universidad de murcia

UNIVERSIDAD DE MURCIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA INTERNA
Estudio en fase I de utilización de las
células madre de médula ósea autólogas
en pacientes con esclerosis lateral
amiotrófica
D. Miguel Blanquer Blanquer
2012
Sigamos buscando, a pesar de todo. Sigamos buscando. De hecho, es el mejor método
para encontrar, y tal vez, gracias a nuestros esfuerzos, el veredicto que daremos a
nuestros pacientes de mañana no será el mismo que tenemos que dar hoy.
Jean-Martin Charcot. Clases de los martes en La Salpêtrière.
A mis padres
AGRADECIMIENTOS
Largo ha sido el camino que me ha llevado hasta la culminación de este
trabajo. Muchas personas han ido ofreciéndome su trabajo, su ilusión y su apoyo… y
muchas más han tenido que soportar que no les hiciera el caso que se merecen. A
todas ellas va mi agradecimiento. Todos saben quiénes son. Todos sabéis quiénes
sois. No puedo dejar de nombrar, sin embargo, a aquellos que han sido condición de
posibilidad para esta tesis. Nada hubiera podido hacer sin el esfuerzo continuado de
mis padres -físico, económico y moral- para hacer de mí un buen hombre y un buen
médico, desde que descubrieron mi vocación. Nada de esto hubiera sucedido tampoco
si José María no se hubiera cruzado en mi vida. Gracias a él trabajo justo en aquello
que, mientras hacía la carrera e iba conociendo la Medicina, me ilusionaba como mi
posible línea de dedicación profesional y de investigación. Tampoco sin Salvador, que
nos sacó a los dos de las aguas mansas del trasplante hematopoyético al agitado mar
de la terapia celular. Y no puedo acabar sin nombrar a Paqui Iniesta. ¿Qué hubiera
sido de todos nosotros sin ella? Verdaderamente, puedo dar gracias a Dios por
haberme puesto las cosas tan fáciles, por haberme colocado a vuestro lado.
ÍNDICE
I.
INTRODUCCIÓN
1. ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA
1
3
1.1. Introducción histórica
3
1.2. Definición y criterios diagnósticos
4
1.3. Epidemiología y genética
5
1.4. Rasgos clínicos
8
1.5. Patogenia
10
1.5.1. Estrés oxidativo
10
1.5.2. Disfunción mitocondrial
12
1.5.3. Excitotoxicidad
13
1.5.4. Agregación proteica
15
1.5.5. Alteración en la regulación del tráfico endosómico
16
1.5.6. Alteración del transporte axonal
16
1.5.7. Inflamación
16
1.5.8. Estrés del retículo endoplasmático
17
1.5.9. Alteración en la regulación del procesamiento y
transcripción del RNA
17
1.5.10. Déficits de factores neurotróficos
18
1.5.11. Papel de las células no neuronales
18
1.5.12. Resumen
20
1.6. Tratamiento
22
1.7. Pronóstico
25
2. LA TERAPIA CELULAR COMO ESTRATEGIA TERAPÉUTICA
27
2.1. Las células madre del adulto
28
2.2. Células madre neurales en modelos de degeneración espinal
30
2.3. Células madre de la médula ósea en enfermedades
neurodegenerativas
2.4. Ensayos clínicos de terapia celular en pacientes con ELA
31
36
II.
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
41
III.
PACIENTES Y MÉTODOS
45
1. Diseño del Ensayo Clínico
47
2. Criterios de selección
49
2.1. Criterios de inclusión
49
2.2. Criterios de exclusión
49
3. Variables de valoración
50
3.1. Variables principales
50
3.2. Variables secundarias
50
4. Procedimiento de obtención y trasplante de las células mononucleadas
51
4.1. Obtención de médula ósea
51
4.2. Preparación de las células mononucleadas de médula ósea
53
4.3. Citometría
56
4.4. Administración de las células a los pacientes: técnica neuroquirúrgica
60
5. Evaluaciones
61
6. Análisis estadístico
64
7. Estudio histológico e inmunohistoquímico
64
IV.
RESULTADOS
67
a. Características de los pacientes
69
b. Recogida de las células mononucleadas de médula ósea y trasplante
70
c. Eventos adversos no severos relacionados con el tratamiento
71
d. Eventos adversos severos
71
e. Evolución clínica
73
f.
78
Evolución radiológica
g. Estudio necrópsico
80
V.
DISCUSIÓN
85
1. Factibilidad y seguridad de la inyección intraespinal de células
mononucleadas de médula ósea autóloga
88
2. Efecto neurotrófico de las células mononucleadas de médula
ósea autóloga
92
VI.
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
95
VII.
BIBLIOGRAFÍA
99
TABLAS
Tabla 1 Resumen de los criterios diagnósticos de El Escorial
6
Tabla 2 Tratamientos sintomáticos en la ELA
26
Tabla 3 Esquema de evaluaciones del ensayo clínico
62
Tabla 4 Anticuerpos utilizados en las tinciones inmunohistoquímicas
66
Tabla 5 Características de los pacientes
69
Tabla 6 Número y tipo de células infundidas
70
Tabla 7 Eventos adversos no severos relacionados
72
Tabla 8 Contaje de motoneuronas con nidos de células CD90+ y depósitos de
ubiquitinina en los segmentos T4-T5 y T8-T9.
83
FIGURAS
Figura 1 Mecanismos moleculares de daño de la motoneurona en la ELA.
21
Figura 2 Objetivos terapéuticos y fármacos ensayados.
23
Figura 3 Disposición de las células de médula ósea alrededor de las
motoneuronas.
35
Figura 4 Neurotrofismo mediado por GDNF.
35
Figura 5 Evolución radiológica en el ensayo de Mazzini et al.
37
Figura 6 Evolución de la capacidad vital forzada en el ensayo de Mazzini et al. 38
Figura
Figura 7 Extracción de la médula ósea y separación de las células
mononucleadas mediante gradiente de densidad.
58
Figura 8 Laminectomía T3-T4 y exposición de la médula espinal.
58
Figura 9 Infusión de las células mononucleadas y cierre de las meninges.
59
Figura 10 Evolución de las escalas neurológicas
75
Figura 11 Evolución de las escalas respiratorias
76
Figura 12 Evolución de la escala POMS
78
Figura 13 Evolución de la calidad de vida
78
Figura 14 Resonancia nuclear magnética
79
Figura 15 Hallazgos anatomo-patológicos en la médula espinal
81
Figura 16 Media de motoneuronas por segmento espinal
83
ABREVIATURAS
CHAT
Colinacetiltransferasa
CVF
capacidad vital forzada
ELA
Esclerosis lateral amiotrófica
PEM
Presión espiratoria máxima
PIM
Presión inspiratoria máxima
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1
INTRODUCCIÓN
2
INTRODUCCIÓN
3. ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA
3.1. Introducción histórica
La primera descripción de la Esclerosis lateral amiotrófica, así como su
definición como una entidad clínica independiente, fue realizada por Jean-Martin
Charcot en 18741. En el momento en el que el Dr. Charcot inició sus observaciones no
se había realizado todavía la distinción entre las motoneuronas superiores e inferiores,
no se conocía el papel del tracto córticoespinal ni el valor diagnóstico de la hiperreflexia osteo-tendinosa o de los signos de Hoffmann y de Babinski, y, por tanto, no
había modo de separar las distintas enfermedades cuyo signo fundamental es la
debilidad muscular2. El Dr. Jean-Martin Charcot se formó como médico y
posteriormente trabajó desde 1862 hasta su muerte en 1893 en el Hôpital de la
Salpêtrière3. Este hospital estaba dedicado desde su fundación en 1656 por Luis XIV a
la atención de mujeres indigentes4. En la última mitad del siglo XIX residían en el
Hôpital de la Salpêtrière miles de pacientes crónicos, muchos de ellos hasta su
muerte. Este hecho posibilitó a la agudeza del Dr. Charcot aislar una serie de
pacientes en los que únicamente se apreciaba debilidad muscular, sin ningún otro tipo
de alteración neurológica o problema médico. El Dr. Charcot mantuvo un cuidadoso
registro de la evolución clínica de estos pacientes prototípicos y realizó un atento
análisis de sus necropsias, llevando a su culmen el método anatomo-clínico que
adquirió de Laennec. De este modo, pudo comparar los hallazgos anatómicos en la
médula espinal de sus pacientes con atrofia muscular medular infantil y poliomielitis
con los descritos por Cruveilhier en 18535 en pacientes que presentaban también una
debilidad muscular progresiva, observando que en ambos casos se producía una
atrofia de las raíces anteriores y una alteración de las células del asta anterior de la
médula espinal. Sugería, por tanto, una relación causal de las neuronas motoras con
el cuadro de amiotrofia. Por otro lado, en 1865 describió el caso de una mujer
inicialmente diagnosticada como “histérica” que presentaba signos de espasticidad
que se asociaban con una alteración de los tractos laterales de su médula espinal6, en
lo que constituye la primera descripción de una esclerosis lateral primaria. En 1869,
3
INTRODUCCIÓN
describió junto con Joffroy dos pacientes en los que se combinaban la espasticidad y
la amiotrofia7. Cinco años más tarde, revisó toda la experiencia adquirida y utilizó por
primera vez el término Esclerosis lateral amiotrófica1, realizando una descripción de la
misma que no desmerece en absoluto de la que podríamos encontrar en cualquier
tratado de neurología actual. Por desgracia, también continúa siendo exacta su
descripción de la rápida evolución clínica de estos pacientes.
3.2. Definición y criterios diagnósticos
La Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) puede ser definida como una patología
neurodegenerativa caracterizada por una parálisis muscular progresiva que refleja la
degeneración de motoneuronas en la corteza motora, bulbo y médula espinal. La
denervación de las fibras musculares secundaria a la pérdida de las correspondientes
neuronas motoras del asta anterior de la médula espinal produce debilidad, atrofia y
fasciculaciones en los músculos afectados. El término esclerosis lateral se refiere al
endurecimiento de los tractos corticoespinal anterior y lateral a medida que se
degeneran las motoneuronas que los forman y son reemplazadas por gliosis8. La
pérdida de estas motoneuronas produce espasticidad, reflejos tendinosos hiperactivos,
signos de Hoffmann y Babinsky, clonus, y otros rasgos característicos de la
enfermedad.8-10
El diagnóstico de la ELA se basa en la presencia de unas características
clínicas bien definidas junto con la realización de una serie de pruebas para excluir la
presencia de síndromes que simulan la ELA. Estos síndromes llegan a conducir a un
diagnóstico erróneo en un 5-10% de los casos11,
12.
El hallazgo de signos clínicos
sugestivos de afectación de primera y segunda motoneurona que no pueden ser
explicados
por
ninguna
otra
enfermedad
-tras
la
realización
de
estudios
electrofisiológicos, de imagen y serológicos, y tras analizar el líquido cefalorraquídeojunto con una progresión compatible con una enfermedad neurodegenerativa, sugiere
el diagnóstico de ELA. Por tanto el diagnóstico de la ELA no depende de los
4
INTRODUCCIÓN
resultados de un único test, sino de la interpretación de las distintas exploraciones en
conjunto con la historia del paciente y los hallazgos clínicos.
Teniendo en cuenta estas consideraciones, la World Federation of Neurology
Research Group on Motor Neuron Diseases desarrolló en El Escorial unos criterios
diagnósticos en 199413 que fueron revisados posteriormente en el año 200014 y más
recientemente en 200815, y que resumimos en la tabla 1. Basados en esos criterios,
los pacientes pueden ser clasificados en las categorías ‘clínicamente definida’,
‘clínicamente probable’, ‘clínicamente probable con apoyo de laboratorio’ y
‘clínicamente posible’. Estos criterios son probablemente más útiles en el ámbito de la
investigación clínica que en la práctica diaria de las consultas de Neurología16.
3.3. Epidemiología y genética
La incidencia comunicada en los estudios epidemiológicos sobre la ELA
esporádica en la década de los 90 en Norteamérica y Europa osciló entre un 1.5 y un
2.7 por 100,000 habitantes/año con una media de 1.89 por 100,000 habitantes/año17.
No hubo diferencias en la distribución de la incidencia entre los distintos países, que
en España se sitúa en el 1/100.000 habitantes/año18. La prevalencia osciló entre un
2.7 y un 7.4 por 100,000 habitantes con una media de 5.2 por 100,000 habitantes17,
siendo en España de 3,5 casos por cada 100.000 habitantes y año18. Sin embargo, la
ELA afecta a personas de todo el mundo y su incidencia exacta todavía no es
conocida19. El riesgo acumulado de padecer una ELA a los 70 años se ha estimado en
un 1 por 1000
20, 21,
aunque una estimación más precisa puede ser de 1 por 400 22. La
incidencia de la enfermedad en hombres (3,0 por 100.000 años-persona; 95% IC 2·8–
3·3) es algo superior que en mujeres (2,4 por 100.000 años-persona; 95% CI 2·2–2·6),
aunque estas diferencias no se aprecian en el caso de la ELA familiar. El pico de
incidencia de la enfermedad se sitúa entre los 58 y los 63 años de edad para la ELA
esporádica y los 47 y 52 años para la familiar23. Sólo un 5% de los casos se presentan
antes de los 30 años24, aunque cada vez se reconocen más casos de debut juvenil de
ELA esporádica25. Hay evidencias que apuntan a que la ELA es menos común en
personas de origen no europeo y de origen étnico mixto19, y que la mezcla genética
5
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de ELA requiere:
Presencia de
Ausencia de
Evidencia electrofisiológica o patológica de
Evidencia de degeneración del tipo de
otra enfermedad o proceso que pueda
neurona motora inferior (MNI), por examen
explicar los signos de degeneración de
clínico, electrofisiológico o neuropatológico
neurona motora superior o inferior
Evidencia de degeneración de neurona
motora superior (MNS) por examen clínico
Evidencia por neuroimagen de otro proceso
o enfermedad, que pueda explicar los signos
clínicos y electrofisiológicos observados
Diseminación progresiva de los síntomas o
signos dentro de una región o de otras
regiones, determinados por medio de la
historia clínica o exploración física
Categorías en la certeza del diagnóstico:
Nivel de certeza diagnóstica
Características clínicas
ELA clínicamente definida
Signos y/o síntomas de MNS y MNI en ≥ tres regiones
ELA clínicamente probable Signos y/o síntomas de MNS y MNI en ≥ dos regiones
y
obligatoriamente algún signo de MNS rostral a signos de
MNI
ELA clínicamente probable Signos y/o síntomas de MNS y MNI en una región,
con apoyo de laboratorio
O
signos y/o síntomas sólo de MNS en ≥ una región;
y
cualquiera de ellas acompañada de signos de MNI en
EMG en ≥ dos regiones
exclusión de otras causas a nivel de laboratorio y RM
ELA clínicamente posible
Signos y/o síntomas de MNS y MNI en una región
o
signos y/o síntomas de MNI en ≥ dos regiones
o
signos y/o síntomas de MNI rostrales a los de MNS
y
exclusión mediante EMG de otros diagnósticos pero sin
criterios de afectación de MNI en dos regiones
exclusión de otras causas a nivel de laboratorio y RM
Regiones: Bulbar, cervical, torácica y lumbo-sacra.
MNS Neurona motora superior; MNI Neurona motora inferior
EMG Electromiografía; RM Resonancia magnética
Tabla 1 Resumen de los criterios diagnósticos de El Escorial, revisión del año 2000
6
INTRODUCCIÓN
puede ser protectora26. Se ha detectado una agrupación de casos de ELA en ciertas
profesiones como en los jugadores de fútbol italianos (pero no en otros deportistas)27
y, posiblemente, militares desplegados en servicio28, 29. Otros factores ambientales que
se han asociado con la ELA son fumar30, 31 y la exposición a pesticidas, plomo, toxinas
orgánicas y radiación electromagnética32.
El inicio bulbar es más común en mujeres y en los pacientes de mayor edad: un
43% de los pacientes con más de 70 años se presentan con síntomas bulbares,
mientras que sólo un 15% de los pacientes con menos de 30 años lo hacen24, 33, 34.
Aproximadamente un 5%-10% de los pacientes tienen historia familiar de
ELA35. El patrón hereditario es predominantemente mendeliano con una alta
penetrancia, siendo autosómico dominante en la mayoría de los casos, aunque
también se han comunicado familias con herencia autosómica recesiva36, 37. La edad
de inicio de la ELA familiar es aproximadamente una década anterior a la de la ELA
esporádica y la supervivencia más corta36, 38, 39. Hasta el momento se han identificado
13 genes y locus sin ningún denominador común biológico, pero que pueden ser
divididos en 5 categorías principales: transporte axonal (DCTN1 y NEFH),
procesamiento de RNAm (FUS, TARDBP, ANG, SETX, TAF15, ELP3 y C9ORF72),
tráfico de vesículas endosómicas (FIG4 y VAPB), ubiquitinación (UBQLN240 y
UNC13A), y otras funciones (SOD1)41. Las mutaciones en SOD1 constituyen un 20%
de las ELA familiares42 y un 5% de las ELA aparentemente esporádicas. Las
mutaciones en TARDBP son responsables de un 5 a un 10% de las ELA familiares, en
FUS de un 5% y en ANG de un 1%43.
El 90% restante de los pacientes son clasificados como ELA esporádica. En
ellos, los estudios familiares han identificado un solapamiento entre la ELA y otras
enfermedades neurodegenerativas comunes. Esto sugiere la existencia de genes que
pueden aumentar el riesgo global de neurodegeneración en los familiares. Sin
embargo, los intentos de establecer la base genética de la ELA esporádica mediante la
identificación de este tipo de genes han tenido poco éxito: los genes identificados
confieren un riesgo que raramente excede una odds ratio de 2 y aumentan el riesgo
mediante un mecanismo desconocido44.
7
INTRODUCCIÓN
3.4. Rasgos clínicos
El fenotipo de la enfermedad se suele clasificar según el lugar en el que
debuta45. La ELA se inicia con debilidad en las extremidades en un 65% de los
pacientes. Los síntomas iniciales son típicamente la caída del pie, la dificultad al
andar, la pérdida de destreza en la mano o la debilidad del hombro. En
aproximadamente un 30% de los pacientes la debilidad se inicia en la musculatura
bulbar, normalmente con disartria (a menudo inicialmente solo se aprecia tras la
ingesta de pequeñas cantidades de alcohol16) seguida de disfagia23. Los síntomas
debidos a la degeneración de la motoneurona inferior (debilidad, atrofia, calambres,
fasciculaciones) a menudo eclipsan a los asociados con la motoneurona superior46.
Eventualmente la función de las extremidades se pierde, llevando al paciente a
depender de los cuidadores: andar, permanecer de pie, desplazar peso se hace
imposible. Las caídas son frecuentes.
Con el tiempo los pacientes dejan de poder hablar inteligiblemente. Los
problemas para tragar pueden llevarles a babear, a la deshidratación, malnutrición con
pérdida de peso y a tener broncoaspiraciones. La debilidad de la musculatura axial
hace que no puedan mantener la cabeza erguida y que se produzca cifosis. La cifosis
puede causar dolor, pérdida del equilibro por cambio en el centro de gravedad y
problemas con actividades como comer o conducir. Los esfínteres, la musculatura
extraocular y la función sensitiva a menudo no se ven afectadas.
Un 20-50% de los pacientes a los que se les realiza tests neuropsicológicos
tienen problemas cognitivos, y aproximadamente un 15% desarrollan demencia,
siendo la frontotemporal la más frecuente47. Las anomalías cognitivas llevan a cambios
en la personalidad, el lenguaje, la capacidad de juicio y en los afectos. La abulia
asociada y la reducción en la capacidad de juicio puede hacerles incapaces de
participar en las decisiones sobre su tratamiento médico y acortar su supervivencia48.
También presentan labilidad emocional que se manifiesta con una pérdida de la
inhibición normal de la risa y del llanto49. La depresión y la ansiedad pueden ser
características prominentes de la enfermedad en todas sus fases50,
8
51.
La ansiedad
INTRODUCCIÓN
puede acompañarse de síntomas de insuficiencia respiratoria y la depresión puede
llevar a una disminución del apetito, sueño pobre y desesperanza.
Habitualmente se describe a la ELA como causante de debilidad muscular sin
dolor. Sin embargo los pacientes pueden experimentar dolor a consecuencia de la
reducción en su movilidad, la incapacidad de darse la vuelta en la cama, contracción
de las articulaciones y úlceras por decúbito. Ocasionalmente, el dolor puede ser
secundario a la misma enfermedad, posiblemente relacionado con la degeneración de
los núcleos o cordones sensitivos. Los calambres pueden ser también dolorosos y
pueden interferir con el sueño y la actividad física.
La dificultad para respirar y otros síntomas respiratorios normalmente ocurren
tarde en la evolución de los pacientes. Los síntomas incluyen la ortopnea, cefaleas
matinales y tos débil. Los pacientes desarrollan disnea de esfuerzo y, eventualmente,
de reposo. El fallo respiratorio y las complicaciones pulmonares secundarias a la
afectación bulbar, como la neumonía por broncoaspiración, son las causas de muerte
más frecuentes52.
En la exploración física la primera manifestación de la enfermedad de inicio en
extremidades o medular suele ser atrofia muscular focal especialmente en los
músculos de las manos, antebrazos u hombros en las extremidades superiores, y de la
zona proximal del muslo o de la musculatura distal del pie en las extremidades
inferiores. Las fasciculaciones son habitualmente visibles en más de un grupo
muscular. La espasticidad se evidencia por el aumento del tono muscular y el
‘atrapamiento’ supinador en los miembros superiores, y el ‘atrapamiento’ rotuliano,
clonus e hipertonía en los miembros inferiores. Los reflejos tendinosos están
aumentados de modo simétrico, incluso afectando a grupos musculares distintos al
estimulado. El signo de Hoffmann puede ser positivo en los miembros superiores y el
reflejo plantar es extensor con frecuencia.
En los pacientes con disfunción bulbar la disartria puede ser consecuencia
tanto de la afectación de la motoneurona inferior como de la parálisis pseudobulbar
secundaria a la afectación de la motoneurona superior. Ambas hacen que el paciente
hable arrastrando las palabras y/o con una tonalidad nasal. Al explorar los nervios
9
INTRODUCCIÓN
craneales, el reflejo mandibular puede estar aumentado, especialmente en las formas
de inicio bulbar. La debilidad facial típica de la afectación de la motoneurona superior
afecta la mitad inferior de la cara, causando dificultad para sellar los labios y silbar. A
menudo coexisten grados variables de debilidad facial de motoneurona superior e
inferior. El reflejo nauseoso está preservado y, a menudo, aumentado. El paladar
blando puede estar flácido. Los pacientes desarrollan fasciculaciones y atrofia de la
lengua, cuyos movimientos están enlentecidos por espasticidad. El resto de los nervios
craneales permanecen intactos aunque, en estadios tardíos de la enfermedad y muy
infrecuentemente, los pacientes pueden desarrollar una parálisis supranuclear
oculomotora53, 54. La exploración sensitiva es casi siempre anodina. A medida que la
enfermedad progresa, los pacientes desarrollan el cuadro característico de
combinación de afectación de motoneurona superior e inferior en la misma región del
sistema nervioso central, afectando los territorios bulbar, cervical, torácico y lumbar55.
Esta progresividad en la afectación de las motoneuronas superiores e inferiores hace
que el diagnóstico sea incierto en los inicios de la enfermedad. De hecho, la mayoría
de los pacientes han sido vistos al menos por dos o tres especialistas antes de ser
formalmente diagnosticados. El tiempo medio desde la aparición del primer síntoma
hasta el diagnóstico definitivo es de 9-15 meses, sea cual sea el sistema de salud en
el que se encuentre el paciente56.
3.5. PATOGENIA
PATOGENIA
A pesar de la intensa investigación realizada sobre la ELA, el mecanismo
exacto por el que se produce continua siendo desconocido. Probablemente, la ELA es
el resultado de una compleja interacción entre varios mecanismos que pueden no ser
mutuamente exclusivos16. Estos mecanismos incluyen:
3.5.1. Estrés oxidativo
El estrés oxidativo causa daño estructural y cambios en las rutas de
señalización sensibles al equilibrio redox. Surge de un desequilibrio entre la
generación y destrucción de especies reactivas de oxígeno, y/o de la reducción de la
10
INTRODUCCIÓN
capacidad del sistema biológico de eliminar o reparar el daño creado por éstas. La
acumulación de estrés oxidativo en neuronas que no se dividen durante el
envejecimiento puede ser un factor importante que convierte la capacidad de hacer
frente a una agresión tóxica, como la presencia de una mutación causante de
enfermedad, en un círculo vicioso de lesión celular que culmina en la muerte neuronal
y el inicio de la neurodegeneración en la mitad de la vida o más tarde. Se ha puesto un
interés particular en el papel del estrés oxidativo porque las mutaciones en SOD1, que
codifica una proteína antioxidante, son responsables de un 20% de los casos de ELA
familiar42.
Se ha observado una elevación en los marcadores de daño por radicales libres
en muestras de suero, orina y líquido cefalorraquídeo de pacientes con ELA57-59.
Además, se han encontrado niveles elevados de daño oxidativo a proteínas60, lípidos61
y DNA62 en tejido postmortem de casos de ELA esporádica y de ELA familiar
relacionada con la mutación SOD1. También se ha documentado daño oxidativo a
RNA en modelos murinos de SOD1 y en el sistema nervioso central de humanos63. En
el modelo murino, la oxidación del RNAm se encuentra primariamente en
motoneuronas y oligodendrocitos, sucede en los estadíos tempranos presintomáticos
de la enfermedad, y se asocia con una disminución de las proteínas codificadas.
Algunos RNAm parecen ser más susceptibles a la oxidación, incluyendo los
relacionados con la cadena de transporte de electrones mitocondrial, rutas de
biosíntesis, conformación y degradación de proteínas, mielinización, citoesqueleto y la
ruta del ciclo del ácido tricarboxílico y glucolisis63. El daño oxidativo se ha podido
observar en modelos murinos y celulares de ELA relacionada con SOD164. Los
modelos celulares recientes de ELA relacionada con la mutación de TDP-43 indican
que la presencia de esta proteína también induce estrés oxidativo en líneas celulares
de motoneurona65.
El origen del estrés oxidativo en la ELA ha sido estudiado en profundidad en los
modelos murinos de mutación SOD1, en los que se han propuesto varias reacciones
oxidativas aberrantes64. Sin embargo, SOD1 mutadas y enzimáticamente inactivas son
todavía capaces de causar degeneración de motoneuronas66, y hay evidencias
11
INTRODUCCIÓN
recientes de que la SOD1 mutada puede causar estrés oxidativo por mecanismos
distintos a su capacidad catalítica. Concretamente, la SOD1 mutada aumenta la
producción de superóxido mediada por la NADPH oxidasa (NOX) bloqueando Rac1 en
su estado inactivo en el complejo NOX, resultando en una prolongación de la
producción de especies reactivas de oxígeno67. La expresión de NOX2 está
aumentada en los ratones con SOD1 mutante y en el SNC de pacientes con ELA, y el
knockout de NOX1 y de NOX2 provocan un aumento de la supervivencia de los
ratones68.
Múltiples estudios han mostrado que el estrés oxidativo interacciona con, y
potencialmente exacerba, otros procesos fisiopatológicos que contribuyen a la lesión
de la motoneurona: excitotoxicidad69, disfunción mitocondrial70, agregación de
proteínas71, estrés del retículo endoplasmático72, y alteraciones en la señalización de
los astrocitos y la microglía73,
74.
De modo que una disminución efectiva del estrés
oxidativo podría potencialmente mejorar múltiples facetas de la patobiología de la
degeneración de motoneurona. Un meta-análisis de los tratamientos intentados en
ratones con mutación de SOD1 concluyó que la terapia antioxidante era el tipo de
fármaco que más aumentaba la supervivencia de los ratones75. Sin embargo, los
antioxidantes todavía no han demostrado ningún beneficio en los ensayos clínicos en
pacientes76.
3.5.2. Disfunción mitocondrial
Las mitocondrias tienen un papel central en la producción de energía
intracelular, la homeostasis del calcio y el control de la apoptosis. Hay evidencias de
que la disfunción mitocondrial está implicada en la patogenia de la ELA. En ratones
mutantes SOD1, la proteína mutada se acumula en vacuolas en el espacio
intermembranoso mitocondrial77, y muestra un aumento en la adhesión a la parte
exterior de la membrana dependiente de la edad. Se postula que este hecho conduce
a la disfunción de las organelas selectivamente en la médula espinal por impedir la
entrada de proteínas78. Se ha encontrado en tejidos de pacientes con ELA79 y en
modelos murinos mutantes SOD180 una función deficiente de la cadena respiratoria
12
INTRODUCCIÓN
asociada con daño oxidativo a proteínas y lípidos mitocondriales. Así, es posible que la
alteración de la regulación de la generación de energía metabólica contribuya a la
disfunción neuronal.
El almacenamiento de calcio esta alterado en las mitocondrias aisladas del
SNC de ratones mutantes SOD181, y puede aumentar la susceptibilidad de las
motoneuronas a la alteración de la homeostasis del calcio asociada a la
excitotoxicidad mediada por glutamato. También se ha encontrado en modelos de ELA
estrés del retículo endoplasmático que puede producir una alteración en el intercambio
de calcio entre el retículo y las mitocondrias82. Se piensa que la muerte celular en la
ELA está mediada por la activación de caspasas y apoptosis. El daño mitocondrial
podría contribuir a este proceso83.
En pacientes con ELA se ha apreciado una morfología alterada de las
mitocondrias en el músculo esquelético y en las motoneuronas medulares84. En
algunos modelos murinos mutantes SOD1 la vacuolización mitocondrial empieza
durante el estadio presintomático de la enfermedad, sugiriendo que se trata de un
evento temprano en la cascada patofisiológica de la lesión de la motoneurona77. La
morfología mitocondrial también está alterada en motoneuronas primarias y en células
NSC-34 que expresan SOD1 mutante85. El transporte axonal de mitocondrias está
afectado en los modelos experimentales de ELA, y es posible que una reducción en el
contenido de mitocondrias en la parte distal del axón, combinada con la afectación de
la función mitocondrial, conduzca a la axonopatía dying-back que se ve en la ELA86, 87.
3.5.3. Excitotoxicidad
Excitotoxicidad
El glutamato es el principal neurotransmisor excitador del SNC y ejerce su
función a través de una serie de receptores postsinápticos iono y metabolotropos. La
señal excitadora es apagada por la retirada del glutamato de la sinapsis por los
transportadores de recaptación metabolotrópicos. El más abundante es el EAAT2
(también conocido como SLC1A2 o GLT1). El daño resultante de la activación
excesiva de los receptores de glutamato o excitotoxicidad puede estar causado por un
13
INTRODUCCIÓN
aumento en los niveles sinápticos de glutamato o por una sensibilidad aumentada de
la neurona postsináptica al glutamato, resultado de la alteración de la homeostasis de
la energía en la neurona o de la expresión del receptor del glutamato88. La alteración
de la homeostasis del calcio intracelular, con la activación secundaria de sistemas
enzimáticos proteolíticos y generadores de radicales libres de oxígeno, y la
perturbación de la función mitocondrial de la producción de ATP son los componentes
clave de la excitotoxicidad89.
Los receptores AMPA median la mayoría de la neurotransmisión activadora
glutaminérgica en el SNC. Las motoneuronas son especialmente vulnerables a la
excitotoxicidad mediada por AMPA, generando lesiones axonales distales. La
permeabilidad al calcio del complejo del receptor AMPA está determinada
fundamentalmente por la subunidad GluR2, que se edita post-transcripcionalmente en
586 Gln/Arg situado en el segundo dominio transmembrana, haciendo el complejo del
receptor impermeable al calcio90. Las características especiales de las motoneuronas,
entre las que se incluye una expresión baja de GluR290 y de proteínas almacenadoras
de calcio91, hacen estas neuronas especialmente vulnerables a la toxicidad mediada
por los receptores AMPA.
Existen evidencias que implican a la excitotoxicidad como un mecanismo que
contribuye a la lesión de la motoneurona en la ELA, aunque no hay una evidencia
clara de que se trate de un mecanismo primario de la enfermedad. En algunos
pacientes con ELA los niveles de glutamato están elevados en el líquido
cefalorraquídeo92, y la expresión y actividad de EAAT2 están reducidas en las áreas
afectadas del SNC93-95, aunque no está claro que esto sea causa o consecuencia de la
pérdida de neuronas96. Hay estudios electrofisiológicos en humanos que demuestran
hiperexcitabilidad del sistema motor en estadios presintomáticos97 y tempranos98 de la
ELA. La evidencia sugiere que la regulación de la permeabilidad al calcio de los
receptores AMPA en el asta anterior de la médula puede estar alterada por una
edición anormal de la subunidad GluR2 del receptor AMPA99. Adicionalmente, se ha
identificado recientemente un gen relacionado con la ELA que codifica D-aminoácido
oxidasa (DAO). Esta enzima es responsable de la deaminación oxidativa de D-
14
INTRODUCCIÓN
aminoácidos, uno de los cuales (D-serina) es un activador y coagonista de receptores
de N-metil-D-aspartato (NMDA)100. Las mutaciones de DAO podrían potencialmente
contribuir a la lesión excitotóxica de las motoneuronas.
En el modelo murino SOD1 mutado se aprecian varios hallazgos que también
apuntan hacia que la excitotoxicidad tiene un papel en la patogenia de la ELA. Se ha
observado una alteración en las propiedades electrofisiológicas y un aumento en la
sensibilidad de las motoneuronas a la excitotoxicidad101, expresión alterada de la
subunidad del receptor AMPA, expresión y actividad de EAAT2 reducidas102, aumento
de la salida de glutamato de las terminaciones de los nervios de la médula espinal103,
reducción en el ratio inhibidor-estimulador de las sinapsis de las motoneuronas104 y
pérdida de la regulación astrocítica de la expresión de GluR2 en las motoneuronas
vecinas105.
3.5.4. Agregación proteica
Un rasgo cardinal de la ELA es la presencia de agregados patológicos de
proteínas, identificados como inclusiones ubiquitinadas106-108, siendo TDP-43 su
constituyente principal109. Es frecuente observar diversas alteraciones en los
neurofilamentos
107, 110.
Se aprecian inclusiones de SOD1 tanto en pacientes con ELA
familiar con mutación en este gen111 como en esporádica112. También se pueden
observar inclusiones citoplasmáticas de FUS en algunos pacientes con ELA familiar
asociada a FUS113, 114. Las proteínas que se encuentran en los agregados en la ELA
proporcionan pistas importantes acerca de la patogénesis de la enfermedad. La
pérdida del TDP-43 nuclear y su agregación en depósitos citoplasmáticos pueden ser
procesos patogénicos claves en la ELA familiar y esporádica. La afectación de los
neurofilamentos sugiere que su disfunción es importante en algunas formas de ELA. El
aumento en la fosforilación de los neurofilamentos en las motoneuronas puede
contribuir al enlentecimiento que se ha constatado en el transporte axonal115,
116.
Recientemente se ha detectado una alteración en el gen UBQLN2 que condiciona una
expresión defectuosa de ubiquilina 2 que, a su vez, produce una disfunción del
sistema ubiquitina-proteasoma. Esta disfunción produce una incapacidad de dicho
15
INTRODUCCIÓN
sistema para destruir proteínas siendo, probablemente, el evento causal generador de
los depósitos que se observan en la ELA40.
3.5.5. Alteración en la regulación
regulación del tráfico endosómico
La gran longitud de los axones de las motoneuronas las hace especialmente
sensibles a las alteraciones en la red que regula el tráfico de los endosomas. Se han
identificado múltiples mutaciones relacionadas con la ELA que afectan este
mecanismo celular como la mutación en el gen que codifica la alsina117, VAPB118,
optineurina119, CHMP2B120, 121, VCP122, 123 o FIG4124.
3.5.6. Alteración del transporte axonal
Las motoneuronas son células extremadamente polarizadas con largos axones
que requieren un adecuado flujo de componentes (RNAm, proteínas, organelas) tanto
de modo anterógrado como retrógrado para su buen funcionamiento. Tanto en el
modelo murino de SOD1 mutado86, 125-127 como en pacientes128-130 se han encontrado
diversas alteraciones que afectan este transporte. La alteración del transporte
retrógrado apoya la teoría dying-back de la enfermedad que afirma que la enfermedad
se origina en una alteración axonal. La alteración del transporte anterógrado
combinada con la disfunción de las mitocondrias puede provocar una disminución en
la generación de energía, especialmente en el extremo distal del axón.
3.5.7. Inflamación
Aunque la ELA no es primariamente una enfermedad autoinmune, hay un
considerable cuerpo de evidencia que apunta a que la inflamación juega un papel en
su patogenia. En el SNC de pacientes con ELA se puede apreciar activación de la
microglía
e
infiltrado
linfocitario
que
producen
citoquinas
inflamatorias
con
interleukinas, COX-2, TNFα y MCP-1131-134; en el líquido cefalorraquídeo hay IL-8 y
16
INTRODUCCIÓN
MCP-1135, signos bioquímicos de activación de la respuesta inmune en la sangre136 y
el complemento está activado137.
3.5.8. Estrés del retículo endoplasmático
Como ya se ha explicado, los agregados de proteínas intracitoplasmáticos son
una de las características histopatológicas típicas de la ELA. La alteración de la
conformación de las proteínas induce la ruta de respuesta de estrés del retículo
endoplasmático que corrige estas alteraciones mediante la acción de chaperonas138 y
puede llegar a suprimir la translación proteica y su degradación en el retículo139.
Aunque estos mecanismos son inicialmente citoprotectores, su activación continuada
puede llevar a la célula a entrar en apoptosis140. En los pacientes con ELA se ha
encontrado elevación de algunos marcadores de activación de esta ruta141 y en un
modelo murino de SOD1 mutada en el que se eliminó uno de los factores de
transcripción clave de esta ruta (X-box binding protein-1) se obtuvo un aumento
considerable de su supervivencia142.
3.5.9. Alteración en la regulación del procesamiento y transcripción del RNA
La atención en el procesamiento y transcripción del RNA como mecanismo
etiopatogénico de la ELA vino determinada por la identificación de TDP-43 como
componente importante de las inclusiones ubiquitinadas de la ELA109, así como la
descripción de mutaciones en FUS como alteración genética presente en un 4% de los
casos familiares de ELA y 1% de los esporádicos. Ambas proteínas tienen un papel
importante en la regulación de la transcripción del RNA y en su procesamiento143.
Adicionalmente, se han encontrado marcadores elevados de oxidación de RNA en
pacientes con ELA63.
17
INTRODUCCIÓN
3.5.10. Déficits de factores neurotróficos
Los factores tróficos tienen un papel importante en el desarrollo, la plasticidad y
la neurogénesis en el sistema nervioso central, así como en la reparación de sus
lesiones144. Estas propiedades los postulan como un posible factor patogénico en la
ELA. Se ha observado una disminución en los niveles de factores neurotróficos
(CTNF, BDNF, GDNF e IGF-1) en muestras post-mortem de pacientes y en modelos in
vitro de la enfermedad145-147. Así mismo, ratones con deleción del elemento de
respuesta a hipoxia del promotor de VEGF desarrollan un fenotipo de ELA148. Además,
el BDNF, CNTF, GDNF, IGF-1, VEGF, HGF, eritropoyetina y G-CSF se han utilizado
con buenos resultados en modelos animales e in vitro de ELA, demostrando casi todos
ellos un efecto protector contra la muerte celular -sea por apoptosis o por
exocitotoxicidad-, el mantenimiento de la placa neuromuscular, y mejora en la
supervivencia de los ratones144.
3.5.11. Papel de las células no neuronales
Un concepto importante de relativamente reciente elaboración y creciente
importancia es el que afirma que la muerte celular no es un proceso centrado
únicamente en las propias motoneuronas: las células del microambiente que rodea a
las motoneuronas tienen un papel crucial. En ratones quiméricos que expresaban
SOD1 mutado únicamente en la glía, las motoneuronas normales desarrollaron signos
de ELA149. En otro experimento en el que las motoneuronas tenían el SOD1 mutado se
correlacionó positivamente la supervivencia de las mismas, así como la supervivencia
de los ratones quiméricos, con la proporción de células no neuronales que no tenían el
SOD1 mutado.
En otro modelo, cuando el SOD1 mutado fue eliminado de la microglía no se
alteró el inicio de la enfermedad, pero la progresión de la misma se enlenteció en un
50%150, sugiriendo que el inicio de la enfermedad y su progresión y propagación
representan dos fases distintas de la misma, poniendo de relieve nuevas posibilidades
terapéuticas.
18
INTRODUCCIÓN
Aunque la expresión restringida a los astrocitos de SOD1 mutado no produce
un fenotipo de ELA151, el silenciamiento selectivo del gen mutante en los astrocitos sí
enlentece significativamente la progresión de la enfermedad en ratones con SOD1
mutado152. En cocultivos, los astrocitos procedentes de ratones con SOD1 mutado son
tóxicos tanto para motoneuronas de cultivos primarios como para motoneuronas
derivadas de células embrionarias153. Este hallazgo indica que los astrocitos que
expresan el SOD1 mutado o bien ejercen efectos tóxicos o son incapaces de
proporcionar el soporte trófico que requieren las motoneuronas.
Se han obtenido resultados contradictorios cuando la expresión de SOD1
mutado se limitó a las motoneuronas. La cantidad de SOD1 mutado que se expresa
parece ser crucial para desencadenar el daño celular e iniciar la enfermedad. Los
ratones que no tienen SOD1G37R en los oligodendrocitos tienen un curso de la
enfermedad más agresivo que el de los ratones cuyos oligodendrocitos sí expresan el
SOD1 mutado, y ese fenotipo se acompaña de una expresión reducida de IGF-1154. La
expresión exclusiva de SOD1G93A en las células de Schwann no altera a las
motoneuronas, y aumentar la expresión de SOD1 mutado en las células de Schwann
no exacerba el fenotipo de la enfermedad155. De modo que, aunque la expresión de
SOD1 en los oligodendrocitos y las células de Schwann altera las propiedades de
dichas células, no parece ser suficiente para causar la degeneración de las
motoneuronas.
Un estudio reciente examinó cómo las propiedades de los astrocitos cambian
en presencia de SOD1 mutado y contribuyen a la degeneración de las
motoneuronas156. Se identificaron como los componentes claves del efecto tóxico de
las astrocitos sobre las motoneuronas, la disminución del soporte metabólico de la
motoneurona por disminución de la liberación de lactato por parte de los astrocitos y la
activación de la ruta de señalización pro-NGF – receptor p75. Se pudo eliminar esta
toxicidad aumentando el aporte de lactato a las motoneuronas, disminuyendo los
niveles de NGF y bloqueando el receptor p75.
19
INTRODUCCIÓN
3.5.12. Resumen
En la figura 1 se encuentran resumidos todos los mecanismos patogénicos
implicados en la ELA. Como puede observarse, la ELA es una enfermedad compleja
en cuya generación intervienen tanto las alteraciones de varias rutas celulares de las
motoneuronas como los trastornos de su interacción con las células vecinas no
neuronales. La microglía activa la cascada inflamatoria mediante la secreción de MCP1 y otras citoquinas. Los astrocitos contribuyen al daño de las motoneuronas mediante
varios mecanismos, incluyendo la liberación de mediadores inflamatorios como el
óxido nítrico (NO) y PEG2, una reducción en la expresión y actividad de EAAT2 –el
transportador de la recaptación de glutamato-, una reducción en la liberación de
lactato, y la activación de la señalización del receptor pro-NGF-p75. Además, las
motoneuronas sufren también una alteración en la transcripción y procesamiento del
RNA que, junto con la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS),
contribuye a generar una conformación aberrante de las proteínas. Estas proteínas
aberrantes pueden formar agregados que llevan a una alteración en la función de los
proteasomas y a estrés del retículo endoplasmático y, finalmente, a la activación de las
rutas de autofagia y apoptosis. La alteración de la función de las mitocondrias y de la
regulación del manejo del calcio son dos componentes importantes del daño de la
motoneurona que también llevan a la activación de la cascada apoptótica. La
alteración del transporte axonal puede contribuir a un déficit energético en la parte
distal del axón y a la axonopatía “dying-back” que se observa en la ELA. Finalmente,
las motoneuronas pueden producir y secretar subunidades del complemento que
constituyen señales importantes de estrés celular para las células vecinas157.
20
INTRODUCCIÓN
Figura 1. Mecanismos moleculares de daño de la motoneurona en la ELA157.
21
INTRODUCCIÓN
3.6. TRATAMIENTO
TRATAMIENTO
El tratamiento de los afectados de ELA debe ser integral, multidisciplinar y
comenzar desde el momento mismo de la comunicación del diagnóstico al paciente y a
sus familiares o potenciales cuidadores. Teniendo en cuenta el carácter progresivo de
la enfermedad y su pronóstico, además del tratamiento etiopatogénico, es fundamental
el tratamiento sintomático adecuado, con el fin de mejorar la calidad de vida del
paciente18.
El inicio precoz del tratamiento integral requiere, en primer lugar, un diagnóstico
también precoz de la enfermedad, siendo deseable la reducción del tiempo promedio
que transcurre desde el inicio de los síntomas y el diagnóstico56. La Federación
europea de sociedades neurológicas158, la Academia americana de Neurología159, 160 y
el Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad español18 han desarrollado
guías clínicas basadas en la evidencia para el tratamiento de los pacientes con ELA
que han supuesto una mejora significativa de los síntomas incapacitantes para los
pacientes161, y han demostrado una mejoría en la calidad de vida y en la
supervivencia162.
A pesar de que se han realizado más de 30 ensayos fase II y fase III163, 164 y de
haber probado al menos en ensayos fase I más de 48 compuestos165 que poseían
fundamento fisiopatológico (figura 2) y habían presentado resultados esperanzadores
en los ensayos en modelos in vitro y murinos, únicamente el Riluzol ha demostrado
modificar el curso de la enfermedad166. El Riluzol fue capaz de aumentar la
supervivencia de los pacientes en 3-6 meses en dos ensayos clínicos aleatorizados y
controlados167, 168. Parece que el beneficio obtenido con este fármaco fue superior en
los hospitales con unidades especializadas multidisciplinares de ELA que en otros
hospitales169 y en los pacientes con una afectación funcional moderada170.
22
INTRODUCCIÓN
Figura
Figura 2 Objetivos terapéuticos y fármacos ensayados171.
23
INTRODUCCIÓN
La falta de resultados positivos se ha relacionado con el insuficiente
conocimiento de los aspectos etiopatogénicos, con la falta de modelos animales
adecuados de ELA esporádica para realizar estudios preclínicos (se utiliza
fundamentalmente el modelo transgénico para la mutación de SOD como modelo de
enfermedad), con la falta de biomarcadores que sean predictivos de supervivencia y
con la necesidad de enfoques terapéuticos que engloben múltiples dianas
patogénicas16, 172.
Por este motivo, el tratamiento sintomático continúa siendo la base
fundamental del manejo de los pacientes de ELA173. Y para algunos pacientes esos
tratamientos no solo alivian los síntomas, sino que también mejoran su supervivencia y
su calidad de vida159,
160.
El cuidado óptimo de los pacientes con ELA se realiza en
unidades multidisciplinares donde los psicoterapeutas, terapeutas ocupacionales,
logopedas, neumólogos, gastroenterólogos y trabajadores sociales colaboran con los
neurólogos para guiar el tratamiento sintomático durante el transcurso de la
enfermedad162.
Los
modelos
multidisciplinares
de
tratamiento
aumentan
la
supervivencia, reduciendo el riesgo de muerte en un 45% a los 5 años. En
comparación con los pacientes tratados en servicios de neurología general, los
pacientes tratados en unidades especializadas tienen una mejor calidad de vida,
apreciándose los beneficios desde la primera visita162.
La función respiratoria y la nutrición son las principales preocupaciones para
los pacientes con ELA, siendo la insuficiencia respiratoria la principal causa de
muerte158. La ventilación no invasiva mejora la calidad de vida de los pacientes y
aumenta su supervivencia174. Las recomendaciones para instituir la ventilación no
invasiva se basan en una combinación de síntomas (disnea y ortopnea) y signos de
debilidad de la musculatura respiratoria como una desaturación significativa en la
oximetría nocturna, aumento de la presión parcial de CO2 ≥ 65 mm Hg y reducción de
la capacidad vital forzada (CVF) por debajo del 80% o sniff nasal de menos de 40 cm
H2O158, 173. Los pacientes con una afectación bulbar importante y sialorrea pueden no
tolerar la ventilación no invasiva siendo, por tanto, de crucial importancia un adecuado
manejo de las secreciones43. La ventilación invasiva vía traqueotomía es una opción
24
INTRODUCCIÓN
en los pacientes que no toleran la ventilación no invasiva, o cuando esta forma de
ventilación ya no es suficiente por la progresión de la debilidad muscular160. Aunque la
ventilación invasiva aumenta la supervivencia, tiende a no utilizarse en la mayoría de
los países por la dificultad práctica en aplicarla, el gasto y la profunda disminución en
la calidad de vida que supone175. Como tratamiento sintomático, la morfina subcutánea
proporciona un gran alivio a los pacientes que tienen disnea de reposo176.
La malnutrición es un determinante fundamental del pronóstico177. El desarrollo
de la malnutrición en la ELA es multifactorial, incluyendo la disminución en la ingesta
provocada por la disfagia así como hipermetabolismo160, 178. Entre un 50% y un 60% de
los pacientes con ELA tienen un estado hipermetabólico179 que parece mantenerse
estable durante el curso de la enfermedad, y es independiente de la edad, el sexo y la
masa no grasa177. El aumento del metabolismo se asocia con disminución de la
supervivencia177. La inserción de un tubo de gastrostomía percutáneo asegura una
ingesta calórica y de fluidos suficiente, y debe ser ofrecida a los pacientes que tienen
una pérdida significativa de peso, incluso en ausencia de disfagia158. La colocación del
tubo de gastrostomía debe ser abordada pronto con el paciente porque la morbilidad
del procedimiento aumenta cuando la capacidad vital forzada es inferior al 50%160.
Para mejorar la calidad de vida de los pacientes es esencial estar atento a los
múltiples síntomas que pueden aparecer durante el desarrollo de la enfermedad180 (ver
tabla 2). La fase terminal de la ELA puede asociarse a inquietud, ansiedad, dolor y
disnea, y son necesarios cuidados paliativos multidisciplinares bien coordinados43.
3.7. PRONÓSTICO
El análisis de muestras numerosas de pacientes extraídas de poblaciones
pertenecientes a ensayos clínicos y de los registros refleja consistentemente que la
supervivencia media desde el inicio de los síntomas para la ELA es de 2-3 años para
los casos de inicio bulbar y 3-5 años para los de inicio medular16. Los grandes estudios
clínicos de cohortes han mostrado una supervivencia a los 3 y 5 años del 48% y el
25
INTRODUCCIÓN
Tabla 2 Tratamientos sintomáticos en la ELA
Debilidad y discapacidad
Aparatos ortopédicos
Fisioterapia
Ayudas adaptativas (ej. andador, silla de ruedas)
Disfagia
Valoración por logopeda y nutricionista
Modificaciones de la dieta
Técnicas para tragar con seguridad
Tubo de gastrostomía
Disnea y tos débil
Soporte ventilatorio
Morfina o benzodiacepinas
Fisioterapia torácica
Máquina de aspiración
Técnicas de tos manualmente asistida
Dolor (dolor musculoesquelético y calambres,
fasciculaciones y espasticidad, dolor por inmovilidad)
Fisioterapia
AINEs
Relajantes musculares (baclofen, toxina botulínica)
Anticonvulsionantes (ej. gabapentina)
Cambios posturales y cuidado de las zonas de presión
Opioides
Colchones antiescaras
Disartria
Valoración por logopeda
Ayudas a la comunicación
Educación de la familia y cuidadores
Cambios cognitivos (disfunción del lóbulo frontal o
demencia)
Explicar los síntomas a los familiares
Antidepresivos
Sialorrea
Antidepresivos anticolinérgicos (ej. amitriptilina)
Anticolinérgicos (ej. bromuro de glicopirronio)
Toxina botulínica
Irradiación de las glándulas salivares
Productos de higiene bucal
Aspiración
Saliva espesa
Remedios naturales (ej. papaya)
Asegurar una hidratación adecuada
Nebulizaciones de suero fisiológico y de N-acetilcisteína
Aspiración
Higiene bucal
Depresión y ansiedad
Consejo
Benzodiacepinas
Antidepresivos
Labilidad emocional
Educar a los pacientes y cuidadores
Amitriptilina
Benzodiacepinas
Dextrometorfano / sulfato de quinidina
Alteración del sueño
Tratar el problema subyacente
Revisión neumológica
Ventilación no invasiva
Benzodiacepinas, antidepresivos tricíclicos
Estreñimiento
Cambios dietéticos (ej. aumentar la ingesta de líquidos y
fibra)
Usar formulaciones ricas en fibra, salvado o no digeribles
Laxantes orales (Movicol o supositorios)
26
INTRODUCCIÓN
24% respectivamente, con un 4% de los pacientes vivos durante más de 10 años181,
182.
Sin embargo, la supervivencia a 5 años comunicada en los estudios poblacionales
es mucho menor, moviéndose en un rango de 4-30%20.
Los factores pronósticos que emergen consistentemente de los estudios
poblacionales y de las cohortes clínicas son: el lugar de inicio de la enfermedad
(bulbar vs. medular)183-187, edad al inicio de los síntomas184-189, el tiempo desde el inicio
de los síntomas hasta el diagnóstico187, el descenso de la capacidad vital forzada
basal184, 186, 190, categoría de El Escorial al diagnóstico183, 189 y el uso de riluzol169, 186.
4. LA TERAPIA CELULAR COMO ESTRATEGIA TERAPÉUTICA
Las células madre o células “stem” se definen por su capacidad de
autorrenovación y diferenciación en, al menos, un tipo celular maduro. Otra
característica de las células madre es que no tienen estructuras específicas de tejido
que les permitan desarrollar funciones especializadas, pero son las mediadoras de la
reconstitución funcional “in vivo”. Aunque las células madre se pueden subclasificar
atendiendo a su tejido de origen o a su potencial para diferenciarse en uno o más tipos
específicos de células maduras, su caracterización es difícil y está mal definida.
Algunas células madre son más pluripotentes que otras y se admite que el potencial
de diferenciación y autorrenovación disminuye a medida que se avanza en el
desarrollo embrionario. Así la única célula capaz de diferenciarse en todas las células
y tejidos de un individuo es el cigoto (célula madre totipotente), ya que puede generar
todos los tejidos del embrión, del feto y los extraembrionarios, como la placenta y el
cordón umbilical191,
192.
Las células madre embrionarias proceden de la masa celular
interna del blastocisto y pueden diferenciarse en células de las tres capas germinales
embrionarias, ectodermo, mesodermo y endodermo; son por tanto células madre
27
INTRODUCCIÓN
pluripotentes pero no dan lugar a un individuo completo. Las células madre presentes
en los tejidos tras el nacimiento (células madre del adulto o somáticas), tienen su
capacidad de diferenciación restringida a las células de la capa embrionaria de la que
proceden. Son responsables de la reparación de ese tejido a lo largo de toda la vida,
por lo que se han denominado células madre tisulares193. Las células madre del adulto
más conocidas y estudiadas son las células madre hematopoyéticas, pero también
existen en el sistema nervioso, el hígado, el intestino, la piel o el pulmón. En la última
década hemos asistido a una avalancha de nuevos conocimientos sobre la biología de
las células madre que desafían los dogmas clásicos del desarrollo y potencialidad
celular192,
194-197.
Se ha generado un enorme interés en la posibilidad de usar las
células madre como fuente de reposición / reparación celular en enfermedades
isquémicas, degenerativas, genéticas o neoplásicas y como fuente de efectos tróficos
de carácter mecánico o humoral.
4.1. Las células
células madre del adulto
Según las teorías del desarrollo hasta ahora admitidas, el potencial de
diferenciación de las células madre del adulto está restringido a la capa embrionaria de
la que proceden. La programación de las células madre del adulto parece producirse
durante el desarrollo embrionario y se perfila dentro del tejido en el que se asientan, de
modo que fabrican, por defecto, las células de dicho tejido. A finales de los años 90, se
desarrollaron estudios que demostraban una versatilidad previamente no reconocida
en las células madre del adulto, acuñándose el concepto de “plasticidad”. En los
experimentos animales más demostrativos, células procedentes de la médula ósea
adquirían características fenotípicas de tejidos de otra capa embrionaria como el
sistema nervioso central o el hígado cuando eran trasplantadas en esos tejidos y
sometidas a la influencia de otro micro-medio ambiente191, 194, 197, 198.
Es motivo de controversia si los fenómenos de plasticidad son debidos a la
presencia en la médula ósea de células madre pluripotenciales tipo MAPCs (células
progenitoras multipotentes del adulto), si por el contrario las células madre
hematopoyéticas son capaces de reprogramación genética para transformarse en
28
INTRODUCCIÓN
células
de
otros
tejidos
(transdiferenciación)
en
respuesta
a
señales
del
micromedioambiente o estrés biológico, o si todo es consecuencia de la fusión de las
células madre con las células locales formando células híbridas199. En esta polémica
son importantes los estudios que resaltan el decisivo papel que el microambiente o
“nicho” local ejerce en el reclutamiento de las células madre circulantes hacia un tejido
concreto, y en la generación de señales que inducen la activación de genes
mediadores de la diferenciación, maduración y estabilidad funcional200. En este
sentido, se considera que las lesiones tisulares favorecen la generación de dichas
señales al liberar moléculas como el SDF-1 que son quimiotácticas para el CXCR4, su
ligando específico situado en la superficie de las células madre hematopoyéticas191, 195.
Las características diferenciales entre los distintos tipos de células madre, en principio
definidas por la actividad de gradientes temporales y espaciales de información
posicional derivados del entorno en el que se localizan, pueden revertir cuando éstas
son ubicadas en un nuevo nicho, readquiriendo la habilidad para generar propiedades
celulares nuevas, incluyendo el potencial trófico celular. Estos estudios han generado
unas enormes expectativas al sugerir que las células madre adultas de la médula ósea
o circulantes podrían utilizarse como fuente de reposición/soporte celular para tratar
una gran variedad de enfermedades de tejidos no hematopoyéticos. Los datos más
claros en este aspecto muestran que las células madre infundidas también ejercen un
efecto
beneficioso
indirecto
(“paracrino”),
al
proporcionar
factores
tróficos
(antiapoptóticos, angiogénicos, anti-inflamatorios), que protegen a las células dañadas,
y otras señales que estimulan la proliferación de los progenitores endógenos201-204.
Nuestro grupo ha aportado datos consistentes con la potencialidad neural de la célula
stem murina, y también con su capacidad neuroprotectora, sin producir efectos
estructurales o funcionales adversos205-208. La infusión de células madre autólogas
procedentes de la médula ósea podría estar indicada para reparar daños tisulares
agudos, como los causados por fenómenos isquémicos o por toxinas. En estas
patologías también se han investigado con resultados esperanzadores células madre
procedentes de la membrana amniótica, el cordón umbilical, el tejido adiposo o incluso
la pulpa dental192, 205, 209-215. En las enfermedades genéticas y en las degenerativas, se
podrían utilizar células madre alogénicas o células madre autólogas modificadas “in
29
INTRODUCCIÓN
vitro”, no solo para reponer células sino como vehículo óptimo de factores tróficos
protectores o de expresiones génicas dirigidas en los tejidos.
4.2. Células madre neurales en modelos de degeneración espinal
En las enfermedades neurodegenerativas de la motoneurona, tal como la
esclerosis lateral amiotrófica y la distrofia muscular espinal, las motoneuronas mueren
progresivamente durante un corto período de tiempo. Estas enfermedades
clínicamente se manifiestan como una progresiva pérdida de la fuerza muscular y
atrofia muscular, lo cual conduce a una parálisis y muerte prematura. Como ya se ha
dicho, en pacientes de ELA la muerte suele ocurrir entre 3 y 5 años después del inicio
de los síntomas clínicos181,
182.
Las terapias farmacológicas intentadas hasta el
momento no detienen la progresión en los déficits ni restauran la función motora
perdida172, 216, 217.
Este desalentador panorama contrasta con los esperanzadores resultados
obtenidos en diferentes modelos animales de muerte neuronal, en los que se
trasplantaban progenitores neurales en las áreas dañadas de la médula espinal. Esta
estrategia puede ser un prometedor enfoque para modificar la historia natural de estas
enfermedades, protegiendo a las motoneuronas de la degeneración e incluso
restaurando la función motora149,
205, 207, 208, 211, 212, 218-225.
Aunque varios autores han
publicado que es factible el trasplante de progenitores neurales obtenidos de cerebros
de adultos y de embriones en modelos de lesión medular con resultados regenerativos
positivos, todos ellos coinciden en la limitada capacidad de diferenciación de las
células trasplantadas en la médula espinal226-228. La posible aplicación de esta
terapéutica en humanos presenta dificultades casi insalvables. La primera, derivada de
la obtención de progenitores neurales humanos con calidad y cantidad adecuadas
para su uso terapéutico. Estas células deben proceder de tejido nervioso viable (fetos
o células derivadas de biopsias), y su aplicación requeriría la inmunodepresión
permanente tras el alotransplante211, 212.
30
INTRODUCCIÓN
Otro tipo de trabajos han demostrado que el trasplante de células derivadas de
una línea neuronal humana, obtenidas a partir de una línea celular de teratocarcinoma
humano, retrasa el inicio de la sintomatología asociada a la ELA en un modelo animal
de la SOD1218, 229, 230. En un modelo de quimerismo celular en ratón, se ha demostrado
que células no neurales de genotipo silvestre en la sustancia gris de la médula espinal
prolongan la supervivencia de neuronas motoras mutantes de ratones SOD1149.
En estos trabajos se demuestra pues, que la presencia de células sin la
mutación de las células del huésped, prolonga la supervivencia de la motoneuronas
espinales en modelos animales de degeneración de motoneuronas.
4.3. Células madre de la médula ósea en enfermedades neurodegenerativas.
Se ha estudiado el potencial neural de células madre derivadas de médula
ósea en el cerebro, y múltiples trabajos sugieren que son capaces de diferenciarse en
neuronas, astrocitos y microglia196-198, 231-233. El potencial regenerador de las células de
la médula ósea en lesiones desmielinizantes de la médula espinal también ha sido
explorado234-236. Sin embargo, no está del todo claro cuál es el mecanismo básico que
subyace en la reparación de las motoneuronas en la ELA. Dada la complejidad
patogénica de la enfermedad, es posible que la terapia celular determine cambios a
varios niveles. Además del eventual efecto regenerador, recientemente se ha puesto
un especial énfasis en el impacto favorable de las células trasplantadas sobre el
micromedioambiente, proporcionando células de la microglía y astrocitos no
disfuncionales, y como fuentes de factores neurotróficos que induzcan una mayor
supervivencia y/o disminuyan las muerte de las motoneuronas201, 211, 212, 237, 238.
Si los efectos beneficiosos encontrados son debidos a un subgrupo celular
concreto es motivo de controversia. Aunque las células madre mesenquimales tienen
capacidad multipotente in vitro y son conocidas sus propiedades anti-inflamatorias e
inmunomoduladoras, otros tipos celulares como las MAPC, las células madre
hematopoyéticas, las “very small embrionic-like stem cells” (VSELs)
239,
o los
precursores de las células dendríticas, identificadas en la fracción mononuclear de la
31
INTRODUCCIÓN
médula ósea, también tienen capacidad multipotente o inmunomoduladora in vitro, por
lo que no es descartable que en mayor o menor medida todas sean necesarias para
una acción multifactorial. Estos factores son importantes a la hora de considerar el
diseño de ensayos clínicos procedentes de médula ósea, ya que la selección de
determinados subgrupos celulares podría alterar los eventuales efectos esperados en
base a la experimentación animal202, 203, 205, 211, 212.
Otras preguntas por resolver incluyen la fuente idónea de células madre, el tipo
celular elegido, su cantidad óptima de células a infundir o la vía de administración más
eficaz203, 204, 220, 240-242. Así, además de la médula ósea, el uso de células madre de la
membrana amniótica, el cordón umbilical, la pulpa dental o la grasa está siendo
investigado con éxito205,
209-211, 213-215, 225, 243.
Por otro lado, es conocido que en la
médula ósea coexisten un grupo heterogéneo de células madre con diversas
potencialidades de autorenovación y especificación, incluyendo células madre
hematopoyéticas, mesenquimales, VSELs239 y MAPC. Este es un factor importante a
considerar en el diseño de ensayos clínicos con células madre procedentes de la
médula ósea, ya que la selección de determinados subgrupos celulares podría limitar o
ampliar la eficacia para una patología concreta, y esto es motivo de estudio191, 192, 194,
244, 245.
Tampoco está del todo clara la vía óptima de infusión de las células madre, o si
esta podría ser diferente según las patologías a tratar. En los últimos años se han
generado datos experimentales que sostienen el beneficio de la administración de
células madre de médula ósea humanas por vía intratecal en modelos animales de
ELA204,
246.
También se está explorando la vía intratecal con el objetivo de reparar
motoneuronas en pacientes con enfermedades neurodegenerativas247. La vía
intratecal ya ha sido utilizada en humanos de forma segura, como vehículo de infusión
de proteínas, fármacos o factores neurotróficos248-250. Algunos autores defienden esta
vía de infusión celular en la terapia celular de enfermedades neurodegenerativas, dado
que es una técnica de rutina en la práctica médica, sus efectos secundarios son leves
y transitorios y mucho menos relevantes que la inyección intraespinal204,
246, 247.
Sin
embargo, es preciso tener más datos sobre su seguridad y particularmente de su
32
INTRODUCCIÓN
eficacia, demostrando que la barrera hemato-encefálica no es un problema para esta
modalidad de infusión.
En conjunto, los resultados preliminares obtenidos en modelos animales,
convierten a la terapia con células madre en un prometedor y novedoso enfoque que
puede abrir nuevas vías terapéuticas en una enfermedad irremediablemente mortal
como la ELA, que actualmente no dispone de tratamientos eficaces, y que dada su
condición de enfermedad huérfana requiere con urgencia el desarrollo de nuevos
ensayos clínicos16, 163.
Los investigadores de nuestro grupo liderados por el Prof. Salvador Martínez
en el Instituto de Neurociencias de Alicante, junto con el Prof. Moraleda en el HUVA,
han desarrollado una línea experimental cuyo objetivo es establecer los fundamentos
científicos del uso de células madre derivadas de la médula ósea, como terapia celular
en pacientes con ELA, cuyos resultados han sido publicados205-208,
225.
Para ello se
puso a punto un modelo animal de enfermedad de la motoneurona, y estudiamos la
capacidad de las células madre de la médula ósea inyectadas en la médula espinal del
animal para enlentecer la progresión de la enfermedad. La ventaja del uso de células
madre de la médula ósea es la posibilidad de realizar el trasplante en pacientes de
ELA y MSD, obteniendo las células del propio paciente (autotrasplante), eliminando el
problema del rechazo u otras reacciones inmunes y de la disponibilidad de
donantes205, 211.
El animal modelo empleado en estos estudios, muscle deficient (mdf), posee
una mutación espontánea en el cromosoma diecinueve, que determina un fenotipo
cuya manifestación clínica es una progresiva parálisis y atrofia de la parte trasera del
cuerpo251. Las alteraciones patológicas son muy similares a la ELA y consisten
principalmente en degeneración de las motoneuronas acompañadas de astrogliosis.
Este ratón ha sido propuesto como modelo genético de enfermedades como la ELA y
MDS252. Como se ha comentado, el propósito de nuestro trabajo fue estudiar el
potencial de las células madre obtenidas de la médula ósea de animales adultos para
mejorar la función motora y rescatar motoneuronas de la degeneración. Las células
madre de la médula ósea se trasplantaron en la región L4-S1 de la médula espinal de
33
INTRODUCCIÓN
animales modelo de ELA (mdf) de entre 10 y 15 semanas de edad, en los cuales la
sintomatología se manifestaba claramente. Después de un período de supervivencia
los animales se sometieron a meticulosas pruebas funcionales, mediante test de
comportamiento y medidas de electromiografía, y análisis de histología e
inmunohistoquímica post-mortem
251.
Con respecto a los controles, los ratones
trasplantados demostraron una mejoría de la función motora que se acompañó de un
incremento significativo en la supervivencia de las motoneuronas en la médula espinal.
El examen histológico e inmunohistoquímico reveló que las células madre inyectadas
sobrevivían en la médula espinal, y que no existía un proceso de “transdiferenciación”,
sino que conservaban marcadores de médula ósea y se disponían alrededor de las
motoneuronas
aportando
factores
neurotróficos
(figura
3).
Un
análisis
inmunohistoquímico (anti-GDNF) y molecular paralelo (expresión del gen GDNF por
hibridación in situ, así como concentración de GDNF por ELISA), aportó evidencias de
que el efecto estaba mediado por el factor GDNF (figura 4). También se realizaron
estudios funcionales que demostraban una mejoría de la función motora, y el recuento
de motoneuronas demostró un aumento muy significativo en la supervivencia de las
motoneuronas en la médula espinal sacra de los animales tratados con respecto al
grupo control. El mecanismo neurotrófico dependiente de GDNF se confirmó al
desaparecer el efecto beneficioso del trasplante cuando la médula ósea utilizaba
procedía de un ratón knock out para GNDF205, 206, 225.
34
INTRODUCCIÓN
A
B
Figura 3 Disposición de las células de médula ósea alrededor de las motoneuronas. A:
tinción de violeta cresil. B: células de médula ósea donante marcadas con GFP,
motoneuronas marcadas retrógradamente con rodamina206.
Figura 4 Neurotrofismo mediado por GDNF. Las células de médula ósea inyectadas
migran al asta anterior (D) y secretan GDNF. A: GDNF medido por ELISA en ratones
wild-type (WT), mdf sintomáticos no operados (NO), mdf operados a los que no se han
inyectado células (SO), inyectados con células de médula ósea (hSC). B y C:
expresión de GDNF por hibridación in situ en las células infundidas GFP positivas. E, F
y G: secreción de GDNF por las células GFP positivas infundidas206.
35
INTRODUCCIÓN
4.4. Ensayos clínicos de terapia celular en pacientes con ELA.
En el momento de plantear nuestro estudio solo se había publicado un ensayo
clínico de terapia celular en pacientes con ELA253. En este ensayo se incluyeron 7
pacientes con ELA de debut medular, con compromiso funcional severo de los
miembros inferiores y leves de los superiores. Los pacientes no presentaban signos de
insuficiencia respiratoria (CVF>50% y polisomnografía normal). Se obtuvo médula
ósea de estos pacientes por punción de su espina ilíaca posterior. Se separaron las
células adherentes (mesenquimales) y se expandieron en cultivo durante 3-4
semanas. El producto final obtenido se resuspendió en 2 ml de líquido cefalorraquídeo
autólogo, que se inyectó directamente en la médula espinal, quirúrgicamente expuesta
en sus niveles T7 a T9 mediante laminectomía. Se escogieron estos niveles primero
porque, desde un punto de vista quirúrgico, el riesgo de producir una lesión de la
médula ósea es menor que a niveles más rostrales. En segundo lugar, porque la
hipotética reinervación neuronal a ese nivel tenía una mayor probabilidad de ser
detectada debido a la menor distancia entre la médula y el músculo; y finalmente,
porque cualquier evidencia de un aumento en el reclutamiento muscular no podía ser
resultado de una lesión medular iatrogénica, como, por ejemplo, por hipertonía
muscular. La duramadre fue abierta en su línea media y las células fueron inyectadas
en la parte más central de la médula con una cánula asociada a una jeringa
Hamilton253.
Ningún paciente experimentó eventos adversos severos como muerte, fallo
respiratorio o déficits neurológicos permanentes. Los eventos adversos menores
fueron: dolor intercostal (4 pacientes), que remitió en una media de 3 días (rango 1-6)
desde la cirugía, y disestesias en las piernas (5 pacientes), que remitieron en un
tiempo medio de 6 semanas (rango 1-8) tras la cirugía. Ningún paciente experimentó
disfunción vesical o intestinal, o déficit motor de los miembros inferiores. No hubo
complicaciones anestésicas. La Resonancia nuclear magnética realizada a los 3 y 6
meses del implante no mostró evidencia de cambios estructurales de la médula
espinal o aumentos de señal que pudieran sugerir una proliferación celular anormal,
comparando con las RNM basales. Los potenciales somatosensoriales evocados por
36
INTRODUCCIÓN
estimulación del nervio tibial que mostraron un retraso leve en la conducción 3 días
después de la cirugía, se normalizaron al primer mes del trasplante253.
Todos los pacientes aceptaron bien el procedimiento y no mostraron
modificaciones significativas de su estado psicológico o de su calidad de vida. La
fuerza muscular (evaluada mediante la escala MRC) disminuyó durante los 6 meses
previos al trasplante en todos los pacientes. Al tercer mes tras el implante de células
madre se hizo evidente una tendencia hacia el enlentecimiento de la disminución lineal
de fuerza muscular en 4 pacientes en los grupos musculares proximales de los
miembros inferiores, mientras que en 2 pacientes se observó un aumento leve en la
fuerza de los mismos grupos musculares253.
En una publicación posterior254 Mazzini et al. confirmaban que, tras 2 años de
seguimiento, los pacientes no habían desarrollado efectos secundarios permanentes o
cambios en la médula espinal por RNM sugestivos de proliferación celular anormal
(figura 5). También objetivaron en esos 2 años de seguimiento un enlentecimiento de
la disminución lineal de la capacidad vital forzada en 4 de los 7 pacientes tratados
(figura 6). Notablemente, este efecto se correlacionaba con el nº de células infundido.
Figura 5 Evolución radiológica en el ensayo de Mazzini et al. Se observa un seroma
postquirúrgico, sin daño medular ni aparición de neoformaciones (cortesía de la Dra.
Mazzini).
37
INTRODUCCIÓN
Figura 6 Evolución de la capacidad vital forzada en el ensayo de Mazzini et al. Puede
apreciarse un enlentecimiento de la evolución tras la terapia celular en los pacientes 2
y 4 (cortesía de la Dra. Mazzini).
Aunque este ensayo es muy valioso y mostraba resultados preliminares
esperanzadores en cuanto a la factibilidad de la terapia celular en pacientes con ELA,
ha sido criticado por tener un escaso número de pacientes, un seguimiento corto y una
información relativamente escasa con respecto a parámetros de seguridad y eficacia.
Además, en este ensayo se empleaban células mesenquimales de médula ósea en
cultivo con una tipificación incompleta, y no se aportaba ningún dato con respecto al
mecanismo por el cual las células podrían ejercer su efecto beneficioso253.
Por otro lado, y como previamente hemos expuesto, se admite que en la
médula ósea coexisten un grupo heterogéneo de células madre con propiedades
intrínsecas diversas y también con diferentes potenciales de reparación funcional
incluyendo células madre hematopoyéticas, mesenquimales, VSELs, y MAPC192, 211, 212,
239.
Todas estas células se pueden aislar a partir de la fracción mononuclear del
38
INTRODUCCIÓN
aspirado medular. De modo que al expandir estas células en cultivo y seleccionar un
subgrupo determinado de ellas, se corre el riesgo de perder o disminuir el potencial
neuroreparador que interesa para las enfermedades neurodegenerativas205, 211, 212.
En consecuencia y con los antecedentes de nuestros estudios preclínicos
previos, nos planteamos el ensayo clínico que es la base de esta memoria de
investigación.
39
INTRODUCCIÓN
40
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
41
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
42
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
La
Esclerosis
Lateral
Amiotrófica
es
una
enfermedad
que
conduce
irremediablemente a la muerte en una media de tres años tras el diagnóstico. Aunque
la enfermedad no es muy frecuente, sí produce un gran impacto socio-económico ya
que los pacientes no pueden cuidar de sí mismos y requieren un cuidador familiar y un
equipo multidisciplinario de atención.
Actualmente no existe ningún tratamiento efectivo, lo que determina que los
pacientes sufran un deterioro inexorable desde el diagnóstico, con evidencia de
parálisis progresiva, habitualmente ascendente, hasta la inevitable parada respiratoria.
El conocimiento de esta evolución provoca tanto en los pacientes como en el entorno
familiar una gran angustia y desesperanza, con un impacto negativo en la calidad de
vida y con frecuencia alteraciones severas del estado de ánimo. Son absolutamente
necesarias nuevas aproximaciones terapéuticas que determinen un cambio en la
historia natural de la enfermedad, y la terapia celular podría ser una alternativa.
El evento patológico subyacente es la pérdida de motoneuronas. Nuestra
hipótesis de trabajo, basada en datos generados por nuestro grupo y otros
investigadores en modelos animales de ELA, es que las células madre procedentes de
la médula ósea pueden ejercer un efecto neurotrófico beneficioso en las motoneuronas
y/o en el micromedioambiente neural, que modifique de manera positiva la evolución
natural de la enfermedad. Para ello sería necesario inyectar las células madre de la
médula ósea en el SNC mediante un procedimiento seguro. Como hemos comentado,
existe un ensayo clínico muy preliminar realizado por la Dra Mazzini, en el que se
sugiere que la infusión intraespinal a nivel T7-T9 de células madre mesenquimales es
un procedimiento técnicamente factible y probablemente seguro.
Con los fundamentos previamente expuestos los objetivos de este trabajo son:
1) Evaluar la factibilidad y seguridad de la inyección intraespinal a nivel T3-T4 de
células mononucleadas de médula ósea autóloga en pacientes con ELA.
2) Investigar si el neurotrofismo que se aprecia en los modelos animales también
puede existir en los pacientes con ELA.
43
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
La confirmación de estos dos extremos puede abrir una nueva vía de investigación
clínica en el tratamiento de la ELA.
44
MÉTODOS
PACIENTES Y MÉTODOS
45
MÉTODOS
46
MÉTODOS
8. Diseño del Ensayo Clínico.
Clínico. Aspectos generales y desarrollo inicial.
inicial.
Diseñamos un ensayo clínico fase I con un único brazo para evaluar la
factibilidad y seguridad de la infusión intraespinal de células mononucleadas de
médula ósea autóloga (BMNC) y, eventualmente, su efecto neurotrófico en pacientes
con ELA. El diseño, la metodología y los resultados de este trabajo han sido motivo de
publicación255-257.
La seguridad fue definida primariamente como la ausencia de eventos
adversos severos relacionados con el tratamiento, siguiendo las definiciones del grupo
CONSORT258. Secundariamente, también se definió la seguridad, como una velocidad
de disminución de la capacidad vital forzada y de las escalas neurológicas ALSFRS259, Norris260 y MRC261, no significativamente superior a la que los pacientes tenían
antes de la intervención.
Para conseguir los objetivos planteados se planteó inicialmente la inclusión de
10 pacientes en el ensayo. El ensayo dio comienzo en junio de 2007 y finalizó en
octubre de 2009 y estaba abierto a pacientes con ELA de toda España. Se realizó la
divulgación de los criterios de inclusión y exclusión mediante los medios de
comunicación disponibles de las asociaciones científicas, profesionales y de las
asociaciones de pacientes.
Se evaluaron 122 historias clínicas de pacientes con ELA enviadas desde toda
España. Sin embargo tan solo 32 pacientes cumplían los criterios de inclusión y
pudieron ser preseleccionados. Tras este primer cribado, se programó una visita inicial
en el Hospital en la que se llevó a cabo un estricto proceso de selección que incluía
una evaluación médica, neurológica, respiratoria y neurofisiológica completa, según
los criterios especificados en el ensayo255-257. Además, se realizó una evaluación
psicológica para asegurar que los pacientes comprendían plenamente la naturaleza
experimental del ensayo y los riesgos asociados con el procedimiento, así como para
evaluar su estabilidad psicológica.
47
MÉTODOS
Finalmente 13 pacientes cumplieron con todos los requisitos y, tras la firma del
consentimiento informado, fueron incluidos inicialmente en el ensayo. Como estaba
programado, a todos estos pacientes se les realizó una evaluación trimestral, durante
6 meses, para monitorizar la velocidad espontánea e individualizada de progresión de
la enfermedad (ver tabla 3). Durante ese tiempo dos pacientes hubieron de ser
excluidos porque dejaron de cumplir alguno de los criterios de inclusión. A los 6 meses
de seguimiento sólo quedaban 11 pacientes que seguían cumpliendo los criterios de
inclusión (y ninguno de los de exclusión), y a todos ellos se les realizó el trasplante
intra-espinal de células mononucleadas de médula ósea autóloga. Estos 11 pacientes
conforman el grupo de estudio del ensayo clínico.
Como más adelante se expone con detalle, para la infusión celular era
necesario hacer una doble laminectomía, y se escogió el nivel de las vértebras
torácicas 3 y 4 (T3 y T4), con la intención de asegurar la estabilidad de la columna
vertebral256. En la elección también se tuvo en consideración el hecho de que los
músculos intercostales inervados por esos segmentos medulares son los que tienen
una función inspiratoria-espiratoria más equilibrada262 y, por tanto, son potencialmente
los más importantes de cara a evitar el fallo respiratorio, último evento en la mayoría
de los pacientes con ELA.
Tras la infusión, todos los pacientes fueron evaluados trimestralmente durante
1 año. Además, y para asegurar un registro exhaustivo de los eventos adversos, se
realizaron entrevistas telefónicas semanalmente durante tres meses y, después,
mensualmente hasta finalizar el año de seguimiento previsto (ver apartado de
evaluaciones más abajo, y tabla 3). Los eventos adversos fueron graduados según la
Terminología común para eventos adversos v3 del grupo CTCAE263.
El ensayo clínico fue aprobado por los Comités de ensayos clínicos del Hospital
universitario Virgen de la Arrixaca y del Hospital Universitario Morales Meseguer.
También recibió la aprobación de la Agencia española de medicamentos y productos
sanitarios. AAI-Pharma se encargó de la monitorización externa del ensayo, que fue
registrado en www.clinicaltrials.gov (identificador NCT00855400) y en la European
Clinical Trials Database (número EudraCT 2006-003096-12).
48
MÉTODOS
La financiación del ensayo fue posible merced a la obtención de convocatorias
competitivas del Instituto Carlos III (FIS EC07/90762), la Dirección general de terapias
avanzadas y trasplantes del Ministerio de Sanidad (TRA-137), la Red de terapia celular
del Instituto Carlos III (Tercel; RD06/0010/0023), DIGESIC-MEC BFU2008-00588,
Ingenio 2010 MEC-Consolider CSD2007-00023, beca GVA Prometeo 2009/028 y por
la Fundación Diógenes.
255-257
9. Criterios de selección255-
9.1. Criterios de inclusión
•
Diagnóstico definido de acuerdo con los criterios establecidos por la World
Federation of Neurology13, 14.
•
Duración de la enfermedad comprendida entre 6 y 36 meses.
•
Inicio medular de la enfermedad.
•
Edad comprendida entre los 20 y los 65 años.
•
Capacidad vital forzada ≥50%.
•
Porcentaje del tiempo total de sueño con desaturaciones de oxígeno por debajo
del 90% inferior o igual al 2% (T90≤2%)
•
Paciente que ofrezca garantías suficientes de adhesión al protocolo.
9.2. Criterios de exclusión
•
Enfermedad neurológica o psiquiátrica concomitante.
•
Necesidad de nutrición parenteral o enteral.
•
Enfermedad sistémica concomitante.
•
Tratamiento con corticoides, inmunoglobulinas o inmunosupresores en los
49
MÉTODOS
últimos 12 meses.
•
Inclusión en otros ensayos clínicos.
•
Embarazo.
•
Incapacidad de comprender el consentimiento informado.
10. Variables de valoración
10.1.
Variable principal
Definimos el número de eventos adversos severos relacionados con el tratamiento
como variable principal del estudio. No deberá darse ninguno para que el
procedimiento que ensayamos sea considerado seguro.
10.2.
Variables secundarias
10.2.1. Clínicas
-
Número de eventos adversos no severos relacionados con el tratamiento.
10.2.2. Neurológicas
-
ALS-FRS score (0-40)
-
Norris score (0-100)
-
MRC score (0-60)
10.2.3. Neurorradiológicas
-
RNM médula espinal alterada (si/no)
10.2.4. Respiratorias
-
Capacidad Vital Forzada
-
Presión inspiratoria máxima (PIM)
50
MÉTODOS
-
Presión espiratoria máxima (PEM)
-
Polisomnografía: nº apneas e hipopneas.
10.2.5. Psicológicas:
-
EuroQol-5D
-
POMS
11. Procedimiento de obtención y trasplante de las células mononucleadas de médula
ósea autólogas (BMNC)
BMNC)
Se siguieron los procedimientos y protocolos ya publicados, que pasamos a referir
a continuación255-257.
11.1.
Obtención de médula ósea (figura 7)
Material:
1. 1 Bolsa de transferencia de 150 cc Teruflex transfer bags (Terumo).
2. Sampling site coupler (Baxter)
3. Suero Fisiológico (Baxter)
4. 1 vial de 5 mL de Heparina 1% (Rovi)
5. Agujas de aspirado de médula ósea (Jamshidi, Cardinal Health)
6. Llave de tres pasos (Productos Medico Hospitalares)
7. Cazoleta metálica estéril.
8. 3 bolsas de Suero fisiológico 500 cc preparadas con 10 cc de Heparina 5%).
9. 6 jeringuillas de 10 mL.
51
MÉTODOS
10. 1 bolsa de ACD-A (Baxter)
11. 2 tubos sin anticoagulante (para recoger plasma).
Procedimiento:
1. En la campana de flujo laminar preparar 1 bolsa de transferencia de 150 cc, y
marcarla como bolsa m.o.
2. Sellar el tubo de la bolsa de transferencia.
3. Colocarle un SSC y la llave de tres pasos.
4. Añadir a la bolsa de trasferencia de m.o. suero fisiológico con mezcla
anticoagulante:
a. 60 mL de Suero fisiológico
b. 5 mL de heparina al 1%
c. 5mL de ACD-A.
d. Mover la bolsa para que se reparta bien la mezcla por toda la superficie.
5. Dejar la campana etanolizada y con los UV encendidos con todo el material que
después se utilizará dentro (SF-heparina, 4 tubos de 50cc, 16 tubos de 15cc,
Histopaque-1077).
6. Trasladar la bolsa a quirófano en condiciones estériles.
7. Lavar las jeringas y agujas de extracción de m.o. en una solución de Salinoheparina (500 cc SF + 10 cc heparina 5%, quedando una solución final de 100
U/ml) que se preparará en un recipiente metálico estéril.
8. Se obtendrá un total de 60 cc. de sangre medular. Para ello se procede a
puncionar el trocar de aspirado en la cortical del hueso y, tras traspasarla, acoplar
una jeringa de 5-10 ml con la que se aspira la MO. Se deberá evitar obtener más
de 3 ml en una sola aspiración. Para facilitar la obtención de MO, en cada lugar de
52
MÉTODOS
punción se cambiará la profundidad del trócar, y en cada nivel se cambiará el
punto de aspiración girando el trocar sobre su eje.
•
Un ayudante de quirófano recogerá las jeringas con MO y se encargará de:
o Comunicar en voz alta el volumen aproximado de MO en cada jeringa
para que sea anotado.
o Transferir la MO de las jeringas a las bolsas de recogida con salinoheparina a través de la llave de tres pasos. Cada vez que deposite MO
se agitará suavemente la bolsa para asegurar una mezcla rápida con la
solución anticoagulante.
o Lavar
las
jeringas
con
salino-heparina
(recipiente
metálico)
y
devolverlas a los operantes para su reutilización.
•
Un segundo ayudante se encargará de:
o Ir registrando y controlando el volumen de MO que se transfiere a cada
bolsa de recogida.
9. Una vez obtenido el volumen final de 60 cc., cerrar la llave de tres pasos, envolver
la bolsa en un paño estéril y enviar al laboratorio para su procesamiento inmediato.
10. Recoger dos tubos de sangre periférica sin anticoagulante para obtener plasma en
el laboratorio y congelarlo.
11.2.
Preparación de las células mononucleadas de médula ósea (figura 7)
Material:
1. Suero Fisiológico (Baxter)
2. 2 viales de 5 mL de Heparina 1% (Rovi)
3. Jeringas de 1, 5, 10 y 20 cc (Becton Dickinson)
4. 4 tubos de 50 cc y 16 tubos de 15 cc tipo Falcon estériles (Deltalab)
53
MÉTODOS
5. Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich)
6. Campana de flujo laminar Bio-II-A (Telstar)
7. Tubos de hemograma con EDTA (Vacutainer, Becton Dickinson)
8. Aspirador Pipeting Aid (Gilson)
9. Pipetas de 1, 2 y 25 cc (Deltalab)
10. Centrifuga refrigerada Jouan CR3i.
11. Agujas de punción lumbar 22G.
12. 2 tapones estériles de jeringa (Disponed UIT oHG).
13. 1 sellador de tubos (Baxter)
14. Paños de campo estériles.
15. Eppendorf 1,5 cc.
16. Gasas estériles.
17. Pipetas Pasteur estériles.
18. Alcohol 70%.
19. Guantes sin polvo.
Procedimiento:
Todos estos procedimientos se realizarán en condiciones asépticas, en una campana
de flujo laminar clase II A.
1. Preparar una solución de lavado SF-Heparina: añadir 10000 U heparina (2 ml al
5%, 10 ml al 1%) a una botella de 500 cc de SF (20 U/ml final). Identificar como
solución de lavado.
2. Preparar 16 tubos de 15 ml y añadir a cada uno 7.5 ml de Histopaque-1077.
54
MÉTODOS
3. Separar en 2 alícuotas, en sendos eppendorf, para realizar recuentos celulares y
citometría.
4. Con la ayuda de una jeringa, dejar caer sobre la pared de cada tubo 7.5 ml de m.o.
Cerrar bien.
5. Centrifugar los tubos a 400 G (1500 rpm Jouan CR3i) durante 30 min. RT.
6. Con pipeta pasteur, desechar la capa de grasa que queda en la superficie y
separar las interfases de CMN a 2 tubos de 50 ml limpios.
7. Añadir SF-heparina hasta completar 45 ml.
8. Centrifugar a 733 G (2000 rpm Jouan CR3i) durante 10 min. para precipitar las
células.
9. Retirar sobrenadante sin apurar mucho.
10. Repetir los pasos 7, 8 y 9.
11. Reunir los dos pellets en un mismo tubo y repetir los pasos 7, 8 y 9.
12. Tras la última centrifugación, retirar sobrenadante a tubos limpios de 50 ml y enviar
muestra del sobrenadante a microbiología para cultivo.
13. Resuspender el pellet celular en 2.10 mL de SF-heparina (es importante evitar la
formación de burbujas y no sacar la punta de la pipeta fuera de la suspensión).
14. Con guantes estériles, cargar las células a infundir en 2 jeringuillas de 1 mL con
una aguja de punción lumbar de 25G. Cargar 1 mL por jeringa. No extraer la
burbuja de aire.
15. Retirar las agujas y poner un tapón a la jeringa.
16. Envolver las jeringuillas en un paño estéril y trasladarlas inmediatamente al
quirófano de neurocirugía para su implante. Mantener en todo momento las
jeringuillas en agitación para que no sedimenten las células.
17. Con una pipeta de 1 mL, recoger 100 µL y pasarlos a un eppendorf estéril.
55
MÉTODOS
18. Pasar 10 µL de esos 100 µL a otro eppendorf, realizar dilución 1:10 en SF y pasar
la suspensión por el contador celular. El resto se utilizarán para realizar la
citometría, la viabilidad con azul de tripano, un frotis, para obtener ADN y para
hacer cultivos.
19. Calcular la concentración celular, CNT y viabilidad.
11.3.
Citometría
1. Escribir en una hoja los tubos que se van a marcar: canal y monoclonal:

Tubo 1: controles

Tubo 2: CD45-FITC (Pharmingen), CD133-PE (Miltenyi), CD34- PrCP-
Cy5.5(Pharmingen), CD117-APC (Pharmingen)

Tubo 3: CD14-FITC (Becton Dickinson), CD38-PE (Becton Dickinson), CD45-
PrCP-Cy5.5 (Becton Dickinson), CD34-APC (Becton Dickinson)
2.
Rotular convenientemente tantos tubos como se vayan a precisar y colocarlos en
fila en una gradilla.
3.
La cantidad de células a dispensar en cada tubo es de 1.000.000. Para hallar el
volumen de muestra a dispensar, basta con hacer la siguiente operación:
Vol=1000000/nº de leucocitos por µL
Sabiendo que la muestra a dispensar no puede sobrepasar los 200 µL. Por tanto,
puede ser necesario hacer una centrifugación previa de la muestra y resuspender el
pellet en un volumen adecuado de PBS.
NOTA: Todas las centrifugaciones se realizarán a 320 G y durante 3.5 min.
4.
Marcar los tubos siguiendo las especificaciones de volumen/nº células del
fabricante.
5. Al finalizar el marcaje, hacer una agitación suave e incubar durante 15 min.
56
MÉTODOS
6. Mezclar con 1 ml de solución de lisis, en los tubos que tengan eritrocitos.
7. Incubar 10 min. justos.
8. Centrifugar.
9. Decantar con energía (excepto si el recuento celular es escaso).
10. Mezclar con 2 ml de PBS.
11. Centrifugar.
12. Decantar con energía (excepto si el recuento celular es escaso).
13. Repetir este paso una 2ª vez.
14. Resuspender en 350 µl de PBS.
15. Pasar las muestras por el citómetro, usando el CellQuest como programa de
adquisición, y recogiendo 100000 eventos CD45+.
16. Analizar el archivo posteriormente con el programa Paint-a-Gate siguiendo la
normativa ISHAGE, para averiguar el nº de células CD133+ viables, y el nº de CD34+
y de CD117+.
57
MÉTODOS
Figura 7 Extracción de la médula ósea y separación de las células mononucleadas
mediante gradiente de densidad.
Figura 8 Laminectomía T3-T4 y exposición de la médula espinal.
58
MÉTODOS
Figura 9 Infusión de las células mononucleadas mediante micro-manipulador
(Medtronic) montado sobre brazo Yargasil en la zona más avascular de los cordones
posteriores de la médula espinal y cierre de las meninges.
59
MÉTODOS
11.4.
255Administración de las células a los pacientes: técnica neuroquirúrgica255-
257
Previamente a la intervención se realiza una Rx de columna dorsal AP para
marcar longitudinalmente en la piel del paciente con tinta indeleble (o tintura de
Castellani) el espacio T3-T4 (figura 8).
En quirófano, se administra profilaxis antibiótica con 1.5g IV de Cefuroxima. En
pacientes alérgicos a β-lactámicos se empleará Vancomicina 1 gr iv. Bajo anestesia
general, con control de potenciales evocados y en decúbito prono sobre trineo, se lava
el campo quirúrgico con solución jabonosa antiséptica y se pinta la piel con povidona
yodada. A continuación se realiza una incisión cutánea de la zona marcada. Acto
seguido se separa el tejido celular subcutáneo con electro-bisturí hasta descubrir las
apófisis espinosas y láminas vertebrales. Se separan los músculos paravertebrales
con disección roma hasta limpiar perfectamente espinosas y láminas. A continuación
se realiza la laminectomía reglada de la zona. Tras descubrir la dura, y mediante
técnica microquirúrgica, se incide ésta en sentido cráneo-caudal protegiendo con
lentinas la médula subyacente (figura 8).
Tras exponer la médula, se procede a la infusión de las BMNC. Para ello se
utiliza un brazo Leila fijado a la mesa quirúrgica al que se le acopla un retractor flexible
Yargasil. Sobre el Yargasil se monta un micro-manipulador desarrollado por Medtronic
que fija la jeringa de 1 mL que contiene las células, implementada con una aguja de
punción lumbar de 22G. De este modo, la posición vertical de la aguja es controlada
por la rueda graduada del micro-manipulador, permitiendo al neurocirujano calcular la
profundidad de la inyección. Se identifican los cordones posteriores medulares en
relación con las raíces nerviosas y el surco medio y se escoge la zona más avascular
como punto de inyección de las células, aproximadamente a una distancia de 1-2.5
mm de la línea media. La aguja es introducida cuidadosamente en el parénquima
medular hasta una profundidad de 6 mm. Tras comprobar que no ha tenido lugar
ninguna hemorragia, se infunden las células contenidas en la jeringa en
aproximadamente 3 minutos. Al finalizar la infusión la aguja es retirada lentamente
utilizando el micro-manipulador, hasta su completa extracción de la médula. La
60
MÉTODOS
operación se repite con la segunda jeringa de BMNC ipsi o contralateralmente,
buscando nuevamente la zona más avascular disponible (figura 9)255-257.
Finalmente se cierra la duramadre de forma estanca mediante sutura continua
con seda, se cubre la sutura con Duragen® y se asegura el sellado con Duraseal®. Se
cierra el resto de los planos en la forma habitual, dejando un drenaje Blake #10
durante 24 horas. La profilaxis antibiótica durante las 24 horas siguientes. Los
pacientes se mantienen en decúbito supino durante 24-48 h, pasadas las cuales
pueden levantarse y caminar. En el séptimo día postquirúrgico se retiran las grapas y
se realiza una resonancia nuclear magnética previa a su alta255-257.
12. Evaluaciones
El esquema de evaluaciones se muestra en la tabla 3. Los pacientes fueron
evaluados por los servicios de Neurología, Neumología, Radiología, Neurofisiología,
Psicología y Neuropsicología de modo trimestral desde el día -180 al +360, siendo el
día 0 el de la infusión de las células. Antes de la intervención los pacientes fueron
evaluados por los servicios de Neurocirugía y de Anestesia. Tras la intervención, los
pacientes permanecieron ingresados en el servicio de Neurocirugía durante una
semana. Antes de darles el alta, se les realizó un control analítico, una resonancia
nuclear magnética, potenciales evocados somato-sensoriales, una espirometría y una
evaluación psicológica.
Las evaluaciones neurológicas fueron realizadas por dos neurólogos de dos
hospitales distintos. La evaluación consistió en una entrevista y exploración clínicas y
en la puntuación de las escalas ALS-FRS, Norris y MRC. La puntuación que se incluyó
en el cuaderno de recogida de datos fue la media entre las puntuaciones de los dos
neurólogos255-257.
61
Tabla 3 Esquema de evaluaciones del ensayo clínico
MÉTODOS
62
MÉTODOS
La espirometría y la evaluación de la musculatura respiratoria fueron realizados
con un espirómetro ZAN 100 y un pletismógrafo ZAN 500 (Waldfenster, Alemania). Se
midió la capacidad vital forzada en posición sedente y se expresó como el porcentaje
del valor predicho. La presión inspiratoria nasal se midió usando una boquilla especial.
Los pacientes realizaron tres esfuerzos inspiratorios y espiratorios máximos desde el
volumen residual hasta la capacidad pulmonar total, midiéndose la presión espiratoria
máxima (PEM) y a presión inspiratoria máxima (PIM), siguiendo las recomendaciones
de Polkey el al.264.
Los potenciales evocados somatosensoriales y la monitorización intraoperatoria
de los mismos fue realizada con el Nihon-Kohden Neuropack M1 de 4 canales. Se
estudiaron los potenciales evocados somatosensoriales de la extremidad inferior
mediante estimulación CPi, siguiendo un protocolo estándard265. Se utilizó el Synergy
Oxford Medelec de 2 canales para realizar la electromiografía de los músculos
geniogloso/masetero, bíceps, extensor común de los dedos, primer interóseo,
paravertebral dorsal, cuádriceps y tibial anterior. La polisomnografía se realizó
siguiendo los criterios de la American Academy of Sleep Medicine266 con el NihonKohden Neurofax de 20 canales.
Las resonancias magnéticas nucleares cerebrales y espinales se obtuvieron
con un sistema de 1.5-T: el MRI LX.1.5T de GE Medical Systems (Milwaukee, WI). Las
imágenes de la médula espinal fueron adquiridas con una antena de superficie
phased-array de cuatro canales, realizando secuencias sagitales Fast Spín-Eco
potenciadas en T1 y T2 y una secuencia axial de Eco de Gradiente, centrada en el
área quirúrgica. En las imágenes se valoró la presencia de:
- Cambios extradurales y durales: colecciones y afectación extrínseca del contenido
dural, incluyendo la compresión de la médula espinal.
- Cambios intrínsecos medulares: deformidades y cambios de señal (hiperintensidad
T2 del área de infusión, edema extenso, y hemorragia aguda y crónica).
Las evaluaciones psicológicas y neuropsicológicas se realizaron con
entrevistas semiestructuradas de los pacientes con y sin la familia. La evaluación
63
MÉTODOS
psicopatológica, prestando una especial atención a la presencia de depresión y de
ansiedad, a la actitud de los pacientes y la familia hacia la enfermedad y el ensayo así
como al soporte familiar, se realizó usando el test MMPI-2 para la evaluación de la
personalidad, el POMS para la ansiedad y el estado de ánimo, y el Euro-QoL5D para
la calidad de vida.
13. Análisis estadístico
Las variables continuas se describieron utilizando medidas de tendencia central
(mediana o media) y de dispersión (desviación estándar). Las medidas categóricas
fueron descritas usando tablas de frecuencias absolutas y relativas. Se comprobaron
las condiciones de aplicación del análisis estadístico y se verificó la normalidad
mediante el test de Kolmogorov-Smirnoff y la homocedasticidad mediante el test de
Levene. Se utilizaron tests no paramétricos para el análisis en el caso de que no se
cumplieran alguna de las condiciones. Se utilizó el test de Chi-cuadrado para la
comparación entre variables categóricas, y el t de Student y test ANOVA para medidas
repetidas (variable independiente: tiempo en el que los pacientes fueron evaluados)
para la comparación de las variables continuas. Se siguieron los resultados positivos
del ANOVA con comparaciones pareadas post-hoc usando el test de Tukey. El análisis
se realizó comparando el aumento de las variables en periodos de tiempo constantes
(tres y seis meses). El nivel de significación en todos los tests fue alpha=0.05. Se
utilizó el programa estadístico SPSS versión 18.0.
14. Estudio histológico e inmunohistoquímico
Se planteó a todos los pacientes la posibilidad de realizar un estudio
necrópsico en caso de fallecimiento, y se les solicitó autorización para ello. Los
pacientes que así lo desearon firmaron un consentimiento informado de donación al
Banco de cerebros de la Región de Murcia. En caso de fallecimiento se llevó un
procedimiento necrópsico reglado para estudio neurohistológico e inmunohistoquímico
que se expone a continuación.
64
MÉTODOS
Antes de la extracción de la médula espinal se realizó una exploración in situ
para detectar posibles malformaciones anatómicas. Se cortaron e identificaron en
relación con el nivel de las inyecciones celulares segmentos de 1 cm de la médula
espinal cervical, dorsal y lumbar, se parafinaron, se cortaron a 7 µm, se montaron en
10 series paralelas y se procesaron mediante tinción estructural (Violeta de cresilo
0.5%) e inmunohistoquímica contra marcadores específicos de células neurales (Tuj1,
Chat, GFAP, Nestina, NG2), de la médula ósea (CD34, CD90, CD68, CD45, CD44,
MCP1) y de neurodegeneración propios de la ELA (TDP-43, SOD1). La tinción
inmunológica se realizó utilizando el procedimiento estándar biotina-avidina/HRP. Los
cortes fueron incubados en PBS más Tritón X-100 al 0.1% (PBS-T) con peróxido de
oxígeno al 0.9% durante 30 minutos, tras los cuales se bloqueó con albúmina bovina al
0.1% en PBS-T durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se incubaron durante 24
horas a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron con sus anticuerpos
secundarios biotinilados correspondientes durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras una incubación de 1 hora con el reactivo Vectastain ABC (Vector Laboratories,
Burlingame,
CA)
la
inmunotinción
fue
revelada
con
tetrahidrocloridro
de
diaminobenzidina para obtener un color marrón claro, con sulfato de niquel (0.08%)
para obtener precipitados negros o con aminoetil carbazol para obtenerlos rojos,
siguiendo las recomendaciones del fabricante. Finalmente, los cortes fueron montados
en portas, deshidratados y cubiertos con Eukitt. Los portas fueron fotografiados
mediante microscopio (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Se contaron las
motoneuronas presentes en el asta anterior de la médula espinal, con la morfología
característica poligonal y con núcleo grande, en diez secciones de cada serie de
violeta de cresilo de los segmentos T1, T2, T4, T5, T6, T8 y T9. Se mantuvo una
separación de 280 µm entre secciones para asegurar que cada célula se contaba una
única vez. Se obtuvieron muestras de médula espinal T1-T9 de dos varones de 66 y
68 años de edad sin historia de enfermedades neurológicas del Banco de cerebros de
la Región de Murcia y se estudiaron siguiendo el mismo protocolo.
65
MÉTODOS
Tabla 4 Anticuerpos utilizados en las tinciones inmunohistoquímicas
Marcadores neurales:
-
Anti-βIII-Tubulina neuronal (Tuj1): Anticuerpo monoclonal de ratón IgGa (COVANCE, Berkeley,
CA)
-
Anti-Colin
Acetiltransferasa
International,Inc., Temecula,CA
-
Anti-Proteína ácida glial fibrilar (GFAP): Anticuerpo monoclonal de rata IgG2a (CALBIOCHEM,
La Jolla,CA)
-
Anti- Nestina Humana: Anticuerpo monoclonal de ratón IgG1(CHEMICON International,Inc.,
Temecula,CA)
-
Anti- Proteoglicano condroitin sulfato (NG2): Anticuerpo policlonal de conejo (CHEMICON
International,Inc.,Temecula,CA)
(Chat):
Anticuerpo
policlonal
de
cabra
(CHEMICON
Marcador de membrana basal:
-
Anti-Laminina: Anticuerpo policlonal de conejo (CHEMICON International, Inc., Temecula, CA)
Marcadores de células de la médula ósea:
-
Anti- CD45 Humano: Anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 (AbD Serotec, Oxford, UK)
-
Anti- CD34 Humano: Anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 (BD Biosciencies, NJ, USA)
-
Anti- CD90 Humano: Anticuerpo monoclonal de ratón gG1 (BD Biosciencies, NJ, USA)
-
Anti- CD68 Humano: Anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a (AbD Serotec, Oxford, UK)
-
Anti- CD44 Humano: Anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 (BD Biosciencies, NJ, USA)
-
Anti- MCP1: Anticuerpo policlonal de conejo (ABCAM, Cambridge, UK)
Marcadores de neurodegeneración
-
Anti-Superóxido Dismutasa 1 (SOD 1): Anticuerpo policlonal de oveja (ABCAM, Cambridge, UK)
-
Anti-TDP-43: Anticuerpo monoclonal de conejo, IgG (ABCAM, Cambridge, UK)
66
RESULTADOS
RESULTADOS
67
RESULTADOS
68
RESULTADOS
1. Características de los pacientes
Las características de los pacientes en el momento de su inclusión en el
ensayo clínico están resumidas en la Tabla 5. Se incluyeron 11 pacientes con una
edad mediana de 46 años (rango 32-61). La duración mediana de la enfermedad
desde el diagnóstico hasta la infusión de las BMNC fue de 21 meses (rango 11-40). La
capacidad vital forzada a la entrada en el ensayo de los pacientes fue de un 105% de
mediana (rango 79-121). Las puntuaciones medianas de las escalas ALS-FRS, Norris
y MRC fueron de 30 (rango 24-38), 74 (rango 54-95) y 46 (rango 35-54)
respectivamente. Todos los pacientes recibieron su tratamiento específico para la
enfermedad habitual durante todo el ensayo. Este tratamiento incluía el Riluzol en la
totalidad de los mismos, vitamina E en seis, creatina en tres, carbonato de litio en tres,
baclofen en tres y tizanidina en dos. El ensayo dio comienzo en junio de 2007 y finalizó
en octubre de 2009.
Tabla 5 Características de los pacientes
TTI
CVF (%)
(meses)
20
113
ALSFRS
24
Norris
MRC
54
45
Tratamiento
ELA
R, E, C, L, B, T
104
28
74
37
E,C,L
16
94
28
69
38
R, T
43
40
105
36
87
47
R
M
45
38
79
27
74
42
R, E
6
M
31
33
104
34
79
46
R, E, C, B
7
F
49
29
115
28
71
35
R
8
F
50
23
99
30
70
46
R, E
9
F
52
24
121
32
81
50
R, E, B
10
M
43
14
120
35
83
50
R, L
11
M
41
15
116
38
95
54
R
46
21
105
30
74
46
# Paciente
Sexo
Edad
1
F
46
2
M
61
21
3
F
54
4
F
5
Mediana
TTI: tiempo del diagnóstico a la infusión, CVF: Capacidad vital forzada, R: Rilutek, E: vitamina E,
C: Creatina, L: Carbonato de litio, B: Baclofen, T: Tizanidina
69
RESULTADOS
2. Recogida de las células mononucleadas de médula ósea y trasplante
Se infundieron una mediana de 462 x106 BMNC (rango 138-602.87) que
incluían una mediana de 2.77 x106 células CD34+ (rango 0.55-23.39), 2.31 x106
células CD117+ (rango 0.41-10.25) y 1.3 x106 células CD133+ (rango 0.41-5.43). Los
datos individualizados por paciente se exponen en la Tabla 6. La viabilidad celular se
analizó en 9 pacientes, siendo del 80% (rango 70-95).
La infusión celular se realizó siguiendo el procedimiento previsto. No hubo
complicaciones anestésicas. Sólo se registró un evento adverso relacionado con la
cirugía
que
consistió
en
una
reducción
del
los
potenciales
evocados
somatosensoriales en un paciente al 50% durante 10 minutos, coincidiendo con la
apertura de la duramadre.
Tabla 6 Número y tipo de células infundidas
# Paciente BMNC x106
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Mediana
602,87
542,40
248,00
138,00
494,00
310,00
462,00
544,00
370,60
476,00
324,00
462,00
CD34+ x106
CD117+ x106
CD133+ x106
10,25
5,42
3,22
0,55
2,47
1,86
2,77
23,39
1,85
2,86
1,94
2,77
10,25
3,80
2,48
0,41
1,98
1,24
2,31
2,72
1,48
3,33
2,27
2,31
5,43
1,63
2,73
0,41
0,99
1,24
1,39
1,09
1,11
2,38
1,30
1,30
BMNC: Células mononucleadas de médula ósea autóloga.
70
RESULTADOS
3. Eventos adversos no severos relacionados con el tratamiento
Los 11 pacientes sufrieron un total de 43 eventos adversos no severos
posiblemente, probablemente o definitivamente relacionados con el tratamiento (Tabla
7). El 51% de estos eventos adversos ocurrió durante las dos primeras semanas
después de la cirugía. El 26% se resolvió en los dos primeros meses, un 14% duró
menos de nueve meses y solo un 9% persistían al final del año de seguimiento. Todos
los eventos adversos fueron un grado ≤2 del CTCAE, siendo el estreñimiento el más
frecuente y duradero (10 pacientes), junto con dolor en la zona de la herida quirúrgica
de hasta tres meses de duración (7 pacientes) y dolor en la región intercostal de hasta
dos meses de duración (5 pacientes). Los pacientes también presentaron pequeñas
áreas de hipoestesia, parestesia y disestesia (7, 4 y 2 pacientes, respectivamente) de
escasa relevancia clínica y localizadas fundamentalmente en los miembros inferiores.
Estos síntomas neurológicos desaparecieron en 3-4 meses, excepto en dos pacientes
que al final del año de seguimiento todavía presentaban una pequeña zona de
hipoestesia en la planta de un pie. Tres pacientes presentaron síntomas transitorios de
hipotensión intracraneal. Otros eventos adversos al menos posiblemente relacionados
con el tratamiento fueron cefalea, vértigo, hiperestesia en la zona quirúrgica e
insomnio.
4. Eventos adversos severos
Durante el ensayo se recogieron 6 eventos adversos severos. Ninguno de ellos
se consideró relacionado con el procedimiento. El paciente 2 experimentó en el día
+137 un flutter auricular con síncope asociado, que requirió un día de hospitalización y
se resolvió espontáneamente. El día +378, el paciente volvió a acudir a urgencias por
un nuevo flutter auricular que volvió a revertir espontáneamente. Sin embargo, al alta
sufrió un embolismo pulmonar masivo que le causó la muerte.
71
En la parte superior de cada celda se muestra el grado CTCAE, seguido de la duración en días desde el trasplante. En algunos
eventos adversos se ha indicado su localización. Las celdas se han coloreado dependiendo de la duración del evento adverso.
Tabla 7 Eventos adversos no severos relacionados
RESULTADOS
72
RESULTADOS
La paciente 3 requirió ingreso hospitalario por insuficiencia respiratoria
secundaria a una infección respiratoria en el día +236. Aunque el episodio pudo ser
resuelto, la enfermedad continuó progresando y finalmente falleció por insuficiencia
respiratoria en el día +359.
Finalmente, la paciente 8 desarrolló en el último trimestre del seguimiento una
colecistitis aguda que requirió colecistectomía posteriormente.
Posteriormente y ya fuera del seguimiento del ensayo, también han fallecido los
pacientes 1 y 5 los días +808 y +1058. La paciente 1 falleció por una infección por el
virus de la gripe H1N1, y el 5 por infección respiratoria e insuficiencia respiratoria
secundaria. Los pacientes 1, 2 y 3 donaron su médula espinal y cerebro al Banco de
cerebros de la Región de Murcia.
Actualmente a fecha de 31 de marzo de 2012 siguen vivos siete de los 11
pacientes, con una mediana de supervivencia desde la infusión de 3.5 años (rango
3.3-4.3).
5. Evolución clínica
No se apreció un empeoramiento en la tasa de deterioro de las variables
espirométricas (CVF p=0.901, PIM p=0.85, PEM p=0.27) ni de las escalas
neurológicas (ALS-FRS p=0.515, Norris p=0.839, MRC p=0.167)255.
En la figura 10 queda recogida la evolución de las escalas ALS-FRS, Norris y
MRC, y en la figura 11 la de la CVF, PIM y PEM de todos los pacientes. En todas las
gráficas la línea negra con triángulos representa la evolución de la media de los
valores de todos los pacientes en cada uno de los puntos. Mientras que esta línea
muestra lo descrito estadísticamente en el párrafo anterior, la observación de la
evolución de los valores en los pacientes individuales nos permite apreciar datos que
pueden ser interesantes a pesar de no tener peso estadístico. Así, el bloque principal
de pacientes (4, 5, 6, 7, 10) presentaba un deterioro progresivo de sus puntuaciones.
Los pacientes 2, 9 y 11, sin embargo, no sufrieron deterioro en las escalas
73
RESULTADOS
neurológicas ni en la función respiratoria a lo largo del ensayo. La evolución antes del
trasplante de los pacientes 1 y 3 era la más acelerada de la serie. Sin embargo, su
devenir después del mismo fue dispar. Mientras que la paciente 3 continuó
empeorando hasta fallecer como consecuencia de la enfermedad, la paciente 1 logró
estabilizar su situación en las escalas neurológicas y enlentecer su deterioro
respiratorio, siendo la paciente en la que sin duda el tratamiento ha cambiado el curso
de su enfermedad. También es reseñable que la CVF media al final del seguimiento
fue todavía del 80%.
La evolución del PIM y el PEM, indicadores indirectos de la funcionalidad de la
musculatura accesoria inspiratoria y espiratoria respectivamente, fue más llamativa
que la de las escalas neurológicas y la CVF. Así 6 pacientes presentaron en el
seguimiento PEM superiores a la del día de la intervención y en 5 la PEM al final del
seguimiento fue al menos similar a la del día +0. Lo mismo sucedió con la PIM en 6 y 3
pacientes respectivamente.
74
Figura 10 Evolución de las escalas neurológicas
RESULTADOS
75
76
CVF: capacidad vital forzada, PEM: presión espiratoria máxima, PIM: presión inspiratoria máxima.
Figura 11 Evolución de las escalas respiratorias.
RESULTADOS
RESULTADOS
Durante
el
seguimiento
los
potenciales
evocados
somatosensoriales
empeoraron progresivamente en ocho pacientes (descenso de amplitudes e
incremento de latencias) llegando a desaparecer, produciéndose un bloqueo de
cordones posteriores. No se observó ninguna correlación clínica con este hallazgo. El
paciente 9, que había experimentado una reducción transitoria de sus potenciales
evocados somatosensoriales durante el trasplante, mantuvo sus potenciales estables
durante todo el seguimiento.
En la evolución postoperatoria se observó una caída del T90 <2% únicamente
en los pacientes 8 y 10. En ninguno de ellos aumentó de modo significativo el nº de
apneas. En general, disminuyó la eficiencia del sueño, haciéndose más superficial y
fragmentado: disminuyeron el tiempo total sueño y las fases de sueño profundo (III/IV),
y aumentaron la vigilia intrasueño y las fases de sueño superficial (I y II). Disminuyeron
también el nº y duración de fases REM.
Las exploraciones neuropsicológicas mostraron que la gran mayoría de los
pacientes (>80%) habían sufrido algún tipo de reacción psicológica adaptativa a lo
largo de la enfermedad, aunque no cuadros depresivos francos. No se encontraron
trastornos de personalidad ni un perfil característico asociado a los pacientes de ELA.
El estado de ánimo de los pacientes (tensión, depresión, cólera, vigor, fatiga y
confusión) medido con la escala POMS (figura 12) se mantuvo estable a lo largo del
ensayo (p=0.45). La escala EuroQol (figura 13) demuestra una caída significativa en la
calidad de vida hasta el tiempo de la infusión (p<0.01) que, sin embargo, permanece
estable después de la misma (p=0.649).
77
RESULTADOS
Figura 12 Evolución de la escala POMS
Figura 13
13 Evolución de la calidad de
Vida
6. Evolución radiológica
Inmediatamente tras la intervención, se apreciaron colecciones extraduralesextraespinales postquirúrgicas en todos los pacientes. En los pacientes 1, 3, 5 y 10
estas colecciones ejercieron un discreto y transitorio efecto masa en la médula espinal.
Se apreció una zona de hiperintensidad en T2 autolimitada sugestiva de edema
intraparenquimatoso en la médula espinal en nueve pacientes. En los pacientes 3 y 6
este aumento de la señal en T2 persistió hasta el final del seguimiento. Aunque se
observó algún grado de deformidad de la médula espinal en todos los pacientes tras el
trasplante, solo en dos de ellos el diámetro antero-posterior llegó a ser mayor que el
transverso. Los pacientes 3, 6 y 8 mostraron una hemorragia subaguda en la
resonancia post-quirúrgica, cuya imagen persistió hasta el final del seguimiento,
aunque sin repercusión funcional o clínica. En la figura 14 se muestra un ejemplo
representativo de los hallazgos de RNM a lo largo del estudio.
78
RESULTADOS
Figura 14 Resonancia nuclear magnética
A) Secuencia spin-echo en T1 en el nivel de la laminectomía una semana tras la cirugía.
Una colección líquida extradural (asterisco) ejerce un efecto masa moderado sobre la
médula espinal (flechas), que también muestra algunos puntos hiperintensos (flechas)
que sugieren un sangrado subagudo.
B) Secuencia fast spin-echo en T2 en el nivel de la laminectomía una semana tras el
trasplante. La colección líquida ejerce un efecto masa sobre el saco dural, sin afectar la
médula espinal. Sin embargo, muestra una leve hiperintensidad en el área quirúrgica
(flecha).
C) Secuencia fast spin-echo en T2 en el nivel de la laminectomía al final del seguimiento.
La colección apreciada previamente es ahora una cicatriz (asterisco). La médula
espinal muestra una deformidad substancial con un diámetro antero-posterior
aumentado.
79
RESULTADOS
7. Estudio necrópsico
necrópsico
El estudio necrópsico se realizó sobre cortes de médula espinal de los
pacientes 1, 2 y 3.
El examen macroscópico de los segmentos infundidos de la médula espinal no
mostró ningún daño o anomalía anatómica secundarios al trasplante (fig. 15 A, B).
Tampoco se apreciaron tumores o neoformaciones255-257.
Las secciones en parafina teñidas con tinción de Nissl mostraron una
acumulación local de células esferoides y basofílicas en el trayecto de la aguja (fig. 15
C,D). También se apreció una acumulación de vasos en la sustancia gris cercana al
injerto, en la base de las astas anteriores (fig. 15 D).
El número medio de motoneuronas espinales en el asta anterior de los
segmentos torácicos aumentó a medida que nos acercábamos a los segmentos
infundidos: de 0.9±0.3 motoneuronas/sección en los segmentos superiores (T1) e
inferiores (T8-9) a 4.2±0.8 motoneuronas/sección en los niveles medulares infundidos
(T4-T5) (fig. 16). Las diferencias entre segmentos fueron significativas (T1 a T2
p<0.01; T2 a T4-T5 p<0.01; T4-T5 a T8-T9 p<0.01), pero no entre los tres pacientes
analizados.
La
médula
espinal
control
tenía
una
media
de
14.4
±1.2
motoneuronas/sección en las astas anteriores de T4-T6. Se identificaron células que
expresaban marcadores hematopoyéticos como CD45, CD90 y CD68 en la sustancia
gris medular (fig.15 E-K). Sin embargo, únicamente en los segmentos infundidos se
observaron células pequeñas y esféricas rodeando las motoneuronas, formando un
nido celular (fig. 15 I, R). De modo consistente con nuestros datos preclínicos206, estos
nidos celulares no expresaban ningún marcador neural. Además eran CD45 y CD68
negativos (fig. 15 J, K) y CD90 positivos (fig. 15 I, R). También analizamos la
presencia
de
signos
degenerativos
en
las
motoneuronas.
No
se
detectó
inmunorreacción contra SOD1, confirmando la naturaleza esporádica de la ELA de
nuestros pacientes143, 267. Se contaron un total de 41 motoneuronas CHAT positivas en
los segmentos caudales al nivel infundido. Ninguna de ellas tenía nidos celulares, 36
80
RESULTADOS
mostraban colapso citoplasmático y depósitos intracelulares de ubiquitinina TDP-43
positivos (fig. 15 L, M), mientras que solo cinco no presentaban signos degenerativos.
Al aproximarnos a los segmentos infundidos las motoneuronas medulares mostraban
menos signos degenerativos y depósitos intracitoplasmáticos (fig. 15 O, P). De modo
llamativo, las motoneuronas rodeadas por nidos celulares CD90 positivos no tenían
depósitos de ubiquitinina (76 de 88 motoneuronas [86.4%] contadas en T4-T5 en las
tres necropsias) (fig. 15 R, Q), mientras que 11 de 12 motoneuronas cercanas [91.6%]
que no tenían nidos celulares mostraban depósitos globulosos intracitoplasmáticos
(fig. 15 Q, tabla 8)255-257.
Figura 15
15 Hallazgos anatomo-patológicos en la médula espinal
81
RESULTADOS
(A) Imagen macroscópica mostrando una vista dorsal de la médula espinal torácica. Las
flechas rojas marcan la cicatriz pial residual, donde la aguja fue introducida en el cordón
posterior izquierdo. (B) Sección transversal de T4 mostrando el punto de entrada de la aguja
(flecha roja), trayectoria (flechas negras) y el área de infusión de las células (rodeada por una
línea roja).
Microfotografías de secciones del segmento espinal T4 parafinado con tinción de Nissl
mostrando: (C) células basofílicas rellenando el tracto de la aguja desde la región subpial
(flecha roja); (D) sustancia gris de la médula espinal en el nivel de la infusión de las células.
Las flechas negras muestran la trayectoria a través del cordón posterior hacia el área de la
infusión (g) en la sustancia gris central.
Tinción inmunohistoquímica doble con colinacetiltransferasa (CHAT, rojo) y CD90 (negro)
mostrando que (E) en los niveles torácicos rostrales a los segmentos infundidos (T1-T2) se
detectan algunas neuronas CHAT positivas (flechas), pero apenas se observan células CD90
positivas (puntas de flecha). (F) En las secciones del nivel T4 se observan motoneuronas
CHAT positivas (flecha) y células CD90 positivas (puntas de flecha). (G y H) Microfotografía de
alto aumento mostrando motoneuronas CHAT positivas (MN) rodeadas por nidos células CD90
positivas (puntas de flecha) en T4 y en T5 (I). Las poblaciones CD45 (J) y CD68 (K) positivas
no forman nidos rodeando las motoneuronas CHAT positivas.
Secciones medulares contiguas procesadas mediante inmunohistoquímica contra CHAT/CD90
y TDP-43 mostrando (L y M) una motoneurona degenerativa con colapso citoplasmático y
vacuolización (L) en el segmento T1 con inclusiones TDP-43 positivas (M). (O y P) En
segmentos más cercanos –T2- se detectan algunas células CD90 positivas cerca de las
motoneuronas (O, flecha) y alguna inmunorreacción granular TDP-43 positiva está presente en
el citoplasma y el núcleo de las motoneuronas (P). Finalmente (Q y R), en los segmentos
infundidos (T3-T5) se sobservan nidos de células CD90 positivas (R, flechas) en motoneuronas
que no tienen ninguna inmunoreactividad contra el TDP-43 (Q, flecha), mientras que las
motoneuronas que no tienen nidos celulares muestran inclusiones globulosas citoplasmáticas
de TDP-43 (Q, punta de flecha).
Escalas: 1 mm (A, B), 100 µm (E, F), 50 µm (G-R). Abreviaturas: AF: cordón anterior; amf:
fisura media anterior; ALF: cordón anterolateral; AR: raíz anterior; cc: canal central; DL:
ligamento dentado; dh: asta dorsal; g: área infundida; lh: asta lateral; PF: cordón posterior; PLF:
cordón posterolateral; pms: surco medio posterior; vh: asta ventral.
82
RESULTADOS
Figura 16
16 Media de motoneuronas por segmento espinal.
CD90+ y UBQ-
CD90- y UBQ+
CD90+ y UBQ+
CD90- y UBQ-
T4-T5/T8-9
T4-T5/T8-9
T4-T5/T8-9
T4-T5/T8-9
Paciente 1
23/0
5/11
0/0
0/1
Paciente 2
19/0
3/12
0/0
1/2
Paciente 3
34/0
3/13
0/0
0/2
MNs Totales
76/0
11/36
0/0
1/5
Tabla 8 Recuento de motoneuronas con nidos de células CD90+ y depósitos de
ubiquitinina (UBQ) en los segmentos T4-T5 y T8-T9.
83
RESULTADOS
84
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
85
DISCUSIÓN
86
DISCUSIÓN
En las últimas dos décadas se han probado casi 50 compuestos
farmacológicos para el tratamiento de los pacientes con ELA165,
268.
Sin embargo
únicamente el Riluzol ha demostrado tener alguna actividad terapéutica, y esta
limitada a un aumento de la supervivencia de 2-3 meses269. El tratamiento de esta
enfermedad necesita, por tanto, de nuevas aproximaciones terapéuticas. Los estudios
preclínicos muestran que el tratamiento con células madre puede producir un efecto
beneficioso con capacidad para modificar el curso natural de la enfermedad a través
de mecanismos multifactoriales, muchos de ellos relacionados con sus efectos
tróficos270. Este efecto concuerda, además, con la importancia en la patogenia y
desarrollo de la enfermedad de la estabilidad del soporte ofrecido por células gliales a
las motoneuronas149,
tróficos144,
145, 147, 148.
150, 152, 153, 156, 271,
así como del correcto aporte de factores
El neurotrofismo puede por tanto ser beneficioso directamente
sobre la supervivencia de las motoneuronas, abortando el mecanismo de muerte
apoptótica, como indirectamente sobre las células del
micromedioambiente,
disminuyendo las señales de inflamación, la activación inmunopatológica o la
liberación de moléculas disreguladoras de actividades celulares clave. Nuestro grupo
ensayó esta hipótesis en un modelo animal de degeneración de motoneurona y
demostró que la infusión intraespinal de células de médula ósea produce un efecto
neurotrófico mediado por GDNF que no sólo mejora la supervivencia de las
motoneuronas en los ratones infundidos respecto a los controles, sino que también
mejora su estado funcional206. Estos prometedores hallazgos, concordantes con los
realizados por otros grupos con fuentes celulares similares y otras diferentes201, no
habían sido corroborados en pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Por
tanto, diseñamos un ensayo clínico fase I para explorar la factibilidad y seguridad de la
administración intraespinal a nivel T4-T5 de células mononucleadas autólogas de
médula ósea en pacientes con ELA, como paso previo necesario para poder
comprobar su eficacia. Además, nos propusimos comprobar el potencial efecto
neurotrófico de estas células en el hipotético caso de que tuviéramos la oportunidad de
hacer estudios necrópsicos255-257.
87
DISCUSIÓN
3. Factibilidad y seguridad de la inyección intraespinal a nivel T4T4-T5 de células
mononucleadas de
de médula ósea autóloga
En base a los datos reflejados en esta memoria y recientemente publicados, el
objetivo principal del estudio, la seguridad del procedimiento, puede considerarse
como demostrado, puesto que ninguno de los pacientes experimentó ningún evento
adverso severo relacionado con el procedimiento255. De hecho, todos los eventos
adversos no severos al menos posiblemente relacionados con el procedimiento fueron
como máximo grado 2 de la escala CTCAE v.3 y desaparecieron en su mayoría en un
plazo inferior a dos meses. Al final del estudio únicamente persistía estreñimiento en
dos pacientes y una zona de hipoestesia en parte de la planta del pie en otros dos
pacientes, uno de los cuales también presentaba una pequeña zona de hipoestesia en
la zona de la herida. Además, la intervención no aceleró el ritmo de progresión de la
enfermedad, medido con las escalas ALS-FRS, Norris y MRC. Como era previsible
tras una inyección intraespinal, se objetivaron alteraciones radiológicas medulares
visibles en la resonancia nuclear magnética, pero la mayoría de ellas fueron
transitorias y, en cualquier caso, no tuvieron ninguna repercusión clínica.
En el momento del diseño del ensayo, únicamente Mazzini el al.253, 254 habían
publicado una experiencia clínica preliminar, infundiendo en la médula espinal de un
grupo limitado de siete pacientes con ELA células mesenquimales de médula ósea
autólogas obtenidas tras cultivo in vitro. Los resultados, descritos extensamente en la
introducción de esta memoria, sugerían que el procedimiento era seguro. A diferencia
de nuestro estudio, la infusión se realizaba a un nivel inferior (T7-T9).
En años posteriores y mientras nuestro ensayo ya estaba en marcha, se han
publicado otros estudios en los que se ha ensayado la infusión intraparenquimatosa de
células madre de diferentes orígenes, que se citan a continuación:
•
Deda et al.272 infundieron a 13 pacientes células mononucleadas de médula
ósea autóloga separadas mediante gradiente de Ficoll y congeladas con
dimetilsulfóxido al 10% en la parte anterior de la médula espinal a nivel
cervical, previa laminectomía de C1-C2. Infundieron 0.1 mL de células
mediante una aguja de 21 G en múltiples inyecciones en la médula espinal.
88
DISCUSIÓN
Después cubrieron la médula espinal con Gelfoam, en el que inyectaron 3 mL
de células (al menos 106 células). Al cerrar la duramadre inyectaron 1.5 mL de
células (aproximadamente 5x106 células) en el espacio subaracnoideo y,
finalmente, otros 1.5 mL intravenosamente.
•
Martínez et al.273,
274
infundieron 2.5-7.5 x105 células CD133+ procedentes de
aféresis autólogas de sangre periférica movilizada con G-CSF en la corteza
motora de 10 pacientes y compararon su evolución con la de otros 10
pacientes que no entraron en el ensayo a pesar de cumplir los criterios de
inclusión. Desgraciadamente, los resultados de la comparación no son
valorables debido al mayor tiempo de evolución de la enfermedad en los
pacientes del grupo control (30.1 vs 14.3 meses). Los mismos autores han
publicado recientemente273 la prolongación del brazo experimental del estudio a
67 pacientes.
•
Mazzini et al.275 realizaron un segundo ensayo clínico fase I inyectando células
madre mesenquimales autólogas en la médula espinal tras laminectomía en
T4-T6 (el ensayo previo fue en T7-T9) en 10 pacientes. Recientemente han
publicado el seguimiento a largo plazo de los 19 pacientes combinados de los
dos ensayos276. El rango de seguimiento de los pacientes es de 24 a 105
meses.
•
Finalmente, Glass et al.277 acaban de publicar un ensayo en fase I en el que
infunden 106 de células madre neurales derivadas la médula espinal de un feto
de 8 semanas en la médula espinal de 12 pacientes, repartidas en 10
inyecciones de 105 células cada una, tras laminectomía de T11-T12. Los
pacientes recibieron inmunosupresión con metilprednisolona y prednisona y
dos dosis de basiliximab, seguidos de tacrolimus y micofenolato mofetil durante
toda la duración del estudio (6-18 meses).
Adicionalmente, otros autores han intentado aprovechar la capacidad de las
células madre de la médula ósea de generar células gliales278:
89
DISCUSIÓN
•
Appel et al.279, siguiendo la experiencia creada en el contexto de la
leucodistrofia metacromática280,
281,
realizaron un trasplante alogénico de
progenitores hematopoyéticos de sangre periférica de hermano HLA idéntico a
seis pacientes con ELA. El acondicionamiento incluía una dosis única de 450
cGy de irradiación corporal total en el día -6 y 30 mg/m2 de fludarabina y 10
mg/kg de ATG los días -5 a -2. La profilaxis de enfermedad injerto contra
huésped se realizó con tacrolimus y metotrexate. Los seis pacientes
alcanzaron quimera mixta en el día +30 que llegó a ser del 100% en cuatro
pacientes tras la disminución y suspensión de los inmunosupresores. Un
paciente adicional llegó a tener quimera completa hematológica tras recibir
infusión de linfocitos del donante.
•
Cashman
et
al.282
movilizaron
a
sangre
periférica
los
progenitores
hematopoyéticos de ocho pacientes de ELA con filgastrim (300-600 µg/kg/d x
5-6 días) hasta recolectar mediante aféresis un mínimo de 2x106 células
CD34+, que eran infundidas intravenosamente el día siguiente a la recogida.
•
Nefussy et al.283 realizaron el único ensayo aleatorizado y doble ciego.
Reclutaron 39 pacientes con ELA, a 19 de los cuales les administraron
filgastrim 5 µg/kg/d sc durante 4 días consecutivos cada tres meses, hasta
completar cuatro ciclos. Los 20 pacientes restantes recibieron suero fisiológico
en la misma pauta. Desgraciadamente 13 pacientes (6 con filgastrim, 7 con
placebo) revocaron el consentimiento para continuar el estudio, siete pacientes
(4 con filgastrim, 3 con placebo) precisaron traqueostomía y quedaron por eso
fuera del ensayo, y 2 pacientes del brazo de filgastrim fallecieron. Por tanto
sólo 17 pacientes finalizaron el estudio (7 con filgastrim, 10 con placebo),
obligando a los investigadores a comparar únicamente las valoraciones
realizadas en los seis primeros meses cuando la tasa de pérdida de pacientes
era solo del 28.2%.
No es posible realizar comparaciones valorables entre los diferentes estudios
expuestos y nuestro trabajo, dada la diversidad tanto cuantitativa como cualitativa de
las fuentes celulares utilizadas, las diferencias en las técnicas y sitios de infusión
90
DISCUSIÓN
celular, el escaso número de pacientes y los diferentes diseños empleados. No
obstante, todos los ensayos citados presentan datos de seguridad del procedimiento
similares a los que hemos obtenido con nuestro estudio, dando solidez a nuestros
resultados. La evidencia acumulada indica, por tanto, que la terapia celular en ELA es
factible y, lo que es más importante, segura. Sin embargo, su eficacia nunca ha sido
realmente testada: se trata de series de pacientes cortas y como se ha comentado sin
grupos aleatorizados de pacientes controles. El único ensayo aleatorizado283 no es
correctamente analizable por la alta tasa de pérdida de pacientes que presenta. A
pesar de ello, ofrece datos esperanzadores como el hecho de observar una caída de
la escala ALS-FRS-R de 6.56 puntos en el brazo placebo y solo de 4.66 en el brazo
con filgastrim, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa. Otro ensayo
con grupo control274, aunque no aleatorizado, ofrece también mejores supervivencias
en los pacientes que recibieron las células CD133+ (66 vs19 meses). Sin embargo,
este resultado puede estar influido por el hecho de que los pacientes del grupo control
tenían un tiempo de evolución de la enfermedad mayor que los del grupo
experimental, lo que es reconocido como un factor pronóstico adverso en esta
enfermedad. El ensayo con el mejor grupo control es el de Appel et al.279 y no
encuentra diferencias en la evolución de los pacientes trasplantados respecto a los
controles, pero en este caso se realizó un trasplante alogénico de progenitores
hematopoyéticos y el número de pacientes tratados fue únicamente de seis.
Probablemente la técnica más agresiva es la empleada por Deda et al.272. Sin
embargo, también es la que ofrece resultados más esperanzadores: nueve de los
trece pacientes presentaban mejoría en la escala bulbar y Norris, así como
electroneurológica, un año después de la intervención.
La evolución de nuestros pacientes concuerda con el marco general creado por
el resto de ensayos clínicos: con pacientes que claramente parecen haberse
beneficiado de la intervención, una mayoría en la que la enfermedad se mantiene
estable en su curso, y otra minoría con un curso agresivo que no se ve modificado por
la intervención255.
91
DISCUSIÓN
4. Efecto neurotrófico de las células mononucleadas de médula ósea autóloga
El diseño del presente ensayo estaba basado fundamentalmente en los
resultados preclínicos generados por nuestro grupo que demostraban que, en un
modelo animal de ELA, las células de médula ósea inyectadas en la médula espinal,
migraban al asta anterior de la misma, formaban nidos celulares alrededor de las
motoneuronas y producían GDNF206. Nuestra hipótesis, por tanto, era que los
mecanismos neurotróficos mediados por las células mononucleadas de médula ósea
modificarían positivamente el microambiente de las motoneuronas y, de este modo,
favorecerían su supervivencia. Y, de hecho, las muestras procedentes de las
autopsias mostraron rasgos histológicos bien definidos en cuanto a número y
distribución de las células y de las motoneuronas, así como ausencia de signos
degenerativos en las motoneuronas.
En las astas anteriores de los niveles medulares trasplantados (T4-T5) el
recuento de motoneuronas fue mayor que en otros niveles torácicos más rostrales y
más caudales. Únicamente en los niveles infiltrados se observó un número significativo
de células CD90+ esféricas, pequeñas y basofílicas, adyacentes a -o alrededor de- las
motoneuronas. La morfología y disposición de esas células era idéntica a la observada
en nuestro modelo animal, en el que habíamos demostrado un efecto neurotrófico de
dichas células sobre las motoneuronas mediado por GDNF206. Además, las
motoneuronas rodeadas por células CD90+ no tenían depósitos de ubiquitinina ni
mostraban signos morfológicos de neurodegeneración, sugiriendo que el mecanismo
neurotrófico mediado por las células trasplantadas observado en nuestro modelo
animal se estaba reproduciendo en nuestros pacientes.
Todo esto sugiere que las células mononucleadas autólogas de médula ósea
son capaces de injertar en las astas anteriores de la médula espinal de pacientes con
ELA, sobrevivir durante un tiempo prolongado formando nidos perineuronales y que,
muy probablemente, protegen a las motoneuronas de la neurodegeneración255.
De los ensayos clínicos anteriormente citados, solo los de Cashman et al.282 y
el de Appel et al.279 realizaron estudios necrópsicos. Ninguno de los dos infundió
directamente células madre en la médula espinal de los pacientes. El primero estaba
92
DISCUSIÓN
basado en la movilización de progenitores de médula ósea con G-CSF, y únicamente
encontró los cambios degenerativos propios de la ELA. El segundo, sin embargo, sí
encontró infiltración de la médula espinal por células macrofágicas-monocíticas y
dendríticas en los lugares de patología de motoneurona. Esta infiltración era mayor
que la observada en las médulas de pacientes no tratados con trasplante alogénico y
se correspondía con un aumento del DNA procedente del donante en dichas zonas.
Probablemente la justificación de esta diferencia observada con respecto al ensayo de
Cashman et al. tenga que ver con la rotura de la barrera hematoencefálica producida
por la irradiación corporal total realizada en el acondicionamiento del trasplante
alogénico. Ninguno de estos autores observaron el fenómeno descrito por nosotros de
formación de nidos neuroprotectores de células madre CD90+, siendo, por tanto, la
primera vez que se describe en humanos255.
Nuestros hallazgos demuestran por primera vez en pacientes con ELA un
mecanismo de acción neurotrófico de la terapia con células madre autólogas
procedentes de médula ósea y abren una nueva vía de investigación en la terapia con
células de las enfermedades neurodegenerativas.
Nuestro grupo continúa actualmente en esta línea de investigación traslacional
y ya está en marcha un estudio de eficacia aleatorizado con un grupo control. Nuestro
propósito es intentar trasladar los hallazgos de la ciencia básica a la clínica, volviendo
de nuevo al laboratorio para resolver las nuevas incógnitas que surjan en los ensayos
clínicos, así como otras preguntas aún no resueltas de esta novedosa aproximación
terapéutica basada en “curar con células”.
93
DISCUSIÓN
94
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
95
CONCLUSIONES
96
CONCLUSIONES
-
En relación con la factibilidad y seguridad de la inyección intraespinal de células
mononucleadas de médula ósea autóloga.
autóloga.
Nuestros resultados demuestran la ausencia de eventos adversos severos
relacionados con el procedimiento. Se apreciaron eventos de intensidad leve o
moderada, de duración transitoria. Concluimos, por tanto, que nuestra técnica de
inyección intraespinal de células mononucleadas autólogas de médula ósea en
pacientes con ELA, es factible y segura.
-
En relación al efecto neurotrófico
neurotrófico que se aprecia en los modelos animales y su
potencial existencia en los pacientes con ELA.
La similitud de los hallazgos histológicos encontrados en los pacientes
estudiados y los de nuestro modelo animal, el incremento significativo del número de
motoneuronas en los segmentos medulares trasplantados, y la ausencia de signos
degenerativos en las motoneuronas rodeadas por nidos celulares, indican con un alto
grado de certeza que las células mononucleares autólogas de médula ósea inyectadas
en la médula espinal de pacientes con ELA ejercen un efecto neurotrófico similar al
observado en estudios preclínicos.
Estos datos abren nuevas vías de investigación en la terapia celular de las
enfermedades neurodegenerativas.
97
CONCLUSIONES
98
BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA
99
BIBLIOGRAFÍA
100
BIBLIOGRAFÍA
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