Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Alejandro Yáñez C.
INSTITUTO : Bioquímica y Microbiología
FACULTAD : Ciencias
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Dr. Víctor Olavarría C.
INSTITUTO : Bioquímica y Microbiología
FACULTAD : Ciencias
“INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ROS POR EFECTO DE LA INFECCIÓN CON
VIRUS ISA EN Salmo salar: MAPK POTENCIAL BLANCO TERAPÉUTICO"
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar
al Título de Químico Farmacéutico.
BORIS ARTURO SALAS DELGADO
VALDIVIA-CHILE
2013
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Alejandro Yañez C.
INSTITUTO: Bioquímica y Microbiología.
FACULTAD: Ciencias.
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Dr.Víctor Olavarría C.
INSTITUTO: Bioquímica y Microbiología.
FACULTAD: Ciencias.
―INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ROS POR EFECTO DE LA INFECCIÓN
CON VIRUS ISA EN Salmo salar : MAPK POTENCIAL BLANCO TERAPÉUTICO‖.
Tesis de Grado presentada
como parte de los requisitos para optar
al título de Químico Farmacéutico
BORIS ARTURO SALAS DELGADO
VALDIVIA – CHILE
2013
¡Caer está permitido, levantarse es obligatorio!
AGRADECIMIENTOS.
En primer lugar agradezco a mi madre, Alicia, por todo el apoyo que me brindó durante
todos los años de mi formación, esta tesis te la dedico a ti. A mis abuelos Rosa, Arnoldo y Sra.
Eva que descansan en paz, muchas gracias por todos los momentos que compartí con ustedes. A
mi familia que está repartida por todo el país, mis tíos Guillermo, Jorge, Verónica, David,
Juvencio, Cecilia Leal, Sabino, Cecilia González, Miguel, Rossana, Gloria, Raúl, Parmenia,
muchas gracias por su preocupación y acogida cada vez que uno los iba a visitar. A todos mis
primos, Javiera, Mía, Verónica, Cristóbal, Francisco, Carolina, Fernanda, Macarena, Francisca,
Daniela, Sebastián, Matías, Loreto y Fabián por todas las veces que hemos compartido cuando se
ha dado la instancia de reunirnos.
Al Dr. Alejandro Yañez por haberme dado la oportunidad de trabajar en su laboratorio y de
haber sido paciente hasta el último momento para esperar los resultados de esta tesis. Al Dr.
Víctor Olavarría muchas gracias por haber trabajado con usted codo a codo en este proyecto, cada
percance que tuvimos fue una oportunidad para aprender más técnicas que nunca pensé que las iba
a implementar, de usted aprendí muchas cosas así que le estaré agradecido eternamente.
Al Dr.Guillermo Cárcamo por ser parte de mi comisión de tesis.
A la señorita Psicopedagoga Carmen Gloria Ibáñez muchas gracias por haberme ayudado,
usted llegó en el momento exacto en el que necesitaba un cambio de actitud para enfrentar las
cosas como debe ser y de haber devuelto la confianza en mí.
A todos mis amigos también les dedico esta tesis a José, Ilse, Mauricio, Texia, Claudio,
Gloria, Christián, Selenne, Mariel, Marcia. Chicos, gracias muchas gracias por haber tenido la
oportunidad de conocerlos y compartir cada ocasión.
También quiero agradecer a los dos laboratorios donde trabajé y obviamente al personal
que lo conforman, me refiero al laboratorio del Dr. Alejandro Yañez y el laboratorio de Virología
del Dr. Víctor Olavarría.
Es muy probable que se me quede gente fuera de esta dedicatoria pero también quiero
agradecer a todo el Instituto de Bioquímica y Microbiología, de todas las personas que lo
conforman, desde el Director del Instituto hasta el personal no académico, que en algún momento
compartí con ellos. Este trabajo fue realizado en el Instituto de Bioquímica y Microbiología de la
Universidad Austral de Chile y fue financiado por el Proyecto FONDEF
FONDECYT POSTDOCTORAL3120027.
D08I1055 y
INDICE.
1
RESUMEN.............................................................................................................. .
1
1.1.
SUMMARY............................................................................................................
2
2.
INTRODUCCIÓN.................................................................................................. .
3
2.1.
Anemia Infecciosa del Salmón (ISA)...................................................................... .
3
2.2.
Características del virus…………………………………………………………….
4
2.3.
Mecanismo de infección……………………………………………………………
6
2.4.
Virus ISA en Chile……………………………………………………………….....
10
2.5.
Inmunidad de teleósteos……………………………………………………………
11
2.6.
Salmónidos y el virus ISA………………………………………………………….
11
2.7.
Complejo NADPH oxidasa………………………………………………………….
12
2.8.
Proteínas MAPK "Interruptores celulares"…………………………………………
15
2.9.
Estallido respiratorio, parte de la inmunidad innata……………………………… …
19
2.10. Stress oxidativo celular………………………………………………………………
20
2.11. Virus y stress oxidativo……………………………………………………………..
22
3.
HIPÓTESIS…………………………………………………………………………...
24
4.
OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………
24
4.1
Objetivos específicos………………………………………………………………...
24
5.
MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………
25
5.1.
Materiales……………………………………………………………………………..
25
5.1.1. Soluciones……………………………………………………………………………..
25
5.1.2. Instrumentos utilizados…………………………………………………………… …..
26
5.2.
28
MÉTODOS………………………………………………………………………........
5.2.1. Animales de experimentación………………………………………………………….
28
5.2.2. Cultivo celular y tratamiento…………………………………………………………..
28
5.2.3. Propagación del virus ISA……………………………………………………………..
29
5.2.4. Concentración del virus ISA…………………………………………………………..
30
5.2.5. Cuantificación de RNA eucariótico……………………………………………………
30
5.2.6. Generación de la hebra de cDNA (Retro-transcripción)……………………………
31
5.2.7. Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)…………………………………………..
32
5.2.8. Electroforesis en gel de agarosa………………………………………………………… 33
5.2.9. Reacción de la polimerasa en cadena en tiempo real (qPCR)…………………………
34
5.2.10. Extracción de proteínas a partir de líneas celulares CHSE-214……………………….
34
5.2.11. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico (BCA)………….. 35
5.2.12. Inmunoprecipitación proteica…………………………………………………………… 36
5.2.13. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)……………………………………..
39
5.2.14. Western blot……………………………………………………………………………… 40
5.2.15. Inmunofluorescencia……………………………………………………………………. 41
5.2.16. Estallido respiratorio…………………………………………………………………….. 42
6.
RESULTADOS…………………………………………………………………………... 43
6.1.
Obtención de cultivo primario de riñón cefálico de S. salar…………………………..
44
6.2.
Propagación de virus ISA en línea celular CHSE-214…………………………………
45
6.3.
Producción de ROS en cultivo primario de riñón cefálico de S. salar incubado con
virus ISA……………….................................................................................................... 47
6.4.
Inhibición farmacológica de las proteínas MAPK bloquea la producción de ROS
en leucocitos infectados con ISAv………………………………………………………. 49
6.5.
Efecto de ISAv en la expresión de marcadores de estrés celular.……………………….. 51
6.6.
Efecto ISAv en la expresión de genes de expresión temprana y reguladores génicos de
estrés celular……………………………………………………………………………… 53
6.7.
Activación p38 MAPK en células infectadas con virus ISA……………………………. 55
7.
DISCUSIÓN……………………………………………………………………………... 57
8.
CONCLUSIÓN…………………………………………………………………………… 62
9.
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………. 63
INDICE DE FIGURAS.
Figura 1.
Representación esquemática de ISAv………………………….........................
Figura 2.
Representación esquemática de la infección del virus ISA en una célula de pez.
6
……………………………………………………………………………………. 8
Figura 3.
Efecto de la infección por virus ISA a nivel macroscópico……………………
Figura 4.
Secuencia aminoacídica de la subunidad p47 phox de S.salar…………………. 14
Figura 5.
Principales vías MAPK celulares…..................................................................... 18
Figura 6.
Esquema representativo del estallido respiratorio………………………………. 20
Figura 7.
Imagen de cultivos celulares empleados…………………………………………. 29
Figura 8.
Representación de la inmunoprecipitación e incubación de la proteína p38……. 38
Figura 9.
Esquema representativo de un cultivo primario………………………………….. 44
Figura 10.
Propagación del virus ISA en la línea celular CHSE-214…………………........ 46
Figura 11.
Efecto de la producción de ROS por parte del virus ISA en riñón cefálico…….. 48
Figura 12.
Efecto de inhibición farmacológica frente al virus ISA en riñón cefálico……….. 50
Figura 13.
Efecto de ISAv en la expresión de marcadores de estrés………………………… 52
Figura 14.
Efecto de virus ISA en expresión de genes de estrés celular……………………... 54
Figura 15.
Cinética de activación de p38 MAPK en células CHSE-214…………………….. 56
Figura 16.
Modelo propuesto………………………………………………………………....61
9
INDICE DE TABLAS.
Tabla I:
Resumen de primers diseñados para qPCR………………………………………. 33
LISTA DE ABREVIATURAS.
ASK-1: Atlantic salmon kidney / Riñón de salmón atlántico.
BCA: Ácido bicinconínico.
cDNA: Complementary DNA/ DNA complementario.
CHSE-214: Chinook salmon embryon / Embrión de salmón de Chinook.
CPE: Citopatic effect / Efecto citopático.
DNA: Desoxyribonucleic acid / Ácido desorribonucleico.
dNTP: Desoxirribunucleótido trifosfato.
ERK: Extracelular signal-regulated kinases / Kinasa señal de regulación extracelular.
FBS: Fetal Bovine serum / Suero bovino fetal.
GPX: Glutatión peroxidasa.
HE: Hemaglutinina.
HPR: High polimorfic region / Región altamente polimórfica.
H₂O₂: Peróxido de hidrógeno.
IRF: Interferon regular factor/ Factor regulación de interferón.
ISA: Anemia infecciosa del salmón.
ISAv: Virus de la anemia infecciosa del salmón.
M1-M2: Proteína de matriz 1 y 2
MAPK: Proteína kinasa de acción mitógena.
MEM: Medio mínimo esencial.
MOI: Multiplicidad de infección.
MPx: Mieloperoxidasa.
NO: Óxido nítrico.
NOX: NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase) / (Nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato oxidasa).
NP: Nucleoproteína.
•O₂-: Anión superóxido.
•OH−: Radical hidroxilo.
PA: Polimerasa ácida
PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetato
PB: Proteína polimerasa.
PCR: Polymerase Chain reaction / Reacción en cadena de la polimerasa .
qPCR: Quantitative polymerase Chain reaction / Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
PF: Proteína de fusión.
PKC: Proteína kinasa C.
RIPA: Radio Immunoprecipitation Assay
RNA: Ribonucleic acid / Ácido ribonucleico.
RNS: Reactive nitrogen species / Especies reactivas de nitrógeno.
ROS: Reactive oxygen species / Especies reactivas de oxígeno.
rpm: revoluciones por minuto.
RT-PCR: Reverse transcription-PCR / Transcripción reversa-PCR.
SOD: Superóxide dismutase / Superóxido dismutasa.
SDS: dodecilsulfato de sodio.
SHK-1: Salmon head kidney / Riñón cefálico de salmón.
TEMED: NNN‘,N‘-tetrametilenetindiamina.
TLR: Toll-like receptors / Receptores Toll-like
Tm: Temperatura de fusión.
TNE: Tris-HCl, NaCl, EDTA.
1
1. RESUMEN.
La anemia infecciosa del salmón (ISA) es una enfermedad provocada por un virus del
mismo nombre el cual ataca a la especie del Salmón Atlántico (Salmo salar) y que también se
puede encontrar en las especies de Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y en Salmón Coho
(Oncorhynchus kisutch) utilizándolos como vector. Al utilizar las células del salmón para
replicarse, provoca lesiones a nivel de la piel como petequias, inflamación del bazo, intestino e
hígado, exolftamia, reducción de glóbulos rojos, branquias pálidas y como última consecuencia
es la muerte de la especie.
La producción de ROS por efecto de la infección viral en cultivo primario de riñón cefálico
fue demostrado en este estudio. La adición de virus ISA mostró un incremento de ROS en las
células provocando la muerte de ellas. La inhibición farmacológica de la proteína p38 MAPK
por parte de inhibidor SB203580 mostró una reducción de producción de ROS, no así con
PD98059 que inhibe a ERK ½ donde se observó que ROS mantenía sus niveles elevados de
producción. Igualmente al evaluar la expresión de genes temprano y reguladores génicos de
estrés celular demostró un incremento de NRF2, Jun y ERK ½. Por último se comprobó que a
medida que transcurre el tiempo, aumenta la activación de la proteína p38 en presencia del virus
ISA.
Concluimos que ISAv está involucrada en la producción de ROS y expresión de genes
antioxidantes como un mecanismo de defensa contra la producción de ROS por medio de la
activación de MAPK p38 y ERK ½ , respectivamente.
2
1.1 SUMMARY.
The infectious salmon anemia (ISA) is a disease caused by a virus of the same name wich
attacks species of Atlantic salmon (Salmo salar) and can also be found in the species of Rainbow
Trout (Oncorhynchus mykiss) and Salmon Coho (Oncorhynchus kisutch). By using salmon cells
to replicate, causes lesions in the skin as petechiae, enlarged spleen, intestine and liver,
exolftamia, decreased red blood cells, pale gills and the ultímate effect is the death of the specie.
ROS production as a result of viral infection of cultured primary head kidney was
demostrated in this study.ISA virus showed an increase of ROS in cells killing them.
Pharmacological inhibition of p38 inhibitor SB203580 showed reduction of ROS production, but
not with PD98059 which inhibits ERK ½ where ROS observed maintained their high production
levels. Additionally, we demostrated that ISAv increased the NRF2and Jun expression. Finally it
was found that as the time passes, increases activation of p38 protein in the presence of ISA
virus.
Conclude that ISAv stimulates production of ROS and antioxidant gene expression
throught the activation of p38 and ERK 1/2 MAPK.
3
2. INTRODUCCIÓN.
2.1. Anemia infecciosa del salmón (ISA).
La anemia infecciosa de salmón (ISA) es un síndrome multisistémico de alta mortalidad
que afecta comúnmente a la especie del Salmón del Atlántico (Salmo salar) (Raynard et al.,
2001). La patología es caracterizada por infecciones individuales, mostrando lesiones a nivel
macroscópico como inflamación del bazo, branquias pálidas, congestión intestinal y anemia
severa (Falk et al., 1995; Jones et al., 1999; Simko et al.,2000; Speilberg et al., 1995).
Esta enfermedad ha sido descrita en las salmoniculturas de Noruega, Canadá, E.E.U.U.,
Escocia, Islas Faroe y Chile (Bouchard et al., 2001; Kibenge et al., 2001a; Lovely et al., 1999;
Rowley et al., 1999; Thorud and Djupvik, 1988). Fue en Noruega en el año 1984 que se detectó
y se dio el primer reporte de la presencia de un nuevo agente, provocando mermas económicas a
la industria pesquera de ese país, afectando a los cultivos de salmón atlántico presentándose
como una anemia aguda (Thorud and Djupvik, 1988).
El agente causal de esta afección fue visto por primera vez a través de microscopía
electrónica en muestras de distintos tejidos 10 años después de la primera infección y fue
descrito como un virus tipo partícula con 100nm de diámetro similar a un Mixovirus (Dannevig
et al., 1995; Hovland et al., 1994). Posteriormente se obtuvo un inoculado viral en líneas
celulares derivadas de cabeza de riñón de salmón (SHK–1) encontrando un efecto citopático a
los 12 – 14 días post-infección, confirmando la presencia del virus por microscopía electrónica
(Dannevig et al., 1995). Quince años después de la primera epidemia, el síndrome fue
nuevamente detectado en otros países productores de S. salar; se aisló el agente etiológico que
tenía características similares de los descritos en Noruega, dañando a las salmonicultura de
4
Canadá, Escocia, Estados Unidos y Chile; la caracterización de la partícula viral fue hecha por
infección y determinación de efecto citopático en líneas celulares de SHK-1, epitelioma
papulosum cyprini (EPC) y células embrionarias de salmón Chinook (CHSE-214), se cuantificó
por medio de la técnica RT- PCR y se visualizó por microscopía electrónica, observándose una
partícula viral de 100nm de diámetro (Bouchard et al.,2001; Godoy et al., 2008; Lovely et al.,
1999; Rowley et al., 1999).
2.2. Características del virus.
La familia Orthomyxoviridae está dividida en 5 géneros que son diferenciados por sus
características genéticas y el tipo de hospedero que infectan (Palese and Shaw, 2007). El virus de
la anemia infecciosa de salmón (ISAv) es el primer miembro de la familia Orthomyxoviridae que
ha sido caracterizada en peces y que es clasificado como un nuevo género Isavirus (Dannevig et
al., 2008;Kawaoka et al., 2005). En diversos estudios a través de varios aislados virales que se
obtuvieron de distintos países, por medio de microscopía electrónica se reveló que los distintos
aislados poseían características morfológicas similares (Bouchard et al., 1999; Kibenge et al.,
2001a; Nylund et al., 1995; Rowley et al., 1999). En el análisis de su estructura se encontró que
la partícula viral tiene un diámetro aproximado de 100 nm (Hovland et al,1994), su genoma
consta de una hebra simple de RNA que posee una polaridad negativa y está dividida en 8
segmentos los cuales generan 10 proteínas distintas (Mjaaland et al., 1997; Rimstad and
Mjaaland, 2002). Al respecto, la organización funcional del genoma para la codificación de las
distintas proteínas es la siguiente: Los segmentos 1, 2 y 4 codifican para la generación de las
polimerasas virales (PB2,PB1 ,PA) (Clouthier et al., 2002; Krossøy et al., 1999; Snow et al.,
2003), mientras que el segmento 3 codifica la nucleoproteína (NP) (Aspehauget al., 2004; Snow
5
and Cunningham, 2001). El segmento 5 del virus es responsable de crear la proteína de fusión
(F) encargada de la fusión de las membranas viral y celular.
En lo que respecta al segmento 6 del genoma, es el encargado de codificar la proteína
hemaglutininaesterasa (HE) que actúa en la unión con el receptor y en la liberación de los nuevos
viriones (Falk et al., 2004; Krossøy et al., 2001; Rimstad et al., 2001); por lo menos 2 proteínas
están codificadas en cada uno de los 2 segmentos más pequeños: El RNAm del segmento 7
produce una proteína no estructural con propiedades antagónicas al interferón del huésped
(Biering et al., 2002; McBeath et al., 2006; García-Rosado et al., in press), mientras que el
segundo marco de lectura se sugiere que codifica para proteínas de exportación nuclear (Kibenge
et al., 2007). Por último, el segmento 8 codifica para la proteína de matriz (M1) y la proteína M2
que posee dos señales de localización nuclear y su función todavía es desconocida (Biering et al.,
2002; Falk et al., 2004).
6
Fig 1: Representación esquemática de ISAv. Las flechas indican las proteínas estructurales
principales que conforman la partícula viral y las proteínas que forman el complejo
ribonucleoproteico, también indican las proteínas generadas por cada segmento viral.
2.3 Mecanismo de infección.
El mecanismo que utiliza el virus para poder infectar el hospedero consta de varias
etapas: (1) El virus por medio de la hemaglutinina de su estructura externa, da origen a la etapa
de adsorción con el receptor del hospedero, hasta el momento desconocido pero que
estructuralmente posee ácido sialico, fenómeno celular que induce la endocitosis de la partícula
viral (Eliassen et al., 2000; Hellebo et al., 2004; Kristiansen et al., 2002; Workenhe et al.,
2007)(2) dentro del endosoma, el virus por medio de los canales iónicos genera una bomba de
protones para liberar el complejo ribonucleoproteico y la membrana viral se une con la
membrana del endosoma (Aspehaug et al.,2005; Eliassen et al., 2000).(3) El complejo
7
ribonucleoproteico que está conformado por el RNA del virus, NP y las polimerasas virales
viajan desde al citoplasma hacia el núcleo del hospedero (Falk et al., 1997; Palese and Shaw,
2007);(4) ya posesionado en el núcleo se da inicio a la replicación y transcripción de material
genético usando la maquinaria de la célula huésped por parte del complejo ribonucleoproteico
(Palese and Shaw, 2007; Sandvik et al., 2000). (5) Finalizada la transcripción del RNA del virus
se comienza con la traducción del transcrito viral que lleva la información para la generación de
los distintos componentes del virus, es el caso de los segmentos 5 y 6 que codifican para las
glicoproteínas de superficie y el segmento 8, estos son traducidos por los ribosomas asociados
con el retículo endoplásmico, el resto de los segmentos son traducidos por ribosomas que
circulan libres por el citoplasma (Falk et al., 2004; Palese and Shaw, 2007).(6) Las proteínas que
fueron generadas en el citoplasma, son transportadas hacia el núcleo (Palese and Shaw, 2007);
(7) las glicoproteínas de superficie con el canal iónico siguen la vía secretoria desde el retículo
endoplásmico a través del aparato de Golgi, para después permanecer en la membrana plasmática
de la célula (Aspehaug et al., 2005; Falk et al., 2004; Mulleret al., 2010; Palese and Shaw, 2007).
(8) El complejo ribonucleoproteico en ayuda de una proteína transportadora nuclear, es llevada
hacia el citoplasma (Goic et al., 2008; Palese and Shaw, 2007). (9) El complejo
ribonucleoproteico comienza a interactuar con la región de la membrana plasmática en donde se
encuentran alojados los otros componentes para originar un nuevo virus (Fig 2) (Koren and
Nylund,1997; Palese and Shaw, 2007; Totland et al., 1996).
8
Fig 2: Representación esquemática de la infección del virus ISA en una célula de pez, donde
muestran los eventos más importantes asociados al proceso, indicando también las proteínas que
son generadas durante la infección.
9
Fig 3:Efecto de la infección por virus ISA a nivel macroscópico. En la imagen se muestra en
forma comparativa (A) salmón sano (B) salmón infectado con ISAv que presenta exoftalmia. (C)
salmón con ictericia (D) y petequias en grasa visceral.
10
2.4. Virus ISA en Chile.
Los primeros antecedentes que confirman la presencia del virus ISA datan del año 2007,
específicamente en la isla de Chiloé posterior a un brote de Pisciricketsiosis. Luego de varios
análisis a través de técnicas inmunológicas e histopatológicas se confirmó el primer brote de
anemia infecciosa de salmón y el primer aislamiento a partir de la especie Salmo salar (M.
Godoy1, F. Kibenge2, A. Aedo1, M. Kibenge2, D. Groman2, H. Grothusen1,A. Lisperguer3, M.
Calbucura1, F. Avendano3, M. Imilan3, M. Jarpa3.,2007).
El virus presenta variaciones en su genoma por lo que se ha clasificado en 2 grupos, el
genotipo I que corresponde a aislados europeos y chilenos y el genotipo II que son aislados
norteamericano (Blake et al., 1999; Devold et al., 2001; Kibenge et al., 2001b). Estas variaciones
son responsabilidad de las secuencias de regiones altamente polimórficas (HPR), (Krossoy et
al., 2001a;Nylund et al., 2003) en Chile predominan los subtipos HPR7b y el HPR0 (Kibenge et
al., 2009; McBeath et al., 2009; Nylund et al., 2007). El subtipo HPR7b de virus ISA provoca
daño en los órganos como el hígado, riñones, bazo e intestino en conjunto con características
visibles como exoftalmia y petequias abdominales, todo ya mencionado con la anemia durante el
curso de la enfermedad (Falk et al., 1995;Godoy et al., 2008; Jones et al., 1999; Moneke et al.,
2005; Rimstad et al., 1999; Simko et al., 2000; Speilberg et al., 1995), mientras que el subtipo
HPR0 causa una infección subclínica respiratoria , pero que no provoca mayor daño en la
especie acuática ya que el tipo HPR0 es de baja patogenicidad a diferencia de los otros subtipos
que son más agresivos (Debes H. Christiansen,1 Peter S. Ostergaard,1 Michael Snow,2Ole
Bendik Dale3 and Knut Falk3).
11
2.5. Inmunidad de teleósteos.
En lo que se refiere al sistema inmune, este es dividido en 2 sistemas; el sistema innato
(no específico) y el sistema
adquirido (específico), sin embargo, un creciente número de
evidencia, tanto en peces como en mamíferos, indica que se trata de sistemas combinados. La
respuesta innata suele preceder a la respuesta adaptativa y determina la naturaleza de la respuesta
adaptativa y colabora en el mantenimiento de la homeostasis (Fearon DT, Locksley RM.,1996;
1997).
Los peces necesitan este sistema ya que es de vital importancia en la lucha contra las
infecciones. El argumento se basa en la ineficiencia intrínseca de la respuesta inmune adquirida
de peces debido a su estado evolutivo y naturaleza poiquiloterma, ello se traduce en un limitado
número de anticuerpos, en la afinidad de la memoria y una lenta proliferación de linfocitos
(Alexander JB, Ingram GA1992; Ellis AE.,2001; Du Pasquier L.,1982). Por otra parte, el sistema
inmune innato es la principal arma de defensa de los invertebrados y una fundamental defensa de
los peces, el cual también juega un rol instructivo en la respuesta inmune adquirida y en la
homeostasis inmunológica. Los parámetros humorales del sistema inmune incluye inhibidores de
crecimiento, varias enzimas líticas y componentes de la vía del complemento, aglutininas,
precipitinas (opsoninas, principalmente las lectinas), anticuerpos naturales, citoquinas,
quemoquinas y péptidos antibacterianos (Bergljo´ t Magnado´ ttir 2004).
2.6. Salmónidos y el virus ISA.
Los peces al estar expuesto al virus generan mecanismos de defensa para evitar la
proliferación del agente invasor. La respuesta contra la infección viral parte con la activación del
sistema inmune innato el cual es asociado por el reconocimiento de la presencia patógena a
12
través de los receptores Toll-like (TLR) (Janeway and Medzhitov, 2002). Luego, las células
inmunitarias del huésped responde por fagocitosis, secreción de citoquinas
(IFN tipo I y
citoquinas proinflamatorias: IL-1, IL-2, TNF-á) y las quemoquinas (Janeway et al., 2005).
Una de las primarias respuestas innatas contra el virus es la secreción de interferón tipo I
(IFN α-β), en donde la mayoría de las células infectadas usan el RNA helicasa (RIG-I y Mda5) o
los TLRs para detectar ácidos nucleicos virales; la encuadernación de los intermediarios RIG-I,
Mda5 o los TLRs dan lugar a una activación coordinada de los factores de transcripción NF-kB,
el factor regulador de interferón 3 (IRF-3) y el IRF-9 (Randall and Goodbourn, 2008). Estos
factores de transcripción a su vez regulan la expresión de cientos de genes tales como IFN, genes
estimulantes de IFN, citoquinas proinflamatorias y quemoquinas que están involucrados en la
organización de la respuesta inmune adaptativa (Katze et al., 2008, Haller et al., 2006).
A medida que avanza la replicación del virus, las células presentadoras del antígeno
muestran los antígenos fijados a MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) tipo I sobre la
superficie celular para la detección por parte de los linfocitos T citotóxicos. Además, los
antígenos son procesados para la producción de anticuerpos específicos que son importantes en
la protección contra la infección viral (Janeway et al., 2005).
2.7. Complejo NADPH oxidasa.
La familia de proteínas NADPH oxidasa (NOX) es un complejo enzimático capaz de
generar el anión superóxido (•O₂-), y otras especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS pueden
ser perjudicial para las células por el daño que sufre el ADN, las proteínas y lípidos. Sin
embargo, la rápida generación de ROS es vital para la célula a la hora de defenderse contra
hongos, bacterias y partículas virales.
13
El rápido consumo de oxígeno en los neutrófilos siguiendo la activación del complejo
NOX se le nombra como estallido respiratorio. La activación de NOX en neutrófilos se produce
en respuesta a estímulos fisiológicos tales como péptidos formulados, partículas opsonizadas, la
adhesión dependiente de integrina (Graham et al., 2007; Mocsai et al.,2002) y la ligación de
receptores de reconocimiento a patógenos específicos (por ejemplo dectin-1 ) (Gantner et al.,
2003).
NOX es la principal fuente de generación de ROS en neutrófilos y macrófagos activados.
El complejo NOX requiere el reclutamiento de varias subunidades hasta la membrana fagocítica
y su ensamblaje con el citocromo b558 para su activación y generación de ROS (Bokoch et
al.,1994). Este citocromo es una flavohemoproteína que comprende de dos componentes NOX
asociados a membrana gp91phox y p22phox (Huang et al.,1995) y tres componentes NOX
citosólicos que son p47phox, p67phox y una segunda proteína de bajo peso molecular que une
GTP, Rac2. Estas últimas, translocan desde el citosol a la membrana durante el ensamblaje de la
maquinaria enzimática activa. La subunidad p47phox es clave y fundamental para la activación
del complejo, este componente proteico tiene varios sitios de fosforilación, que interesantemente
están conservados en salmónidos (Huang et al.,1999; Olavarría et al.,2010), necesarios para la
activación de esta subunidad y por lo tanto del complejo NOX. Al respecto, se han descrito
diferentes proteínas quinasas que activan p47phox, tales como PKC (Dang et al .,2001; Fontayne
et al.,2002; Olavarría et al.,2010) y p38 MAPK (El Benna et al.,1996; Olavarría et al.,2010).
14
Fig 4: Secuencia aminoacídica de la subunidad p47 phox de S.salar.
15
2.8. Proteínas MAPK “interruptores celulares”.
La cascada de proteína quinasa de actividad mitógena (MAPK) es una vía de señalización
evolucionadamente conservada. Las vías de señalización intracelulares responden a varios
estímulos extracelulares y controlan un largo número de procesos extracelulares como
crecimiento, proliferación, diferenciación, motilidad, respuesta al stress, sobrevivencia y
apoptosis (Y.D.Shauld et al.,2007; G. Pimienta et al.,2007). Cada cascada consiste en tres
corazones quinasas (MAP3K, MAPKK y MAPK) y a menudo también componentes río arriba
(MAP4K) y río abajo (MAPKAPK). Cada una de estas señales es propagada por fosforilación
secuencial y activación de las secuencias quinasas, y ellos eventualmente llevan la fosforilación
de las proteínas reguladoras marcadoras por los componentes MAPK
y MAPKAPK.
Actualmente, cuatro cascadas MAPK han sido identificadas y nombradas de acuerdo a los
componentes de MAPK: señal-regulación extracelular 1 y 2 (ERK 1/2), c-Jun kinasa N-terminal
(JNK), p38 y ERK5 (P. Coulombe et al .,2007)
En orden a ejecutar sus funciones, las MAPKs y MAPKAPKs fosforilan y modulan la
actividad de cientos de sustratos. La localización subcelular de estos sustratos varían
dependiendo del tipo celular, el estímulo y la función reguladora (S.Yoon et al .,2006; Z. Yao et
al.,2009).
ERK 1/2: esta cascada desempeña un papel central en la señalización de una amplia
variedad de agentes extracelulares que operan a través de diversos receptores. En la mayoría de
los casos la activación de dichos receptores se transmite por varios mecanismos a la pequeña
GTPasa Ras, la cual es activada principalmente en la membrana plasmática. A su vez, Ras
activada recluta a nivel de la cascada MAP3K a la membrana plasmática a fin de inducir su
activación (T. Niault et al., 2010). A partir de ahí, la señal es transmitida a las MAPKKs MEK1
16
y MEK2 (MEK 1/2) y en menor medida la alternativa MEK1b (Y.D.Shaul et al ., 2009)
mediante la fosforilación de sus residuos de serina-específicos. A su vez, al activar MEK ½, este
transmite su señal a ERK1 y ERK2 (ERK1/2) (R.Seger et al ., 1995) y también alternativamente
a ERK1b y ERK1c (Y.Yung et al .,2000; D.M. Aebersold et al ., 2004). Finalmente, las señales o
interruptores ―encendidos‖ o ―apagados‖ están localizados en el citoplasma, el núcleo o en otros
organelos celulares (Z.Yao et al .,2009), desarrollando complejas conexiones muchas de ellas
aún desconocidas, sobretodo en peces.
JNK: fue inicialmente identificada como un regulador del factor de transcripción c-Jun y
un mediador de stress intra o extracelular por lo que se denominó proteína kinasa activadora de
stress (SAPK) (R.J. Davis et al.,1994) No obstante, como el resto de las MAPKs, fue más tarde
demostrado que esta cascada es también estimulada por un gran número de estímulos
independiente de stress y receptores incluyendo los mitógenos (G.L.Johnson et al.,2007; M.A.
Bogoyevitch et al.,2010). Luego de su activación, el stress y otros estímulos transmiten sus
señales a las pequeñas GTPasas como la CDC42 y Rac1, que activan el nivel de MAPK3 ya sea
directamente o a través de MAPK4s. Alternativamente la cascada de MAPK3s y MAPK4s
también pueden ser directamente activada por estímulo de interacción con proteínas adaptadoras
como la TRAF (J.R.Bradley et al., 2001). Un gran número de MAPK4s (I.Dan et al., 2001) y
MAPK3s (E.A. Craig et al., 2008) han sido identificado hasta el momento y cada una de ellas
parece transmitir la señal de cascada de unión a distintas proteínas de andamiaje en condiciones
distintas (A.J. Whitmarsh et al.,2006). Tras la activación, las quinasas a nivel de MAPK3
transmite las señales mediante fosforilación de los residuos de Thr y Ser en el bucle de
activación, y de este modo activa las kinasas en el nivel de MAPKK (MAPK4 y MKK7)
17
(X.Wang et al., 2007). A su vez, estas kinasas activa los tres componentes a nivel de MAPK
(JNK1-3; 46 y 54 KDa: JNKs) por fosforilación directa.
Tras la estimulación, las JNKs y posiblemente sus MAPKAPKs fosforilan un gran
número de sustratos existentes principalmente en el núcleo, pero también en el citoplasma. Estos
marcadores fosforilados a la vez regulan la transcripción de muchos genes que a su vez median
procesos celulares tales como la apoptosis (D.N. Dhanasekaran et al.,2008), efectos
inmunológicos (M.Rincón et al., 2009) actividad neuronal, señalización de insulina y muchos
más (W.Haeusgen et al.,2009).
p38 MAPK: esta cascada exhibe componentes similares con la cascada de la JNK (J.M.
Kyriakis et al., 2001) del mismo modo esta cascada parece ser activado principalmente por el
stress, pero también se sabe que responde a las señales transmitidas por una variedad de otros
receptores y procesos celulares (T.Zarubin et al.,2005; L.R. Coulthard et al.,2009). Tras la
activación de los receptores o por inducción de condiciones de stress por señales ambientales, las
señales de la cascada de p38 se transmiten a través de proteínas adaptadoras, pequeñas GTPasas
MAPK4s y MAPK3 que suelen ser similares a los de la cascada de JNK. Las diferencias de
activación de estas dos cascadas cuando existen, están mediados por proteínas específicas de
andamio, la compartimentación y sustratos variables (M.Raman et al.,2007; D.K.Morrison et
al.,2003; B.D. Cuevas et al.,2007).
ERK5: La cascada ERK 5 es la cascada menos estudiada y la menos comprendida de las
cascadas MAPK. Como todas las otras cascadas MAPK, esta también se activa por un gran
número de estímulos y receptores, pero a diferencia de las otras, igual está implicada en la
señalización de stress y mitogénica (J.Moscat et al.,2006; X.Wang et al.,2006). El mecanismo de
18
activación de esta cascada no ha sido todavía dilucidada completamente, pero probablemente se
debe ya sea por adaptador de proteínas (ejemplo Lad (W.Sun et al.,2001)) o MAPK4 (ejemplo
WNK1(B.E.Xu et al.,2004)).
En peces se han descrito todas estas proteínas (MacDougal et al., 1984; Hashimoto et al.,
1997, 1998; Iwama etal., 1998; Fujii et al., 2000; Kultz and Avila, 2001; Basu et al., 2002; Iwama et
al., 2003) pero no hay muchos estudios centrado en la inducción de MAPK, mucho menos se ha
estudiado la conexión de estas proteínas con los virus y particularmente ISAv.
Fig 5: Esquema que representa las vías principales de las vías MAPK. La figura muestra un
esquema de las vías principales de MAPK: ERK1/2, p38, JNK y ERK5. Cada vía se va a activar
de acuerdo al tipo de estímulo que está recibiendo desde los receptores celulares desencadenando
una cadena de fosforilación de los distintos componentes que conforman cada vía de las MAPK.
19
2.9. Estallido respiratorio, parte de la inmunidad innata.
El estallido respiratorio representa, como mecanismo de defensa, la primera línea contra
patógenos (Babior 2002). Los macrófagos, neutrófilos y eosinófilos (DeCoursey et al., 2001;
Neumann et al., 2001; Babior et al., 2002) destruyen las bacterias, hongos (Rongrungruang and
Levitz, 1999) y partículas virales (Little et al., 1994; Peterhans,1997) a través de la producción
de ROS. La cantidad de ROS producido es un indicador de la intensidad de la respuesta inmune
innata y la salud general del organismo. La producción de ROS es iniciado por quinasas
celulares como la proteína kinasa C (PKC) (Christiansen et al., 1988) a través de la fosforilación
de las subunidades de NOX, clave en el estallido respiratorio. Tras la fosforilación, los
componentes de NOX se reúnen en la membrana plasmática para producir una enzima completa.
NOX activa y reduce el oxígeno molecular (O₂) en anión superóxido(•O₂–), el cual es
subsecuentemente activado por la superóxido dismutasa (SOD) para producir peróxido de
hidrógeno (H₂O₂). H₂O₂ sirve además como un sustrato para las peroxidasas celulares dando
lugar a otras ROS (Babior et al., 2002) como por ejemplo la generación del radical •OH− a
través de la reacción de Fenton donde el Fe2+ o Cu2+ actúan como agentes reductores (S.W.
Ryter, H.P. Kim, A. Hoetzel, J.W. Park, K. Nakahira, X. Wang et al.,2007). En general, todas
estas especies reactivas del oxígeno contribuyen con la destrucción de los patógenos invasores.
Lo interesante, que estas moléculas reactivas son dañinas para la célula y por lo tanto, cada vez
que hay producción de ROS, se produce un incremento en la expresión de enzimas
detoxificadoras de estas moléculas que junto con diversas productos del metabolismo
intermediario, como el glutatión se encargan de proteger a la célula de los radicales de oxígeno.
20
Fig 6: Esquema representativo del estallido respiratorio. La figura muestra cómo reacciona
una célula ante la presencia de un agente externo como es el caso de un virus. La activación se
inicia con la fosforilación de la subunidad p47 phox y la consecuente generación de ROS.
2.10. Stress oxidativo celular.
El stress oxidativo se define como un desequilibrio entre la producción de radicales libres
y metabolitos reactivos llamados oxidantes o especies reactivas de oxigeno (ROS) y su
eliminación por mecanismos protectivos conocidos como antioxidantes. Este desbalance
conduce a daños importantes en biomoléculas y células, con un potencial impacto sobre el
organismo (Durackova et al .,2010). ROS es un producto del metabolismo celular normal y juega
un papel fundamental en la estimulación en las vías de señalización en células de plantas y
21
animales en respuesta a los cambios de condiciones ambientales a nivel intra y extracelular (Jabs
et al.,1999). La mayoría del ROS se genera en las células por la cadena respiratoria mitocondrial
(Poyton, R.O et al.,2009). Durante las reacciones del metabolismo endógeno, las células
aeróbicas producen ROS tales como •O₂-, H₂O₂, •OH- y peróxidos orgánicos como productos
normales de la reducción del oxígeno molecular (O₂) (Fridovich, I. et al., 1978). Las proteínas y
lípidos son blancos importantes para el ataque oxidativo y la modificación de estas moléculas
puede aumentar el riesgo de la mutagénesis (Schraufstatter, I. et al.,1988). El anión superóxido,
puede ser dismutado espontanea o enzimáticamente con la ayuda de SOD (Superóxido
Dismutasa) que convierte el anión O₂- a H₂O₂. SOD existe asociado a Mn (mitoncondrial), Cu y
Zn (citoplasma) y en forma extracelular. H₂O₂ también es utilizado por parte de la
mieloperoxidasa (MPx) produciendo ácido hipocloroso y otros derivados oxidantes clorados
nocivos. H₂O₂ es reducido a agua por ayuda de la glutatión peroxidasa (GPX) y la catalasa. El
selenio que contiene GPX degrada los peróxidos orgánicos a expensa de GSH. Los sistemas de
GSH/GSH reductasa (GR) y tiorredoxina (Trx)/ tiorredoxina reductasa regenera el GSH celular o
reducen a la Trx respectivamente, a expensas del complejo NOX. GSH per se es la molécula
antioxidante más importante en la célula y debido a su alta concentración citosólica también
puede eliminar ROS directamente como •O₂−, •OH− y NO. Otras moléculas antioxidantes (como
el ascorbato, vitamina E) y enzimas (como la fosfolípido hidroperóxido, peroxirredoxinas,
glutarredoxinas) actúan como defensas secundarias contra el stress oxidativo. Este último, surge
si los sistemas de desintoxicación y antioxidantes están comprometidos están afectados o si la
producción de ROS es excesiva, lo que resulta en un daño al ADN, proteínas y lípidos (S.W.
Ryter et al.,2007; J.D.West et al.,2006; R.Franco et al.,2007).
22
2.11. Virus y stress oxidativo.
Los virus inducen la activación de los fagocitos lo que eventualmente se asocia con el
stress oxidativo, debido a que los patógenos intracelulares estimulan la liberación de citoquinas
pro-oxidantes tales como el factor de necrosis tumoral (TNF), e interleuquina 1 (IL1)
(Gloenbock et al.,1991). Desde el punto de vista celular, los virus pueden afectar a la
célula/huésped en el balance antioxidante mediante el aumento de pro-oxidantes celulares como
el hierro por el sistema retículo endotelial (Klempner et al.,1978). A todo lo anterior, se suma el
hecho que ROS podría afectar a los virus mediante la alteración del estado redox de la célula
huésped seleccionando mutantes virales resistentes a la presencia de radicales de oxígeno y por
lo tanto generando
mecanismos de evasión de la respuesta inmune innata. Un ejemplo
interesante de la evasión de respuesta inmune por parte de virus la entrega el virus influenza A
(que pertenece a la misma familia del virus ISA) el cual a través del uso de interruptores
celulares específicos escapa de la infección antiviral de PKR por medio de la activación de p38
MAPK que bloquea la expresión a nivel de RNAm de PKR, por lo tanto a través de la activación
de esta vía de señalización el virus se propaga hasta alcanzar elevados títulos virales, instancia
que es completamente bloqueada tras el uso del inhibidor farmacológico de p38 MAPK
SB202190 (Luig et al.,2010). Por otro lado, este mismo virus, requiere para su replicación el
componente ERK1/2 de la cascada MAPK, específicamente para el transporte de las proteína
viral NS2 y la nucleoproteína NP que son fundamentales para la nueva progenie de virus (Xing
et al .,2010). Por último, la activación de la vía ERK1/2 por parte del virus Influenza A bloquea
la expresión de TNF-α, clásico activador de la vía extrínseca apoptótica, así el virus evita la
entrada de la apoptosis de la célula infectada en la etapa inicial de infección favoreciendo de esta
23
manera alcanzar un elevado título viral antes de inducir la destrucción del huésped (Xing et al
.,2010).
Al parecer, la familia Orthomyxoviridae conserva aspectos claves del mecanismo de
infección y transducción de señal que nos permite postular que ISAv activaría p38 y/o ERK1/2
en el transcurso de la infección y que permitiría la activación del complejo NOX trayendo como
consecuencia el aumento de ROS y la activación de la(s) vía(s) de señalización implicadas en
apoptosis.
Por último, el conjunto de antecedentes señalados, se resumen en:
A. La presencia de distintas formas de ROS generadas por el complejo NADPH oxidasa de la
célula.
B. La presencia de motivos de reconocimiento para MAPK en la subunidad p47phox de S. salar
del complejo NADPH oxidasa generador de ROS.
C. La frecuente utilización de proteínas MAPK por parte de Orthomyxovirus como parte de su
mecanismo de infección, nos llevaron a postula la siguiente hipótesis:
24
3. HIPÓTESIS.
El mecanismo por el cual el virus ISA genera stress oxidativo a través de la
producción de ROS es mediada por la vía de transducción de señal MAPK.
4. OBJETIVO GENERAL.
Dilucidar una potencial conexión celular entre la infección por virus ISA y la activación
del complejo NADPH oxidasa a través de las proteínas MAPK.
4.1 Objetivos específicos.
Objetivo 1: Evaluar la producción de ROS en cultivo primario de riñón cefálico de Salmo salar
infectado con virus ISA en presencia o ausencia de inhibidores farmacológicos de esta vía de
señal.
Objetivo 2: Evaluar la expresión mediante qPCR en tiempo real de marcadores de stress
oxidativo tales como p47phox, glutatión reductasa y superóxido dismutasa (SOD) en presencia o
ausencia de inhibidores farmacológicos de esta vía de señal.
Objetivo 3: Evaluar el grado de fosforilación de la proteína p38 MAPK por efecto de la
infección con virus ISA.
25
5. MATERIALES Y METODOS.
5.1 Materiales.
Ambion RNA: TRIzol Reagent.
Amresco: TEMED.
AppliChem: Acrylamide Solution (30%) 1 Mix 37,5 Molecular biology grade.
Axygen: Axy prep Multisources Total RNA Miniprep kit (para extracción de RNA).
Calbiochem: Sodium n-Dodeyl Sulfate.
Cell Signaling: p38 MAP Kinase Assay Kit (Nonradioactive).
Cell Signaling: RIPA Buffer (10x).
EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur: Ácido bórico para análisis.
Gibco: 0,5% Tripsina-EDTA (10x) (para medio de cultivo)
HYCLONE: Agua HyPure (grado biología molecular).
HYCLONE: Solución de penicilina-estreptomicina (para medio de cultivo).
Invitrogen: SYBR safe DNA gel stain.
MECK: Ammoniumperoxodisulfate ACS, Reag. Ph Eur.
Lonza: agarosa (Sea Kem Le Agarose para electroforesis en gel).
OmniPur: Tris (hydroxymethyl) aminomethane.
Thermo Scientific: Pierce BCA Protein Assay Kit.
Thermo Scientific: Pierce ECL Western Blotting Substrate.
Winkler: Bicarbonato de sodio para análisis.
5.1.1 Soluciones.
Alcohol 95º TCL.
Alcohol isopropílico: Winkler Alcohol isopropílico para análisis.
Buffer de corrida: Tris-base (259mM), glicina (2,5M), SDS 0,1%.
26
Buffer de transferencia: Tris-base (48mM), glicina (39mM), SDS 0,375%.
Cloroformo: EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur Chloroform for analysis.
Horse Serum 16050.
HyClone: L-15 Leibovitz Media + 2,05mM L-Glutamate.
MEM: Gibco Minimum Essential Medium.
Metanol: EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur Methanol for analysis.
PBS: NaCl (1,37 M), KCl (26,8mM), Na₂HPO₄ (78,1mM), KH₂PO₄ (14,7mM).
Peróxido de hidrógeno: EMSURE Hydrogen peroxide 30% (perhydrol) (stabilized for higher
storage temperature) for análisis.
SB 1X: 0,4 g de hidróxido de sodio en 1L de agua destilada PH final 8,0 ajustado con ácido
clorhídrico.
TAE 1X: 0,968g Tris-base, 0,204 ml ácido acético glacial, 0,4ml EDTA 0,5M Ph 8,0 en 1L de
agua ultrapura).
Tween: Tween 20 for sintesis.
5.1.2 Instrumentos utilizados.
Agitador : MERK Heidolph Polymax 1040
Agitador magnético: BARNSTEAD THERMOLYNE Nuova Stirrrer.
Autoclave: MARKET FORGE STERILMATIC
Balanza: RADWAG WTB 200.
Botellas de medio de cultivo: NUNC tm
Cámara de electroforeis, Bio-Rad wide mini sub cell GT, Bio –Rad mini-sub cell GT.
Cámara de revelado de membranas: Omega ULTRALUM
Cámara de flujo laminar: LABCARD Class II Biological Safety Cabinet.
Cámara de PCR: BIOAIR Aura PCR, Escoclass II BSC Airstream.
Centrífuga: Eppendorf centrifuge 5810 R.
27
Destilador de agua: THERMO SCIENTIFIC BARNSTEAD MEGA-PURE STILL MP-11.
Espectrofotómetro: Thermo scientific Evolution 60.
Filtros: Orange Scientific Membrane CA, porosity 0,2um, inlet luer lock, outlet luer slip.
Fuente de poder: Bio-Rad Power Pac Basic.
Incubadora: ARQUIMED Autotwing FTC 90E.
Jeringas: NIPRO jeringa de plástico desechable
Lector de microplacas: Biotek Synergy 2.
Microcentrífuga: Heahrow scientific sprout, Hettich, Heraeus BIOFUGE Fresco, Sigma.
Microondas: Somela fancy WT 1700.
Micropipetas: Labnet.
Microscopio: Olympus CKX41 ARQUIMED.
NanoDrop 2000 SPECTROPHOTOMETER: Thermo SCIENTIFIC.
Parafilm: Laboratory Film 4 IN. X 125 FT. ROLL.
Placa de micropocillos para cultivo de Tejidos: Orange Scientific
Placa Neubauer: BOECO Germany Bright Line deep 1/10mm.
Placas de vidrio: BIO-RAD Mini PROTEAN System Glass Plates
pHmetro: WTW inolab pH720.
Pipetas: Disposable serological pipettes 10 y 5ml.
Purificador de agua: ELGA PURELAB Option.
Selladora manual: P&C
Sonicador: Q SONICA, LLC XL-2000 SERIES MISONIX SONICATORS.
Termoblock: BIOSAN T-100 Thermo Shaker.
Termociclador PCR tiempo real: STRATAGENE Mx 3000P.
Termociclador: Axygene Maxygene.
Tubos falcon: AXYGEN Scientific screw cap tubes, SCT-50ml-25-S
28
Vórtex: mcr VM-2000.
5.2. METODOS.
5.2.1. Animales de experimentación.
Para la realización de los experimentos, se utilizó salmones (S. salar) provenientes de
Aquasan de los cuales se extrajo riñón cefálico.
5.2.2. Cultivo celular y tratamiento.
Riñón cefálico de salmón (equivalente de la médula ósea en el pez) fue obtenida como se
describe en otro lugar (Sepulcre et al.,2002) fueron mantenidos con RPMI (Medio de cultivo
RPMI 1640 (Invitrogen)) suplementado con suero bovino fetal (FBS Invitrogen) y 100UI/ml de
penicilina y 100Ig/ml de estreptomicina (P/S ;Biochrom).
Se usó líneas celulares como la SHK-1 que viene del riñón cefálico del salmón el cual
exhibe propiedades macrófagas (Dannevig et al.,1997) y la línea celular CHSE-214. Las células
fueron cultivadas a 18°C en botellas de cultivo de 75cm2 y tratadas con L-15 y MEM (500 ml
con 300mg/l L-glutamina) suplementada con 500µl de sulfato de gentamicina (50mg/ml en agua
destilada) 365 µl de 2-mercaptoetanol (55mM en Dubelco‘s buffer fosfato salino) y 5% de FBS.
Cuando las botellas tenían ya un 100% de confluencia, se procedía a la duplicación con medio
previamente preparado y se agregaban en cantidades equivalentes en cada botella (Figura 7).
29
Fig 7: Imagen de cultivos celulares empleados. En la imagen se observa las distintas líneas
celulares utilizadas en los experimentos: (A) cultivo primario de riñón cefálico de S. salar, (B)
línea celular CHSE-214, (C) línea celular SHK-1y (D) línea celular ASK-1.
5.2.3. Propagación de virus ISA.
Se utilizaron líneas celulares CHSE-214 (Chinook salmon embrión), SHK-1 (Salmon
head kidney) y ASK-1(Atlantic salmon kidney) cultivadas en MEM y L-15 suplementada con
FBS al 10% y con antibiótico/antimicótico siendo cultivadas en botellas de medio de cultivo,
30
todo este procedimiento se efectuó en una cámara de flujo (ver punto 5.2.2.). Una vez que las
células se encontraron a un 100% de confluencia, se les retiró el medio de cultivo y fueron
infectadas con 1ml de virus ISA (MOI 5) por un período de 30 minutos, luego se restituyó el
medio al 2% de FBS. Una vez que las células mostraron efecto citopático, se recolectó el
sobrenadante donde se encontraba el virus. Por último, el sobrenadante obtenido del medio de
cultivo se almacenó en un tubo falcon a -80ºC para su posterior utilización.
5.2.4. Concentración de virus ISA.
El protocolo comenzó a partir del sobrenadante de las células que fueron infectadas con
el virus, el descongelamiento se hizo a 4ºC. A continuación, la solución se centrifugó para
obtener el sobrenadante sin partículas y la solución fue filtrada con filtro de 0,22 µm. Se preparó
polietilenglicol al 8.5%, se agregó la solución hecha y se dejó en agitación suave a 4ºC por toda
la noche. Por último, mediante centrifugación se eliminó el sobrenadante y el precipitado fue
resuspendido con buffer TNE y almacenado en un tubo falcon a -80ºC.
5.2.5. Cuantificación de RNA eucariótico.
El
contenido
de
RNA
fue
cuantificado
en
un
equipo
NanoDrop
2000
SPECTROPHOTOMETER. El blanco que se utilizó fue agua Hypure grado biología molecular. Se
consideró que una unidad de absorbancia (OD) a 260nm, equivale a 40 µg/ml. El cálculo final se
realizó en el NanoDrop2000 incorporado al equipo.
31
5.2.6. Generación de cDNA (Retro-transcripción).
De las distintas muestras de RNA que se cuantificaron en el equipo NanoDrop 2000
SPECTROPHOTOMETER se escoge la muestra que resultó en menor cantidad con respecto al
total de muestras analizadas. Se hicieron los cálculos respectivos asumiendo que cada muestra
posee la misma cantidad de RNA.
Para producir el cDNA de cada muestra se realizó el protocolo:
Paso1:
Reactivo
DNAsa
Buffer DNAsa 10x
RNA
H₂O
Cantidad
1ul
1ul
1ug
Hasta 10ul
Tiempo
Reactivo
Oligo dt
dNTPs
Cantidad
1ul
1ul
Tiempo
65°C por 5 minutos
2 minutos en hielo
Reactivo
5x Find strand buffer
0,1M DTT
RNAsa out
Cantidad
4ul
2ul
1ul
Tiempo
37°C por 10 minutos
65°C por 10 minutos
Paso2:
Paso 3:
37°C por 2 minutos
32
Paso4:
Reactivo
M-MLVRT
Cantidad
1ul
Tiempo
25°C por 10 minutos
37°C por 50 mnutos
70°C por 15 minutos
5.2.7. Reacción de la polimerasa en cadena (PCR).
Se amplificaron fragmentos de las secuencias β-actina, p38, ERK1/2, JUN, NRF2, SOD,
GLURED y p47 usando partidores diseñados para su detección. Para las reacciones de PCR se
utilizaron 1ul de cada partidor (25uM), 9,8ul de agua Hypure grado biología molecular, 5ul de
5x Green Go Taq Flexi Buffer y 1ul de cADN o agua Hypure grado biologÍa molecular (como
control negativo) y se homogenizó pipeteando cada una de las muestras, todo esto fue realizado
bajo cámara de flujo laminar. El programa de amplificación se muestra a continuación en esta
tabla estándar para un PCR convencional (Sambrook et al.,2001).
Etapas
Temperatura ºC
Tiempo
Denaturación inicial
94º
2 min
Denaturación
94º
30 seg
Alineamiento
55º
30 seg
Extensión
72º
2 min
Extensión final
72º
7 min
33
Tabla I: Resumen de primers diseñados para qPCR.
Partidor
β-actina
p38
ERK1/2
JUN
NRF2
SOD
GLURED
p47
Secuencia
F 5‘ GCG TGG GCA GAG CGT AAC C ‗3
R 5‘ G TT GGG TTC GCT GGA GAT GA ‗3
F 5‘ TGG CCT GTT GGA TGT GIT TA ‗3
R 5‘ AGG AAC TGA ACG TGG TCG TC ‗3
F 5' CTC TGC CTG AGA AAC CCA AG'3
R 3' GAA AGT GAA CGG CTC CTC TG '3
F 5' CTA AAG CCA GCG ACA TCC TC '3
R 5' CTA ACA AAT CCC TCD GCA AA '3
F 5' TTC CCA TTG GTA GAG GCA AC '3
R 5' CAG CTC AGG AAG GGA CAA AG '3
F 5' GGA GAC AAC GAG GAG AGT CG '3
R 5' GGT AGA GTT CGG GGG TAA GC '3
F 5' TTC CCA CGG TAG TTT TCA GC '3
R 5' TGC ACT GAG TCT TCC TGG TG '3
F 5' GAG GAG CCT GAA GAA GCT GA '3
R 5' TCC AGC AGC TTG TGA ATG AC '3
5.2.8. Electroforesis en gel de agarosa.
Los geles se prepararon pesando la cantidad necesaria de agarosa en polvo para obtener
geles entre 1 y 1,2 % p/v, se agregó el volumen necesario de buffer TAE 1x o SB 1x, se fundió
en un microondas, se agregó el volumen necesario de SYBR SAFE 10.000x para obtener una
concentración 1x y la mezcla resultante se enfrió y se gelificó en un equipo de electroforesis.
Se cargaron 5 -10 ul de producto de PCR y 7ul de marcador de tamaño molecular de
ADN, de escala 50pb, 100pb. La corrida electroforética se llevó a cabo aplicando una corriente
de 90 Volts durante un período de 30-40 minutos. Por último, las bandas se visualizaron en un
transiluminador UV y las imágenes fueron capturadas utilizando un sistema de documentación
de geles.
34
5.2.9. Reacción de la polimerasa en cadena en tiempo real (qPCR).
Se amplificó fragmentos de las secuencias de los genes GLURED, SOD, p47, NRF2,
p38, ERK 1/2 utilizando 1µl de partidores, 7,5 µl de 2X Brilliant II SYBR Green qPCR master
mix, 1µl de cDNA o agua nanopura (como control negativo) y un volumen de agua HyPure
grado biología molecular suficiente para completar un volumen final de 20 µl y se homogenizó
en un vórtex.
Se usó el termociclador STRATAGENE Mx 3000P para efectuar las reacciones de PCR
en tiempo real, utilizando un programa para dicha reacción.
La primera etapa fue de denaturación a 95°C por 10 minutos, una segunda fase de 35-45
ciclos de: 15 segundos de denaturación a 95°C, 15 segundos de alineamiento a 57°C y 15
segundos de extensión a 72°C o 40 segundos de alineamineto-extensión a 60°C además de una
curva de disociación compuesta por 10 segundos a 95°C, 10 segundos a 25°C, 1 segundo a 70°C
y 1 segundo a 95°C. Los resultados de las reacciones se analizaron utilizando el programa
MXPRO y electroforesis en el gel de agarosa.
5.2.10. Extracción de proteína p38 a partir de líneas celulares CHSE-214.
A partir de la línea celular CHSE-214 se cultivaron en placas Petri con MEM, suero
bobino fetal al 10% y antibiótico 100x, cada placa tenía un volumen final de 15ml. Se esperó
hasta que todas las placas que fueron cultivadas tuvieran un 100% de confluencia para poder
pasar a la siguiente etapa.
35
Luego de alcanzar la confluencia, se extrajo el medio que contenía para reemplazarlo por
uno nuevo, pero sin suero bovino fetal dejándolas en ayuna toda la noche. Al día siguiente se
preparó medio con MEM, suero bovino fetal al 5% y antibiótico 100x. De esa preparación se
tomó 4ml en un tubo falcon y se agregó 1ml de virus para luego retirar el medio de cada uno de
los pocillos y agregarle 1ml de esa preparación a cada pocillo y someterla a un proceso de
adsorción por 45 minutos moviéndolas en intervalos de tiempos de 10 minutos para que la
adsorción del virus fuera efectiva.
Una vez concluida la adsorción, se adicionó medio con suero al 10% y se realizó la
extracción de las proteínas a distintos tiempos (0.5, 1, 2 y 4 horas post infección) con una
solución de RIPA más inhibidores. La extracción de las proteínas fue hecha raspando la
superficie de la placa en donde estaban las células con un ―cell scrapper‖ todo hecho sobre hielo
para frenar la reacción y conservar las proteínas, las muestras se recolectaron cada una en un
tupo Eppendorf y se sometieron a sonicación.
5.2.11. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico (BCA).
Para la determinación de la concentración total de proteínas presente en las distintas
muestras de línea celular, se realizó el método del ácido biciconínico. Se utilizó un kit comercial
Thermo Scientific: Pierce BCA Protein Assay Kit, siguiendo el protocolo recomendado por el
fabricante.
Se construyó una curva de calibración, con seroalbúmina de bovino (BSA) para un rango
de concentración proteica de 0 a 2 mg/ml.
36
A un volumen de 50ul de muestra de problema contenido en tubo Eppendorf, se le agregó
1ml de mezcla reactiva de color verdoso (solución de sulfato de cobre II 4% pentahidratada +
solución de ácido bicinconínico), agitó (color vira a un púrpura suave).
Se realizó una réplica usando 25ul de muestra completando 50ul con agua destilada y se
incubó por 5min a 50ºC (se obtiene un color púrpura más marcado).
Luego la reacción se detuvo sumergiendo los tubos con las muestras en hielo por 2
minutos y posteriormente la absorbancia
fue leída en un espectrofotómetro Spectronic-21
modelo DUV. a una longitud de onda de 562nm.
La lectura obtenida se interpola en la curva de calibración y se obtiene la concentración
de proteínas de la muestra, de la misma forma se realiza para la réplica, el promedio de ambos
resultados nos da un valor final de la concentración proteica de la muestra problema.
5.2.12. Inmunoprecipitación proteica.
El método de inmunoprecipitación se llevó a cabo con el kit de extracción p38 MAPK
Assay Kit (Nonradioactive)
La obtención de una cantidad mayor de proteínas de las muestras se asumió que en 100ul
había 100ug de proteína total y se completó con 400ul de buffer RIPA para llevarlo a un
volumen final de a 500ul y se adicionó 10ul de proteína A/G agarosa para incubarlo por un
tiempo de 45 minutos a 4ºC en un agitador orbital (preaclaramineto de la proteína de interés).
Posteriormente se centrifugó a 5000 rpm por 10 minutos a 4ºC para luego trasladar el
sobrenadante a un nuevo tubo y se colocó 5ul de anticuerpo phospho-p38 MAPK
37
(Thr180/Tyr182, Cell signaling) Mouse mAb. La mezcla se incubó en un agitador orbital por
toda la noche a 4ºC.
Al día siguiente, se le agregó nuevamente 10 ul de proteína A/G agarosa y se incubó por
un período de 1 hora a 4ºC en el agitador orbital. Se centrifugaron las muestras a 14000 rpm por
30 segundos a 4ºC para obtener los pellets a trabajar.
Los pellets obtenidos de cada una de las muestras se lavan con buffer Cell Lysis y buffer
Kinase hechos previamente. Primero se lavó con 50 ul de buffer de Cell Lysis dos veces, se
dieron golpes suaves a cada muestra para resuspender las esferas que se depositan en el tubo y
se centrifugaron a 8000rpm por 1 minuto, después de los dos lavados se procedió de la misma
manera con el buffer Kinasa, es de tener en cuenta que todo este procedimiento se efectuó en
hielo.
Una vez terminado los lavados con el buffer Kinasa, el pellet se resuspendió en un mix
preparado que contenía buffer Kinasa, ATP 10uM y sustrato de kinasa en un volumen de 20ul y
se incubó por un período de 1 hora a 30°C. Para finalizar se detuvo la reacción agregando buffer
SDS sample 3x 25ul a cada muestra y se calentó a 95-100°C por 5 minutos, se le dio un breve
spin y se extrajo el sobrenadante para cargarlo en un gel de poliacrilamida.
38
Fig 8: Representación de la inmunoprecipitación e incubación de la proteína p38.La imagen
muestra una etapa (A) de inmovilización con la proteína Phospho p38 (Thr/Tyr194) mAb (B) e
incubación que se lleva a cabo con bufer kinasa en el que contiene la proteína de fusión ATF-2 y
que es reaccionada con ATP, por último las muestras se cargan en un gel de poliacrilamida.
39
5.2.13. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE).
Las proteínas fueron separadas de acuerdo a su tamaño molecular por PAGE – SDS
(Laemmli y co, 1970). Se preparó un gel separador de 7cm de la siguiente composición: Agua
destilada 4ml; poliacrilamida 12% (p/v); Tris-HCl 0,375M pH 8,8; SDS 0,1% (p/v); persulfato
de amonio 10% (p/v) y TEMED 0,1% (v/v); se agregó alcohol isopropílico para que el gel se
gelificara de manera uniforme y para eliminar las burbujas de oxígeno que se forman al depositar
el gel en la placa de vidrio. Después de retirar el alcohol isopropílico, se agregó el gel espaciador
de alrededor de 2cm de alto con la siguiente composición: Agua destilada 1ml; poliacrilamida
4% (p/v); Tris-HCl 0,125M pH 6,8; SDS 0,1%; persulfato de amonio 10% (p/v) y TEMED en
iguales concentraciones al gel separador. Ambas geles se prepararon de forma separada.
Las proteínas fueron solubilizadas en tampón de muestra constituído por: Tris- HCl 62,5
mM, pH 6,8; SDS 1 % (p/v); glicerol 10 % (v/v) y de azul de bromofenol 0,05 % (p/v),
(marcador del frente iónico), en condiciones reductoras (2-mercaptoetanol 5 % (v/v), por 15
minutos a 4ºC. Luego las muestras se calentaron a 95ºC por 5 minutos.
Previamente el gel se monta en un equipo electroforético de SDS-PAGE y se adiciona
buffer de corrida 1x y se aplica una corriente de 30 Volts para eliminar el persulfato del gel. Una
vez que las proteínas fueron calentadas, se cargaron en los espacios que se dejaron hechos
previamente con la peineta y se procede a que migren las proteínas a una corriente de 90 Volts
por un período de 2 horas para que el frente iónico alcance el final del gel. Finalizada la
electroforesis se retira el gel del equipo y se depositó en un recipiente con azul de coomasie R250 0,3% (p/v); metanol 30% (v/v) y ácido acético 10% durante 1 hora. Para desteñir el gel, se
retiró la solución de azul de coomasie y se agregó una solución de desteñido haciendo lavados
40
por cada 30 minutos hasta ver que el gel haya quedó transparente y sólo se visualice las proteínas
teñidas.
5.2.14. Western Blot.
Se preparó una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF) de 0.2um que contenía
las mismas dimensiones del gel que se obtuvo de la electroforesis en SDS-PAGE. Se sumergió
en metanol para que adquiera carga y luego fue embebido en buffer de transferencia 1x. El gel de
electroforesis SDS-PAGE se depositó en un sistema de acople tipo sándwich en donde también
se depositó la membrana sobre el gel, haciendo que no haya quedado burbujas en su unión.
La membrana se ubicó hacia el lado positivo de la cámara (ánodo), sobre una hoja de
papel filtro humedecida en tampón de transferencia 1x. Sobre la membrana, se incubó el gel
hacia el polo negativo (cátodo) y encima de este se depositó un papel filtro humedecido en
tampón de transferencia 1x. Antes de iniciar la transferencia, se depositó un refrigerante para
evitar que el equipo se sobrecalentara. La transferencia se realizó por 2 horas a una intensidad de
300mA.
La membrana, con las proteínas ya electrotransferidas fue bloqueada con una solución
que contenía PBS 1x, leche descremada 5% y Tween 20 0,05% (v/v) por 1 hora a temperatura
ambiente con agitación constante. Posteriormente se incubó con una solución que contenía PBS
1X, leche descremada y el anticuerpo phospho-ATF-2 (Thr71) en una dilución de 1:1000
dejándose en agitación constante por toda la noche a una temperatura de 4ºC. Después de la
primera incubación, se retiró la solución de anticuerpo primario y se lavó la membrana para
eliminar los anticuerpos no unidos específicamente con una solución de PBS Tween 20 0,05% en
41
3 sesiones de 10 minutos cada una. Luego se incubó con un segundo anticuerpo del kit de
detección HPR- anticuerpo secundario conjugado (1:2000) y HPR- anticuerpo antibiotina
conjugado (1:1000) ambos preparado en un volumen final de 10 ml. La agitación se realizó por
un período de 2 horas a temperatura ambiente. El exceso del segundo anticuerpo se eliminó
realizando 3 lavados por 10 minutos cada vez con solución PBS Tween20 0,05%
Por último, se preparó una solución de reactivos en base al kit de detección Thermo
Scientific: Pierce ECL Western Blotting Substrate. Se preparó un volumen final de 600ul al
mezclar los dos reactivos (Reagent Ay B 300ul c/u) y se agregó a las membranas al interior de
una cámara de revelado ULTRALUM.
5.2.15. Inmunofluorescencia.
Las células fueron cultivadas sobre una placa de 6 pocillos previamente cubierto con poliL-lisina por un período de 30 minutos el cual fueron retirados y fue lavado cada compartimento
con agua nanopura en 3 repeticiones.
Luego fueron agregadas la línea celular SHK-1 en cada pocillo para luego adicionarle
medio de cultivo preparado con MEM, suero bovino fetal al 2% y antbiótico 100x para ser
dejado en una incubadora
Se retiró todo el medio de cada una de las placas con mucho cuidado para no dañar a las
células y se agregó a cada una de las placas 200 ul de metanol por un período de 10 minutos a
10°C en una incubadora. Una vez transcurrido el tiempo se retiró el metanol y se lavó con PBS 3
veces. Luego se permeabilizó las células incubando con una solución de bloqueo (BSA 1% y
leche descremada 5% en PBS 0,1M, tritón 0,01%). En esta misma solución fueron incubadas las
42
muestras con los anticuerpos primarios en una cámara húmeda por toda la noche a 4°C. Como
anticuerpo secundario se utilizó anti IgG de conejo conjugado a Alexa fluor 488; los núcleos
fueron teñidos utilizando DAPI. Las muestras fueron montadas con medio de fluorescencia
DAKO y visualizadas utilizando un microscopio epifluorescente (García y col., 2005).
5.2.16. Estallido respiratorio.
Este experimento se midió por reacción de quimioluminiscencia luminol-dependiente
producida por leucocitos de riñón cefálico (Mulero et el.,2001). Esto fue provocado por la
adición de 100ml luminol (Sigma-Aldrich) y 1 µg/ml PMA (Sigma-Aldrich) mientras que la
quimioluminiscencia fue registrada cada 117 segundos durante una hora en un luminómetro
FLUOstart. Los valores reportados son el promedio de las lecturas cuádruples, expresando como
la pendiente de la curva de reacción de 117 a 1170 segundos.
43
6. RESULTADOS.
6.1. Obtención de cultivo primario de salmónidos para infección con ISAv.
En peces el órgano que interviene en la defensa inmunológica es el riñón cefálico ya que
contiene el tejido hematopoyético productor de los diversos tipos celulares implicados en la
inmunidad del pez.
Este trabajo de tesis tuvo como primera etapa, la obtención de células de riñón cefálico
instancia que se resume en la figura 9 y que básicamente fue necesario y fundamental para
evaluar la capacidad del virus ISA de gatillar la producción de ROS en las distintas condiciones
evaluadas a lo largo de este trabajo (presencia y ausencia de específicos inhibidores
farmacológicos). Esta etapa del trabajo fue por lo tanto un importante resultado del trabajo de
tesis, pues mediante esta aproximación biológica se obtuvo información muy sugerente de lo que
ocurre en el animal vivo e infectado con el virus ISA.
44
Fig 9: Esquema representativo de un cultivo primario. En la imagen representa los pasos que
se hicieron en un cultivo primario. Se comenzó con la extracción de riñón cefálico, se tamizó en
un tamiz de malla 10µm, se centrifugó a 1500rpm a 10°C por un tiempo de 10 minutos, se
obtuvo un pellet en donde estaban contenidas las células y se sembraron en placas de cultivo.
45
6.2. Propagación de virus ISA en línea celular CHSE-214.
Con el propósito de generar un stock adecuado viral para todos los ensayos del trabajo de
tesis, el aislado de ISAv utilizado en este trabajo fue propagado en las células CHSE-214 en las
condiciones señaladas en la sección de materiales y métodos (5.2.3.). Para verificar la presencia
del virus en la línea celular se utilizó el anticuerpo p40 policlonal diseñado en el laboratorio y
que reconoce la hemaglutinia del virus. La figura 10 muestra que efectivamente hay señal
específica y que esta se visualiza en toda la célula, lo cual confirma la presencia del virus luego
de 7 días post-infección con un MOI inicial de infección de 5. En estas condiciones y luego de
sucesivas propagaciones en la línea CHSE-214 se logró obtener un stock viral básico para el
desarrollo completo del trabajo de tesis.
46
ISAV
DAPI
Superposición
C
B
A
IgY
Pre-inmune
CHSE-214
INFECTADAS
40 μm
D
40 μm
E
40 μm
F
IgY
anti-p40
40 μm
G
CHSE-214
SIN INFECTAR
40 μm
H
40 μm
I
IgY
anti-p40
40 μm
40 μm
40 μm
Fig 10: Propagación del virus ISA en la línea celular CHSE-214. Análisis de
inmunofluorescencia indirecta por microscopía epifluorescente utilizando marcadores DAPI y
anticuerpo Anti- p40 hemaglutinina (1:100). Las barras de magnificación corresponden a 40 µm.
47
6.3. Producción de ROS en cultivo primario de riñón cefálico de S. salar incubado con virus
ISA.
Una vez obtenido un stock viral y luego de estandarizar la obtención de cultivo primario
de riñón cefálico y con el propósito de evaluar el grado de ROS producido por efecto de la
infección con el virus ISA en Salmo salar se utilizaron dos cepas distintas de virus ISA en riñón
cefálico (ISAa e ISAb) con distintos MOI (multiplicidad de infección). Alrededor de 500.000
células por pocillo fueron incubas en las distintas condiciones señaladas en la figura 11.
Transcurridos 8 hr post infección se procedió a cuantificar la producción de ROS mediante
ensayos de quimioluminiscencia. El experimento muestra un incremento MOI dependiente de
ROS, resultado que sugiere fuertemente el efecto de la infección por ISAv en la producción de
radical superóxido en cultivo primario de S. salar. Este resultado confirma que el virus ISA es
capaz de inducir fuertemente la producción de especies reactivas del oxígeno en las primeras
horas del proceso de infección, independientemente de la carga viral. Como control positivo del
experimento, se empleó el PMA (forbol miristato acetato), potente inductor de la actividad
NADPH oxidasa.
Producción de ROS / 500.000 células
48
300
250
*
200
150
100
50
0
Fig 11: Efecto de la producción de ROS por parte del virus ISA en riñón cefálico. Este
experimento fue realizado con tres replicas cada vez, evaluado la actividad de dos distintos
aislados virales (gris y café). El control positivo del experimento fue estimulado con extracto
total de bacteria P.salmonis.
49
6.4. Inhibición farmacológica de las proteínas MAPK bloquea la producción de ROS en
leucocitos infectados con ISAv.
Una vez demostrado que el virus ISA gatilla la producción de ROS en leucocitos de
salmónidos el siguiente objetivo de la tesis, fue estudiar el efecto inhibitorio farmacológico de
SB203580 y PD98059 (inhibidor de p38 MAPK y ERK ½, respectivamente) en la producción
de ROS por efecto de la infección con ISAv. Para ello se consideró 500.000 células por pocillo
que fueron incubadas con el virus ISA (MOI 1) por 8 hrs, antes de revelar y cuantificar la
producción de ROS. Como control positivo del experimento, se empleó un extracto total de la
bacteria Piscirickettsia salmonis que a través de sus múltiples PAMPs (Patrones Moleculares
Asociados a Patógenos) gatillo la producción de ROS. El control negativo utilizado en esta
experiencia fue apocinina, que es un inhibidor farmacológico de la subunidad p47phox,
componente sensor del complejo NADPH oxidasa. Los resultados obtenidos, sugieren
fuertemente la participación de la proteína MAPK p38 en la producción de ROS gatillada por el
virus ISA, por sobre la participación de la proteína ERK ½ en este proceso celular (Figura 12).
Es importante señalar que las dosis de inhibidores empleadas por el tiempo establecido en el
experimento no produjeron alteración celular por citotoxicidad (información no mostrada).
50
Fig 12: Efecto de inhibición farmacológica frente al virus ISA en riñón cefálico. Las células
fueron expuestas a 6 condiciones distintas de virus ISA en presencia de SB203580, PD98059 y
apocinina por 8 hrs. En el control negativo del experimento se empleó apocinina, inhibidor
farmacológico que bloquea la translocación desde el citoplasma hasta la membrana celular de la
subunidad p47phox y como control positivo se utilizó un pool de PAMP‘s de P. salmonis.
51
6.5. Efecto de ISAv en la expresión de marcadores de estrés celular.
Un aspecto importante y necesario de evaluar en este trabajo de tesis fue el efecto de la
infección por el virus ISA a nivel de la expresión de componentes del complejo NADPH
oxidasa y enzimas implicadas en la detoxificación celular por efecto de radicales de oxígeno.
Para ello se evaluó mediante qPCR la expresión de p47phox, glutatión reductasa (GLURED) y
superóxido dismutasa (SOD) en células infectadas por 24 hr con el virus ISA (MOI:1) en
presencia o ausencia de inhibidores farmacológicos SB203580 y PD98059. Los resultados
obtenidos muestran que a nivel de expresión de transcritos hubo un incremento de p47phox,
GLURED y SOD por efecto de la infección celular. Un aspecto relevante de destacar es el hecho
que las distintas MAPK aparentemente tienen distinto nivel de participación en la expresión de
genes relacionados con inmunidad y estrés oxidativo. Particularmente, el resultado del
experimento muestra que p38 MAPK sólo tiene efecto en la expresión de p47phox, en tanto que
ERK ½ participa fuertemente en la expresión las enzimas detoxificadoras. Aparentemente, la
conclusión más relevante de esta experiencia es que el virus ISA, de alguna forma es capaz de
encender dos distintos ―interruptores celulares‖ en un mismo proceso celular.
52
Fig 13: Efecto de ISAv en la expresión de marcadores de
estrés.
Las
células
fueron
expuestas a virus ISA en presencia de SB203580, PD98059 y apocinina. Mediante qPCR se
amplificaron los marcadores de estrés celular para ver la expresión de GLURED, SOD y p47. El
virus ISA produce un incremento de 3 veces como mínimo para cada transcrito y aparentemente
los inhibidores MAPK interfieren de manera específica la expresión de cada trasncrito.
53
6.6. Efecto ISAv en la expresión de genes de expresión temprana y reguladores génicos de
estrés celular.
Los resultados obtenidos hasta aquí, muestran que el virus ISA activa el complejo
NADPH oxidasa generador de radicales de oxígeno, adicionalmente junto con la activación de la
maquinaria presente en la célula los resultados obtenidos sugieren que el virus sería capaz de
estimular la expresión de complejo NADPH adicional. Ambos resultados en su conjunto se
traducen en un incremento de la actividad oxidativa celular producto de la infección. Un aspecto
que complementa los resultados obtenidos, es la expresión de factores de transcripción
implicados directamente en la regulación de genes pro-estrés oxidativo como Jun o reguladores
transcripcionales anti-estrés oxidativo como NRF2. Aparentemente, el virus ISA en el curso de
su infección es capaz de encender y apagar diversos ―interruptores celulares‖ que finalmente se
traducen en la expresión de diversos mecanismos regulatorios de la transcripción de genes
ligados al estrés oxidativo celular.
Incremento relativo del marcador génico
54
*
7
6
5
4
3
2
1
0
C (-)
NRF2
C (-)
JUN
Fig 14: Efecto de virus ISA en expresión de genes de estrés celular. Las células fueron
expuestas a virus ISA con un MOI de valor 1 dejando a 3 a una condición de control negativo.
Luego se amplificó los marcadores de estrés celular mediante qPCR para ver la expresión de
NRF2 y Jun.
55
6.7. Activación p38 MAPK en células infectadas con virus ISA.
Finalmente, para corroborar parte de los resultados obtenidos y específicamente la
activación de una de las proteínas que participa en la cascada de las vías MAPK (en este caso
p38) se efectuó una cinética de infección en la línea celular CHSE-214. Se evaluaron 4 periodos
de infección, 0.5, 1, 2 y 4 horas post infección. Transcurrido cada tiempo de infección, se agregó
tampón de lisis RIPA más un cócktel de inhibidores de proteasas con el propósito de final de
evaluar el grado de fosforilación de la proteína MAPK p38. La figura 17, muestra que a partir de
los 30 min post-infección con el virus ISA, hay un incremento significativo del nivel de
fosforilación de la proteína p38 MAPK, resultado que indudablemente confirma la participación
de este interruptor celular en el proceso de infección del virus ISA en el hospedero.
56
Fig 15: Cinética de activación de p38 MAPK en células CHSE-214. Las células fueron
infectadas por diferentes períodos de tiempos (0, 0.5, 1 y 4 hrs), los extractos proteicos se
trataron como fue descrito en el punto 5.2.10., separados por SDS-PAGE y revelados por
Western blot.
57
7. DISCUSION.
El virus de la anemia infecciosa del salmón ha sido el patógeno responsable de causar
grandes pérdidas de S. salar en la industria pesquera nacional y mundial (Thorud and Djubvik,
1988). Diversas investigaciones se han hecho en torno a este virus principalmente en el análisis
de su estructura para poder entender su comportamiento en el interior del huésped, así como las
etapas implicadas en el proceso de infección, sin embargo a la fecha hay aspectos biológicos
ligados al virus que son una completa incertidumbre, nos referimos particularmente a los
mecanismos de evasión de la respuesta inmune del hospedero. Por lo anterior, el presente trabajo
de tesis tuvo como objetivo principal evaluar parte del mecanismo de infección del virus ligado a
la activación de las proteínas MAPK y su consecuencia en el incremento de actividad oxidativa
por parte del hospedero.
El punto de partida del trabajo fue los antecedentes bibliográficos y experimentales de
nuestro laboratorio en el cual se demostraba fuertemente que los Orthomyxovirus (Virus
Influenza A, Virus Gripe Aviar) empleaban las proteínas MAPK en su ciclo infeccioso. Desde el
punto de vista experimental recientemente demostramos que el sensor molecular del complejo
NADPH oxidasa, subunidad p47phox, posee a nivel estructural motivos de reconocimiento para
la proteína p38 MAPK (Olavarría et al 2010) por lo tanto, el conjunto de la información condujo
a evaluar la capacidad del virus ISA de ―encender‖ p47phox con la consecuente activación del
complejo NADPH oxidasa incrementando la producción de ROS en la célula infectada. La figura
11 muestra el efecto de la carga viral en la producción de ROS, fenómeno que es directamente
proporcional a la cantidad de partículas virulentas infectando el hospedero. Aparentemente estos
resultados avalan fuertemente los antecedentes experimentales y bibliográficos en otros modelos
de Orthomyxovirus, permitiéndonos dar el siguiente paso consiste en dilucidar la participación
58
de las proteínas MAPK en la activación del complejo NADPH oxidasa. La figura 12 muestra que
el inhibidor farmacológico SB203580 tiene un drástico efecto sobre la producción de ROS en
células incubadas con el virus ISA, fenómeno que es diametralmente opuesto al preincubar, antes
de la infección, los leucocitos de S. salar con PD98059 un inhibidor farmacológico de la
proteínas MAPK ERK 1/2. Este resultado da cuenta que la activación del complejo es altamente
específico para un tipo de enzimas celulares independientemente de formar parte de la misma
familia de quinasas (MAPK). En el 2012, nuestro grupo demostró que la subunidad p47phox, es
activada por la proteína PKC, quinasa que ahora se suma a p38 MAPK y que aparentemente
participan de forma activa en la activación del complejo NADPH oxida en peces (Olavarría et
al., 2012).
Resultados de nuestro laboratorio demostraron que otro patógeno intracelular,
Piscirickettsia salmonis, fue capaz de incrementar la producción de ROS (Olavarría et al.,
2010b) e interesantemente junto con activar la maquinaria NADPH presente en la célula,
mediante un mecanismo hasta ese momento desconocido, también fue capaz de incrementar el
nivel de expresión de los tres principales componentes del complejo NADPH; p47phox, p67phox
y gp91phox, dando a entender que esta bacteria es capaz de estimular la generación de nueva
maquinaria productora de radicales de oxígeno (Olavarría et al., 2010b). Teniendo en
consideración esta observación celular gatillada por una infección intracelular, se procedió en
este trabajo de tesis a evaluar el efecto de la infección del virus ISA en la expresión a nivel de
transcrito de p47phox, además de las enzimas detoxificadoras de radicales de oxígeno SOD
(superóxido dismutasa) y GLURED (glutatión reductasa). La figura 13, muestra que el virus es
capaz de estimular la expresión de estos tres trascritos luego de 24 hpi, situación que de alguna
manera era esperable dado los antecedentes y la capacidad de la célula para responder al
59
incremento de ROS, como mecanismo de protección del estrés oxidativo. Cuando las células
fueron preincubadas con el inhibidor farmacológico SB203580, antes del contacto con el virus
ISA, hubo una disminución considerable en la expresión de p47phox sin alterar la expresión de
las enzimas detoxificadoras SOD y GLURED. Por el contrario, cuando las células fueron
preincubadas con el inhibidor PD98059 hubo una disminución en la expresión de las enzimas
SOD y GLURED en tanto p47phox no sufrió alteración en su nivel de expresión a nivel de
transcrito. Estos resultados, confirman que la expresión de cada uno de estos marcadores
obedece a la participación de reguladores transcripcionales altamente específicos y que
aparentemente el virus ISA, coordina de una manera directa o indirecta. Evidentemente, para
lograr dilucidar aspectos más específicos de este hallazgo, es vital la realización de una serie de
experimentos que no están contemplados en este trabajo de tesis, pero que tienen su origen en la
activación de factores de transcripción reguladores de genes implicados en el estrés oxidativo.
Al respecto, NRF2 (Factor nuclear eritroide 2) es un factor de transcripción que en humanos
responde como molécula antioxidante contra los efectos citotóxicos del estrés oxidativo en
defensa de la células (Moi et al., 1994). En peces hay poca información relacionada con este
marcador, sin embargo en este trabajo y en el contexto del estrés oxidativo gatillado por ISA
virus se evaluó la expresión de NRF2 luego de 24 hpi. Los resultados de la figura 14 muestran
que efectivamente este factor de transcripción incrementa su expresión lo cual de cierta manera
respalda el conjunto de observaciones experimentales ligadas a la infección del virus ISA y el
incremento de ROS gatillado por su infección. Un fenómeno muy similar fue observado por el
factor de transcripción jun, el cual se expresa de manera ubicua frente a distintos fenómenos que
estresan la homeostasis normal de la célula (Figura 14).
60
Finalmente y dado que todos los resultados apuntaban a la participación de la proteína
p38 MAPK en la activación del complejo NADPH oxidasa, se procedió a evaluar la activación
de esta quinasa evaluando de forma indirecta su activación (ver métodos). La figura 15, muestra
que a las 0,5 h.p.i hay activación de la proteína p38 MAPK por efecto de la infección con el
virus ISA.
El conjunto de estos resultados, resumidos en el esquema 18, confirman la hipótesis
planteada en este trabajo de tesis y demuestran por primera vez que el virus ISA es capaz de
activar ―interruptores‖ celulares de manera de emplear la maquinaria celular a sus expensas.
Futuros experimentos, serán necesarios para dilucidar las estructuras virales implicadas en estos
fenómenos celulares, así el cronograma detallado de sucesos celulares que genera el virus ISA al
interior del
hospedero
61
ISAv
p38 MAPK
ERK 1/2 MAPK
Estrés
oxidativo !!
Jun /
NRF2
p47 phox
Producción
ROS
GLURED /
SOD
Protección
antioxidante !!
Fig 16: Modelo que muestra cómo sería el mecanismo de acción del virus ISA. El virus ISA
estaría activando por la vía MAPK p38 la producción de ROS y a la vez activaría la unidad p47
para que esta se encargue del acoplamiento del complejo NADPH. Por otro lado ISAv estaría
también activando la cascada MAPK ERK ½ para la activación de genes antioxidantes para
contrarrestar el efecto de las distintas especies de ROS.
62
8. CONCLUSION.
Después de todos los experimentos realizados en trabajo de tesis se concluye que:
 Indistintamente de la cepa de virus ISA propagable, hay producción de ROS en la especie
Salmo salar producto de la infección.
 Al inhibir la vía MAPK p38 por medio del fármaco SB203580 el nivel de ROS disminuye
considerablemente mostrando que el virus emplea esta quinasa, no así la vía ERK ½ que al
parecer no estaría implicada directamente en la generación de ROS en las células infectadas
por el virus ISA.
 ISAv por sí solo es capaz de estimular la expresión de componentes del complejo NADPH
oxidasa y enzimas detoxificadoras de radicales de oxígeno en un periodo de 24 h.p.i. La
expresión de estas proteínas es regulada finamente por quinasas específicas de la familia
MAPK.
 El virus ISA activa genes de expresión temprana que tienen directa implicancia en la
regulación de enzimas y componentes necesarios para la protección celular de los radicales de
oxígeno.
63
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