alicante. 2Hospital General Universitario de Elche.
Introducción. La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crónica inflamatoria de carácter autoinmune, en la cual los pacientes sufren
una dinámica inflamatoria caracterizada por fases de remisión/activación. Las células T reguladoras, fundamentales para el mantenimiento de la autotolerancia y la prevención de enfermedades autoinmunes,
expresan de manera constitutiva el factor de transcripción FoxP3.
Objetivos. Analizar la expresión de FoxP3 por citometría de flujo en diferentes poblaciones celulares de sangre periférica en pacientes AR (vs. controles sanos), y determinar si existen cambios en su detección asociados al grado de inflamación según el DAS28 (Disease Activity Score).
Métodos. Células mononucleares de sangre periférica de 23 pacientes AR (5 en remisión, 11 con actividad inflamatoria moderada, 7 muy
activos) y 10 controles sanos fueron analizadas. Las células fueron marcadas con anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC o anti-CD19-FITC en combinación con anti-CD25-Pe-Cy5. Posteriormente, las células se procesaron según el Kit FoxP3-PE Staining Set (clone PCH101, eBioscience).
FoxP3 fue analizado por citometría de flujo teniendo en cuenta diferentes intensidades para el CD25.
Resultados. El porcentaje de células FoxP3+ aparece aumentado
en las células CD4+ (p<0.01) y subpoblaciones CD4+CD25low/int/high
(p<0.05) de los pacientes, respecto a los controles. Existe una tendencia al aumento de células CD8+CD25+FoxP3+ en los pacientes respecto a los controles sanos. El análisis según el DAS 28, muestra un aumento de células CD4+FOXP3+ y subpoblaciones CD4+CD25low/int/high
FoxP3+ en paralelo al grado de inflamación, siendo sobretodo en los
pacientes activos vs. controles (p<0.01) o vs. en remisión (p<0.05) donde las diferencias son más significativas.
Conclusiones. El aumento de células FoxP3+ en la sangre periférica de pacientes, especialmente marcado durante los brotes, podría
traducirse en un intento del sistema inmunológico por controlar la
enfermedad.
POSTERS
8. EL ESTADO HETEROCIGOTO PARA LOS POLIMORFISMOS
DEL GEN VDR ES PROTECTOR DE CELIAQUÍA. Manzanares Martín B, Casado A, González Fernández R, Jimenez Gómez
J, Sánchez Ruiz F, Rodriguez Reynoso F, Quesada Gómez M, Peña
Martínez J. Hospital Reina Sofia.
Introducción. La enfermedad celiaca (MIM 212750) es un desorden crónico autoimmune causado por intolerancia al gluten en sujetos genéticamente susceptibles. Los genes HLA sólo confieren un 40%
del riesgo genético de padecer esta enfermedad. Los enfermos celiacos (EC) presentan alteraciones en el metabolismo de la vitamina D,
que además de su efecto en el metabolismo del calcio, tiene un efecto
inmunomodulador. Recientemente se han demostrado diferentes asociac iones entre los polimorfismos del gen del receptor de la vitamina D (VDR) y enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, en el presente estudio nos planteamos determinar si los polimorfismos CDX-2,
BSM-I, FOK-I deVDR son factores de r iesgo de EC. Se estudiaron 50
familias con al menos un hijo con EC y algún hermano HLA idéntico
al paciente. Se tiparon por PCR-SSO de Dynal (tipaje genérico) y PCRSSO Innogenetics (AR) los loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQB1 y
DQA1 de los padres, el paciente y sus hermanos para confirmar la identidad HLA. El paciente y su(s) hermano(s) HLA idéntico(s) fueron genotipados para el polimorfismo de VDR (CDX 2, Fok I, Bsm I) usando
una amplificac ión por PCR seguido por digestión por endonucleasas
de restricción y electroforesi s en geles de agarosa.
Resultados. La comparación de los genotipos VDR de los pacientes
con sus hermanos HLA idénticos demostró que la proporción de “heterocigotos” en CDX-2, Bsm-I y Fok-I para los tres polimorfismos estudiados era significativamente superior en el grupo de los hermanos sanos.
Ningún EC resultó ser heterocigoto para los tres polimorfismos a la vez.
En el grupo control también encontramos una mayor proporción estadísticamente significativa de sujetos heterocigotos respecto a los pacientes celiacos. Cuando se compararon los haplotipos resultantes de las combinaciones de dos polimorfismos (CDX + Bsm I, CDX-2 + Fok I, Bsm I
+ Fok I) el porcentaje de dobles heterocigotos fue mayor en los hermanos sanos (28%, 28%, 28% respectivamente) con relación a EC (4.35%,
8.7%, 17.39%). Los controles se comportaron como los hermanos sanos.
9. LA PRESENCIA DE DRB1*0405 EN PACIENTES CON ARTRITIS
REUMATOIDE SE ASOCIA A REFRACTARIEDAD A LOS TRATAMIENTOS CONVENCIONALES (MTX / SLZ / HCLQ). Manzanares Martín B, Martínez Sánchez F, González Fernández R, Carrasco JA, Collantes Estevez E, Peña Martínez J. Hospital Reina Sofia.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria articular crónica mediada por alteraciones inmunológicas que afecta al
0.5% de la población adulta española. La presencia de una secuencia
común de aminoácidos en las posiciones 70-74 de la tercera región
hipervariable de la cadena beta (DRBI-SE), se relacionan a un peor curso clínico sobre todo los alelos que contienen la secuencia de aminoácidos (motif) QRRAA. También es conocida la relación existente entre
los alelos DRB1-SE(+) , los ac antiPCC y el FR a las formas de mayor
severidad clínica. Por tanto nuestro objetivo ha sido determinar la presencia de alelos DRB1-SE, Ac antiPCC y FR en pacientes con AR iniciales refractarios al tratamiento secuencial con los DMARDs clásicos
hidroxichloroquine (HCQ), salazopiry ne (SLZ) y methotrexate(MTX).
Pacientes y métodos. Se incluyeron 153 pacientes con AR inicial
(menor de 1 año), que cumplían criterios diagnósticos del ACR y de
57
POSTERS
ellos 42 cumplían criterios de refractariedad a los DMARDs clásicos.
Todos disponían del tipaje de alta resolución de los alelos DRB1, niveles de Ac antiPCC y FR, variables clínicas, tiempo de evolución hasta
suspensión de MTX, número de DMARDs administrados; variables
del DAS 28, HAQ y la progresión radiográfica según método Sharp
modificado por Van der Heijde.
Resultados. En los pacientes refractarios enc ontramos mayor frecuencia de DRB1*0405 (p=0.012; OR 6.31), de Ac antiPCC (p=0.03; OR
3.79), predominancia del género femenino (p=0.006), mayor numero
de DMARDs (p<0.000) y una prevalencia más alta del FR (p=0.002). El
alelo DRB1*0101 fue el más frecuente en ambos grupos: refractarios
(17.6%) vs no refractarios (15.2%).
10. INFLUENCIA DE LOS GENOTIPOS DE IL-10 Y TNF-ALPHA
EN LA ARTRITIS REUMATOIDE. de Paz B1, Alperi M2, López
P1, Prado C1, Ballina J2, Gutiérrez C1, Suárez A1. 1Área de Inmunología. Departamento de Biología Funcional. Universidad de Oviedo. 2Servicio de Reumatología. Hospital Universitario Central de Asturias.
Los genotipos funcionales de la IL-10 y el TNF se han asociado con
la susceptibilidad y la evolución clínic a de varias enfermedades autoinmunes, por lo que nos propusimos analizar su posible influencia en el
desarrollo de la AR. Para ello analizamos los alelos presentes en -1082
IL-10 y -308 TNF de 343 controles sanos y 165 pacientes de AR en los
que se recogieron los parámetros clínic os al diagnóstico, el tratamiento en el momento de la toma de muestra y, en algunos pacientes, la respuesta observada a los 6 meses. La distribución de genotipos de la IL10 mostró diferencias significativas entre pacientes y controles, estando disminuidos los genotipos bajos productores de esta citocina (1082AA) en pacientes (26% vs 39%), mientras que los portadores del
alelo -1082G* presentaban un mayor ri esgo de padecer la enfermedad
(OR=1,8, IC: 1,2-2,7, p=0.004). Además, el análisis de los parámetros clínicos indicó que la presencia de este alelo incrementaba la VSG, la PCR,
el DAS y la edad al diagnóstico, pero no se asociaba con presencia de
autoanticuerpos (antiCCP, FR). No se encontró una asociación significativa con los genotipos del TNF , aunque el genotipo combinado alto
IL-10/bajo TNFγ era el que tenía un mayor riesgo de padecer la enfermedad. Por otra parte, en otras patologías se ha sugerido que la respuesta a los esteroides puede estar influida por el genotipo de la IL-10. En
nuestros pacientes de AR la prednisona se suministra habitualmente en
combinación con otros tratamientos, frecuentemente con metrotrexato,
por lo que analizamos la respuesta al tratamiento combinado con estos
2 agentes midiendo la mejoría en el DAS a los 6 meses. Resultados preliminares (n=37) sugieren una mejor respuesta al tratamiento en los
pacientes altos productores de IL-10. En resumen, estos resultados sugieren que los portadores del genotipo alto productor de IL-10 presentan
una mayor susceptibilidad a padecer AR pero tienen mayor pr obabilidad de respuesta al tratamiento con prednisona y metrotrexato.
11. EFECTO DE UNA DIETA RICA EN ANTIOXIDANTES SOBRE
EL ESTRÉS OXIDATIVO DE LA ARTRITIS ADJUVANTE.
Ramos-Romero S, Ramiro-Puig E, Ramírez-Santana C, PérezCano FJ, Castellote C, Franch A, Castell M. Facultad de Farmacia,
Universidad de Barcelona.
Durante un proceso inflamatorio se eleva la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), moléculas capaces de oxidar macro-
58
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
moléculas como DNA, carbohidratos, proteínas y lípidos, y contribuir
así en la patogenia de diversas enfermedades. En este sentido, la ingesta de dietas ricas en antioxidantes puede tener un efecto modulador
en determinados estados patológicos. El objetivo del presente estudio
se centra en determinar el estado oxidante/antioxidante en un modelo de artritis experimental (artritis adyuvante, AA) y establecer la
influencia sobre el desarrollo del proceso inflamatorio de una dieta rica
en antioxidantes como es el cacao, producto con un elevado contenido en flavonoides. El estudio se ha realizado en ratas Wistar, alimentadas con un 5 o un 10% de cacao, incorporado en el pienso. A las 4
semanas de la inducción, se han obtenido macrófagos peritoneales y
muestras esplénicas. Se ha cuantificado la producc ión de ROS a partir de macrófagos mediante técnicas fluorimétricas y se han determinado las actividades catalasa y superóxido dismutasa (SOD) en tejido
esplénico mediante kits específic os (Calbiochem). A las 4 semanas
de la inducción, la inflamación articular se encuentra ligeramente atenuada en los animales que han recibido las dietas ricas en cacao respecto a los animales artríticos de referencia. La producción de ROS fue
superior en macrófagos procedentes de AA que en animales sanos
(p<0,05). Este incremento fue inferior en los animales que recibieron
cacao. Por otro lado, la AA causa, en bazo, disminución de la actividad catalasa (p<0,05) y aumento de la actividad SOD (p<0,05), alteraciones que no son tan marcadas tras una dieta rica en cacao. En conclusión, una dieta rica en flavonoides atenúa el estrés oxidativo del
proceso artrítico.
12. INFLUENCIA DE UNA DIETA RICA EN FLAVONOIDES
SOBRE LAS POBLACIONES LINFOCÍTICAS DURANTE UN
PROCESO ARTRITICO EXPERIMENTAL. Ramos-Romero S,
Pérez-Berezo T, Suàrez-Germà C, Castell M, Franch A, Pérez-Cano
FJ. Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona.
Los flavonoides son compuestos de origen vegetal, con una reconocida capacidad antioxidante. Esta actividad parece ser la causante
de sus efectos beneficiosos a nivel cardiovascular y también en procesos cancerosos. Sin embargo, hasta ahora, poco se sabe sobre el efecto de los flavonoides sobre el sistema inmunitario. El objetivo de este
estudio se ha centrado en determinar el efecto de una dieta rica en
cacao, producto con un elevado contenido en flavonoides, sobre diferentes poblaciones linfocíticas y sobre la respuesta humoral durante la
artritis adyuvante (AA).
Se ha dispuesto de ratas Wistar adultas que recibieron dietas ricas
en cacao. La artritis se ha inducido mediante inyección i.d. en la base
de la cola de Mycobacterium butyricum (Mb) inactivado.
A los 30 días de la inducción, se ha procedido al estudio de
las diferentes poblaciones linfocíticas presentes en ganglios linfáticos inguinales y sangre por técnicas de citometría de flujo. Asimismo se han cuantificado los anticuerpos anti-Mb presentes en suero.
Los ganglios linfáticos inguinales de los animales con AA presentan una menor proporción de linfocitos B y un mayor porcentaje de
células NKT así como de linfocitos T activados. Los animales sometidos a las dietas ricas en flavonoides no modifican estas alteraciones si
bien disminuyen la proporción de linfocitos T CD4+ (Th) y aumentan
la de linfocitos T CD8+ (Tc), tanto los correspondientes a células TCR
+ como a células TCR +. A nivel periférico, el proceso artrítico provoca un aumento en la relación Th/Tc, que se restablece con las dietas
ricas en flavonoides.
INMUNOLOGÍA
Por otra parte, la concentraci ón de anticuerpos anti-Mb disminuye un 60-75% en los animales artríticos que consumen las dietas ricas
en cacao.
En resumen, las dietas ricas en flavonoides no revierten las alteraciones en las proporciones de linfoci tos presentes en los animales con
AA, si bien causan un aumento de los linfoci tos Tc y producen una
disminución de los anticuerpos específicos.
13. EFFECTS OF DISEASE MODIFYING DRUGS IN THE ABNOR
MAL DISTRIBUTION OF MYELOID AND PLASMACYTOID
DENDRITIC CELLS IN RHEUMATOID ARTHRITIS
PATIENTS. Chara L1, Díaz D1, Chevarría J1, Sánchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Prieto A1, Albarrán F2, Cuende E2, Álvarez-Mon
M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA, Departamento
de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune y Reumatología, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, Madrid.
Background. Several lines of evidence point to a polarized Dendritic Cells (DC) immune response in Rheumatoid Arthritis (RA). At
least two peripheral blood DC subsets have been described: myeloid
DCs (mDC-I: Lin-HLADR+CD123-CD11c+high and mDC-II: LinHLADR+CD123-CD11c+low) and Plasmacytoid DCs (pDC: Lin-HLADR+CD123+CD11c-). In this study we conducted a quantitative analysis of the peripheral blood DC subsets in treated and untreated RA
patients compared with healthy controls.
Objectives. To compare the distribution of the different subsets of
DC in RA patients treated with disease modifying antirheumatic drugs
(DMARDs) or Anti-TNF alfa with respect to untreated RA patients and
healthy controls and to relate this distribution with the disease activity.
Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 46 rheumatoid arthritis patients and 15 healthy controls were purified and characterized in a FACSCalibur cytometer using fluorochrome-labeled
monoclonal antibodies to label CD3, CD11c, CD14, CD19, CD56, HLADR, and CD123 antigens. DAS28 score was calculated in each patient
in order to determine thedisease activity (non active disease < 3.2, active disease ¡? 3.2). Comparisons between patients and healthy controls
were carried out using the non parametric Mann-Whitney test and considered significant when p<0.05.
Results. We found a significant increase in mDC subset and significant decrease in pDC subset in RA patients with respect to healthy
controls. In RA patients with non active disease, we did not find significant differences in plasmacytoid DC subset with regard to healthy
controls. However, we found significant differences in mDC of RA
patients treated with DMARDS. In RA patients with active disease, we
found a significant decrease in pDC from untreated RA patients with
regard to healthy controls. In the other hand, we found a marked decrease of pDC in RA patient treated with DMARDS and Anti-TNFalfa
with respect to healthy controls. We also found a significant increase
in the percentage of mDC-II subset in treated and untreated RA patients
compared with healthy controls.
Conclusions: RA is characterized by an increase in peripheral blood of mDC and a decrease of pDC subsets. The response to the treatment with DMARDS and anti-TNFalfa increases the percentage in peripheral blood of pDC and mDC-II subsets. This may explain that the
treatment effect is probably due to their traffic to the inflamed synovial membrane. The fact that RA patients with active disease present
higher increases of these subsets agree with this idea.
POSTERS
14. DECREASE IN THE PERCENTAGE OF REGULATORY T
CELLS FROM RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS INVERSELY CORRELATES WITH DISEASE ACTIVITY. Chara L1, Díaz
D1, Chevarría J1, Sánchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Prieto A1, Pérez
A2, Turrión A2, Álvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNBCSIC, IMMPA, Departamento de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune
y Reumatología, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá
de Henares, Madrid.
Background. The balance between T regulatory cells and proinflammatory effector cells has shown to be of great relevance for the
development and persistence of autoimmune diseases, becoming this
regulatory cell population important to the development of a therapeutic target of interest in autoimmune arthritic conditions suc h as
rheumatoid arthritis.
Objectives. To determine the distribution of T regulatory cells of
peripheral blood of rheumatoid arthritis patients compared with healthy
controls, and to relate that distribution with the disease activity.
Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 15 rheumatoid arthritis patients and 12 healthy controls were purified and char
acterized in a FACSCalibur analyzer using fluorochrome-labeled monoclonal antibodies for CD3, CD4, CD25 membrane antigens combined
with intracellular staining of FOXP3 molecule. Likewise, the DAS28
score was calculated in each patient in order to determine the disease
activity. Comparisons between patients and healthy controls were
carried out using the non parametric Mann-Whitney test and considered significant when p<0.05.
Results: A significant decrease in the CD3+CD4+FOXP3+ cell
population was found in peripheral blood lymphocytes from rheumatoid arthritis patients with respect to healthy controls, more over a significant decrease in the CD3+CD4+FOXP3+ cell population was found
in peripheral blood lymphocytes of patients with active disease (DAS28
> 3.2), observing a negative correlation between the percentage of
CD3+CD4+FOXP3+ and DAS28 score value (r= -0.78; p< 0.05).
Conclusions. There is an important decrease of T regulatory cells
in rheumatoid arthritis patients that correlates inversely with the disease activity, being this way an important therapeutic target and biological marker of this disease.
15. ABNORMAL DISTRIBUTION OF MONOCYTES AND DENDRITIC CELLS IN RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS.
Chara L1, Chevarría J1, Díaz D1, Sánchez A2, Monserrat J1, Mur S1,
Prieto A1, Albarrán F2, León MJ2, Álvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D
asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA, Departamento de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune y Reumatología, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, Madrid.
Background. Since the rec ent evolution of the immunopathologic thought proposes that reumatoid arthritis is an i nnate autoimmune pathology, the knowledge of the distribution of the dif ferent
monocytic and dentritic cells (DC) subsets in these patients is important to understand the immunopathogenic process of this disease.
Objectives. To determine the distribution of the different monocytic and dendritic cells (DC) subsets from rheumatoid arthritis patients
compared with healthy controls, and to relate that subset distribution
with the disease activity.
59
POSTERS
Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 15 rheumatoid arthritis patients and 12 healthy controls were purified and char
acterized in a FACSCalibur c ytometer using fluorochrome-labeled
monoclonal antibodies for CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD16, CD19,
CD56, HLA-DR, and CD123 antigens. The DAS28 score was calculated in each patient in order to determine the disease activity. Comparisons between patients and healthy controls were carried out using
the non parametric Mann-Whitney test and considered significant
when p<0.05.
Results. A significant decrease in the percentage of CD14+highCD16monocyte subset was found in peripheral blood from rheumatoid arthritis patients with respect to healthy controls, no significant differences were found in the CD14+lowCD16+ subset. On the other hand, a
significant decrease in the percentage of plasmacyotid DCs (LinHLADR+CD123+CD11c-) subset was found in peripheral blood
monocytes from rheumatoid arthritis patients with respect to healthy
controls, as well as a significant inc rease in the myeloid DC subsets
(Lin-HLA-DR+CD123-CD11c+high and Lin-HLADR+CD123-CD11c+
low). There were no signific ant differences in the distribution of these subsets between the patient group with active disease (DAS28 > 3.2)
and the group with controlled disease (DAS28<3.2).
Conclusions. There is an altered distribution of the different
monocytic and dendritic c ells subsets in peripheral blood of rheumatoid arthritis patients characterized by a decrease in the “c lassical”
monocyte subset and a decrease in the plasmacytoid dendritic cell subset, probably due to their traffic to the inflamed synovial membrane.
This phenomenon could be independent of the disease activity.
16. APOPTOSIS ANALYSIS OF T NAÏVE/EFFECTOR/MEMORY
SUBSETS FROM RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS BY
POLYCHROMATIC FLOW CYTOMETRY. Chara L1, Chevarría
J1, Díaz D1, Sánchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Prieto A1, Cuende
E2, Pérez A2, Álvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNBCSIC, IMMPA, Departamento de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune
y Reumatología, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá
de Henares, Madrid.
Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has been
involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). We have
analyzed the apoptosis in specifically defined naïve/effector/memory
T lymphocyte circulating subpopulations of RA patients. OBJECTIVE:
To quantify spontaneous and induced apoptosis in lymphocytes of RA
patients with regard to a control population of sex and age matched
healthy individuals.
Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 RA patients
diagnosed according to the Am C Rh criteria (4 with active untreated
RA and 3 with refractory di sease) and 5 healthy controls were purified
and characterized using monoclonal antibodies and annexin V by eight
color flow cytometry in a FACSAr ia sorter. The apoptotic index (AI) of
lymphocyte subsets were determined after 24 hour culture under two conditions: spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinin induction.
Results. A marked decrease in spontaneous ex vivo apoptosis was
found in peripheral blood T lymphocytes from RA patients. This decreased apoptosis was found in effector (CD45RA+/-CD27-), naïve
(CD45RA+CD27+) and memory (CD45RA-CD27+) subsets of both
CD4+ and CD8+ T lymphocyte subpopulations. Similar impressive
decreases in AI were found in mitogen-induced T cell apoptosis. Apop-
60
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
tosis of lymphocytes from refractory RA patients was always lower
than that found in T lymphocytes from active RA patients.
Conclusions. Patients with active RA show an impressive decrease in spontaneous and mitogen-induced apoptosis within naïve/effector/memory CD4+ and CD8+ T-cell subsets. This decrease in T
lymphocyte apoptosis was specially marked in refractory RA patients.
17. LA PRESENCIA DE AUTOANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA MICA COMO NUEVO MARCADOR DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES ASOCIADAS EN PACIENTES CELIACOS. López Vázquez A1, Alonso Árias R1, Suárez Álvarez B1, Vidal
Castiñeira JR1, Rodrigo L2, Fuentes D2, López Larrea C1. 1Unidad
de Histocompatibilidad. Hospital Universitario Central de Asturias. 2Servicio de Digestivo. Hospital Universitario Central de Asturias.
Estudios recientes han demostrado que la proteína MICA se expresa en exceso en enterocitos de pacientes con enfermedad celiaca (EC),
en respuesta a un efecto tóxico directo del gluten. Esta activación produce daño tisular y podría ser el fenómeno inicial que conduce a la
atrofia vellositaria. Debido al daño experimentado por la mucosa intestinal y a la expresión excesiva de MICA, es posible que estos pacientes desarrollen anticuerpos anti-MICA, tal y como sucede en algunos
tumores y en el trasplante de órganos sólidos. Decidíamos investigar
la presencia de anticuerpos anti-MICA en sueros obtenidos de 323
pacientes con EC no tratada y en 100 controles sanos. Empleamos una
técnica de citometría de flujo en fase sólida (Luminex) utilizando los
kits LABScreen Mixed y MICA Single Antigen de OneLambda Inc.
Observamos que el 42% de los celíacos tenían anticuerpos anti-MICA
mientras que estos anticuerpos se detectaron en el 3% de los controles
sanos. En una 2ª muestra después de un año a dieta sin gluten encontramos que estos se mantenían en menos del 10% de los pacientes. 57
pacientes tenían además una enfermedad autoinmune adicional, especialmente Diabetes Mellitus Tipo I, fenómeno relacionado con el tiempo excesivo de exposición al gluten por un retraso en el diagnostico de
la EC. En este grupo de pacientes encontramos que el 73.6% eran positivos para anticuerpos anti-MICA mientras que estos sólo estaban presentes en el 34% de pacientes afectados solamente por EC. La aparición de estos anticuerpos era además independiente de la edad a la
que se había realizado el diagnóstico de EC.
Estos resultados sugieren que el desarrollo de enfermedades autoinmunes en pacientes celiacos está asociado a la presencia anticuerpos
anti-MICA. En c onclusión, el diagnóstico temprano y el tratamiento
de la enfermedad celíaca son esenciales para prevenir el desarrollo de
autoinmunidad, tanto para evitar la exposición al gluten como el posible efecto patológico de los anticuerpos anti-MICA.
18. RELACIÓN ENTRE ANTICUERPOS ANTI-CCP Y POLIMORFISMOS DRB1 Y CD154 EN PACIENTES ESPAÑOLES CON
ARTRITIS REUMATOIDE. Oliver A1, Calleja S1, Gamoneda E1,
Matías JA1, Romo E1, Mateo I2, Joven B2, Pérez-Aciego P3, PazArtal E1, Castro MJ1. 1Inmunología. Hospital 12 de Octubre. Madrid.
2Reumatología. Hospital 12 de Octubre. Madrid. 3Fundación LAIR.
Madrid.
Introdución. La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad compleja, poligénica y de etiología desconocida, que afecta al 0.8-1% de la
población en proporc ión de 3 mujeres: 1 hombre.
INMUNOLOGÍA
Sobre la AR actúan tanto factores genéticos como ambientales.
La asociación HLA-DRB1*04 y AR se ha demostrado hace más de 25
años. Los alelos DRB1 poseen una secuencia aminoacídica muy conservada, posiciones 72-74, el epítopo compartido (SE). Las distintas
variantes del SE (S1, S2, S3P, S3D) se relacionan con esta asociación
y favorecerían en distinto grado, predisposición o protección, la unión
de péptidos citrulinados (CCP) y la producción de anticuerpos antiCCP. Otro gen que se postula como asociado a AR es el ligando CD40
(CD40L).
CD40/CD40L es importante en la respuesta inmune humoral T
dependiente. Participa en la producción y regulación de Ig, activación
de señales inflamatorias, producción de citocinas, quimoquinas y moléculas de adhesión. CD40L, o CD154, posee un microsatélite (CA)n que
podría modular la unión de factores reguladores y variar la producción de proteína.
Objetivos. Comprobar si hay diferencias de asociación DRB1
(SE)/Ac anti-CCP y si hay asociación entre AR/(CA)n/anticuerpos
anti-CCP.
Métodos. Se han estudiado los alelos DRB1 y los niveles de anticuerpos anti-CCP en 107 paci entes de AR, y en 92 se han determinado los alelos (CA)n de CD154.
Resultados. Mayor frecuencia de DRB1*01 (p=0.004) y DRB1*04
(p<0.0001) en pacientes que controles. DRB1*0101 (S3P), *0401 (S2),
*0405 (S3P) asociados a pacientes de AR, anti-CCP+. DRB1*0402 (S1)
asociado a AR anti-CCP-. Asociación de distintos alelos SE en pacientes AR, CCP+ y CCP-. También se establece el nivel de significación
entre alelos (CA)n en pacientes AR, CCP+ y CCP-.
Conclusiones. Los alelos DRB1, portadores de distintos SE, condicionan la producción de anticuerpos anti-CCP. Encontramos distinta asociación entre alelos (CA)n del gen CD154 y pacientes AR antiCCP+ y anti-CCP-.
19. EFECTIVIDAD DE PRESENTACIÓN DE EPÍTOPOS CELIACOGÉNICOS POR LOS DÍMEROS trans HLA-DQA1*0505/
DQB1*0202 E INEFECTIVIDAD DE LOS HETERODÍMEROS
DQA1*03/DQB1*0302. Planelles D1, Donat E2, Capilla A3, Rodríguez M1, Gómez I1, Alba E1, Granell R1, Jarque D1, Ribes-Koninckx
C2, Montoro J1. 1Unidad de Histocompatibilidad, Centro de Transfusión
de la Comunidad Valenciana. 2Unidad de Gastroenterología Pediátrica,
Hospital la Fe de Valencia. 3Laboratorio de Genética, Instituto de Biomedicina del CSIC, Valencia.
Gran parte de la predisposición genética a celiaquía se encuentra ligada a los alelos HLA DQA1*0501, DQB1*0201, habiéndose descrito que los pacientes no portadores de estos dímeros DQ2 son DQ8
positivos. Esto ha conducido a la hipótesis de que estas moléculas
son importantes presentadoras de péptidos en esta enfermedad. El
OBJETIVO de este trabajo ha sido analizar la contribuci ón de los diferentes dímeros cis y tr ans DQab como determinantes de susceptibilidad a celiaquía en la población mediterránea. En una serie de
pacientes pediátricos se ha realizado un análisis comparativo del riesgo relativo (RR) de los haplotipos marcadores clásicos de celiaquía
(DRB1*0301/DQA1*0501/DQB1*0201 y DRB1*04/DQA1*03/
DQB1*0302) y no-clásicos (DRB1*07/DQA1*0201/DQB1*0202), tanto en homocigosis como en heterocigosis, calculándose la fracción
etiológica o preventiva de cada combinación haplotípica. Por otra
parte, se ha realizado un análisis de similaridad de secuencias entre
los distintos alelos implicados en la enfermedad.
POSTERS
Resultados. El RR de ser portador del dímero DQA1*0501/
DQB1*0201 es 9,7. Éste incrementa a 11,2 en combinación con
DQA1*0201/DQB1*0202 y disminuye a 2,9 con otros haplotipos noDR7; en homocigosis es 5,8. El RR de ser portador del dímero
DQA1*03/DQB1*0302 es inferior a la unidad. Por otra parte, el RR global de DQA1*0201/DQB1*0202 es 2.9, disminuyendo a 0,4 en homocigosis. En combinación con DQA1*0505/DQB1*0301 incrementa a 6,9
pero con otros haplotipos no-DR3, no-DR11, disminuye a 0,2. El análisis de secuencias revela similaridad estructural en la región de unión
a péptidos y de contacto con el TCR entre DQA1*0501 y *0505 y entre
DQB1*0201 y *0202. En conclusión, parece que el dímero trans
DQA1*0505/DQB1*0202 es más efectivo presentando péptidos celiacogénicos que el dímero ci s DQA1*0201/DQB1*0202, y podría pr esentar los mismos epítopos que DQA1*0501/DQB1*0201. El dímero
DQA1*03/DQB1*0302 no parece ser determinante de susceptibilidad
a celiaquía en nuestra población.
20. EVALUACION DE UN NUEVO TEST ELISA EN EL SCREENING DE LA ENFERMEDAD CELIACA EN POBLACION
PEDIATRICA. Prada Iñurrategui A, Riñon Martinez-Gallo M,
Maruri Machado N, Luque I, Arrieta Gutierrez A. Hospital de Cruces.
Introducción. Los marcadores serológicos, anticuerpos antigliadina (AGA) y antitransglutaminasa (ATG), han demostrado su utilidad como método de screening de la enfermedad celiaca (EC) en la
población pediátrica. Recientes estudios han revelado que la desamidación de la gliadina por la enzima transglutaminasa favorece su unión
a los AGA y consiguen una mayor exactitud en el screening de la EC
que la determinación de los AGA que utilizan la molécula convencional.
Objetivo. Evaluar un ELISA (INOVA) que utiliza como sustrato
una molécula de gliadina desamidada (AGA-D) en el screening de la
EC en población pediátrica. Comparar sus resultados con los resultados obtenidos por ELISAs que utilizan como sustrato una gliadina convencional (AGA-C) y la transglutaminasa humana recombinante
(ATGhr).
Materiales y Métodos. Se analizaron 245 sueros de pacientes pediátricos (1-6 años. Media de edad 2.2años). En todas las muestras se determinaron los AGA desamidada (AGA-D), los AGA convencional (AGAC) y ATG humana recombinate (ATGhr). Se cuantifico la IgA en los
sueros. En los pacientes con resultado positivo para ATGhr se analizó el HLA –DR.
Resultados. De las 245 muestras analizadas 29 muestras fueron
positivos para la ATGhr (25 muestras fueron positivas para los tres test
ATGhr+, AGA-D+ y AGA-C+, 2 muestras fueron únicamente ATGhr+
y 2 muestras fueron ATGhr+AGA-D+) y presentaban un tipaje HLADR relacionado con la EC. Una muestra fue sólo AGA-D+ y pertenecí a a un paciente diagnosticado de Diabetes Mellitus tipo I. Los muestras de 5 pacientes fueron AGA-D+ AGA-C+ presentaban cuadros abdominales inespecificos y/o alergias alimentarias continuandose el estudio de estos pacientes. 42 muestras fueron AGA-C+ y 160 muestras
fueron negativas para los tres tests. El déficit de IgA se diagnostico en
las muestras de 8 pacientes. Los resultados de sensibilidad (S) y especificidad (E) para cada test fueron:
ATGhr AGA-C AGA-D Sensibilidad 100% 86.3% 93% Especificidad 100% 78.8% 97%
61
POSTERS
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Los resultados del Test de Concordancia fueron: Concordancia global entre ATGhr y AGA-D: 96% Concordancia global entre ATGhr y
AGA-C: 80% Concordancia global entre AGA-D y AGA-C: 81%
Conclusiones:
1. Los anticuerpos AGA-D son útiles como método de screening de
la EC en población pediátrica.
2. Los anticuerpos AGA-D presentan una sensibilidad y especificidad superior a los anticuerpos AGA-C y parecida a los ATGhr
en el screening de la EC en población pediátrica.
SESIÓN 2: INMUNOGENÉTICA
Moderadores: Dra Estela Paz Artal (Madrid),
Dr. Jordi Yagüe (Barcelona)
21. POLIMORFISMOS EN GENES IMPLICADOS EN INMUNIDAD INNATA NO ESTÁN ASOCIADOS CON EL RIESGO DE
SUFRIR SEPSIS. Guzmán Fulgencio M1, Sirgo Rodríguez G2, Castillo Rama M1, Bernardo Gonzalez I1, Mancebo Sierra E1, Romo
Pasamar E1, Pérez V1, Paz Artal E1, Morales Pérez P1. 1Hospital
Universitario12 de Octubre, Madrid. 2Departamento de Medicina Intensiva, Hospital Universitario Joan XXIII, Tarragona.
La sepsis es una patología que se define como la respuesta inflamatoria sistémica a la infección. El objetivo de este estudio es evaluar si polimorfismos de genes implicados en la primera línea de defensa de la inmunidad innata como aquellos localizados en los genes de
los receptores de membrana TLR2 (Arg753Gln), TLR4 (Asp299Gly y
Thr399Ile) y el polimorfismo en la región promotora del gen del receptor de macrófagos y monocitos CD14 (-159C>T), incr ementan el riesgo de sufrir sepsis. El estudio se ha realizado con 100 pacientes sépticos que proceden de la unidad de cuidados intensivos de dos hospitales universitarios y 107 controles. Los distintos genotipos han sido
determinados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
a tiempo real y análisis con curvas de melting (TLR2 y TLR4) y mediante PCR y análisis de fragmentos de restricción (CD14), todos a partir
de ADN extraído de sangre periférica. Los r esultados obtenidos fueron comparados por el test estadístico de Chi-cuadrado aplicando la
corrección de Yates. El análisis estadístico reveló la falta de diferencias
significativas en las frecuencias genotípicas de los polimorfismos estudiados comparados con controles tanto en los polimorfismos de los
genes TLRs (TLR2: p=0,32, TLR4: p=0,96 y p=0,8 en los polimorfismos
Asp299Gly y Thr399Ile respectivamente), como en el polimorfismo del
gen CD14 (p=0,42) Podemos concluir entonces que polimorfismos estudiados no están asociados con el riesgo a sufrir sepsis.
22. DISTRIBUCION DE ALELOS HLA-C EN LA POBLACION DE
CASTILLA Y LEON. Leon Moya V1, Leon Arroyo A2, Alonso Sardon M3. 1Serv. Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca.
2Laboratorio de Pediatria e Inmunologia. Universidad de Valladolid.
3Dept. Med. Preventiva. Universidad de Salamanca.
Introdución. Los estudios de alelos HLA en poblaciones localizadas tienen un gran interes a fin de disponer de datos basales de poblaciones concretas, aplicable a una gran diversidad de estudios, desde
62
los simplemente poblacionales a servir de base comparativa en los estudios de ciertas enfermedades, sobre todo las que presentan un componente autoinmune.
Material y Métodos. Hemos estudiado la distribución de polimorfismos del gen HL-C en nuestra población ( n= 126)de Castilla y León.
Muestras de sangre, de 50 a 200 mcl, fueron depositadas en un
papel Whatman 3MM secadas a almacenadas a temperatura ambiente hasta su utilización. El ADN fué extraido con el kit DNA
Direct II de Dynal, obteniendo de 1- 4 mcg de ADN. El locus HLA
–C fué estudiado con el kit Dynal SSP HLA-Cw. Hemos cambiado
las condiciones generales de la PCR a fin de adaptarla a nuestras cantidades de ADN, 2-4 ng y 0,1 U de Taq Polymerasa, por tubo (en vez
de 100 ng de ADN y 0.4 U de Taq del protocolo original).
Las condiciones de la PCR fueron: 1) 94ºC, 2 min., 1 ciclo. 2) 94ºC
10 sec., 65ºC 60 sec. 10 ciclos. 3) 94ºC 10 sec., 61ºC 50 sec., 72ºC 30 sec.
30 ciclos. 4) 72ºC 3 min. Los productos PCR fueron visualizados por
electroforesis en agarosa al 2%.
Resultados. Las frecuencias de los alelos HLA-C halladas fueron:
HLA Cw 01*, 3,6% ; Cw 02*, 4,4% ; Cw 03*, 8,2% ; Cw 04*, 10,8% ; Cw
05*, 13,8% ; Cw 06*, 8,6% ; Cw 07*, 16,2% ; Cw 08*, 5,6% ; Cw 012*,
10,8% ; Cw 014*, 2,4% ; Cw 015*, 3,4% ; Cw 0116*, 12,4% ; Cw 017*,
3,2%.
No se hallaron diferencias signifi cativas con otros estudios efectuados en poblaciones españolas y portuguesas.
23. ALELOS DPB1*, HLA CLASE II, EN LA POBLACION DE CASTILLA Y LEON. Leon Moya V1, Leon Arroyo A2, Alonso Sardon
M3. 1Serv. Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Laboratorio de Pediatria e Inmunologia. Universidad de Valladolid. 3Dept. de
Med. Preventiva. Universidad de Salamanca.
Introdución. Los estudios de alelos HLA en poblaciones localizadas tienen un gran interes a fin de disponer de datos basales de poblaciones concretas, aplicable a una gran diversidad de estudios, desde
los simplemente poblacionales a servir de base comparativa en los estudios de ciertas enfermedades, sobre todo las que presentan un componente autoinmune.
Material y Métodos. Hemos estudiado la distribución de polimorfi smos del gen DPB1* en nuestra población (n= 128)de Castilla y León.
Muestras de sangre, de 50 a 200 mcl, fueron depositadas en un
papel Whatman 3MM secadas a almacenadas a temperatura ambiente hasta su utilización. El ADN fué extraido con el kit DNA Direct II
de Dynal, obteniendo de 1- 4 mcg de ADN. El locus DPB1* fué estudiado con el kit Dynal SSP allset DPB1*. Hemos cambiado las condiciones generales de la PCR a fin de adaptarla a nuestras cantidades de
ADN, 2-4 ng y 0,1 U de Taq Polymerasa, por tubo (en vez de 100 ng de
ADN y 0.4 U de Taq del protocolo original).
Las condiciones de la PCR fueron: 1) 94ºC, 2 min., 1 ciclo. 2) 94ºC
10 sec., 65ºC 60 sec. 10 ciclos. 3) 94ºC 10 sec., 61ºC 50 sec., 72ºC 30 sec.
30 ciclos. 4) 72ºC 3 min. Los productos PCR fueron visualizados por
electroforesis en agarosa al 2%.
Resultados. Las frecuencias de los alelos DPB1* halladas fueron:
DPB1* 0101, 3,6%; DPB1* 0201, 13,6%; DPB1* 0202, 3,2%; DPB1* 0301,
10,6%; DPB1* 0401, 34,4%; DPB1* 0402, 7,6%; DPB1* 0501, 1,8%; DPB1*
0601, 2,4%; DPB1* 0901, 2,2%; DPB1* 1001, 2,4%; DPB1* 1101, 7,6%; DPB1*
1301, 0,6%; DPB1* 1401, 1,2%; DPB1* 1501, 1,2%; DPB1* 1701, 2,8%.
No se hallaron diferencias signifi cativas con otros estudios efectuados en poblaciones españolas y portuguesas.
INMUNOLOGÍA
24. POLIMORFISMOS EN GENES DE CITOKINAS EN PACIENTES DE ALZHEIMER. Leon Moya V1, Cacho J2, Hernandez Cerceño MI1. 1Serv. Análisis Clínicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Serv. de Neurología. Hospital Universitario de Salamanca.
Hemos estudiado 24 pacientes con Enfer medad de Azheimer ,EA,
de acuerdo con los cr iterios de NINCDS-ADRDA, y 28 sujetos control. Los polimorfismos fueron analizados empleando el kit Citokine
genotiping Kit (Pel-freez).
Los polimorfismos halladosen el grupo control fueron: IL-1alpha/
- 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/ 45 CT/15 TT),
IL-1beta/ 396 (60 CC/35CT/5 TT),IL-1RA/mspa 11100 (5 CC/47.5
CT/47,5 TT), IL1R/psti 1970 (50 CC/40 CT/10 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/
45 GT/40 TT), IL-2/ 166 (50 GG/40 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/
27.5 GT/ 62,5 TT), IL-4/ - 590 (72.5 CC/25 CT/ 2,5 TT), IL-4/ - 33 (75
CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (60 AA/35 AG/5 GG), IL-6/ - 174
(20 CC/ 40CG/40 GG), IL-6/ 565 (12.5 AA/52,5 AG/35 GG), IL-10/
- 592 (5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (50 CC/40 CT/10 TT) IL-10/
- 1082 (25 AA/50AG/25 GG), IL-12/ - 1188 (62.5 AA/32.5 AC/5CC),
IFN gamma/utr 5644 (32.5 AA/42,5 AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0
AA/2O AG/80 GG), TNF alpha/ - 308 (10 AA/25 AG/65 GG), TGF
beta1/codon 10 (25 CC/50 CT/25 TT), TGF beta1/codon 25 (0 CC/15
CG/85 GG)
Los polimorfismos para el grupo de pacientes EA: IL-1alpha/ 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (35 CC/ 50 CT/15 TT), IL1beta/ 3962 (55 CC/35CT/10 TT),IL-1RA/mspa 11100 (0CC/50 CT/50
TT), IL1R/psti 1970 (45 CC/52.5 CT/7.5 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 50
GT/35 TT), IL-2/ 166 (55 GG/35 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/ 22
GT/ 70 TT), IL-4/ - 590 (75CC/25 CT/ 0 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5
TT), IL-4R alpha/1902 (75 AA/15 AG/10 GG), IL-6/ - 174 (15CC/
45CG/40 GG), IL-6/ nt 565 (10 AA/50 AG/40 GG), IL-10/ - 592 (5
AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (55 CC/35 CT/10 TT) IL-10/ - 1082
(20 AA/50AG/30 GG), IL-12/ - 1188 (60 AA/35 AC/5 CC), IFN gamma/utr 5644 (35 AA/40AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80
GG), TNF alpha/ - 308 (5 AA/30 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (25
CC/50 CT/25 TT), TGFbeta1/codon 25 (0 CC/10CG90 GG)
El test de Chi-Cuadrado no muestra diferencis signific ativas
p<0.05, entre los polimorfismos del grupo
25. ORIGENES Y RELACIONES GENÉTICAS HLA DE LOS UROS:
HABITANTES DE ISLAS-FLOTANTES EN EL LAGO TITIKAKA (BOLIVIA/PERÚ). Arnaiz-Villena1, Serrano-Vela JI1, Barbolla L2, Reguera R1, Ferri A1, Abd-El-Fatah-Khalil S2, Ruiz-Tovar
M2, Millan P1, Moscoso J1. 1Dept. Inmunología, Universidad Complutense, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 2Dept. Hematología, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid.
Los Uros viven en islas flotantes (de juncos o “totora”) en el Lago
Titikaka, que hace frontera entre Bolivia y Perú y se cree que fueron
los primeros habitantes del altiplano Andino en esa zona. En este trabajo, se han identific ado alelos de los genes HLA-A, -B, -C, -DRB1 y
–DQB1 mediante tipaje de alta resolución de ADN. Se han estimado
los haplotipos extendidos y los resultados se han comparado con poblaciones de todo el mundo (unos 12.450 cromosomas) mediante dendrogramas Neighbour-Joining y análisis de correspondencia. Los Uros son
genéticamente más próximos a los Aymaras Sudamericanos, los Tarahumaras y los Indios Terena (de Bolivia, México y Brasil, respectiva-
POSTERS
mente) que a otras poblaciones Amerindias geográficamente más cercanas. Se ha observado también que: a) todos los Amerindios representan un grupo separado del resto de las poblaciones del mundo
(incluidos Na-Dene, Eskimos y Siberianos); b) se confirma que los grupos de Amerindios genéticamente relacionados pueden estar geográficamente distantes; c) lenguas y genes no se correlacionan y esto
es particularmente llamativo en los grupos étnicos en Amerindios.
26. GENES HLA EN LA POBLACIÓN DE LOS MAYOS DEL NORESTE DE MÉXICO. Arnaiz-Villena1, Fernandez M2, Abd-El-FatahKhalil S2, Serrano-Vela JI1, Reguera R1, Millan P1, Ferri A1, Vargas-Alarcon G3, Moscoso J1. 1 Dept. Inmunología, Universidad Complutense, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 2Dept.
Hematología, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 3Dept.
Inmunología, Instituto Salvador Zubiran, Ciudad de México.
Se han identificado los alelos de clase I y clase II de 60 individuos no relacionados de un grupo de Mayos, que viven en el Estado
Mexicano-Pacífico de Sinaloa. Se compararon los resultados HLA de
Mayos con los de otros Amerindios y poblaciones de todo el mundo.
Para estas comparaciones se utilizaron un total de 14.896 cromosomas.
Se calcularon distancias genéticas entre las poblaciones, dendrogramas Neighbour-Joining y se realizaron análisis de correspondencia
para determinar las relaciones genéticas entre las poblaciones analizadas. Los nuevos haplotipos específicos encontrados fueron: HLA-A*02B*35-DRB1*1406-DQB1*0301; HLA-A*02-B*48-DRB1*0404-DQB1*0302;
HLA-A*24-B*51-DRB1*0407-DQB1*0302 y HLA-A*02-B*08-DRB1*0407DQB1*0302. Sin embargo, el alelo típico Centro-Americano HLADRB1*0407 representa un 40% de todos los alelos DRB1. Al mismo
tiempo que se observan características HLA comunes con grupos étnicos de Amerindios que se encuentran alejados, también se detectan
nuevos haplotipos HLA específicos de grupo (elevado DRB1*0407), lo
que sugiere un efecto fundador común. Probablemente, la aparición
de los nuevos haplotipos HLA seguramente se deba a una selección
específica por patógenos. El leguaje de los Mayos es próximo al de los
Tarahumaras (otro grupo geográfic amente cercano), a pesar de que
estos dos grupos no son genéticamente próximos según nuestros resultados, haciendo constar de nuevo la diferente evolución de genes y de
lenguas, que no se correlacionan. Sinaloa es uno de los Estados Mexicanos en los que se encuentran más genes europeos. Sin embargo, no
se observan genes HLA europeos en Mayos y nuestros resultados podrían utilizarse en programas de trasplante y para estudio de enfermedades HLA.
27. CAMBIO DE AMINOACIDO EN EL DOMINIO ALFA-3 DE UN
NUEVO ALELO HLA-G (HL A-G*0108). Moscoso J1, SerranoVela I1, Pérez-Saborido B2, Moreno E2, Barbolla L3, Algora M3,
Reguera R1, Ferri A1, Arnaiz-Villena A1. 1Dept. Inmunología, Universidad Complutense, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid.
2Dept. Cirugía Gastrointestinal y Hepática, Hospital 12 de Octubre,
Madrid. 3Dept. Hematología, Centro de Transfusión de la Comunidad de
Madrid.
El gen de histocompatibilidad de clase I no clásico HLA-G muestra un bajo polimorfismo. Codifica para moléculas HLA tolerogénicas
que pueden ser importantes en el control de la autoinmunidad y el
rechazo de trasplante (y también del feto semialogénico). Las molécu-
63
POSTERS
las HLA-G dan señales negativas a las células NK (Natural Killer) y
a los linfocitos T. En este trabajo, se describe un nuevo alelo, HLAG*0108, que puede ser útil para una tolerización natural HLA y/o la
inducida por fármacos en trasplantes y para el estudio de enfermedades ligadas a HLA. Es el segundo alelo encontrado hasta la fecha donde el polimorfismo se encuentra en el dominio alfa-3 de la valva de
HLA-G. Se discute la importancia de los cambios en el dominio de alfa3 de la molécula HLA-G en relación con su función.
28. CAMBIO NO-CODIFICANTE DE BASE EN EL ADN DEL
EXON 2 DE UN NUEVO ALELO, HLA-G*010114. Arnaiz-Villena A1, Serrano-Vela JI1, Reguera R1, Barbolla L2, Algora M2, Ferri
A1, Pérez-Saborido B3, Moreno E3, Moscoso J1. 1Dept. Inmunología,
Universidad Complutense, Centro de Transfusión de la Comunidad de
Madrid. 2Dept. Hematología, Centro de Transfusión de la Comunidad de
Madrid. 3Dept. Cirugía Gastrointestinal y Hepática, Hospital 12 de Octubre, Madrid.
El gen de histocompatibilidad de clase I no clásico, HLA-G, muestra un bajo polimorfismo proteico y una mayor variabilidad de su ADN
(ocho proteínas y 28 alelos). Este polimorfismo del ADN en HLA-G se
debe mayoritariamente a cambios en la tercera base de los codones en
los exones que, generalmente, no producen cambio de aminoácido.
Este alto polimorfismo en el ADN en comparación c on su polimorfismo proteico sugiere que existe una presión evolutiva que se opone a
la variación de HLA-G. Esto puede estar relacionado con la función
inmunotolerogénica que se postula para HLA-G y la selección para
invarianza, puede ser de purifi cación al no tener que presentar HLAG gran variedad de péptidos microbianos, c omo lo hacen las moléculas HLA de clase I clásicas. La descripción de nuevos alelos HLA puede servir en un futuro próximo para medir el grado de tolerancia o
aceptación de determinados injertos y así proceder con la terapia adecuada.
29. VARIABILIDAD DE LOS GENES DE HISTOCOMPATIBILIDAD EN UN MODELO DE AVES SALVAJES EUROPEAS Y
SUDAMERICANAS (JILGUEROS, GÉNERO CARDUELIS).
Serrano-Vela JI, Reguera R, Ferri A, Millan P, Ferre S, Arnaiz-Villena A. Dept. Inmunología, Universidad Complutense, Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid.
Los genes que componen el sistema principal de histocompatibilidad humano (HLA) están bien caracterizados en cuanto a su localización cromosómica, su variabilidad (genética y proteica) y su funcionalidad. Sin embargo, no está claro que esta organización sea paradigmática ni que pueda utilizarse como modelo representativo de los sistemas de histocompatibilidad de la generalidad de vertebrados. De
hecho, numerosos estudios realizados en otros grupos de mamíferos
y en otros vertebrados (anfibios, peces, reptiles y aves) no siempre
muestran el gran polimorfismo observado en humanos. En este trabajo se plantea el estudio de genes de histocompatibilidad de clase I
(MHC-I) en una especie de jilguero europeo (Carduelis c arduelis) y
en varias especi es estrechamente emparentadas de jilgueros sudamericanos (otras especies del género Carduelis). El objetivo es determinar su variabilidad y evolución, analizando especialmente los puntos de variación en la proteína que puedan tener implicaciones en su
función. El estudio se ha realizado a partir de ADN extraído de sangre
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VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
obtenida de pájaros salvajes en su hábitat natural. Las secuencias de
ADN analizadas incluyen exón 2- intrón 2 - exón 3 de moléculas de
clase I y se han obtenido mediante amplificación por PCR y posterior
secuenci ación. Las ambigüedades debidas a los polimorfismos se han
resuelto mediante clonación. Se ha detectado la presencia de al menos
dos genes de clase I en el jilguero europeo con una variabilidad genética que en la mayoría de los casos se traduce en una variabilidad proteica. Sin embargo, en los jilgueros sudamericanos se ha detectado
un único gen de clase I con una variabilidad reducida, hasta el punto
de que los mismos alelos están presentes en distintas especies (evolución transespecífica). Las posiciones variables de la región de unión
al péptido en las proteínas de Carduelis carduelis son diferentes a las
encontradas en los jilgueros sudamericanos. Se contrapone la gran
variabilidad MHC en modelos no salvajes (humanos, ratones de laboratorio y pollos) y la escasa en salvajes (hamster sirio, rata, topo, guepardo). Se relaciona la gran variabilidad de especies no salvajes con
fenómenos de autoinmunidad.
30. EL ALELO HLA-B*8301 SE GENERA POR UN EVENTO DE
CONVERSIÓN GÉNICA QUE INCLUYE EL EXÓN 2 COMPLETO. Martinez Laso J1, Roman A1, 2, Cervera I1, Rodriguez M1, Gutierrez-Solar B1, Head J1, 2. 1Unidad de Inmunoterapia Celular. Instituto
de Salud Carlos III. Centro Nacional de Microbiología. Majadahonda.
Madrid. 2Servicio de Microbiología. Hospital Clínico San Carlos.
Se han propuesto tres mecanismos diferentes de generación de polimorfismo de alelos del MHC: mutación puntual, recombinación y conversión génica. Se ha descrito previamente que varios alelos de HLAA y de HLA-B se generaron por fenómenos de conversión génica y de
recombinación que involucran regiones no codificantes. Varios estudios indican que la conversión génica es el fenómeno más importante
cuando se analiza la secuencia de los intrones. El alelo HLA-B*8301 fue
el primero en el que se describió un proceso de recombinación consistente en la inclusión del exón 2 del alelo B*5603 en la secuencia del
B*4402. Los exones 1, 3 y 4 del alelo B*8301 eran idénticos a la mayoría de los alelos B*44 mientras que el exón 2 presentaba una diferencia
de 23 nucleótidos con el alelo B*4402 y de sólo un nucleótido con el alelo B*5603 en el codón 24. Para confi rmar la implicación de los intrones
en la generaci ón del alelo B*8301 se secuenciaron parci almente el exón
1 y la totalidad del intrón 1, exón 2, intrón 2 y exón 3 de los alelos B*8301
y B*5601. Teniendo en cuenta todos los resultados se puede plantear la
hipótesis de que B*8301 se genera por un fenómeno de conversión génica entre B*44020101 como receptor y B*5601 como donante del exón 2
completo, el extremo 3’ del intrón 1 y el extremo 5’ del intrón 2. Estos
datos reflejan la importancia de los intrones para establecer el correcto mecanismo de generación de polimorfismo del MHC.
31. LA INMUNOGLOBULINA M Y LA IMMUNOGLOBULINA D
EN EL REPTIL GECKO LEOPARDO (Eublepharis macularius).
Sánchez Espinel C1,3, Magadán Mompó S2,1, Gambón Deza F3. 1Área
de Inmunología. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo. 2Instituto
Superior de Saude do Alto Ave (ISAVE). Portugal. 3Unidad de Inmunología. Hospital do Meixoeiro. Complejo Hospitalario Universitario de
Vigo (CHUVI).
Introducción. La inmunoglobulina D (IgD) ha sido un misterio
desde que fue descubierta en los mamíferos hace 40 años. Comparte
INMUNOLOGÍA
con la inmunoglobulina M (IgM) el papel de receptor antigénico en la
membrana de las células B maduras. La ausencia de esta inmunoglobulina en las aves y su descripción en peces óseos contribuyó a la confusión acerca de su origen evolutivo.
Objetivos. Estudios recientes han demostrado la presencia de IgD
en el anfibio Xenopus tropicalis, la cual convierte en esencial su búsqueda y estudio en reptiles para poder comprender la evolución de
esta inmunoglobulina en los vertebrados.
Metodología. Se realizó una extracción de DNA genómico y se
obtuvo una primera secuencia, empleando primers degenerados, la c
ual se alargó por ambos extremos utilizando la técnica de “DNA walking” previa construcción de una librería de DNA (GenomeWalker
Universal Kit Clontech de TAKARA BIO). Para las extracciones de RNA
total se utilizó el kit QUIamp (QIAGEN) y para la realización de RTPCRs el kit One Step QIAamp RNA (QIAGEN). La secuenciación se
llevó a cabo empleando BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems) y el secuenciador ABI PRISM® 3130-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Para los análisis fi logenéticos se
empleó el software MEGA4 y a nivel estadístico el software SPSS.
Resultados y conclusiones. En el presente trabajo se describe la
IgD e IgM en el reptil Eublepharis macularius. El gen de la IgM tiene
características similares a aquellas descritas en otras especies, mientras que la IgD tiene una estructura particular en esta especie. Está formada por 11 dominios de inmunoglobulina sin ningún tipo de evidencia de duplicaciones intragénicas de los exones, como ha sido descrita en la de los peces y anfibios. Es posible que esta inmunoglobulina
esté compuesta por dominios heredados de especies anteriores y que
esta forma sea similar a la presente en animales que dejaron el mar
para vivir en la tierra. También describimos una segunda inmunoglobulina D (IgD2), la cual debió aparecer recientemente por duplicación
de una inmunoglobulina anterior y recombinación con la IgA-like descrita para esta especie. La expresión de ambas inmunoglobulinas en
los tejidos del animal es similar a la de la IgM sugiriendo un papel funcional para la IgD de reptil.
32. LA PRESENCIA DE LOS HAPLOTIPOS HLA MÁS FRECUENTES EN NUESTRO MEDIO PROTEGE FRENTE A LA DEGENERACIÓN MACULAR ASOCIADA A LA EDAD. González
Fernández R, Villegas Becerril E, Manzanares Martín B, Gallardo Galera JM, Peña Martínez J. Hospital Reina Sofia.
La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la causa
más común de ceguera en mayores de 60 años en países desarrollados.
En su patogenia se involucra tanto la predisposición genética como la
participación del sistema inmune. En este sentido, el sistema HLA sería
un buen candidato porque juega un papel crucial en la regulación
del sistema inmune y presenta un amplio polimorfismo. Nuestro objetivo es establecer la relación existente entre la DMAE en concreto de
tipo exudativo y los alelos de HLA clase I (HLA-A y HLA-B) y c lase
II (HLA DRB1). Pacientes y métodos: Se incluyeron en este estudio
75 pacientes con NVC subfoveales/yuxtafoveales secundarias a DMAE
diagnosticadas mediante angiografía con fluoresceína, predominantemente clásicas con agudeza visual comprendida entre 3/60 y 20/60
y tamaño de la lesión inferior a 5400 μm de diámetro. También
se incluyeron pacientes con NVC oculta, con visión inferior a 20/50, o
con membranas ocultas de tamaño menor de 4 áreas de disco con visión
mejor de 20/50 y con lesiones mínimamente clásicas con AV > 0.08 y
tamaño menor de 6 áreas de disco. Se excluyeron del estudio las mem-
POSTERS
branas secundarias a otras patologías como las secundarias a miopía
o corioretinopatía central serosa, entre otras. Se realizó el tipaje HLA
A, B y DR por una técnica de PCR-SSO (Dynal y/o I nnogenetics) y a
250 sujetos sanos mayores de 55 años sin patología oftalmológica conocida. Resultados: El análisis de los datos demostró la ausencia de los
10 haplotipos más frecuentes en nuestro medio en la mayoría de nuestros pacientes. Se presentarán las frecuencias de los haplotipos en los
pacientes y nuestro grupo control. En el análisis de los alelos (HLA-A,
B y DRB1) no se observaron diferencias signif icativas entre los pacientes y el grupo control excepto el alelo HLA-B*27 que era más frecuente en el grupo con DMAE exudativa (p 0.0113). No se encontró ningún
alelo protector para esta patología.
33. DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO HLA-DQ2/DQ8 POR PCR
A TIEMPO REAL. Faner Canet MR1, Ruiz E1, Campos E1, PujolBorrell R1,2, Juan M3, Palou E1. 1Laboratori d’Immunobiologia per a la
Recerca i Aplicacions Diagnòstiques (LIRAD), Banc de Sang i Teixits
(BST). 2Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). 3Servei d’Immunologia. Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic Barcelona.
La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatía mediada por una
respuesta inmune que se desencadena por la ingestión de gluten. En
estos pacientes, se ha descrito que la molécula HLA-DQ es un factor
de susceptibilidad genética muy importante: más del 90% de enfermos
celiacos son HLA-DQ2 y los restantes son HLA-DQ8. Debido a esta
alta asociación la tipificación HLA se usa como un marcador diagnostico, que es muy útil cuando las pruebas serológicas y las biopsias son
de resultado inconcluyente. Para la detección de DQA1*05, DQB1*02
(codificando DQ2) y DQB1*0302 (codificando DQ8) se usan habitualmente diversos métodos de PCR-SSP, pero ninguno es del todo satisfactorio ya que requieren la realización de muchas reacciones y también manipulaciones post-PCR. Por ello hemos desarrollado un método de tipificación basado en la PCR a tiempo real con sondas FRET
capaz de determinar el genotipo DQA1*05, DQB1*02 y DQB1*0302 de
la muestra mediante cuatro reacciones y sin necesidad de manipulación post-PCR. Para la validación de dicha aproximación se han analizado 40 muestras que habían sido tipificadas mediante otros métodos obteniendo resultados equivalentes, demostrando la reproducibilidad y precisión de la técnica. En resumen, podemos decir que el
uso de esta técnica en los laboratorios de tipificaci ón HLA puede ayuda a incrementar el número de muestras procesables a la vez, minimizar el esfuerzo y reducir los riesgos de contaminación.
Financiado por ayuda Profit FIT 010000-2006-38.
34. UTILIZACIÓN DE UN MÉTODO DE HIBRIDACIÓN CON
SONDAS ESPECÍFICAS DE SECUENCIA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA FRECUENCIA DE GENOTIPOS KIR EN
LA POBLACIÓN DE DONANTES DE SANGRE DE CANTABRIA. Sánchez-Velasco P1, Lavín-Alconero L1, Arroyp JL2, Ausín
F1, Amunárriz C2, Leyva-Cobián F1, Gonzalo Ocejo-Vinyals J1.
1Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. 2Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria.
Introducción. El estudio con sondas específicas de secuencia ha
demostrado ser de gran utilidad en el estudio de polimorfismos en el
MHC. Esta técnica se utiliza de forma rutinaria en el tipaje HLA, tanto en el trasplante como en estudios de asociación HLA-enfermedad.
65
POSTERS
El objetivo de este estudio es valorar su utilidad en el genotipado de
receptores de células NK, concretamente los genes KIR.
Materiales y Métodos. Se incluyeron en el estudio 144 donantes
de sangre. Se utilizó una técnica de PCR-SSO que detecta 14 genes KIR
y 2 pseudogenes. Las muestras hibridadas fueron analizadas mediante fluorimetría (Luminex® 100). La frecuencia de los individuos que
tenían al menos una copia de cada gen KIR se determinó por recuento directo. Para analizar diferencias en la frecuencia de los diferentes
genes KIR respecto de otras poblaciones cercanas, se usó la prueba de
Chi 2 con corrección de Yates.
Resultados. Todos los individuos analizados, eran positivos para
los tres genes estructurales KIR2DL4, KIR3DL2 y KIR3DL3. Se observó una variación, estadístic amente significativa respecto de la mayoría de las poblaciones estudiadas hasta la fecha, en la frecuencia de
KIR2DL3. Una frecuencia tan baja, sólo ha sido descrita en poblaciones étnicamente muy alejadas de la población cántabra (vietnamitas,
aborígenes australianos y etnias sudafricanas de xhosa y san).
Conclusión. La técnica de PCR-SSO es una técnica fácilmente automatizable que posibilita el análisis de un gran número de muestras en
menos tiempo que los tradicionales métodos de PCR-SSP. No obstante, la resolución de esta metodología es actualmente inferior. Estudios previos han demostrado una concordancia de casi un 100% entre
ambas técnicas. Sin embargo, debido a la baja frecuencia de KIR2DL3
en nuestra población en comparación con la de poblaciones vecinas,
convendría realizar más estudios con el objetivo de comprobar realmente si la tecnología Luminex® permite detectar todos los alelos de
KIR2DL3.
35. POLIMORFISMO DE CITOCINAS, RECEPTORES DE CITOCINAS Y ANTAGONISTAS DE RECEPTORES DE CITOCINAS
EN PACIENTES CON OBESIDAD MÓRBIDA. Ausin Ortega F,
Sánchez Castañon M, Leyva-Cobian F, Ocejo-Vinyals JG. Servicio
de Inmunología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.
Introducción. El término obesidad mórbida (OM) hace referencia
a pacientes que están desde un 50 a 100% ó 45 kg por encima de su
peso corporal ideal. Por otro lado, un valor mayor a 39 en el índice
de masa corporal se puede utilizar para diagnostic ar este tipo de obesidad. Hasta la fecha apenas hay estudios de asociación de esta patología con polimorfismos en los genes de citocinas. El objetivo de este
estudio se ha centrado en comprobar si existe alguna asociación significativa entre OM y polimorfismos en los genes de algunas citocinas y
sus receptores.
Materiales y Métodos. Se incluyeron en el estudio 191 pacientes
diagnosticados de OM. Como grupo control, se analizaron 94 individuos sanos, no obesos, donantes de sangre. Para el estudio de los polimorfismos se utilizó un ensayo comercial basado en la técnica de PCRSSP, el cual detecta 22 posiciones polimórficas en 13 citocinas (IFNg,
IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-1R, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-4R alfa, IL-6, IL-10, IL12, TGF-beta, TNF-alfa): PROTRANS Cytokines 2. El análisis de la frecuencia de los diferentes polimorfismos en pacientes con OM y controles sanos se realizó mediante recuento directo. Para el análisis estadístico de la diferencia entre ambos grupos se recurrió al test exacto de
Fisher.
Resultados. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los polimorfismos de los genes de las siguientes citocinas:
IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TGF-beta y TNF-alfa.
No hubo diferencias significativas en los polimorfismos de: IFN-gam-
66
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
ma, IL-1R, IL-4R alfa, IL-12. Al estar en un fuerte desequilibrio de ligamiento, los haplotipos generados por estos polimorfismos también
mostraban unas diferencias significativas entre pacientes con OM e
individuos sanos
Conclusión. Existen muy pocos datos sobre polimorfismos de citocinas en la OM. El presente estudio muestra que existen diferencias
estadísticamente significativas en las frecuencias de polimorfismos de
ciertas citocinas. Algunos de ellos no tienen efecto sobre la expresión
de estas; otros aumentan su expresión y finalmente, otros la disminuyen. Estos hallazgos, junto con variaciones genéticas estructurales
o polimórficas en otros genes, podrían contribuir a una susceptibilidad a padecer OM. Se necesitan estudios más amplios, con una selección más estricta de los pacientes y quizá con diseños diferentes (v.g.
cohortes) para tratar de esclarecer el papel que todos estos genes juegan en la predisposición y desarrollo de la OM.
SESIÓN 3: INMUNOLOGÍA Y TRASPLANTE
Moderadores: Dr. Joan Milá (Palma de Mallorca)
Dr. Alfredo Minguela (Murcia)
36. DISTRIBUCIÓN ALELICA DRB1* EN EL BANCO DE CORDON DE ANDALUCIA. de Paula Sanchez Gordo F, Carrasco
Hidalgo A, Jaen J, Marie Christensen E, Rodriguez Pena R, Prat
Arrojo I. Centro de Transfusión y Banco de Tejidos.
Introducción. La sangre de placenta (SCU) ha demostrado ser una
fuente de progenitores hematopoyéticos adecuada para su uso en el
rescate post-acondicionamiento TMO. Dada la complejidad del tipaje
HLA y la necesidad de compatibilidad DRB1 a nivel alélico, hemos realizado un análisis de frecuenci a del locus HLA-DR.Material y métodos. El método utilizado en nuestro laboratorio es SSOP LuminexÒ,
complementándolo con SSP con el fin de poder informar el tipaje de
DRB1 a nivel alélico, o bien con nomenclatura NMDP de tal forma que
sólo estuviera presente un alelo de alta frecuencia. Hemos analizado la
frecuencia DR (baja resolución)de 7.159 muestras (donantes y SCU) y
de ellas, analizamos el tipaje a nivel alélico de 1000 ADNs procedentes
de SCU consecutivas correspondientes a unidades criopreservadas en
los meses de abril a junio de 2007. En caso de no disponer del tipaje a
nivel alélico, hicimos una traducción de la nomenclatura NMDP al alelo mas frecuente (>99% probabilidades) considerando que dado el número de muestras no interferiría la posible existencia de un alelo raro.
Resultados y conclusiones. La frecuencia fenotípica del análisis
de las 7.159 muestras fue por orden de frecuencia DR7 (30%), DR4
(26%), DR13 (26%), DR3 (25%), y DR11 (25%). A nivel alélico los más
frecuentes son DRB1*0701 Y DRB1*0301 . La distribución para DR4,
DR11 y DR13 son: DR4 (224 casos), frecuencia: *0404 (26,78%), *0405
(20,10%), *0403 (14,73%), *0402 (13,85%), *0401 (12,95%), *0407 (4,91%),
*0408 (4,01%), *0406 (2,23%), *0411 (0,44%). DR11: (216 casos), frecuencia: *1101 (39,82%), *1104 (39;35%), *1102 (12,96%), *1103 (6,49%), y
*1106, *1114 y *1136 con un 0,46% cada uno. DR13: (266 casos), frecuencia: *1301 (50%), *1302 (33,46%), *1303 (13,91%), *1305 (1,50%), *1304
(0,75%) y *1325 (0,38%). El tipaje de DR4 es el mas heterogéneo. Debido al importante porcentaje de nacimientos de inmigrantes y su multiplicidad étnica, el interés principal del presente estudio se basa en la
probabilidad de encontrar una unidad de cordón DRB1 compatible
dentro de nuestro banco de cordón.
INMUNOLOGÍA
37. RELACIÓN DEL FENOTIPO ANTIGÉNICO ENTRE LAS
CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES HUMANAS Y LAS
CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES. De la Mata Espinosa
CT, Ortiz-Ferrón G, Tirado I, Muñoz-Fernandez R, Blanco O, Leno
E, Abadía-Molina AC, Olivares EG. Instituto de Biopatología y Medicina Regenerativa, Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad
de Granada.
Introducción. La decidua es el tejido materno que se encuentra en
contacto directo con el trofoblasto fetal. Durante el embarazo, los mecanismos inmunológicos que llevan a un embarazo exitoso o al aborto,
se encuentran en la decidua. Las células deciduales estromales (DSC)
constituyen una proporción de alrededor del 50% del total de las células de la decidua y se ha demostrado que tienen actividades inmunológicas como producción de citoquinas (IL-6, IL-8, MCP-1α, RANTES)
fagocitosis y activación de células T. Nuestro grupo ha aislado DSC de
embarazo normal humano y las mantuvo en cultivo. Estas células expresaron CD10, CD13, CD29, CD34, CD73, CD90, ICAM-1,VCAM-1, STRO1, α-SM actin, y ALP, y falta de CD3, CD15, y CD45. Las DSC presentan morfología semejante a las MSC (células madre mesenquimales)
de médula ósea, por lo que pensamos que están estrechamente relacionadas entre sí.
Objetivo. El objetivo general de este trabajo es estudiar las relaciones inmunofenotípicas entre las MSC de médula ósea y las DSC y
la posible diferenciación de las DSC a linajes mesenquimales.
Métodos. Las MSC de médula ósea se aislaron aplicando la misma metodología utilizada por nuestro grupo para la obtención de DSC.
Se estudió el fenotipo antigénico de las dos poblaciones por medio de
citometría de flujo y la diferenciación de las DSC por medios específicos de linaje mesenquimal.
Resultados. Los análisis revelaron que la expresión de los antígenos superficiales de las MSC cultivadas, tales como CD29, CD10, αsm-actina, y STRO-1 eran fuertemente positivos; CD34, CD21, CD73,
y 106 estaban positivos en baja intensidad y CD45 fue negativo. Una
población en células frescas de médula ósea también demostró tener
los mismos antígenos de superficie de la célula. Las DSC se diferenciaron a osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
Conclusiones. Nuestros resultados confirman que las DSC esta
estrechamente relacionadas con las MSC.
38. ANTICUERPOS ANTI-HLA PREFORMADOS FAVORECEN
EL RECHAZO Y DISMINUYEN LA SUPERVIVENCIA DEL
INJERTO HEPÁTICO. RESULTADOS DE UNA SERIE DE 896
TRASPLANTES. Castillo-Rama M1, Castro MJ1, Bernardo I1,
Calleja-Antolín S1, Morales P1, Romo E1, Meneu-Diaz JC2, PérezSaborido B2, Moreno Elola-Olaso A2, Paz-Artal E1. 1Inmunología.
Hospital Doce de Octubre. 2Cirugía Digestiva y Trasplante de Órganos
Abdominales. Hospital Doce de Octubre. Madrid.
896 trasplantes hepáticos realizados en nuestro centro entre 1986
y 2006 se analizaron retrospec tivamente con el objetivo de investigar
el impacto de los anticuerpos anti-HLA en el rechazo y la supervivencia del injerto hepático. La prueba cruzada se realizó por citotoxicidad
dependiente del complemento (CDC). Los anticuerpos anti-HLA clase I y II se detectaron por citometría multiparamétrica con microesfer
as (Luminex® xMAP).
La supervivencia actuarial se calculó con las tablas de vida y la
acumulada con el método Kaplan-Meier. El test log rank se aplicó para
POSTERS
determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre
los grupos. Para estudiar la correlaci ón entre técnicas (CDC y Luminex) y entre anticuerpos prefor mados y rechazo se utilizaron tablas
2x2 y el test del Chi-cuadrado.
Resultados. Existe una fuerte correlación entre las dos técnicas y
su capacidad para detectar anticuerpos preformados (p<0.0001).
La presencia de anticuer pos preformados detectados por CDC y
Luminex® xMAP esta asociada con una disminución en la supervivencia del injerto hepático dentro del primer año post-trasplante (p=0.01
y p= 0.016 respectivamente)
Una prueba cruzada positiva con linfocitos T tiene un impacto
negativo en la supervivencia del injerto a 1 y 5 años (p =0.043 y p= 0.
0019 respectivamente). Asimismo, los anticuerpos clase II detectados
por Luminex tienen un impacto negativo en la supervivencia del injerto a 1 y 5 años (p=0.005 y p= 0.038 respectivamente). Se observó una
asociación entre los anticuerpos preformados clase II detectados por
Luminex o anticuerpos clase I y II detectados por Luminex y el rechazo del injerto hepático ( p=0.001 y p=0.042 respectivamente).
Conclusiones. El screening de anticuerpos HLA con técnicas de
Luminex y CDC puede ser útil en la detección de pacientes de alto riesgo que podrían beneficiarse de una vigilancia post-trasplante más estrecha y una terapia inmunosupresora más agresiva.
Financiación Fundación MMA 2004-008. In press Liver Transplantation 2008.
39. SCREENING DE ANTICUERPOS ANTI-HLA. COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS: LUMINEX® VERSUS ELISA.
Calleja Antolín S1, Castro Panete MJ1, Nevado Cestero J1, Bernardo González I1, Castillo Rama M1, Serrano Hernández A1, Ramírez Bustillo E2, Morales Cerdán JM2, Mérida E2, Paz Artal E1. 1Servicio de I nmunología. Hospital Universitario 12 de Octubre. 2Servicio
de Nefrología. Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid.
Introducción y objetivos. Comparar la sensibilidad y la especificidad entre dos técnicas de detección de anticuerpos anti-HLA en suero: ELISA y citometría de flujo Luminex®.
Material y métodos. Se realizó screening de anticuerpos anti-HLA
por ELISA (LAT® Mixed, One Lambda Inc., CA, EE. UU.) y Luminex®
(LABScreen® Mixed, One Lambda Inc., CA, EE. UU.) a 290 sueros seleccionados aleatoriamente de entre 2.074 sueros de los receptores de la
lista de espera de trasplante renal.
El análisis estadístico de los resultados obtenidos se realizó mediante tablas de contingencia 2 x 2 y curvas ROC, con el programa de análisis estadístico SPSS.11.0.
Resultados. La tecnología Luminex® presenta una mayor sensibilidad como prueba de screening para la detección de anticuer pos antiHLA en suero. Luminex® presenta una sensibilidad del 92%, frente al
81% de la de ELISA.
Por otra parte, se observa una menor especifici dad en la detección de estos anticuerpos por Luminex® respecto a ELISA (89% frente
a 96%). Las c urvas ROC demuestran una relación más óptima de sensibilidad/especificidad en la tecnología Luminex® que en ELISA (variables resultado de contraste: área Luminex® 0,910; área ELISA 0,887).
Conclusiones. Luminex® LABScreen® Mixed presenta una sensibilidad mayor para detectar anticuerpos anti-HLA y, aunque su especificidad es menor que la de ELISA, su mejor relación entre sensibilidad y especificidad la convierte en una prueba de screening más potente que ELISA.
67
POSTERS
40. ACUTE HUMORAL REJECTION MEDIATED BY ANTIBODY,
UNDETECTED BY CDC. Osório E1, Mendes C1, Sinde Monteiro
M1, Teixeira J1, Castro Henriques A2, Alves H1. 1Centro de Histocompatibilidade do Norte, Porto, Portugal. 2Hospital Geral de Sto.AntónioServiço de Nefrologia, Porto, Portugal.
Introduction. Knowing that pregnancy is a risk factor in the formation of anti-HLA antibodies (Ab), we should detect them before the
renal transplant.
Objective. Identify the causes that led to acute humoral rejection.
Methods. Crossmatch (XM) was performed by Cytotoxicity (CDC)
and Flow Cytometry (FC) FACSCalibur (Becton Dickinson), with antiIgG/FITC Dako and anti-CD2/PE BD.
HLA Ab screening was done by CDC, LAT-M (ELISA), Luminex
LABScreen Mix and LABScreen PRA (OneLambda).
The patient was a 51 years-old female with no past transfusions
or infections, three pregnancies, with a cadaver kidney transplant after
48 months of haemodialysis.
Donor HLA-A1,2;B8,51;DR3,8
patient HLA-A1,11;B8,35;DR3,8
Mismatch-A2,B51.
HLA Ab screening by CDC was done every 3 months since 2002
and was negative at all times, whereas HLA Ab by ELISA or Luminex
was positive for class I and II.
The transplant CDCXM was negative for T and B cells, whereas
FCXM was positive for T cells.
Induction therapy with CyA, MMF, Pred, ATG. The patient had
immediate graft function. Serum creatinine dropped to 2,7mg/dL. On
the 8th day the patient was anury. The biopsy showed acute rejection
Banff II b with diffuse positive C4d. The FCXM was positive on the 8th
day.
The patient went through 10 Plasmapheresis with IVIg. She
currently (45 days after transplant) keeps class II Ab positive, being
negative for class I (Luminex), 1,8mg/dL of creatinine with proteinuria, treated with MMF, Pred and Tacrolimus.
Taking as hypothesis that the patient's sensitivity was due to her
past pregnancies (last 27 years ago), we typed her husband: HLAA2; B44; DR1,15.
The CDC XM with her husband's cells tested negative for T and B
(XM's with serum before TX) and FCXM positive for T and B cells.
We detected anti-A2 in patient serum by Lum LS1PRA (the husband was HLA-A2).
Conclusion. In the case of women, sensitized because of their pregnanc ies, XM by CDC might not be enough (low title antibody) and
FCXM should be performed afterwards.
41. POSTTRANSPLANTECTOMY HLA DONOR SPECIFIC ANTIBODIES: CASE REPORT. Mendes C1, Osório E1, Sinde Monteiro M1, Teixeira J1, Castro Henriques A2, Alves H1. 1Centro de Histocompatibilidade do Norte, Porto, Portugal. 2Hospital Geral de Sto.António, Serviço de Nefrologia, Porto, Portugal.
Introduction. HLA Donor specific antibodies(DSA) may appear
in patients submitted to a kidney transplant(KTx).This often ends in
humoral rejection(RJ) and organ loss. Several studies indicate that occasionally DSA only appear after transplantectomy
Case report. Patient with rejection and DSA, not detected in peripheral blood until transplantectomy
68
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
15/8/98 Male patient, 44 years, end-stage renal disease (familial
nephropathy), pre-TX HLA antibodies (Ab) by Luminex (Lum) and
CDC neg
5/7/2003 Kidney Tx (cadaver male donor, 53 years). Crossmatch
(XM) by CDC and Flow Cytometry (FC) neg. Patient treated with Daclizumab+TAC+MMF+Pred
PosTX monitoring on the 1st, 3rd and 6th months: Ab by Luminex
and CDC-neg; XM with donor frozen cells-neg.
13/12/04 biopsy-29 glomeruli, with vascular lesion, malignant
nephrosclerosis, with acute RJ cri teria or polioma virus infection.
15/10/05 Rejection – The patient returns to dialysis with
TAC+Pred.
10/2/06 and 30/3/2006 Ab by Lum and CDC neg; XM with donor
frozen cells-neg.
6/6/06 Transplantectomy, Patient refers abdominal pain, haematuria and severe hypertension, maintains Pred.
6/7/06 Ab by Lum class I–positive
PRA (CDC) 78%
XM with donor frozen cells–positive (T cells)
Donor HLA-A1,2;B8,40;DR13,15
Recipient HLA – A2;B44,57;DR13,15
Mismatches A1, B8, B40
Ab identification anti-A1 and anti-B40
Methods. PRA was performed by CDC/45 cells panel. Anti-HLA
class I and II Ab screening and the specificities were performed by Lum
(Labscreen mixed and PRA, One Lambda) and CDC. The XM was performed by CDC and FC (FACSCalibur).
Conclusion. The existence of pos-TX DSA may be hidden by the
"sponge effect" of the transplanted organ. The circulating Ab are induced by the removal of the organ itself and/or by the immunosuppression stop. This may be relevant in the case of a retransplant patient.
42. CÉLULAS MESENQUIMALES PARA REGENERACION DE
CARTILAGO: ARTRITIS REUMATOIDE Y OSTEOCONDRITIS DISECANTE. Martinez Lorenzo MJ1,5, Desportes Bielsa P2,5,
Alegre Aguarón E2,5, Royo Cañas M5, Castiella T3, García Alvarez
F4,5, Larrad Mur L2,5. 1Banco de Sangre y Tejidos de Aragón. 2Servicio
de Inmunología. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. 3Servicio de Anatomía Patológica-HCU. 4Servicio de Traumatología-HCU.
5Instituto Aragonés Ciencias de la Salud.
Introducción. Las células mesenquimales (MSC) constituyen un
modelo muy útil en aplicaciones clínicas para un gran número de enfermedades, tanto en terapia regenerativa como en terapia génica (Deans
et al, 2000). Además de la médula ósea y el cordón umbilical, otra fuente alternativa de MSC es el tejido adiposo. El potencial diferenciador
de estas células ha sido confirmada por diversos grupos (Zuk et al
2001). En este trabajo se aislaron y caracterizaron las MSC obtenidas
de grasa de tres especies diferentes y se analizó su capacidad de diferenciación y regeneración de cartílago.
Materiales y Métodos. Se obtuvieron muestras de tejido adiposo de 5 ovejas, 5 conejos y 5 humanos. Las células procedentes
del tejido adiposo se obtuvieron mediante digestión mecánica y
enzimática y fueron separadas por centrifugación. En el caso de
células procedentes del líquido sinovial, éstas se obtuvieron por
centrifugación.
El cultivo de las células se realizó en un medio de expansión y se
mantuvo a 37ºC en atmósfera húmeda con 5% de CO2. Para el estu-
INMUNOLOGÍA
dio fenotípico las células se incubaron con anticuerpos monoclonales específicos. La diferenciación celular hacia condrocitos se realizó
en un medio de diferenciación y las muestras se analizaron tras realizar cortes del tejido embebido en parafina y tinción con eosinahematoxilina.
Resultados. Las células obtenidas se adherían fácilmente al plástico y tenían una morfología fibroblástica Para comprobar que no había
contaminación con adipositos se analizó el marcador CD36, el cula fue
negativo en más del 95% de la población analizada. Más del 90% de
las células mesenquimales obtenidas fueron negativas para CD31 y
CD45, marcadores de la línea hematopoyética y endotelial, respectivamente. Menos de un 5% de las células expresaron CD34.
El porcentaje de células que expresaban CD54 osciló entre un 30 y
un 80%. La expresión de CD49d osciló entre un 10 y un 80%, siendo
menor la expresión en las células obtenidas de la grasa de conejo. La
expresión de CD105 fue baja (10-25%) para c onejo y oveja. Sin embargo, dicha expresión supero el 90% en células obtenidas de grasa humana . Fueron positivas para CD13, CD44, CD59 y CD166.
Los resultados obtenidos en los estudios histopatológicos indicaron que tanto las células mesenquimales obtenidas de tejido adiposo
de oveja como de conejo tenían capacidad para diferenciar hacia condrocitos, mientras que el análisis realizado en células mesenquimales
obtenidas de grasa humana indicaron una peor diferenciación hacia
dicho linaje. Sin embargo, actualmente se están realizando estudios
con otros medios de diferenciación , que parecen dar mejores resultados anatomo-patológicos en cuanto al grado de diferenciación celular
hacia condrocitos.
43. ES LA HEPATITIS “AUTOINMUNE” DE NOVO UNA FORMA
DE RECHAZO HUMORAL EN EL TRASPLANTE HEPÁTICO?
Aguilera I, Sousa JM, Wichmann I, Gavilán F, Bernardos A, NúñezRoldán A. HH UU Vírgen del Rocio.
La hepatitis “autoinmune” de novo (HAIdn) es una complicación
del Tx hepático que ha generado una cierta controversia desde que
se describió en 1998. Si bien es cierto que las alteraciones morfológicas
en biopsia hepática son similares a las de la HAI clásica, se trata de una
respuesta inmune frente al aloinjerto. Si a esto le sumamos la presencia de ab anti-GSTT1 debido a incompatibilidad genética en el gen
de la glutation S-transferasa T1 (GSTT1) entre donante+ y receptor
nulo, la hipótesis más directa es la del rechazo humoral.
Objetivo. Comprobar la presencia de depósitos C4d (considerado marcador de rechazo humoral) en biopsias hepáticas de siete pacientes diagnosticados de HAIdn que presentaban anticuerpos anti-GSTT1
específicos de donante.
Material y Métodos. Biopsias obtenidas entre los 12-85 meses
post-Tx con diagnóstico de HAIdn fueron utilizadas para detectar
depósitos C4d con el ab policlonal anti-C4d (Biomédica, Viena). El
grado de tinción C4d se valoró de forma semicuantitativa: 0, ninguna; 1+, débil; 2+, moderada; 3+, fuerte (Troxell, 2006). Los ab antiGSTT1 fueron estudiados por WB y ELISA con la proteína recombinante humana.
Resultados. Seis pacientes presentaron depósitos C4d+ en el estroma de la zona portal y uno fue C4d- con muestra de suero negativa
para los ab anti-GSTT1 tras un año en tratamiento. En los pacientes 2
y 5 que también estaban en tratamiento con esteroides antes de la biopsia, también se observó disminución de los C4d+ aunque el titulo de
ab cercano a la biopsia no pudo ser comprobado.
POSTERS
Paciente
(m post-Tx)
1
2
3
4
5
6
7
Biopsia
Nº muestras Ab anti-GSTT1 Tinción Diagnóstico
previas con fecha biopsia
(score)
C4d
histológico
ab anti-GSTT1
21
85
12
58
24
21
32
3
5
0
1
2
1
0
Neg
nd
>320
>320
nd
1/160
1/320
0
1+
3+
3+
1+
3+
4+
HAIdn
HAIdn
HAIdn
HAIdn
HAIdn
HAIdn
HAIdn
Conclusión. La presencia de depósitos C4d en pacientes con ab
anti-GSTT1 refuerza la hipótesis de que la HAIdn es una forma particular de rechazo mediado por anticuerpos en pacientes con la incompatibilidad genética GSTT1.
44. IMPORTANCIA RELATIVA DE LA COMPATIBILIDAD HLA
A NIVEL ALELICO EN EL TRASPLANTE DE SANGRE DE
CORDON UMBILICAL EN ADULTOS. Planelles D1, Cantero
S2, Solves P3, Moscardó F2, Rodríguez M1, Granell R1, Gómez I1,
Alba E1, Jarque D1, Vila E1, Laguarda E1, Puig N1, Montoro J1, Sanz
G2. 1Unidad de Histocompatibilidad, Centro de Transfusión de la Comunidad Valenciana. 2Unidad de Trasplante de Médula, Hospital La Fe,
Valencia. 3Banco de Cordon Umbilical, Centro de Transfusión de la Comunidad Valenciana.
El éxito del trasplante de progenitores hematopoyéticos parece
depender en gran medida de la compatibilidad HLA a nivel alélico en
los loci A, B, C y DRB1. En los últimos años, el trasplante de sangre de
cordón umbilical (TSCU) ha cobrado importancia debido a las ventajas que ofrece sobre el trasplante de médula o sangre periféric a; entre
éstas, la más baja incidencia de enfermedad injerto contra huésped
(ICH), lo que permite realizar el trasplante con menor restricción de
compatibilidad HLA. Sin embargo, se desconoce el impacto diferencial de las disparidades HLA entre donante y receptor (clase I vs II ó
“single locus vs multiloci”) en la evolución de este tipo de trasplante,
principalmente en adultos. El objetivo de este trabajo ha sido evaluar
el impacto del número y clase de disparidades HLA, en uno o más loci,
en la evolución de pacientes adultos sometidos a TSCU. La METODOLOGIA seguida para el tipaje HLA fue por alta resolución (PCR-SSP,
–SSO) para los loci A, B, C, DRB1, DQB1 y DPB1. Para el análisis del
impacto de disparidades “multiloci” se evaluaron las combinaciones
de loci: A+B+DRB1, A+B+C+DRB1, A+B+C+DRB1+DQB1 y
A+B+C+DRB1+DQB1+DPB1. Todos los análisis se realizaron considerando las disparidades a nivel alélico y genérico y tanto en dirección
ICH como HCI (huésped contra injerto). RESULTADOS: El grado de
compatibilidad HLA considerando HLA-A y –B a nivel genérico y
–DRB1 a nivel alélico, fue 6/6 en el 5% de los casos, 5/6 en el 35% y
4/6 en el 60%. El análisis multivariante indicó que sólo la presencia de
disparidad a nivel genérico en el locus HLA-A en dirección HCI se relacionó con el prendimiento mieloide. En conclusión, los resultados obtenidos indican que el grado de compatibilidad HLA en el TSCU en adultos no parece ser tan decisivo como en niños. Por tanto, el tipaje HLA
de alta resolución para los loci A, B, C, DRB1, DQB1 y DPB1 no parece esencial en las búsquedas de unidades de cordón para pacientes
adultos con enfermedades hematológicas malignas.
69
POSTERS
45. SOPORTE INMUNOLÓGICO EN EL DIAGNÓSTICO DE
RECHAZO AGUDO EN TRASPLANTE CARDIACO. Blanco
García RM1, López Álvarez MR2, Pascual Figal DA3, Garrido Bravo I3, Botella C1, Salgado Cecilia MG1, Muro M2, García Alonso
AM2, Álvarez López MR2, Minguela A2. 1Servicio de Inmunología.
2Servicio de Inmunología CIBERehd. 3Servicio de Cardiología. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
Introducción. El diagnóstico de rechazo agudo (RA) en transplante cardiaco se basa en la sospecha clínica y/o en la presencia de infiltrados inflamatorios en la biopsia endomiocárdica. Sin embargo, ambas
formas de diagnóstico presentan limitaciones y conllevan un aumento de la inmunosupresión no exento de complicaciones. En los últimos
años, nuestro grupo ha utilizado con éxito marcadores inmunológicos,
como la expresión de CD28 ó HLA en células de sangre periférica (SP)
para la monitorización del rechazo en el seguimiento de trasplantes
cardiacos.
Objetivos y métodos. Se pretende establecer si dichos marcadores son útiles en pacientes que no puedan esperar al diagnóstico histológico. Se estudian 51 trasplantes cardiacos, c lasificados en: sinRA (NRA), con RA-Biópsico/Clínico (RA-BC, n=15), con RA-Biópsico-solo (RA-BS, n=8), con RA-Clínico-solo (RA-CS, n=4). En estos
pacientes se estudió por citometría de flujo la expresión de CD28 en
linfocitos CD4+ y CD8+ y de HLA clase-I en linfocitos totales, en el
pre-trasplante y 1, 2, 3, 4, 6 y 12 meses post-trasplante.
Resultados. La expresión de CD28 en linfocitos CD4+ y CD8+ y
de HLA en linfocitos totales, fue superior (p<0.05) en pacientes con
RA-BC y RA-BS que en NRA. Sin embargo, en los pacientes con RACS la expresión de dichas moléculas fue similar a la de los del grupo
NRA. Al estudiar estos parámetros en los días en los que se realizaron
los diagnósticos de RA, se comprobó que la expresión de CD28 y HLA
era superior, y se incrementaron más, respecto al pre-trasplante, en
pacientes con RA (RA-BC y BS) que en los que sólo se basaron en criterios clínic os (RA-CS).
Conclusión. El estudio de la expresión de CD28 sobre linfocitos
CD4+ y CD8+, y de HLA en linfocitos totales, podría ser de ayuda para
la correcta aplicación del tratamiento antirrechazo, en pacientes en los
que bajo sospecha clínica, no se disponga de los datos histológicos.
46. SOPORTE INMUNOLÓGICO EN EL DIAGNÓSTICO DE
CÉLULAS REGULADORAS NATURALES CD4+CD25highCTLA-4cit+ EN TRASPLANTE HEPÁTICO. Salgado Cecilia MG1,
López Alvárez MR2, Blanco García RM1, Legaz Pérez I2, Botella
C1, Lucas Aroca D1, Martinez Sánchez MV1, Miras M3, Álvárez
López MR. 1Servicio de Inmunología. 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). 3Servicio de Medicina Digestiva. Centro de Investigación Biomédica en Red
de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). Hospital U. Virgen de la Arrixaca.
Introducción. Las células reguladoras naturales CD4+CD25high
(nTr) son decisivas en el mantenimiento de la homeostasis en las diferentes respuestas del sistema inmune, incluida la respuesta alogénica.
Aunque no está claro el papel que juegan en trasplante hepático (TH).
Objetivo y Metodología. Evaluar el papel que juegan las nTr en
la aceptación de injertos hepáticos. Se estudiaron las nTr en sangre periférica de 130 receptores de TH, en 780 muestras correspondientes a los
días 0 (pretrasplante), 7, 15, un mes, tres meses y un año post-trasplan-
70
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
te. Las cifr as absolutas (células/μl) de linfocitos CD4+, CD4+CD25high,
CD4+CD25-/lowCTLA-4cit+ (no-nTr) y CD4+CD25highCTLA-4cit+
y la expresión de CD62L y CD28 en dichas subpoblaciones, se han estimado mediante citometría de flujo. Los pacientes se clasificaron en dos
grupos: rechazo agudo (RA, n=23) y no rechazo agudo (NRA, n=107).
Resultados. Ambos grupos partieron de cifras pretrasplante similares de linfocitos CD4+ y CD4+CD25high. Sin embargo, las células
no-nTr y CD4+CD25highCTLA-4cit+ presentaron cifras pretrasplante
superiores en el grupo RA. En el post-trasplante, ambos subtipos de
células CTLA-4cit+ (nTr y no-nTr) decrecieron en el grupo RA. Por el
contrario, en el grupo NRA, que partían de cifras basales menores, las
células nTr se incrementaron en el post-trasplante, con cifras máximas
al año de evolución. En estos pacientes, las células CD4+ no-nTr CTLA4cit+ mantuvieron sus valores constantes. La expresión de CD62L en
los diferentes subtipos de células no mostró diferencias entre los pacientes, a excepción de los primeros 15 días post-trasplante, donde células
T CD4+ de fenotipo activado (probablemente alorreactivas) CD25/lowCTLA-4cit+CD62L- se incrementaron en RA.
Conclusiones. Los pacientes con mejor aceptaci ón temprana del
injerto hepático presentaron cifras de c élulas nTr CD4+CD25highCTLA-4cit+ más elevadas al año de evolución, por lo que estas células
podrían estar favoreciendo su aceptación a largo plazo.
47. ESTUDIO DE LA DINÁMICA DE RECONSTITUCIÓN DE LINFOCITOS T CD4+CD25+ EN TRASPLANTADOS CARDÍACOS
TRATADOS CON 2 DOSIS DE DACLIZUMAB. Lanio Amador
N, Sarmiento Marchese E, Gallego López A, Navarro J, Fernández-Yañez J, Palomo J, Fernández-Cruz E, Carbone Campoverde
J. Departamentos Inmunología y Cardiología. HGU Gregorio Marañón.
Madrid.
Introducción. El daclizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado, que bloquea específica y antagónicamente la subunidad alfa
(CD25) del receptor de alta afinidad de la IL2. Su utilización como tratamiento inductor en el trasplante cardíaco se basa en su capacidad
transitoria de inhibir la expansión clonal de los linfocitos T activados.
Objetivos: Evaluar el efecto del daclizumab sobre la subpoblación
CD4/CD25+ en pacientes sometidos a trasplante cardíaco (TC). Determinar las posibles difer encias en la dinámica de reconstitución inmunológica y su relevancia clínica.
Métodos: Estudio prospectivo 27 pacientes TC (edad=56±11;
21H/6M). Inducción: 2-dosis daclizumab, 1 mg/kg IV (día 0 y 14);
mantenimiento: tacrolimus (n=26) o ciclosporina (n=1), mofetil micofenolato y prednisona. Determinaciones seriadas de subpoblaciones T
CD4/CD25+, CD4/CD25high y CD4/CD38+DR+; Pre-TC, 7d, 30d,
90d y 180d. Citometría de flujo en sangre periférica (FACSCalibur).
Resultados. Dos dosis de daclizumab son suficientes para mantener los niveles de CD4/CD25+ prácticamente indetectables hasta
los 90d, mientras que los niveles de CD4/CD38+DR+ permanecen
estables. El patrón de reconstitución de CD25 es gradual y con diferencias entre pacientes. Al estratificar en base al % CD4/CD25+ a los
90d (G1<11%<G2<43%<G3) se observa una tendencia de asociación
entre G2 y ausencia de infección (Chi-cuadrado p=0,1). La comparación de medias indica que los pacientes con rechazo tenían menores porcentajes de CD4/CD25+ a los 30d (0,11% vs 0,60%, p=0,05),
mientras que no se observan diferencias entre infectados y no infectados.
INMUNOLOGÍA
Conclusiones. La expresión gradual de CD25 posterior al tratamiento con daclizumab, refleja un efecto inmunomodulador, además
de bloqueador, que no afecta la expresión de marcadores de activación
de los linfocitos T CD4. Así mismo, los distintos patrones de reconstitución sugieren diferenci as entre pacientes, lo que podría tener relevancia clínica en la detección anticipada de aquellos con mayor riesgo de sufrir eventos infecciosos o de rechazo.
48. AUSENCIA DE ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS
GÉNICOS DE LAS CITOQUINAS CON EL SÍNDROME DE LA
BRONQUIOLITIS OBLITERANTE Y EL RECHAZO AGUDO
EN TRANSPLANTE PULMONAR. Torío Ruiz A, Borro Mate JM,
Sánchez Mozo MP, de la Torre Bravos M, Rey García C, Alonso
Blanco C. Complejo Hospitalario Juan Canalejo.
Introducción. La principal causa de pérdida del injerto pulmonar
es el desarrollo del síndrome de la bronquiolitis obliterante (BOS),
un proceso al que se han asociado diversos factores de riesgo inmunológicos como la incompatibilidad HLA, los anticuerpos anti-HLA, y la
presencia de c iertos polimorfismos genéticos de citoquinas.
Objetivo. Determinar si existe alguna correlación entre los polimorfismos genéticos de una serie de citoquinas y la presencia de rechazo agudo y/o el desarrollo de BOS en los pacientes transplantados de pulmón.
Pacientes y métodos. El estudio comprende 93 transplantes pulmonares realizados en el CHU Juan Canalejo de 1999 a 2004, con al
menos un año de seguimiento. La presencia de episodios de rechazo
agudo fue detectada en un 43% de los pacientes (AR+), mientras que
un 39% de los pacientes habían desarrollado BOS en el momento del
estudio. El genotipaje de las citoquinas se realizó utilizando el kit comercial (One-Lambda Inc., CA), que permite detectar polimorfismos de
cinco citoquinas (IL-10, IFN-g, TGF-b1, TNF-a y IL-6). El análisis estadístico se realizó mediante test de chi-cuadrado y Fisher, estableciendo el nivel de significación en p<0.05.
Resultados. Al comparar los distintos grupos de estudio, encontramos una serie de diferencias en las frecuencias genotípicas, alélicas
y de los fenotipos secretores de la citoquinas. Así, el fenotipo alto secretor de la IL-10 está aumentado en los pacientes BOS+ respecto a los
pacientes BOS- (33% vs. 19%), mientras que el fenotipo alto secretor
del TNF- a se encontraba presente en el 34% de los pacientes AR+ y
únicamente en el 21% de los pacientes AR-. Sin embargo, ninguna de
estas diferencias alcanzaba significación estadística (p>0.05).
Conclusión. Nuestros resultados muestran que la presencia de los
diferentes polimorfismos genéticos de las citoquinas estudiadas no tiene un efecto directo en la presencia de episodios de rechazo agudo o
el desarrollo de BOS en nuestra población.
49. LA EVOLUCIÓN DEL NIVEL DE ANTICUERPOS ANTI-HLA
POR FLOW -PRA EN EL PRIMER AÑO POST-TRASPLANTE
CARDIACO Y SU SIGNIFICADO CLÍNICO. Domenech García
N, Crespo Leiro M, Moscoso Galán I, Pani Agua Martin MJ, Naya
Leira C, Grille Cancela Z, Estevez Cid F, Castro Beiras A. Complejo Hospitalario Juan Canalejo.
Introducción. La detección de anticuerpos (Ac) anti-HLA clase I
y clase II es variable en los pacientes con trasplante cardiaco (TC). El
significado de la intensidad de detección y momento de aparición de
dichos anticuerpos no es bien conocido.
POSTERS
Objetivo. Evaluar la presencia de Ac anti-HLA clase I y clase II
tras el TC y su patrón evolutivo. Material y métodos: Estudio longitudinal de 59 pacientes con TC (79,7% varones, edad media 49,7+/-11,1
años). Se evaluó el suero pre y post-TC a 1, 3, 6 y 12 meses para los Ac
anti-HLA clase I y clase II mediante Flow-PRA. Se cuantificó para cada
determinación la positividad en 1, 2, 3 y 4 según fuese < 10%, 10-25%,
25-75% y 75-100%. Los datos clínicos evaluados fueron rechazo cardiaco, f unción ventricular y supervivencia.
Resultados. Se detectaron Ac anti-HLA I en algún momento postTC en el 37,3% y HLA II en el 10,1%. El porcentaje de detección de
Ac anti-HLA I a 1, 3, 6 y 12 meses fue de 17,3%, 20,9%, 16,7% y 18,2%.
El grado de positividad (de 1 a 4) fue de 55,6%, 22,2%, 11,1% y 11,1 para
1 mes; 77,8% y 22,2% (grado 1 y 2) para 3 meses; 55,6%, 22,2% y 22,2%
(grado 1, 2 y 3) para 6 meses; 75%, 12,5% y 12,5% (grado 1, 2 y 3) para
12 meses. El porcentaje de detección de Ac anti-HLA II a 1, 3, 6 y 12
meses fue de 5,8%, 4,5%, 5,8% y 2,3%. El grado de positividad (de 1 a
3) fue de 33,3%, 33,3% y 33,3% para 1 mes; 100% (grado 3) para 3 meses;
33,3% y 66,7% (grado 2 y 3) para 6 meses; 100% (grado 3) para 12 meses.
No hubo correlación entre la detección/intensidad de Ac anti-HLA
clase I y c lase II y rechazo cardiaco. La supervivencia a 12 meses fue
del 100% y todos los pacientes tuvieron una función ventricular normal, con una media de FEVI del 66,9 ± 8,3%.
Conclusiones. Los Ac anti-HLA clase I y clase II están presentes
en un 37,3% y 10,1% de los pacientes en el primer año tras el TC. En la
mayoría de los casos, la detección es inferior a un 10% y el significado
clínico de la presencia es incierto. Se necesitan estudios con mayor
número de pacientes y seguimiento para valorar la utilidad de estas
determinaciones en el seguimiento a largo plazo post trasplante.
50. INFLUENCIA DE LA COMPATIBILIDAD HLA EN LA EVOLUCIÓN DEL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS. Marin Rubio LA, Alcoceba M, Balanzategui A, Sarasquete ME, Chillón MC, Santamaria C, Corral R,
García-Sanz R, San Miguel J, Gonzalez M. Servicio de Hematología,
Hospital Universitario de Salamanca.
Introducción. El transplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (TAPH) es un procedimiento terapéutico potencialmente
curativo para un amplio grupo de enfermedades hematológicas. El éxito del transplante está condicionado por el grado de compatibilidad
HLA entre receptor y donante. Sin embargo, aproximadamente 1/3 de
los pacientes tienen un familiar HLA compatible.
Objetivo. Investigar la influenci a del grado de identidad HLA y
la evolución de pacientes que han recibido un transplante alogénico
de progenitores hematopoyéticos. Pacientes: Se incluyeron en el estudio 270 pacientes adultos consecutivos diagnosticados de hematopatía maligna sometidos a un TAPH en un único centro. Las características de la serie fueron: mediana de edad: 47 (15-70); Varón/Mujer:
153/117; Disparidad de sexo: 48%. Diagnóstico: 68 Leucemia mieloblástica aguda, 38 Linfoma no Hodgkin, 31 Leucemia linfoblástica aguda, 31 Leucemia mieloide crónica, 31 Mieloma múltiple, 31 Síndrome
mielodisplásico, 19 Leucemia linfátic a crónic a (LLC), 11 Linfoma de
Hodgkin (LH), 6 Síndrome mieloproliferativo, 1 LLC+LH, 3 Otros;
Régimen de acondicionamiento: 158 RIC/112 convencional; SP/MO:
235/35. La mediana de seguimiento fue de 52 meses (2-162). Métodos:
Tras la extraccin del ADN genómico se realizó el tipaje HLA según el
estándar de la European Federation of Immunogenetics: tipaje de baja
resolución para HLA-A, -B y DRB1 mediante PCR-rSSO para aquellos
71
POSTERS
transplantes con donante familiar, y tipaje de alta resolución de HLAA, -B, -C y DRB1 para los donantes no emparentados. El análisis estadístico se realizó mediante lostest O2 y t de Student. Se aplicó el análisis del log-rank para comparar diferencias entre curvas de supervivencia mediante SPSS 15.0 Software. De acuerdo al status del HLA, los
transplantes se clasificaron en tres grupos: i) TAPH con donante emparentado HLA idéntico (6/6 identidades); ii) TAPH con donante no
emparentado HLA idéntico (8/8 identidades) y iii) TAPH con disparidad en HLA (6-7/8 identidades).
Resultados. Comparando los dos grupos de pacientes que recibieron transplante de un donante HLA idéntico, se observó que la supervivencia del grupo de trasplantes con donante emparentado era semejante a la de los del grupo de no emparentados (49% vs 45%, p>0.05).
Sin embargo, aquellos pacientes que recibieron un transplante con al
menos una disparidad HLA mostraron una peor supervivencia que
aquellos que recibieron un transplante con identidad HLA completa
(38% vs 49%, p=0.022).
Conclusión. El transplante de progenitores hematopoyéticos proveniente de un donante no emparentado HLA idéntico tiene una evolución
similar que en aquellos cuyo donante es emparentado HLA idéntico.
51. PREVALENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-LINFOCITOS T NO
ANTI HLA DE CLASE I EN SUEROS DE PACIENTES EN LISTA DE ESPERA DE TRASPLANTE REANAL. de las Fuentes BD,
Álvarez A, Caro Oleas JL, Núñez Roldán A, González Escribano
MF. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgen del Rocío.
Introducción. La prueba cruzada positiva frente a linfocitos T de
un donante es una contraindicación absoluta para el trasplante renal.
Esta prueba cruzada positiva constituye en la mayoría de los casos un
reflejo de la presencia de anticuerpos dirigidos frente a moléculas HLA
de clase I del donante en el suero del paciente. Sin embargo, en determinados casos los anticuerpos dirigidos frente a linfocitos T pueden
reconocer otras moléculas que sean irrelevantes para el trasplante en
la superficie de estas células.
Objetivo. Determinar el porcentaje de sueros con anticuerpos frente a linfocitos T no dirigidos frente a moléculas HLA de clase I en la
lista de espera de trasplante renal.
Material y métodos. Se incluyeron 318 sueros rec ibidos en el laboratorio de forma consecutiva en el último trimestre de 2007 obtenidos
de pacientes en lista de espera para trasplante renal. Estos sueros fueron estudiados en paralelo mediante citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) frente a un panel de linfocitos T obtenidos de 40 donantes diferentes y citometría con microesferas recubiertas de moléculas
HLA (Luminex).
Resultados. En el 97.5% de los casos (310 sueros) ambas técnicas
fueron concordantes, en el resto de los sueros (n=8) se encontraron discordancias. Entre las discordancias, en el 50% de los casos (4 de 8), el
Luminex resultó positivo y la CDC negativa y en el 50% restante encontramos un resultado negativo para Luminex y positivo para CDC. En
estos 4 sueros se investigó la presencia de anticuerpos anti-HLA de clase IgM, resultando todos negativos. Por tanto, la frecuencia de sueros que presenta anticuerpos fr ente a linfocitos T no dirigidos frente
a moléculas HLA de clase I es del 1.3% (4/318) en nuestra lista de espera.
Conclusión. El porcentaje de sueros que presentan anticuerpos no
dirigidos frente a moléculas HLA que pueden dar lugar a una prueba cruzada positiva frente a linfocitos T es bajo.
72
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
52. EMPLEO PROFILÁCTICO DE RITUXIMAB EN EL TRASPLANTE RENAL DE PACIENTES CON LES Y RIESGO INMUNOLOGICO. Bernal MJ1, García T2, Martínez de Saavedra M1, Mazuecos A2, Nieto A1, Brieva JA1, Rivero M2, Rodriguez C1. 1Servicio de
Inmunología. 2Servicio de Nefrología. Hospital Universitario Puerta del
Mar. Cádiz.
Objetivo. Rituximab se ha empleado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y en la profilaxis del rechazo humoral en trasplante (Tx). Se presenta la evolución de 3 pacientes con LES y alto riesgo inmunológico que recibieron un Tx renal y fueron pretratados con
Rituximab.
Pacientes. Tres mujeres de 36, 39 y 47 años. La nefropatía lúpica fue
la causa de la insuficienci a renal crónica. Las pacientes presentaron manifestaciones clínicas severas y brotes de actividad durante su estancia en
diálisis, tenían títulos altos de autoAc, historia de PRA positivos poliespecíficos y pruebas cruzadas donante-receptor positivas previas.
Métodos. Se realizaron pruebas cruzadas mediante citotoxicidad
celular con DTT, análisis de Ac HLA donante-específicos mediante tecnología luminex y monitorización del tratamiento con Rituximab (cuantificación de inmunoglobulinas (Ig) séricas, autoAc (ANA, DNAds,
ENA, fosfolípidos) y poblaciones linfocitarias B.
Resultados. Tras 23, 20 y 5 meses de seguimiento, la evolución de
la función renal ha sido muy buena en las 3 pacientes. No han sufrido
episodios de rec hazo agudo ni manifestaciones sistémicas de LES.
Rituximab fue bien tolerado. Rituximab indujo depleción total de linfocitos B en las 3 pacientes, que se mantuvo durante 18 y 9 meses en 2
pacientes. En la tercera paciente persiste la depleción de linfocitos B
tras 5 meses de seguimiento. El nivel de autoAc descendió en las 3
pacientes tras el tratamiento y, en las 2 pacientes que han inic iado la
reconstitución de los linfocitos B, los autoAc han iniciado un ligero
ascenso. La reconstitución se inic ió a expensas de linfocitos B naive
(CD27-) y, posteriormente, de linfocitos B memoria (CD27+). El nivel
de Ig séricas se ha mantenido dentro de la normalidad y no se han
detectado Ac. HLA donante-específicos.
Conclusiones. Rituximab puede ser de utilidad como tratamiento profiláctico en Tx renal de pacientes con LES activos y alto riesgo
inmunológico humoral de pérdida del injerto.
SESIÓN 4: INMUNOLOGÍA TUMORAL - I
Moderadores: Dr. Francisco Ruiz-Cabello (Granada),
Dr. Ignacio Melero (Navarra)
53. NUEVAS APROXIMACIONES EN INMUNOTERAPIA ANTITUMORAL: UNIÓN DE INTERFERON-GAMMA A NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS. Mejías Laguna R1, Costo R2, G. Roca
A2, Arias CF1, Veintemillas-Verdaguer S2, González Carreño T2, del
Puerto Morales M2, Serna CJ2, Mañes S1, Barber DF1. 1Centro Nacional de Biotecnología. 2Instituto de Ciencia de Materiales de Madrid.
La unión de citoquinas a nanopartículas magnéticas ha sido desarrollada como un método novedoso de liberación local de drogas antitumorales. Hemos estudiado la unión y liberación de Interferon-gamma (IFN-γ) murino en nanopartículas magnéticas sintetizadas
mediante tres métodos distintos (coprecipitación, descomposición en
medio orgánico y laser-pirólisis) y modificadas en su superficie c on
INMUNOLOGÍA
diferentes moléculas para alcanzar una carga superficial negativa a pH
7 y permitir la interacc ión con el IFN-γ, sin perder estabilidad.
Hemos incubado las dispersiones magnéticas con IFN-γ y hemos
estudiados cuáles son las condiciones óptimas de interacción entre esta
citoquina y las partículas, así como su capacidad de liberación a distinto pH y en función del tiempo. Las partículas sintetizadas mediante descomposición en medio orgánico y modificadas con ácido dimercaptosuccínico presentaron la mayor capacidad de unión/liberación.
La unión a estas nanopartículas de IFN-γ u otras biomoléculas
permitiría concentrar éstas en lugares específicos de acción para el tratamiento del cáncer u otras enfermedades.
54. EL INMUNOMODULADOR PSK POSEE ACTIVIDAD CITOTÓXICA IN VITRO FRENTE A LÍNEAS CELULARES TUMORALES. Berruguilla Pérez E1, Romero García I1, Garrido C1, Linares I1, Collado A1, Algarra I2, Garrido F1, García-Lora AM1. 1Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 2Departamento de
Ciencias de la Salud. Universidad de Jaén.
PSK (protein bound polisaccharide) deriva de la cepa CM.101 del
hongo Coriolus versicolor y ha mostrado actividad antitumoral in vitro
e in vivo en modelos tumorales humanos y modelos experimentales.
Varios ensayos clínicos han mostrado que PSK posee un gran potencial
en la terapia adyuvante contra el cáncer, pr esentando resultados positivos frente a tumores de diferente tipo: gástrico, esofágico, colorrectal,
mama y pulmón. Estas propiedades antitumorales de PSK se le han
atribuido a su efecto inmunomodulador, principalmente debido a la
proliferación y activación de células NK. En este estudio hemos analizado el efecto citotóxico directo sobre líneas celulares tumorales.
Diferentes líneas celulares tumorales, derivadas de distintos tipos
de tumores, fueron tratadas con PSK, midiéndose su tasa de proliferación mediante la incorpor ación de BrdU y relizándose contaje celular
con azul trypan. El análisis del ciclo celular se realizó mediante la incorporación de BrdU y marcaje con 7-AAD. Se evaluó la apoptosis mediante un ensayo de anexina V. La expresión de caspasa 3 activa se analizó mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo.
Los resultados mostraron que PSK inhibió in vitro el crecimiento
de diferentes líneas tumorales, disminuyendo su tasa de proliferación.
La inhibición de la proliferación varió desde un 22% a un 84%. El análisis del ciclo celular mostró una acumulación de las células en la fase
G0/G1 y un fuerte descenso del número de células en la fase S. La
expresión de Anexina V en células tumorales tratadas con PSK muestra una inducción de la apoptosis. La expresión de caspasa 3 se incrementó en algunas de las líneas estudiadas.
Estos resultados indican que PSK tiene un efecto citotóxico directo in vitro sobre células tumorales, lo que puede sumarse a su acción
inmunomoduladora sobre las células NK.
55. BALANCE ENTRE PROLIFERACIÓN Y APOPTOSIS EN CÉLULAS PLASMÁTICAS NORMALES Y TUMORALES EN ENFERMOS CON GAMMAPATÍA MONOCLONAL DE SIGNIFICADO INCIERTO. Martínez Viñambres E, García Trujillo JA, Alcalá Peña MI, Rodríguez Martín E, Coll Martí J, Roldán Santiago
E. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Introducción. La gammapatía monoclonal de significado incierto
(MGUS) es una neoplasia caracterizada por la expansión clonal de las
POSTERS
células plasmáticas (CP) presentes en la médula ósea (MO), coexistiendo en proporciones variables CP normales y CP tumorales. El MGUS
es considerado como un estadio premaligno que progresa, en la mayoría de los casos, hasta la fase maligna de la enfermedad (mieloma múltiple).
Objetivos. Estudio de la proliferación de las CP tanto tumorales
como normales presentes en pacientes con MGUS. Relación de la proliferación con los mecanismos de apoptosis de las CP.
Métodos. Aspirados de MO de individuos sanos y diagnosticados de MGUS. Cultivos de CP para ensayos de proliferación (incorporación de BrdU). Detección de apoptosis espontánea e inducida por
anticuerpos aCD95 mediante ensayos de anexina. Las poblaciones
de CP así como el resto de antígenos estudiados se detectaron mediante citometría de flujo.
Resultados. Las CP normales de la MO de enfermos con MGUS
muestran una capacidad proliferativa superior a las CP tumorales con
las que coexisten (1.2% vs. 0.4%).
Sin embargo, tanto el porcentaje como la intensidad media de florescencia (IMF) de la proteína Bcl-2 f ueron mayores en las CP tumorales de enfermos de MGUS; por el contrario, la expresión de la proteína CD95 fueron mayores en CP normales de estos mismos enfermos,
tanto en términos porcentuales como de IMF.
En consonancia con estos hallazgos, las CP normales mostraron
una apoptosis espontánea superior a la observada en las CP clonales
y fueron discretamente sensibles a la muerte inducida por el anticuerpo aCD95 (c lon CH11), mientras que las CP tumorales no lo fueron.
Conclusiones. La proliferación disminuida de las CP tumorales
en el MGUS se ve compensada con una mayor supervivencia de las
mismas. Ambos mecanismos mantienen la población clonal controlada y en coexistencia c on las CP normales en esta primera fase de la
enfermedad.
56. POLIMORFISMOS DE IL-10 Y EVOLUCIÓN DESFAVORABLE
DE PACIENTES CON HEPATOTOXICIDAD IDIOSINCRÁSICA A FARMACOS (DILI). Sáenz-López P1, Pachkoria K2, Lucena MI2, Crespo E3, Borraz Y2, Ruiz-Cabello F1, Andrade RJ4 . 1Servicio de Inmunología, H. Virgen de las Nieves, Granada. 2Servicio de Farmacología Clínica, 4Unidad de Hepatología, H. Universitario Virgen de
la Victoria, Facultad de Medicina, Málaga. 3Departamento de Farmacología, Universidad de Granada.
El balance entre citocinas inmunorreguladoras (IL-4, IL-10) y proinflamatorias (TNF-α) podría jugar un papel fundamental en la modulación de la respuesta del sistema inmune innato al efecto tóxico de los
fármacos en el hígado siendo determinante en la aparición final de
lesión. Nuestro objetivo fue determinar la influencia de los polimorfismos del gen promotor de IL-10, IL-4 y TNF-α en el desarrollo de
hepatotoxicidad idiosincrásica y de sus características clínicas.
Métodos. Se determinó la frecuencia de tres polimorfismos localizados en el gen promotor de la IL-10 (-1082 (G/A), -819 (C/T), -592
(C/A), IL-4 (-590 C/T)) Y TNFα (308 (G/A)) en 140 pacientes de DILI
y 268 controles mediante ensayo de discriminación alélica TaqMan 5´.
Resultados. Se analizaron 140 pacientes. La edad media fue de 51
años (13-82 años) sin diferencias en la distribución por sexos. Las frecuencias alelicas, genotípicas para la IL-10, IL-4 y TNFα no mostraron
diferencias significativas entre los pacientes con DILI y los controles.
Los pacientes con las variantes polimórficas para la IL-4, TNF-α y aquellos con alelos salvajes no mostraron diferencias con respecto al tipo
73
POSTERS
de daño, presentación clínica y evolución del daño hepático. El análisis del genotipo de la IL-10 (-1082) demostró la existencia de un desarrollo más temprano de la hepatotoxicidad en el caso de mujeres con
el genotipo bajo productor de IL-10, (p<0.03). El haplotipo bajo productor de IL-10 fue mas prevalerte en los pacientes DILI con ausencia de eosinofilia [Pc=0.004, OR= 5.29, 95% CI 2.04-13.67] y se asoció a
un recuento mas bajo de eosinofilos en sangre periférica (p<0.0002)
comparado con el resto de haplotipos de IL-10. Los pacientes (10) que
presentaron una evolución mas desfavorable (fallo hepático fulminante, transplante hepático o muerte o daño grave con ictericia y actividad protrombina < 50%) exhibían un haplotipo bajo productor de IL10 y ausencia de eosinofilia. De la revisión de los 591 casos de hepatotoxicidad incluidos en el Registro Español en 36 casos (6%) tuvieron
una evolución desfavorable y ninguno de ellos presentó eosinofilia.
Conclusiones. Los polimorfismos de la IL-10, IL-4 y TNFα no parecen estar asociados a la susceptibilidad de desarrollar hepatotoxicidad
en pacientes españoles. La presencia del haplotipo bajo productor de
la IL-10 podría favorecer una evolución grave del daño hepático no
inmunoalergico y junto con la ausencia de eosinofilia periférica ser
marcadores de evolución desfavorable.
57. MAPEO DE LAS ISOFORMAS CD33M Y CD33m CON UN
PANEL COMERCIAL DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
ANTI-CD33. POSIBLE U TILIDAD DIAGNÓSTICA Y TERAPÉUTICA EN LEUCEMIAS. Hernández-Caselles T, Pérez-Oliva
AB, Martínez-Esparza M, Corral-San Miguel R, García-Peñarrubia P. Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular (B) e Inmunología, Universidad de Murcia.
CD33 (siglec-3) es un receptor de membrana que se expresa en numerosos tipos celulares de origen hematopoyético, de utilidad diagnóstica
y terapeútica en varios tipos de leucemia. A pesar de la importancia derivada de su aplicación clínica, hasta la fecha, este receptor permanece
poco estudiado en comparación con otros miembros de la familia como
son CD22 (siglec-2) o la sialoadhesina (siglec-1), de manera que se desconocen muchas de sus características bioquímicas y funcionales. CD33
ha sido identificado como un receptor potencialmente inhibidor al poseer un dominio ITIM en su cola citoplásmica y reclutar las fosfatasas SHP1 y 2 cuando dicho dominio se encuentra fosforilado. Nosotros hemos
descrito previamente que, en todas las poblaciones celulares que expresan CD33, también se expresa otra isoforma, al menos a nivel de mRNA,
que llamamos CD33m, generada por splicing alternativo, isoforma que
se caracteriza por la ausencia del dominio Ig extracelular de tipo C2 de
CD33. En el presente trabajo hemos explorado la capacidad de diversos
anticuerpos comerciales anti-CD33 utilizando células 293T transfectadas y diferentes líneas celulares para detectar la presencia de CD33m
como proteína de membrana y su papel en las células hematopoyéticas.
En el presente trabajo mostramos que:
1) Los mAb comerciales WM53, WM54, 4D3, P67.6 y My9 reconocen
diferentes epítopos localizados en el dominio más externo (dominio V) de CD33.
2) El mAb HIM3-4 es el único que reconoce un epítopo localizado en
el dominio C2. A su vez, este Ab es el único que no marca células
T activadas CD33+ que sí se marcan con los demás mAb. HIM34 reconoce CD33 en aquellas células T activadas que han sido tratadas con sialidasa.
3) Los Ab H-110 detectan una isoforma de menor tamaño expresada
en membrana que probablemente es la isoforma menor CD33m.
74
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
4) La actividad inhibidora mediada por CD33 es más potente cuando se utiliza el mAb HIM3-4 que con WM53.
Nuestros resultados indican que CD33m se expresa probablemente en la membrana de las células CD33+ y que puede ser reconocido
por los anticuerpos HIM3-4 y H-110. El reconocimiento de CD33 por
los mAb HIM3-4 tras el tratamiento con sialidasa sugiere que esta molécula podría estar asoci ada en cis (enmascarada) en la membrana de
linfocitos T activados. La utilidad de HIM3-4 podría ser la de discernir entre los estados de enmascaramiento o desenmascaramiento de
CD33 en estas células y su mayor efecto inhibidor podría aportar una
mejora en la inmunoterapia actual de la leucemia mieloide aguda.
58. DIFERENTES LÍNEAS CELULARES DE MELANOMA HUMANO PRESENTAN ALTERACIONES EN EL FENOTIPO HLA
TRAS SU CRECIMIENTO EN RATONES INMUNODEFICIENTES. Garrido C1, Berruguilla Pérez E1, Linares Dickler I1, Romero
García I1, Casares C1, Stefanski J1, Algarra I2, Collado A1, Garrido
Torres-Puchol F1, García Lora AM1. 1Hospital Universitario Virgen de
las Nieves. 2Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad.
Los ratones inmunodeficientes son normalmente utilizados para el
crecimiento de líneas de células tumorales humanas y para el análisis in
vivo de terapias antitumorales. Estudios previos de nuestro grupo mostraron que el fenotipo HLA de la línea celular de melanoma Ando-2 cambio tras su crecimiento en ratones inmunodeficientes. La línea Ando-2
expresa sólo un haplotipo HLA en la superficie celular, tras el crecimiento en ratones nude se produce una pérdida total de expresión de moléculas HLA de clase I. Los resultados son similares tras su crecimiento en
ratones SCID-Bei ge. En este estudio hemos analizado este fenómeno en
otras líneas celulares humanas de melanoma. Se han analizado tres líneas celulares de melanoma humano: FM93.2, E-179 y E-195. Los ratones
nude fueron inyectados con 5 x 106 células, y cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 10 mm, fueron extirpados y adaptados a cultivo
celular. La expresión en superficie de moléculas HLA de clase I fue estudiada mediante inmunofluorescencia indir ecta y ci tometría de flujo. El
fenotipo HLA de clase I de las líneas celulares de melanoma antes del
crecimiento en ratones fue: FM93.2 tenía una pérdida en la expresión de
locus B, tanto E-195 como E-179 presentaban pérdida de un haplotipo.
Tras el crecimiento en ratones nude: E-179 presenta una pérdida total de
expresión del locus B y disminuci ón en el locus A; E-195 presento una
pérdida completa en la expresión en superficie de moléculas HLA de
clase I, siendo irrecuperable tras inducc ión con interfer ón. En el caso
de la línea de melanoma FM93.2 no se encontró ningún cambio. Estos
resultados muestran que de las cuatro líneas celulares de melanoma
inyectadas en ratones nude, tres sufrieron cambios en la expresión de
HLA de clase 1. Podemos así concluir que las alteraciones en la expresión de moléculas HLA de clase I en líneas de melanoma después del
crecimiento en ratones nude es un fenómeno frecuente y reproducible.
59. LA CITOTOXICIDAD CELULAR MEDIADA POR RITUXIMAB
CONTRA CELULAS B DE LLC ES POTENCIADA POR LA IL15. Moga E1, Álvarez E1, Cantó E2, Vidal S2, Juarez C2, Sierra J1,
Briones J1. 1Servicio de Hematología Clínica. 2Servicio de Inmunología.
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona.
Introducción. Las leucemias linfocíticas crónicas (LLCs) de células B tratadas con rituximab muestran un porcentaje bajo de respues-
INMUNOLOGÍA
tas, debido en parte a la baja expresión de CD20. La citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) es uno de los principales mecanismos
de acción del rituximab. El receptor activador FcγRIIIa, ampliamente
expresado en células NK, juega un papel importante en la ADCC que
media el rituximab. La IL-15 actúa a diferentes niveles de la respuesta inmune al activar y expandir las células NK. Hemos estudiado el
efecto de la IL-15 potenciando la citotoxicidad celular contra células B
de LLCs que media el rituximab.
Material y métodos. La ADCC se analizó mediante estudios de
liberación de 51Cr utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de un gradiente de centrifugación de
“buffy coats” de 10 voluntarios sanos. Las células se cultivaron durante 24 horas en presencia de IL-15 (rhIL15; 10 ng/ml). Células mononucleares de 10 pacientes diagnosticados de LLC-B (> 90% células tumorales) fueron utilizadas como diana. Las células de LLC-B fueron incubadas en presencia de rituximab (10 μg/ml) o IgG1 humana como control (10 μg/ml) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las células diana y efectoras se incubaron a diferentes ratios desde 40:3 a 10:3,
durante 4 horas a 37ºC. El polimorfismo presente en el aminoácido 158
del receptor activador FcγRIIIa fue analizado en las células efectoras
de los donantes sanos mediante PCR alelo-específica y digestión enzimática. El IFN-γ se cuantificó en el sobrenadante de cultivos de células efectoras activadas mediante ELISA (pg/ml).
Resultados. La citotoxicidad natural mostró un porcentaje de lisis
bajo al mayor ratio (2.7% ± 1.7% lisis, media ± SEM de 10 experimentos independientes), alcanzando un porcentaje máximo del 10% en un
experimento. En presencia de rituximab, las PBMCs de los 10 donantes mostraron también bajos niveles de ADCC (13.4% ± 2.5% lisis,
media ± SEM). Sin embargo, cuando las células efectoras se activaban
con IL-15, el porcentaje de lisis de células B de LLCs observado aumentó significativamente (33.2% ± 4.9% vs. 13.4% ± 2.5%, IL15 + rituximab vs. rituximab) (p<0.0001). No se observó ninguna relación entre
genotipo del FcγRIIIa y porcentaje de lisis. La producción de IFN-γ
por las células efectoras activadas con IL-15 fue mayor que el de células no activadas (1228.4 ± 420.5 vs 217.5 ± 65.4 pg/ml, respectivamente; p=0.03).
Conclusión. Las PBMCs son células efectoras con baja capacidad de matar células B de LLCs en presencia de rituximab. Las PBMCs
activadas con IL-15 potencian la ADCC que media el rituximab contra estas células. Estos datos tienen implicaciones clínicas en el tratamiento de las LLC-B, ya que su utilización como adyuvante en combinación con el rituximab podría aumentar su efecto terapéutico.
SESIÓN 5: INMUNODEFICIENCIAS: ALERGIA Y COMPLEMENTO
Moderadores: Dra . Núria Matamoros (Palma de Mallorca),
Dra. Margarita López-Trascasa (Madrid)
60. TRATAMIENTO CON GAMMAGLOBULINA SUBCUTANEA
EN PACIENTES PEDIATRICOS CON INMUNODEFICIENCIA
VARIABLE COMÚN. Español Boren T1, Martin Nalda A2, Alvarez A2, Figueras C2, Soler Palacin P2. 1Unidad de Inmunología. H.
Vall d´Hebron. Barcelona. 2Unidad de Infecciosas e Inmunodeficiencias
Pediátricas. H. Vall d´Hebron. Barcelona.
Antecedentes y objetivos. El tratamiento con gammaglobulina
inespecífica constituye el tratamiento estándar para las inmunodefi-
POSTERS
ciencias primaras (IDP) con déficit de producción de anticuerpos. Desde 1981 se utiliza la vía IV con la obtención de niveles permanentes
superiores a 600 mg/dl. La terapia por vía subcutánea (GGSC) supone una eficacia similar, niveles más estables y evita valores de IgG elevados después de la administración y sus efectos adversos secundarios. La posibilidad de autoadministración domiciliaria mejora, además, la calidad de vida de los pacientes y su dependencia del hospital.
Métodos. Se recogen los datos demográficos, clínicos y analíticos de los pacientes que han recibido GGSC en nuestro centro desde
noviembre de 2006.
Resultados. Diez pacientes pediátricos (4M/6H) entre 6 y 18 años
(mediana 14.5) afectos de IDCV que recibían tratamiento periódico con
GGIV, con una mediana de peso de 55.5 Kg. Las dosis administradas
han sido de 100-200 mg/Kg/semana. Se han mantenido cifras correctas de IgG plasmática (> 685 mg/dl) sin complicaciones infecciosas
durante este periodo. Los efectos secundarios locales han sido frec uentes pero leves y autolimitados. Ausencia de reac ciones adversas sistémicas. La valoración por parte de los pacientes de esta nueva modalidad terapéutica ha sido favorable.
Conclusiones. La terapia con GGSC es una alternativa válida para
pacientes pediátric os con IDP, suponiendo además una reducci ón de
costes sanitarios a medio plazo. Los valores de IgG plasmática y la eficacia clínica son similares a la administración por vía IV.
61. INCREMENTO DE LOS NIVELES DE PGE2 EN LAS VÍAS
AÉREAS DE PACIENTES CON BRONQUITIS EOSINOFÍLICA. Sastre B1, Fernández-Nieto MM1, López E1, Gámez C1, del Álamo C1, Sastre J1, Quirce S2, del Pozo V1. 1Fundación Jiménez-Díaz
Capio y Ciberes. 2Hospital Universitario La Paz y Ciberes.
Introducción. La bronquitis eosinofílica (BE), cuyo síntoma principal es la tos crónica se caracteriza, al igual que el asma, por presentar eosinofilia en el esputo pero, a diferencia de los pacientes asmáticos, los pacientes con bronquitis eosinofílica no poseen obstrucción
variable al flujo aéreo ni hiperreactividad de las vías aéreas, aunque
actualmente el tratamiento de ambas patologías es similar.
Objetivo. Evaluar si las características diferenciales en las vías
aéreas de los pacientes de estas dos patologías podría ser causado por
un disbalance en la producción de mediadores lipídicos broncoconstrictores (cisteinil-leucotrienos:LTC4) y broncoprotectores (prostaglandina E2:PGE2).
Métodos. Evaluamos los niveles de citocinas, mediadores proinflamatorios y concentración de eicosanoides en muestras de esputo de
13 sujetos con bronquitis eosinofílica, 13 sujetos con asma y 11 individuos control. Los niveles de expresión de ARN-m de las citocinas se
midieron por qRT-PCR; PGE2 Y LTC4 fueron evaluados mediante enzimo-inmunoensayo.
Resultados. A nivel celular, no existen diferencias estadísticamente significativas entre el porcentaje de eosinófilos de esputo entre los
pacientes asmáticos (7,95%) y los pacientes con bronquitis eosinofílica (15,29%). Los niveles de ARN-m de diversas citocinas (IL-5, 10, 13,
4, 2, IFN-γ y TGF-β) fueron similares entre los pacientes de ambas patologías. Tampoco se encontraron diferencias en citocinas proinflamatorias como IL-8, IL-1 y TNF-α. Sin embargo, encontramos diferencias
estadísticamente significativas entre ambas patologías al evaluar los
niveles de mediadores lipídicos en el sobrenadante del esputo inducido. Así, los niveles de PGE2 estaban incrementados en los pacientes
75
POSTERS
con BE (838.3±612 pg/ml) con respecto a los asmáticos (7.54±2.14
pg/ml) y los individuos sanos (4±1.3 pg/ml).
Conclusión. Estos datos sugieren que las diferencias funcionales
de las vías aéreas de los pacientes con BE y asma podrían deberse a
diferencias en la producción de PGE2.
62. CONCENTRACIÓN DE APRIL (TNFSF13A) EN SUERO DE
PACIENTES CON DÉFICIT DE IGA (DIGA). Fernández P1, Detkova D1, Rodrigo MJ1, Español T1, Caragol I1, de Gracia J2, Alvarez A2, Hernández González M1. 1Inmunología. 2Neumología. Hospital Universitari Vall d'Hebron. Barcelona.
Los individuos con DIgA (1/700), actualmente de etiología desconocida, son habitualmente asintomáticos pero algunos sufren un mayor
número de infecciones y desarr ollan enfermedades autoinmunes y
alérgicas. La proteína APRIL que se expresa en células presentadoras
de antígeno pertenece a la familia del TNF y actúa como ligando de
TACI y BCMA. Estudios en modelos murinos APRIL-/- han demostrado un déficit de IgA. También se han descrito niveles elevados de
APRIL en enfermedad autoinmune.El objetivo de este estudio ha sido
determinar la concentración de APRIL en pacientes con DIgA con el
fin de observar si hay una posible asociación entre APRIL y la base
molecular del DIgA. Los niveles séricos de APRIL se determinaron
mediante un ELISA comercial (BenderMedSystems) en tres grupos de
individuos: 65 donantes sanos (DS); 83 con IDVC y 54 con DIgA con
edades medias de 43, 35 y 39 años, respectivamente. El análisis estadístico se realizó mediante los tests de K-S,UMann-W,Kruskal-W. Se
obtuvo un límite de detección=0,78 ng/ml y una imprecisión intra e
interensayo de 4,37% y 6,84%, respectivamente. Se obtuvieron diferencias signific ativas (P<0,05) en las medianas de concentraciones de
APRIL entre el grupo DS (2,67 ng/ml), pacientes DIgA (9,45 ng/ml) y
IDVC (31,38 ng/ml). En el grupo de DIgA no se observó una asociación (p>0,05) entre los fenotipos clínicos: sin infecciones (n=14; 2,7
ng/ml), con infecciones leves (n=16; 8,8 ng/ml), moderadas (n=9:
2,07ng/ml), graves (n=10; 3,09 ng/ml) y los niveles de APRIL. Tampoco se observó ninguna asociación entre los niveles de APRIL en el
grupo de DIgA entre los paciente con patología autoinmune (AI) (n=16;
3,9ng/ml) y sin AI (n=33; 2,8 ng/ml).En este estudio se demuestra que
los pacientes con DIgA,presentan unos valores séricos de APRIL significativamente más elevados que los hallados en la población sana y
menores a los hallados en la población con IDVC.Para conocer la etiología de este hallazgo es necesario realizar más estudios en este sentido.
63. ANÁLISIS LONGITUDINAL DE LA FUNCIÓN INMUNE
DURANTE LOS TRES PRIMEROS AÑOS DE VIDA EN NEO
NATOS TIMECTOMIZADOS POR CARDIOPATÍAS CONGÉNITAS. Mancebo Sierra E1, Clemente J2, Sánchez JI3, Ruiz Contreras J2, de Pablos P1, Cortezón SA1, Paz Artal E1, Allende Martínez
LM1. 1Servicio de Inmunología. 2Unidad De Inmunodeficiencias. 3Unidad de Cuidados Intensivos. Hospital Universitario 12 de Octubre.
Madrid.
El propósito de este estudio es evaluar los efectos de la timectomía neonatal en el desarrollo del sistema inmune. Hemos seleccionado un grupo de 23 individuos que han sido timectomizados en sus primeros días de vida (<30 días), durante una operación para corregir car-
76
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
diopatías congénitas. Se han evaluado varios parámetros inmunológicos durante los primeros tres años de vida de los pacientes: cuantificación de las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias, respuesta linfoproliferativa por estimulación in vitro con mitógenos, cuantificación
de inmunoglobulinas e IL-7 y determinación de TRECs (T-cell receptor excision circles). Tras este estudio observamos que la timectomía
neonatal produce linfopenia mantenida en el tiempo, afectando especialmente a los linfocitos T CD4+. Adic ionalmente, los TRECs disminuyen de forma muy signifi cativa y los niveles de IL-7 en plasma
aumentan. Además encontramos una correlación estadísticamente signific ativa entre la disminución de los números absolutos de linfocitos
T CD4+ y el aumento de la IL-7. En conclusión, durante el periodo
de estudio, los pacientes timectomizados no sufrieron mayor número de infecc iones que las padecidas por niños sanos. Sin embargo, se
ha podido constatar que la timectomía en neonatos provoca una disminución significativa de los niveles de linfocitos T y TRECs, que es
consistente con el cese de la timopoyesis. Esto podría provocar un compromiso de la función inmune en los pacientes que necesiten un timo
activo en la edad adulta.
64. DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN UN NUEVO CASO DE
ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA LIGADA AL
SEXO. Martínez-Martínez L1, González-Santesteban CA1, Benaiges-Martínez C1, Badell I2, de la Calle-Martín O1. 1Hospital de la
Santa Creu i Sant Pau. 2Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Pediatría).
La Enfermedad Granulomatosa Crónica (CGD) se caracteriza por
infecciones severas recurrentes debidas a un defecto en la cadena respiratoria implicada en la destrucción de bacterias y hongos fagocitados por células mieloides (NADPH oxidasa). Este complejo enzimático está formado por 5 subunidades, una de las cuales, denominada
gp91phox, está codificada en el cromosoma X.
Presentamos el caso de un niño de 2 años, tercer hijo de padres no
consanguíneos. Existía el antecedente de un hermano muerto en el año
2002 a los 15 meses de edad como consecuencia de una colitis ulcerosa, que se complicó con una sepsis y que derivó en un síndrome hematofagocítico que resultó letal.
El paciente desarrolló durante el primer mes de vida una enfermedad inflamatoria intestinal. A los 10 meses sufrió una osteomielitis
aguda causada por Serratia y al año una endocarditis bacteriana. La
determinación de la capacidad oxidativa de los granulocitos demostró que los neutrófilos del paciente eran incapaces de realizar esta función, mientras que en su madre sólo un 80% lo hacían normalmente.
Se estableció el diagnóstico de Enfermedad Granulomatosa Crónica.
Ante la sospecha de una herencia ligada al X, se estudió la proteína
gp91phox. El estudio mediante citometría de flujo mostraba una alteración en la expresión de dicha proteína en el paciente; mientras que
en la madre había una población que la expresaba correctamente y otra
que no, en un porcentaje similar al obtenido en la prueba funcional
(80%/20%). El análisis de gp91phox mediante western blot corroboró
la ausencia de la proteína en el paciente. En el estudio del cDNA del
gen CYBB se encontró una mutación en el nucleótido 175 (C>T;
Cys58Arg), que está reportado que se correlaci ona con una ausencia
de la proteína. La madre era portadora de dicha alteración. El análisis de CYBB en el hermano fallecido a partir de una muestra de la autopsia, reveló la presencia de la mutación Cys58Arg, estableciéndose el
diagnóstico de CGD.
INMUNOLOGÍA
65. ANÁLISIS DE MUTACIONES EN TNFRSF13B EN PACIENTES
CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN. Gisel Del
Pozo Rodríguez N1, López R1, Cruz García M2, Núñez C1, Fernández-Arquero M1, Ferreira A2, Gómez de la Concha E1, Fontán G2.
1Servicio de Inmunología Clínica. Hospital Clínico San Carlos. 2Servicio de Inmunología Clínica. Hospital La Paz. Madrid.
La inmunodeficiencia variable común (IDVC) se caracteriza por
hipogammaglobulinemia, infecciones bacterianas recurrentes, y algunos pacientes presentan enfermedades inflamatorias, autoinmunes
y granulomatosas. Su etiopatogenia no está aún bien definida. Se han
descrito recientemente mutaciones del gen TNFRSF13B, que codifica TACI (transmembrane activator and CAML interactor), y que se
postula afectan al cambio de isotipo en linfocitos B. El objetivo de
nuestro estudio es analizar en pacientes españoles con IDVC la presencia de tres mutaciones en TNFRSF13B y valorar su implicación en
las características clínicas de dichos pacientes. Para ello incluimos 61
enfermos con IDVC (47,5% mujeres; edad media de inicio 15 años)
que fueron genotipados con sondas TaqMan para las mutaciones
R202H, A181E y C104R. Encontramos una prevalencia de mutaciones de 6,3% (4/61). Cuatro enfermos (6,3%) presentaron la mutación
en C104R, frente al 2,5% observado en 568 controles sanos y al 2,1%
observado en 282 enfermos con défici t de IgA. Un portador de dicha
mutación también presentó en heterozigosis la mutación en A181E.
Para estos dos polimorfismos no encontramos ningún enfermo con
mutación en homozigosis. No observamos individuos con mutaciones en R202H. Los cuatro enfermos portadores de mutaciones eran
mujeres, con edad media de inic io de 25 años y edad media de diagnóstico de 30 años. Todos presentaron patologías infecciosas (respiratorias y urinarias). Uno de ellos presentaba psoriasis y PTI, bronquiectasias y VHC. Un paciente presentó linfoma tipo MALT, esplenomegalia, hepatitis y cirrosis. El paciente portador de doble mutación presentaba esplenomegalia. Ninguno de los pacientes con mutaciones tenía historia familiar de IDVC ni déficit de IgA. Dado el bajo
tamaño muestral proponemos la necesidad de realizar estudios multicéntricos para pr ofundizar el estudio genotipo/fenotipo de esta
enfermedad.
66. EVIDENCIAS DEL DETERIORO FUNCIONAL DE CÉLULAS
T CD8+ HIV ESPECÍFICAS EN ENFERMOS VIH-1 POSITIVOS
TRATADOS CON TARGA Y DE LA EXISTENCIA DE UNA
POBLACIÓN REGULADORA CD8+HLA-G+. Lozano Reina JM,
García Jurado G, Frías M, Luque Moruno J, González Fernández
R, Ki Ndelán Jaquotot KM, Rivero A, Peña Martínez J. Hospital
Universitario Reina Sofía.
En la infección por VIH-1, una respuesta CD8 específica adecuada ha sido correlacionada con un mejor control de la infección en enfermos lentos progresores (LTNP). Además, en modelos con simios, la
retirada de las células CD8+ del torrente sanguíneo elevó de manera
significativa la carga viral en plasma. Se han relatado defectos en cuanto a la función citotóxica y secretora de las células CD8+ de enfermos
con peor evolución de la enfermedad. Paralelamente, varios autores
demuestran que algunas proteínas víricas serían c apaces de reducir
la expresión de moléculas HLA-I, fundamentales para el reconocimiento de las células infectadas por los linfocitos CD8. A pesar de que las
causas por las cuales los linfocitos CD8 positivos permanecen dañados en la infección VIH-1 han sido extensamente estudiadas, la influen-
POSTERS
cia de los tratamientos TARGA sobre la distribución y función de las
células CD8 HIV-específi cas carec e de datos suficientes. Con el objetivo de evaluar las posibles influencias de los tratamientos antirretrovirales (TARGA) sobre los linfocitos T CD8 VIH-específicos, nuestro
grupo ha analizado la distribución de las subpoblaciones CD8+ VIHespecíficos y su perfil funcional medido como capacidad de expresión
de INF-γ, TNF-α y perfor ina tanto en enfermos VIH-1+
tratados como no tratados. Nuestros resultados muestran como, a pesar
de existir igual distribución de células CD8+ VIH-específicas en cuanto a la expresión de CCR7 y CD45RA, la capacidad secretora de IFNγ y perforina en enfermos tratados fue significativamente menor
que en los pacientes que nunca recibieron TARGA. Este hecho demuestra un posible deterioro de la funcionalidad CD8 VIH-específic os en
pacientes tratados, evidenciada por un perfil menos efector (CD45RA+)
de las células secretoras. Además, nuestros estudios en la distribución
de subtipos CD8 positivos, evidencian la expansión de una supoblación HLA-G+ reguladora en enfermos VIH-1 positivos y que fue más
evidente en pacientes bajo TARGA. Esta nueva subpoblación
CD8+HLA-G+ ha sido ya descrita por otros autores en procesos inflamatorios y podría tener una significación fundamental en la patogenia de la infección por el VIH-1.
67. ESTUDIO CUANTITATIVO DE LA EXPRESIÓN DE VARIANTES DE SPLICING DE C1 INHIBIDOR EN PACIENTES DE
ANGIOEDEMA HEREDITARIO. Mena de la Cruz MR, LópezLera A, Garrido S, Fontan G, López-Trascasa M. Hospital Universitario La Paz. Madrid.
El C1 inhibidor es la esterasa que controla la activación de C1 en
el inicio de la vía clásica del sistema del complemento y es un importante regulador de los sistemas de contacto, la generación de cininas,
la coagulación y la fibrinolisis. Las alteraciones moleculares en el gen
de C1 inhibidor (ID:X54486, C1-Inh) producen la enfermedad autosómica dominante denominada Angioedema Hereditario (AEH), c aracterizada por ni veles cuantitativa o cualitativamente inferiores al 50%
(AEH Tipo I o AEH Tipo II, respectivamente) de C1-Inh.
El objetivo del presente trabajo es comprender el patrón de expresión de mRNA de C1-Inh total en sangre periférica en pacientes de
AEH. El estudio se realizó por RT-PCR a tiempo real en una serie de
34 pacientes y 13 c ontroles sanos de la población española. El valor
medio de expresión de mRNA de C1-Inh en los pacientes AEH tipo I
(12.60%) y AEH Tipo II (20.22%) resultó significativamente inferior al
de los controles. En estudios previos, hemos observado que el patrón
de expresión de mRNA total de C1-Inh en sangre periférica presenta,
de forma constitutiva, dos tránscritos diferentes: completo y sin exón
3. Se realizó un estudio por RT-PCR a tiempo real que permitió cuantificar la expresión de los dos tránscritos y el ratio entre ambos en 31
pacientes (23 AEH Tipo I y 8 AEH Tipo II) y 17 controles sanos. El análisis de los ratios revela tres grupos diferenciados correspondientes a
pacientes AEH Tipo I (0.52), pacientes AEH Tipo II (1.90) y grupo control (1.12).
Los resultados obtenidos en la expresión de mRNA total de C1Inh en sangre periférica sugieren una transinhibición del alelo sano
por parte del alelo mutado. El estudio de la ratio de los tránscritos revela correlación entre este cociente y los niveles de proteína en cada grupo de pacientes (AEH Tipo I y AEH Tipo II), lo que sugiere una regulación de la expresión a nivel de la traducción o la transcripción por
parte de la proteína o el mRNA alterados.
77
POSTERS
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
68. LINFOCITOS INTRAEPITELIALES (LIES) EN EL DIAGNÓSTICO DE ALERGIAS ALIMENTARIAS FRENTE A ENFERMEDAD CELÍACA. De Andrés A, Mirete S, Marín N, Camarero C,
Roy G. Hospital Ramón y Cajal de Madrid.
La enteropatía por Alergia alimentaria puede cursar con una clínica inespecífica, de difícil filiación que a veces dificulta un diagnóstico diferencial; de hecho, no es infrecuente encontrar pacientes con
alergias alimentarias en los que se realiza una biopsia duodenal con la
sospecha de enteropatía celíaca.
Está descrito que la enteropatía celíaca (EC) tiene una distribución
fenotípica específica de las sub-poblaciones linfoides del epitelio intestinal proximal (Linfograma LIEs)1.
Objetivo. Validar la especificidad del Linfograma LIEs para el
diagnóstico de la EC, en el grupo de los pacientes con alergias alimentarias.
Metodología. Se han analizado los LIEs por citometría de flujo, en
un total de 43 biopsias de duodeno de pacientes con alergias alimentarias, demostradas clínica (mejoría con la supresión del alergeno) y/o
analíticamente (IgE específica positiva frente al alergeno/s). Los pacientes se dividieron en 2 grupos, tomando como referencia los hallazgos
anatomopatológicos: 14 con lesiones histológicas sugerentes de enteropatía celíaca (A = atrofia) y 29 con biopsia sin alteraciones (NA =
no atrofia).
Resultados:
Porcentaje con respecto al total de LIEs
Porcentaje con
respecto al total
de enterocitos
Atrofia (n = 14)
21.7 ± 1.5
29.5 ± 4
No atrofia (n = 29)
2.3 ± 0.6
LIEs
TCRγδ
i-NK
Media ± ES Media ± ES Media ± ES
7.8 ± 0.8
10 ± 1.5
26.4 ± 3.2
1 Camarero et al. Intraepithelial lymphocytes and Celiac disease: permanent
changes in CD3-/CD7+ and T cell receptor gamma-delta subsets studied by
flow cytometry. Acta Paediatr 2000; 89: 285-290.
78
Se describe el caso de una mujer de 40 años que padece ulceras en
la pierna derecha desde la infancia. La lesión fue expandiéndose hasta cubrir toda la superfici e de la pierna y el pie. La biopsia reveló una
inflamación granulomatosa necrotizante con afectación de la dermis
y la hipodermis (necrobiosis lipoidic a). Desde la adolescencia la paciente comenzó a tener episodios de infecciones bacterianas recurrentes
del tracto respiratorio, que finalmente evolucionaron a bronquiectasias. El cuadro respiratorio y las lesiones crónicas granulomatosas de
la piel llevaron a la sospecha de BLS I. El estudio de la expresión de las
moléculas HLA de clase I mostró una disminución muy marcada. En
el tipaje molecular se observó que la paciente era homocigota para
todos los loci HLA. El análisis de los genes TAP mostró que la secuencia del cDNA de TAP1 era correcta y coincidía con el alelo más frecuente (TAP 1A). La región codificante de TAP2 correspondía a la variante
2A, excepto por el cambio de un nucleótido en el exón 3. Se confirmó
la presencia de la mutación mediante la secuenciación del exón 3 de
TAP2 a partir de DNA genómico de la paciente y sus familiares. La
paciente tiene un cambio en homocigosis de C a T en el nucleótido 628,
no descrito anteriormente, que introduce un codón stop prematuro.
Su madre y sus hijas eran heterocigotas. La lesión ulcerada en la pierna de la paciente evolucionó hacia un carcinoma epidermoide de elevada agresividad que produjo metástasis en hígado, pulmón y huesos, y finalmente a la muerte de la paciente.
70. CAMBIO DE FENOTIPO DE SCID A SÍNDROME DE OMENN
TRAS UN TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO EN UN
PACIENTE CON MUTACIONES EN RAG1. González C1, Martínez L1, Benaiges C1, Badell I2, Nogués N3, de la Calle O1. 1Servicio Inmunología, Hospital Sant Pau. 2Servicio de Pediatría, Hospital Sant
Pau. 3Banco de Sangre y Tejidos.
Conclusiones. En la muestra analizada, todos los pacientes con
atrofia de la mucosa intestinal han sido diagnosticados de EC, con
un fenotipo de LIEs característico; en los pacientes sin atrofia, no se
modifican las poblaciones que nos afectan para el diagnóstico fenotípico de la EC.
LIEs
TCRγδ
i-NK
Media ± ES Media ± ES Media ± ES
69. DEGENERACIÓN NEOPLÁSICA EN UN PACIENTE CON SÍNDROME DEL LINFOCITO DESNUDO TIPO I DEBIDO A UNA
NUEVA MUTACIÓN EN TAP-2. González C1, Martínez L1, Agustí M1, España A2, de la Calle O1. 1Servicio Inmunología, Hospital Sant
Pau. 2Departamento de Dermatología e Inmunología, Universidad Clínica de Navarra.
El síndrome de Omenn (OS) es una forma de inmunodeficiencia
severa combinada (SCID) que se caracteriza por eritrodermia, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatías, eosinofilia e hiper IgE, además de
las infecciones graves propias del SCID. Se observa una ausencia de
linfoci tos B y un número normal o incluso elevado de linfocitos T oligoclonales, y en la mayoría de los casos se ha asociado a mutaciones
hipomórficas en RAG. Se presenta el caso de un niño de origen marroquí, hijo de padres consanguíneos, que debuta con eritrodermia e infecciones severas a partir de los dos meses de edad. Los resultados de
laboratorio muestran una falta total de linfocitos B, y una función defec
tuosa de linfocitos T (anérgicos). El inmunofenotipo LT+/LB- es compatible con OS, aunque algunas manifestaciones no aparecen en el
paciente (eosinofilia, hiper IgE). El análisis molecular de los genes Rag
permitió identificar una deleción en homocigosis de la timidina 631
del gen Rag1 (del631T), que comporta la aparición de un codón stop
prematuro por desplazamiento del patrón de lectura. El uso de un
codón alternativo de inicio de la traducción permitiría explicar una
actividad residual de las proteínas RAG y la presencia de linfocitos
T. Los padres del paciente son portadores de la deleción, así como 3 de
los 5 hermanos. Se realizó un trasplante de médula ósea (TMO) de uno
INMUNOLOGÍA
de sus hermanos (compatible en 9/10 antígenos HLA) con una evolución inicial muy favorable (rápida recuperación de las cifras de leucocitos y una implantación total de linfocitos del donante). Un año después del TMO comenzaron a observarse una serie de cambios progresivos: reaparici ón de los linfocitos B del receptor, aumento en las cifras
de IgE, y disminución pr ogresiva del número absoluto de linfocitos
B. El paciente presentó una sepsis (hemocultivo + para Bacillus sp) y
comenzó a padecer un cuadro de OS. Rápidamente el cuadro se complicó con fallo multiorgánico y el paciente finalmente falleció.
71. CANÁLISIS DE LOS RECEPTORES NK EN PACIENTES VIH1+ CON INTERRUPCIÓN PROGRAMADA DEL TARGA. Lozano Reina JM1, Frías Casas M1, García Jurado G1, Luque Moruno
J1, González Fernández R1, Soriano N2, Leal M2, Peña Martínez J1.
1Hospital Universitario Reina Sofía. 2Hospital Universitario Virgen del
Rocío. Sevilla.
Desde hace ya más de una década, la única forma efectiva de controlar la replicación viral en la infección por el VIH-1, ha sido el tratamiento anti-retroviral de gran actividad (TARGA). Sin embargo, dicho
tratamiento presenta consabidas limitaciones, como la imposibilidad
de controlar los reservorios del virus, la aparición de resistenci as a
muchos de los fármacos que lo componen y la presentación de toxicidades cuando el tratamiento es mantenido durante largos periodos.
Para reducir estos efectos clínicos se ha propuesto la interrupci ón
estructurada del tratamiento (IET). Además, algunos autores han apuntado a la posibilidad de que estas interrupciones puedan aumentar
la respuesta celular inmune específica frente al virus. Sin embargo,
existe controversia sobre la eficacia del IET en el manejo prolongado
de pacientes en fase crónica y si el IET mejora la calidad de vida de
dichos pacientes. Numerosos trabajos señalan que una interrupción
del tratamiento conlleva un pago inmunológico, principalmente de
células CD8+, que se ve compensado por la reducción de fenómenos
de resistencia y toxicidad. La respuesta CD8 específica ha sido la más
estudiada en las cohortes de interrupción, pero pocos o ningún dato
existen sobre la repercusión, de esta práctica clínica, sobre las células
NK, a pesar de la importancia de estas células en controlar la replicación viral. Nuestro objetivo ha sido el estudio del perfil fenotípico y
funcional de las subpoblaciones NK en una cohorte de pacientes incorporados en un programa de interrupción programada del TARGA. Los
criterios de inclusión de los pacientes (n=11) fueron los siguientes:
CV<50c/mm3, CD4+>500c/mm3 al menos durante los últimos 12
meses y un recuento nadir de CD4+>250c/mm3. El estudio se ha llevado a cabo mediante citometría de flujo, usando un FACScalibur (Becton Dic kinson) y el análisis de las muestras se realizó mediante el software Cell Quest Pro (Becton Dickinson). También se medieron los niveles de secreción de TGF-β y IFN-γ mediante ELISA. Nuestros resultados indican un descenso de la frecuencia de NK en todos los enfermos
que iniciaron la interrupción del tratamiento, descenso que se mantuvo 6 meses después del reinicio del mismo. Interesantemente, este descenso fue mas acentuado entre la población NK más citotóxica
(CD56dim). En cuanto al perfil funcional, los niveles de ILT-2 y NKp46
se vieron incrementados durante la fase de interrupción en todas las
subpoblaciones NK. No se observaron cambios reseñables con respecto a los otros receptores reguladores de la citotoxicidad estudiados,
KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL2, KIR2DS4, NKG2A o NKG2C. Sin embargo se observaron correlaciones positivas y negativas entre la carga viral
y los niveles de expresión de algunos de estos NKRs. Por último obser-
POSTERS
vamos aumentos significativos de TGF-β después de la IET y que se
mantuvo elevado cuando el TARGA fue reintroducido un año después.
Por el contrario, los niveles de IFN-γ estuvieron descendidos durante
la fase de interrupción. En conclusión, la IET descendió los niveles
de NK, principalmente la subpoblación más citotóxica, y aunque se ve
modificado ligeramente el perfil funcional de las células NK, la IET no
parece que modifique signific ativamente el perfil funci onal de estas
células. Aún es necesario un mayor número de estudios para conocer
el verdadero impacto de la interrupción del tratamiento (IET) sobre la
respuesta innata de los pacientes infectados por VIH-1 que ayude a
entender si una suspensión de la terapia contra VIH por cortos periodos de tiempo mejora la capacidad del sistema inmunológico a controlar la infección.
72. INFLUENCIA DE HLA-DRB1 Y -DQB1 EN SUSCEPTIBILIDAD
A ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR EN PACIENTES
CON FIBROSIS QUISTICA. Salgado G1, Sánchez-Solis M2, Campillo JA1, Botella C1, Mondejar P2, López M1, Alemany JM1, Garcia-Alonso A1, Alvarez-López MR1, Muro M1. 1Servicio Inmunología. 2Servicio de Pediatría. Hospital Universitario Virgen Arrixaca.
La Aspergilosis Bronco-Pulmonar Alérgica (ABPA) es una hipersensibilidad pulmonar que afecta a pacientes con fibrosis quístic a (FQ)
y pacientes asmáticos (AS). Algunos alelos HLA-DRB1 han sido asociados con una cierta susceptibilidad a ABPA mientras que la asociación
con alelos HLA-DQ1 no está claramente establecida. Nuestro propósito fue estudiar la asociación de HLA clase II con ABPA-FQ y determinar su papel en la susceptibilidad o protección frente a la enfermedad.
En este estudio se incluyeron pacientes con ABPA-FQ, AS y controles.
Los DNA fueron obtenidos automáticamente con el extractor de DNA
Maxwell 16 (Promega, WI). Los genotipajes en HLA-DRB1 y DQ1 fueron realizados por Luminex mediante el método PCR-SSO (One Lamba CA). La alta resolución se realizó mediante PCR-SSP. El análisis estadístico se realizó con el programa SSPS. Los alelos HLA-DRB1*1501 y
–DRB1*1104 mostraron una mayor frecuencia en pacientes con ABPAFQ respecto al grupo control, corroborando los datos publicados por
Cauchan et al. Por otra parte, el análisis de los haplotipos revela que
casi todos los pacientes con ABPA-FQ que carecen de DRB1*1501 y
DRB1*1104 llevan los alelos DRB1*04 y/o DRB1*0701. En la región DQB1,
la frecuencia de los alelos HLA-DQB1*0602, -DQB1*0301, -DQB1*0202
y -DQB1*0302 fue incrementanda estos pacientes ABPA-FQ, mientras
que la frecuencia de HLA-DQB1*0201 se encontró disminuida. En conclusión, estos datos corroboran los estudios previos que demuestran
que existe una correlación entre los alelos DRB1*1501, DRB1*1104,
DRB1*04 y DRB1*0701 y la susceptibilidad a ABPA-FQ y el alelo HLADQB1*0201 podría ser un alelo de resistencia.
73. DEFICIENTE ACTIVACIÓN Y PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS B EN INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMUN
(IVC) A TRAVÉS DE RECEPTORES “TOLL LIKE” (TLR). Escobar D, Pons J, Alorda J, Martínez N, Matamoros N, Ferrer J. 1Servicio Inmunología. Hospital Son Dureta.
Introducción. La IVC es una inmunodeficiencia humoral caracterizada por infecciones sinopulmonares recurrentes causadas por bacterias encapsuladas (S. pneumoniae y H. influenzae). Se han descrito algunas mutaciones genéticas en pacientes con IVC, pero en la mayoría
79
POSTERS
sigue sin identific arse el defecto molecular subyacente que conduce a
un bloqueo en la maduración de los linfocitos B a células plasmáticas
y de memoria.
Los TLR desempeñan un papel clave activación y/o maduración
de algunas células del sistema inmune. En humanos la expresión de
TLR-9 está restringida a células B y células dendríticas
plasmocitoides. La activación de TLR-9 con ADN bacteriano interviene en la producción de anticuerpos por los linfocitos B.
Objetivos. Evaluar la respuesta de los linfocitos B de un grupo de
pacientes con IVC estimulándolos con ligandos de TLR9 y extractos
bacterianos de S. pneumoniae y H. influenzae.
Material y métodos. En 14 pacientes con IVC y 14 controles sanos
se estimularon linfocitos de sangre periférica con ODN (0,6 ug/ml),
extractos de S. pneumoniae o H. influenzae en presencia o ausencia de
anti-IgM (5 ug/ml). Se evaluaron mediante citometría de flujo, en la
población B, la expresión de CD86 en membrana y el índice de proliferación previo marcaje con carboxifluoresceína a los 3 y 4 días, respectivamente.
Resultados. En los linfocitos B de los pacientes con IVC la expresión de CD86 fue significativamente inferior a la de los controles cuando las células se estimularon con ODN, extractos de S. pneumoniae y
H. influenzae asociados a anti-IgM. La proliferación de los linfocitos
B de los pacientes con IVC fue también inferior a la de los controles
al estimular con extractos de S. pneumoniae y H. influenzae asociados
a anti-IgM.
Conclusión. Los linfocitos B de los pacientes con IVC no responden óptimamente a la estimulación a través de TLR lo que podría explicar la falta de maduración, generación de células B de memoria y producción de anticuerpos de los mismos.
74. LA FUNCIÓN DE RECEPTORES TOLL-LIKE (TLR) ESTÁ CONSERVADA EN MONOCITOS DE PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN (IVC). Escobar D, Pons J,
Iglesias J, Matamoros N, Ferrer J. 1Servicio Inmunología. Hospital
Son Dureta.
Introducción. La IVC se caracteriza por hipogammaglobulinemia
e infecciones respiratorias de repetición, causadas fundamentalmente
por S. pneumoniae y H. influenzae. Se han descrito mutaciones en ICOS,
TACI y CD19 en algunos pacientes pero el defecto molecular subyacente es desconocido. Publicaciones recientes apuntan a deficiencias
en la maduración y función de las células dendríticas obtenidas “in
vitro” a partir de monocitos de sangre periférica en los pacientes con
IVC.
Objetivos. Evaluar la funcionalidad los TLR del sistema inmunitario innato en monocitos de sangre periférica de pacientes con
IVC.
Metodología. En 14 pacientes con IVC y 14 controles, se estudió,
mediante citometría de flujo, la expresión basal de TLR2 y TLR4 y la
inducción de moléculas coestimuladoras (CD80, CD86, DR y CD40)
en monocitos de sangre periférica, así como la producción de interleucinas (ILs) (TNFa, IL1b, IL6, IL8 e IL10) mediante CBA o ELISA. Para
la estimulación se utilizaron ligandos de TLR (SLTA, Zymosan y LPS)
y extractos de S. pneumoniae y H. influenzae.
Resultados. La expresión basal de TLR2, pero no de TLR4, fue
mayor en monocitos de pacientes con IVC que en los controles. La estimulación con ligandos de TLR2 (SLTA) y TLR4 (LPS) indujo mayor
producción de TNFa en pacientes con IVC que en controles. No obser-
80
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
vamos diferencias en la expresión de CD80, CD86, DR, CD40 ni en la
producción de otras ILs estudiadas con ninguno de los estímulos utilizados.
Conclusión. La mayor producción de TNFa frente a SLTA podría
estar directamente relacionada con la mayor expresión de TLR2 en los
monocitos de los pacientes. La expresión de TLR4 es igual en pacientes y controles; alteraciones en CD14 y/o MD2 (coreceptores de TLR4)
podrían explicar el aumento de producción de TNFa en respuesta a
LPS. En respuesta a la estimulación bacteriana, los monocitos de pacientes y controles producen ILs y expresan moléculas coestimuladoras de
forma equivalente.
75. ANÁLISIS DE MECANISMOS DIFERENCIALES DE SENSIBILIZACIÓN Y TOLERANCIA EN LA RESPUESTA AL POLEN
DE OLIVO. Chacártegui M1, Florido F2, Quiralte J3, LLanes E1,
Delgado J4, Miranda A5, del Álamo C1, Palomino P1, Lahoz C1, Cárdaba B1. 1Fundación Jiménez Díaz-CAPIO-CIBERES. 2Departamento
de Alergia, Hospital Universitario San Cecilio, Granada. 3Unidad de
Alergia, Complejo Hospitalario de Jaén, Jaén. 4Servicio de Alergia. Policlínico, Sevilla. 5Servicio de Alergia, Hospital Civil, Málaga.
Objetivos. Buscar mecanismos diferenciales (tanto a nivel celular
como humoral) entre tolerancia natural e induci da frente al polen del
olivo, analizando sujetos sensibilizados y no sensibilizados, en condic
iones de baja y alta exposición ambiental.
Metodología. Población: 148 sujetos, 84 del periodo de polinización (máxima exposición) y 64 fuera del mismo (mínimos niveles de
polen), distribuidos en 5 grupos: I. Tolerantes (No alérgicos, n=32),
II. Asintomáticos ó subclínicos (n=17), III. Atópicos (no al olivo, n=35),
IV. Alérgicos al olivo (n=37) y V. Alérgicos al olivo tratados (n=27). Tras
exploración clínica, consentimiento informado y pruebas cutáneas, se
extrajeron 3 alícuotas de sangre para suero, plasma y PBMCs (mediante gradiente de densidad). En el suero se determinaron los niveles de
anticuerpos IgE total e IgE, IgG4 e IgA específicos al polen del olivo,
por CAP (Phadia-Pharmacia) y con los PBMCs, la proliferación celular frente al extracto de olivo, así cómo a péptidos de Ole e 1 (antígeno mayoritario) mediante incorporación de TH3 (5 días de cultivo) y
los niveles de citocinas solubles (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-a, IFN-g e
IL-13, mediante citometría de flujo y TGF-b por ELISA) tras 24 horas
de estimulación.
Resultados. 1. Respuesta humoral: El Grupo II (subclínicos) presenta los mayores niveles de IgE total pero muy bajos de IgE específica, y el Grupo V (alérgicos tratados) los mayores niveles de IgG4 e
IgA específic a. Los mayores niveles de IgE específica los presentaron
tanto el Grupo IV (alérgicos a olivo) como el Grupo V. Los niveles de
IgE e IgG4 específica fueron mayores en el periodo de menor exposición, excepto en los subclínicos. 2. Respuesta celular: Observamos la
mayor respuesta proliferativa frente al extracto de olivo en el Grupo
IV y el péptido inmunodominante de Ole e 1 (10+12+13) sólo indujo
proliferación en este Grupo. La determinación de citocinas solubles no
aportó un perfil discriminatorio entre grupos, aunque sí diferencias
reseñables.
Conclusiones. En general, se observa una mayor respuesta (humoral y celular) en el periodo de menor exposición antigénica (quizá por
ser sujetos de áreas con una dosis extremadamente alta de antígeno)
y, aunque aún no tenemos un fenotipo diferencial entre respuesta-no
respuesta, sí hay diferencias destacables que sugieren la implicación
de mecanismos reguladores.
INMUNOLOGÍA
76. LINFOADENOPATÍA NO-MALIGNA E INFECCIÓN PERSISTENTE POR EBV. Martín JL1, Diéguez MA1, Suárez Leiva P2,
Melón S2, Oña M2, Miñones L3, Ramos E3, Soler P4, Español T5, Tricas L1. 1Inmunonología. Hospital Universitario Central de Asturias.
2Microbiología. Hospital Universitario Central de Asturias. 3Pediatría.
Hospital Universitario Central de Asturias. 4Pediatría. Hospital Valle de
Hebrón. Barcelona. 5Inmunología. Hospital Valle de Hebrón. Barcelona.
El paciente es un niño de 6 años. Su madre presenta un déficit selectivo de IgA. Tiene una hermana sana. No hay consanguinidad familiar ni otros antecedentes familiares de inmunodeficiencia. Desde los
2 años de edad presenta adenopatías recurrentes cada 3- 6 meses laterocervicales y submaxilares con fiebre, leucocitosis y neutrofi lia. A la
edad de 4 años, se abscesifica la adenopatía cervical que espontáneamente drena. En el scanner de cuerpo entero no había esplenomegalia
ni adenopatías internas. La función hepática es normal. A la edad de
5 años las adenopatías se generalizan y extienden a región cervical,
axilar,inguinal y poplítea. No presenta adenopatias internas, pero aparece esplenomegalia. La biopsia mostraba cambios reactivos y excluía
un proceso linfoproliferativo. El estudio virológico muestra anticuerpos IgM e IgG anti-CMV y elevados títulos de IgM anti-EBV-VCA que
han permanecido durante toda la evolución del cuadro clínico, títulos
más bajos de IgG anti-EBV-VCA, anticuerpos anti- EBV-EA negativos y anticuerpos moderadamente positivos anti-EBV-EBNA. Intermitentes picos de viremias EBV-DNA y CMV-DNA en sangre periféric
a que también permanecen durante toda la evolución. El paciente no
ha presentado otras infecciones excepto la persistente activación del
EBV y esporádicas infecc iones intercurr entes por CMV. El estudio
inmunológico muestra: disgammaglobulinemia (IgG = 5.5 g/L , IgA <
0.07 g/L e IgM = 3.97 g/L, que se ha incrementado hasta 10.5 g/L en
los 2 últimos años. Persistente disminución de linfocitos B = 3% y de
la ratio CD4/CD8 c on incremento de linfocitos T CD8 que expresan
HLA-DR, SAP y un marcado inc remento de la expresión de perforina. Los linfocitos NK están moderadamente incrementados en sangre
periférica y la actividad NK frente a células K-562 es normal. El estudio genético no encontró mutaciones en el gen SH2D1A ni en el gen
XIAP. Tampoco presenta características inmunológicas de ALPS, el porcentaje de linfocitos TCRab+CD3+CD4-CD8- y la expresión de CD95
es normal y no tiene alteraciones autoinmunes. El paciente fue diagnosticado de infecc ión persistente por EBV y síndrome XLP-like. Ha
recibido tratamiento con Gammaglobulina IV, antivirales y Rituximab.
El tratamiento con Rituximab produjo una mejoría clínica y analítica
completa. Desaparecieron las adenopatías y los parámetros inmunológicos se normalizaron: Ig M= 0.78 g/L, Linfocitos T CD8 no expresaban HLA-DR, el título de anticuerpos IgM anti –EBV-_VCA disminuyó a valores muy bajos. Pero 9 meses después de recibir la última
dosis de Rituximab reaparece el cuadro clínico inicial y las mismas alteraciones inmunoanalíticas.
77. DETERMINACION DE ANTICUERPOS ANTI-FACTOR H EN
SINDROME HEMOLITICO UREMICO ATIPICO. Soto Cárdenas C1, Alonso MM1, Abarrategui C2, Rodríguez de Córdoba
S3, Sánchez-Corral P2, López Trascasa M1. 1Unidad de Inmunología.
2Unidad de Investigación. Hospital La Paz. 3Centro de Investigaciones
Biológicas. CSIC.
El factor H es una proteína plasmática que actúa como cofactor
para el factor I, una enzima inactivadora de C3b; también inhibe la for-
POSTERS
mación y acelera la disociación de la C3 convertasa de la vía alternativa del complemento. Recientemente se ha descrito la existencia de anticuerpos anti-factor H en pacientes con diagnóstico de Síndrome Hemolítico Urémico atípico (SHUa).
Se diseñó un ELISA para valorar la presencia de anticuerpos
anti-factor H, para lo cual se sembró la placa con factor H purificado. Se añadieron diluciones decrecientes de muestras de suero de
pacientes y de controles, junto con una curva de calibración, dejándose incubar toda la noche a 4º C. Como anticuerpo secundario se
utilizó suero de cabra anti-IgG humana marcada con peroxidasa.
La placa se reveló utilizando ABTS como sustrato de la peroxidasa.
La presencia de anticuerpos anti-factor H se analizó en los sueros de 113 pacientes con diagnóstico de Síndrome Urémico Hemolítico atípico, de los cuales 62 eran adultos y 67 niños; se detectaron
anticuerpos anti-factor H en 4 casos, todos niños. En uno de los casos
se realizó seguimiento de los niveles de anticuerpos durante el tratamiento con plasmaféresis. En tres de los casos se encontró deficiencia completa de las proteínas relacionadas con factor H CFHR1 y
CFHR3.
La determinación y cuantificación de anticuerpos anti-factor H
permite identificar un subgrupo de pacientes con SHUa de origen
autoinmune. Este ensayo es una herramienta de screening que permite la pronta identificación de estos pacientes y el inicio rápido del
tratamiento mediante plasmaféresis, así como valorar la evolución y
la respuesta al tratamiento inmunosupresor en los enfermos.
78. ASOCIACIÓN DE PERFILES FENOTÍPICOS DE LINFOCITOS
T CON COMPLICACIONES CLÍNICAS EN PACIENTES CON
INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN (IDVC). Lanio
Amador N, Sarmiento Marchese E, Gallego López A, FernándezCruz E, Carbone Campoverde J. HGU Gregorio Marañón. Madrid.
Introducción. En la IDVC se han descrito perfiles celulares anormales de linfocitos B y T. Sin embargo, continúan sin esclarecerse las
bases moleculares de la patología y los defectos funcionales asociados
a un mayor riesgo de complicaciones clínicas. Su conocimiento permitiría una corr ecta clasificac ión y mejor manejo del síndrome.
Objetivo. Identificación de nuevos marcadores celulares asociados a complicaciones frecuentes de la IDVC y su posible asociación
con anteriores clasificaciones propuestas (Piqueras 2003[a]).
Métodos. Estudio transversal de 21 pacientes con IDVC
(edad=47±17, 12M/9H) y 21 controles sanos (CS, edad=46±11,
7M/14H). Se analizaron subpoblaciones celulares en sangre total por
citometría de flujo (FACSCalibur) usando varias combinaciones de
los marcadores CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD16, CD27, IgM, IgD,
CD45RA, CCR7, CD38, HLA-DR y CD25. Estudio realizado antes de
infusión con GGIV y sin complicación infecciosa o autoinmune activa reciente.
Resultados. En comparación con CS se observó ↑%
CD19/CD27-, CD4/RA-, CD8/CCR7-, CD4 o CD8/DR+CD38+;
↓% CD19/CD27+IgM-IgD-, CD4/CD25+ y CD4/CD25high.
Grupos MB0-MB1-MB2 similar a otras series(a). Al estratificar
las variables según media±2SD de CS, se demostró asociación significativa entre enfermedad autoinmune y ↑%CD8/CD38+
(Prueba Fisher, p=0,031), clínica infecciosa recurrente y ↑
%CD8/DR+ (p=0,05), e hiperplasia linfoide y ↑ %CD4/RA(p=0,026).
81
POSTERS
Conclusiones. El perfil de maduración/activación de linfocitos T
podría ser de utilidad para clasificar pacientes con IDVC. Su asociación c on distintas complicaciones clínicas es similar a la descrita por
otros grupos en base al perfil madurativo de linfocitos B, con la ventaja técnica añadida de contar para el análisis con poblaciones celulares cuantitativamente superiores (CD4 y CD8).
La combinación de ambos perfiles (con confirmación longitudinal) podría añadir precisión a los sistemas de clasificación propuestos
en la actualidad.
79. CÉLULAS REGULADORAS CD4+CD25+ ESPECIFICAS DE
ALERGENO EN PACIENTES ALÉRGICOS A ARTEMISIA
VULGARIS. Martínez Sánchez MV1, Salgado Cecilia MG1, López
Álvarez MR2, Muro Amador M2, Campillo Marquina JA2, García
Alonso AM2, Álvarez López MR2, Pagán Alemán J3, Minguela
Puras A2. 1Hospital Universitario Virgen Arrixaca. Servicio de Inmunología. 2Hospital U. Virgen Arrixaca. Servicio de Inmunología. Centro
de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). 3Hospital Universitario Virgen Arrixaca. Servicio de
Alergia.
Introducción. Las células reguladoras naturales CD4+CD25+ (nTr)
juegan un papel importante en el control de las diferentes facetas del
sistema inmunitario, incluidas las respuestas de hipersensibilidad tipoI. Numerosos trabajo han puesto de manifiesto que es posible detectar células nTr alergeno específicas en pacientes sensibilizados a diferentes sustancias. Por otro lado, nuestro grupo ha descrito que existe
una clara asociación del genotipo DRB1*01-DQB1*0501 con el asma
alérgico a Artemisia vulgaris.
Objetivo y métodos. El presente trabajo analiza si existen diferencias de cantidad, c alidad o funcionalidad de células nTr entre
pacientes alérgicos y controles sanos, a la vez que estudia, si la presencia del genotipo DRB1*01-DQB1*0501 puede afectar la función de
dichas células. Para ello, se han fenotipado por citometría de multiflourescencia las nTr en 6 pacientes alérgicos a Artemisia vulgaris y
6 controles sanos. Con métodos inmunomagnéticos (Dynal y Miltenyi) se han purificado células nTr y células efectoras CD25-/low, y
hemos ensayado su capacidad para suprimir respuestas alergeno
específicas in vitro.
Resultados. Las cifras (en porcentajes y en nº de células/μl) de nTr
CD4+CD25highCD127dim no muestran diferencias entre los pacientes alergicos y los controles sanos. Así mismo, atendiendo a la expresión de las moléculas CD29, CD49d, CD62L, CXCR3, CCR4, CCR5 y
CRTh2 tampoco se han podido describir diferenc ias fenotípicas aprec
iables. Por otro lado, la capacidad para suprimir la respuesta proliferativa a extractos de Artemisia vulgaris de las células nTr es similar en
los pacientes y controles (55% de supresión a un ratio 1:1). Sin embargo, este efecto es mucho mejor apreciable en pacientes y controles
DRB1*01-DQB1*0501, que son los que muestran las mayores respuestas frente al alergeno, a diferencia de los que tienen otro genotipo HLA
que apenas responden al extracto antigénico.
Conclusión. En principio no se detectan diferencias en el número, el fenotipo, o la capacidad de suprimir respuestas específicas de las
células nTr entre personas alérgicas a Artemisia vulgaris y los controles sanos. En la actualidad se está estudiando si, al menos, existen diferencias en la capacidad de las nTr para suprimir la secreción de factores solubles por las células alergeno específicas (los datos se presentarán en el poster).
82
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
80. REMISION DE LARGA DURACION DE LINFOMA NO
HODGKIN EN INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMUN
TRAS USO DE RITUXIMAB-CHOP. Carbone J1, Pérez-Fernández R2, Sarmiento E1, Angus B3, Rodríguez-Molina J1, Lanio N1,
Flores E2. 1Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañon. 2Servicio de Oncología. Hospital Gregorio Marañón. Madrid. 3Newcastle
upon Tyne NHS Foundation Trust, Newcastle.
La quimioterapia con R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, vincristina, adriamicina y prednisona) es un tratamiento aceptado para
pacientes con linfoma B difuso de células grandes (LBDCG). Sin embargo, pueden surgir dudas a la hora de indicar CHOP para tratar un linfoma si el paciente tiene una deficiencia primaria de anticuerpos e
infección recurrente. Presentamos un caso de IDVC complicada con
LBDCG tratado con R-CHOP. Datos clínicos: Varón de 20 años. Diabetes insulino-dependiente a los 13 años. Un episodio de sepsis por
SAMS con amputación de miembro inferior. 3 neumonías entre los 17
y 19 años. En el último episodio de neumonía se documentó pan-hipogammaglobulinemia (IgG 149, IgA 9, IgM <4 mg/dl); déficit de formación de anticuerpos; células B CD19+ 9% (252/mm3). Se estableció
el diagnóstico de IDVC e inició GGIV a dosis sustitutiva. El curso clínico se complicó 1 año después con la aparición de un LBDCG, estadío III-B con afectación masiva ganglionar periférica, mediastínica y
retroperitoneal. El diagnóstico se confirmó mediante IH de una adenopatía periférica (CD20+ CD79a+ BCL6+ CD10+ BCL2+; ciclina D1CD23- CD5-; tasa de proliferación celular ki67: 80%; hibridación in
situ para EBV–). El paciente fue sometido a 8 ciclos de tratamiento con
rituximab (375 mg/m2 IV), ciclofosfamida (750 mg/m2 IV), adriamicina (50 mg/m2 IV), vincristina (1.4 mg/m2 IV) y prednisona/metilprednisolona. Antes de cada ciclo de tratamiento se administró GGIV
a dosis de 400 mg/kg con la finalidad de mantener niveles de IgG por
encima de 400 mg/dl. No se presentaron complicaciones infecciosas.
Después del 6º ciclo de tratamiento se evidenció una disminución significativa de la hiperplasia linfoide. Tres años después de la última
dosis de R-CHOP no había evidencia de actividad del linfoma. El
inmunofenotipo de SP 3a post-rituximab es: CD19+/CD27+I gD-IgM: 9.8%; CD4+/RA-: 74%; CD8+/CCR7-: 90.6%; CD4+/CD38+DR+:
10,4%.
Conclusión. En el caso presentado de IDVC complicada con linfoma, el tratamiento con R-CHOP fue eficaz y bien tolerado.
81. REGISTRO ESPAÑOL DE INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (REDIP) ONLINE 2005-2008. Escobar Oblitas D, MartínezPomar N, Milà J, Cambra A, Matamoros N. Servicio de Inmunología. Hospital Son Dureta.
Introducción. Con objeto de facilitar el acceso y análisis, el Registro español de inmunodeficiencias primarias inicia, en el año 2005,
su versión online (http://web.hsd.es/redip)
Objetivo. Presentar los datos epidemiológicos de las inmunodeficiencias primarias (I DPs) registrados, dar a c onocer el REDIP online y fomentar la participación de los facultativos.
Metodología. La base de datos ha sido desarrollada con un
acceso limitado a la información básica para el público y un acceso exclusivo a la base de datos para los usuarios previamente registrados.
Resultados. El número de casos registrados hasta marzo de 2008
es 721. El porcentaje de casos registrados por comunidades autónomas
INMUNOLOGÍA
es: 46% Madrid, 24% Andalucía, 11% Islas Baleares, 7% Cataluña, 3%
Extremadura, 3% Murcia, 3% Aragón y 2% Comunidad Valenciana. La
distribución por grandes grupos de diagnóstico: deficiencias predominantemente de anticuerpos 73%, deficiencias del sistema del complemento 9%, síndromes de inmunodeficiencia bien definidos 9%,
defectos congénitos del número o función del sistema fagocitario 3%,
inmunodeficiencias combinadas 2%, enfermedades con disregulación
inmunológica 2% y otras inmunodeficienc ias primarias 2%. Las IDPs
con mayor número de casos por diagnóstico son: deficienc ia selectiva de IgA (300), inmunodeficiencia variable común (140) y la deficiencia de C1 inhibidor (54).
Conclusiones. Con el REDIP online se ha conseguido mayor difusión del conocimiento de las IDPs en nuestro país, ofrec iendo una
información básica para el público e información específica sobre demografía, características clínicas y tratamientos de las IDPs. El REDIP online agiliza y favorece la participación de los facultativos lo que contribuye a la consolidación del Registro Español de Inmunodeficiencias
Primarias.
82. SÍNDROME HEMOFAGOCÍTICO FAMILIAR SECUNDARIO
A MUTACIÓN EN EL GEN DE PERFORINA-1 (PRF-1). CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y MOLECULARES. Martínez Pomar
N1, Ferreira A2, García MC2, Escobar D1, Romo N3, Pons J1, Iglesias J1, Salinas JA4, López Botet M3, Fontan G2, Matamoros N1.
1Servicio de Inmunología. Hospital Son Dureta. 2Servicio de Inmunología. Hospital La Paz. 3Unitat d'Immunologia. Universitat Pompeu
Fabra. 4Servicio de Pediatría. Hospital Son Dureta.
La LHH es un desorden raro, autosómico recesivo, caracterizado
por proliferación generalizada, no maligna, de histiocitos con marcada actividad hemofagocítica. Las características clínicas incluyen
fiebre, hepatomegalia, citopenias y, menos frecuentemente, alteraciones del SNC. Los primeros episodios transcurren mayoritariamente
durante la infancia con una evolución fatal si no se realiza tratamiento. El 40% de los casos son debidos a mutaciones en el gen de la perforina-1 (PRF1) localizado en la región 10q22 del cromosoma 1. La perforina-1, de 70-75 kD, es la principal proteína citolítica localizada en
los gránulos de los linfocitos T citotóxicos y natural killer (NK). Se
presenta el caso de un varón de 2 meses de edad, nacido de padres
consanguíneos, que ingresó por fiebre de 1 semana de evolución e
hipoactividad. No antecedentes familiares. La exploración física revela, esplenomegalia y hepatomegalia. En la analítica inicial destacaba
plaquetopenia, anemia, alteraciones hepáticas (aumento de GPT, GGT
y bilirrubina), alteraciones de la coagulación e incremento de los niveles de LDH y triglicéridos. El aspirado de médula ósea (MO) presentó hemofagocitosis. Tratamiento: corticoides, ciclosporina, G-CSF,
profilaxis antibiótica, gammaglobulina endovenosa y medidas de
soporte. Actualmente se encuentra en lista de espera par a TMO. El
estudio molecular del gen PRF1 muestra la presencia, en homocigosis, de la mutación p.G149S, previamente descrita. Esta mutación no
se ha observado en 50 controles sanos. Mediante citometría de flujo,
no se observa expresión de perforina en células NK y linfocitos T
CD8+CD16+ del paciente y su madre, siendo la expresión normal
en el padre. El análisis molecular de los padres revela que ambos son
heterocigotos para la mutación. Está en curso la determinación de la
actividad citotóxica de las células NK del paciente y progenitores, así
como, la detección de perforina, mediante técnica de western blot, en
células de la madre y del paciente.
POSTERS
83. PSEUDO-BEHCET ASOCIADO A LINFOPENIA SEVERA,
AUTOINMUNIDAD E INFECCIONES. Botella Martínez C1,
Campillo JA1, Poza-Cisneros G2, Salgado-Cecilia G1, Muro M1,
García-Calatayud MC1, Martínez-García P1, Minguela-Puras A1,
Alvarez-López MR1, García-Alonso AM1. 1Servicio de Inmunología.
2Servicio De Medicina Interna. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
Paciente de 53 años HLA B-51 negativa, HIV negativa y sin antecedentes de ETS, que desde 2003 presenta aftosis urogenital recidivante. En 1992 se le diagnosticó epilepsia del lóbulo temporal relacionada con esclerosis mesial del lóbulo temporal. Actualmente sigue tratamiento anticomicial con buen control de sus crisis y sin objetivarse
cambios leucocitarios. En 11/2005 presento en brazo izquierdo parestesias, fenómeno de Raynaud, edema y sudoración de mano izquierda que desapareció al retirar reloj con aro de níquel. En 06/2005, tras
una tuberculosis miliar diagnosticada 3 meses antes, nos fue remitida para estudio inmunológico. Recibió tratamiento tuberculostático
1 año con buena evolución clínica.
El estudio inmunológico reveló un déficit de IgG4 (1 mg/dl), y
déficit parc ial de IgG2 (98 mg/dl), IgA (56 mg/dl) e IgM (50 mg/dl),
anticuerpos antinucleares 1/320 homogéneo, anti-nucleolares 1/80,
anti-células parietales gástricas 1/640 con anti Factor intrínseco negativo. Por otra parte, se observó una importante linfopenia 559
linfocitos/uL con 70% de células T, 39,6 T CD4+, 31% T CD8+, 2.3 células B, 18% células NK. Normal expresión de CD45RA, CD45RO, CD25
o DR y algo aumentada la población T TCRalfa-beta+CD4-CD8-. En
cultivos tras estimular linfocitos con ConA, anti-CD3 y anti-CD3+antiCD28 la respuesta proliferativa fue normal pero estaba disminuida con
PHA e IL-2 (30%)
Permanentemente se detectan en suero títulos altos de anticuerpos citotóxicos frente a los antígenos HLA I de su pareja detectados
por FlowPra y por cultivos de microcitotoxicidad “in vitro”. Éstos no
son citotóxicos los linfocitos propios y no han desaparecido tras tratamiento de IGIV a altas dosis. Ha tenido 3 embarazos, 1 aborto y no ha
reci bido transfusiones.
Dado que la linfopenia se va haciendo más severa (02/2008, 332
linfocitos/uL) profundizaremos en el estudio de la patofisiología de
estos procesos con el fin de poder tratarlos más adecuadamente para
evitar consecuencias indeseables.
84. UN CASO DE AGAMMAGLOBULINEMIA LIGADA A X
COMPLICADO CON UNA AMILOIDOIS SISTÉMICA TIPO
AA DE EVOLUCION FATAL. Lucas Aroca D1, Campillo JA1, García-Rodriguez MC2, García-Están J3, Rodrigo-Agudo JL4, LopezSolbes R5, Lopez-Hernández R1, Bernal-Ramos A1, Alvarez-López
MR1, García-Alonso AM1. 1Servicio de I nmunología. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. 2Servicio de I nmunología. Hospital
Universitario La Paz, Madrid. 3Servicio de Medici na Interna. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. 4Servicio de Medicina Digestiva Hospital Universitario Viregn de la Arrixaca. 5Servicio De Nefrología Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
Paciente nacido en 1980 que a los 2 años fue diagnosticado por
nosotros de Agammaglobulinemia con una IgG 25 mg/dl, IgM 10
mg/dl e IgA ausente y antecedentes clínicos de bronconeumonía bilateral masiva, sepsis por Pseudomonas, infección urinaria E. Coli., otitis y bronquitis recurrentes. Diagnosticado en 2000 de Agammaglobu-
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POSTERS
linemia ligada al sexo (XLA) con una mutación nonsense en el exón 12
del gen de la BTK (mutación c.1215C>A, cambio de aminoácido
p.Y361X, dominio SH2). En 1997 intervenido de bocio amiloide descartándose amiloidosis sistémica. Hasta 2004 asistió periódicamente
Inmunología del Hospital La Paz para control de tratamiento de IgG
endovenosa, antibióticos y fisioterapia respiratoria. En el 2006 ingresó en nuestro hospital por diarrea prolongada, dolor abdominal, malabsorción y malnutrición protéico-calórica por amiloidosis tipo AA o
secundaria que afectaba a riñón e intestino delgado observándose úlceras con depósitos amiloides, aislándose en heces Clostridium difficile y Giardi a lamblia. En 2007 entró en hemodiálisis. Nos fue enviado
en Noviembre de 2007 y observamos que había mantenido bajas tasas
de IgG sérica (386 mg/dl 08/2006, 414 mg/dl 07/2005) y ajustamos
tratamiento. En ese momento presentó 483 mg/dl IgG sérica (no en el
valle), ligera leucocitosis neutrofílica. Las poblaciones de células T y
NK eran normales y apenas había linfocitos B (< 0,7%). El cociente
CD4/CD8 era 1.39, la población T CD3+8+57+ estaba aumentada y
parte de la población T estaba activada. La oxidación de los PMN estaba algo reducida. La Amiloidosis AA es una complicación rara en la
XLA y no se conoce muy bien su patogénesis pero, sin descartar posibles factores genéticos que influyan en su desarrollo, es evidente que
las infecc iones recurr entes son el principal factor etiológico en la mayoría de los casos por lo que es necesario una sistemática evaluación
inmunológica y el control adecuado del tratamiento en los pacientes
inmunodeficientes para prevenir infecciones.
85. ERRADICACION DE INFECCIONES FUNGICAS RESISTENTES EN INMUNOSUPRIMIDOS: TERAPIA COADYUVANTE
CON INMUNOGLOBULINAS INTRAVENOSAS. Sarmiento
E1, Acero A2, Balado P2, Pelaez T3, Fernández-Yañez J4, FernándezCruz E1, Carbone J1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio de Oftalmología. 3Servicio de Microbiología. 4Servicio de Cardiología. Hospital Gregorio Marañon. Madrid.
Presentamos dos casos de pacientes trasplantados que desarrollan
infecciones fúngicas severas.
Caso 1. Aspergilosis invasiva renal y prostática (suelen requerir
resección quirúrgica). Varón de 61 años trasplantado cardíaco. Inmunosupresión: daclizumab, micofenolato mofetil, tacrolimus y prednisona. Por discordancia CMV (D+/R-) recibió ganciclovir y GG hiperinmune anti-CMV (12 sem). Infecciones: 14d post-trasplante: bacteriemia por pseudomona aeruginosa e infección respiratoria por HIB y
SAMR. 6m: infección CMV. 9m: TAC: nódulos hipodensos en próstata y riñones, PAF: aspergillus fumigatus confirmados en cultivo y biopsia. Persiste sintomático pese a voriconazol. Por hipogammaglobulinemia y disminución de ac específicos se añade GGIV sustitutiva (300
mg/Kg/21d). Ac específicos al mes post-tranplante y tras GGIV: IgG
(454 y 800-1200 mg/dl); anti-HBs (16 y 212 mU/ml); anti-polisacárido
de neumococo (2.5 y 48.8 mg/dl); anti-tétanos (0.2 y 4.9 mg/dl); antiCMV (597 y 7996, respectivamente).
Resultado. Desaparición de todas las lesiones en TAC sin requerir cirugía.
Caso 2. Micosis corneal unilateral por fusarium solanii multirresistente. Mujer de 27 años. Tras 6m de tratamiento con distintos antimicrobianos acude c on perforaci ón corneal requiriendo queratoplastía. Por rechazo recibe ciclosporina, corticoides tópicos y orales además de voriconazol, pero ocurre invasión fúngica agresiva del injerto.
Se realiza 2º queratoplastía y recibe tratamiento tópico con distintos
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VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
antifúngicos sistémicos, anfotericina B y ciclosporina tópicos, sin corticoides locales y sistémicos. Por persistencia de riesgo de diseminación, actividad de rechazo y detección de IgG3 baja (14.7 mg/dl) se
decide añadir GGIV a alta dosis (niveles de IgG: 1660-3100 mg/dl
durante 3 meses).
Resultado. Se observa negativización de cultivo. 1 año tras la queratoplastía no hay reci diva infecciosa. Existe evidencia experimental
del rol de la inmunidad humoral específica contra antígenos fúngi cos.
Conclusión. El tratamiento con GGIV actuaría c omo coadyuvante en la erradicación de infecc iones fúngicas invasivas y/o resistentes
en pacientes inmunosuprimidos con déficits de anticuerpos.
86. ESTUDIO DE SÍNDROME AUTOINMUNE LINFOPROLIFERATIVO (SALP) POR CITOMETRIA DE FLUJO. Maruri N1,
Luque I1, Bilbao A2, García JM2, Riñón M1, Prada A1, Arrieta A1.
1Servicio de Pediatría. 2Unidad de Oncología infantil e Inmunoalergia.
Hospital de Cruces. Vizcaya.
Objetivo. La presentación de un caso diagnosticado de S. Autoinmune Linfoproliferativo (OMIM 601859). Inmunodeficiencia Primaria
en la que existe una alteración en la regulación sistema inmune. La base
inmunológica de este trastorno es un defecto en la apoptosis de los linfocitos que da lugar a una acumulación de los mismos en el sistema
inmune. Existe riesgo evolutivo de desarrollo de enfermedades autoinmunes y linfomas. Los 3 criterios diagnósticos requeridos son: 1) Clínica de linfadenopatia crónica no maligna ± esplenomegalia de más de 6
meses de evolución; 2) Porcentaje de linfocitos T α/β + doble negativos (DN) superior al 1%; 3) Defecto en la apoptosis celular.
Pacientes y métodos. Paciente de 13 años en seguimiento por esplenomegalia con antecedentes de hipertrofia de adenopatías cervicales
e hipergammaglobulinemia. El padre y la hermana han sido diagnosticados de esplenomegalia. Se determina el fenotipo linfocitario en
el paciente, ambos padres y hermana. Se realiza estudio funcional de
apoptosis en el paciente. Los linfocitos doble negativos (CD3+α/β+CD4CD8-) se cuantifican con anticuerpos monoclonales por citometría de
flujo (CF). Para el estudio funcional de la apoptosis se cultivan los linfocitos en presencia de IL-2 y de fitohemaglutinina a dosis subóptimas,
la apoptosis se induce con anti-CD95 y se realiza la cuantificación de
anexina por CF. El defecto de apoptosis se analiza con el test de Kolmogoroff-Smirmoff.
Resultados
Esplenomegalia
LT CD4-CD8- (%)
Apoptosis
Paciente
Hermana
Madre
Padre
Ecografía
16%
Defecto
Exploración
6%
Pendiente
Ausente
1%
Pendiente
Exploración
6%
Pendiente
Conclusiones
a) El niño cumple criterios de SALP. Es probable que estén afectos la
hermana y el padre.
b) La presencia de esplenomegalia y/o adenopatías persistentes no
malignas justifica descartar esta entidad sobre todo si existen antecedentes familiares.
c) El diagnóstico facilita el seguimiento de los pacientes por existir
un alto riesgo de desarrollar linfomas y enfermedades autoinmunes.
INMUNOLOGÍA
POSTERS
87. FAMILIA CON MUTACIÓN C104R EN TACI, HIPOGAMMAGLOBULINEMIA DE DIAGNÓSTICO TARDÍO Y AUTOINMUNIDAD. Bernal MJ, Martínez Pomar N, Martínez de Saavedra M, Nieto A, Matamoros N, Brieva JA, Sampalo A. Servicio de
Inmunología. H. Puerta del Mar, Cádiz.
Recientemente se ha realizado el diagnóstico de Inmunodeficiencia variable comun (CVID) en dos hermanas (H1 y H2) de 53 y 67 años.
Ambas acudieron a consulta por neumonías (4 y 3 episodios, respectivamente) y otras infecciones recurrentes, no graves, de vías respiratorias superiores (aprox.10 años de evolución). Las dos debutaron al
diagnóstico con hipogammaglobulinemia moderada (IgG. 399 y 488
mg/dl, respectivamente), número normal de linfocitos B, fenotipo MB2
y fenómenos autoinmunes asociados. En el caso índice (H1) se detectó la mutación C104R en homocigosis en el gen que codifica la proteina TACI.
En el cribado familiar se detectó un sobrino de 30 años con hipogammaglobulinemia moderada y un sobrino-nieto (18 meses) con gastroenteritis recurrentes y baja concentración de IgA. La incidenc ia
de fenómenos autoinmunes fue asimismo notable: eritema nodoso
recurrente en H1, ANA+ y anticuerpos anticélulas parietales+ a título
elevado en H2, madre y dos hermanos varones de las pacientes con
diabetes tipo I de curso severo y una hija de H1 con anticuerpos antiperoxidasa tiroidea. Se mostraran los resultados del estudio de la mutación en TACI de toda la familia.
Estos casos confirman la heterogeneidad de presentación clínica
de los defectos de TACI, con cuadros clínicos prácticamente indiferenciables del cajón de sastre de hipogammaglobulinemias primarias de
etiología no conocida que comunmente denominamos inmunodeficiencia variable comun. En esta familia llama la atención el fenotipo
atenuado y tardío de inmunodeficiencia y la acumulación de eventos
autoinmunes.
SESIÓN 6: CÉLULAS B Y NK
Moderadores: Dra. África González (Vigo),
Dr. Miguel López-Botet (Barcelona)
88. EVOLUCIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE LOS GENES KIR
DE CÉLULAS “NATURAL KILLER” EN POBLACIONES MUNDIALES. Middleton D1,2, Meenagh A1, Mosocoso J3, Arnaiz-Villena A3. 1Northern Ireland Regional Histocompatibility and Immunogenetics Laboratory, City Hospital, Belfast, Northern Ireland. 2School of
Biological Sci ences, University of Ulster, Coleraine, Northern Ireland.
3Dept. Inmunología, Universidad Complutense, Centro de Transfusión
de la Comunidad de Madrid, Madrid.
En los últimos años se han estudiado intensivamente los genes de
las células NK (Natural Killer) KIR y su interacc ión con los ligandos
HLA. Es un fenómeno sin explicación funcional la presencia o ausencia de algunos de estos genes y, en algunos casos, también la frecuencia de ellos y de sus alelos en distintas poblaciones. El objetivo de nuestro trabajo es ver los factores que han influido en la evolución de las
frecuencias de genes y alelos KIR en determinadas poblaciones, que
pueden ayudar a comprender la función global y evolución del sistema de estos receptores NK KIR. En este estudio, se ha analizado la presencia o ausencia y las frecuencias alélicas de genes KIR en individuos
de siete poblaciones representativas de cada continente del mundo:
Cubanos,Brasileños, Omanís, Chinos de Hong Kong, Chinos de Singapur, Xhosa de Sur África y San de Sur Áfr ica y se han comparado
con poblaciones Caucasoides, Negroides y Mongoloides del resto del
mundo (total de 5.734 cromosomas). Muchos patrones de sondas de
oligonucleótidos específicas de secuencia muestran alelos nuevos, cada
uno propio de una población determinada, lo que pone de manifiesto
la divergencia de las frecuencias de estos genes y sus alelos en las distintas poblaciones. Se obtuvieron las frecuencias de los genes KIR en
las siete poblaciones mencionadas y a partir de las distancias genéticas se construyeron dendrogramas Neighbour-Joining y se elaboraron
análisis de correspondencia. Así mismo, se comparó la presencia o
ausencia de 17 loci de KIR de este estudio con la presencia o ausencia
de esos mismos loci en 56 poblaciones de todo el mundo. Tras los análisis realizados, se observa cómo los individuos aparecen agrupados
de acuerdo con un gradiente geográfi co. Se discuten la relación de la
evolución de frecuencias KIR con las frecuencias de los genes HLA y
los mecanismos y factores evolutivos que actúan sobre los genes KIR.
89. EFECTOS DEL TNF/LT Y CÉLULAS B EN EL PROCESO DE
DIFERENCIACIÓN DE FDC. Muñoz Fernández R, Tirado González I, Blanco Muñoz O, de la Mata C, Leno Durán E, Ortiz Ferrón
G, Abadía Molina AC, García Olivares E. Centro de Investigación
Biomédica.
Introducción. Las células foliculares dendríticas (follicular dendritic cells, FDC) son un tipo celular que se localiza en los folículos linfoides de los órganos linfoides secundarios. Se encuentran en íntimo
contacto con las células B formando clusters. El desarrollo de las FDC
depende del correcto funcionamiento de los folículos, hecho que depende directamente de las interacciones célula B- FDC, así como de las
señales mediadas por TNF/LT en las FDC.
Objetivos. Estudio de la expresión de antígenos relacionados con
la diferenciación de FDC c omo consecuencia del tratamiento de FDC
con LT/TNF(10ng/ml), así como del co-c ultivo con células B (Raji) de
manera individual durante 72h.
Metodología. FDC fueron obtenidas de amígdalas, y cultivadas.
En su fase exponencial de crecimiento se trataron con LT/TNF o fueron cocultivadas con Raji. Mediante citometría de flujo se estudió la
expresión de los marcadores STRO-1 y CD34 (marcador de inmadurez) y CD14, ICAM-1 Y VCAM-1(marcadores de madurez).
Resultados y conclusión. Tanto en las células tratadas con LT/TNF
como con las cocultivadas con Raji, se produjo un descenso de CD34
y STRO-1(marcador estromal), así como un aumento ICAM-1, VCAM1 y CD14. Estos resultados parecen indicar que la diferenciación de las
FDC y por tanto que puedan llevar a cabo de forma correcta su función, depende de la presencia de las células de las células B y de las
citoquinas LT/TNF presentes en los folículos linfoides.
90. ESTUDIO DE LA ESPECIFICIDAD FUNCIONAL DE AID.
Pérez-Durán P, Ramiro AR. Centro de Nacional de Investigaciones
Oncológicas.
La hipermutación somática (SHM, del inglés Somatic HyperMutation) y el cambio de isotipo (CSR, del inglés Class Switch Recombination) son los mecanismos moleculares que dan lugar a la diversificación secundaria de anticuerpos en centros germinales. La enzi-
85
POSTERS
ma AID (del inglés Activation Induced Deaminase) inicia la SHM y
el CSR a través de la deaminación de citosinas en el locus de inmunoglobulinas, que desencadena la fijación de una mutación (SHM) o la
generación de una rotura de DNA seguida de un proceso de recombinación (CSR). Se ha demostrado que las lesiones iniciadas por AID
pueden generar translocaciones cromosómicas y que su actividad puede introducir mutaciones en diversos genes, además de los de inmunoglobulinas. Aunque la regulación de AID parece por tanto esencial
para evitar la generación de lesiones linfomagénicas, los mecanismos
que determinan su especificidad no están definidos. El único requerimiento imprescindible conocido hasta la fecha para que un gen sea
susceptible de ser mutado por AID es que esté transcripcionalmente
activo.
Para tratar de esclarecer la especificidad funcional de AID hemos
establecido un sistema experimental de “promoter traping”. Utilizamos una construcción con un casete reportero sin promotor con el que
podremos “cazar” genes transcripcionalmente activos y monitorizar
las mutaciones inducidas por AID. Esta aproximación nos permitirá
1) relacionar la actividad transcripcional de un gen con su susceptibilidad de ser diana de AID, 2) determinar el sitio de inserción de la
construcci ón dentro del genoma y 3) analizar las secuencias ci s reguladoras de los loci susceptibles.
91. DOCK10, NUEVA PROTEÍNA INDUCIBLE POR IL4. Yelo E1,
Gimeno L1, Bernardo MV1, Alcaraz MJ1, Majado MJ2, Álvarez MR1,
Parrado A1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio de Hematología. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.
Introducción. La IL4 es una citoquina que interviene en el control
de la proliferación, expresión génica y apoptosis. Además, la IL4 prolonga la supervivencia de células LLC-B cultivadas in vitro. Estudiando el efecto en la expresión génica de la IL4 en muestras de pacientes
con LLC-B, identificamos una nueva proteína inducible por esta citoquina: Dock10. Dock10 pertenece a una nueva familia de proteínas
caracterizadas por ser activadoras de las Rho-GTPasas. Dock10 presenta dos homólogos estructurales en humanos: Dock9 y Dock11.
Objetivos. Estudio de la expresión tisular y subcelular de Dock10
y su inducción por I L4 en muestras sanguíneas normales y patológicas.
Metodología. La distribución tisular de Dock10 se estudió por RTPCR y Norhern-Blotting. El análisis de la expresión subcelular de la
proteína se determinó mediante Western-Blotting e inmunofluorescencia. Se construyeron plásmidos con expresión inducible de Dock10 y
se obtuvieron clones estables de la línea celular K562. Para el análisis
de la apoptosis en muestras celulares de pacientes en cultivo con y sin
I L4, se empleó la citometría de flujo.
Resultados. Se encontró que Dock10 presentaba altos niveles de
expresión en linfocitos T y B. Dock11 presenta una distribución tisular
similar, mientras que Dock9 no presenta una expresión significativa
en linfocitos B. Dock10 se localizaba tanto en citoplasma como en el
núcleo.La expresión de Dock10 se ve inducida ante la presencia de IL4,
sin embargo este efecto no ocurre en ninguno de sus homólogos. La
inducción de la expresión de Dock10 por IL4 se observa en linfocitos
B normales y LLC-B, no produciéndose en los linfocitos T ni en otros
tipos de leucemias. La adición de IL4 reduce el porcentaje de apoptosis en LLC-B, sin embargo, esto no ocurre en LLA-B.
Conclusiones. DOCK10 es un nuevo factor con alta expresión en
linfocitos que se induce por IL-4 específicamente en células B. El estu-
86
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
dio de la función de DOCK10 podría ayudar a entender las actividades biológicas de la IL4.
92. CARACTERIZACION INMUNOFENOTIPICA Y FUNCIONAL
DE LOS LINFOCITOS NK EN UN PACIENTE CON LINFOCITOSIS CRONICA DE CELULAS LGL/NK, PORTADOR DEL
POLIMORFISMO C77G. Gil Herrera J1, Diaz Alderete A1, Modrego Ruiz J1, Vazquez-Piñeiro T2, Polo Casado A3, Fernández-Cruz
E1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio de Estomatología. 3Servicio de
Medicina Interna. Hospital General Universitario "Gregorio Marañón".
Madrid.
Introducción. La linfocitosis crónica de células NK (LCCNK) se
caracteriza por el aumento de las células NK circulantes durante más
de 6 meses y curso clínico indolente. La sustitución de C por G en la
posición 77 del exón 4 del gen CD45 (C77G) causa procesamiento anormal del ARNm y un patrón variante de coexpresión de las isoformas
CD45RA y CD45RO sobre la superficie de las células T de memoria
circulantes. La prevalencia de C77G en nuestra población sana es de
un 1,1%. La descripción de tres portadores de C77G entre pacientes
diagnosticados de linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH), podría indicar la contribución de este polimorfismo a la patogenia de los defectos de citotoxicidad.
Paciente y Métodos. Varón de 63 años, asintomático con antecedentes de diabetes no insulinodependiente, focos infecciosos dentarios y un
episodio de herpes zoster, estudiado en el Servicio de Inmunología
por linfocitosis documentada de dos años de evolución. Bioquímica,
serología viral y TAC toracoabdominal sin hallazgos. Niveles séricos de
inmunoglobulinas, complemento y autoanticuerpos en rango normal.
Análisis del inmunofenotipo linfocitario por citometría de flujo de cuatro colores (Becton&Dickinson). Amplificación del DNA genómico y
análisis del exon 4 del gen CD45 mediante secuenciación automática.
Ensayo de citotoxicidad NK por liberación de Cr51 de células K562.
Resultados. El paciente presentaba un aumento del número de
linfocitos NK circulantes (6.7 x 103 células/ml) con un perfil inmunofenotípico homogéneo: CD2+CD7+CD8+/-CD16+/-CD122+ D158a+
perforina+granzimaB+. El patrón de coexpresión variante de las isoformas de CD45 se correspondía con el cambio C77G. Las células circulantes del paciente mostraron actividad citotóxica NK conservada
respecto a los controles sanos.
Conclusiones y Discusión. Se trata de una LCCNK que requiere
seguimiento clínico e inmunológico. Se aportan por primera vez datos
sobre la actividad NK en un individuo portador del polimorfismo
C77G. Aunque en este paciente las alteraciones del splicing inducidas
por C77G no alteran la actividad citotóxica de las células NK, la expresión anormal de las isoformas de CD45 puede haber influido sobre
otros aspectos del funcionamiento del sistema inmune contribuyendo
al desarrollo y/o mantenimiento de la linfocitosis c rónica LGL/NK.
93. ALTERACIONES FUNCIONALES EN LAS CELULAS iNKT EN
EL NVEJECIMIENTO. Gayoso I1, Peralbo E1, Pita ML1, Tarazona R2, Solana R1. 1Departamento de Inmunología. Hospital Universitario Reina Sofía. Universidad de Córdoba. 2Departamento de Fisiología (Área Inmunología) Universidad de Extremadura. Cáceres.
Introducción. Está ampliamente descrito que la respuesta inmune se encuentra afectada con la edad, proceso denominado inmunose-
INMUNOLOGÍA
nescencia, que afecta a las diferentes componentes de la respuesta inmune. Recientes estudios realizados en nuestro laboratorio han incluido
a las células “invariantes NKT” (iNKT) dentro de las poblaciones afectadas por el proceso de inmunosenescencia. Las células iNKT en humanos se caracterizan por la co-expresión del receptor NK CD161 y por
la expresión de un receptor T (TCR) formado por una cadena Vα24JαQ
y una cadena Vβ11 que reconoce antígenos glucolopídicos presentados por un MHC-I no clásico denominado CD1d. El gluolípido α-Galactosil Cerámida (α-GalCer) esta identificado como un potente inductor
de la activación de las células iNKT vía TCR. De acuerdo con la expresión de los marcadores CD4 y CD8 las células iNKT se pueden dividir
en tres subpoblaciones: iNKT-CD8+, iNKT-CD4+ e iNKT-Dobles Negativas. Tras la activación de su TCR, las células iNKT proliferan liberando citoquinas tipo Th1 y Th2. Las células iNKT actúan durante la respuesta innata del sistema inmune y está demostrada su implicación
en la eliminación de tumores y en enfermedades autoinmunes en diferentes modelos experimentales.
Objetivos. Estudio ex vivo del fenotipo y función, secreción de
citoquinas y proliferación, de células iNKT en sangre periférica procedente de donantes jóvenes y ancianos sanos.
Metodología. Se obtuvieron las PBMCs de donantes jóvenes (1835 años) y ancianos (70-95 años) sanos. La identificación de las iNKT
se analizó mediante fluorescencia multiparamétrica. Se utilizaron AcMo
anti-Vα24, anti-Vβ11, CD8, CD4, y otros marcadores de diferenciación,
así como anticuerpos anti-IFN-γ e IL-4. Para analizar la secreción de
citoquinas las PBMCs se incubaron con PMA, Ionomicina y Brefeldina durante 6 horas La capacidad proliferativa se determinó mediante el marcaje con CFSE. Las células marcadas con CFSE se sembraron
en medio de cultivo durante 5 días con IL-2 y α-GalCer.
Resultados y Conclusiones. Transcurridos 5 días de cultivo in
vitro de las células iNKT-CFSE observamos una mayor proliferación
en donantes jóvenes con respecto a los ancianos. Cuando observamos
la proliferación de las diferentes subpoblaciones de iNKT vimos como
las células CD4-NKT son las que principalmente proliferan en jóvenes
aunque también hay proliferanción de las otras dos subpoblaciones
pero menor. Cuando obserbamos la proliferación en ancianos vemos
como la subpoblación CD4-NKT es la única que presenta cierta proliferación aunque menor que en jóvenes.
Cuando analizamos la secreción de citoquinas por las células NKTi
tras estimularla con KRN vemos una disminución de la secreción de
IFN-γ en células NKTi de ancianos mientras que la IL-4 no muestra
diferencias significativas. Cuando estudiamos la secreción en cada una
de las subpoblaciones de NKT encontramos un descenso significativo
de la secreción de IFN-γ en la subpoblación CD8-NKT y de IL4 en la
subpoblación DN-NKT. La subpoblación CD4-NKT no presenta cambios significativos en la secreción de ambas citoquinas.
El descenso de la capacidad proliferativa de las células iNKT de
ancianos y el descenso de producción de IFN-γ y IL-4 indican que las
células iNKT se encuentran entre las poblaciones linfocitarias afectadas por la inmunosenescencia.
94. EXPRESION DE RECEPTORES ASOCIADOS A CITOTOXICIDAD EN CELULAS NK DE ANCIANOS. Gayoso I1, Peralbo E1,
Pita ML1, Sánchez B2, Tarazona R2, Solana Lara R1. 1Universidad
de Córdoba. 2Universidad de Extremadura.
Las células NK son una población heterogénea de linfocitos definidas por un fenotipo de membrana CD3-CD56+ que se caracteri-
POSTERS
zan por su capacidad para lisar gran variedad de tipos celulares transformados o infectados por virus. Las células NK son un componente muy importante de la respuesta innata, tanto por su función efectora como por su función reguladora, actuando como enlace con la
iniciación de la respuesta inmune adaptativa. El envejecimiento afecta el numero y funci ón de células NK. Se han definido diferentes cambios en las células NK asociados a la edad como son el incremento en
ancianos del porcentaje de células NK con fenotipo maduro (CD56dim),
el descenso de la respuesta a IL-2 y a otras citoquinas o la disminución de la expresión de CD69. Las células NK poseen receptores de
membrana encargados de la activación o inhibic ión de su función
citotóxica. El balance entre señales activadoras e inhibitorias determina la activación o no de la citotóxicidad de las células NK. En este trabajo hemos analizado la variación asociada a la edad de dichos receptores y su influencia sobre los cambios en la capacidad funcional de
las células NK en ancianos. Para la realización de este estudio se tomaron las PBMCs de donantes voluntarios jóvenes (18-35 años) y ancianos (70-95 años) sanos. Se identificaron las células NK por citometría
de flujo y se analizó la expresión de los receptores NK activadores e
inhibidores en las diferentes subpoblaciones de NK en voluntarios
jóvenes y ancianos sanos Los resultados demuestran que las células
NK de ancianos poseen un descenso en la expresión del receptor
NKp30 y un incremento en la expresión del receptor NKp44. El descenso de la expresión de NKp30 puede contribuir no solo al descenso en la capacidad ci totoxica natural de estas células asociada a la
edad, sino que, dado el importante papel de este receptor en la interacción de células NK con células dendríticas, puede influir en las alteraciones en la inic iación de la respuesta inmune adaptativa observadas en ancianos.
95. ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL LRC
(LEUKOCYTE RECEPTOR COMPLEX) EN LA ESCLEROSIS
MÚLTIPLE. Ordóñez D1, Sánchez AJ2, Ramil E2, García-Merino
A2, Vilches C1. 1Inmunología. 2Laboratorio de Neuroinmunología. Hospital Universitario Puerta del Hierro.
La Esclerosis Múltiple es una enfermedad desmielinizante, inflamatoria y neurodegenerativa que presenta distintas formas evolutivas. Aunque no se conoce su causa, la enfermedad parece ser desencadenada por factores tanto genéticos como ambientales. La patogenia tiene un componente autoinmune que podría surgir tras una
infecc ión por virus de la familia Herpesviridae. En cuanto a su base
genética, existe una fuerte asociación con los genes HLA (6p21,
DRB1*1501). También están descritas asociaciones con regiones de
otros cr omosomas, incluyendo el cromosoma 19, donde se localiza el LRC (Leukocyte Receptor Complex - 19q13.4). El LCR codifica
para r eceptores que activan o inhiben diferentes subpoblaciones
leucocitarias linfoides y mieloides. Estos receptores, al expresarse
en células del Sistema Inmunológico que contri buyen a la defensa
frente a Herpesvirus, podrían participar en el origen o el desarrollo
de la esclerosis múltiple. Entre ellos se incluyen los Leukocyte Immunoglobulin-like Receptors (LILR, también conocidos como Ig-like
Transcripts - ILT), los Leukocyte-Associated Ig-like Receptors (LAIR)
y los Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors (KIR), que muestran una gran variabilidad genética individual. Presentaremos un
análisis de la posible asociación de la forma Recurrente-Remitente
de Esclerosis Múltiple, con algunos polimorfismos genéticos localizados en el LRC.
87
POSTERS
96. EXPRESION DE CD148 Y CD84 EN LEUCEMIA LINFATICA
CRONICA. Gaya A1, Bargay J2, Mascaro M2, Cladera A2, García
M3, Arbos A1, Calvo J1. 1Banc de Teixits. F. Banc de Sang i Teixits de
les Illes Balears. 2Servicio de Hematología. Hospital Son Llatzer. 3Servicio Anatomía Patológica.
A pesar de tener varias caracteristicas de linfocitos B “naive”,
las celulas de leucemia linfatica cronica (LLC) en ocasiones prersentan mutaciones en los genes de la region variable de las inmunoglobulinas (IgVH) que las definiria como linfoc itos B memoria. Especialmente relñevante es que la presencia de mutaciones en IgVH
se asocia a un mejor pronostico respecto a la evolución de la enfermedad. Por otra parte, se ha descrito que los linfoci tos B "naive" y
con el gen IgVH no mutado carecen de la expresión de CD148 y
muestran una baja expresión de CD84, a diferencia de los linfocitos B memoria con IgVH mutado que si expresan CD148 y CD84high.
Con el fin de analizar la posible correlación entre la expresión de
CD148 y CD84 con la presencia/ausencia de mutaciones en IgVH,
en el presente estudio hemos caracterizado un total de 20 LLC, 9 sin
mutaciones en el gen IgVH (linfocito B "naive") y 11 con mutaciones
en IgVH (linfoci to B memoria).Todas las LLC analizadas mostraron
un patrón de expresión de CD148 homogeneo, sin diferenc ias apreci ables entre las que tenian mutaciones en VH frente a las que mantenian la secuencia inalterada. Por otra parte, se ha comprobado que
la intensidad de expresión de CD148 en las celulas leucémicas
CD19+CD5+ es equivalente al de las células B normales de sangre
periferica. Tambien en las LLC se ha comprobado que la intensidad
de expresión de CD148 es mayor en los linfocitos B que en los linfocitos T, tal como habíamos descrito anteriormente para linfoci tos
normales de sangre periferica. Asimismo se ha estudiado la posible
perdida de heterozigosidad del gen CD148 en las LLC analizadas.
Los ensayos de LOH se han llevado a cabo utilizando microsatélites localizados a lo largo del segmento cromosómico 11p11-12:
D11NKI02, D11S4183, D11NKI01, D11S1326, D11S1784, D11S4117 y
D11S1350. Los r esultados obtenidos no muestran perdida de heterozigosidad del gen CD148 al comparar muestras de DNA normal
y neoplásico. Este resultado concuerda con la expresión homogenea
y de intensidad equivalente a la de celulas normales demostrada por
los estudios de citometria de flujo.
Respecto al CD84, el análisis del patrón de expresión no evidencia diferencias apreci ables entre las LLC que presentan mutaciones
en IgVH frente a las que mantienen el gen IgVH inalterado, ni tampoco entre las que expresan zap70 y aquellas que no lo hacen. En
resumen, la expresion de CD148 y CD84 es homogenea en los linfocitos B de LLC no permitiendo distinguir el estatus naive o memoria
de los mismos.
97. FORMACIÓN DE TEJIDO LINFOIDE ECTÓPICO EN LA
PARED ARTERIAL DE LOS ANEURISMAS DE AORTA ABDOMINAL. Ocaña E1, Pérez-Requena J2, Bohorquez JC3, Brieva JA1,
Rodríguez C1. 1Servicio Inmunología. 2Servicio Anatomía Patológica.
3Servicio Cirugía Vascular. Hospital Universitario Puerta del Mar.
Cádiz.
Introducción. Los aneurismas de aorta abdominal (AAA) son una
patología cardiovascular común cuya rotura tiene una mortalidad global superior al 50%. Hay evidencias de la etiología inflamatoria de los
AAA y del papel patogénico de los infiltrados inflamatorios.
88
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Objetivos. Estudiar las características de las estructuras linfoides
presentes en la pared arterial de los AAA.
Pacientes y métodos. Se estudiaron 25 pacientes sometidos a
cirugía reparadora electiva, de los que se obtuvieron muestras de
aorta. También se estudiaron 3 muestras de aorta sana. Se realizaron estudios inmunohistoquímicos y de inmunofluorescencia sobre
las muestras de aorta y análisis mediante microscopia confocal. Se
analizó la expresión de diferentes moléculas (CD3, CD20, CD68,
CD38, CD31, CD21, Ki 67, cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas)
Resultados y conclusiones. Más del 90% de las muestras mostraron signos de inflamación crónica en. Los infiltrados inflamatorios se
localizaban fundamentalmente en la adventicia y en 1/3 de las muestras se extendían a la capa media. Los infiltrados inflamatorios formaban agregados heterogéneos compuestos fundamentalmente de células CD3+ y/o CD20+. En algunas áreas, situadas generalmente en la
adventicia, se identificaron estructuras linfoides complejas que remedaban órganos linfoides secundarios: I). Los linfocitos T y B estaban
localizados en áreas separadas. II) En un 20% de casos se encontraron centros germinales-like (CG), definidos por la presencia de células B IgD- y Ki67+. III) Los CG contenían una red de células dendríticas foliculares (CD21+). IV) En la zona externa de las estructuras linfoides se observaban abundantes células plasmáticas (CP) (CD38+).
Las CP estaban adheridas a una red prominente de capilares. V) Se
observaban fenómenos de neovascularización en las capas media y
adventicia.
Este estudio muestra la formación de tejido linfoide ectópico
en la pared arterial de los AAA y apoya la etiología inflamatoria de
los AAA.
98. ANÁLISIS COMPARATIVO DE DIFERENTES SUBPOBLACIONES B DE MEMORIA CIRCULANTES EN INDIVIDUOS
SANOS. Rodríguez Bayona B, Rodríguez C, Brieva JA. Hospital
Universitario Puerta del Mar. Cádiz.
Las células B de sangre periférica (SP) pueden dividirse en dos
grandes compartimentos atendiendo a la expresión del marcador CD27,
cuya presencia se asocia a la existencia de mutaciones en los genes
de las inmunoglobulinas. El compartimento CD27- comprende una
subpoblación näive mayoritaria (CD27- IgD+ ) y una subpoblación
minoritaria (CD27- IgD-) r ecientemente asociada a una función de
memoria efectora. Dentro de las células B CD27+ podemos diferenciar
dos subpoblaciones de memoria atendiendo a la expresión de IgD:
memoria “switch” (CD27+ IgD-) y memoria “no switch” (CD27+ IgD+).
El objetivo de este estudio consistió en la caracterización fenotípica y
funcional de las distintas poblaciones B de sangre periférica de individuos sanos.
Para ello se purificaron células mononucleares de SP por centrifugación en gradiente de Ficoll y se procesaron para su análisis por citometría de flujo. Se analizó la expresión de diversas moléculas de adhesión, receptores de quemoquinas, moléculas de coestimulación, receptores de muerte celular y de supervivencia. Se encontró un gradiente
creci ente de expresión de CXCR3, CD95 y TACI en la direcci ón naive-no switch-switch. Asimismo hallamos diferencias de expresión de
distintas moléculas de adhesión y de coestimulación entre células naive y memoria. La mayor expresión de CD95 en células de memoria no
se traducía en una mayor susceptibi lidad a sufrir apoptosis espontánea ni inducida por antic uerpos anti-CD95. Estos datos sugieren la
INMUNOLOGÍA
existencia de un gradiente madurativo entre las diferentes poblaciones de células B de memoria.
99. DIFERENCIAS EN LA HIPERMUTACIÓN SOMATICA DE LOS
SEGMENTOS CDR1 Y CDR2 DE GENES IGVH DE CÉLULAS
PLASMÁTICAS HUMANAS. Jiménez Gómez G, Gómez Perales
JL, Ramos-Amaya AB, Medina F, Campos-Caro A, Segundo C,
González-Garcia I, Brieva JA. Servicio de Inmunología y Unidad de
Investigación.
Las células plasmáticas (CP) , estadio final B, son las encargadas
de secretar Ig. Tras la activación de los linfocitos B en los órganos linfoides inductivos (p ej. la amígdala (A)), los genes IGVH sufren hipermutación somática (HS), dando lugar a Igs c on mayor afinidad. Reci
entemente, nuestro laboratorio ha establecido la existencia de un gradiente mutacional en genes IGVH que se inicia en las CP tempranas
de los órganos linfoides (A), progresa en la fase circulante en sangre
periférica (SP) y es máximo en CP presentes en órganos de depósito
final, como la médula ósea (MO). En este trabajo se han obtenido CP
humanas de A, SP y MO altamente purifi cadas usando métodos inmuno-magnéticos y "sor ting" de células CD38++. Se ha secuenc iado el
ADNc codifi cante de los genes IGVH6 e IGVH3 procedentes de las
tres poblaciones de CP (n= 574 y 737, respectivamente). Estos genes
aparecen más mutados y tienen más mutaciones reemplazantes (R)
en los CDRs que en los FRs, de acuerdo con lo previsto. La frec uencia de mutaciones tanto totales como R es mayor en CDR1 que en
CDR2 en las tres poblaciones estudiadas y en las dos familias de genes.
Sin embargo, la relación R/S es inferior en CDR1, siendo en ambas
regiones los valores observados de R/S infer iores a los esperados si
dependiera exclusivamente del azar. Este fenómeno es especialmente acusado en CDR1, que tiene una mutabilidad inherente mucho
mayor. La diferencia entre R/S esperado y observado se hace menor
en la dirección A?SP?MO sobretodo en CDR2. La frecuencia del cambio de aminoácidos (aa) también es claramente mayor en CDR1 que
en CDR2 a lo largo del gradiente madurativo. Sin embargo, la frecuencia de cambio de aa no conser vativo deja de ser mayor en CDR1 que
en CDR2 en MO, mostrándose un progreso selectivo de la HS quizás paralelo al aumento de la afinidad por el Ag. Estos datos revelan una presión selectiva diferencial sobre CDR1 y CDR2, sugiriendo
que ambos segmentos juegan diferentes roles en el sitio de unión al
Ag.
100.ANÁLISIS COMPARATIVO DE CÉLULAS PLASMÁTICAS
CD19+ Y CD19- EN LAMINA PROPIA DE COLÓN HUMANO.
Ocaña E, Campos-Caro A, Jiménez-Gómez G, Brieva JA. Unidad
de Investigación y Servicio de Inmunología.
Introducción. Las células plasmáticas (CP) se consider an la fase
final de diferenci ación de los linfocitos B y son las responsables de la
producción de anticuerpos. En humanos, los órganos de alojamiento
final de las CP son la médula ósea y la lamina propia ( LP) mucosa. Las
CP de LP son las responsables de la respuesta inmune humoral mucosa. OBJETIVOS: Aislar y analizar fenotípic a y genéticamente las dos
poblaciones de CP presentes en la lámina propia de colon en humanos
(CP LP CD19+ y CP LP CD19-).
Resultados y conclusiones. Las dos poblaciones de CP LP fueron
altamente purificadas mediante cell-sorting. El análisis fenotípico de
POSTERS
diferentes marcadores (DR, CD44, CD95 y CXCR4) mediante citometría de flujo no mostró diferencias significativas. En el estudio cuantitativo de los factores de trascripción (FT) implicados en la diferenci
ación de las CP (Pax5, Blimp-1 y Xbp-1) se encontró una mayor expresión del FT Pax5 en las CP LP CD19+. En el análisis del numero de
mutaciones somáticas de los genes IgVH de las inmunoglobulinas, no
se encontraron diferencias signific ativas en cuanto al numero de mutaciones (reemplazantes y silentes) ni al cociente R/S. Sin embargo, si se
encontraron diferenc ias signific ativas en la utilización de los segmentos D y J en el reordenamiento. También se analizó los cambios de aminoácidos debido a mutaciones somáticas en ambas poblaciones mediante el programa Clustalw (http://www.ebi.ac .uk/clustalw. Los cambios de aminoácidos (Aa) se agr uparon según el tipo de variación en
cambios no conservativo (NC) y conservativos o semiconservativos
(C). En primer lugar observamos un mayor número de cambios de Aas
en los genes IgVH de las CPLP CD19- y además eran cambios no c
onservativos. Estos cambios de Aas tenían lugar fundamentalmente
en la zona FR y CDR1, no encontrándose diferencias en CDR2. El análisis de las dos poblaciones de CP LP revela la existencia de diferencias en sus IgVH, quizás relacionadas con una diversa afinidad por
el antígeno.
101.EXPRESIÓN DE I-100 EN LAS POBLACIONES LEUCOCITARIAS DE SANGRE PERIFÉRICA. Imbernón M1, Viñuela JE2, Cordero OJ1. 1Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular. Universidade de Santiago de Compostela. 2Departamento de Inmunoloxía. Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela.
Las proteasas de prolina juegan un papel muy importante en
la modificación postraduc cional de proteínas o péptidos que contengan X-Pro en su extremo N-terminal. Un ejemplo de ello es CD26
(Dipeptidil peptidasa IV, DPPI V), una glicopr oteína integral de
membrana de tipo II que ejerce en el sistema inmunitario un importante papel regulador al menos sobre las quimiocinas. I-100 es otra
glicoproteína de membrana que se incluye dentro de la familia de
las N-acetilated alfa_Linked Acidic Dipeptidase debido a su similitud de secuencia con las proteínas de ésta familia, y por eso se le
denomina también NAALADAasa-Like. Pero su ac tividad proteolítica la sitúa también dentro de las dipeptidil peptidase IV activity and/or structure homologous (DASH). Se ha descrito la presenci a de transcritos de I-100 en diversos tejidos, y nosotros estamos estudiamos la presencia de la proteína I-100 en el sistema inmunitario. En este estudio utilizamos un anticuerpo policlonal diseñado frente a una secuencia específica de 15 aminoácidos de I-100 y
se analizó la distribución de ésta proteína en las diferentes poblaciones de leucocitos mediante un marcaje indirecto detectado por
FACS. Las poblaciones de células T, B, NK, monocitos y polimorfonucleares se identific aron con marcadores monoclonales específicos combinándolo con el marcaje de I-100. El estudio se repitió en
leucocitos fijados con paraformaldehído y linfocitos activados con
PHA. La expresión de I-100 presenta una distribución carac terística y de diferente intensidad en las distintas poblaciones: sólo un 11.5% de linfocitos T CD4 es consistentemente marcado, mientras un
35% de las células B y casi todas las NK (con valores variables dentro de sus subpoblaciones) son positivas; un 77% en monocitos y
un 33% ( menos consistente) en granulocitos. Esta ausencia de expresión uniforme en la superficie de las células sugiere que el estudio
de I-100 nos puede revelar también nuevas rutas reguladoras en
el sistema inmunitario.
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POSTERS
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
SESIÓN 7: INMUNOLOGIA TUMORAL - II
Moderadores: Dr. Luis Álvarez Vallina (Madrid)
Dr. Federico Garrido (Granada)
102.PUESTA A PUNTO DE UN MÉTODO SENSIBLE Y ESPECÍFICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL COMPONENTE
MONOCLONAL EN MIELOMA. Vazquez Gonzalez AC, Villar
Guimerans LM, Cardero Gonzalez E, Gonzalez Porqué P. Servicio
de Inmunologia. Hospital Ramon y Cajal.
Antecedentes. La cuantificación del componente monoclonal es
de suma importancia en el diagnóstico y seguimiento de los pacientes
con gammapatía monoclonal, ya que en las clasificaciones actuales
es lo que determina en que situación se encuentra el enfermo y por tanto el tipo de tratamiento que debe seguir.
En el momento actual los métodos utilizados para la determinación de dic ha cuantific ación tienen ci ertas limitaciones ya que no permiten averiguar con exactitud el porcentaje de la Inmunoglobulina
total que corresponde al componente monoclonal presente. Además,
en aquellos pacientes en los que se observan pequeñas bandas, ó en
los casos en que esta banda monoclonal se sitúa en la zona beta del
espectro electroforético ( EEF ) la cuantificación se ve muy sesgada,
si sólo se utiliza la densitometría directa del EEF.
Objetivos. Puesta a punto de un método que nos permita cuantificar de modo específico, objetivo y reproducible el porcentaje de
Inmunoglobulina monoclonal presente en suero y orina de pacientes
con gammapatías monoclonales.
Método. A todas las muestras se les realizó un Espectro Electroforético (EEF), cuantificación de Inmunoglobulinas por Nefelometría y
caracterización del pico monoclonal mediante Inmunofijación (IFJ).
Además, se realizó, una densitometría de la IFJ para cuantific ar el pico
monoclonal.
Resultados. Hemos comparado la cuantificación del pico monoclonal a partir de la densitometría del EEF, y de la densitometría de la
IFJ, usada en combinación con la cuantificación de las Inmunoglobulinas por Nefelometría. Se ha comprobado que este último método es
el que nos ofrece los resultados más precisos y reproducibles, sobre todo
con los picos pequeños y c on aquellos picos que se localizan en beta.
Conclusiones. La Inmunofijación Cuantitativa es un método que
permite una determinación más precisa de la cantidad de Inmunoglobulina monoclonal que tienen estos pacientes al diagnóstico y durante el seguimiento, así como valoración de la eficacia del tratamiento. El
método nos permite cuantificar picos pequeños que por otros métodos
no serían cuantificables y proporciona información sobre el porcentaje de la Inmunoglobulina que aún presenta aspecto monoclonal.
103.PURIFICACION DE LA LECTINA EXTRAIDA DE LA
EUPHORBIA HANDIENSIS. Guzman-Bistoni C1, Evora N1, Segui
ME1, Peraza S2, Garcia-Tamayo J3, Molina J3, Frias I4, BlascoOlaetxea E1. 1Instituto Canario de Investigación del Cáncer ICIC. 2Centro Cancer Gastrointestinal San Cristobal – Venezuela. 3Novapath - Maracaibo- Venezuela, 6Novapath - Maracaibo- Venezuela. 4Universidad de
La Laguna.
La lectinas son proteinas extraidas de plantas que tienen la caracteristica de reconocer y unirse a estructuras carbohidrato Nuestro objetivo con el presente trabajo es comprobar la utilidad de la Lectina extrai-
90
da del Cardón de Jandia Euphorbia handiensis, un endemismo de la Isla
de Fuerteventura, en el estudio de tejido Humano normal y patológico.
Euphorbia handiensis es una especie incluida en el catálogo de
especies amenazadas de Canarias, por lo que fue necesaria la autorizaci ón para su recolecci ón por el Gobierno de Canarias. Una vez recolectada en campo, el material vegetal se conserva en frío hasta su llegada al laboratorio, donde se congela para su posterior procesamiento. 61 bloques de parafina con tejido gástrico del Centro de Control de
Cáncer Gastrointestinal en San Cristobal, fueron procesados en el Laboratorio del ICIC en Fuerteventura y Novapath de Maracaibo.
Aislamiento y purificación de lectinas: A partir de muestras congeladas de plantas seleccionadas se procede a su rotura en un mortero mantenido con nitrógeno líquido a una baja temperatura <90 º C. Posteriormente se homogeneiza el polvo resultante en PBS+ (PB, 200 mM
NaCl, 1mM PMSF, 5mM βME, pH6,9) con ayuda de un politrón
(5min x 5000 rpm, 0 º C). A continuación. El homogenado se centrifuga
en volúmenes de 20 ml durante 20 minutos a 15 000 x g 4ºC. El sobrenadante que se obtiene se cromatografía sobre un lecho de Sephadex LH20 previamente desgasificado y silanizado a fin de evitar oxidaciones
e interacciones entre lectinas y residuos de la fase sólida. A continuación
se precipita la fracción no-lectina con SO4 (NH4)2 durante 1 hora en agitación y a 40% de saturación. Tras 12-15 horas de sedimentación y equilibrado la muestra se centrifuga 10 minutos a 15 000 x g y se realiza una
nueva precipitación salina de la fracción rica en lectina con SO4 (NH4)2
al 65-80% de saturación -dependiendo del material vegetal- a4 º C. Por
último se centrifuga de nuevo en las mismas condiciones y el precipitado se redisuelve en buffer PBS+ y se dializa en el mismo buffer (1 Litro,
2 cambios, durante 12 horas) el dializado se clarifica por centrif ugación
y puede congelarse en este punto. Cromatografía de afinidad sobre
manosa y Neu5Gc. Se realiza en microcolumnas (Pierc e C.O.) sobre dos
lechos en támdem de Sepharose CL6B con Manosa acoplada a través de
brazo espaciador C8 (Sigma C.O.) y Sepharose acoplada a Neu5Gc a través de un brazo C8 siguiendo el protocolo del fabricante. La unión se
lleva a cabo a 20ºC, con 10 pases de la muestra por el gel, lavado y elución con manosa en PBS+ 500mM NaCL, siguiéndose la absorbancia a
280 para la unión y mediante el reactivo de Bradford para la elución.
Muestras de cada paso se separan para análisis mediante SDS-PAGE y
Western blot. Se procede a la biotinización de las proteínas eluidas
Histoquímica de lectinas. Las biopsias incluidas en parafina se cortan a 3 micras de espesor y se montan sobre portaobjetos con Poly-L-Lysina. Se utilizó sistema Stepavidina-HRP (Dako) para la unión a la biotina
por 10 minutos. El revelado se realizó con Diaminobenzidina (DAB).
Resultados y conclusiones. La lectina extraida de la Euphorbia
handiensis reconoce una estructura carbohidrato presente en las células de la mucosa gástrica superf icial normal, dando un patrón de expresión similar al de los antígenos relacionados con los grupos sanguíneos. Es por ello que basandonos en nuestra experiencia con este tipo de
marcadores pensamos que podría ser útil en el estudio de los procesos neoplásico del estómago.
104.LA PROTEÍNA VIRAL A238L INHIBE LA EXPRESIÓN DE
COX-2 Y LA MIGRACIÓN EN CÉLULAS DE CARCINOMA DE
COLON HUMANO. Sabina Villar P1, González Granja A2, García Sánchez E1, Nogal París ML1, Revilla Novella Y1. 1Centro de
Biología Molecular. 2Cancer Research UK London Research Institute.
La ciclooxigenasa 2 (COX-2), está aumentada en diversos cánceres humanos afectando a la carcinogénesis. Anteriormente hemos
INMUNOLOGÍA
demostrado que la proteína viral A238L inhibe la actividad de los factores de transcripción NF-kappa B, NFAT y los coactivadores CBP/p300
en distintos tipos celulares y por tanto los genes diana se encuentran
inhibidos en células que expresan A238L. En el presente trabajo, usando líneas celulares de carcinoma de colon humano como Caco-2 y HT29 que expresan establemente A238L, cotransfectadas con distintas
construcciones reporteras de la actividad del promotor de COX-2,
demostramos que la expresión del gen viral inhibe la trascripción de
COX-2 en sitios específicos de su promotor y consecuentemente la síntesis de PGE-2. Además, la expresión de una versión constitutivamente activa de calcineurina o NFAT revierte la inhibición mediada por
A238L, implicando a esta ruta de señalización en el mecanismo funcional de la proteína viral. Además, utilizando ensayos de quimiotáxis en placa, observamos que la presencia de A238L disminuye la migración celular, un efec to que se revierte mediante sobreexpresión de calcineurina.
Puesto que COX-2 ha sido implicada en desarrollo de metástasis
tumoral, actualmente estamos analizando la expresión de marcadores
de adhesión celular tales como I-CAM y V-CAM, de angiogénesis como
VEGF y de invasión tumoral como MMP-9, en células HT-29 pcDNA
y HT-29 pcDNA-A238L, así como el efecto de sus respectivos sobrenadantes de cultivo sobre células HUVEC, para evaluar, mediante ensayos in vitro, la consecuencia de la disminución de la expresión de COX2 mediada por A238L y su repercusión en la formación de metástasis
in vivo.
105.ANALISIS DE NIVELES DE TRANSC RIPCION DE GENES
HLA LOCUS B ESPECÍFICO EN LÍNEAS DE MELANOMA
QUE PRESENTAN BAJA EXPRESIÓN DE LOCUS B EN SUPERFICIE. García Ruano AB, Romero Noguera JM, del Campo Alonso AB, Mendez Valdes R, Ruiz-Cabello Osuna F, Garrido TorresPuchol F. Hospital Universitario Virgen de las Nieves.
Medimos los niveles transcripcionales específic os para locus B
en siete líneas celulares de melanoma (ESTDAB) que presentaban
baja expresión de HLA-B en superfic ie medida por citometría de flujo. Para determinar los niveles trasncripcionales realizamos PCR cuantitativa en el analizador Light Cycler de Roche usando cebadores
específicos y SGRB-green. Como control estudiamos los niveles transcripcionales específicos para locus B en 50 muestras de linfocitos de
sangre periférica. Todos los resultados se refirieron a niveles transcripcionales de glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa. Para comprobar
que la amplificación era específica para el locus B chequeamos el
amplificado por electroforesis en gel de agarosa y analizamos la curva meelting.
Todas las líneas estudiadas mostraban amplificación específica
para HLA-locus B. La media de los niveles de transcripción del locus
B en las muestras de linfocitos de sangre periférica fue 31,40 copias de
mRNA de locus B/copias G6PDH (rango 9,82-109). En el caso de las
líneas celulares de melanoma los niveles medios de trasncripción fueron 5,11 copias de mRNA de locus B/copias G6PDH (rango 0,50-11,43).
Los resultados para cada línea fueron los siguientes: FM28, 0.50 locus
B/GPDH; E120, 0.56 locus B/GPDH; E135, 2.14 locus B/GPDH; FM3,
6.93 locus B/GPDH; E100, 3.16 locus B/GPDH; E114, 11.43 locus
B/GPDH; E125, 11.04 locus B/GPDH.
Analizando estos resultados podemos decir que FM28 y E120
muestran niveles muy bajos de transcripción de locus B lo cual puede explicar su baja expresión en superfic ie. En las líneas celulares
POSTERS
E135, FM3 y E100 encontramos niveles transcripcionales reduc idos
que podrían explicar parc ialmente la baja expresión. Sin embargo,
en el resto de las líneas, los niveles transcripcionales fueron similares a los de los linfocitos por lo que en estos casos la baja expresión
de HLA-B en superficie no sería debida a un fallo en la transcripción.
106.PRESENCIA DE CELULAS TRONCALES NEURALES NESTINA POSITIVAS EN EL GLIOBLASTOMA MULTIFORME. Hernández-Cillero L1, Subiza Garrido-Lestache JL2, Martínez-Martínez A3, Zimman-Mansfeld H1. 1Instituto de Neurociencias y Servicio de Neurocirugía. 2Servicio de Inmunología. 3Anatomía Patológica.
Hospital Clínico San Carlos. Madrid.
Antecedentes. Las células troncales neurales son definidas como
células multipotentes del sistema nervioso central capaces de dividirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de células especializadas, morfológica y funcionalmente(1). Además pueden ser expandidas en agregados celulares esféricos llamados “neurosferas” en medio
libre de suero conteniendo EFG y FGF.
Dentro de los tumores cerebrales de origen glial, el glioblastoma
multiforme (GBM), es un tumor altamente maligno. Constituye el
50-60% de los tumores gliales(3), con una supervivencia media de 14
meses a pesar de los tratamientos convencionales de cirugía, r adio y
quimioterapia.
Objetivo. Demostrar la presencia de células definidas como troncales nestina positiva en el GBM.
Materiales y métodos. Se estudiaron cinco tumores cerebrales
humanos diagnosticados como Glioblastoma Multiforme de acuerdo
a la clasific ación de la Organización Mundial de la Salud, previo consentimiento de los pacientes y con protocolo aprobado por el comité
ético del Hospital Clínico San Carlos.
Se recogieron los tumores en fresco, procediendo a digestión enzimática y disociación mecánica.
Se realizó cultivo primario de los tumores en medio DMEM-F12
libre de suero suplementado con hormonas(4) y factores de crecimiento epidérmico y fibroblástico.
Las tumoresferas, las cuales aparecen en la primera semana de cultivo, se disgregaron y se r ealizó el estudio de contenido de nestina por
inmunofluorescencia y citometría de flujo.
Resultados
1. Se observó la formación de neurosferas o tumoresferas mediante
microscopio de contraste de fases.
2. Presencia de un pequeño número de células positivas para nestina con patrón citoplasmático en los tumores estudiados.
3. El análisis citofluorométrico demostró hetereogeneidad morfológica además de un porcentaje (1-5%) de células teñidas con antinestina.
Conclusiones
1. Se demostró la existencia en el GBM de un pequeño grupo de células carac terizadas por su positividad a la nestina.
2. Estas células similares a las células troncales neurales pueden ser
el origen o fuente de renovación del tejido tumoral.
Bibliografía
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Sato GH, Bottenstein J. et al. Methods in Enzymology 1979;58.
91
POSTERS
107.CARACTERIZACIÓN INMUNOGENOTÍPICA DEL REORDENAMIENTO MONOCLONAL DE LA CADENA PESADA DE
LA INMUNOGLOBULINA (IGH) EN UNA SERIE DE 25
PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA B (LLCB). Modrego Ruiz J, Teijeiro Martorell R, Santamaría Jaramillo
B, Gil Herrera J, Rodriguez-Sainz C, Fernández-Cruz E. Hospital
General Universitario Gregorio Marañón. Madrid.
Introducción. En los síndromes linfoproliferativos la caracterización inmunogenotípica del reordenamiento monoclonal de IgH permite determinar el estado de hipermutación somática (HMS) y la región
VH reordenada. Ambas determinaciones tienen valor pronóstico y particular interés en la LLC-B ya que esta patología muestra gran heterogeneidad en su progresión clínica. El estado de la HMS no mutado
frente al mutado y el uso de la familia VH3-21 son marcadores independientes de peor pronóstico, siendo controvertida la influencia geográfica en la frecuencia de estas características.
Objetivo. Efectuar la caracterizaci ón genética del reordenamiento IgH en una serie de 25 pacientes con LLC-B atendidos en el Hospital “Gregorio Marañón”.
Método. Estudiamos 25 pacientes con LLC-B cuyas muestras de
sangre periférica se recibier on consecutivamente en la sección de Inmunogenética Molecular del hospital. Después de extraer el DNA genómico, se amplificó el DNA de IgH reordenado y se secuenció con el kit
BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). El análisis de las secuencias se hizo con el programa IMGT/V-QUEST. Resultados: De las 25 muestras procesadas conseguimos analizar 22. La
mayor parte de los reordenamientos muestran un estado mutado
(72.7%) con una frecuencia de mutación media del 8.3% (rango 5.511%). Siete individuos (27.3%) presentaron un estado no mutado, 5 de
ellos con identidad total respecto a la secuencia consenso. Un sólo individuo presentó reordenada la familia VH3-21(4.5%), siendo su estado
no mutado. La región más frecuentemente reordenada es VH3(72.8%).
Conclusiones. En la mayoría de los pacientes con LLC-B hemos
podido determinar el estado de HMS y la familia reordenada, lo que
añade valor pronóstico a las estadificaciones c lásicas (RAI y BINET). La
ampliación de la serie y el seguimiento de los pacientes estudiados permitirán confirmar el valor pronóstico de ambos marcadores y estudiar
la frecuencia de las familias VH reordenadas en nuestra población.
108.ESTUDIO DEL PAPEL DE Eph Y EFN EN LA INTERACCIÓN
T-B EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA. de Garcillan
Goyoaga B1, Trinidad Álvarez EV1, Ballesteros Andres M2, Zapata González A1, Alonso Colmenar LM1. 1Universidad Complutense
de Madrid. 2Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid.
Distintas evidencias han puesto de manifiesto un papel crítico
de la interacción T-B en leucemia linfática crónica (LLC) , caracterizada por una acumulación progresiva de linfocitos B CD19+CD5+, y donde la familia de receptores tirosinaquinasa Eph y sus ligandos, ephrin
(EFN), i mplicada en procesos de adhesión/repulsión celular en otros
sistemas, podría jugar un papel clave en dichas interacciones.
Hemos caracterizado la expresión de Eph/EFN en linfocitos T y
B sanos y de pacientes LLC, mediante RT-PCR y citometría de flujo
(FACS), así como mediante inmunofluorescencia en ganglios reactivos
sanos y de pacientes LLC. Además, hemos estudiado in vitro el efecto
de la adición de proteínas recombinantes Eph ó EFN a co-cultivos de
linfocitos T y B sanos y de pacientes LLC estimulados via CD3 y CD28,
92
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
analizando la supervivencia de ambas poblaciones, su respuesta proliferativa y la modulación de distintos marcadores de activación.
Las poblaciones linfoides estudiadas expresan varios de los miembros Eph/EFN, tanto receptores como ligandos, destacando una expresión incrementada de EFNA4, incluyendo una isoforma soluble, en las
células B leucémicas, así como un incremento signific ativo en la proporción de linfocitos T que expresan EphA4 en los ganglios de pacientes LLC, por lo que EphA4 y EFNA4 podrían funcionar como “pareja” receptor-ligando en la interacción T-B. La adición de EphA4 ó
EFNA4 recombinantes solubles a co-cultivos T-B, lo cual debería interferir en la interacción normal de EphA4/EFNA4, resultó en una mayor
respuesta proliferativa de los linfocitos T así como en una mayor supervivencia de los linfocitos B leucémicos fr ente a la situación control, en
ausencia de proteínas recombinantes solubles.
Nuestros resultados sugieren que la interacción T-B en la LLC está
mediada, en parte, por EphA4/EFNA4 modulando la respuesta proliferativa T y la supervivencia de las células B leucémicas.
109.INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO –1082 A>G DE L-10 EN
LA EVOLUCIÓN DEL CARCINOMA RENAL DE CÉLULAS
CLARAS. Sáenz-López Garrocha P, Romero JM, Carretero R,
Cózar JM, Tallada M, Garrido F, Ruiz-Cabello F. Hospital Universitario Virgen de las Nieves.
La IL-10 es una citoquina inmunosupresora que podría favorecer el escape tumoral a la inmunovigilancia. Sin embargo existen evidencias de una interacción compleja de esta citoquina en el microambiente tumoral de tal manera que podría desarrollar también efectos
antitumorales. Por este motivo, los estudios de polimorfismos genéticos de IL10 en relación al cáncer están sujetos a controversia.
El polimorfismo IL10-1082A>G (rs1800896) se ha descrito como el
más importante en población española y se ha relacionado el alelo G a
alta producción de IL-10. En el presente estudio se ha determinado este
polimorfismo en 127 pacientes y se ha analizado su influencia sobre
varios parámetros relacionados con la evolución: diámetro tumoral, grado nuclear, adenopatías, trombosis maligna, metástasis, estadío tumoral y riesgo UKLA. Nuestro estudio reveló en primer lugar, que no hubo
una asociación directa de ninguno de los polimorfismos o haplotipos de
IL10 estudiados en relación al riesgo de cáncer renal. Sin embargo hemos
observado que un mayor heterocigosidad AG en la posición -1082 del
gen (que determinaría niveles intermedios de producción de la citoquina) se asocian a un diámetro tumoral mayor de 7 cm (OR=4,41; p=0,001),
a la aparición de adenopatías (OR=1,79; p=0,006) y a un estadío tumoral avanzado (OR=14; p=0,002). Nuestros resultados pueden ser interpretados en el contexto de la compleja interacción de IL10 en el microambiente tumoral, con efectos tanto sobre las células tumorales, sobre
el infiltrado inflamatorio, y sobre la vascularización, y donde esta citoquina puede desarrollar a la vez efectos pro- y antitumorales.
110. ESTUDIO DE POLIMORFISMOS DE LOS GENES RANTES,
IL-1, MCP-1 Y TNF-α EN PACIENTES DE CANCER DE PRÓSTATA. Saenz-López P1, Carretero R1, Romero JM1, Cantón J1, Cózar
JM2, Tallada M2, Garrido F1, Ruiz-Cabello F1. 1Servicio de Análisis
Clínicos y de 2Urología. Hospital Virgen de las Nieves de Granada.
Introducción. La inflamación ha sido implicada como factor etiológico de varios canceres en humanos, incluido el cáncer de próstata. Las
INMUNOLOGÍA
variantes alélicas de los genes involucrados en las vías de la inflamación
son candidatos lógicos para la determinación genética del riesgo de padecer cáncer de próstata. El propósito de este estudio fue por tanto, analizar la asociación entre polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) de
citoquinas proinflamatorias en la predisposición al cáncer de prostata.
Material y métodos. Hemos realizado un análisis genético analizando los polimorfismos de las citoquinas: TNF-α-308 A/G (rs1800629),
RANTES-403 G/A (rs 2107538), IL-1α-889 C/T (rs 1800587), y MCP-1
2518 G/A (rs1024611). El estudio se realizo con 296 pacientes españoles con cáncer de próstata y 216 personas sanas españolas.
Resultados y conclusiones. Pacientes con cáncer de próstata se asocian significativamente al genotipo TNF-α GA+AA (OR, 1,697;95% CI,
1.089-2,644) y al genotipo RANTES GA+AA (OR,1,610;95% CI, 1,088-2382
). El alelo A de TNF-α y RANTES influye en la susceptibilidad de padecer cáncer de próstata. No se descubrió ningún efecto epistático entre combinaciones de diferentes polimorfismos. Por ultimo no se observó una asociación entre riesgo de desarrollo de cáncer de próstata y los polimorfismos de IL-1α y MCP-1. Nuestros resultados favorecen la hipótesis de que
variaciones en algunos genes que regulan la inflamación y la respuesta
innata pueden ser importantes en el desarrollo del cáncer de próstata.
111. ANALISIS DE CADENAS LIGERAS LIBRES EN SUERO PARA
LA VALORACION DE LOS FILTROS DE GRANDES POROS
EN EL PERIODO INICIAL DEL MIELOMA MULTIPLE CON
DAÑO RENAL AGUDO. Muñoz Alcon H1, Jiménez Cobaleda MJ1,
García de Burgos M1, Hernandez A1, Rodríguez R1, Hernández J2,
Queizan JA2, Heras M3, Sánchez R3, Fernéndez-Reyes MJ3. 1Análisis Clínicos. 2Hematología. 3Nefrología. Hospital General de Segovia.
Se analizaron las cadenas ligeras libres CLL en el suero de un paciente, diagnosticado de mieloma múltiple IgG-K con eliminacion urinaria
de grandes cantidades de K libre e insuficiencia renal aguda, antes , durante y despues de una hemodiálisis con fi ltro GAMBRO HEO 1100. El analizador utilizado es un Immage 800 y reactivos específicos para CLL de
la casa the binding site. El paciente fué tratado farmacológic amente desde su diagnóstico con dexametasona y con bortezomib y dexametasona
a partir del dia +7. Se observó que los niveles de K libre descesdieron a
partir de la tercera hora y hasta el final de la hemodiálisis (6 horas). La
hemodialisis se realizó durante varios dias analizándose las CLL en suero pre y post diálisis, observándose que los niveles previos eran muy elevados descendiendo en porcentajes de hasta el 80% tras el filtrado. A partir del dia 14 de tratamiento farmacológico, los niveles de K libre prediálisis comenzaron a mejorar, descendiendo tras la diálisis en la misma proporción que en dias anteriores. El dia 20 el paciente pidió el alta voluntaria; aún así se ha comprobado la eficacia del fi ltro para la disminucion
de CLL y la necesidad de mantener este tipo de hemodiálisis hasta el control de la masa tumoral del mieloma múltiple.
112. SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN VARIABLE DEL GEN DE
LAS CADENAS PESADAS DE INMUNOGLOBULINA EN
PACIENTES CON LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA. Calvo Benito FJ1, Arbós Magrinyá A1, Corbillo Colom C1, Vercher Agustí FJ2,
Balanzat Muñoz J2, Gayà Puig A1. 1Fundació Banc de Sang i Teixits de
les Illes Balears. 2Servei d’Hematologia. Hospital Can Misses. Eivissa.
La Leucemia Linfoide Crónica (LLC) de células B es la forma más
frecuente de leucemia en nuestro entorno. La principal dificultad diag-
POSTERS
nóstica de esta enfermedad radica en la necesidad de disponer de una
gran cantidad de muestra patológica para realizar las pruebas necesari as, ya sea por citometría de flujo o por diagnóstico molecular clásico. En este trabajo describimos una técnica utilizada en nuestro laboratorio que no sólo permite la realización de un diagnóstico de seguridad con una cantidad limitada de células leucémicas sino que posibilita el seguimiento tras el tratamiento y la determinación de enfermedad residual en un enfermo. Por otra parte, la heterogeneidad en
el comportamiento clínico de pacientes con LLC dificulta a los clínicos
identificar con precisión los pacientes que se puedan beneficiar de estrategias terapéuticas tempranas y agresivas y además poder ofrecer a los
pacientes información relevante del pronóstico de su enfermedad. Dada
la eficacia potencial de las nuevas terapias y la voluntad de tratar pacientes en el momento óptimo, es cada vez más importante desarrollar técnicas lo suficientemente sensibles para identificar los pacientes con
peor pronóstico. Los estudios más recientes en esta enfermedad sugieren que realmente englobaría dos enfermedades diferentes con diferente curso clínico e implicaciones pronósticas que pueden distinguirse fundamentalmente mediante la secuencia del reordenamiento monoclonal VDJ. La técnica de secuenciación de reordenamientos VDJ del
gen de cadenas pesadas de inmunoglobulinas es compleja y no está al
alcance de muchos centros. En el presente trabajo describimos la puesta a punto y los resultados de la secuenciación de aquellas muestras
con reordenamientos monoclonales diagnosticados en nuestro laboratorio.
112. SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN VARIABLE DEL GEN DE
LAS CADENAS PESADAS DE INMUNOGLOBULINA EN
PACIENTES CON LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA. Calvo
Benito FJ1, Arbós Magrinyá A1, Corbillo Colom C1, Vercher Agustí FJ2, Balanzat Muñoz J2, Gayà Puig A1. 1Fundació Banc de Sang i
Teixits de les Illes Balears. 2Servei d’Hematologia. Hospital Can Misses.
Eivissa.
La Leucemia Linfoide Crónica (LLC) de células B es la forma
más frecuente de leucemia en nuestro entorno. La principal dificultad diagnóstica de esta enfermedad radica en la necesidad de disponer de una gran cantidad de muestra patológica para realizar
las pruebas necesari as, ya sea por citometría de flujo o por diagnóstico molecular clásico. En este trabajo describimos una técnica utilizada en nuestro laboratorio que no sólo permite la realización de un
diagnóstico de seguridad con una cantidad limitada de células leucémicas sino que posibilita el seguimiento tras el tratamiento y la
determinación de enfermedad residual en un enfermo. Por otra parte, la heterogeneidad en el comportamiento clínico de pacientes con
LLC dificulta a los clínicos identificar con precisión los pacientes que
se puedan beneficiar de estrategias terapéuticas tempranas y agresivas y además poder ofrecer a los pacientes información relevante
del pronóstico de su enfermedad. Dada la eficacia potencial de las
nuevas terapias y la voluntad de tratar pacientes en el momento óptimo, es cada vez más importante desarrollar técnicas lo suficientemente sensibles para identificar los pacientes con peor pronóstico.
Los estudios más recientes en esta enfermedad sugieren que realmente englobaría dos enfermedades diferentes con diferente curso
clínico e implicaciones pronósticas que pueden distinguirse fundamentalmente mediante la secuencia del reordenamiento monoclonal VDJ. La técnica de secuenciación de reordenamientos VDJ del
gen de cadenas pesadas de inmunoglobulinas es compleja y no está
93
POSTERS
al alcance de muchos centros. En el presente trabajo describimos la
puesta a punto y los resultados de la secuenciación de aquellas muestras con reordenamientos monoclonales diagnosticados en nuestro
laboratorio.
113. IgM MONOCLONAL CON CAPACIDAD CITOFÍLICA EN
LINFOMA LINFOPLASMOCÍTICO. Rodríguez-Martín E, Alcalá I, González-Porqué P, Martínez-Viñambres E, Neil Hermenegildo Y, Coll J, Roldán E. Servicio de Inmunología.
El linfoma linfoplasmocítico se caracteriza por la presencia de
células clonales en diferentes estadios madurativos (linfocitos, infoplasmocitos y células plasmáticas) en proporciones muy variables,
dependiendo del enfermo. La población tumoral presenta expresión
leucémica en la mayoría de los pacientes, detectándose en sangre perif
érica ( SP) y médula ósea (MO), llevando asociada una paraproteína
IgM circ ulante. Por otro lado, la citofilia es una propiedad de la región
Fc de las inmunoglobulinas (Igs) que consiste en la capacidad que presenta la Ig para unirse a las células a través de sus receptores para Fc.
El caso clínico que se presenta es el de un varón de 75 años con síndrome constitucional acompañado de vómitos, tos y expectoración.
Se realizaron estudios de citometría de flujo en muestras de PAAF, SP,
aspirado de MO y líquido pleural. En todas las muestras, excepto en
el líquido pleural, se detectó la presencia de dos poblaciones tumorales de células B, diferenciándose dos estadios madurativos: linfocitos
B y linfoplasmocitos. Ambas poblaciones presentaron diferencias en
su fenotipo, siendo kappa de superficie +. La inmunofijaci ón en suero y en líquido pleural detectó la presencia de un pico monoclonal
IgM kappa. Asimismo, el estudio inmunofenotípico realizado en líquido pleural mostró la alta capacidad citofílica de la Ig clonal, detectándose su presencia unida a linfocitos T en ausencia de población tumoral linfoide B tras tratamiento. La preincubación de la muestra con
EDTA, DTT y a 37ºC no fue capaz de revertir la unión de la Ig a las
células T. Además, la incubación de los linfocitos T de un individuo
sano con el plasma o el líquido pleural del paciente condujo a la unión
de la IgM kappa a la membrana de estas células. Estos datos concluyen que la Ig monoclonal de algunos enfermos puede tener una gran
capacidad citofílica en su unión a diferentes tipos celulares y que tal
capacidad puede llevar a errores en el cálculo del porcentaje de células tumorales.
114.CORRELACION ENTRE EL COMPORTAMIENTO BIOLOGICO DE TUMORES DE PROSTATA Y LA EXPRESION DE UN
EPITOPO DE CARBOHIDRATO EN MUC-1 RECONOCIDO
POR EL AcMo A10 Y SU RELACION CON ANTICUERPOS
DE IgM. Moltó L, García-López Asenjo JA, Fuentes M, Cillero
L, Hernández S, Moreno J, Campanario F, Arroyo M, Subiza JL.
Departamentos de Análisis Clínicos, Medicina Preventiva, Anatomía
Patológica, Urología y Inmunología. Hospital Clínico San Carlos.
Madrid.
Introducción. A10 es un anticuerpo monoclonal de tipo IgM
que define un epitopo carbohidrato en MUC-1 y que esta presente
en adenocarcinomas epiteliales humanos. Estudios previos han descrito la presencia de anticuer pos naturales frente a este epitopo de
carbohidrato. Dependiendo de su arquitectura histológica y del perfil molecular adquirido durante su desarrollo los adenocarcinomas
94
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
de próstata pueden comportarse como una enfermedad en progresión. Entre los indicadores de recurrencia y progresión están los
niveles séricos de PSA y su tiempo de duplicación. El grado de expresión y pérdida de glicosilación de mucinas de membrana como
MUC-1 también repercute en la actividad biológica de los adenocarcinomas. El objetivo de este estudio es valorar la expresión del
epitopo de A10 en tumores de próstata y su relaci ón con la inmunoreactividad de los anticuerpos I gM así como con los niveles séricos de PSA.
Resultados. Mediante citometria de flujo hemos observado que
los niveles de reactividad de IgM del suero de individuos sanos frente a las líneas de tumor de próstata humanas, DU145 y PC3, se relacionan con la expresión del epitopo A10 en carbohidrato de tumor
de Ehrlich (ELISA) (p=.001). Por otra parte hemos observado un
mayor grado de expresión de A10 en Hiperplasias Benignas de próstata en comparación con Adenocarc inomas de próstata (p=.01) así
como también entre tumores de bajo grado histológico de Gleason
en comparación con tumores de alto grado (p=.001). Los valores séricos de PSA al momento del diagnostico histológico aparecen incrementados en Adenocarcinomas de próstata de alto grado histológico en comparación con los de bajo grado y con Hiperplasias Benignas de próstata, con y sin PIN (p=.001 y .003, respectivamente). Además cuanto mayores son los niveles de PSA al diagnostico histológico menores son los niveles de expresión de A10. Por otra parte los
Adenocarcinomas de próstata que expresan altos niveles de A10 al
momento del diagnóstico histológico responden mejor a los tratamientos convencionales (Bloqueo Androgénico Completo, Prostatectomía Radical, Radioterapia) que los que son A10 negativos o
muestran una débil expresión de A10 (p=.041) según niveles de recidiva de PSA después del tratamiento. En conclusión el grado de
expresión del epitopo A10 se relaciona con el comportamiento biológico de los tumores de próstata humanos y con la inmunoreactividad de los anticuerpos de IgM.
115. CUANTIFICACIÓN DEL COMPONENTE MONOCLONAL EN
MIELOMA MÚLTIPLE MEDIANTE ELUCIÓN DEL PRODUCTO DE INMUNOSUSTRACCIÓN. Gómez-Rial J, Hermenegildo IN, González-Porqué P, Villar Guimerans LM. Hospital Ramón
y Cajal. Madrid.
Introducción. La cuantificación del componente monoclonal se
ha convertido en un objetivo importante para el seguimiento de los
pacientes con Mieloma Múltiple. Las técnicas convencionales de electroforesis en geles de Agarosa (EGA) y cuantificación nefelometrica
presentan problemas para la separación de la fracción policlonal de
la monoclonal. Una técnica de Electroforesis Capilar, la Inmunosustracción, permite la caracterización de paraproteínas mediante incubación del suero con bolas de agarosa que llevan unidos anticuerpos
específicos frente a las cadenas pesadas y ligeras de las Inmunoglobulinas
Objetivo. Puesta a punto de un método para la cuantificación del
componente monoclonal en el mieloma múltiple utilizando la tecnología de inmunosustracción (Beckman-Coulter).
Método. Tras la incubación del suero del paciente con las bolas de
agarosa correspondientes, se sometió esta a varios lavados en suero
salino, y se eluyó la inmunoglobulina inmunosustraída mediante incubación en un tampón ácido ó básico según el tipo de cadena pesada, y
posterior neutralización. La fracción eluída, se separó mediante elec-
INMUNOLOGÍA
troforesis capilar y se analizó mediante el software de Beckman-Coulter. El resultado final se expresa como el porcentaje de inmunoglobulina que corresponde al componente monoclonal con respecto a la inmunoglobulina total.
Resultado. Se han analizado mediante este método una serie de
pacientes con Mieloma Múltiple, a los cuales se ha realizado la cuantificación del pico monoclonal mediante nefelometría/AGE y mediante inmunosustracción. Los resultados obtenidos muestran una mayor
sensibilidad y especificidad de este método cuando se le compara
con los que están actualmente en uso así como una alta reproducibilidad.
Conclusiones. Se ha puesto a punto un método sensible y reproducible para la cuantificación del componente monoclonal en mieloma múltiple mediante la elución y posterior separación de la inmunoglobulina que se une a la matriz sólida durante la inmunosustracción.
116. CORRELACIÓN INVERSA ENTRE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS MHC DE CLASE I Y EL CRECIMIENTO IN VIVO EN
DOS SISTEMAS TUMORALES. Romero I, Berruguilla E, Garrido C, Linares I, Casares C, Stefanski J, Algarra I, Collado A, Garrido F, García-Lora AM. Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. Departamento de Ciencias de la
Salud, Universidad de Jaén.
Se ha desarrollado un modelo tumoral murino, B9, compuesto por diferentes metástasis espontáneas derivadas de un mismo
clon tumoral, que presentan diferentes fenotipos MHC de clase I:
MN – con un fenotipo positivo; MPA – con un fenotipo MHC de
clase I negativo, recuperable con IFN-γ; y MPB – con fenotipo negativo para MHC de clase I, e irrecuperable para la molécula L con
IFN-γ. También, hemos desarrollado un sistema tumoral humano,
Ando-2, compuesto por: una línea celular de melanoma humano,
con perdida de un haplotipo HLA; otra línea celular obtenida después del crecimiento en ratones nude, Ando-2nude, con perdida
total de expresión de moléculas MHC de clase I; y una tercera, obtenida por la transfección estable del gen HLA-A2 en la línea celular Ando-2, Ando-2-A2.
Se ha comparado el crecimiento in vivo de estas líneas celulares
en ratones inmunocompetentes en uno de los sistemas y en ratones
nude en los dos sistemas. Las células fueron inyectadas subcutáneamente en la pata y el crecimiento local del tumor fue controlado tres
veces en semana.
En el sistema B9, las tres líneas mostraron en ratones inmunocompetentes una correlación inversa entre el crecimiento del tumor y la
expresión de H-2 de clase I: La línea MPB presentó un crecimiento más
rápido comparado con la línea MPA, mientras que la línea MN que
comenzó creciendo, finalmente fue rechazada. En ratones nude las tres
líneas presentaron crecimiento local, con el siguiente orden:
MPB>MPA>MN. En el sistema tumoral Ando-2, en ratones nude, también se encontró una correlación inversa entre el crecimiento y la expresión de HLA de clase I: Ando-2nude presento un mayor crecimiento y
es la mas oncogénica; la línea celular Ando-2 creció más lentamente; y
por último, la línea Ando-2-A2, consiguió crecer al principio pero finalmente el tumor fue rechazado.
En estos dos sistemas tumorales, se ha encontrado una correlación
inversa entre el crecimiento in vivo y la expresión de moléculas MHC
de clase I en células tumorales.
POSTERS
117. LAS MOLÉCULAS HLA DE CLASE I PRESENTAN UN RITMO
CIRCARDIANO DE EXPRESIÓN EN CELULAS TUMORALES
Y EN LINFOCITOS TRANSFORMADOS. Stefanski J, Linares
Dickler I, Romero García I, Maleno I, Berruguilla Pérez E, Garrido Torrres-Puchol F, García Lora AM. Hospital Universitario Virgen
de las Nieves.
Diferentes procesos fisiológicos presentan una regulación circadiana, con ciclos que se repiten aproximadamente cada 24 horas. En mamíferos este ritmo circadiano es controlado por el núcleo supraquiasmático. Numerosos estudios han mostrado que las propias células periféricas, células inmortalizadas y células en cultivo presentan un reloj circardiano independiente. Estos ciclos circadianos están controlados principalmente por las familias de genes Clock, Period y Cry ptocrom. Dentro de la célula, se han descrito muchos genes que presentan una expresión circadiana, regulada por los genes mencionados anteriormente. En
este estudio hemos analizado si la expresión en superficie de moléculas
HLA de clase I presentan una expresión circadiana en líneas células
tumorales y en linfocitos transformados con el virus de Epstein-Barr.
Las células en cultivo fueron sincronizadas mediante un shock de
suero, y la expresión en superficie de moléculas HLA de clase I fue
medida cada 6 h, por inmunofluorescencia indirecta y lectura por citometría de flujo. Se han utilizado una línea celular de melanoma y una
línea de linfocitos transformados con EBV.
Una vez sincronizadas las células en cultivo, los resultados mostraron que la expresión de moléculas HLA de clase I presenta un ritmo circadiano tanto en células tumorales como en los linfocitos transformados.
La expresión disminuye durante las primeras 12 h después de la
sincronización; a continuación, aumenta alcanzando un máximo a
las 24 a 30 h, para finalmente decaer a las 36 h. Podemos decir que el
ciclo empieza a las 12 h y termina a las 36 h, teniendo un ritmo circadi ano de aproximadamente 24 h..
Los resultados obtenidos muestran que la expresión de moléculas
HLA de clase I en estos dos casos de líneas celulares en cultivo presenta un ritmo circadiano, abriendo la posibilidad de que en la expresión
de moléculas HLA de clase I desempeñe un papel importante los genes
que regulan el ritmo circ adiano a nivel celular.
118. COMPARACIÓN DE 2 ENSAYOS PARA LA DETERMINACIÓN DE CADENAS LIGERAS LIBRES EN SUERO EN
PACIENTES CON GAMMAPATÍA MONOCLONAL. Morandeira F1, Soriano A1, Quandt E1, Castro P1, Ruiz E1, Oriol A2, Pujol
R1, Herrero MJ1. 1Servicio de Inmunologia (LIRAD-BST). 2Servicio de
Hematologia – ICO del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
UAB. Badalona.
Introducción. En las gammapatías monoclonales se ha descrito
una sobreproducción de cadenas ligeras libres kappa (κ) o lambda (λ),
que en muchos casos resulta en una alteración de la ratio κ/λ normal
en suero. Estudios previos han demostrado que el valor de esta ratio
es de utilidad en el diagnóstico, monitorización y evaluación del pronóstico (evolución a malignidad) de estas patologías.
Objetivo. Comparar la sensibilidad de dos sistemas de determinación de la ratio κ/λ en suero y su correlación con la clínica en pacientes con gammapatía monoclonal.
Pacientes y métodos. Se analizaron 47 muestras de suero pertenecientes a pacientes con banda monoclonal detectada por inmunofija-
95
POSTERS
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
ción. Se dosificaron las cadenas κ y λ libres mediante nefelómetro
utilizando reactivos de 2 proveedores (P1 y P2): uno validado para uso
en suero (P1) y otro para orina adaptado a medición en suero (P2), y
se calculó la ratio κ/λ de cada suero.
Resultados. De los 47 sueros analizados, 16 (34%) dieron una ratio
κ/λ alterada (intervalo de referencia: 0.26-1.65) con los reactivos del
P1 y 9 (19%) con los del P2, todos ellos detectados también con los reactivos del P1. Los 7 (15%) sueros con resultado discrepante entre P1 y
P2 correspondían a positivos reales (3 a mieloma múltiple (MM) de
inmunoglobulina intacta, 2 a MM de cadena ligera y 2 a gammapatía
monoclonal de significado incierto).
Conclusiones. Los reactivos del P1 tienen más sensibilidad para
la detección de ratios κ/λ alteradas que los del P2. Es importante utilizar la técnica más sensible de que se disponga para un mejor diagnóstico y seguimiento de estos pacientes.
SESIÓN 8: INMUNIDAD E INFECCIÓN
Moderadores: Dr. Francisco Lozano (Barcelona),
Dra. Margarita Bofill (Barcelona)
119. LOS NIVELES BASALES DE LINFOCITOS CD8+CD25+ PUEDEN SER UN MARCADOR PREDICTIVO DE SINDROME DE
RECONSTITUCION INMUNE TRAS TARGA. García Delgado
R1, Cianchetta Sivori M1, Raso Torres S1, Gorgolas-Hernández de
Mora M2, Goyenechea A2, Fernández-Guerrero M2. 1Inmunología.
2Infecciosas. Fundación Jiménez Díaz-CAPIO.
Objetivos. En los pacientes VIH+ que inician terapia antiretroviral de alta eficacia se puede observar una disminución de la carga viral
junto con un aumento de los linfocitos CD4 y en algunos pacientes esta
reconstitución inmunológica lleva a una importante reacción inflamatoria o a un deterioro clínico producido por el incremento súbito de su
respuesta inmune (Síndrome de Reconstitución Inmunológica). El objetivo de este trabajo es encontrar un parámetro inmunológico que pueda predecir este comportamiento.
Pacientes y Métodos. Se han evaluado 55 pacientes VIH+ naive
de tratamiento o sin tratamiento antiretroviral el año anterior al estudio, con linfocitos CD4 < de 100 cels/ul y una carga viral de VIH1 >4,5
Log. En ellos se han estudiado por citometría de flujo los linfocitos naive y de memoria y marc adores de activación basalmente y durante
los 6 meses siguientes al comienzo de terapia anti-retroviral.
Resultados. En los 5 pacientes que presentaron RSI del aumento de los linfocitos CD4 a los seis meses de tratamiento anti-retroviral fue 8 veces superior al valor basal, mientas que en los que no
presentaron SRI fue de 4 veces su valor basal a 6 meses de tratamiento, siendo el descenso de la carga viral VIH-1 de un 90% con
respecto a su valor basal frente al 70% en los pacientes sin SRI. La
elevación de estos linfocitos CD4 en ambos tipos de pacientes es
siempre debida al aumento de los linfocitos CD4CD45RO (memoria). Cuando se analizaron los marcadores de activación de los linfocitos CD4 y CD8 (CD38, HLA-DR, CD25) se encontró una diferencia significativa entre los niveles basales de linfocitos CD8CD25
entre los pacientes que presentan SRI y los que no (SRI 17 ± 32% vs
pacientes sin SRI 4 ± 6.8% p= 0.07) c on una disminución marcada
a lo largo del tratamiento de los linfocitos CD8CD25 en los pacientes que presentan SRI.
96
Conclusiones. El nivel basal de los linfocitos CD8CD25 y su evolución con el tratamiento antiretroviral podría ser un parámetro inmunológico útil para distinguir los pacientes que, con unos CD4 inferior
es a 100 células /ml y una carga viral mayor de 4-5 Log, van a presentar un síndrome de reconstitución inmune con el inicio de la terapia
anti-retroviral.
120.POLIMORFISMOS EN GENES DE CITOQUINAS IMPLICADAS EN INFLAMACIÓN NO ESTÁN ASOCIADOS CON EL
RIESGO DE SUFRIR SEPSIS. Guzmán Fulgencio M1, Sirgo Gonzalez G2, Castillo Rama M1, Bernardo González I1, Mancebo Sierra E1, Romo Pasamar E1, Pérez V1, Paz Artal E1, Morales Pérez
P1. 1Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid. 2Departamento de
Cuidados Intensivos. Hospital Universitario Joan XXIII, Tarragona.
La sepsis es una patología que se define como la respuesta inflamatoria sistémica a la infecci ón. El objetivo de este estudio es valorar si los polimorfismos de genes implicados en inflamación como los
situados en las regiones promotoras de los genes de las citoquinas proinflamatoria TNF-a (-308G>A) y anti-inflamatoria IL-10 (-592C>A),
incrementan el riesgo de sufrir sepsis. El estudio se ha realizado con
107 pacientes sépticos que proceden de la unidad de cuidados intensivos Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital 12 de Octubre
(Madrid, España) y el Hospital Joan XXIII (Tarragona, España) y 107
controles. Los distintos genotipos han sido determinados empleando
la reacción en cadena de la polimerasa seguida del análisis por fragmentos de restricción a partir de ADN extraído de sangre periférica.
Los resultados obtenidos fueron comparados por el test estadístico de
Chi-cuadrado aplicando la corrección de Yates . El análisis estadístico reveló la falta de diferenci as signific ativas en las frecuencias génicas de los polimorfismos estudiados comparados con controles tanto
en el polimorfismo del gen TNF-a (p= 0,99) , como en el polimorfismo
en el gen IL-10 (p=0,47). Podemos concluir entonces que los polimorfismos estudiados no estan asociados con el riesgo a sufrir sepsis.
121.EL POLIMORFISMO INSERCIÓN/DELECIÓN EN EL GEN DE
LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA (ACE)
ESTÁ ASOCIADOS CON EL RIESGO DE SUFRIR SEPSIS. Guzmán Fulgencio M1, Sirgo Gonzalez G2, Castillo Rama M1, Bernardo Gonzalez I1, Mancebo Sierra E1, Romo Pasamar E1, Pérez Aradas V1, Paz Artal E1, Morales Pérez P1. 1Servicio Inmunología. Hospital Universitario 12 Octubre. 2Unidad de Cuidados Intensivos. Hospital Universitario Joan XXIII, Tarragona.
La sepsis es una patología que se define como la respuesta inflamatoria sistémica a la infección. El objetivo de este estudio es evaluar si el polimorfismo Inserci ón /Deleción en el intron 16 del gen de
la Enzima Convertidora de Angiotensina (ACE) incrementa o no el
riesgo de sufrir sepsis. El estudio se ha realizado con 100 pacientes sépticos que proceden de la unidad de cuidados intensivos de dos hospitales universitarios y 107 controles. Los distintos genotipos han sido
determinados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y electroforesis en gel de acrilamida. Los resultados obtenidos fueron
comparados por el test estadístico de Chi-cuadrado aplicando la corrección de Yates. Los resultados mostraron el genotipo DD en 51 pacientes (51%), el genotipo ID en 31 (31%) y el genotipo II in 18 (18%). Los
pacientes sépticos mostraban una mayor frecuencia del genotipo DD
INMUNOLOGÍA
comparados con controles (51% vs 35,5% p =0,035) y del alelo D comparado con el alelo I (66,5 vs 49,1% p =0,02). Podemos concluir, por
tanto, que el alelo D de este gen está asociado con el riesgo de sufrir
sepsis.
122.SUPRESSION OF INFLAMMATORY RESPONSES BY LABDANE-TYPE DITERPENOIDS. Hortelano Blanco S1, de las Heras
B2, López R1, Giron N2, Traves PG3, Rodriguez B4, Boscá L3. 1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid. 2Departamento de Farmacología Facultad de Farmacia, Universidad Complutense, Madrid. 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols
CSIC-UAM), Madrid. 4Instituto de Química Orgánica (CSIC), Juan de
la Cierva, Madrid.
Diterpenoids are natural products which have been reported to
possess a variety of biological properties, including antimicrobial, antiviral, inmunomodulating and anti-inflammatory activities. As part of
an intensive program of research into the biological activities of terpenoids, a ser ies of 11 labdane-type diterpenoids (1-11) with various patterns of substitution were tested for potential anti-inflammatory activity. Of these compounds, 4 and 11 were selected to evaluate their
influence on targets relevant to the regulation of the inflammatory response in order to investigate the mechanism of action of this class of
compounds. These diterpenoids reduced the production of nitric oxide, prostaglandin E2, and tumor necrosis factor-alpha in LPS-activated RAW 264.7 macrophages, with IC50 in the range 1-10 microM. Inhibition of these inflammatory mediators was related to inhibition of the
expression of nitric oxide synthase-2 (NOS-2) and cyclooxygenase-2
(COX-2) at the transcriptional level, as determined by western-blot and
RT-PCR. Examination of the effects of these diterpenoids on nuclear
factor kappaB (NF-kB) signaling showed that both compounds inhibit the phosphorylation of IkBalpha and IkBbeta, preventing their
degradation and the nuclear translocation of the NF-kB p65 subunit.
Inhibition of IKK ac tivity was also observed. These derivatives displayed significant anti-inflammatory activity in vivo, suppressing mouse ear edema induced by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)
and inhibiting myeloperoxidase activity, an index of neutrophil infiltration. The anti-inflammatory effects of these labdane diterpenoids,
together with their low cell toxicity, suggest potential therapeutic applications in the regulation of the inflammatory response.
123.EL VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL HUMANO INFECTA
E INDUCE MARCADORES DE ACTIVACIÓN EN LINFOCITOS B MURINOS. Rico MA1, Trento A2, Ramos M3, Johnstone C3,
del Val M3, Melero JA3, López D1. 1Unidad de Proteomica. 2Unidad de
Biología Viral. 3Unidad de Inmunología Viral. Centro Nacional de Microbiología. ISCIII.
El virus Respiratorio Sincitial Humano (HRSV) es la causa más
frecuente de infecciones respiratorias severas en niños. Aunque las
células epiteliales de los conductos respiratorios son la principal diana de infección por parte de HRSV, se ha descrito que este virus puede también infectar células presentadoras profesionales como macrófagos y células dendríticas. En dichas células la infecc ión conlleva la
expresión de marcadores de maduración. El presente estudio, demuestra que linfocitos B (B220+) pr ovenientes de bazo de ratón son susceptibles a la infección in vitro por parte de HRSV, probablemente por un
POSTERS
mecanismo dependiente de unión a glicosaminoglicanos. Por el contrario, HRSV es incapaz de infectar ni linfocitos CD4+ ni CD8+. En linfocitos B, la infección por HRSV aumenta la expresión de moléculas
de MHC de clase II pero no MHC de clase I induciendo además la
expresión del marcador de activación CD86.
124.INTERACCIÓN DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (VFA)
CON CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs): PAPEL DE LA INTERLEUQUINA-10 (IL-10) EN LA INDUCCIÓN DE UN ESTADO
DE INMUNOSUPRESIÓN TEMPRANA DURANTE LA INFECCIÓN POR VFA EN EL CERDO. Rodríguez Calvo MT1, Díaz San
Segundo F2, Sevilla Hidalgo N1. 1Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA). 2Plum Island Animal Disease Center.
Las células dendríticas (DCs) constituyen un elemento crítico en
la activación de una respuesta inmune eficaz. En el caso del virus de
la fiebre aftosa (VFA), causante de una de las enfermedades más importantes en sanidad animal desde el punto de vista económico, la interacción virus-DC y su influencia en la inducción de una respuesta inmune frente a virus es poco conocida. En nuestro laboratorio se ha descrito que el virus de la fiebre aftosa (VFA) serotipo C es capaz de infectar linfocitos in vivo, originando la aparición de linfopenia y depleción
linfoide. Asimismo, los linfocitos son incapaces de responder frente a
una estimulación con mitógeno, lo que indica que los animales se
encuentran inmunosuprimidos en el pico de viremia (J. Virol. (2006)
80: 2369). En el presente trabajo hemos estudiado el papel de las DCs
en esta inmunosupresión. Para ello, DCs fueron diferenciadas a partir
de monocitos periféricos (PBMCs) obtenidos de cerdos infectados con
VFA en presencia de GM-CSF e IL-4. Estas células pierden su capacidad de madurar y presentar antígenos a células T en un ensayo de alorreactividad. Asimismo, cuando DCs diferenciadas a partir de PBMCs
de cerdos naïve fueron infectadas in vitro con VFA se observó que eran
incapaces de activar una respuesta T específica de antígeno. Estos cultivos de DCs expuestas al virus producen interleuquina-10 ( IL-10) y
, lo que es más interesante, los sobrenadantes de estos cultivos añadidos a DCs naïve inducen un estado de inactivación de células T en cocultivos DCs-células T. Además, sueros procedentes de cerdos infectados con VFA muestran altos niveles de IL-10 a tiempos tempranos
post-infección. Estos datos sugieren que la IL-10 estaría produciendo
la inhibición de una respuesta timo dependiente (TD) durante el pico
de viremia, lo que favorecería la activación de una respuesta timo independiente (TI) y la consiguiente producción de anticuerpos capaces de
eliminar el virus. Actualmente se están realizando experimentos para
evaluar esta posibilidad.
125.NUEVOS VECTORES VACUNALES DE PSEUDO PARTICULAS VIRALES DE CALICIVIRUS. Crisci E1, Almanza H2, Mena
I2, Gómez-Casado E3, Córdoba L1, Fraile L1, Bárcena J2, Montoya
M1. 1Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona. 2Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Valdeolmos, Madrid. 3Dpto. Biotecnología, INIA, Madrid.
La proteína de la cápsida (VP60) del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) es capaz de formar pseudo partículas virales (VLPs) cuando se expresa en baculovirus (Bárcena et el, 2004). Las
VLPs representan un tipo particularmente efectivo de vacunas de subu-
97
POSTERS
nidad, puesto que mimetizan la estructura general de las partículas
virales, no contienen material genético infeccioso y resultan muy inmunógenas incluso en ausencia de adyuvantes. Además trabajos recientes subrayan el potencial inmunomodulador que pueden jugar las VLPs
en su interacción con las células dendríticas (CDs), y su capaci dad
para inducir una respuesta inmune frente a epítopos heterólogos. El
objetivo del estudio ha sido evaluar las interacciones in vitro entre nuevas VLPs quiméricas con las CDs murinas y su posible papel como
vectores vacunales in vivo. Se han construido VLPs quiméricas de
RHDV conteniendo el epítopo antigénico de OVA insertado en dos
localizaciones diferentes de la proteína VP60: en el extremo N-terminal (2GS-3OVA2) o en un bucle expuesto (306GS-3OVA2). Como control negativo se emplearon VLPs de RHDV sin inserciones. Las diferentes VLPs se incubaron con CDs murinas derivadas de medula ósea
y se analizó la presentación antigénica a un hibridoma específic o que
reconoce el péptido antigénico SIINFEKL presentado por MHC de clase I. De las diferentes VLPs la más inmunógena resultó ser la que incluía el péptido antigénico en la posición amino terminal (VLP-2GS3OVA2), con un reconocimiento dependiente de dosis. Se está estudiando si esta presentación antigénica es dependiente de los interferones de tipo I. La capacidad de inmunogénica de estas construcciones in vivo se ha estudiado en ratones hembras C57BL/6 inoculados
con diferentes dosis de VLPs (8 y 40 μg) tras lo cual se desafió con el
virus vaccinia que expresa OVA. En resumen, la utilización de estos
vectores vacunales recombinantes supone una nueva estrategia segura para inducir inmunidad protectora.
126.INMUNOMODULACION EN CERDOS VACUNADOS CON
VACUNA VIVA MODIFICADA DEL VIRUS DEL SINDROME
REPRODUCTOR Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRSV). Crisci E, Fraile L, Gimeno M, Diaz I, Mateu E, Montoya M. Centre de
Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona.
El objetivo de este estudio es evaluar si la administración de un
inmunomodulador, cuyo ingrediente principal es el beta-sitosterol,
mejora la respuesta inmune en cerdos de engorde a los que se vacuna con una vacuna viva modificada del virus del síndrome reproductor y respir atorio porci no (MLV PRRS). Esta molécula y su glicósido
tiene actividad inmunomoduladora en animales incrementando la actividad Th1. Se utilizaron 24 cerdos distribuidos en 4 grupos experimentales (NP/NV, NP/V, P/NV y P/V). 12 animals recibieron immunomodulador (P) con el alimento durante 8 semanas. A las 13 semanas
de edad, 12 animales se vacunaron con MLV PRRS (V) o con suero fisiológico (NV). Se obtuvieron células mononucleares (PMBC), se determinaron las subpoblaciones celulares por citometría de flujo y se estimularon con PHA a diferentes concentraciones. No se observó ninguna modificación en las subpoblaciones celulares de PBMC estudiadas salvo un incremento significativo en las células dendríticas plasmacitoides en el grupo experimental NP/V. Sin embargo, se observó
una disminución en la respuesta proliferativa por PHA en el grupo
experimental NP/V durante los dos primeros días post-vacunación.
Este efecto se revertía si se utilizaba inmunomodulador en los animales. No se han observado diferencias significativas en la viremia de
PRRS y en el título de anticuerpos neutralizantes entre los grupos experimentales. Por otra parte los niveles de IL-6 es más bajo a los 33 días
post-administración en el grupo P/V. Los datos obtenidos indican que
el tratamiento mejora la respuesta innata y que el daño tisular (como
98
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
niveles de IL-6) era menor en el grupo tratado con el inmunomodulador. Sin embargo, no se han observado diferencias signifi cativas
en la respuesta inmune adquirida. El desarrollo de una estrategia vacunal más eficaz frente a este virus es un gran reto científic o y, mientras no exista una vacuna eficaz, el uso de este inmunomodulador incrementa la respuesta inmune contra PRRSV.
127.RESPUESTA ESPECÍFICA DE CÉLULAS T CD4+ Y CD8+ FRENTE AL VHC EN PACIENTES CON HEPATITIS CRÓNICA C
CON Y SIN INFECCIÓN POR VIH. Rallón NI, López M, García-Samaniego J, Soriano V, Romero M, Moreno A, Labarga P, García-Gascó P, Benito JM. Servicios de Hepatología y Enfermedades Infecciosas. Hospital Carlos III. CIBEREHD. Madrid.
Introducción. La respuesta celular frente a VHC es débil en la
mayoría de pacientes con hepatitis crónica C (HCC). Esta respuesta
puede ser aún menor en pacientes coinfectados por VIH. En este estudio se examina el perfil funcional de las células T específicas frente al
VHC en pacientes con HCC con y sin infección por VIH.
Métodos. Se midió la respuesta específica de células T CD4+ y
CD8+ en 30 pacientes con HCC sin tratamiento previo. 10 eran monoinfectados por VHC y 20 coinfectados VIH/VHC. El perfil de producción de citoquinas (IFN-γ, IL-2 y TNF-α) en respuesta a 324 péptidos
solapantes de cinco proteínas del VHC (E2, p7, NS3, NS5a, NS5b) se
analizó mediante citometría de flujo de 5 colores.
Resultados. La mayoría de pacientes (>80%) en ambos grupos presentó respuesta detectable CD4+ ó CD8+ frente a las proteínas del VHC.
Los niveles de respuesta total CD4+ y CD8+ fueron también similares
en ambos grupos. El perfil de citoquinas producidas por células T CD4+
y CD8+ específicas estuvo dominado por TNF-α en ambos grupos. Sin
embargo, la contribución de las células TNF-α+ a la respuesta CD4+
frente a NS3 y NS5a fue significativamente mayor en los pacientes
VHC+/VIH+ que en los VHC+/VIH-, mientras que la contribución
de las células IL2+ a la respuesta CD4+ fue más alta en los pacientes
VHC+/VIH- que en los VHC+/VIH+ (p=ns). En pacientes con genotipo 1 se observó una asociación entre la contribución de las células
que producen únicamente TNF-α a la respuesta CD4+ frente a la proteína NS5a y la carga viral del VHC (r=0.86, p=0.01).
Conclusiones. El perfil funcional de las células T frente al VHC se
limita a una sola función dominada por TNF-α. La capacidad de las
células CD4+ para producir IL2 frente al VHC está disminuida en
pacientes coi-nfectados por VIH. El nivel más elevado de contribución
de las células que producen únicamente TNF-α a la respuesta CD4+
en pacientes coinfectados, podría explicar el peor control de la replicación del VHC en estos pacientes.
128.ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO DEL PTPN22 EN LA EVOLUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA HEPATITIS
C. Montes Cano MA1, García-Lozano JR1, Caro-Oleas JL1, Romero-Gómez M2, Martín J3, Aguilar-Reina J4, Núñez-Roldán A1, González-Escribano MF1. 1Servicio de Inmunología. HU Virgen del Rocío.
Sevilla. 2Servicio de Digestivo de Hospital Universitario de Valme. Sevilla. 3Instituto de Parasitología y Biomedicina "López Neyra". Granada.
4Sección de Hepatología del Hospital Universitario Virgen del Rocío.
Introducción. La evolución de la infección por virus de la hepatitis C (HCV) presenta grandes diferencias entre los pacientes que podrí-
INMUNOLOGÍA
an estar influenciadas por factores genéticos del huésped. El gen
PTPN22 codifica una proteína intracelular que interviene en la regulación de la activación de las células T, NK, y neutrófilos y que se ha
relacionado con la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes e infecciosas.
Objetivos. Analizar la posible asociación del SNP C1858T del
gen PTPN22 en el desarrollo de hepatitis crónica, en la evolución
de la misma y en la respuesta al tratamiento en pacientes con infección VHC. Pacientes y Métodos: Se incluyeron 353 pacientes de los
cuales 69 eran aclaramientos virales espontáneos (AVE) y 284 pacientes con infección crónica (IC). Los pacientes con infección crónica
se estratificaron según el índice de Scheuer de fibrosis en F0-F2 (n=202)
y F3-F4 (n=82), y según su respuesta al tratamiento en individuos con
respuesta sostenida (SR, n=105) y sin respuesta sostenida (NSR,
n=110). El genotipado del SNP C1858T rs2476601 se realizó utilizando sondas TaqMan. Los resultados se analizaron utilizando la chi cuadrado. Se consideraron significativos valores de p<0.05 y con tendencia valores de p entre 0.25 y 0.05.
Resultados. No se encontraron diferencias signific ativas en la distribución de frecuencias del polimorfismo analizado entre el grupo de
pacientes con AVE (92.5% CC, 7.5% CT+TT) y el grupo de pacientes
con IC (87.5% CC, 12.5% CT+TT, p=0.6). Tampoco se encontraron diferencias significativas entre los grupos de pacientes en estadio F0-F2 y
F3-F4 (88.5% CC y 11.5% CT+TT vs. 85.2% CC y 14.8% CT+TT respectivamente, p=0.5). Por último no se encontraron diferencias entre el
grupo RS y el NRS (85.7 CC y 14.3% CT+TT vs. 88.2% y 11.8% respectivamente, p=0.6).
Conclusión. El polimorfismo C1858T del gen PTPN22 no parece
jugar un papel ni en la susceptibilidad a la infección ni en la evolución
de la enfermedad por este virus.
129.POLIMORFISMO DEL CODÓN 25 DEL GEN TGF-BETA-11 EN
LA EVOLUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA
HEPATITIS C. Montes-Cano MA1, García-Lozano JR1, Dávila B1,
Romero M2, Aguilar-Reina J3, Núñez-Roldán A1, González-Escribano MF1. 1Servicio de Inmunología. HU Virgen del Rocío. Sevilla. 2Servicio de Digestivo de Hospital Universitario. Sevilla. 3Sección de Hepatología. HU Virgen del Rocío. Sevilla.
Introducción. La evolución de la infección por virus de la hepatitis C (HCV) presenta grandes diferencias entre los pacientes que podrían estar influenciadas por factores genéticos del huésped. El polimorfismo Arg25Pro en el gen TGF-beta-1 podría relacionarse con diferencias en los niveles de la citocina, de manera que los individuos Arg/Arg
presentarían niveles mas elevados de la misma que podrían relacionarse con una peor r espuesta antiviral.
Objetivos. Analizar la posible asociación del polimorfismo
Arg25Pro del gen TGF-beta-1 en el desarrollo de hepatitis crónica, en
la evolución de la misma y en la respuesta al tratamiento en pacientes
con infección por VHC.
Pacientes y Métodos. Se incluyeron 353 pacientes de los cuales 69
eran aclaramientos virales espontáneos (AVE) y 284 pacientes con infección crónica (IC). Los pacientes con infección crónica se estratificaron
según el índice de Scheuer de fibrosis en F0-F2 (n=202) y F3-F4 (n=82),
y según su respuesta a la terapia antiviral en individuos con respuesta sostenida (SR, n=135) y sin respuesta sostenida (NSR, n=113). El
genotipado se realizó mediante PCR-RFLP con el enzima de restricción FseI. El análisis se realizó utilizando la chi cuadrado. Se consi-
POSTERS
deraron significativos valores de p<0.05 y con tendencia valores de p
entre 0.25 y 0.05.
Resultados. No se encontraron diferencias significativas en la distribución de frecuencias del polimorfismo analizado entre los pacientes con AVE (87.7% CC, 12.3% CG+GG) y los pacientes con IC (84.1%
CC, 15.8% CG+GG, p=0.5) ni entre los grupos F0-F2 y F3-F4 (82.7% CC
y 17.3% CG+GG vs. 87.8% CC y 12.2% CG+GG respectivamente, p=0.3).
Al comparar el grupo RS y el NRS se encontró una tendencia hacia una
mayor frecuencia de individuos Arg/Arg en el grupo NRS (79.2 CC
y 20.8% CG+GG en el grupo RS vs. 86.7% y 13.3% en el grupo NRS,
p=0.12).
Conclusión. No se puede descartar cierta influencia del polimorfismo Arg25Pro del gen TGF-beta1 en la respuesta al tratamiento antiviral en la infección por HCV.
130.LA PROTEINA LISOSOMAL LIMP-2 PERTENECE A LOS
COMPONENTES DEL SISTEMA INMUNE INNATO LIGADO
A RAB5A FRENTE A LISTERIA MONOCYTOGENES. Fernández Prieto L, Madrazo Toca F, Gómez López MT, del Cerro Vadillo E, Carrasco Marin E, Alvarez Dominguez C. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla-IFIMA
La inmunidad innata frente a Listeria monocytogenes depende
de la degradación bacteriana dentro de los fagosomas. Describimos
el papel de la proteína de membrana lisosomal, Limp-2/lgp85/CD36like, como componente de los mecanismos bactericidas no oxidativos de las células hospedadoras de este patógeno. La acción de Limp2 está ligada a la activación de Rab5a y se restringe al ambiente fagosomal. Limp-2 ejerce su acción listericida controlando las interaciones con los endosomas tardíos-lisosomas que transforman el lumen
y la membrana fagosomal que contienen a este patógeno. Sin embargo, la acción de Limp-2 no se restringe solo a células permisivas para
el crecimiento de este patógeno, sino también a los macrofagos y a la
respuesta innata global, lo cuál se observa por un incremento 10 veces
más alto en la tasa bacteriana de los bazos de ratones defic ientes
geneticamente en Limp-2. Estos resultados forman parte de la estrategia intracellular de este patógeno para evitar la degradación lisosomal.
131.AFRICAN SWINE FEVER VIRUS A238L PROTEIN BLOCKS
THE HOST CELL ANTIVIRAL INFLAMMATORY RESPONSE
THROUGH A DIRECT INHIBITION ON PKC-THETA-MEDIATED P300 TRANSACTIVATION. González Granja A2, García
Sánchez E1, Sabina Villar P1, López Carrascosa A1, Fresno Escudero M1, Revilla Novella Y1. 1Centro de Biología Molecular. 2Cáncer
Research UK London Research Institute.
During a viral infection, reprogramming of the host cell gene
expression pattern is required, to establish an adequate antiviral
response. The transcriptional coactivators p300 and CBP play a central role in this regulation by promoting the assembly of transcription enhancer complexes to specific promoters of immune and proinflammatory genes. Here we show that the protein A238L encoded by African swine fever virus counteracts the host cell inflammatory response through the control of p300 transactivation. By
using DNA-protein pull-down assays with biotinilated DNA specific probes, we demonstrate that A238L inhibits the expression of
99
POSTERS
the enzyme COX-2 and the cytokines TNF-alpha and IL-2 by preventing the recruitment of p300 to the enhanceosome formed on
their promoters. Furthermore, we report that A238L inhibits the
activity mediated by a GAL4-p300 reporter construction of the amino terminal TAD of p300 during the viral infec tion, and that the
amino terminal CH1 regulatory region of p300 is essential in the
A238L-mediated inhibition of the inflammatory response. Importantly, through specific mutagenesis analysis, we found that the
residue serine 384 of p300 is required for the viral protein to accomplish its inhibitory function and that PKC-theta completely reverted this inhibition, thus showing that this signaling pathway is interfered by A238L during the viral infection. These findings shed new
light on how viruses alter the host cell antiviral gene expression
pattern through the blockade of the p300 activity, which represents
a new and sophisticated viral mechanism to evade the inflammatory and immune defensive responses.
132.RESPUESTA VACUNAL A S. PNEUMONIAE EN PACIENTES
CON DIFERENTE GRADO DE TRAUMATISMO ESPLENICO.
Troya-Diaz J1, Oller-Sales B1, Martínez-Arconada MJ2, Pacha MA1,
Rodrigo MJ3, Roca J4, Rodríguez N1, Fernández-Llamazares J1,
Pujol-Borrell R2, Martínez-Caceres E2. 1Servicio de Cirugía General y Digestiva. Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. UAB.
Badalona. 2Servicio de Inmunologia (LIRAD-BST). Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. UAB. Badalona. 3Sección Inmunología. Hospital General Vall d’ Hebrón. UAB: Barcelona. 4Servicio de Epidemiologia. Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. UAB. Badalona.
Desde que en 1952 se estableció la relación clínica entre esplenectomía y riesgo de sepsis, se ha introducido una actitud terapéutica
más conservadora ante el traumatismo esplénico (TE), incluso en
bazos con desvascularización y destrucción tisular importante. Se
desconoce el grado de afectación de su función inmunológica. Objetivo: Cuantific ar la función esplénica en un grupo de pacientes con
diferente grado de TE y en relación al tratamiento recibido: conservador no quirúrgico, exéretico total o autotrasplante Metodología: 1)
Anamnesis (infecciones); 2) Hematológico: pits y corpúsculos HowellJoly; 3) Estudio isotópico dinámico; 4) Inmunológico: poblaciones linfocitarias y respuesta vacunal a S. pneumoniae (IgG e IgM) y H
influenzae (IgG). Análisis estadístico test no paramétricos Kruskal
Wallis y Willcoxon (SAS9.1.3). SE si P<0,05 Resultados: se han analizado 41 pacientes con TE distribuidos según la presencia de tejido
esplénico en: A) trat. conservador (n=26); B) autotrasplante (n=5); C)
esplenectomía±esplenosis (n=10). No se han encontrado diferencias
dentro del grupo A independientemente del grado de lesión (leve: IIII, severo: IV-V) . Comparando el grupo A con pacientes intervenidos (grupos B, C), se ha detectado incremento del % de “pits”
(P<.0001) y corpúsculos (P=0.0002), y descenso en % CD3+ (P= 0.0005),
CD4+ (P=0.0006), % y MFI de CD19+CD54+ (P= 0.0019 y P= 0.0166)),
así como del % de células CD19+IgMhighIgDlow implicada en la respuesta T-independiente (TI) (P=0.0036) en los grupos intervenidos.
Estas diferencias se mantienen cuando se comparan los tres grupos
por separado, si bien el grupo B (autotrasplante) es más similar al
grupo A. Todos los pacientes han respondido a H. Influenzae y han
presentado respuestas IgG valorables a S. pneumoniae, aunque con
incremento menor en los pacientes intervenidos (B,C). La respuesta
anti-S. pneumoniae IgM se ve mermada en los pacientes del grupo
C. Así mismo, en el grupo A los traumatismos graves (IV-V) pre-
100
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
sentan menor incremento en comparación con los leves, lo que obliga a cuestionar su funcionalismo en cuanto a la respuesta rápida a
Ag TI-2.
133.VACUNA COMBINADA DNA/MVA FRENTE AL VIRUS DE
LA LENGUA AZUL: EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE PROTECTORA EN UN MODELO DE RATÓN. Calvo Pinilla E, Sevilla N, Ortego J. CISA-INIA.
El virus de la lengua azul (BTV) causa una enfermedad infec ciosa, transmitida por mosquitos Culicoides, que afecta a rumiantes y está
ampliamente distribuida por todo el mundo. Las vacunas atenuadas
e inactivadas empleadas hasta el momento no son del todo eficaces ni
seguras. Las vacunas DNA y los vectores vacunales basados en poxvirus son una buena estrategia para inducir protección frente a otras
enfermedades. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de una vacuna marcadora recombinante basada en DNA y virus vaccinia recombinante cepa Ankara (MVA) que sea segura y efectiva, permitiendo
diferenciar entre animales vacunados e infectados. Los segmentos genómicos 2 y 6 del virus BTV-4/Menorca, que codifican las proteínas de
la cápsida exterior VP2 y VP5 respectivamente, se amplific aron mediante RT-PCR y fueron clonados en el vector de expresión pcDNA3, bajo
el control del promotor de citomegalovirus humano (CMV), y en el
plásmido de transferencia del virus vaccinia pSC11. Se generaron virus
MVA recombinantes mediante recombinación homóloga en el locus de
la timidina quinasa y se purif icaron mediante selección por el gen marcador LacZ. En ambos vectores se observó un alto nivel de expresión
de las proteínas VP2 y VP5 mediante inmunoprecipitación y se detectó mRNA mediante RT-PCR. El análisis de la respuesta inmune después de la vacunación con DNAs desnudos y rMVAs expresando estas
proteínas se evaluó en ratones C57BL/6. Los ratones fueron inoculados con una primera dosis de pcDNA3-VP2/VP5 y una segunda dosis
de rMVAs-VP2/VP5 detectándose altos títulos de anticuerpos neutralizantes frente a BTV-4 (log VNT=2). Estos títulos se mantuvieron al
menos 100 días después de la inmunización. La inducc ión de la respuesta T producida en estos ratones vacunados está siendo analizada.
Estos datos indican que la vacunación combinada DNA-MVA puede
ser muy útil para inducir inmunidad protectora frente al virus BTV,
evitando los problemas inherentes a las vacunas vivas atenuadas.
134.NUEVOS VECTORES VACUNALES CONTRA LA INFLUENZA BASADOS EN EL VIRUS DE LA PSEUDORRABIA PORCINA. Gómez-Casado E1, Mena I2, Crisci E3, Fraile L3, Córdoba
L3, Bárcena J2, Montoya M3. CISA-INI.
La enfermedad de Aujeszky (EA) o pseudorrabia (PR) está causada por un alfaherpesvirus porcino tipo 1 (PRV). El PRV se usa con éxito como vacuna contra la propia EA y frente a otros patógenos virales porcinos. Utilizando el modelo murino, se ha estudiado el comportamiento de nuevos vectores PRV con células dendríticas (CDs) in vitro,
y su papel como vectores vacunales in vivo contra el virus de la influenza murina. Se han generado dos virus recombinantes (PRVr) defectivos (gE-/gI-/TK-) expresando uno de ellos la proteína M2 del virus
de la gripe murina en fusión a la proteína GFP (PRV-M2-GFP), y el otro
virus con la fusión de la proteína modelo OVA a EGFP (PRV-OVAGFP). Los PRVr se incubaron in vitro con CDs murinas derivadas de
medula ósea y se analizó la presentación antigénica mediante un hibri-
INMUNOLOGÍA
doma específico que reconoc e el péptido antigénico de OVA (SIINFEKL) presentado por MHC de clase I. Las CDs infectadas a una multiplicidad de infección de 1,5 con el PRV-OVA-GFP eran capaces de
presentar el péptido antigénico en superficie. La capacidad inmunogénica de estas construcciones se ha estudiado in vivo en ratones
BALB/C que se infectaron con diferentes dosis (10exp4 y 10exp5
pfu/ratón), tras la cuales se desafió con el virus PR8 de la influenza.
Mediante Elispot, se evaluó la producción de células productoras de
IFNγ estimuladas con PR8 y PRV, y se utilizaron pentámeros
específicos MHCI-HYLSTQSAL (péptido GFP) para la detección de
células CD8+ específicas. La respuesta más potente se detectó con la
inmunización de PRV a una dosis de 10exp4 pfu/ratón con 2 inmunizaciones. El análisis de las células CD8+ y pentámeros+ por citometría
de flujo ha confirmado la capacidad de estos vectores para inducir células CD8+ específicas contra el antígeno exógeno. En resumen, la utilización de estos vectores vacunales recombinantes supone una nueva estrategia para intentar inducir una inmunidad protectora frente al
virus de la influenza.
135.VARIANTES EN EL GEN DE LA LECTINA DE UNIÓN A
MANOSA (MBL) Y SU ASOCIACIÓN CON TUBERCULOSIS
EN CANTABRIA. Lavín-Alconero L, Sánchez-Velasco P, Villegas
N, Ausín F, Leyva-Cobián F, Gonzalo Ocejo-Vinyals J. Hospital
Universitario Marqués de Valdecilla.
Introducción. La lectina de unión a manosa (mannose binding lectin, MBL) es una proteína sérica que funciona principalmente como
opsonina, uniéndose a patógenos y activando el complemento a través de la vía de las lectinas. Se han descrito tres variantes estructurales en el exón 1 que resultan en una funcionalidad disminuida de la
MBL y tres polimorfismos en el promotor de la región 5’ no traducida
del gen, que afectan a la expresión de la proteína. Se han identific
ado 7 haplotipos diferentes, derivados de estas variantes, los cuales
dan lugar a 28 diplotipos diferentes. Se han comunicado resultados
contradictorios sobre la asociación de ciertos diplotipos y susceptibilidad o resistencia a tuberculosis en diferentes poblaciones. El objetivo de este trabajo ha sido comprobar si en nuestra población, existe
alguna asociaci ón entre las variantes genéticas de MBL y tuberculosis
pulmonar activa
Materiales y Métodos. Se analizaron las diferentes variaciones
estructurales y polimorfismos del gen MBL2 mediante la técnica de
PCR e hibridación r eversa en tira (INNO-LiPA MBL2, Innogenetics)
en 107 pacientes con tuberculosis pulmonar activa (VIH negativos) y
en 294 donantes de sangre sanos.
Resultados. No hubo diferencias en la frecuencia de los diferentes alelos ni haplotipos del gen MBL entre controles sanos y pacientes con tuberculosis. salvo en el caso del alelo D y del haplotipo HYPD
(2,34% en tuberculosos vs 6,97% en controles, p < 0.01). Respecto a los
diplotipos, sólo HYPD/HYPA resultó ser más frecuente en controles
que en tuberculosos (4.1% vs 0%).
Conclusión. Se han publicado resultados contradictorios sobre la
asociación entre las diferentes variantes genéticas de MBL y la tuberculosis. Los resultados obtenidos en este estudio no aportan evidencias convincentes de asociación entre las difer entes variantes genéticas de MBL y la tuberculosis pulmonar activa a pesar de las diferencias encontradas. Probablemente la conjunción con otros factores genéticos sea lo que determine la susceptibilidad o resistencia a la infección
tuberculosa.
POSTERS
136.ASOCIACIÓN ENTRE LOS POLIMORFISMOS FUNCIONALES -403 G/A Y -28 C/G DE RANTES (CCL5) Y TUBERCULOSIS EN CANTABRIA. Sánchez-Castañón M, Baquero Mejía I,
Sánchez-Velasco P, Ausín Ortega F, Leyva-Cobián F, Gonzalo Ocejo-Vinyals J. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.
Introducción. Las quimiocinas juegan un papel fundamental en
el reclutamiento de leucocitos durante la formación de los granulomas
en la infección tuberculosa. Apenas existen estudios que relacionen
polimorfismos funcionales de quimiocinas con susceptibilidad o resistencia a la infección por Mycobaterium tuberculosis. El objetivo de este
estudio ha consistido en analizar si dos polimorfismos del promotor
de RANTES (-403 G/A y -28 C/G) se asocian a la infec ción tuberculosa en Cantabria.
Materiales y Métodos. Para el estudio del polimorfismo RANTES
-403 G/A se estudiaron 69 pacientes con tuberculosis pulmonar activa (VIH negativos) y 70 donantes de sangre sanos. El estudio del polimorfismo RANTES -28 G/A se realizó en 77 pacientes con tuberculosis pulmonar activa (VIH negativos) y en 56 donantes de sangre sanos.
Se utilizó la técnica de PCR-RFLP. Los productos de PCR fueron digeridos con Mae III para el polimorfismo -403 G/A y Mnl I para el -28
G/C. El análisis de los fragmentos se realizó mediante electroforesis
en gel de agarosa.
Resultados. Nueve pacientes con tuberculosis eran homocigotos
para el polimorfismo -403 G/A frente a ninguno en el grupo control
(p = 0.0014), 19 eran heteroci gotos frente a 7 controles (p = 0.0093) y
41 presentaban un genotipo salvaje frente a 63 en el grupo control (p
< 0.0001). En el caso del polimorfismo -28 G/C, 6 pacientes eran homocigotos (ninguno entre los controles, p = 0.039), 14 pacientes eran heterozigotos (1 en el grupo control, p = 0.004). En el grupo control, 55 presentaban un genotipo salvaje frente a 57 pacientes con tuberculosis
(p = 0.0001).
Conclusión. La diferenc ia estadísticamente significativa en la
prevalencia de ambos polimorfismos sugiere la existencia de una asociación entre estos y susceptibilidad a la tuberculosis. Son necesarios
estudios más amplios para confirmar esta asociación entre variaciones funcionales en el promotor de RANTES y tuberculosis pulmonar
activa.
137.VACUNAS DNA CONTRA EL VIRUS DE LA FIEBRE DEL
VALLE DEL RIFT: ESTUDIOS DE PROTECCIÓN EN RATONES TRANSGÉNICOS IFNAR -/-. Martin Folgar R, Lorenzo
G, Hevia E, Brun A. Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISAINIA).
El virus de la Fiebre del Valle del Rift (RVFV) es un bunyavirus
que afecta a animales y al hombre, pudiendo ocasionar en este hospedador los síntomas clásicos de una fiebre hemorrágica. En la actualidad existen diferentes tipos de vacunas para esta enfermedad, tanto
vacunas inactivadas como atenuadas, sin embargo debido a los problemas que éstas generan, ya sea por su carácter teratogénico o bien
por la necesidad de varias dosis debido a su baja inmumogenicidad,
sería necesario generar nuevas vacunas más efectivas y mejor toleradas como las vacunas basadas en inmunización con DNA. Objetivos.
El objetivo de nuestro trabajo se ha basado en el estudio de la capacidad de protección de construcciones DNA que incluyen secuencias de
las glicoproteínas G2/G1 y la Nucleoproteína del virus, mediante la
inmunización de ratones IFNAR -/- susceptibles a la infección con la
101
POSTERS
cepa atenuada MP12, así como su relación con la respuesta humoral
generada tras la inmunización. Inmunización y desafío: Los ratones
recibieron 2 dosis con 100μg de DNA vía im. Se analizó la presencia de
anticuerpos neutralizantes en los sueros pre y post desafío y se recogier on muestras de diferentes órganos con el objeto de detectar viremia. Resultados: Hemos obtenido protección total con las construcciones pCMV-G2/G1 y protección parcial con pCMV-N y la combinación
pCMV-G2/G1 + pCMV-N. Mientras que en los animales inmunizados
con pCMV-G2/G1 se pudo establecer una correlación entre protección
y presencia de anticuerpos neutralizantes específicos de las glicoproteínas virales, en el resto de animales dicha correlación no se pudo establecer sugiriendo que otros mecanismos inmunológicos podrían estar
implicados en protección. Conclusiones: Los resultados obtenidos
demuestran la capacidad inmunogénica de las construcciones DNA
generadas y su capacidad para conferir protección en el modelo de
ratón utilizado.
138.ANALYSIS OF THE NK CELL-MEDIATED RESPONSE TO
HUMAN CYTOMEGALOVIRUS-INFECTED MYELOID DENDRITIC CELLS. Magri G1, Saez A1, Romo N1, Angulo A2, LopezBotet M1. 1AUniversitat pompeu Fabra (DCEXS). 2Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer.
Human cytomegalovirus (HCMV) is a prototypic betaherpesvirus
that infects cell types including fibroblasts, epithelial, smooth muscle,
endothelial and hematopoietic cells. In healthy immunocompetent
individuals HCMV persists as a subclinical, lifelong latent infection
and myeloid dendritic cell (DC) progenitors are considered to be a
main HCMV reservoir. In the present study we have set up an experimental system to analyse the NK cell response against HCMV-infected myeloid dendritic cells (mDC) derived from monocytes. To this
end, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and purif ied NK cell
populations obtained from HCMV-seronegative donors were co-cultured with autologous mDC infected with the TB40/E HCMV strain;
the NK cell phenotype and function were subsequently analysed.
Expression of HLA class I antigens was downregulated in infected
mDC that were detected by immunofluorescence staining with an anti
IE1 mAb. NK cells specifically reacted to HCMV-infected mDC as
shown by IFN gamma secretion and upregulation of the surface espression of CD69 and CD25 and NKp30 molecules. No response was detected when NK cells were co-c ultured with mock-infected mDC or cells
treated with UV-inactivated virus. Studies using a panel of blocking
mAbs are in progress to assess the participation of triggering NK cell
receptors in this process.
139.BIOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA INMUNODETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS FRENTE AL ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE HEPATITIS B
(HBSAG). Díaz B1, Sánchez-Espinel C1, Ambrosi A2, de la Escosura A2, Merkoçi A2, Faro J1,3, González-Fernández A1. 1Grupo de
Inmunología. Edificio Ciencias Experimentales. Universidad de Vigo.
2Grupo de Nanobioelectrónica y Biosensores. Institut Català de Nanotecnologia. Campus UAB. Bellaterra. Barcelona. 3Instituto Gulbenkian
de Ciência, Oeiras, Portugal.
Introducción. El campo de la nanotecnología y el desarrollo de
biosensores basados en métodos de detección electroquímicos amplía
102
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
el abanico de los diferentes métodos de inmunodetección utilizados
actualmente en la práctica clínica, c omo el MEIA (Inmunoensayo por
micropartícula) y el CMIA (Inmunoensayo Magnético Quimio-luminiscente), y supone la posibilidad de diseñar nuevas técnicas más rápidas, sensibles, con menor cantidad de muestra y a un menor coste que
las técnicas tradicionales.
Objetivo. Desarrollo de una nueva técnica electroquímica de detección del antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg), basada en el
uso de anticuerpos conjugados con nanopartículas de oro (AuNPs),
que actúan como marca electroactiva, y de micropartíc ulas paramagnéticas (MPs) que actúan como soporte de las reacciones inmunológicas. La detección electroquímic a de las AuNPs se lleva a cabo de manera direc ta, sin necesidad de oxidación pr evia mediante agentes químicos.
Metodología. La proteína recombinante de antígeno HBsAg fue
unida covalentemente a la superfic ie de las MPs (tosylactivated). Estas
MPs fueron incubadas con diferentes concentraciones de anticuerpo
monoclonal (AcMo) de ratón (IgG) anti-HBsAg. A continuac ión, se
incubaron las MPs con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG de
ratón, previamente conjugados a AuNPs de 15 nm de diámetro. Después de cada incubación, el exceso de reactivos fue separado de las
MPs usando un electroimán. Las AuNPs fueron detectadas electroquímicamente, siendo proporcional la señal electroquímica a la cantidad
de IgG anti-HBsAg presente en la muestra.
Resultados. Los resultados muestran que este método permite la detección de anticuerpos específicos de hepatitis B en muestras. El nivel de detección fue de 1,6 ng/ml de AcMo de ratón antiHBsAg, inferi or al obtenido por la técnica de ELISA ( 4 ng/ml).
Actualmente estamos probando muestras de sueros de ratones
inmunizados con HBsAg y de donantes vacunados, y los resultados preliminares indican la validez del método con muestras reales.
Conclusión. Los biosensores electroquímicos basados en el uso de
AuNPs como marca pueden ser aplicados con éxito para la determinación de anticuerpos específicos del antígeno HBsAg. Este ensayo
podría ser automatizado y extendido a otros Ags en el futuro, y optimizado para la medición de Ags en pequeñas cantidades de muestra.
140.POLIMORFISMO DE LOS GENES TGF-μ1 E IL-6 EN PACIENTES DE BRUCELOSIS. Bravo MJ1, Lavado Valenzuela R1, de Dios
Colmenero J2, Alonso A1, Caballero A1. 1Servicio de Inmunología y
2Servicio de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitario Carlos
Haya, Málaga.
Introducción. Los polimorfismos genéticos que afectan a los niveles de producción de determinadas citoquinas son determinantes de
riesgo, severidad y/o protección para algunas enfermedades infecciosas. Se han identificado dos polimorfismos en el gen del factor de
crecimiento (TGF)-β1, en la posiciones +869 y +915, que producen
variaciones en los codones 10 (Leu por Pro) y 25 (Arg por Pro). Éstos
se asocian a diferentes niveles de producción de TGF-β1. Por otra parte, se ha descrito un polimorfismo en el promotor del gen de la IL-6
en la posición -174 (G/C), que se ha asociado con diversas enfermedades.
Objetivo. Evaluar la asociación entre los polimorfismos del T+869C
y G+915C en el exón 1 del gen del TGF-β1 y del promotor -174 (G/C)
del gen de la IL-6 y la susceptibilidad a la brucelosis.
INMUNOLOGÍA
Métodos. Hemos tipado 82 pacientes de brucelosis y 102 controles sanos de la misma área geográfica para los polimorfimos en los
codones 10 y 25 del gen del TGF-β1, y el del promotor de la IL-6 en la
posición -174 por métodos basados en PCR-SSP.
Resultados. El genotipo T/T G/G del gen del TGF-β1 se encontró aumentado en pacientes cuando fue comparado con controles
(49% vs. 32%) P=0.02; OR = 1.99 (1.05-3.80), y la frecuencia del genotipo T/C G/G fue menos frecuente en los pacientes que en el grupo
control (32% vs. 49%) P=0.01; OR=0.48 (0.25-0.92). El genotipo CC del
codón 10 se encontraba aumentado en pacientes que presentaban formas focales de la enfermedad comparados con los que no desarrollaban formas focales (19% vs. 4%), P=0.03; OR=0.19 (0.02-1.10). No se
encontraron diferencias de las variantes de la IL-6 entre pacientes y
controles.
Conclusiones. Estos resultados sugieren que el polimorfismo del
gen del TGF-β1 podría estar involucrado en la susceptibilidad frente
a la brucelosis y en el desarrollo de formas focales en un grupo de
pacientes del sur de España, aunque serían necesarios estudios posteriores para confirmar este hallazgo.
141.ACTIVACIÓN DE LAS MAP KINASAS EN HEPATOCITOS
MURINOS TIB-73 POR OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS.
Martín-Orozco E, Chicano A, Ruíz-Alcaraz AJ, Lizana A, Martínez-Esparza M, Hernández-Caselles T, García-Penarrubia P. Universidad de Murcia.
Objetivos. En este trabajo nos planteamos realizar un estudio prospectivo de la expresión de TLR9 y TLR4 en una línea de hepatocitos
murinos denominada TIB-73 y compararlo con otra línea de células
macrofágicas conocida como J774, mediante las técnicas de microscopía confocal y Western blot. Adicionalmente nos planteamos estudiar el papel que podrían desempeñar las MAP kinasas ERK 1/2 y p38
en la señalización intracelular inducida por la estimulación con oligonucleótidos con secuencias CpG y no-CpG y estructura de tipo fosfodiester o fosforotioato.
Resultados. Los hepatocitos TIB-73 expresan las proteínas TLR9
y TLR4. La estimulación con oligos CpG y no-CpG activa las vías de
señalización mediadas por ERK 1/2 tanto en los hepatocitos TIB73, como en los macrófagos J774. Como era de esperar, los oligos análogos de tipo fosforotioato con secuencias CpG y no-CpG inducen
niveles mayores de fosforilación de ERK1/2 en células TIB-73, superiores incluso a las inducidas en células J774 bajo las mismas condiciones, y también un nivel menor de activación de p38. La fosforilación de ERK 1/2 inducida por oligonucleótidos sintéticos es dependiente de la dosis, y alcanza un nivel máximo a 100 mg/ml. El pretratamiento de los hepatocitos con un inhibidor de ERK 1/2 incrementó la fosforilación de p38.
Discusión y Conclusiones. Los hepatocitos TIB-73 expresan de
modo constitutivo TLR9 y TLR4 y responden a la estimulación con oligos sintéticos mediante una intensa fosforilación de ERK1/2 y una
moderada fosforilación de p38, de una manera independiente de la
existencia de motivos CpG. Cuando se bloquea ERK 1/2 por medio de
un inhibidor específico, utilizan como vía alternativa la mediada por
p38. Nuestros resultados demuestran que la respuesta de los hepatocitos TIB-73 a la estimulación con oligonucleótidos (generación de peróxidos intracelulares, nitritos y actividad antibacteriana) desc rita previamente por nuestro grupo, está mediada por las MAPKs ERK1/2 y
p38. Por lo tanto, estos resultados indican que los hepatocitos son capa-
POSTERS
ces no sólo de detectar la presencia de oligos sintéticos, sino también
de responder a los mismos. Esto apoya el posible papel de los hepatocitos como células que participan en la respuesta del sistema inmunitario natural o innato.
Financiado con proyectos de: ISCIII (PI060006) y Fundación Séneca
(CARM) (03112/PI/05).
142.IMPACTO DE LA TERAPIA ANTIRRETROVIRAL (ART)
SOBRE LOS RESERVORIOS DE CARGA PROVIRAL DNA
HIV-1 EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA (PBMCS)DE PACIENTES HIV-1+ Y SU ASOCIACIÓN
CON LA CARGA VIRAL RNA HIV-1 . Rodríguez-Sáinz C, Valor
L, Modrego J, Fernández-Cruz E. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid.
Objetivos. Estudiar los cambios que experimenta la carga proviral DNA HIV-1 (CpV) de pacientes VIH-1+ durante la ART y explorar
el valor adicional de este marcador virológico.
Método. Se analizaron 75 pacientes HIV-1+, asintomáticos, naive
para ART, enrolados en el estudio STIR-2102, doble ciego aleatorizado, diseñado para evaluar la reconstitución inmunológica. Se evaluó
la carga viral RNA HIV-1 (CV) trimestralmente durante los 36 meses
(M36) del ensayo o hasta el momento en que se produce una CV>5.000
copias/mL (fracaso virológico, FV). Hemos realizado un estudio retrospectivo de cuantificación de la CpV en PBMCs mediante PCR a tiempo real y de las correlaciones entre CpV y CV, en los pacientes que
alcanzaron M36 (Grupo A) y en los que tuvieron un FV (Grupo B; seguimiento medio 14.8 meses ± 9.1), antes del inicio de ART (pre-ART), seis
semanas después de iniciar ART (post-ART) y al final del estudio (M36
o el tiempo del FV).
Resultados. La Tabla incluye las CpV [ media (SD) copias/106
PBMCs] y las CV [media (SD) copias/mL]. Se muestra la significac ión
estadística para la comparación de medias de datos pareados (respecto a la basal pre-ART). Los resultados de correlación muestran el coeficiente r de Pearson.
Pre-ART Post-ART Fin de Estudio
Grupo A Grupo B
(N=35) (N=40)
CpV 1960 (3789) 1519 (2727) 324 (204) 1314(3034)
p=0.115 p=0.013* p=0.067
CV 37518(53270) 817 2236) 553 (987) 18021(23360)
p=0.000** p=0.000** p=0.001**
Corre. r=0.391 r=0.244 r=0.250 r=0.213
CpV-CV
p=0.001** p=0.035* p=0.208 p=0.242
Conclusiones. 1. La ART impacta significativamente sobre los
reservorios de CpV en los individuos que controlan la viremia
durante los 36 meses (Grupo A). 2. Existe una correlación positiva
significativa entre CpV y CV pre-ART y seis semanas post-ART.
Estas correlaciones no se mantienen tras un periodo largo en ART.
3. La CpV podría ser útil como un marcador viral complementario que evoluciona independientemente de la CV en pacientes VIH1+.
103
POSTERS
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
SESIÓN 9: CÉLULAS DENDRÍTICAS
Moderadores: Dr. Ángel Corbí (Madrid),
Dr. Francisco Borrás (Barcelona)
143.LOS TRANSCRITOS DE LAS ISOFORMAS HLA-G1, G2, G5,
G6 Y G7 SE EXPRESAN EN CÉLULAS DENDRÍTICAS DE
SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL. Martínez Laso J1, Roman
A1,3, Herraiz MA2, Rodriguez M1, Head J1,3, Gutierrez-Solar B1,
Vidart J2. 1Unidad de Inmunoterapia Celular. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III. 2Servicio de Ginecología y Obstetricia. Hospital Clínico de San Carlos. 3Servicio de Microbiología. Hospital Clínico San Carlos.
En trabajos previos de nuestro grupo se encontró expresión de HLAG de superficie e intracelular en células dendríticas procedentes de cordón umbilical. En el presente trabajo, se han aislado las células dendríticas mieloides (MDC) y plasmocitoides (PDC) para detectar los diferentes transcri tos de HLA-G. Se encontraron los transcritos de G1 y G5
en siete de las diez MDC estudiadas mientras que en las otras tres sólo
se encontró G1. Sin embargo, se encontraron G1 y G5 en tres de las nueve muestras de PDC analizadas. Las otras seis mostraban únicamente
el subtipo G1. Estos resultados señalan las diferencias entre las subpoblaciones de células dendríticas y pueden reflejar distinta funcionalidad de HLA-G en los dos tipos de DC. Es posible que la isoforma
soluble HLA-G5 desempeñe un papel más importante en MDC que en
PDC. HLA-G1 y HLA-G5 parecen ser las dos isoformas principales
en las poblaciones celulares estudiadas. Además, se encontraron HLAG2 y G6 en tres de las nueve PDC y un G7 en una de las diez MDC estudiadas. La detección de varias isoformas de HLA-G, especialmente
de las solubles, podría ser fundamental en el transplante disminuyendo la probabilidad del rechazo del injerto. Las isoformas cortas de HLAG (HLA-G2, G6 y G7) producidas intracelularmente podrían ser secuestradas en el retículo endoplasmático, no alcanzando la superficie. Estas
isoformas podrían tener una única función de apoyo a la expresión
de HLA-E y a la modulación de su interacción con el receptor
CD94/NKG2. Los datos obtenidos difieren de los encontrados en sus
equivalentes en sangre periférica de adulto, donde sólo se encontraron
estas isoformas en células dendríticas derivadas de CD34+. La expresión de HLA-G en células dendríticas de cordón umbilical puede tener
una función inmunoreguladora con respecto a las células NK y T e inmunosupresora con respecto a la relación inmune entre el feto y la madre.
144.INCORPORACION DE PARTICULAS POR CELULAS DENDRITICAS. Marcos Campos I1, Asin Pardo L2, Saez Gutiérrez B1,
Godino J1, Goya G2, Ibarra R2, Tres A1. 1Servicio de Oncología. Hospital Clinico Lozano Blesa. 2Instituto de Nanociencia de Aragón.
Introducción. Las células dendríticas son las células presentadoras de antígenos más importantes del sistema inmunológico, desempeñando un papel clave en el inicio de la respuesta inmune adaptativa. Una de las principales características de estas células es la capacidad para incorporar diversos tipos de antígenos. Estudios recientes
han demostrado el potencial de estas células para incorporar diferentes tipos de partículas. La incorporac ión de estas partículas por las
células dendríticas permitirí a utilizar estas células para vehicular posibles fármacos que y ser visualizadas mediante técnicas como resonancia magnética o técnicas de imagen.
104
Objetivos:
a) Valorar la tasa de incorporación de dextrano-FITC y latex beads
por parte de las células dendríticas realizando la incubación a diferentes tiempos.
b) Valorar la influencia que ejercen el tamaño y la concentración de
las partículas sobre la tasa de incorporación de las células dendríticas.
Materiales y métodos. Los experimentos se realizaron con células dendríticas obtenidas a partir de monocitos CD14+ aislados de
sangre periférica. Para ello, los monocitos fueron cultivados durante 7 días en presencia de GM-CSF e IL-4. En el primer experimento
estas células fueron cocultivadas con varias concentraciones de dextrano y latex beads durante diferentes tiempos de incubación (2, 6 y
24 horas). La tasa de incorporación de partículas fue medida por fluorescencia con citometría de flujo. Posteriormente, las células dendríticas se incubaron con nanopartículas aminadas (130 nm y 250 nm)
y carboxiladas (130 nm y 250 nm) en la membrana. La incorporación
de partículas fue también observada por medio de microscopía electrónica.
Resultados. Se observó mediante citometría de flujo que la tasa
de incorporación de partíc ulas por las células dendríticas varió en función de la conc entración de éstas en el cultivo y del tiempo de incubación, siendo la tasa de incorporación hasta tres veces mayor en un período de incubación de 24 horas respecto al de 2 horas. Los datos de incorporación obtenidos fueron ratificados mediante microscopía electrónica y microscopía confocal.
145.EL TRATAMIENTO DE MONOCITOS CON IFNα GENERA
CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO INSENSIBLES
A LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE MHC-II POR
ATORVASTATINA. López P1, Prado C1, de Paz B1, Gutiérrez C1,2,
Suárez A1. 1Área de Inmunología, Departamento de Biología Funcional,
Universidad de Oviedo. 2Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Central de Asturias.
El IFNα es una citocina inmunoestimuladora implicada en el desarrollo de autoinmunidad y en la patogénesis del lupus eritematoso sistémico. Por otra parte, se ha sugerido la utilización de estatinas en el
tratamiento de estas enfermedades ya que, además de regular la síntesis de colesterol, poseen efectos inmunosupresores, que incluyen la
inhibición de la expresión de MHC-II inducida por IFNγ. En este trabajo nos propusimos evaluar el papel del IFNα en la generación de
células presentadoras de Ag funcionales y determinar el posible efecto de la presencia de atorvastatina durante este proceso. Para ello comparamos las características morfológicas y fenotípicas de las células
obtenidas tras el tratamiento de monocitos con IFNα con las células
dendríticas generadas de forma clásica (IL-4+GM-CSF). La actividad
funcional se evaluó mediante análisis de la captación de Ag e inducción de respuestas proliferativas en linfocitos T. Encontramos que tras
3 días de cultivo con IFNα los monocitos se diferenciaban a células con
morfología y fenotipo similar al de células dendríticas maduras
(CD86high, CD1alow, MHC-IIhigh y CD14low). Además estas células eran
capaces de captar antígenos e inducir respuestas en linfocitos T autólogos de forma similar a las células dendríticas clásicas. Cuando estas
células fueron generadas en presencia de atorvastatina, sorprendentemente, no encontramos una disminución de la expresión de HLA-DR,
aunque sí se reducía significativamente su habilidad para inducir respuestas en linfocitos T. De hecho la atorvastatina, incluso en eleva-
INMUNOLOGÍA
das concentraciones, no era capaz de disminuir la expresión de HLADR inducida por IFNα, al contrario de lo que ocurre con el IFNγ. Estos
resultados confirman en efecto inmunoestimulador del IFNα, promoviendo la generación de células presentadoras de Ag y apoyan la aplicación clínica de las estatinas como moduladores de las respuestas
autoinmunes en pacientes con altos niveles patológicos o farmacológicos de IFNα.
146.POLIMERIZACIÓN DE LA ACTINA EN CÉLULAS FOLICULARES DENTRÍTICAS TRATADAS CON CITOQUINAS.
Muñoz Fernández R, Leno Durán E, de la Mata C, Blanco Muñoz
O, Tirado González I, Ortiz Ferrón G, Abadía Molina AC, García
Olivares E. Centro de Investigación Biomédica.
Introducción. Las células foliculares dendríticas (follicular dendritic cells, FDC) son un tipo celular que se localizan en los folículos
linfoides de los órganos linfoides secundarios. Almacenan durante largos periodos de tiempo, antígenos con estructura nativa en su superficie celular, y proporcionan una fuente continua de estimulación para
las células B específicas, c ontribuyendo a la diferenciaci ón y mantenimiento las células B memoria.
Las FDC están relacionadas con el precursor de células madre
mesenquimales (MSC). Por otro lado, también están relacionadas con
los miofibroblastos debido a la expresión de alfa-SM-actina (marcador
de miofibroblastos), hecho que le confiere la capacidad contráctil a
estas células.
Objetivos. Estudio de la polimerización de la actina (formación
de fibras de estrés) en FDC tratadas con diferentes citoquinas.
Metodología. Cultivo de FDC en gel de colágeno y tratamiento de
24 horas con diferentes citoquinas (IL-2, IL10, IFN gamma, TNF alfa y
LT), posteriormente a través de inmunofluorescencia, se observó la
localización de la actina. La polimerización se determinó por inmunofluorescencia y citometría de flujo.
Resultados y conclusiones. Se observó por inmunofluorescencia
las fibras de actina y mediante citometría de flujo se vio una mayor
polimerización de actina. Lo que indica un estimulo de las FDC frente a la presencia de citoquinas.
147.FENOTIPO ANTIGÉNICO DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS
DE DECIDUA HUMANA A TÉRMINO. Tirado González I, Leno
E, Muñoz-Fernández R, de Lamata Espinosa C, Blanco O, OrtizFerrón G, Abadía-Molina AC, Olivares EG. Centro de Investigación
Biomédica.
Introducción. La decidua a término es considerada como un lugar
de privilegio inmunológico en la que tiene lugar la protección del feto
semi-alogénico del sistema inmune materno durante 9 meses, mediante mecanismos de tolerancia e inmuno-actiación. Una de las APC (antigen presenting cells) más importantes son las células dendríticas (DC),
consideradas como centinelas del sistema inmune. Estas DC han sido
descritas como células de origen mieloide CD11c+. Sus características
funcionales dependen de su estado de diferenciación, siendo las DC
inmaduras (iDC) las que capturan el antígeno en los tejidos comenzando con el proceso de migración, y las DC maduras (mDC) las que en
los órganos linfoides dan lugar a la presentación antigénica.
Objetivo. El objetivo del presente trabajo es determinar el fenotipo antigénico de las DC de decidua a término.
POSTERS
Materiales y métodos. Las muestras de decidua a término fueron
pr ocesadas y tratadas mediante gradiente de Ficoll-Histopaque. Las
células dendríticas fueron estudiadas mediante citometría de flujo en
base a la expresión de DC-SIGN (marcador c aracterístico de las DC
inmaduras, iDC). Mediante doble marcaje se pudo observar la expresión de los antígenos CD11c, CD14, CD25, CD40, CD45, CD68, HLADR, CD56, CD123.
Resultados. Hemos podido observar la existencia de una población DC-SIGN+ (marcador de iDC), indicando una población principal de iDC, confirmada por la baja expresión del marcador CD83 (marcador de mDC). El doble marcaje mostró que las células DC-SIGN+
expresaban CD11c, CD14, CD25, CD40, CD56, CD68, CD123 y CD45.
Estos datos indicaban que estás iDC eran células de origen mieloide
(CD11c+) y plamocitoides (CD123+) que podrían coexistir en la decidua a término, en distintas etapas de diferenciación (CD14/DC-SIGN),
activadas y en distintos estados de maduración debido a la baja coexpresión de HLA-DR, datos que fueron confirmados por la co-expresión de CD25 y CD40. El marcaje CD56 nos indicarí a la existencia de
complejos NK-DC.
Conclusiones. Las DC de decidua a término se encuentran en
un estado inmaduro, en distintas etapas de diferenciación/maduración, activadas y formando complejos con las células NK deciduales.
148.COORDINACIÓN ENTRE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS
CONVENCIONALES Y PLASMACITOIDES EN LA GENERACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE. Pérez-Cabezas B1, Naranjo-Gómez M1, Fernández MA2, Sánchez-Pla A3, Núñez F4, PujolBorrell R1, Borràs Serres FE1. 1Laboratorio de Inmunobiologia para la
Investigación y las Aplicaciones Diagnósticas (LIRAD). Banco de Sangre y Tejidos (BST). Instituto de Investigación Germans Trias i Pujol,
Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), Badalona (Barcelona). 2Unidad de Citometría, Instituto de Investigación Germans Trias i Pujol,
Badalona (Barcelona). 3Departamento de Estadística, Universidad de Barcelona. 4Unidad Cientificotécnica de Soporte (UCTS), Instituto de Investigación Hospital Vall d'Hebron, Barcelona.
Las células dendríticas (DC) son las responsables del inicio de la
respuesta inmune. Las DC se dividen en dos subtipos mayoritarios,
DC convencionales (cDC) y DC plasmacitoides (pDC). Cada subtipo
lleva a cabo determinadas funciones, como son la captura y presentación de antígenos y la secreción de interf erones tipo I respectivamente. Sin embargo, diversas evidencias obtenidas en nuestro (Naranjo-Gómez, 2005) y otros laboratorios (Lou, 2007) apuntan a la posibilidad de un sinergismo entre ambas subpoblaciones en la inducción
de una potente respuesta inmunitaria. En este sentido, nuestros resultados muestran que las cDC maduras inducen a su vez la maduración
de las pDC, capacitándolas para estimular la proliferación de linfocitos T naive.
Nuestro estudio intenta determinar los perfiles de expresión génica (Af fymetrix) de las pDC capacitadas por las cDC y establecer si existe alguna diferencia en función del estímulo madurativo recibido por
la cDC. Para ello se obtienen, mediante separación celular por citometría de flujo, las subpoblaciones de DC. Tras la estimulación de las cDC
por los diferentes estímulos seleccionados (LPS, R-848, células apoptóticas, células necróticas, CD40L), se procede al co-cultivo pDC/cDC.
Los dos subtipos celulares se separan nuevamente tras el co-cultivo,
obteniéndose una población pDC pura para el análisis del perfil de
expresión génica específico. En algunos experimentos, la capacitación
105
POSTERS
se pone de manifiesto por la inducción de moléculas de coestimulación en las pDC capacitadas por cDC activadas.
Los resultados de los análisis de microarrays permitirán definir el
perfil de las pDC capacitadas por las cDC, y contribuirán a enunciar
posibles hipótesis en cuanto al papel y/o la implicación de cada suptipo de DC en el desarrollo de la respuesta inmune.
1.
2.
Naranjo-Gómez M. Am J Transplant. 2005;5(12): 2838-48.
Lou Y. J Immunol. 2007, 178:1534-1541.
149.ORGANIZACION PODOSOMAL Y MOTILIDAD DE CELULAS DENDRITICAS Y OSTEOCLASTOS. Anton Gutiérrez IM1,
Bañón-Rodríguez I1, Chou H-C2, Jones GE2, Calle Y2. 1Centro Nacional de Biotecnología, Madrid. 2Randall Division of Cell and Molecular
Biophysics.
La homeostasis del sistema inmune depende en gran medida del
tráfico leucocitario r egulado. Las células de origen mieloide como las
células dendríticas (CDs) y los osteoclastos (OCs) forman unas estructuras de adhesion y migración caracterí sticas denominadas podosomas que están constituídas por dos regiones: el centro y el anillo periféri co. La región central esté enriquecida en actina y en proteínas implicadas en la regulación de la polimerización de los microfilamentos
como la GTPasa Cdc42, WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein)
y el complejo nucleador de actina Arp 2/3. El anillo periférico contiene proteínas relacionadas con adhesion como integrinas, vinculina
y paxilina. Nosotros hemos descrito la presencia de WIP (WASP Interacting Protein) en la region central de los podosomas de las CDs y de
los OCs y hemos analizado mediante técnicas bioquímicas y de imagen la participación de WIP en la organización y función de los podosomas. Utilizando células mieloides derivadas de ratones deficientes
en WIP hemos observado que la ausencia de WIP reduce drásticamente la capacidad de las CDs y de los OCs para formar podosomas, que
en CDs WIP-/- son reemplazados por contactos focales donde se recluta la integrina β1. El reciclaje de estas estructuras de adhesion es
más lento que el de los podosomas lo que confieren una enorme estabilidad a las adhesiones celulares y disminuye la motilidad celular.
Además, WIP modula la polarización celular y es insustituible como
transportador de WASP a las regiones de membrana donde se inicia
la polimerización de actina para generar los podosomas. Utilizando
vectores lentivirales que permiten la expresión de WIP-eGFP en CDs
WIP-/- hemos recuperado la formación de podosomas y estamos estudiando la contribución a este proceso de los diferentes dominios de
WIP.
150.ANÁLISIS INMUNOFENOTÍPICO PRELIMINAR DE LA
POBLACIÓN CELULAR MIELOIDE DEL LÍQUIDO ASCÍTICO DE PACIENTES CON CIRROSIS Y ASCITIS. Guarinos RF1,2,
Hernández-Caselles T3, Martín-Orozco E3, Martínez-Esparza M3,
Zapater P1,2, Ruiz-Alcaraz AJ3, Dongo MN1, Pérez-Mateo M1, García-Peñarrubia P3, Such J1,2. 1Unidad Hepática, Hospital General Universitario, Alicante. 2CIBERehd, Instituto de Salud Carlos III, Madrid.
3 epartamento de Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología B, Universidad de Murcia.
Introducción. La población monocito/macrófago del líquido ascítico de pacientes con ci rrosis y asc itis juega un papel fundamental en
106
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
la respuesta inmunitaria frente a distintos productos bacterianos. La
car acterizaci ón fenotípica de esta población ha revelado la importancia de CD16 como marcador del destino y función de estas células dentro del complejo sistema de diferenciación mieloide. Sin embargo, su
distribución no se encuentra caracterizada en estos pacientes.
Objetivo. Caracterizar fenotípicamente la población celular mieloide responsable de la respuesta innata en pacientes con cirrosis y ascitis.
Pacientes y Métodos. Muestras de cuatro pacientes con cirrosis
y ascitis no neutrocítica con cultivo negativo fueron incluidos en este
estudio piloto. Ninguno de los pacientes incluidos estaba en tratamiento con norfloxacino. Se obtuvo una muestra de LA y su población celular fue caracterizada mediante un panel de anticuerpos monoclonales
de superficie marcados con fluorescencia (BD Biosciences, San José,
CA) y analizada por citometría de flujo en un Epics Xl (Beckman-Coulter, Fullerton, CA).
Resultados. Esta población monocito/macrófago podemos diferenci arla en células CD16low y CD16high mostrando los siguientes
porcentajes de expresión para CD16low: CD14 (86.74±7.56), CD33
(85.88±13.72), CD64 (93.30±9.72), CD11b (77.78±8.00), CD11c
(77.84±11.84), CD80 (79.17±20.81), CD86 (92.91±10.77), CD40
(84.99±13.27), DR (93.41±10.60), CD119 (93.33±10.38); y para CD16high:
CD14 (13.26±7.56), CD33 (14.06±13.78), CD64 (6.71±9.71), CD11b
(21.36±9.08), CD11c (22.16±11.88), CD80 (20.83±20.81), CD86 (7.09±10.77),
CD40 (15.01±13.27), DR (6.59±10.60), CD119 (6.67±10.38). La población
CD16high aumenta significativamente para todos los marcadores estudiados, excepto CD11b y CD11c, cuando las muestras son diferenciadas de acuerdo con la presencia de DNA bacteriano.
Conclusión. La expresión elevada de CD16 identifica una subpoblación minoritaria de monocitos en el líquido ascítico de pacientes
con cirr osis y ascitis. La presencia de ADN bacteriano induce un
aumento de esta población, posiblemente, como consecuencia de un
mayor requerimiento de transición a células dendríticas.
151.UPTAKE OF SOLUBLE ANTIGEN IS REDUCED BY NUCLEIC
ACIDS IN THE ABSENCE OF DENDRITIC CELL ACTIVATION. Tirapu Fernández de la Cuesta I, Diebold S. 1Guy's Hospital - King's college London.
Dendritic cells (DC) are key players in the initiation and modulation of adaptive immune responses due to their ability to acquire and
present antigen and stimulate T cells. For the induction of effector Tcell functions, antigen must be presented by activated dendritic cells.
Upon activation dc transiently increase their endocytic activity and
subsequently cease to take up antigen. In this study, we have compared uptake of antigen by DC in the presence of different TLR ligands,
which are potent inducers of DC activation. Surprisingly, we have
found no reduction on antigen uptake when DC were stimulated with
LPS and only a marginal reduction when CPG was used. By contrast,
the viral DSRNA analogue polyi:c, a tlr3 ligand, led to a reduction in
uptake of soluble antigen by DC. This effect was seen both for in vitro
generated bone marrow-derived dc and for splenic DC. The reduction
in antigen uptake was dose dependent and also took place in the absence of DC activation. The same phenomenon was observed for polyribonucleotides, such as polyg or polyi, which inhibit the uptake of soluble antigen by blocking scavenger-receptor mediated endocytosis. Thus,
polyi:c reduces endocytosis of soluble antigens independent of dc activation by blocking scavenger receptor mediated uptake, while it does
INMUNOLOGÍA
POSTERS
not affect pinocytosis. These results should be taken into consideration when loading DC wi th antigen in the presence of polyi:c.
SESIÓN 10: CÉLULAS T
Moderadores: Dr. Manel Juan (Barcelona),
Dra. Mª Luisa Toribio (Madrid)
152.POTENCIACIÓN POR AGENTES INHIBIDORES DE HISTONA DEACETILASAS DE LA APOPTOSIS MEDIADA POR
TRAIL EN CÉLULAS T LEUCÉMICAS. Morales Camino JC, Ruiz
Magaña MJ, Carranza Domínguez D, Ruiz Ruiz MC. Instituto de
Biopatología y Medicina Regenerativa.
TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) es un ligando de
muerte con actividad selectiva sobre células transformadas. Se han propuesto diversas estrategias combinadas capaces de vencer la resistencia que presentan algunos tumores a la apoptosis mediada por TRAIL,
entre ellas los inhibidores de histona deacetilasas (HDACi), enzimas
implicadas en la reorganización de la estructura del ADN en las distintas fases del ciclo celular.
En este trabajo se ha estudiado el efecto de diferentes HDACi, pertenecientes a distintas familias estructurales, en la inducci ón de apoptosis por TRAIL en líneas de células T leucémicas y en células T normales, mediante tinción del ADN con yoduro de propidio y determinación de activación de caspasas. Además, se ha analizado la regulación por HDACi de los factores implicados en la ruta de señalización
de TRAIL en ambos tipos celulares mediante RT-PCR y Western Blot.
Observamos que todos los HDACi utilizados potencian la apoptosis mediada por TRAIL en células T leucémicas, pero no en T normales, aumentando todas las señales intracelulares de la ruta de inducción de apoptosis por TRAIL, desde la activación de la caspasa-8 apical. Dic ha potenciación puede explicarse por el descenso en la expresión de la proteína anti-apoptótica FLIP y el incremento en los niveles
del receptor pro-apoptótico TRAIL-R2 que tiene lugar en las células T
leucémicas en respuesta al tratamiento con HDACi. Por el contrario,
la regulación de dichas proteínas no se observa en células T normales.
154.REGULACIÓN DE NFAT POR LA ACTIVIDAD POLI-ADPRIBOSA POLIMERASA EN LOS LINFOCITOS T. Valdor Alonso R1, Schreiber V2, Saenz L1, Aguado E4, García-Cozar F4, Ramírez P1, Parrilla P1, Yélamos J4. 1Hospital Universitario Vir gen de la
Arrixaca, Murcia. 2CNRS. Estrasburgo. Francia. 3Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia. 4Hospital Puerto Real, Cadiz. 5IMIMHospital del Mar, Barcelona.
NFAT representa una familia de factores de transcripc ión que
juegan un papel central en la funcionalidad de los linfocitos T. Hasta el momento, se ha descrito que los procesos de activación de
NFAT que tienen lugar tras la estimulación de los linfocitos T, tales
como su translocación desde el citoplasma al núcleo, su capacidad de unión a las regiones consenso del ADN y su actividad transcripcional, están mediados en gran parte por su estado de fosforilac ión. En este trabajo, aportamos la primera evidencia de un nuevo mecanismo de modificación post-transduccional que regula a
NFAT, la poli-ADP-ribosilación. Nuestros datos han puesto de manifiesto que tanto NFATc1 como NFATc2 son poli-ADP-ribosilados
por PARP-1.
De igual forma hemos demostrado una interacc ión física de
PARP-1, a través de sus dominios A y D, con NFATc1 y con NFATc2.
En este trabajo también hemos puesto de manifiesto que la estimulación de los linfocitos T con PMA más ionomicina induce la activación de PARP en ausencia aparente de daño en el ADN, monitorizado por la ausencia de fosforilación de la histona H2AX en los linfocitos T en respuesta a dicha estimulación.
La formación de poli-ADP-ribosa en los linfocitos T durante su
estimulación modula la activación de NFAT, puesto que la inhibición de PARP utilizando diferentes inhibidor es farmacológicos produce un incremento de la actividad transcripcional dependiente de
NFAT y un retraso en el exporte nuclear de este factor de transcripción.
En conjunto nuestros datos indican que PARP-1 y las reacci ones
de poli-ADP-ri bosilación repr esentan un nuevo mecanismo de regulación de NFAT a nivel nuclear, sugiriendo un uso potencial de la
actividad PARP como una nueva diana terapéutica en la modulación
de NFAT y, por consiguiente, en la modulación de la respuesta inmune.
107
POSTERS
155.CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES HUMANAS PROTEGEN DE LA MUERTE A LOS LINFOCITOS. Leno Durán E, de
la Mata Espinosa C, Ortiz Ferron G, Tirado González I, Muñoz
Fernández R, Blanco O, Abadia Molina AC, García Olivares E.
Centro de Investigaciones Biomédicas.
Introducción. Las células deciduales estromales (DSC), pueden
secretar numerosos factores incluyendo prolactina, insulin-like growth
factor binding protein 1, tissue factor, VEGF, IL-11 e IL-15, que pueden
favorecer la supervivencia de los linfocitos. Se ha observado que DSC
forman complejos con linfocitos y los podrían proteger de la muerte.
Objetivos. Determinar la protección que ejercen las DSC frente a
la muerte celular de linfocitos y los mecanismos implicados.
Metodología. Las DSC se obtuvieron de decidua normal del
primer trimestre de embarazo, los linfocitos de sangre periférica (
PBL) se obtuvieron de voluntarios sanos. Los linfoci tos se pusieron en gradiente de ficoll-histopaque y se cultivaron a diferentes
proporci ones en diferentes condiciones, DSC en placa de 6 poci llos,
en cámara Traswell, y con sobrenadante procedente del cultivo de
las DSC. Se tuvieron en cocultivo 24 ó 48 horas. La muerte celular
fue medida por citometría de flujo por marcaje del ADN con ioduro de propidio.
Resultados y conclusiones. Se ha podido observar que al cocultivar DSC con linfocitos, disminuye la muerte celular de los linfocitos
cocultivados con DSC con respecto al cultivo de linfocitos solos.
El mismo resultado lo hemos obtenido al cultivar los linfocitos con
DSC, separando los dos tipos celulares en cámara Transwell, con el fin
de que no haya contacto entre dichas células, o con sobrenadante procedente de cultivos de DSC. En los tres tipos de condiciones de cultivos observamos una disminución de muerte celular, por lo tanto pensamos que las DSC liberan al medio determinados factores protegen
de la muerte celular a los linfocitos.
156.ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD PARA LA APOPTOSIS EN
LAS POBLACIONES DE LINFOCITOS T CD4+CCR5+/- Y
CD4+CXCR3+/- EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Julià Arteaga E, Téllez Lara N, Tur Gómez C, Montalban Gairín X, Comabella López M. Institut de Recerca- Hospital Vall d'Hebron. Barcelona.
Introducción. Los receptores de quimiocinas CCR5/CXCR3 intervienen en la migración leucocitaria a través de la barrera hematoencefálica. Uno de los mecanismos implicados en el mantenimiento de la
tolerancia i nmunológica es la muerte celular apoptósica de linfocitos T (LT) activados auto-reactivos. Un defecto en la eliminación de
células potencialmente patogénicas, como los LT CCR5+ y CXCR3+,
conduci ría a una persistencia anormal de estas células en sangre periférica.
Objetivo. Estudiar la resistencia/susceptibilidad para la apoptosis en LT CCR5+ y CXCR3+ de pacientes con esclerosis múltiple (EM).
Métodos. En el estudio se incluyeron 15 controles sanos (CS) y 41
pacientes con EM [17 con EM primariamente progresiva (EMPP), 12
con EM remitente-recurrente (EMRR) sin tratamiento, y 12 con EMRR
tratados con interferón-beta (IFNb)]. La susceptibilidad para la apoptosis en LT CD4+ CCR5+/- y CXCR3+/- activados, se determinó por
citometría de flujo mediante Annexina V a las 6 y 24 horas y DiOC6
(3-3’ -dihexyloxacarboyanine iodide) a las 24 horas de la inducción de
la apoptosis mediante anticuerpos anti-Fas o TNFa (factor de necrosis
tumoral-alfa).
108
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Resultados. En la población de LT CD4+CCR5+ de pacientes con
EM se observó una menor susceptibilidad para la apoptosis que en CS
(p<0.05) a las 24 horas de la induc ción de la apoptosis mediante anticuerpos anti-Fas.
La población de LT CD4+CCR5+ tiene mayor susceptibilidad para
la apoptosis mediada por Fas comparado con el resto de subpoblaciones de LT estudiadas.
Conclusiones. Los resultados de este estudio sugieren un carác
ter diferenc ial del proceso de muerte celular inducida por activación
en la subpoblación de LT CD4+CCR5+ de pacientes con EM.
157.VALORACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE UN MODELO DE
ARTRITIS EN CONEJO INDUCIDA POR OVOALBÚMINA
(OVA). Alegre Aguarón E2,5, García-Alvarez F3,5, Desportes Bielsa
P2,5, Martinez Lostao L4, Anel Bernal A4, Larrad Mur L2,5, Martínez Lorenzo MJ1,5. 1Banco de Sangre y Tejidos de Aragón. 2Servicio de
Inmunología. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. 3Servicio
de Traumatología-Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. 4Departamento Bioquímica y Biología Molecular y Celular Univ. Zaragoza. 5Instituto Aragonés Ciencias de la Salud.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica inflamatoria carac terizada por una intensa activación inmune y una gran variedad de manifestaciones sistémicas. El proceso inflamatorio guía a la
destrucción del cartí lago y hueso. Aunque el proceso inflamatorio no
se conoce muy bien, el gran número de células T infiltradas en la membrana sinovial y la producción local de citoquinas deri vadas de células T sugiere que las células T tienen un papel importante en la respuesta autoinmune de pacientes con artritis reumatoide. Además, se
han descrito defectos en la apoptosis de los linfocitos T infiltrantes
en la sinovia que podrían generar una hiperplasia c on la consiguiente invasión de la articulación. Recientemente nuestro grupo describió
que los linfocitos infiltrados en la sinovia de pacientes con ar tritis reumatoide eran sensibles a APO2Lrecombinante. Con el fin de avanzar
en esta posible terapia, nos propusimos optimizar un modelo experimental de artritis induci da por antígeno, utilizando conejos de raza
neozelandés e inyección de ovoalbúmina (OVA). Para ello, se realizó
una inyec ción a día 0 con ovoalbúmina utilizando como adyuvante
Freund completo. La segunda inyección subcutánea se realizó a día 14
(protocolo A y B) ó a día 21 (Protocolo C). Una vez sensibilizados se
realizó, a día 19 (Protocolo B), 21 (Protocolo A) y 26-31 (protocolo C)
una inyección intraarticular en la extremidad trasera derecha. La extremidad trasera izquierda de cada animal sirvió como control interno
del experimento, inyectando intraarticularmente solución salina. Durante los 7 días posteriores se cuantificaron diferentes parámetros para
analizar el grado de la patología inducida. Tras la inyección intraarticular se evaluó diariamente el diámetro de cada articulación y el peso
corporal. Tras el sacrifi cio, se extrajo tejido de la articulación para realizar estudios anatomopatológicos mediante tinciones de cortes parafinados. Además, se realizaron determinaciones en suero de factor reumatoide, proteína C reactiva e inmunoglobulinas A, G y M.
De los tres protocolos utilizados, el que dío mejores resultados en
cuanto a inflamación, aumento de factor reumatoide y estudios de anatomía patológica fue el protocolo C. Actualmente, estamos utilizando este modelo para continuar con nuestros estudios sobre el efecto de
APO2L recombinante como posible tratamiento en la artritis reumatoide.
Financiación: PI061217.
INMUNOLOGÍA
158.BMPs Y PROTEÍNAS HEDGEHOG PARTICIPAN EN EL MANTENIMIENTO DE LOS PROGENITORES INTRATÍMICOS
CD34+. Hidalgo Lumbreras L1, Martínez VG1, Valencia J1, Vázquez M1, Zapata AG2, Sacedón R1, Hernández-López C1, Varas A1,
Vicente A1. 1Facultad Medicina. 2Facultad Biología. Universidad Complutense. Madrid.
Introducción. Las Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs) y las
Proteínas Hedgehog (Hh) son dos familias de proteínas de secreción muy conservadas que participan en la determinación del patrón
general de desarrollo del embrión y en organogénesis, y también
controlan procesos de supervivencia, prolif eración y diferenci ación
celular. En el timo de ratón se ha descrito la implicación de estas
dos familias de proteínas en diversos puntos de la diferenc iación
T.
Objetivos. Analizar el papel de estas proteínas en el timo humano.
Metodología. Las muestras de timo humano se obtuvieron de
niños (3 meses-5 años) sometidos a cirugía car diaca correctora. La
expresión de los componentes de la vía BMP se analizó por citometría
de flujo, inmunofluorescenci a y RT-PCR. Los estudios funcionales se
realizaron con cultivos en suspensión y con cultivos orgánicos de lóbulos tímicos fetales de ratones SCID reconstituidos con precursores tímicos humanos CD34+ purificados.
Resultados. En el timo humano las células epiteliales producen
BMPs y los precursores linfo-hematopoyéticos CD34+ expresan los
receptores para estos morfógenos y toda la maquinaria implicada en
la transducción de la señal. La estimulación de la vía BMP en progenitores intratímicos CD34+ inhibe su diferenciación hacia timocitos
CD4+CD8+, reduce su expansión inducida por IL-7 y promueve su
supervivencia. Estos efec tos son similares a los inducidos por la
vía de señalización Hh. El estudio de los efectos de la adición conjunta de Noggin, antagonista de BMPs, y de Sonic Hh, así como de
la modulación de los receptores para estos factores, demuestra que
BMP media al menos parte de los efectos de Hh en los precursores
CD34+.
Conclusiones. BMP y Hh participan conjuntamente en el mantenimiento de la población de precursor es intratímicos CD34+.
159.DIVERSIDAD DE ISOFORMAS DE CD3e EN CÉLULAS T
HUMANAS: PAPEL DE LA SECUENCIA N-TERMINAL. Rojo
JM1, Feito MJ1,2, Bello R1, Ojeda G3, Portolés P3. 1Centro de Investigaciones Biológicas, C.S.I .C. 2Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular I, Facultad de Ciencias Químicas, U.C.M, 3Centro Nacional
de Microbiología, I.S. CARLOS III.
Las cadenas CD3e carac terizan el linaje de linfocitos T, siendo
necesari as para el ensamblaje y la expresión en la membrana citoplasmática del complejo TCR/CD3, así como para la transmisión de las
señales producidas por la unión de ligandos al receptor TCR/CD3.
Durante la ontogenia de los linfocitos T se producen procesos selectivos positivos y negativos en los que intervienen péptidos antigénicos propios. Par a evitar procesos autoinmunes, las señales del receptor para antígeno han de modularse en funci ón de estos distintos estadíos, para lo que se han propuesto diversos mecanismos de cambio
cuantitativo o cualitativo tanto en los ligandos, como en la estructura
de los complejos TCR/CD3, o en las casc adas señalizadoras activadas
por los ligandos.
POSTERS
Hemos mostrado previamente que en CD3e de ratón se produce
un procesamiento proteolítico de la corta secuencia ac ídica N-terminal de la cadena, generándose especies moleculares que pueden ser
discriminadas mediante electroforesis bidi mensional (IEF-SDS PAGE)
e inmunoblot. Se conoce la secuencia de CD3e de 22 especies distintas,
en las que la región N-terminal es altamente variable en longitud y
secuencia, pero conserva siempre una alta proporción de residuos
áci dos. La mayoría de las cadenas de CD3e, incluyendo las cadenas
de CD3e humanas, carecen de motivos de glicosilación, por lo que su
pI se corresponde con el de su secuencia de aminóacidos. El análisis
bidimensional de precipi tados de CD3 de células Jurkat y de linfoblastos T normales confirma la generación de isoformas de CD3e con pI
c oincidente con una pérdida de aminoácidos N-terminales cargados
negativamente. Lo mismo ocurre en c adenas de CD3e de ratón expresadas en células T humanas, lo que sugiere que es un proceso generalizado.
Por tanto, y como ocur re en el ratón, la abundancia relativa de isoformas CD3e en células T humanas podría modular la interacci ón
de CD3 con el TCR y el umbral de activación de los linfoci tos, regulando la funcionalidad del complejo.
160.INTERACCIONES MOLECULARES DE ICOS (INDUCIBLE
COSTIMULATOR, CD278): ESTUDIO PROTEÓ MICO Y FUNCIONAL. Saez de Guinoa J1, Zafra MP1, Seren Bernardone I1, Portolés P2, Rojo JM1. 1Centro de Investigaciones Biológicas, C.S.I.C. 2Centro Nacional de Microbiología, I.S. Carlos III.
ICOS es una molécula coestimuladora de linfocitos T que interviene en el desarrollo de respuestas inmunitarias eficaces y también en el
desarrollo de inmunopatologías. Presenta homología de secuencia y
funcional con CD28, pero solamente es expresada en niveles altos en
células T activadas. Por ello, cabe preguntarse hasta qué punto las diferencias en el efecto de ICOS y CD28 en la respuesta de los linfocitos
T son debidas a su distinto patrón de expresión, o bien son determinantes las diferentes moléculas capaces de asociarse a su región citoplásmica.
Empleando como modelo una línea de linfocitos T CD4+ de ratón
que expresa altos niveles de ICOS, hemos abordado varios aspectos
funcionales de ICOS: En primer lugar, se ha r ealizado un estudio de
las moléculas que pueden asociarse a la región citoplasmica de ICOS
en función de la fosforilación o no del residuo de Tyr que forma parte del motivo YMxM presente tanto en ICOS como en CD28. Se ha
empleando un sistema de “pull down” con péptidos sintéticos de
ICOS, fosfori lados o no, unidos a una mariz sólida que se incuban
con lisados celulares. El análisis proteómico de los polipéptidos precipitados muestra que la secuencia fosfor ilada de ICOS asocia selectivamente subunidades reguladoras y catalíticas de fosfatidil inositol
3-quinasa (PI3-K). El estudio proteómico ha permitido comprobar además que, en contra de análisis anteriores empleando ensayos de triple híbrido, ICOS une diversos tipos de subunidades reguladoras
de PI3-K (p85a, p85b, p53a). Sin embargo, solamente se ha identificado un tipo de subunidad catalítica (p110a) asociado a estas subunidades, y no otras subunidades catalíticas, como p110b y p110d, también
expresadas en células T y susceptibles de unirse a las subunidades
reguladoras detectadas. Con esta base, se ha estudiado el papel de
ligandos de ICOS en el citoesqueleto de actina y en la redistribución
de balsas lipídicas, así como el efecto de inhibidores específicos de
PI3-K en estos fenómenos.
109
POSTERS
161. LAS CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES HUMANAS PROTEGEN DE LA CITOTOXICIDAD A LOS LINFOCITOS T Y SON
RESITENTE A LA APOPTOSIS MEDIADA POR RECEPTORES
DE MUERTE. Leno E, Morales J, Blanco O, de la Mata Espinosa
C, Ortiz-Ferron G, Tirado I, Muñoz-Fernandez R, Garcia Olivares
E, Maricarmen Ruiz-Ruiz M. Centro de Investigación Biomédica.
Introducción. El embarazo y el aborto espontáneo son procesos
fisiológicos que están asociados a diversos mecanismos inmunológicos. En estas actividades inmunológicas participa la decidua que es el
tejido materno que está en contacto intimo con el trofoblasto. En la
decidua se encuentran las células deciduales estromales (DSC), que
participan en la inmunorregulación materno-fetal. La apoptosis juega
un papel fundamental en el embarazo, la expresión de FasL por parte del trofoblasto induce apoptosis a los leucocitos deciduales Fas+,
regulando por tanto su supervivencia y favoreciendo el embarazo
Objetivo. Investigar la capacidad de las DSC de inducir apoptosis a los linfocitos T.
Metodología empleada. Las DSC fueron obtenidas de decidua de
aborto voluntario y cultivadas en Optimen. Las células Jurkat fueron
mantenidas en RPMI 10% FBS. Las DSC colocadas en cámara Transwell fueron cocultivadas con Jurkat, El porc entaje de células en apoptosis se determinó por ci tometría de flujo mediante el ciclo celular
(Sub-G1). También observamos la apoptosis de las Jurkat por microscopia de fluorescencia a través de DAPI.
Resultados y conclusiones. Las células deciduales estromales
(DSC) expresan FasL, aunque no solo no indujeron apoptosis a los linfocitos T Jurkat, sino por el contrario protegieron a estas células de la
muerte mediada por el anti-Fas. También se observó estos efectos protectores cuando las Jurkat fueron tratadas con TRAIL. Por otro lado al
colocar las DSC y J urkat en cámara Transwell observamos que es esta
protección seguía manteniéndose, lo que demostraba que el efecto protector estaba mediado por factores solubles. Por otra parte, aunque las
DSC expresan Fas y receptores de TRAIL, fueron resi stente a la inducción de apoptosis por anti-Fas y TRAIL. Estos resultados confirman la
participaci ón de las DSC en los fenómenos de apoptosis; fenómenos
claves en el desarrollo normal o patológico del embarazo.
162.ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LA QUIMIOQUINA PORCINA
CCL21 FUSIONADA A GFP. Moreno Rivera S, Álvarez Vega B,
Revilla Calvo C, Domínguez Juncal J, Ezquerra Martínez A, Alonso Moreno F. INIA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología
Agraria y Alimentaria).
Las quimioquinas juegan un papel fundamental en el desarrollo
de la respuesta inmune, regulando la migración de las diferentes subpoblaciones de leucocitos a sus órganos diana. En el caso de las células
dendríticas, no solo dirigen la migración de las mismas a los lugares de
entrada de antígeno sino que además pueden regular su maduración.
En humano, rata y ratón se han descrito múltiples patrones de
expresión de receptores de quimioquinas en distintas poblaciones celulares del sistema inmune, los cuales presentan diferenc ias fenotípicas
y funcionales. En el modelo porcino, debido a la falta de reactivos específicos, no existen datos de la expresión de receptores de quimioquinas en las subpoblaciones de leucocitos. Es por tanto necesario generar los reacti vos que nos permitan analizar el patrón de expresión de
dichos receptores en las diferentes poblaciones celulares del sistema
inmune porcino y tratar de establecer su funcionalidad.
110
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
En este trabajo evaluamos la actividad de la quimioquina CCL21,
expresada como proteína de fusión con la proteína verde fluorescente
GFP (CCL21-GFP), y su actividad quimiotáctic a sobre diferentes subpoblaciones de células T. Para ello hemos clonado la quimioquina en
el plásmido “CT-GFP Topo” y generado transfectantes estables en células CHO. En ensayos de migración realizados sobre diferentes poblaciones de células mononucleares sanguíneas, la quimioquina recombinante CCL21-GFP, obtenida de los sobrenadantes de las células transfectadas, presenta actividad quimiotáctic a, sobre todo para la población celular CD4+2E3+, que contiene las células T naïve, que expresan
el mRNA que codifi ca para el rec eptor CCR7.
Estos resultados abren un camino para el análisis de la expresión
difer encial de receptores de quimioquinas en las diferentes subpoblaciones de células del sistema inmune porcino.
163.CONTRIBUCIÓN DE CD3GAMMA A LA SEÑALIZACIÓN
VÍA TCR/CD3. Busto EM1, Reiné J1, Regueiro JR1, Rossi NE1,
Domínguez O2, Lombardía L2, Recio MJ1. 1Inmunología. Facultad de
Medicina. Universidad Complutense, Madrid. 2CNIO. Centro Nacional
de Investigaciones Oncológicas, Madrid.
El receptor del linfocito T es un complejo multimérico integrado
por diferentes cadenas, en las cuales las cadenas variables TCR (TCRα
y TCRβ) son las encargadas del reconocimiento antigénico, mientras
que las cadenas invariantes CD3 (CD3ε, CD3γ, CD3δ y CD3ζ) son responsables del ensamblaje y expresión del complejo TCR/CD3, así como
de las señalización intracelular. La participación de cada una de las
cadenas en el proceso de señalización sigue siendo tema de discusión,
así como las baterías de genes inducidos en cada caso.
Con objeto de acotar la contribución y conexiones de CD3γ en la
señalización del TCR/CD3 nos hemos propuesto estudiar en células
deficientes de CD3γ transformadas con Herpesvirus saimiri, eventos de
señalización tempranos (fosforilación de los intermediarios de señalización) y tardíos (inducción de genes mediante microarrays).
Los resultados preliminares sugieren que los linfocitos T de los
individuos deficientes de CD3γ (γ-/-) estimulados a distintos intervalos de tiempo con anticuerpos anti-CD3 (UCHT1) no presentan diferencias en la fosforilación de la proteína ZAP70 mediante citometría
de flujo ni en la cinética de activación de proteínas de la ruta de señalización de las MAP Kinasas (ERK, p38 y JNK) mediante western blot
en comparación con individuos control (γ+/+). Sin embargo, los resultados de inducción de genes sugieren un perfil de expresión distinto
en linfocitos γ+/+ frente a γ–/–. En base a estos resultados, podemos concluir que los linfocitos sin CD3γ emiten con normalidad señales tempranas a través de las rutas analizadas, pero deben existir diferencias
en otras rutas que expliquen las disparidades distales.
164.PAPEL DE CD38 EN LA RESPUESTA ANTÍGENO-ESPECÍFICA DE LOS LINFOCITOS T. Muñoz Fernández P1, Mittelbrunn
M2, de la Fuente H3, Pérez Martínez M3, García Pérez A1, Zubiaur
Marcos M1,4, Sánchez Madrid F2,3, Sancho López J1. 1Instituto de
Parasitología y Biomedicina. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares. 3Hospital
de la Princesa. 4Instituto de Salud Carlos III.
CD38 es una glicoproteína transmembrana de tipo II altamente
expresada en células T activadas. Aunque se conocen funciones como
INMUNOLOGÍA
señalización intracelular, adhesión, prolif eración, apoptosis, producci ón de citocinas y f osforilación de proteínas, aún no está claro el papel
de CD38 en la señalización mediada por el complejo TCR/CD3. Para
tratar de dilucidarlo se han realizado experimentos de sobre-expresión
de CD38 mediante la transfección del cDNA que codifi ca CD38 fusionado al de la proteína de fluorescencia verde (GFP) en células T Jurkat o bien inhibiendo su expresión mediante la transfección de RNA
de interferencia específico para CD38 (siRNA CD38). Para medir cambios en la concentración de calcio intracelular [Ca2+]i, las células Jurkat transfectadas fueron pre-incubadas con el indic ador Fura-2, lavadas y estimuladas con células Raji previamente pre-pulsadas o no con
el superantígeno SEE, que actúan como células presentadoras de antígeno (APC). La producción de citocinas se midió por ELISAs específicos para IL-2 o IFN-gamma (Diaclone) o simultáneamente para 10
citocinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, I L-12 (p70), I L-13,
IFN-gamma and TNF-alpha) por un sistema multiplex (Bio-Plex, BioRad). La fosforilación de LAT, Erk y PKC-theta fue determinada por
Western-blot con anticuerpos fosfoespecíf icos (Cell Signaling Technology). La sobre-expresión de CD38 en linfocitos T incrementaba los
niveles de [Ca2+]i y la producc ión de IL-2 mediados por el TCR, mientras que la inhibición de la expresión de CD38 inducía el efecto contrario. Efec tos similares a los producidos por siRNA CD38 fueron obtenidos mediante el bloqueo de CD38 con los anticuerpos monoclonales anti-CD38 HB136 o IB6, considerados como no agonistas. Estos
resultados indican que CD38 tiene un papel inmunomodulador en la
respuesta funcional del linfocito T antígeno-específica.
165.INFLUENCIA DE LA SEÑALIZACIÓN POR NOTCH1 SOBRE
EL POTENCIAL DE RECONSTITUCIÓN HEMATOLINFOIDE
IN VIVO DE PROGENITORES INTRATÍMICOS HUMANOS.
García-Peydró M, Toribio ML. Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”.
El abordaje de los mecanismos que regulan la colonización de la
médula ósea (BM) por células troncales hematopoyéticas y la migración de progenitores y células maduras a órganos periféricos, incluido el timo, requier e el empleo de modelos in vivo. Dado el papel esencial de la señalización por Notch en la especificaci ón del linaje T, hemos
abordado la contribución de la señalización por Notch1 al proceso
de colonización intratímica, así como el impacto de la señalización
de Notch1 sobre la dinámica de rec onstitución hematopoyética in vivo
de progenitores hematolinfoides humanos.
Para ello se han realizado transferencias in vivo de progenitores
hematolinfoides de timo humano modificados genéticamente por transducción r etroviral en ratones deficientes para la recombinasa RAG-2
y la cadena gamma común de receptores de citoquinas (RAG-2-/c-/-). Los resultados obtenidos demuestran que los progenitores intratímicos humanos son capaces de colonizar el timo de ratones RAG-2-/- c-/- y r econstituir eficientemente (>90%) el
compartimento de linfocitos T humanos, recapitulando los diferentes estadios madurativos T. Dic ha reconstituci ón es transitoria y se r
estringe exclusivamente al timo.
La sobre-expresión de una forma constitutivamente activa de
Notch1: i) no afec ta a la reconstitución tímica, aunque impide la transición al estadio SP; induce: ii) la repoblación efi ciente (>95%), pero
transitoria, de la médula ósea, y iii) la dif erenciac ión extratímica en
la BM de células DP, aunque no altera la capacidad intrínseca de migración a la BM de los progenitores humanos.
POSTERS
El potencial de reconstitución in vivo de progenitores hematolinfoides humanos es absolutamente dependiente de la interacción de
la molécula de adhesión CD44 con su ligando.
La señalización por Notch1 mantiene la expresión de CD44 a niveles altos, permitiendo la retención específica de los progenitores hematolinfoides humanos en la BM.
166.FLOW CYTOMETRY CHARACTERIZATION OF EALT (EYEASSOCIATED LYMPHOID TISSUE) CELLS OBTAINED BY
BRUSH CYTOLOGY. Martínez Osorio H1, López-García A1,
Quintana R1, Gutiérrez San José E2, Fernández-Martínez I1, Calonge M1, Diebold Y1, Corell A1,2. 1,2Ocular surface group - I OBA, University of Valladolid. 2,1Immunology section, University of Valladolid,
Valladolid.
Purpose. To characterize by f low cytometry human conjunctival
(epithelial and intra-epithelial lymphoid) cells recovered by brush cytology (BC).
Methods. BC was performed in conjunctivas of 20 healthy donors.
Cells were detached by shaking the brush in supplemented DMEM/F12 medium. To characterize recovered cells, 4 flow cytometry assays
were done in each sample in order to: 1) establish their lineage (An
anti-c ytokeratin7-FITC MoAb was used as epithelial marker and an
anti-CD45-PC7 MoAb for lymphoid cells); 2) analyze the cell-cyc le
(IP); 3) assess the apoptotic stage (Annexin V vs PI); and 4) study the
lymphocyte subsets by their cor responding CD markers. Two-tailed
Student’s t test was performed for statistical analysis.
Results. 14 x 104 ± 0.9 cells were recovered. CK-7+ c ells represented the 67.8 ± 1.6% in tarsal BCs and the 65.7 ± 2.5% of bulbar BCs. Bulbar cells showed higher density of CK7 than tarsal epithelium. CD45+
cells were the 3.8 ± 0.4% of the tarsal cells and the 2.8 ± 0.3% of the bulbar cells. Regarding the DNA content, tarsal epithelial cells had higher proliferative index (S phase) than bulbar conjunctival cells (3.5 ±
0.3% vs. 2 ± 0.2%). Although the % of viable, apoptotic and dead cells
showed no signific ant differenc es between tarsal and bulbar BCs, we
observed two different populations: 22.8% (± 1.6) of c ells were smaller, less complex and had good viability (77.9 ± 3.4%) ; 76.4% (± 1. 6)
of cells were larger, more complex and showed poor viability (21.3 ±
2.2% ). The Lymphocyte subsets showed a predominant T cell population but were difficult to assess due to the low numbers of obtained cells.
Conclusions. In healthy subjects, conjunctival cell populations
recovered by BC are not purely epithelial, as there are a few CD45+
cells (mainly T cells), not previously described. Besides, the differences observed in cell size, viability and proliferative capacity of rec overed epithelial cells may help in long-term cultures for regenerative purposes.
167.DIFERENTES EFECTOS DE LA INHIBICIÓN DE FOSFODIESTERASA 4 Y FOSFODIESTERASA 7. González García C, Bravo B, Gómez S, Hernández J, Ballester S. Instituto de Salud Carlos
III.
Los niveles de AMPc en la célula están regulados por la adenilato ciclasa a nivel de síntesis, y por las fosfodiesterasas, a nivel de degradación. Variaciones en los niveles de este nucleótido cíclico pueden
111
POSTERS
estar implicados en procesos de inflamación. Este segundo mensajero
se une a PKA (proteína kinasa A), que fosfori la el factor de transcripci ón CREB (cyclic AMP response binding proteins). Los inhibidores
de PDE4, una de las PDE mayoritarias de linfoc itos T, son los más
ampliamente caracterizados hasta el momento; sin embargo, presentan efectos secundarios que han llevado a la búsqueda de otros inhibidores de PDE que minimicen estos efectos negativos. Otra de las PDE
expresadas por linfocitos es la PDE7, por lo que se piensa en ella como
una posible alternativa para el control de procesos inflamatorios.
Nosotros hemos querido analizar comparativamente los efectos
de la inhibici ón de cada una de estas PDE, para lo que hemos usado
Rolipram y BRL 50481, como inhibidores especí ficos de PDE4 y PDE7,
respectivamente; o una combinación de ambos. En linfocitos T, la proliferac ión se ve afectada de manera similar por la inhibición de cada
una de estas fosfodiesterasas; aunque la inhibici ón de PDE7 presenta un mayor efecto pro-apoptótico. Los niveles de AMPc intracelular
son más sensibles a la inhibición de PDE4, indic ando una mayor implicación de ésta en el control de dichos niveles en linfocitos T. Estos datos
también corr elacionan con los obtenidos para los ensayos de actividad transcripci onal del factor CREB, los cuales muestran mayor ac
tivación de este factor mediada por Rolipram. Además, la utilización
simultánea de Rolipram y BRL 50481 no produce ningún efecto sinérgi co en cuanto a la activación de CREB. Sin embargo, los ensayos transcripc ionales realizados en astrocitos, de importante implicación en
algunos procesos inflamatorios en sistema nervioso central, muestran
que en este tipo celular ambos inhibidores cooperan en la actividad de
CREB.
168.INMUNODETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE INTERFERÓN
GAMMA HUMANO MEDIANTE EL USO DE NANOPARTÍCULAS DE ORO Y MICROPARTÍCULAS MAGNÉTICAS. Sánchez-Espinel C1, Ambrosi A2, de la Escosura A2, Díaz B1, Garet
ME1, Merkoçi A2, Faro J1,3, González-Fernández A1. 1Grupo de Inmunología. Edificio Ciencias Experimentales. Universidad de Vigo. 2Grupo
de Nanobioelectrónica y Biosensores. Institut Català de Nanotecnologia.
Campus UAB. Bellaterra. Barcelona. 3Instituto Gulbenkian de Ciencia,
Oeiras, Portugal.
Introducción. El uso de nanopartículas, principalmente nanopartículas de oro (AuNPs), conjugadas con proteínas, permite pensar en
el diseño de técnicas más rápidas y sensibles, que requieran menor
cantidad de muestra y que supongan un menor coste que las técnicas de inmunodetección tradicionales. Así, métodos como el ELISA y
la citometría de flujo, pueden ser sustituidos por biosensores electroquímicos basados en AuNPs como marca.
Objetivo. Nuestro grupo ha comparado la técnica de ELISA para
la determinación de interf erón gamma humano (INF-gamma), con un
nuevo método electroquímico basado en el uso de AuNPs conjugadas
con anticuerpos, como marca electroactiva, y mic ropartículas paramagnéticas (MPs) como soporte de las reacciones inmunológicas. La
detección electroquímic a de las AuNPs se lleva a cabo de manera directa, sin necesidad de oxidación previa mediante agentes químicos.
Metodología. Se unió un anticuerpo monoclonal anti-INF-gamma a MPs recubiertas con estreptavidina y, posterior mente, éstas fueron incubadas con distintas concentraci ones de INF-gamma humano.
A continuación, se incubó con la disoluci ón de anticuerpo monoclonal anti-INF-gamma que previamente había sido conjugado con AuNPs
de 15 nm de diámetro Después de cada incubac ión, el exce-
112
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
so de reactivos fue separado de las MPs usando un electroimán. Las
AuNPs fueron detectadas electroquímicamente, siendo proporcional
la señal electroquímica a la cantidad del analito problema en la muestra. Los niveles de INF-gamma fueron analizados comparando con un
test de ELISA sándwich convencional (kit BD optiEIA).
Resultados. Los resultados muestran que este método permite
la detección de interferón gamma en muestras, dando resultados comparables al ELISA, con un nivel de detección de 6 pg/ml. Sin embargo, consideramos que esta técnica podría ser optimizada tanto en el
uso de menor volumen de muestra como en el límite de sensibilidad
(v.g., usando métodos catalíticos).
Conclusión. Los biosensores electroquímicos basados en el uso de
AuNPs como marca pueden ser aplicados con éxito para la determinación de citocinas como el INF-gamma humano.
169.PAPEL DE LA PROSTAGLANDINA F2 ALPHA EN LA REGULACIÓN DE GENES IMPLICADOS EN LA ACTIVACIÓN DEL
LINFOCITO T. Cacheiro C, Iñiguez MA. Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (UAM).
Introducción. Las prostaglandinas (PGs) son productos del metabolismo del ácido araquidónico originados por la acción de diversos
enzimas tales como las ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2) y las prostaglandin sintasas. Las PGs ejercen su acción a través de receptores de
siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G (GPCRs) específicos para cada una de ellas. En el caso de la PGF2α, su interacción
con el receptor FP (acoplado a una proteína Gαq) produce un incremento en los niveles de calcio intracelular, requisito indispensable para
la activación óptima del factor de transcripción NFAT (esencial en la
activación del linfocito T).
En este sentido, nuestros resultados sugieren la implicación de la
señalización a través de receptores acoplados a proteínas Gαq, tales
como el FP, en la activación de NFAT y en la inducción de la expresión
de genes dependientes de dicho factor de transcripción (COX-2, IL-2,
TNF-α, etc).
Objetivos. Estudio del posible papel que desempeña la PGF2α en
la regulación de genes implicados en la activación del linfocito T. Para
la consecución de este objetivo, se han realizado estudios en células
T Jurkat, analizando las vías de señalización implicadas en la inducción transcripcional de estos genes por estímulos como el TPA, diversos prostanoides, etc. Con el fin de determinar la implicación de determinadas vías de señalización intracelular en respuesta a los diversos
estímulos, se han usado inhibidores farmacológicos. Las variaciones
de la expresión y de la actividad de COX-2 y de prostaglandin sintasas en células T se han medido mediante RT-PCR, Western, ELISA, etc.
Resultados. Los resultados indican que esta prostaglandina, a través de la unión a su receptor FP, induce la traslocación de NFAT al
núcleo incrementando de esta manera la transcripción de genes mediada por NFAT en células T.
170.CAPACIDAD PROLIFERATIVA DE LINFOCITOS CD4 NAÏVE CD31+ Y CD31- DE SANGRE PERIFERICA EN HUMANOS.
Ruiz Hernandez R1, de Haro J2, Clotet B1, Bofill M1. 1Fundación irsiCaixaHospital Germans Trias i Pujol. 2Hospital Municipal de Badalona.
Introducción. La homeostasis de los linfocitos T CD4+ CD45RA+
depende en parte de la entrada a la circulación peri féric a de los lin-
INMUNOLOGÍA
focitos procedentes del timo (linfocitos emigrantes tímicos recientes,
ETR) y del mantenimiento del número de éstos por proliferaciones
homeostáticas (independiente de antígeno). Estas dos poblaciones
de células CD4 pueden identificarse respectivamente por la presencia
o ausencia de CD31.
Objetivos. Evaluar el impacto de las citocinas homeostáticas IL2, IL-17 e IL-15 sobre la capacidad proliferativa de las poblaciones
CD4/CD45RA+ CD31+ y CD4/CD45RA+ CD31-procedentes de sangre periférica.
Métodos. Las poblaciones de linfocitos CD4 CD45RA+ de sangre periférica humana se aislaron por selección negativa con el uso de
esferas magnéticas (StemCell Technologies, Barcelona, Spain). Las subpoblaciones CD31+ y CD31- se aislaron mediante un cell sorter. Las
células se cultivaron en presencia de medio, de las interleuquinas homeostáticas IL-2, IL-7 e IL-15, PHA, ó ambas durante 3 ó 5 días. La capacidad proliferativa de estas poblaciones se evaluó mediante incorporación de timidina tritiada; Los niveles de activación CD25, y los marcadores de Naïve y de memoria, CD45RA y CD45RO, se midieron
mediante citometria de flujo.
Resultados. Ninguna de las dos subpoblaciones de células CD4
naive proliferó en presencia de medio o de citocinas. Si n embargo la
población CD31+ proliferó en presencia de PHA, mientras que la población CD31- no responde a dicho estímulo a menos que se hallaran presentes en los cultivos IL-2, IL-7 o IL-15 en cuyo c aso la capacidad prolifer ativa de ésta población fue parec ida a la de la población CD31
positiva.
Conclusiones. Las interleuquinas homeostáticas podrían jugar un
papel el mantenimiento del nivel de linfocitos CD4 Naïve en humanos.
171.PAPEL DE LA CADENA CD3 GAMMA DEL COMPLEJO TCR
EN LA SELECCIÓN TÍMICA: ¿UN CASO CERRADO? Fernández-Malavé E, Reiné J, Regueiro JR. Universidad Complutense Madrid.
Los procesos de selección positiva y negativa de las células T del
linaje alfa/beta en el timo dependen de señales mediadas por el complejo TCR/CD3. Sin embargo, la contribución específica de las cadenas CD3 en estos procesos, en particular de CD3gamma y CD3delta
que derivan de un gen ancestral común, sigue siendo materia de debate.
Con el objetivo de identificar funciones específicas de CD3gamma en la selección tímica, hemos generado y analizado una línea de
ratones carentes de CD3gamma que expresa el TCR transgénico HY.
Este TCR reconoce un péptido específico de machos en el contexto
de MHC de clase I H-2Db. La expresión del TCR HY resulta en la selección positiva de células CD8+ en las hembras y la selección negativa
de estas mismas células en los machos, permitiendo así el análisis simultáneo de la selección positiva y negativa in vivo.
Los resultados obtenidos indican que el TCR HY carente de
CD3gamma es capaz de seleccionar tanto positiva como negativamente a las células CD8+ TCR HY+, pero con una eficiencia baja. Por
otro lado, la falta de CD3gamma resulta en una alteración en la “decisión de linaje”, reflejada en la aparición de células CD4+ TCR HY+
en los ratones CD3gamma-deficientes. Además, estas alteraciones se
asocian con una reduc ción generalizada en la intensidad de la señalización vía TCR.
En conclusión, nuestro estudio sugiere que CD3gamma está implicada de una forma específica en la regulación fina de la eficiencia y
POSTERS
fidelidad de la selección tímica, a través del control de la intensidad de las señales generadas por el TCR. Sin embargo, este caso continua en abierto a la espera del análisis de más modelos de TCR transgénicos que permitan la elucidación de los mecanismos moleculares
subyacentes a este papel de CD3gamma durante la selección tímica.
172.EFECTO DIFERENCIAL DE LA FALTA PRE-TÍMICA Y POSTTÍMICA DE CD3 GAMMA. Reiné J, Recio MJ, Busto E,
Fernández-Malavé E, Regueiro JR. Universidad Complutense
Madrid.
Introducción. Los linfocitos naturales deficientes de CD3 gamma,
a diferencia de los mutantes de Jurkat, expresan mucho TCR/CD3.
Pensamos que esto es debido a que los mutantes de Jurkat fueron selecci onados para no expresar TCR/CD3 y tienen, de hec ho, mutaciones
adicionales, ya que se cr eía que la falta de cualquier cadena CD3 impedía la expresión del resto del complejo.
Sin embargo, es posible que los linfocitos naturales deficientes de
CD3gamma, que carecen de CD3gamma antes de la maduración, alcancen la periferi a muy seleccionados y por tanto sean poco representativos bioquímicamente.
Objetivos. En este trabajo nos propusimos evaluar el efecto que
tiene la ausencia de CD3gamma en linfocitos post-tímic os. Para ello
silenciamos la expresión de CD3gamma empleando un pool de oligos
siRNA específic os (Dharmacon).
Metodología. Los linfocitos T Jurkat fueron electroporados c on
un pool de oligos siRNA específi cos. La expresión del complejo
TCR/CD3 se monitorizó por ci tometría de flujo al cabo de 24 horas
post-tratamiento, con diferentes anticuerpos monoclonales (SK7;
BMA031).Para evaluar el grado de interferencia a nivel de la proteína CD3gamma se realizaron tinciones intracelulares con el antisuero
anti-CD3gamma (TG5).
Resultados. Las células tratadas con siRNA para CD3gamma muestran un grado de inhibición del 70% (a nivel intracelular c on TG5) que
se corresponde con una bajada de expresión del complejo TCR/CD3
con BMA031 (70%) pero no con SK7 (11%).
Conclusiones. Nuestros datos indican que existen difer encias de
expresión entre la pérdida de CD3gamma antes y después de pasar
por el timo. Por lo tanto, la baja expresión del TCR/CD3 en linfocitos
naturales defici entes de CD3gamma se debe más a un proceso de selección tímica que a un efecto bioquímico.
173.LA CARGA DE ANTÍGENOS DE CD1 DEPENDE DE UNIONES ENTRE LOS DOMINIOS REGULADAS POR EL PH.
Relloso M1, 4, Cheng T-Y1, Roura-Mir C1, Porcelli SA2, Wilson IA3,
Moody DB1. 1Division of Rheumatology, Immunology and Allergy,
Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, Boston,
MA, USA. 2Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, USA. 3Skaggs Institute for Chemical Biology, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA. 4Dpt.
Microbiología, Facultad De Farmacia, Universidad Complutense
Madrid.
La familia CD1 está constituida por moléculas presentadoras de
antígeno no polimórfic as que presentan lípidos y glicolípidos a células T. Las moléculas CD1 se clasifican por su secuencia en dos grupos:
113
POSTERS
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
el grupo 1 incluye las moléculas de CD1a, CD1b, CD1c y el grupo 2
CD1d.
Actualmente tenemos información sobre la localización intracelular, estruc tura, y antígenos que presentan algunas de las moléculas de
CD1, pero no se conoce como los lípidos son capaces de atravesar la
estrecha entrada que da acceso al sitio de unión de antígeno y como
son capaces de colocarse dentro de ella para que puedan ser reconocidos por células T a través de los TCR.
Esta cuestión es incluso más importante en el caso de CD1b que
tiene una entrada a la hendidura muy estrecha (15 Å) comparada con
la de MHC I (25 Å). Además CD1b es capaz de alojar lípidos de cadena de hasta 80 carbonos que requieren, para su carga, encontrar las
moléculas de CD1b en los endosomas tardíos donde el pH es ácido.
Por eso hipotetizamos que el pH ácido podría cambiar la conf ormación de algunas partes de la molécula de CD1b que favoreciera la carga de los antígenos.
Para identificar áreas de la molécula de CD1b que pudieran ser
elásticas elaboramos modelos de dinámica molecular. Después, mutamos los aminoácidos ác idos de esas áreas. Escogimos estos aminoácidos por que a pH neutro tienen carga negativa y producen interac ciones salinas con aminoácidos básicos y a pH ácido las cargas se neutralizan y las interacciones salinas desaparecen.
De esta manera nuestros mutantes deberían mimetizar los cambios conformacionales produci dos por el pH en los lisosomas. Del
resultado del análisis de estas mutaciones identific amos que los
mutantes en D60 y E62 mejoran la activación de las células T por
antígenos largos y la unión de los antígenos a las moléculas de
CD1b. Por otro lado, también demostramos que las mutaciones
también afectan a la capacidad de las moléculas de CD1b de retener a los antígenos.
Por lo tanto, concluimos que los aminoácidos D60 y E62
que hacen interacciones con K55 y R168 respectivamente en CD1b
controlan la carga y retención de los antígenos lipídicos de
CD1b.
SESIÓN 11: AUTOINMUNIDAD - II
Moderadores: Dra. Mª Rosa Julià (Palma de Mallorca)
Dra. Carmen Gelpí (Barcelona)
174.ASOCIACIÓN DE POLIMORFISMOS DE LOS GENES
CAPSL E IL7R CON DIABETES TIPO 1 EN POBLACIÓN
ESPAÑOLA. Santiago JL1, Martinez A1, Espino L1, de la Calle
H2, Fernandez-Arquero M1, Figueredo MA1, de la Concha EG1,
Urcelay E1. 1Hospital Clínico San Carlos. 2Hospital Ramón y Cajal.
Madrid.
La predisposición genética a la diabetes tipo 1 (T1D) es debida fundamentalmente al Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC).
Sin embargo, se han descrito una serie de genes asociados a la T1D
localizados fuera de esta región. En la región cromosómica 5p13 se ha
encontrado asociado un bloque que incluye los genes CAPSL (calcyphosine-like) situado e IL7R (receptor de la IL-7 o CD127) que se
encuentra en el mismo bloque de ligamiento que CAPSL. Nuestro objetivo fue replicar la asociación descrita con anterioridad en otras poblaciones caucásicas.
114
Realizamos un estudio caso-c ontrol con 301 enfermos y 646 controles sanos, de la Comunidad de Madrid. En ambas cohortes se analizaron 2 SNPs en el gen CAPSL (rs1445898 y rs1010601) y 3 en el gen
IL7R (rs6891932, rs987106 y rs3194051). El genotipado se realizó por
sondas TaqMan mediante Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, USA). Las diferencias en frecuencias alélicas y
genotípicas fueron comparados mediante el estadístico Chi-cuadrado
y las asociaciones fueron medidas con la odds ratio (OR) (Epi Info v.
6.02, CDC, USA).
En el análisis de nuestra cohorte encontramos que el genotipo
homocigoto mutante del polimorfismo CAPSL-rs1445898 estaba significativamente disminuido en enfermos frente a controles (OR=0.65;
p=0.023). El efecto protector fue más significativo en el grupo de pacientes con debut temprano de la enfermedad frente a los de debut tardío (OR=0.33; p=0.004) y frente a controles (OR=0.31; p=0.0004). En
este mismo grupo de enfermos el genotipo homocigoto mutante del
polimorfismo IL7R-rs6891932 presentó también un efecto protector
frente a pacientes con debut tardío (OR=0.21, p=0.03) y frente a controles (OR=0.24, p=0.03).
Replicamos la protección por los polimorfismos de CAPSLrs1445898 y de IL7R-rs6891932 encontrada en otras poblaciones caucásicas. Describimos por primera vez que este efecto protector se
encuentra específicamente en pacientes de T1D con debut temprano
de la enfermedad.
175.CONTRIBUCIÓN DE UN POLIMORFISMO EN EL GEN STAT4
A LA SUSCEPTIBILIDAD A LA DIABETES TIPO 1. Santiago
JL1, Espino L1, Martinez A1, de la Calle H2, Fernandez-Arquero M1,
Figueredo MA1, de la Concha EG1, Urcelay E1. 1Hospital Clínico San
Carlos. 2Hospital Ramón y Cajal.
El gen STAT4 (signal transducer and activator of transciption 4)
codifica un factor de transcripción involucrado en las rutas de señalización de diversas citocinas (IL-12, IL-15, IL-23) y en la diferenciación de células Th1 y Th17. Recientemente se ha publicado la asociación con artritis reumatoide (AR) y con lupus eritematoso sistémico
(LES) de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) localizado en
este gen. Nuestro objetivo fue analizar el papel de este SNP (rs7574865)
en otra enfermedad autoinmune como es la T1D en población española.
Realizamos un estudio caso-control con 311 enfermos y 716 controles sanos, de la Comunidad de Madrid. La edad de debut varia
entre 1 y 55 años (media: 17.3 ± 10.0 y mediana: 15 años) siendo todos
ellos insulinodependientes en el momento del estudio. El SNP del
gen STAT4 (rs7574865) se genotipó mediante sondas TaqMan que
se analizaron en ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). Las diferenc ias en frecuencias
alélicas y genotípicas fueron c omparadas por el estadístico Chi-cuadrado y las asociaciones fueron medidas con la odds ratio (OR) con
un intervalo de confianza del 95% (Epi Info v. 6.02, CDC, Atlanta,
USA).
El polimorfismo del gen STAT4 analizado (rs7574865) cumple las
condiciones del equilibrio de Hardy-Weinberg en nuestra población
control. La frecuencia de alelo minoritario (alelo T) fue signific ativamente mayor en enfermos que en controles [OR=1.36 (1.07-1.71);
p=0.008]. Cuando estratific amos nuestro grupo de pacientes por edad
de debut de la enfermedad y por sexo, no encontramos diferencias significativas en ninguno de los grupos.
INMUNOLOGÍA
Describimos por primera vez la asociación del polimorfismo del
gen STAT4 previamente asociado a AR y LES con un incremento en la
susceptibilidad a sufrir T1D con independencia de la edad de debut
de la enfermedad y del sexo. Nuestros datos sugieren que el gen STAT4
interviene en el desarrollo de múltiples enfermedades autoinmunes
poligénicas.
176.MODULATION OF INFLAMMATORY RESPONSES BY
DITERPENE ACIDS FROM HELIANTHUS ANNUUS L. Hortelano S1, Girón N2, de las Heras B2, Diaz-Viciedo R2, Massó JM2,
Rodriguez B3, Villar A2. 1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC; Madrid. 2Departamento de Farmacología Facultad de
Farmacia, Universidad Complutense Madrid. 3Instituto de Química
Orgánica (CSIC), Juan de la Cierva, Madrid.
Fractionation of a petroleum ether extract of Helianthus annuus
L. (sunflower) led to the isolation of three diterpene acids: grandiflorolic, kaurenoic and trachylobanoic acids. These compounds were studied for potential anti-inflammatory activity on the generation of inflammatory mediators in lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW 264.7
macrophages. At non-toxic concentrations, these compounds reduced,
in a concentration-dependent manner, nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) and tumor necrosis factor (TNF-alfa) production, as well
as expression of inducible nitric oxide synthase (NOS-2) and cyclooxygenase-2 (COX-2).
All diterpenoids displayed significant in vivo anti-inflammatory
activity and suppressed the 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
(TPA)-mouse ear edema. In addition, inhibition of myeloperoxidase
(MPO) activity, an index of cellular infiltration, was observed. In summary, our results demonstrate that these diterpenoids have anti-inflammatory activity in macrophages, as indicated by inhibition of NOS-2
and COX-2 expression and activity and impaired cytokine release. The
low cytoxicity of these compounds in cell culture and their effectiveness in an in vivo animal model of inflammation indicate that these
substances may contribute to the anti-inflammatory activity attributed to the sunflower.
177.AUTO-ANTICUERPOS CIRCULANTES EN PACIENTES CON
ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA.
Núñez B1,3, Sauleda J1,2,3, Julià MR4, García-Aymerich J5, Antó JM5,
Gea J3,6, Monsó E3,7, Gómez F3,8, Roca J3,8, Farrero E9, Agust A1,2,3.
1Servei de Neumologia, Hospital Son Dureta, Illes Balears. 2Fundació
Caubet CIMERA, Bunyola, Illes Balears. 3CIBER en Enfermedades Respiratorias. 4Servei Inmunologia, Hospital Son Dureta. 5Centro de Recerca en Epidemiologia Ambiental, IMIM, Barcelona. 6Servei de Neumologia, Hospital del Mar, Barcelona. 7Servei de Pneumologia, Hospital
Germans Trias i Pujol, Badalona. 8Servei de Pneumologia, Hospital Clínic-IDIBAPS, Brcelona. 9Servei Pneumologia, Hospital De Bellvitge,
Hospitalet del Llobregat. Barcelona.
Introducción. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)
se caracteriza por alteraciones en la respuesta inmune innata y adquirida, habiéndose descrito fenómenos de autoinmunidad en forma de
anticuerpos antielastina y anti epitelio pulmonar.
Hipótesis: Los anticuerpos circulantes antinucleares (ANA), antitejido (AT) y anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) están aumentados
en la EPOC.
POSTERS
Objetivos. Evaluar la prevalencia de títulos positivos de estos
autoanticuerpos (≥ 1/160 de ANA y AT, y ≥ 1/10 ANCA) en pacientes con EPOC estable de la cohorte PAC-EPOC (68 ± 9 a, FEV1 52
± 16% ref, FEV1/FVC 54 ± 12%, BMI 28 ± 5 kg/m 2, PCR, 8.2 ± 2
mg/L, X±SD).
Método: Se estudiaron los autoanticuerpos por inmunofluorescencia indirecta y se analizaron sus relaciones con características fenotípicas relevantes de la enfermedad como obstrucción al flujo aéreo,
grado de enfisema, tabaquismo, inflamación sistémica y tratamiento
con corticoides inhalados.
Resultados: Se hallaron títulos patológicos de ANA en el 34%,
de AT en el 25.4%, de ANCA en el 12.5%. Los AT y ANCA presentaron
una asociación significativa con el grado de obstrucción pulmonar y
el grado de enfisema (p<0.05) pero no c on los cuartiles de la PCR. Los
AT estaban aumentados en exfumadores (p<0.05). El tratamiento con
corticoides inhalados no influyó en la frecuencia de distribución de los
autoanticuerpos estudiados.
Conclusión: La prevalencia de autoanticuerpos circulantes positivos está aumentada en la EPOC. Estos resultados aportan nuevas
evidencias a la hipótesis de la patogenia autoinmune de la enfermedad.
Subencionado parcialmente por FIS PI020541, FIS PI052082, SEPAR2003, FUCAP-2003, Marató TV3-2004 y CIBERES.
178.LOCALIZACIÓN DE LAS REGIONES ANTIGÉNICAS DEL
AUTOANTIGENO CB (macroH2A). Ferrer Villahoz B, Delgado
de la Poza JF, Rodríguez-Sánchez J-L, Juárez Rubio C. Hospital
de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona.
En nuestro laboratorio se describió la presencia de anticuer pos
frente al antígeno CB en el suero de pacientes con distintas enfermedades autoinmunes. CB fue caracterizado como una proteína de 40
kDa unida a DNA, cuya expresión varía en distintos tejidos, especialmente en la diferenciación de células linfoides. Estudios realizados
posteriormente han permitido identificar al antígeno como macroH2A,
una proteína unida a DNA con una región N-terminal con un 65% de
homología con la Histona H2A, y una región C terminal, el dominio
macro, altamente conservado en la evolución y que presenta características muy similares a los dominios macro descritos en otras proteínas.
Dado que el autoantígeno CB presenta en su estructura dos regiones c laramente diferentes se decidió abordar la localizac ión de los
epítopos antigénicos de la molécula con el propósito de conocer si
existía una localización preferente de dichos epítopos en alguna de
las dos regiones. Se diseñaron una serie de digestiones de la proteína con reactivos químicos o enzimas que la cortaran en un número
pequeño de fragmentos y para el posterior seguimiento de la antigenicidad se usaron protocolos de inmunoblot. Se escogieron el ácido
iodosobenzóico y la trombina para la digestión, dado que en condiciones controladas rompen por un único sitio, obteniendo sólo dos
fragmentos de macroH2A . Así, al digerir con el ácido iodosobenzoico se obtenía el dominio H2A-like entero mientras que con la trombina se obtenía el dominio macro completo. Sólo cuando se mantenía integro el dominio macro se observaba reactividad con los autoanticuerpos.
En conclusión, el dominio macro de macroH2A presenta determinantes antígenicos reconocidos por los autoanticuerpos antiCB.
115
POSTERS
179.ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS L469F Y R334W, R334Q
DEL GEN CARD15 EN UVEÍTIS IDIOPÁTICA. Rodríguez Pérez
N1, Aguinaga Barrilero A1, Gorroño Echebarría MB2, Pérez Blas
M1, Martín Villa JM1. 1Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid. 2Servicio de Oftalmología, Hospital Universitario "Príncipe de Asturias”.
Introducción. Varios factores genéticos se han implicado en la susceptibilidad a padecer uveítis. Recientemente, mutaciones en el gen
CARD15 se han considerado factores de riesgo en determinadas patologías inflamatorias. En concreto, los polimorfismos R334W, R334Q y
L469F, se han implicado en la susceptibilidad a padecer síndrome de
Blau, patología inflamatoria que cursa con uveítis. No hay datos, sin
embargo, sobre el polimorfismo de esta región en uveítis idiopáticas,
otra patología inflamatoria.
Pacientes y métodos. Se obtuvo muestra de ADN de 110 pacientes con uveítis idiopática y 104 individuos sanos. El polimorfismo L469F
de este gen se analizó mediante ensayo de genotipado. Los polimorfismos R334W y R334Q se estudiaron mediante secuenciación directa en 42 pacientes con uveítis y 38 controles. Se amplificó la región de
interés mediante PCR con los cebadores, y condiciones previamente
publicadas y se secuenció en el servicio de Genómica del C.I.B.
Resultados. Ninguno de los pacientes o controles presentaron los
polimorfismos anteriormente mencionados.
Conclusión. Los polimorfismos del gen CARD15 asociados a susceptibilidad a padecer síndrome de Blau, no parecen, por el momento, serlo en el caso de las uveítis idiopáticas.
180.UTILIDAD CLÍNICA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-MPO
PARA EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE INSUFICIENCIA RENAL AGUDA EN PACIENTES CON ESCLERODERMIA. Franco Maside A1, Cobo Caso MA2, Romera Ruiz MI1,
Barrios del Pino Y1. 1Sección Inmunología Hospital Universitario de
Canarias. 2Servicio Nefrología Hospital Universitario de Canarias.
La esclerodermia es una enfermedad autoinmune multisistémica. Debido a que la lesión patológica subyac ente en esta enfermedad
es de origen vascular, la implicación renal suele manifestarse de forma insidiosa con proteinuria, alteraciones del sedimento y posible
impacto en la tensión arterial de estos pacientes. Sin embargo, se ha
descrito más raramente un fenómeno agudo de insuficiencia renal en
pacientes con afectación sistémica que constituye una urgencia vital.
Esta presentación de crisis renal aguda constituía, hasta el descubrimiento de los IECA, la principal causa de muerte de estos pacientes.
Por otra parte, en los últimos años se ha enfatizado el papel primordial que tiene la determinación precoz de autoanticuerpos asociados al síndrome agudo riñón-pulmón (Ac. anti-membrana basal glomerular (MBG), mieloperoxidasa (MPO), y proteinasa3 (Pr3)) para el
pronóstico de los pacientes. Presentamos el caso de una paciente de
53 años de edad, diagnosticada de Esclerodermia Sistémica desde hace
seis años, que acude al Servicio de Urgencias con deteri oro brusco de
la función renal y tensión arteri al sistólica de 157 mmHg (previamente normotensa). Ingresa con el diagnóstico de crisis r enal esclerodérmica. Sin embargo, la determinación de Autoanticuerpos MPO, PR3
y MBG resulta positiva para Ac. antiMPO, siendo el estudio de IFI en
neutrófilos humanos positivo para P-Anca. Este hallazgo resulta crucial para la indicación de realización de Biopsia Renal cuyo resultado
muestra GMN extracapilar tipo II I (Pauci -Inmune). Se instaura tra-
116
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
tamiento con bolos de metilprednisolona y ciclofosfamida. En la presentación se discute el caso y las alternativas diagnósticas así como la
evolución de la enfermedad en la paciente y en el título de autoanticuerpos.
181.REACTIVIDAD FRENTE A UN GRUPO SELECCIONADO DE
PÉPTIDOS DE LA MIELINA EN PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE REMITENTE –RECURRENTE. Grau-López L1,2,
Naranjo M1, Ramo C2, Raich D1, Pérez-Cabezas B1, Martin R3,
Pujol-Borrell R1, Martínez-Caceres E1, Borras FE1. 1Servicio I nmunología (LIRAD-BST). Hospital Universitario German Trias i Pujol,
Badalona. 2Servicio Neurología. Hospital Universitario German Trias i
Pujol, UAB, Badalona. 3Institute for Neuroi mmunology and Clinical
MS Research. University Medical Center Eppendorf, Hamburg.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune del
SNC caracterizada por la presencia de infiltrados inflamatorios, desmielinización y pérdida axonal. Estudios previos(1) utilizando dosis
muy bajas de antígeno han permitido seleccionar un grupo de epítopos inmunodominantes de la mielina altamente discriminatorios entre
pacientes con EM y controles. Como paso previo a un protocolo de
tolerancia inmunológica antígeno-específica, en este estudio se pretende valorar la reactividad celular in vitro de un grupo de pacientes con EM, frente a la mezcla definida de 7 péptidos inmunodominantes de la mielina, así como la evolución de esta reactividad en el
tiempo.
Material y métodos. Treinte pacientes con EM remitente recurr
ente (RR) sin tratamiento inmunomodulador ni corticoideo en los 3
meses previos a la extracción de la muestra y 10 controles. Ensayos de
proliferación con PBMC de los individuos frente a la mezcla de los péptidos de la mielina: MBP 13-32, MBP 111-129, MBP 146-170, MBP 8399, MOG 1-20, MOG 35-55, PLP 139-154 a concentraciones de 2 y 10
μM de cada péptido. La proliferación de los linfocitos se determinó
mediante incorporación de timidina tritiada. Se consideraron positivas las réplicas ≥ 3SD del control negativo. Se consideraron positivos aquellos individuos con >50% de las réplicas por encima de este
valor. En 16 pacientes, se realizó una segunda proliferación a los 3 meses
de la inicial.
Resultados. Se detectó una reacc ión positiva en 21 de 30 pacientes (75%) fr ente a la mezcla de péptidos, mientras que sólo 2 de 10
(20%) donantes sanos tuvo una reacción similar. La reactividad celular observada fue dosis-dependiente (39% a 2 μM frente 75% a 10 μM).
Aquellos pacientes con reactividad positiva (n=22) presentaban una
mayor discapacidad (EDSS 2.5 vs 1.0), frecuencia de brotes (8±2 vs 4±1)
y un menor tiempo de evolución desde el último brote (9±0.6 vs 14±1
meses). A los 3 meses se mantuvo la reactividad a la mezcla de péptidos en 13 pacientes de los 16 analizados. Un paciente positivizó tras
sufrir un brote de la enfermedad y dos pacientes negativizaron tras
iniciar tratamiento con interferón β. Por tanto: a) Los pacientes
con EM-RR proliferan significativamente frente a la mezcla descrita de
péptidos inmunodominantes de la mielina; b) La reactividad se mantiene en el tiempo pero parece verse modificada tanto por los brotes
como por el tratamiento inmunomodulador. Estos resultados sugieren
que la mezcla definida de péptidos de la mielina es potencialmente
utilizable en protocolos de inducción de tolerancia antígeno-específica.
Bibliografía
1.
Bielekova et al. J Immunol 2004
INMUNOLOGÍA
POSTERS
182.INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE (iNOS) EXPRESSION
IN AUTOIMMUNE THYROID DISORDERS (AITD). Guadalupe Figueroa Vega N1, Majano P1, Larrañaga E1, Bravo JM1, Rodríguez Ramos R2, González Amaro R1, Marazuela Azpiroz M1. 1Hospital Universitario de la Princesa. 2Universidad San Pablo CEU.
Introduction. Nitric oxide (NO) is synthesized by different cell
types through the action of the enzyme nitric oxide synthase (NOS).
There are four isoforms of this enzyme, the neuronal, the endothelial, the mitochondrial, and the inducible (iNOS) forms. Although NO
may have a relevant role in inflammation and tissue damage, its possible role in autoimmune thyroidits has not been properly explored.
Aim. To study the expression of iNOS at protein and mRNA levels
in human autoimmune thyroid disorders ( AITD).
Methods. We evaluated the expression of iNOS in thyroid gland specimens from 10 patients with Graves´ disease (GD), 5 with Hashimoto´s
thyroiditis (HT) and 10 controls by immunohistochemical and RT-PCR.
Results. We found an up-regulated expression of iNOS expression
in both GD and HT thyroid glands at protein and mRNA levels. iNOS
expression was higher in GD compared to HT. In contrast, no iNOS
expression was detected in normal thyroid tissue. iNOS was detected on thyrocytes, mainly in those localized in areas in close proximity
to the inflammatory cell infiltrate. In addition, an up-regulated expression of iNOS was observed in endothelial cells and thyroid-infiltrating
mononuclear cells in both GD and HT.
Conclusions. The enhanced expression of iNOS in autoimmune
thyroiditis suggests that the synthesis of NO may have a relevant role
in the inflammatory phenomenon and tissue damage observed in this
condition.
183.EL FACTOR DE CRECIMIENTO VEGF COMO MARCADOR
DEL TRATAMIENTO CON BEVACIZUMAB EN PACIENTES
CON RETINOPATÍA DIABÉTICA Y DMAE. Lucena Soto JM1,
Sagrario Fustero T2, Ruiz Lapuente C2, Wichmann Schlipf I1, Núñez
Roldán A1. 1Servicio de Inmunología del Hospital Universitario Virgen
del Rocío. Sevilla. 2Servicio de Oftalmología del Hospital Universitario
Virgen del Rocío. Sevilla.
La retinopatía diabética (RT) y la degeneración macular asociada a la
edad (DMAE) son enfermedades oculares que se caracterizan por el desarrollo patológico de neovasos en la retina. VEGF es un factor proangiogénico cuya sobreexpresión en la retina se asocia al desarrollo de ambas patologías. Actualmente, se han desarrollado diversos tratamientos anti-VEGF.
Uno de ellos, bevacizumad, administrado en el vítreo, está siendo utilizado como tratamiento off-label. A pesar de que numerosos estudios han
demostrado su eficacia, no hay un consenso con respecto a la posología.
Con el objetivo de utilizar la concentración intraocular de VEGF
como marcador de la eficacia del tratamiento, hemos realizado un estudio prospectivo en 15 pacientes con RT y 31 con DMAE de la evolución de la agudeza visual (AV) y la concentración en el humor acuoso de VEGF a los 0, 15 y 60 días del tratamiento.
Los resultados fueron los siguientes:
0 días
RD
DMAE
15,03
4,25
AV (logMAR)
15 días
60 días
18,73
7,18
23,07
7,26
0 días
337
101
VEGF (pg/ml)
15 días 60 días
52
11
163
58
A los 60 días, el porcentaje de pacientes que mantenían la concentración de VEGF por debajo de los valores iniciales era del 77 y 71%
para RD y DMAE, respectivamente. Por otro lado, un 73% de pacientes con RD había mejorado la AV tras 60 días post-tratamiento, mientras que en pacientes con DMAE la mejoría abarcaba al 65%.
Estos resultados demuestran que el tratamiento con bevacizumab
mejora significativamente la agudeza visual de los pacientes (p<0,001),
aunque en DMAE, el efecto positivo se ejerce en los primeros 15 días.
Respecto a la posología, la re-inyección de bevacizumab, en aquellos
pacientes donde las concentraciones de VEGF se mantengan bajas, tendría un efecto muy limitado.
184.EXPRESIÓN DE METALOTIONEINAS EN CELULAS FOLICULARES TIROIDEAS EN AUTOINMUNIDAD Y NEOPLASIAS
PRIMARIAS DE TIROIDES: ¿UN MARCADOR DE STRESS
TISULAR? Martínez-Arconada MJ1, Alonso N2, Armengol MP1,
Soldevila B2, Sanmartí A2, Pujol-Borrell R1, Martínez-Caceres E1.
1Servicio Inmunología (LIRAD-BST). 2Servicio Endocrinología y Nutrición. Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona.
La enfermedad autoinmunitaria tiroidea (AITD) es una enfermedad crónica resultado de una respuesta immune mantenida frente a
antígenos del tiroides. Se ha postulado que en la AITD la respuesta
autoimmunitaria se inicia con la generac ión “in situ” de señales moleculares de peligro que a su vez podrían ser responsables de la perpetuación de la respuesta, dando lugar a enfermedad clínica. OBJETIVO:
Analizar la expresión de un grupo de moléculas (TLR-2, TLR-4, HMGB1, metalotioneínas I-II (MTs)) que pudieran actuar como señales moleculares de peligro en glándulas de pacientes con AITD. MATERIAL Y
METODOS: Se analizó un total de 14 glándulas de pacientes con enfermedad de Graves’ Basedow (GB), bocio multinodular (n=12), tiroiditis de Hashimoto (n=2), carcinoma primario tiroides (n=3) y tiroides
control (n=5) por IFI con acMo anti-TLR-2, TLR-4, HMGB1, MT, HLAII, TPO, CD3, CD45, CD20. RESULTADOS: Se ha observado positividad anti MT en 9/14 glándulas de pacientes con GB y 2/3 carcinomas
primarios (negativa en el resto de patologías y en los controles). La
intensidad de expresión de MT en las glándulas de GB fue variable en
las células foliculares tiroideas (TFCs), pero cabe destacar que aquellas TFCs que expresaban MT no expresaban HLA-II y viceversa. En
ningún caso se observó expresión de MT y HLA-II en la misma célula. El patrón de expresión de MT en la enfermedad de GB sugiere que
estas moléculas podrían estar implicadas en la resolución del proceso inflamatorio y protección del tejido tiroideo en la AITD.
185.IMPLICATION OF LIVER X RECEPTORS (LXRs) IN THE
RESOLUTION OF INFLAMMATION AND AUTOIMMUNITY.
Alonso González N1, Beceiro Casas S1, Déniz Fleitas JM1, Ramirez CM1, Gallardo Campos G1, López Blanco F1, Ruiz de Galarreta CM1, Andujar M2, Castrillo Viguera A1. 1Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 2Hospital Materno-Insular. Las Palmas de Gran
Canaria.
The Liver X Receptors (LXRs) are members of the nuclear receptor superfamily of transcription factors that play central roles in the
transcriptional control of lipid metabolism and inflammation. Activation of LXRs promotes the expression of genes involved in cholesterol
homeostasis and inhibits the expression of inflamatory genes. LXR sig-
117
POSTERS
nalling is important for the innate immune response against intracellular bacteria. Thus, the study of LXR function in macrophages is unraveling previously unrecognized links between innate immunity and
lipid metabolism. Chronic inflammation and disregulation of the immune mechanisms are currently underlying many human diseases. Whi
le essential to combat pathogens, macrophage-derived cytokines are
also injurious to normal cells and tissues. If unchecked at the resolution of immune responses, production of cytokines leads to chronic
inflammation and autoimmunity. For example, systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory disease with unknown etiology in which the immune system turns its defenses upon self-elements
such as chromatin. SLE is characterized by lymphocyte expansions,
hypergammaglobulinemia and renal damage. Nephritis is caused by
deposition of DNA-specific autoantibody complexes, activation of the
complement cascade and subsequent infiltration of T cells and macrophages that amplify the local inflammatory response that results in
eventual renal failure. Here we describe that mice lacking LXRs manifest an age-dependent breakdown in self-tolerance and develop autoantibodies and autoimmune glomerulonephritis. W e will also discuss
the potential implications of LXR-dependent pathways in the protection against autoimmune disease and the potential mechanisms involved. Our results demonstrate that LXRs are important players in the
protection against autoimmune disease and suggest that pharmacological activation of LXR could be a therapeutic alternative to ameliorate inflammatory disregulation in autoimmune disease.
186.STUDY OF INTERACTIONS BETWEEN REGULATORY T
LYMPHOCYTES AND TH17 CELLS IN AUTOIMMUNE
THYROID DISORDERS (AITD). Figueroa Vega NG, Benedicto
I, Sánchez Madrid F, González Amaro R, Marazuela M. Hospital
Universitario de la Princesa.
Introduction. Natural regulatory T lymphocytes (nTreg) are cells
specialized in modulating immune responses a key event in limiting
pathological autoimmunity. Several cytokines play a key role on both
Treg differentiation and function. On the contrary, T-helper Th17 cells
are a novel T-cell subset that produce interleukin 17, have a highly
inflammatory role recruiting immune cells to peripheraltissues, and
are probably related to some autoimmune diseases. The cytokine transforming growth factor (TGF)-fÒ has a critical role in the differentiation
of both Treg and Th17 populations. We have recently reported a
dysfunction in Treg cells in patients with autoimmune thyroid disorders ( AITD).
Aim. To study the role of different pro-inflammatory cytokines
(IL-6, IL-15, IL-17, IL-21 and IL-22) on both the regulatory T cell dysfunction and the Th17 differentiation in AITD.
Design. Case-comparative study ex vivo and in vitro of biological specimens from patients with AITD and controls.
Results: We found increased serum levels of proinflammatory
cytokines IL-15 and IL-6 in patients with AITD when were compared
with healthy subjects. Furthermore, we detected an increase in Th17
population in vitro differentiation when stimulated with phorbol myristate acid plus ionomicine, mainly in TH patients. In addition, we observed expression of IL-17 and IL-22 in thyroid biopsiesfrom AITD patients.
Moreover, we detected by PCR, increased RNAm levels of IL-17, IL22, and RORfxt transcription factor in HT and GD patients when compared with healthy subjects. Finally, these Th17 cells were able synthesize pro-inflammatory cytokines (IL-17 and IL-22).
118
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Conclusions. To our knowledge this is the first report where Th17
lymphocytes have been studied in AITD. These cells could have a role
in the chronic inflammatory context and the regulatory T cell dysfunction of AITD.
187.VALORACIÓN DE LA TÉCNICA “ANA AtheNA Multi-Lyte”
PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES. Vlagea F, Alvarez Doforno R, Marcos Gutierrez MJ, Marco
Castro E, Lozano Doncel M, Fontan G. Servicio de Inmunología. Hospital La Paz. Madrid.
Introducción. La detección de anticuerpos antinucleares (ANA)
es fundamental para el diagnostico y/ó clasificación de las enfermedades autoinmunes sistémicas.
Objetivo. 1) Valorar una técnica multiparamétrica “ANA MultiLyte AtheNA” para detectar los anticuerpos antinucleares y compararla con técnicas convencionales. 2) Optimizar su utilización como
técnica de cr ibaje en el laboratorio de autoinmunidad.
Materiales y métodos. Para la detección de ANA se empleó la IFI
sobre portas de triple tejido de rata y células HEp-2 (Euroimmun,
Lübeck). Para determinar la especifi cidad de los anticuerpos se empleó
como técnica múltiparamétrica IMD (INNO-LIA ANA Update, Innogenetics) y para la cuantificación de Ac anti dsDNA el sistema UniCAP (Pharmacia). La tecnología AtheNA detecta ANA e identifica a la
vez nueve autoanticuerpos (SS/A, SS/B, Sm, RNP, Jo-1, Scl-70, dsDNA,
Centrómero, e Histonas). Se ensayaron 600 sueros de pacientes con
diversas patologías y 53 controles.
Resultados. 1) El cribaje de ANA por el Sistema AtheNA revela
una muy alta concordancia con el ensayo IMD en las muestras de
pacientes con patología autoinmune sistémica. Cuando se compara
con la IFI disminuye un poco y a que ésta es menos sensible y a veces,
es difícil interpretar los patrones, sobre todo en los casos de Ac anti
Ro/SSA y Ac anti Jo-1. 2) Resultados discrepantes negativos por Athena aparecen en patologías autoinmunes sistémicas con anticuerpos a
otras especificidades distintas de las nueve ensayadas. 3) Resultados
discrepantes positivos por Athena se observan en algún positivo débil,
en muestras con concentraciones elevadas de IgG y alguna con patología infecciosa. 4) Para la utilización del sistema Athena como técnica de cribaje se deben usar unos protocolos de trabajo específi cos.
Conclusión. El sistema Athena es una técnica muy útil para detectar los ANA y los 9 anticuerpos más comunes presentes en las enfermedades autoinmunes sistémicas, puede ser usada como cribaje en un
laboratorio de autoinmunidad siempre y cuando se utilice con unos
protocolos adecuados.
188.SIGNIFICADO DE Ac ANTI SLA Y Ac ANTI Ro52 EN PACIENTES CON PATOLOGÍA AUTOINMUNE. Alvarez Doforno R,
Alba Domínguez M, Lozano Doncel M, Salcedo Moreno C, Fontan G. Servicio de Inmunología. Hospital La Paz. Madrid.
Introducción. Los autoanticuerpos dirigidos al antígeno Ro52 se
encuentran en una variedad de enfermedades autoinmunes sistémicas, aunque su significado clínico no se conoce. Los Ac anti SLA son
altamente específicos para la hepatitis autoinmune aunque sólo se
detectan en un 10-30% de los pacientes con esa enfermedad. Recientemente se ha descrito una asociación entre Ac anti Ro 52 y Ac anti SLA
con la actividad de la hepatitis autoinmune.
INMUNOLOGÍA
Objetivo. Comprobar la asociación de Ac anti Ro52 y Ac anti SLA
en hepatitis autoinmune. Estudiar la asociación de Ac anti Ro52 con
otros anticuerpos en patologías autoinmunes sistémicas.
Materiales y métodos. Se analizaron la presencia de Ac anti Ro52
y Ac anti SLA en 45 sueros de pacientes con hepatitis autoinmune y
600 pacientes con enfer medades autoinmunes sistémicas. Para la detección de Ac anti Ro52 se utilizó el inmunodot (INNO-LIA ANA Update, Innogenetics) y para Ac anti SLA se empleó el inmunodot perfil
hepático (Liver dot de ALPHADIA). Se recogieron los diagnósticos y
parámetros bioquímicos de los pacientes que presentaban los dos anticuerpos.
Resultados. Hay 11pacientes con hepatitis autoinmune que presentan Ac anti SLA (+) de ellos 7 fueron Ac anti Ro52 (+). De los 600
pacientes con patología autoinmune 77 presentan Ac anti Ro52 (+) y
en 65 se encuentran combinados con otros autoanticuerpos: SLA (4),
Sm (3), RNP (9), Jo-1 (6), Scl70 (3), Ro60 (10), SSB (20), CEN B (16), rRNP
(2), F-Actina (4), M2 (10). Los 4 pacientes que presentan Ac anti Ro 52
y Ac anti SLA presentan disfunción hepática.
Conclusión. Hay una fuerte asociación entre Ac anti Ro52 y los Ac
anti SLA en las hepatopatías autoinmunes. Los Ac anti Ro52 en patologías autoinmunes sistemas se encuentran asociados a otros anticuerpos, en los casos con alteración de transaminasas es conveniente estudiar la presencia de Ac anti SLA descartando patología hepática autoinmune.
189.ESTUDIO PROSPECTIVO DE MARCADORES SEROLÓGICOS DE ACTIVIDAD CLÍNICA EN UNA COHORTE AMPLIA
DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO.
Villegas Zambrano N, Novo MJ, Martínez-Taboada V, Bolívar A,
López-Hoyos M. Servicios de Inmunología y Reumatología. Hospital
Universitario Marques de Valdecilla. Santander.
Introducción. El LES es una enfermedad de curso y pronóstico
variable que puede presentar exacerbaciones y remisiones que precisa de un control clínico estricto, por lo que es importante conocer el
grado de actividad clínica. Para ello, una de las herramientas más utilizadas es la cuantificación de diversos parámetros serológicos como
los anticuerpos anti-DNA nativo (DNAn) y los niveles de C3 y C4.
Objetivo. Determinar la relación entre el índice de actividad clínica (SLEDAI) y los títulos de Acs anti-DNAn junto a los niveles séricos de C3 y C4, de forma prospectiva.
Métodos. El estudio se realizó en 194 pacientes. Para el análisis,
se seleccionaron 98 pacientes con LES (seguidos en la consulta de reumatología) por contarse con los datos clínicos suficientes y un seguimiento mínimo de 5 años. Se recogieron los siguientes parámetros:
SLEDAI (descontando el dato de Acs anti-DNAn y complemento), los
títulos de Acs anti-DNAn, medidos mediante EliATM dsDNA (Phadia), e inmunofluorescencia indirecta sobre C. Luciliae (CLIFT), y niveles séricos de C3 y C4 medidos mediante nefelometría.
Resultados. De los 98 pacientes analizados, solo 30 (30,6%) presentaron alguna correlaci ón positiva significativa con el SLEDAI, siendo el EliATM dsDNA en 7 (7,2%; p< 0.05), con CLI FT en 9 (9.18%).
Respecto al complemento, se encontró correlación negativa en 11 (11.2%)
con C3 y 12 (12,3%) con C4, sin haber relación de estos datos con el
tiempo de evolución del LES. Por otraparte cabe destacar que la mayoria de los pacientes presentan disminución de los Acs anti-DNAn antes
del brote de actividad, reflejado por el aumento del SLEDAI, aunque
no es estadísticamentesignificativo.
POSTERS
Conclusión. Los datos reflejan la experiencia de único centro durante más de 8 años de recogida de los datos clínicos y serológicos de forma prospectiva. Según ello, ninguno de los marcadores serológicos,
clásicamente asignados como marcadores de actividad clínica, se les
puede conferir una relevancia clínica por sí mismos. Por consiguiente, su utilidad vendrá dada por la situación individual de cada paciente.
190.PORCENTAJES ELEVADOS DE CELULAS CD8+DR+ SE ASOCIAN A COMPLICACIÓN CLINICA EN MUJERES CON SINDROME ANTIFOSFOLIPIDO (SAAF) OBSTETRICO. Carbone
J1, Gallego A1, Lanio N1, Sarmiento E1, Aguaron A2, Orera M3, Fernandez-Cruz E1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio de Obstetricia.
3Unidad de Genética. Hospital Gregorio Marañón. Madrid.
Introducción. Las pacientes con SAAF obstétrico pueden sufrir
distintas complicaciones clínicas además de la morbilidad obstétrica,
sin que dispongamos en la actualidad de marcadores que indentifiquen el riesgo de desarrollarlas. Su conocimiento permitiría programar más finamente medidas profilácticas y terapéuticas.
Objetivo. Establecer si existe asociación entre alteraciones de subpoblaciones linfocitari as T, B o NK, que se observan en el SAAF obstétrico, y la presencia de complicaci ones clínicas (isquemia/trombosis, crisis convulsivas, preclampsia/abruptio placentae).
Métodos. Estudio transversal: 36 mujeres con SAAF obstétrico, 36
con aborto rec urrente sin AAF, 36 sanas con hijos y sin abortos y 36
sanas sin antecedente de gestación. Edad similar en todos los grupos. Subpoblaciones linfocitarias estudiadas en sangre total, mediante citometría de flujo de tres colores. Distintas combinaciones de ac.
monoclonales anti: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45RA, CCR7, CD38,
HLA-DR, CD19, CD27, IgD, CD5, CD40, CD16 y CD56. Estudio realizado sin actividad reciente de las complicaciones. 13 pacientes tuvieron algunas de las complicaciones.
Resultados. En relación con distintos grupos control, las mujeres
con SAAF tenían: >% de células T activadas (CD4+DR+, CD8+DR+);
>% de células B-naive (CD19+CD27-IgD+) y <% de células NK (CD3CD56+CD16+). Se demostró asociación significativa entre porcentajes
>40% de células CD8+DR+ y el antecedente de trombosis (Prueba de
Fisher, p=0.014); y con la presencia de cualquiera de las complicaciones descr itas (p=0.016). Niveles elevados de células CD8+DR+ se asociaron a ri esgo de trombosis (RH 10.2, IC95% 1.16-90.91; p= 0.03) i ndependientemente de la presencia de títulos más altos de ACA.
Conclusiones. El estudio de marcadores de activación de celúlas
T CD8+ podría ser útil para identific ar el riesgo de complicaciones en
mujeres con SAAF obstétrico. Se ha iniciado un estudio prospectivo
de las pacientes para establecer el impacto de las alteraciones inmunofenotípicas en el curso clínico del SAAF.
191.ESTUDIO DEL PERFIL CELULAR PRESENTE EN LÍQUIDO
CEFALORRAQUÍDEO DE LOS DISTINTOS SUBTIPOS DE
ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Espiño Martínez M, Álvarez Cermeño JC, González Porqué P, Sádaba Argaiz MC, Gómez Rial J, Roldán Santiago E, Villar Guimerans LM. Hospital Ramón y Cajal.
Madrid.
Introducción. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central. Se ha demostrado recien-
119
POSTERS
temente que los linfocitos B y los anticuerpos juegan un papel importante en la patogenia de esta enfermedad. El 96% de los pacientes
con EM presenta síntesis intratecal de IgG (SIG) y el 40% además síntesis intratecal de IgM (SIM). La presencia de esta última constituye
un marcador de mal pronóstico en los pacientes con esclerosis múltiple remitente recidivante (EM-RR).
Objetivo. Estudiar los perfiles linfocitarios presentes en el líquido cefalorraquídeo de una serie de 187 pacientes con esclerosis múltiple divididos según la presencia o no de SIM y según la forma evolutiva de la enfermedad.
Metodología. Muestras: Las muestras de LCR de pacientes con
EM se centrifugaron a 1800 rpm durante 15 minutos inmediatamente
después de ser extraídas. El sobrenadante (LCR) se utilizó para la detección de bandas oligoclonales de IgG (BOCG) e IgM (BOCM) mediante isoelectroenfoque e inmunoblotting. El pellet celular se utilizó para
el análisis de las poblaciones celulares. Se marcó con anticuerpos frente a los siguientes marcadores: CD45, CD4, CD8, CD38, CD19, CD5. El
análisis de las células se hizo mediante citometría de flujo en un citómetro FACSCanto (Becton Dickinson).
Resultados. Los pacientes con EM-RR con BOCM tienen un aumento significativo de linfocitos B CD5+ y linfocitos B activados CD38+ así
como de linfocitos T CD4+ con respecto a los pacientes con EM-RR que
no presentan BOCM y los pacientes con EM primaria progresiva (EMPP). Los pacientes con EMRR presentan un aumento significativo de
linfocitos B CD5- con respecto a los PP. Los pacientes con EM-PP presentan un aumento significativo de linfocitos CD8+ con respecto a los
pacientes con EM-RR.
Conclusiones. El estudio de LCR puede contribuir a conocer los
mecanismos fisiopatológicos predominantes en los distintos tipos de
EM y ayudar a la identificación de los mismos.
192.CINÉTICA DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS Y NIVELES
SÉRICOS DE HORMONAS SEXUALES DURANTE LA GESTACIÓN Y POSTPARTO EN EMBARAZADAS SANAS Y CON
ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Teijeiro Martorell R, de Andres C, Sánchez-Ramon S, Aristimuño C, Rodríguez-Mahou M, López-Nazareno N, Fernández-Cruz E, Martínez-Gines ML. HGU Gregorio
Marañón. Madrid.
Introducción. Los mecanismos celulares inmunológicos por los
que disminuye la actividad de la esclerosis múltiple (EM) durante la
gestación son poco conocidos. Las células dendríticas (CDs) desempeñan un papel central en la inducción y regulación de las respuestas
inmunológicas. Es conoc ido que las hormonas sexuales son inmunomoduladores.
Objetivos. Analizar durante los 3 trimestres del embarazo
(T1,T2,T3) y en el posparto (PP) la proporción de las subpoblaciones
de CDs en 20 embarazadas sanas (ES) y en 30 con EM.
120
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Métodos. Se analizaron mediante citometría de flujo las CDs mieloides (mCDs, BDCA1+CD19- y Lin-CD11+) y plasmacitoides (pDCs,
BDCA2 y Lin-CD11-) y los niveles séricos de hormonas sexuales (estradiol, progesterona y testosterona).
Resultados. En ES observamos un aumento de mCDs CD11+ (de
0,77±0,31 en T1 a 1,43±0,61 en T2 p=0,04), disminuyendo a 0,72±0,17
en PP. Las pDCs BDCA2 disminuyeron (0,39±0,24 in T1a 0,20±0,17 en
T3, p=0,005) y persisten bajas en PP (0,20±0,04). En EM, ambas mCDs
aumentaron durante el embarazo, más las BDCA-1 (0,27±0,15 en T1
a 0,45±0,67 en T3) y se mantuvieron elevadas en PP (0.44±0.42.). Las
pCDs CD11c- disminuyeron (0, 47±0,15 en T1 a 0,36±0,13 en T3, p=0,05)
y suben no significativamente en PP (0,43±0,23). En el PP, las ES tienen
las pCDs más bajas que las EM (p=0,007). En ambas, las hormonas
aumentaron significativamente durante el embarazo y descendieron
en el PP.
Conclusión. La gestación es un modelo único de tolerancia inmunológica fisiológica, que afecta beneficiosamente a la EM. La distintas
subpoblaciones de CDs presentan patrones diferenciales en el embarazo normal y en el contexto de embarazo en la EM, que sugieren efectos inmunorreguladores específicos.
193.AUTOANTICUERPOS ANTI-PCNUA? UN NUEVO PATRÓN
DE FLUORESCENCIA EN HEP-2 RELACIONADO CON EL
CICLO CELULAR. Ontañón Rodríguez J1, Rada Martínez R1, Sáez
Méndez L2. 1Servicio de Análisis Clínicos. 2Servicio de Medicina Interna. Complejo Hospitalario de Albacete.
El objetivo de esta comunicación es hacer público el hallazgo de
un patrón de fluorescencia del que no hemos encontrado ninguna referencia bibliográfica para su discusión entre los asistentes al congreso.
Metodología. Técnica de cribado de ANAs mediante inmunofluorescencia i ndirecta sobre portas con células HEp-2. Título inicial 1/40.
Diluci ones seriadas a 1/2 hasta 1/640, en la fotografía adjunta 1/320.
Descripción. El patrón de fluorescencia encontrado consiste en la
tinción irregular de las células, afectando aparentemente a un antígeno de expresión variable en función del ciclo celular (no se tiñen el 2030% de las células) y cuya localización es también variable dando lugar
a imágenes de células que, en la interfase, muestran patrones intermedios entre el centromérico, el moteado y el nucleolar sin tinción de
nucleoplasma. Las células en metafase no se tiñen a diferencia de lo
que sucede en los centroméricos. Asociación con enfermedad: la muestra analizada corresponde a un paciente varón, de 71 años de edad,
que acude a consulta externa por “pérdida de memoria”. Historia de
artralgias y artrosis.
Vida activa, normal. MMSE 30 puntos
Hipótesis. Podía tratarse de un antígeno de expresión variable
implicado en la asociación centrómero-nucleolo que se da durante el
ciclo celular.
Indice de autores
A
Abad C, 17
Abadía Molina AC, 45, 67, 85, 105, 108
Abarrategui C, 81
Abd-El-Fatah-Khalil S, 19, 63, 64
Abos Gracia B, 43
Acero A, 25 , 84
Acevedo Calado MJ, 23, 25
Aguado E, 107
Aguaron A, 119
Aguilar Reina J, 41, 98, 99
Aguilera García I, 23, 25, 69
Aguinaga Barrilero A, 116
Agust A, 115
Agustí M, 78
Alamillo C, 23
Alba Domínguez M, 118
Alba E, 61, 69
Albarrán F, 59
Alcalá Peña MI, 28, 73
Alcaraz MJ, 86
Alcoceba M, 71
Alegre Aguarón E, 108
Alegre Aguarón E, 68
Alemany JM, 20
Alemany JM, 79
Alés Díaz I, 39
Alfaro Sánchez D, 48
Alfonso Pérez M, 34
Algarra I, 73, 74
Algarra I, 95
Algora M, 64
Allende L, 33
Allende Martínez LM, 30, 76
Almanza H, 97
Almeida Parra J, 45, 47
Alonso A, 102
Alonso Árias R, 60
Alonso Blanco C, 71
Alonso C, 36
Alonso Chamorro L, 35
Alonso Colmenar LM, 92
Alonso González N, 117
Alonso MM, 81
Alonso Moreno F, 40, 110
Alonso N, 117
Alonso Ortiz A, 39
Alonso Sardon M, 62
Alonso-Árias R, 20
Alorda J, 79
Alperi M, 58
Alvarez A, 32, 72, 75, 76
Álvarez Cermeño JC, 119
Alvarez Doforno R, 24, 33, 118
Alvarez Domínguez C, 40, 99
Álvarez E, 74
Alvarez L, 24
Álvarez López MR, 70, 82
Álvarez Márquez A, 23, 25, 41
Álvarez MR, 86
Álvarez Vega B, 40, 110
Álvarez-Cermeño JC, 48
Álvarez-López MR, 20, 79, 83
Álvarez-Mon M, 18, 59, 60
Álvarez-Vallina L, 27, 38
Alves H, 68
Ambrosi A, 102, 112
Ampudia RM, 52
Amunárriz C, 42, 65
Andrade RJ, 73
Andres Martin A, 24
Andujar M, 117
Anel Bernal A, 108
Angulo A, 102
Angus B, 82
Antó JM, 115
Anton Gutiérrez IM, 106
Antón M, 107
Aramburu J, 40
Arbos A, 88
Arbós Magrinyá A, 93
Arias CF, 72
Arias M, 23
Arina A, 25, 26
Aristimuño C, 120
Armengol Barnils MP, 49, 50
Armengol MP, 117
Arnaiz-Villena A, 19, 63, 64, 85
Arostegui JI, 32
Arrieta A, 84
Arrieta Gutierrez A, 61
Arroyo JL, 42, 65
Arroyo M, 94
Arroyo R, 49
Asin Pardo L, 104
Ausín F, 42, 65, 101
Ausin Ortega F, 66, 101
Auxiliadora Bajo M, 44
Azpilicueta A, 26
B
Badell I, 31, 76, 78
Baeza A, 25
Balado P, 25, 84
Balanzat Muñoz J, 93
Balanzategui A, 47, 71
Balas Pérez A, 19, 21, 28
Balderramo D, 23
Ballester S, 111
Ballesteros Andres M, 92
Ballina J, 58
Balsa Criado A, 17
Bañón-Rodríguez I, 106
Baquero Mejía I, 101
Barber DF, 72
Barbolla L, 63, 64
Bárcena J, 97, 100
Bárcena P, 47
Bargay J, 88
Barrenechea C, 34
Barrios del Pino Y, 116
Beceiro Casas S, 117
Bello R, 46, 109
Bellón Heredia T, 36, 44
Belver Miguel L, 35
Benaiges-Martínez C, 76, 78
Benavides Orgaz M, 39
Benedicto I, 118
Benito A, 23
Benito Almazan MJ, 23, 98
Berga Bolaños R, 48
Berga R, 40
Bernal MJ, 34, 72, 85
Bernal-Ramos A, 83
Bernardo González I, 62, 67, 96
Bernardo I, 67
Bernardo MV, 86
Bernardos A, N69
Berruguilla Pérez E, 39, 73, 74, 95
Bertranpetit J, 30
Bilbao A, 84
Blanco FJ, 18
Blanco García RM, 70
Blanco Gelaz MA, 21
Blanco Muñoz O, 85
Blanco O, 45, 67, 105, 108, 110
Blasco-Olaetxea E, 90
Bofill M, 112
Bohorquez JC, 88
Bolívar A, 119
Bonet Roselló L,107
Borrás FE, 52, 116
Borràs Serres FE, 105
Borraz Y, 73
Borrega P, 37
Borro Mate JM, 71
Bosch L, 22, 97
Botella Martínez C, 20, 70, 79, 83
Bravo B, 111
Bravo JM, 117
Bravo Romero MJ, 39, 102
Bravo-Mendoza C, 21
Brckalo T, 43
Brieva JA, 16, 34, 72, 85, 88, 89
Bruijns S CM, 44
Brun A, 101
Buelta L, 38, 51
Bustamante L, 19, 21, 28
Busto E, 33, 110, 113
Buxadé M, 40
C
Caballero González A, 39, 102
Cabello V, 25
Cabezón Sánchez A, 17
Cabrera T, 26
Cacheiro C, 112
Cacho Gutierrez J, 19
Cacho J, 63
Calle Y, 106
Calleja Antolín S, 30, 60, 67
Callejas Rubio JL, 51
Calonge M, 111
Calvo Benito FJ, 93
Calvo J, 88
Calvo Pinilla E, 100
Camacho F, 26
Camarero C, 15, 78
Cambra A, 82
Campanario F, 94
Campillo Marquina JA, 20, 79, 82, 83
Campos E, 65
Campos-Caro A, 37, 89
Cantero S, 69
Cantó E, 74
121
INDICE DE AUTORES
Cantón J, 92
Cañete JD, 18
Capilla A, 61
Caragol I, 29, 32, 76
Carbone Campoverde J, 70, 81
Carbone J, 25, 53, 82, 84, 119
Cárdaba B, 29, 80
Cardero Gonzalez E, 90
Carillo J, 47
Caro Oleas JL, 23, 25, 72, 98
Carranza Domínguez D, 33, 107
Carrascal J, 52
Carrasco Hidalgo A, 66
Carrasco JA, 57
Carrasco Marin E, 40, 99
Carretero R, 26, 92
Carrillo J, 52
Casado A, 57
Casado JF, 26
Casado JG, 36
Casanova J-L, 32
Casares C, 74, 95
Cassatela MA, 43
Castañer Alabau JL, 24
Castaño J, 36
Castell M, 58
Castellote C, 58
Castiella T, 68
Castillo Rama M, 62, 67, 96
Castrillo Viguera A, 117
Castro Beiras A, 71
Castro Henriques A, 68
Castro MJ, 44, 60, 67
Castro P, 95
Castro Panete MJ, 67
Cedenilla Horcajuelo M, 43
Cejalvo Goyanes T, 48
Cénit MC, 49
Cervera C, 23
Cervera I, 64
Chacártegui M, 29, 80
Chamorro Pérez S, 40, 44
Chapgier A, 32
Chara L, 18, 59, 60
Cheng T-Y, 113
Chevarría J, 18, 59, 60
Chicano A, 103
Chillón MC, 71
Chong Espino Y, 19
Chou H-C, 106
Chow I-T, 37
Cianchetta Sivori M, 96
Cillero L, 94
Cladera A, 88
Clemente J, 76
Clemente X, 52
Closa D, 56
Clotet B, 112
Cobo Caso MA, 116
Cobo Ibáñez T, 17
Cobo M
Cobos Dols M, 33, 39
Coll Martí J, 28, 73, 94
Collado A, 73, 74, 95
Collantes Estevez E, 57
122
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Colobran Oriol R, 49, 50
Colombetti S, 26
Comabella M, 49, 108
Compte Grau, 27
Corbillo Colom C, 93
Cordero OJ, 89
Córdoba L, 97, 100
Corell A, 111
Corral R, 71
Corral-San Miguel R, 74
Correro F, 16
Cortes JR, 37, 51
Cortezón SA, 76
Costa C, 22
Costo R, 72
Coto E, 30
Cózar JM, 39, 92
Crawford M, 19
Crespo A, 33
Crespo E, 73
Crespo Leiro M, 71
Crisci E, 42, 97, 98, 100
Cruz García M, 77
Cuende E, 59, 60
Cuesta Martínez A, 27
Cuesta Mateos C, 34
D
Dai Z, 37
Dávila B, 99
de Andrés A, 15, 78
de Andres C, 120
de Dios Colmenero J, 102
de Garcillan Goyoaga B, 92
de Gracia J, 32, 76
de Haro J, 112
de la Calle H, 114
de la Calle Martín O, 30, 31, 76, 78
de la Concha EG, 49, 114
de la Escosura A, 102, 112
de la Fuente H, 110
de la Mata C, 67, 85, 108, 110
de la Rosa O, 36
de la Torre Bravos M, 71
de Lamata Espinosa C, 45, 105
de las Fuentes BD, 72
de las Heras B, 97, 115
de las Heras V, 49
de Pablos P, 76
de Paula Sanchez Gordo F, 66
de Paz B, 52, 58
Deishenhammer F, 49
del Álamo C, 29, 75, 80
del Campo Alonso AB, 91
del Cerro Vadillo E, 40, 99
del Giudice G, 41
del Peso G, 44
del Pozo N, 30
del Pozo V, 29, 30, 75
del Puerto Morales M, 72
del Val M, 43, 97
Delgado Cerviño E, 33
Delgado de la Poza JF, 115
Delgado J, 80
Delgado-Pérez L, 37
Dema B, 49
Dema Jiménez B, 55
Déniz Fleitas JM, 117
Desportes Bielsa P, 68, 108
Detkova D, 32, 76
Diaz Alderete A, 86
Díaz B, 102, 112
Díaz D, 18, 59, 60
Diaz I, 98
Diaz MC, 24
Díaz Peña R, 21
Díaz San Segundo F, 97
Díaz-Freitas B, 44
Díaz-Peña R, 20
Díaz-Rubio M, 16, 55
Diaz-Viciedo R, 115
Diebold S 106
Diebold Y, 111
Diéguez MA, 81
Domenech García N, 71
Domínguez A, 32
Domínguez J, 40, 42, 110
Domínguez MA, 31
Domínguez O, 110
Donat E, 61
Dongo MN, 106
Dubrot J, 25
E
Escalera A, 17
Escobar D, 32, 33, 79, 80, 82, 83
Esiri M, 48
España A, 78
Español Boren T, 28, 75
Español T, 32, 34, 76, 81
Espejo C, 49
Espino L, 114
Espiño Martínez M, 48, 119
Esteller M, 56
Estevez Cid F, 71
Evora N, 90
Ezquerra Martínez A, 40, 110
F
Faner Canet MR, 47, 65
Faro J, 44, 102, 112
Farrero E, 115
Feito MJ, 109
Fenutría Aumesquet R, 107
Ferández-Rey M, 50
Fernandes R, 44
Fernándes-Arquero M, 17
Fernández Fresnedo G, 23
Fernández Gutiérrez B, 17
Fernández J, 25
Fernandez M, 63
Fernández MA, 105
Fernández O, 17
Fernández P, 76
Fernández Prieto L, 40, 99
Fernández Rey M, 51
Fernández S, 47
Fernández-Arquero M, 16, 30, 55, 56, 77, 114
Fernández-Cruz E, 52, 53, 70, 81, 84, 86, 92, 103, 119,
120
INMUNOLOGÍA
Fernández-Guerrero M, 96
Fernández-Gutiérrez B, 17, 56
Fernández-Llamazares J, 100
Fernández-Malavé E, 113
Fernández-Martínez I, 111
Fernández-Nieto MM, 75
Fernández-Rey M, 41
Fernandez-Valle C, 34
Fernández-Yañez J, 70, 84
Fernéndez-Reyes M, 93
Ferrando AA, 46
Ferre S, 64
Ferreira A, 30, 77, 83
Ferrer J, 32, 79, 80
Ferrer Villahoz B, 115
Ferri A, 19, 63, 64
Fieschi C, 32
Figueras C, 75
Figueredo MA, 55, 56, 114
Figueroa Vega NG, 118
Flores E, 82
Florido F, 80
Florido Y, 32
Fogal V, 38
Fontán Casariego G, 31, 33
Fontan G, 24, 30, 31, 77, 83, 118
Fraile L, 97, 98, 100
Franch A, 58
Franco Maside A, 116
Fresno Escudero M, 99
Frías Casas M, 79
Frias I, 90
Frías M, 77
Fuentes D, 60
Fuentes M, 94
Fuster F, 23
G
Gallardo Campos G, 117
Gallardo Galera JM, 65
Gallego A, 119
Gallego López A, 70, 81
Gambón-Deza F, 20, 64
Gámez Gámez C, 29, 30, 75
Gamoneda E, 60
Garces P, 29
García Alonso AM, 70, 82
García Alvarez F, 68
García de Burgos M, 93
García Delgado R, 96
García JM, 84
García Jurado G, 77, 79
García Laorden MI, 32
García Lora AM, 39, 74, 95
García Lozano JR, 41
García M, 88
García MC, 83
García Montero AC, 47
García Olivares E, 85, 108, 110
García Pérez A
García Pérez A, 35, 110
García Peydró M, 46
García Ruano AB, 91
García Sánchez E, 90, 99
García T, 72
INDICE DE AUTORES
García Trujillo JA, 73
García Veguillas A, 35
Garcia-Alonso A, 79, 83
García-Alvarez F, 108
García-Aymerich J, 115
García-Calatayud MC, 83
García-Ceca J, 48
García-Cozar F, 107
García-Están J, 83
García-Gascó P, 98
García-Laorden I, 32
García-López Asenjo JA, 94
García-Lora AM, 73, 95
García-Lozano JR, 17, 98, 99
García-Merino A, 87
García-Penarrubia P, 74, 103, 106
García-Peydró M, 111
García-Rodríguez MC, 30, 83
García-Samaniego J, 42, 98
García-Sánchez F, 19, 21, 28
García-Sanz R, 71
Garcia-Tamayo J, 90
García-Vallejo JJ, 44
Garet ME, 112
Garrido Bravo I, 70
Garrido C, 39, 73, 74, 95
Garrido F, 26, 73, 92, 95
Garrido P, 47
Garrido S, 31, 77
Garrido Torres-Puchol F, 39, 74, 91, 95
Gavilán F, 69
Gayà Puig A, 88, 93
Gayoso I, 36, 86, 87
Gea J, 115
Gentil MA, 25
Gil Herrera J, 86, 92
Gil J, 52
Gimeno L, 86
Gimeno M, 98
Giron JA, 34
Giron N, 97, 115
Gisel del Pozo Rodríguez N, 77
Godino J, 104
Gómez de la Concha E, 16, 17, 30, 55, 56, 77
Gómez del Moral M, 43
Gómez F, 115
Gómez I, 61, 69
Gómez J, 52
Gomez Lopez MT, 40, 99
Gómez Perales JL, 89
Gómez Rial J, 119
Gomez S, 55 , 111
Gómez-Casado E, 97, 100
Gómez-Lozano N, 36
Gómez-Rial J, 94
Góngora Fernández R, 35
González Amaro R, 117, 118
González C, 78
González Carreño T, 72
González Escribano MF, 25, 41, 72
González Fernández R, 57, 65, 77, 79
González García C, 111
González García S, 46
González Granja A, 90, 99
González J, 50
Gonzalez M, 71
Gonzalez Porqué P, 90, 119
González Rodríguez S, 37
González-Escribano MF, 17, 98, 99
González-Fernández A, 44, 102, 112
González-Garcia I, 89
González-Porqué P, 48, 94
Gonzalez-Quevedo N, 32
González-Santesteban C, 31, 76
Gonzalo Ocejo-Vinyals J, 15, 42, 65, 101
Gorgolas-Hernández de Mora M, 96
Gorroño Echebarría MB, 116
Goya G, 104
Goyenechea A, 96
Gozalbo López B, 43
Granell R, 61 69
Grau-López L, 116
Graus F, 38
Grille Cancela Z, 71
Grimbacher B, 29
Groh V, 37
Guadalupe Figueroa Vega N, 117
Guarinos RF, 106
Gure AO, 38
Gutierrez C, 52, 58, 104
Gutierrez EI, 15
Gutiérrez San José E, 111
Gutierrez-Solar B, 64, 104
Guzmán Fulgencio M, 62, 96
Guzman-Bistoni C, 90
H
Harris C, 31
Head J, 64, 104
Heras M, 93
Hermenegildo IN, 94
Hernandez A, 93
Hernández Campo PM, 45
Hernandez Cerceño MI, 63
Hernández González M, 76
Hernández J, 93, 111
Hernández M, 29, 32
Hernández MV, 18
Hernández S, 94
Hernández-Caselles T, 74, 103, 106
Hernández-Cillero L, 91
Hernández-López C, 109
Hernández-López J, 32
Herraiz MA, 104
Herrero MJ, 95
Hervás-Stubbs S, 25, 26
Hevia E, 101
Hidalgo Lumbreras L, 109
Hortelano Blanco S, 97
Hortelano S, 115
Houston L, 47
I
Ibarra R, 104
Ibón Rallón N, 42
Iglesias J, 80, 83
Iglesias M, 3, 50, 51
Imbernón M, 89
Infantes S, 43
Iñiguez MA, 112
123
INDICE DE AUTORES
J
Jaen J, 66
James E, 47
Janda J, 26
Jara P, 24
Jarque D, 61, 69
Jiménez Cobaleda MJ, 93
Jiménez Gómez G, 89
Jimenez Gómez J, 57
Jiménez M, 43
Jiménez P, 39
Jiménez Pérez E, 48
Jiménez-Gómez G, 89
Juan M, 47
Johnstone C, 97
Jones GE, 106
Joven B, 60
Jover JA, 17
Juan M, 47, 65
Juarez C, 74
Juárez Rubio C, 115
Juliá A, 34
Julià Arteaga E, 108
Julià MR, 33, 115
K
Kaiser BK, 37
Kalaydjieva L, 30
Ki Ndelán Jaquotot KM, 77
Kwok WW, 47
L
Laban S, 44
Labarga P, 42, 98
Lage Gallé E, 23
Laguarda E, 69
Lahoz C, 29, 30, 80
Lamana Domínguez A, 46
Lamas R, 33
Lanio Amador N, 70, 81
Lanio N, 82, 119
Larrad Mur L, 68, 108
Larrañaga E, 117
Larrauri J, 24
Lavado Valenzuela R, 39 , 102
Lavín-Alconero L, 65, 101
Leal M, 79
Lécrevisse Q, 45
Lefranc G, 33
Legaz Pérez I, 70
Leno E, 45, 67, 85, 105, 108, 110
Leon Arroyo A, 55, 62
León MJ, 18, 59
Leon Moya V, 19, 55, 62, 63
Lévy F, 26
Leyva-Cobián F, 15, 42, 65, 66, 101
Linares Dickler I, 39, 73, 74, 95
Líz Marzán L, 44
Lizana A, 103
LLanes E, 80
Lombardía L, 110
López Alvárez MR, 70, 82
López Blanco F, 117
López Botet M, 83
López Carrascosa A, 99
124
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
López Cernada ME, 29
López D, 43, 97
López E, 30, 75
López García C, 49
López Giral S, 34
López Hoyos M, 23
López Larrea C, 21, 60
López Lera A, 31
López M, 20, 42, 79, 98
López Mejías R, 30
López P, 52, 58, 104
López R, 77, 97
López Trascasa M, 31
López Vázquez A, 21, 60
López-Botet M, 43, 102
López-García A, 111
López-Hernández R, 20, 83
López-Hoyos M, 15, 119
López-Larrea C, 20, 21
López-Lera A, 77
López-Nazareno N, 120
López-Nevot MA, 17
López-Rodríguez C, 40
Lopez-Solbes R, 83
López-Trascasa M, 77
López-Vázquez A, 20
Lorente E, 43
Lorenzo G, 101
Loza-Santamaría E, 56
Lozano Doncel M, 118
Lozano F, 18, 23
Lozano Reina JM, 77, 79
Lozano Soto, 107
Lucas Aroca D, 70, 83
Lucas D, 20
Lucas Martín AM, 50
Lucena MI, 73
Lucena Soto JM, 117
Lucendo B, 44
Luengo O, 30
Luque I, 61, 84
Luque Moruno J, 77, 79
Lutz H, 31
M
Madrazo Toca F, 40, 99
Magadán Mompó S, 20, 64
Magadán S, 44
Magri G, 102
Majado MJ, 86
Majano P, 117
Maleno I, 26, 95
Maluenda C, 49, 55
Mancebo Sierra E, 30, 62, 76, 96
Mann HH, 37
Manzanares Martín B, 57, 65
Mañes S, 72
Máñez R, 22
Marazuela Azpiroz M, 117, 118
Marco Castro E, 118
Marcos Campos I, 104
Marcos Gutierrez MJ, 118
Maricarmen Ruiz-Ruiz M, 110
Marie Christensen E, 66
Marín Alberca MG, 56, 57
Marin Crespo N, 24
Marín Gallén S, 52
Marín N, 15, 78
Marin Rubio LA, 71
Márquez Ortiz AM, 16, 55
Martín F, 33
Martin Folgar R, 101
Martin Gayo E, 45, 46
Martín Ibáñez J, 17
Martín J, 17, 98
Martín JL, 81
Martín Martín L, 45
Martín Martín N, 35
Martin Nalda A, 75
Martin R, 116
Martín Villa JM, 116
Martín-Cófreces NB, 46
Martín-Orozco E, 103, 106
Martinez A, 114
Martínez A, 17, 49
Martínez Ara J, 31
Martínez Cabeza V, 44
Martínez Cáceres E, 49, 50
Martínez de la Riva S, 40
Martínez de Saavedra M, 72, 85
Martínez Doncel A, 16, 55
Martínez L, 78
Martinez Laso J, 64, 104
Martínez Lorenzo MJ, 68 , 108
Martinez Lostao L, 108
Martínez N, 79
Martínez Naves E, 43
Martínez Osorio H, 111
Martínez Pomar N, 83, 85
Martínez Sánchez F, 57
Martinez Sánchez MV, 70, 82
Martínez VG, 109
Martínez Viñambres E, 28, 73
Martínez-Arconada MJ, 100, 117
Martínez-Caceres E, 100, 116, 117
Martínez-Doncel A, 17, 55, 56
Martínez-Esparza M, 74, 103, 106
Martínez-García P, 83
Martínez-Gines ML, 120
Martínez-Martínez A, 91
Martínez-Martínez L, 31, 76
Martínez-Pomar N, 32, 33, 82
Martínez-Taboada V, 119
Martínez-Viñambres E, 94
Maruri Machado N, 61
Maruri N, 84
Mascaro M, 88
Massó JM, 115
Matamoros N, 32, 33 34, 79, 80, 82, 83, 85
Mateo I, 60
Mateu E, 98
Matías JA, 60
Mazuecos A, 72
Medina F, 89
Meenagh A, 36, 85
Mejías Laguna R, 72
Melero I, 25, 26
Melero JA, 97
Melgosa M, 33
Melón S, 81
INMUNOLOGÍA
Mena de la Cruz R, 31, 77
Mena I, 97, 100
Mendes C, 68
Méndez J, 44
Mendez Valdes R, 91
Mendoza JL, 16, 55
Meneu-Diaz JC, 67
Mérida E, 67
Merino J, 38 , 41, 50, 51
Merino R, 38, 41, 50, 51
Merkoçi A, 102, 112
Middleton D, 36 85
Milà J, 82
Millan P, 19, 63, 63, 64
Minguela A, 20, 70
Minguela Puras A, 82, 83
Minguillón J, 40
Miñones L, 81
Miranda A, 80
Miras M, 70
Mirete Bachiller S, 24
Mirete S, 15 78
Mittelbrunn M, 110
Modrego J, 103
Modrego Ruiz J, 86, 92
Moga E, 74
Molina IJ, 33, 34
Molina J, 90
Mollá R, 30
Moltó L, 94
Mondejar P, 79
Monserrat J, 18, 59, 60
Monsó E, 115
Montalban X, 49, 108
Montes Cano MA, 98, 99
Montilla C, 55
Montoro J, 61, 69
Montoya M, 42, 97, 98, 100
Moody DB, 113
Morales J, 110
Morales Camino JC, 26, 107
Morales Cerdán JM, 67
Morales P, 67
Morales Pérez P, 62, 96
Morandeira F, 95
Morel Bárcena E, 36
Moreno A, 23, 98
Moreno E, 64
Moreno Elola-Olaso A, 67
Moreno J, 94
Moreno Pelayo MA, 30, 33
Moreno Rivera S, 110
Moscardó F, 69
Moscoso Galán I, 71
Moscoso J, 19, 63, 64, 85
Muños-Criado S, 47
Muñoz Alcon H, 93
Muñoz Calleja C, 34
Muñoz Fernández P, 35, 85, 108, 110
Muñoz Oliveira JJ, 48
Muñoz-Fernández R, 45, 67, 105, 110
Mur S, 18, 59, 60
Murillo O, 25, 26
Muro M, 20, 70, 79, 82, 83
INDICE DE AUTORES
N
Naranjo-Gómez M, 105, 116
Navarro Blasco FJ, 56, 57
Navarro J, 70
Navasa M, 23
Naya Leira C, 71
Neil Hermenegildo Y, 94
Nevado Cestero J,67
Nieto A, 16, 34, 72, 85
Nogal París ML, 90
Nogués N, 78
Nos C, 49
Novo MJ, 119
Núñez B, 115
Núñez C, 17, 30, 49, 77
Núñez F, 105
Núñez Pardo de Vera C, 55
Nuñez Roldan A, 17, 23, 25, 41, 69, 72, 98, 99, 117
O
Ocaña E, 88, 89
Ocejo-Vinyals JG, 66
Ojeda G, 46, 109
Olivares G, 45
Olivares EG, 67, 105
Oliver A, 60
Oliver D, 52
Oller-Sales B, 100
Ontañón Rodríguez J, 120
Oña M, 81
Ordóñez D, 87
Ordóñez del Valle D, 36
Orera M, 119
Orfao A, 45, 47
Oriol A, 95
Orozco G, 17, 47
Ortego Centeno N, 51
Ortego J, 100
Ortiz-Ferrón G, 45, 67, 85, 105, 108, 110
Osório E, 68
Otero MJ, 49
P
Pacha MA, 100
Pachkoria K, 73
Pagán Alemán J, 82
Palka M, 25
Palomino P, 29, 80
Palomo J, 70
Palou E, 65
Panés J, 56
Pani Agua Martin MJ, 71
Parrado A, 86
Parrilla P, 107
Pascal M, 23
Pascual Figal DA, 70
Pascual-Salcedo Pascual D, 17
Pastoriza I, 44
Pavón Castillero EJ, 35, 51
Paz Artal E, 30, 60, 62, 67, 76, 96
Pelaez T, 84
Peña Martínez J, 57, 65, 77, 79
Peralbo E, 36, 86, 87
Peraza S, 90
Perdigones Borderías MN, 16
Perdigones N, 17, 56
Pérez A, 59, 60
Pérez Aradas V, 96
Pérez Blas M, 116
Pérez García V, 56, 57
Pérez Martínez M, 110
Pérez R, 20
Pérez V, 33, 62, 96
Pérez-Aciego P, 60
Pérez-Berezo T, 58
Pérez-Cabezas B, 105, 116
Pérez-Cano FJ, 58
Pérez-Durán P, 85
Pérez-Fernández R, 82
Perez-G M, 37, 51
Pérez-Gracia JL, 26
Pérez-Mateo M, 106
Pérez-Oliva AB, 74
Pérez-Requena J, 88
Pérez-Saborido B, 64, 67
Peris Pertusa A, 56, 57
Pini E, 46
Pinto JA, 18
Piñero A, 16
Pique JM, 56
Pita ML, 36, 86, 87
Planas R, 52
Planelles D, 61 69
Poderoso García T, 40
Polanco I, 49, 55
Polo Casado A, 86
Pons J, 79, 80, 83
Porcelli SA, 113
Portolés P, 46, 109
Postigo J, 41, 50
Poza-Cisneros G, 83
Prada Iñurrategui A, 61, 84
Prado C, 52 , 58, 104
Prat Arrojo I, 66
Prieto A, 18, 59, 60
Prieto J, 23
Pruneda L, 20
Puig N, 69
Pujol Borrell R, 47, 49, 50, 52, 65, 95, 100, 105, 116, 117
Q
Quandt E, 95
Queizan JA, 93
Quesada Gómez M, 57
Quintana R, 111
Quiralte J, 80
Quirce S, 75
R
Rada Martínez R, 120
Raich D, 116
Rallón NI, 98
Ramil E, 87
Ramírez Bustillo E, 67
Ramirez CM, 117
Ramírez P, 107
Ramírez-Santana C, 58
Ramiro AR, 85
Ramiro Latienda S, 17
Ramiro-Puig E, 58
125
INDICE DE AUTORES
Ramo C, 116
Ramos E, 81
Ramos JM, 31
Ramos M, 97
Ramos-Amaya AB, 89
Ramos-Romero S, 58
Raso Torres S, 96
Real LM, 26
Recio Hoyas MJ, 33
Recio MJ, 110, 113
Rego I, 18
Regueiro JR, 33, 110, 113
Reguera R, 19, 63, 64
Reiné J, 33, 110, 113
Relloso M, 113
Revilla Calvo C, 40, 110
Revilla Novella Y, 90, 99
Rey García C, 71
Ribes S, 31
Ribes-Koninckx C, 61
Riccardi C, 41
Rico MA, 97
Rieva JA, 89
Riñón M, 84
Riñon Martinez-Gallo M, 61
Rio J, 49
Ríos RM, 46
Rivas MD, 37, 51
Rivero A, 77
Rivero M, 72
Robles Valero J, 46
Roca A, 72
Roca J, 100, 115
Rodrigo L, 20, 60
Rodrigo MJ, 76, 100
Rodrigo-Agudo JL, 83
Rodriguez AB, 26
Rodríguez AI, 39
Rodriguez B, 97, 115
Rodríguez Bayona B, 16, 88
Rodríguez C, 16, 72, 88
Rodríguez Caballero MA, 47
Rodríguez Calvo MT, 97
Rodríguez de Córdoba S, 31, 81
Rodriguez F, 26, 47
Rodríguez Folgueras A, 37
Rodríguez Gallego JC, 32
Rodríguez Gutiérrez JF, 16
Rodríguez L, 56
Rodríguez M, 61, 64, 69, 104
Rodríguez Martín E, 28, 73
Rodríguez N, 100
Rodriguez Pena R, 66
Rodríguez Pérez N, 116
Rodríguez R, 93
Rodríguez Ramiro A, 35
Rodríguez Ramos R, 117
Rodriguez Reynoso F, 57
Rodríguez-Gallego C, 32
Rodriguez-Gutierrez JF, 34
Rodríguez-Mahou M, 52 , 120
Rodríguez-Martín E, Alcalá I, 94
Rodríguez-Molina J, 82
Rodriguez-Sainz C, 92, 103
Rodríguez-Sánchez J-L, 115
126
VOL. 27 SUPL. 1/ 2008
Roep BO, 44
Rojo JM, 46, 109
Roldán E, 28, 94
Roldán Santiago E, 73, 119
Roman A, 64, 104
Romera Ruiz MI, 116
Romero García I, 39, 73, 74, 95
Romero Gómez M, 98
Romero I, 95
Romero JM, 26, 92
Romero M, 42, 98, 99
Romero Noguera JM, 91
Romero Z, 33
Romo E, 60 , 67
Romo N, 102
Romo N, 83
Romo Pasamar E, 62, 96
Roque Cuellar MC, 41
Rosell A, 33
Rossi NE, 110
Roura-Mir C, 113
Roy G, 15, 78
Royo Cañas M, 68
Ruiz Contreras J, 30, 76
Ruiz de Galarreta CM, 117
Ruiz E, 65, 95
Ruiz Hernandez R, 112
Ruiz JC, 23
Ruiz Lapuente C, 117
Ruiz Magaña MJ, 26, 107
Ruiz Riol M, 49, 50, 55
Ruiz Ruiz MC, 26, 107
Ruíz-Alcaraz AJ, 103, 106
Ruiz-Cabello F, 26, 47, 73, 91, 92
Ruiz-Tovar M, 63, 64
Ruoslahti E, 38
S
Sabater L, 38
Sabina Villar P, 90, 99
Sacedón R, 109
Sádaba Argaiz MC, 48, 119
Saenz L, 107
Sáenz-López Garrocha P, 39, 73, 92
Saez A, 102
Saez de Guinoa J, 109
Saez Gutiérrez B, 104
Sáez Méndez L, 120
Sagrario Fustero T, 117
Saiz A, 38, 56
Salcedo Moreno C, 118
Salgado Cecilia MG, 70, 82
Salgado G, 20, 79
Salgado-Cecilia G, 83
Salinas JA, 83
Samino Y, 43
Sampalo A, 34, 85
San José Valiente B, 17
San Miguel J, 71
San Segundo D, 23
Sánchez A, 18, 59, 60
Sánchez AJ, 87
Sánchez B, 87
Sánchez Castañon M, 66
Sánchez E, 17
Sánchez Espinel C, 20, 64
Sánchez F, 47
Sánchez García ML, 45
Sánchez JI, 76
Sánchez López M, 27
Sánchez M, 15, 38
Sánchez Madrid F, 110, 118
Sánchez Mozo MP, 71
Sánchez R, 93
Sánchez Ruiz F, 57
Sánchez Sánchez B, 41
Sánchez-Castañón M, 101
Sánchez-Corral P, 81
Sánchez-Espinel C, 44, 102, 112
Sánchez-García F, 19
Sánchez-Madrid F, 46
Sánchez-Martín D, 38
Sánchez-Pla A, 105
Sanchez-Ramon S, 52, 120
Sánchez-Solis M, 79
Sánchez-Velasco P, 65, 101
Sanchís MJ, 20
Sancho López J, 35, 51, 110
Sanmartí A, 117
Sanmartí R, 18
Santamaria C, 71
Santamaría Jaramillo B, 92
Santamaria Ossorio M, 47
Santiago E, 32
Santiago JL, 114
Santiuste I, 38, 41, 50
Santos-Valle P, 27
Sanz Alcober L, 27
Sanz G, 69
Sanz L, 27
Sarasquete ME, 71
Sarmiento E, 25, 53, 82, 84, 119
Sarmiento Marchese E, 70, 81
Sarrias MR,107
Sastre B, 29, 30, 75
Sastre J, 75
Sauleda J, 115
Schreiber V, 107
Segalés J, 42
Segui ME, 90
Segundo C, 89
Selgas R, 44
Sempere Ortells JM, 56, 57
Seren Bernardone I, 109
Serna CJ, 72
Serra A, 32
Serrano A, 27
Serrano Hernández A, 67
Serrano-Vela JI, 19, 63, 64
Seto E, López Soto A, 37
Sevilla Hidalgo N, 97
Sevilla N, 100
Sierra J1, Briones J, 74
Sinde Monteiro M, 68
Sirgo Gonzalez G, 96
Sirgo Rodríguez G, 62
Sloan C, 48
Solana Lara R, 87
Solana R, 36, 86
Soldevila B, 117
INMUNOLOGÍA
Soler P, 29, 32, 81
Soler Palacin P, 75
Sologuren I, 32
Solves P, 69
Sommaggio R, 22
Soriano A, 95
Soriano N, 79
Soriano V, 42, 98
Soto Cárdenas C, 81
Sousa JM, 69
Spies T, 37
Srivastava GK, 34
Stefanski J, 39, 74, 95
Strong R, 37
Suárez A, 52, 58, 104
Suárez Álvarez B, 21, 60
López Rodríguez C, 48
Suárez B, 18, 23
Suárez Casasús B, 107
Suárez Leiva P, 81
Suarez-Alvarez B, 21
Suàrez-Germà C, 58
Subiza Garrido-Lestache JL, 91
Subiza JL, 94
Such J, 106
T
Tabernero MD, 47
Tallada M, 39, 92, 92
Tamayo E, 38, 41, 51
Tarazona R, 36, 86, 87
Taxonera C, 16, 55
Teijeiro Martorell R, 92, 120
Teixeira J, 68
Téllez Lara N, 108
T´Hart BA, 44
Tirado González I, 45, 67, 85, 105, 108, 110
Tirapu Fernández de la Cuesta I, 106
Titulaer M, 38
Toca M, 15
Toribio ML, 45, 46, 111
Torío Ruiz A, 71
INDICE DE AUTORES
Torres B, 17
Torres S, 34
Traves PG, 97
Trento A, 97
Tres A, 104
Tricas L, 81
Trinidad Álvarez EV, 92
Troya-Diaz J, 100
Tur Gómez C, 108
Turrión A, 18, 59
Tzartos J, 48
U
Unciti JD, 33
Unger W, 44
Urcelay E, 16, 17, 49, 55, 56, 114
Uribe-Herranz M, 22
V
Valdor Alonso R, 107
Valencia J, 109
Valor L, 103
Van Kooyk Y, 44
Van Montfrans J, 33
Varadé López J, 17, 56
Varadñe J, 16
Varas A, 109
Vargas-Alarcon G, 63
Vazquez F, 39
Vazquez Gonzalez AC, 90
Vázquez M, 109
Vazquez-Piñeiro T, 86
Veintemillas-Verdaguer S, 72
Velastegui Ordoñez A, 52
Vendrell M, 32
Veny M, 56
Vera Fernández J, 107
Vercher Agustí FJ, 93
Verdaguer J, 52
Verschuuren J, 38
Vicario JL, 19, 25, 27, 28
Vicente A, 109
Vidal C, 34
Vidal Castiñeira JR, 21, 60
Vidal S, 74
Vidal Sernández I, 35
Vidal-Castiñeira JR, 20
Vidaller A, 32
Vidart J, 104
Vila E, 69
Vilches C, 36, 87
Villar A, 115
Villar Guimerans LM, 48, 90, 94, 119
Villegas Becerril E, 65
Villegas N, 42, 101
Villegas Zambrano N, 119
Viñuela JE, 89
Vives-Pi M, 52
Vlagea A, 31
Vlagea F, 118
W
Wichmann Schlipf I, 23, 25, 69, 117
Wilson IA, 113
Woellner C, 29
Y
Yagüe J, 32
Yang J, 47
Yañez F, 24
Yélamos J, 107
Yelo E, 86
Yim D, 37
Z
Zafra MP, 109
Zaldivar G, 34
Zamorano J, 37, 51
Zapata AG, 109
Zapata González A, 48, 92
Zapater P, 106
Zimman-Mansfeld H, 91
Zubiaur Marcos M, 35, 51, 110
Zumaquero Martínez EC, 35
127
Comunicaciones Orales
Estas comunicaciones se añaden a este documento
de forma posterior a la edición impresa. Por este
motivo no se mantiene la paginación anterior ni
existen referencias en el índice de autores.
SESIÓN 7: INMUNOLOGIA TUMORAL II
Moderadores: Dr. Federico Garrido (Granada),
Dr. Luis Álvarez Vallina (Madrid)
ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE RECEPTORES ACTIVADORES DE LA CITOTOXICIDAD DE LAS CÉLULAS NK EN
PACIENTES CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (AML). Sánchez Correa B1, Morgado S1, Bergua J2, García Casado J1, Gayoso I3,
Solana R3, Durán E1, Tarazona Lafarga R1. 1Facultad de Veterinaria. 2Hospital San Pedro de Alcantara (Cáceres). 3Facultad de Medicina (Córdoba).
Las células Natural Killer (NK) constituyen una subpoblación linfoide esencial en la respuesta inmune innata ya que reconocen y lisan
células infectadas por virus y células neoplásicas sin necesidad de una
sensibilización previa al antígeno. La activación de las células NK es
resultado de un complejo balance entre las señales de activación e inhibición enviadas a través de receptores expresados en su superficie.
Las señales inhibidoras son aportadas por interacciones de los
receptores inhibidores con moléculas de histocompatibilidad clase I
(HLA-I), garantizándose así la tolerancia de las células NK frente a las
células autólogas sanas.
En ausencia de interacciones inhibidoras eficientes, las células diana son susceptibles a ser lisadas por las células NK gracias a la participación de los receptores activadores. Este grupo de receptores incluye CD16, NKG2D, los NCRs (Natural Cytotoxicity Receptors):NKp46,
NKp30 y NKp44; DNAM-1, 2B4 (CD244), NTB-A, CRACC (CS1) y
NKp80.
En el presente estudio se analiza por citometría de flujo el fenotipo de las células NK en pacientes con leucemias mieloide aguda (AML)
en el momento del diagnóstico.
Los resultados muestran que existen variaciones significativas en
la expresión en superficie de los receptores activadores más importantes implicados en la eliminación de las células leucémicas. Así podemos
observar un notable descenso en la expresión de NKp46, NKp30 y
DNAM-1, mientras que NKp44, receptor inducible tras la activación de
la célula NK, incrementaba notablemente su expresión en superficie.
Inmunología
Vol. 27 / Supl. 1/ Mayo 2008
Por ello podemos concluir que las células leucémicas son capaces alterar la expresión en superficie de los principales receptores activadores. Esta alteración podría considerarse un mecanismo de escape
tumoral, que podría emplearse como nuevo marcador pronóstico de
la supervivencia en pacientes con AML.
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN Y LIBERACIÓN DE LIGANDOS
PARA EL RECEPTOR ACTIVADOR DE LA CITOTOXICIDAD
NKG2D EN LÍNEAS CELULARES DE MELANOMA. Morgado
García S1, Sánchez Correa B1, García Casado J1, Gordillo González
JJ1, Durán Flórez E2, Tarazona Lafarga R1. 1Área de Inmunología. Dpto.
Fisiología. Facultad de Veterinaria. UEX. 2Área de Anatomía y Anatomía
Patológica Comparada. Dpto. Medicina Animal. Facultad de Veterinaria.
UEX.
Las células Natural Killer (NK) son un componente del sistema
inmune innato que contribuyen a la respuesta inmune frente a tumores, puesto que son capaces de matar células cancerosas sin una inmunización previa. Su activación depende de un balance de señales activadoras e inhibidoras transmitidas mediante receptores que se encuentran en la superficie de las NK. Uno de estos receptores activadores es
el NKG2D, cuyos ligandos son MICA/B y la familia de ULBP, y el cual
también aparece en otras células del sistema inmunitario.
En trabajos anteriores, estudiando el papel de NKG2D en la citotoxicidad mediada por las células NK hemos puesto de manifiesto que
la mayoría de las líneas celulares de melanoma procedentes del proyecto OISTER y ESTDAB presentan en su superficie ligandos para
NKG2D, demostrando que la interacción NKG2D-NKG2DL es un mecanismo de gran importancia en el reconocimiento y posterior eliminación de las células de melanoma.
En el presente trabajo hemos puesto de manifiesto, mediante el
análisis por ELISA, la presencia de ligandos solubles para el receptor
NKG2D en los sobrenadantes de los cultivos celulares de algunas líneas de melanoma, lo cual sugiere una posible vía de inmunoescape de
estas líneas de melanoma, a través de la interacción de estas formas
solubles de los ligandos con el receptor NKG2D.
1