departamento académico de biología marina

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE
BIOLOGÍA MARINA
"Incidencia de bacterias del género Vibrio sp. como indicadores
de contaminación fecal presentes en moluscos bivalvos en La
Ensenada de La Paz,
B. C. S y áreas adyacentes "
MEMORIA TÉCNICA DE TRABAJO PROFESIONAL
Que como requisito para obtener el título de:
BIÓLOGO MARINO
Presenta:
Jessica Rocío Vega López
La Paz, B.C.S Diciembre 2010
ÍNDICE GENERAL
Índice general……………………………………………………………. I
Índice de tablas….………………………………………………………..II
Índice de figuras……………………………………………………........III
Resumen………………………………………………………………….IV
INTRODUCCIÓN.........................................................................................1
JUSTIFICACIÓN..........................................................................................8
ANTECEDENTES........................................................................................8
OBJETIVOS…………..................................................................................9
ÁREA DE ESTUDIO…………………………………………………… 10
METODOLOGÍA…………....................................................................... 12
1.- Muestreo campo................................................................................... 12
2.-Método de análisis.................................................................................. 14
RESULTADOS.......................................................................................... 16
DISCUSIÓN…………………………………………………………….. 21
CONCLUSIONES...................................................................................... 25
ANEXO…………………………………………………….……………. 26
APÉNDICE……………………………………………………………… 36
LITERATURA CITADA........................................................................... 40
I
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I.- Vibrio patógenos diferentes a Vibrio Cholerae tomada de Cerezo et al.,
1991…………………………………………………………………………………..…. 4
Tabla
II.-
Coliformes
fecales
NMP/100
mL
en
agua
de
superficie……………………………………………………………………………… 20
Tabla III.-
Coliformes
totales
NMP/100
mL
en
agua
de
superficie………………………………………………………………….…………… 20
Tabla IV.- Especies del género Vibrio, tomado de Giono et al, 1991............................26
Tabla V.- Viabilidad del V. Cholerae biotipo eltor en alimentos marinos y agua. Fuente:
Manual
de
buenas
prácticas
y
lucha
contra
el
cólera
OPS
No.
40…………..……………………………………………………………………..……. 27
Tabla VI.- Identificación de diferentes especies del género Vibrio. Fuente: Giono et al.,
1991……………………………………………………………………..……………… 33
Tabla VII.- Características de Vibrio y otras bacterias afines, tomado de Kelly y
colaboradores,
1991………………………………………………………………………...………….. 34
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.- Área de estudio. Estaciones de Muestreo en la Ensenada de La Paz y áreas
Adyacentes. Fuente: Extracted coast line data 2010. NGDC NOAA (National geofisical
data center)……………………………………………………………………. 11
Figura 2.- Vibrio vulnificus en medio TCBS, aislada de la estación Hotel Crown Plaza en
muestras de moluscos bivalvos en la Ensenada de la Paz, B.C.S…………………….. 19
Figura 3.- Vibrio algynoliticus en medio TCBS, aislada de la estación Marina Palmira en
muestras de moluscos bivalvos en la Ensenada de la Paz, B.C.S………………….….. 19
Figura 4.- Aislamiento y caracterización de Vibrio cholerae. Fuente: Manual de
laboratorio de infecciones gastrointestinales tomado de Cerezo et al., 1994……..…… 30
Figura 5.- Determinación del NMP (número más probable) de coliformes. Fuente:
CCAYAC-M-004…………………………………………………………...……….… 35
III
RESUMEN
Del periodo de Junio del 2006 y hasta Abril del 2007, se llevó a cabo un análisis
de la concentración de microorganismos indicadores de la contaminación fecal en agua
de mar y muestras de moluscos bivalvos en La Bahía y Ensenada de La Paz, B.C.S.
México. Como indicadores de contaminación, se consideraron las bacterias coliformes
totales y coliformes fecales. Se utilizó la Técnica de NMP (Número Más Probable) de
acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994; NOM-112-SSA1-1994; que presentan las
especificaciones para los métodos de prueba para análisis microbiológicos, número más
probable, coliformes totales, coliformes fecales. Así mismo se realizaron análisis
bacteriológicos para la búsqueda de Vibrio cholerae según la NOM-031-SSA1-1993 que
da las Especificaciones sanitarias para productos de la pesca, moluscos bivalvos frescos
refrigerados y congelados y la NOM- 016-SSA-1994 y para la vigilancia, control,
manejo y tratamiento del cólera.
En general La Bahía y La Ensenada de La Paz presentan un sistema de recambio que le
permite mantenerse en buenas condiciones de salud, permitiendo que sus aguas puedan
ser utilizadas para recreación. Los resultados indicaron que la contaminación
bacteriológica ocurre solo en áreas muy puntuales y que están asociadas a la época de
lluvias, turismo y dragado. En el análisis realizado a 180 muestras de moluscos
bivalvos pertenecientes en su mayoría a la familia Verenidae se detectó la presencia de
las especies de Vibrio vulnificus y Vibrio alginolyticus, considerados como patógenos,
los cuales podrían significativamente contribuir en la aparición de brotes de
gastroenteritis y otras afecciones, asociadas al consumo de moluscos bivalvos crudos o
parcialmente cocidos o al contacto directo. Así mismo se determinó la presencia de
organismos coliformes fecales en las estaciones 6 correspondiente a marina Palmira y en
la estación 14 del Hotel Crown plaza. Por lo cual es importante mantener un monitoreo
constante de la Ensenada y áreas adyacentes a la Bahía de la Paz, para evaluar las
fuentes de contaminación actuales y potenciales, procedentes de las actividades
humanas.
IV
INTRODUCCIÓN
La contaminación del mar se define como la introducción por el hombre en
forma directa o indirecta, de sustancias o de energía, dentro del ambiente marino
(Carney et al., 1975). Con el resultado de efectos nocivos tales como: perjuicios para los
recursos vivos, peligro para la salud humana, obstáculos para las actividades marinas
(incluidas la pesca) empeoramiento de la calidad para el empleo del agua de mar y
reducción de las posibilidades de esparcimiento. La preocupación por la contaminación
del medio marino ha aumentado contantemente en los últimos años (Smith et al., 1973).
El daño a los organismos y a los ecosistemas marinos, los peligros para la salud humana
por contacto directo con el agua contaminada y por el consumo de alimentos de origen
marino contaminados y la destrucción de la belleza de la costa, son algunos de los
diversos efectos. (Arizpe, 1996)
La descarga de aguas residuales de tipo doméstica en zonas costeras es una
práctica común en muchas partes del mundo, y esto trae como consecuencia un deterioro
de la calidad de la misma. Las aguas residuales descargadas al mar contienen
concentraciones importantes de microorganismos patógenos, entre ellos bacterias
coliformes, Streptococos, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, y Vibrio (Carney et al.,
1975; Sayler et al., 1975; Shuval, 1978, Orozco-Borbón et al., 1989 y Papapetropoulou
y Rodopoulou, 1994).
Representando un riesgo para la salud por la propagación de enfermedades
infecciosas. De igual forma, representan un riesgo para la salud en las personas
consumidoras de moluscos bivalvos y para los bañistas en playas contaminadas
(Delgadillo-Hinojosa, 1987).
Con el fin de obtener información sistemática de los diversos sistemas acuáticos
que sostienen este recurso alimenticio tan importante, desde hace varias décadas se han
empleado coliformes y estreptococos fecales como indicadores de la posible presencia
de bacterias patógenas asociadas con la contaminación fecal (Cohen y Shuval 1973,
Smith et al., 1973, Carney et al., 1975).
Tradicionalmente los coliformes totales y fecales se les han considerado como
indicadores de la contaminación (Seyler et al., 1976). Es importante mencionar que los
estudios que se hacen para evaluar la contaminación en zonas costeras utilizando como
indicadores a los coliformes, generalmente consideran el agua, sin embargo, los
resultados no reflejan lo que está pasando en los sedimentos y en los organismos
filtradores como los moluscos bivalvos que son capaces de concentrar microorganismos
en su interior debido a que su forma de alimentación es no selectiva, y como
consecuencia, pueden ser reservorios de patógenos (Carney et al., 1975).
Ha sido ampliamente adoptado el uso de microorganismos indicadores
(coliformes totales y fecales, así como estreptococos fecales) para la vigilancia de zonas
ostrícolas y centros de distribución, ya que se ha demostrado cuantitativamente su
relación con bacterias patógenas (Smith et al., 1973, Andrews et al., 1975, Seyler et al.,
1976).
El género Vibrio pertenece a la familia Vibrionaceae a la que también pertenecen
los géneros Aeromonas Plesiomonas y Photobacterium, todos aquí incluidos por ser
oxidasa positivos y tener flagelos polares. Vibrio comprende bacilos curvos Gramnegativos que miden de 0.5 a 0.8 µm de diámetro por 1.4 a 2.6 µm de larga. En medio
líquido son móviles por flagelos polares (Cerezo et al., 1991). No forman endoesporas,
ni microquistes. Son anaerobios facultativos y poseen ambos metabolismos respiratorio
y fermentativo; no fijan ni desnitrifican el nitrógeno, todos son quimicoorganotrofos,
muchos crecen en medio mineral conteniendo D-glucosa y cloruro de amonio y solo
unas cuantas cepas necesitan de factores orgánicos de crecimiento. Los iones sodio
estimulan el desarrollo de todas las especies y son un requerimiento para la mayoría,
muchas especies crecen bien en medio conteniendo una base de agua de mar (Giono et
al., 1994).
La enfermedad causada por estos microorganismos es nombrada vibriosis
(Bowser et al., 1981; Elston, 1981) y ha sido reconocida enteramente en zonas
específicas donde ocurren desoves de moluscos bivalvos (Elston, 1981, 1990).
2
Los estudios de enfermedad en moluscos bivalvos han sido enfocadas a especies
comercialmente importantes y específicamente en aquellas transmisoras de bacterias del
género Vibrio, patógenos para el humano particularmente Vibrio cholerae (Guthrie y
Cofie, 1991).
Los vibriones se encuentran ampliamente distribuidos en ambientes acuáticos y
sobre organismos marinos. Algunas especies se encuentran asociadas con cuadros de
gastroenteritis producidos por el consumo de alimentos marinos crudos o semicrudos y
por su inadecuado manipuleo. A nivel internacional se han aislado especies de Vibrio de
moluscos, peces y otros organismos marinos empleados en la alimentación humana
(Hoge et al., 1989).
Microbiológicamente, las especies vibronaceas pueden confundirse con
enterobacterias y con Pseudomonas. Con las primeras, la diferenciación inicial se hace
mediante la prueba de oxidasa y con Pseudomonas se hace buscando su incapacidad
para fermentar glucosa. Para hacer la distinción entre cepas de V. cholerae, Aeromonas y
Plesiomonas, se emplea primariamente la determinación de arginina (Kaneko y Colwell,
1973).
Vibrio y sus más de 20 especies están ampliamente distribuidas en la naturaleza
en ambientes acuáticos con diverso grado de salinidad, son comunes en ambientes
marinos y algunas especies viven sobre la superficie y en el contenido intestinal de
animales marinos, también se les halla en agua dulce donde sobreviven horas o semanas
cuando está contaminada con materia orgánica y su pH es entre 6 y 9 (Kaneko y
Colwell, 1973).
Está demostrado que Vibrio y sus especies documentadas se encuentran
ampliamente distribuidas en la naturaleza en ambientes acuáticos en donde se mantienen
durante periodos prolongados en presencia de concentraciones variables de cloruro de
sodio, característica propia de los microorganismos halofílicos (Hoge et al., 1989). Solo
12 especies son patógenas para el hombre y algunos lo son para animales marinos, la
temperatura del agua regula la población del género Vibrio aumentando su número en el
verano (CDC/NCID, 1994).
3
La asociación entre Vibrio sp y cuadros clínicos, incluyen gastroenteritis,
infecciones de heridas en contacto con agua de mar, otitis media y septicemia en
especial en huéspedes inmunodeficientes (Cerezo et al., 1991).
Tabla I.-VIBRIO PATÓGENOS DIFERENTES A V. Cholerae
TIPO DE INFECCION
ESPECIES ASOCIADAS
V. cholerae O1
V. cholerae NO O1
Gastroenteritis
V. parahaemolyticus
V. fluvialis
V. mimicus
V. furnissii
V. hollisae
V. alginolyticus
Heridas infectadas
V. vulnificus
V. damsela
Sepsis
V. cholerae NO O1
V. vulnificus
V. cholerae NO O1
Infección Óptica
V. mimicus
V. parahaemolyticus
V. alginolyticus
Este género se encuentra asociados al plancton, lo que sugiere que juegan un
papel importante en el ciclo de elementos en el medio marino, mediante su
mineralización (Kaneko y Colwell, 1973).
4
La importancia de las bacterias del género Vibrio no solo radica en su papel
como remineralizadoras en el ambiente marino. Se ha corroborado que diferentes
especies de este género participan en enfermedades mortales de algunos invertebrados
marinos como el camarón (Adams; De la Peña et al., 1993), en cangrejos y en langosta
(Bowser et al., 1981), en peces (Hustvedt et al., 1992) y en moluscos bivalvos (Nottage
et al., 1992; Freites et al., 1993).
Las especies del género Vibrio son de amplia distribución en ambientes acuáticos
marinos y estuarinos; son frecuentemente aislados de agua de mar, sedimento, plancton
y animales que tienen contacto con estas aguas (OMSS 2002). Vibrio cholerae O1 ha
sido la especie de Vibrio con mayor importancia a nivel de salud pública en mariscos, la
presencia de Salmonella sp en sistemas acuáticos se atribuye a las descargas de aguas
residuales urbanas, agrícolas y de aguas residuales en zonas costeras, las cuales
representan un foco de contaminación permanente (Bowser et al., 1981; Elston, 1981) .
Entre las bacterias que se han utilizado como indicadores de contaminación fecal
en moluscos se incluyen los coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli y
Salmonella; esta última ha sido considerada como uno de los patógenos más temidos en
alimentos, dada su virulencia y habilidad para sobrevivir a condiciones de estrés (Giono
et al., 1994).
Por tanto, de adaptarse al mar, le permitiría mantener sus características
virulentas, lo cual conlleva a alertar sobre el riesgo de su transmisión a través de
productos marinos, especialmente moluscos, que generalmente son consumidos crudos o
semicrudos y que por su capacidad de filtración son capaces de concentrar
microorganismos hasta niveles que permitan alcanzar dosis infecciosas(Guthrie y Cofie,
1991).
La infección por V. cholerae es adquirida por la ingestión de agua o alimentos
contaminados consumidos crudos o insuficientemente cocidos. Uno de los tipos de
alimento involucrados son los moluscos bivalvos que se contaminan en el medio marino.
Las almejas, ostras, mejillones se suelen consumir crudos o con un tratamiento de calor
mínimo, en los cuales, V. cholerae puede ser no sólo contaminante de superficie, sino
5
estar presentes en su tracto intestinal, ya que estas especies son filtradoras y concentran
el microorganismo (Costagliola, 2000).
V. cholerae es un habitante común del ambiente marino y se ha encontrado
íntimamente asociado con especies de vertebrados e invertebrados (peces, mariscos y
zooplancton). Además se puede aislar de agua dulce de ríos, corrientes y lagos (OMSS
2002).
La Ensenada y La Bahía de La Paz, son ecosistemas costeros muy complejos, en
dicho lugar se asientan diferentes comunidades biológicas que interactúan entre sí y con
los asentamientos humanos, mismos que en su crecimiento y expansión han alterado
paulatinamente las condiciones naturales de esos ecosistemas. La velocidad de alteración
ha sido lenta debido a que la carga poblacional no es excesiva, como se ha observado en
otros ecosistemas costeros de nuestro país (Arizpe, 1996).
El ser humano es un huésped incidental y transitorio pero es quien disemina la
bacteria hacia las fuentes de agua y a los alimentos. Para explicar la sobrevivencia de V.
cholerae en el medio marino diversos autores han propuesto diferentes medios:
1.- Los microorganismos pueden ser recuperados de cuerpos de agua en estado
de vida libre, particularmente cuando la temperatura del agua y la concentración
de materia orgánica es elevada.
2. Los vibriones se asocian a sustratos específicos como la quitina de mariscos o
copépodos mediante la producción de una enzima específica, la quitinasa. Este
ciclo se favorece en condiciones de pobreza de nutrientes; aparentemente Vibrio
sobrevive más tiempo asociado a la quitina de artrópodos marinos que en estado
de vida libre (Hoge et al., 1989).
El cólera es una infección gastrointestinal aguda grave, que se caracteriza por la
aparición brusca de diarrea acuosa y abundante, vómitos, deshidratación rápida,
acidosis, colapso circulatorio y en los casos no tratados puede sobrevenir la muerte
dentro de las 24 horas de su aparición. Hoy se sabe que la infección también puede ser
asintomática o sola provocar una leve sintomatología. La letalidad de los casos graves
6
no tratados puede exceder el 50%, pero si se aplica el debido tratamiento esto se reduce
a menos del1%(SSA, 1993).
El diagnóstico microbiológico se realiza mediante la búsqueda del agente etiológico: V.
cholerae O1 a partir de heces. Los organismos aislados deben confirmarse mediante
reacciones bioquímicas y serológicas (Giono et al., 1994).
El cólera se transmite típicamente por vía fecal-oral y la infección se contrae
predominantemente por la ingestión de alimentos o agua con contaminación fecal. El
gran número de microorganismos necesario para causar una infección hace que el
contacto entre personas sea una vía de transmisión improbable (OMSS 2002).
Se ha reconocido que los brotes de cólera y varias formas de gastroenteritis se
adquieren por la ingestión de agua o alimentos contaminados; tal es el caso de algunos
moluscos bivalvos (Brown y Dorn, 1977; Word, 1979).
7
ANTECEDENTES
A la fecha, estudios detallados sobre la relación que existe entre la reproducción
y los parámetros ambientales han sido realizados en varias especies de bivalvos a nivel
mundial, como es el caso del estudio sobre la reproducción de Argopecten ventriculosus
y su relación con la temperatura realizado por Villalejo-Fuerte (1992) en Bahía
Concepción B.C.S. Para la Ensenada y la Bahía de La Paz se tuvieron como
antecedentes los trabajos realizados por el Centro de Estudios de Aguas Litorales
(CEAL) en 1982, en donde se evalúo la calidad bacteriológica del agua y de la almeja
catarina (Argopecten ventriculosus) así como estudios de contaminación bacteriológica
del cuerpo de agua de La Ensenada de La Paz (Camacho-Valenzuela, 1992). En un
estudio de la calidad físico química y bacteriológica del agua y almeja catarina
Argopecten Circularis en La Ensenada de La Paz B C S Mayoral Vázquez 1984, los
realizados en el CICIMAR donde se determinaron coliformes totales y fecales en agua,
sedimento y almeja roñosa (González-Acosta et al., 1988; García-Domínguez et al.,
1989; González-Acosta et al., 1994).
Alonso Aguilar en 1985 realiza el estudio sobre distribución y generalidades de
moluscos, anélidos, crustáceos y equinodermos en la zona de La Bahía de La Paz,
B.C.S. Estudios sobre la importancia comercial de los moluscos en el Pacífico Mexicano
(Arizpe 1992). Y estudios sobre la variación espacial de indicadores de estrés oxidativo
en almeja chocolate en la Bahía de La Paz (Cantú, 2006). En estudios sobre
identificación y clasificación de Bivalvos por Herrera. Estudios sobre crecimiento y
producción secundaria de bivalvos, Pinna rugosa en Bahía de La Paz, México (Arizpe,
1995).
8
JUSTIFICACIÓN
Por lo anterior es importante poder determinar la calidad del agua circundante de
núcleos poblacionales. Tal calidad es posible determinarla con agua de los moluscos por
su característica filtradora.
OBJETIVO GENERAL
Determinar la incidencia de bacterias del genero Vibrio sp. Presentes en
moluscos bivalvos en la Ensenada de La Paz y áreas adyacentes a La Bahía de la Paz,
B.C.S.
OBJETIVOS PARTICULARES
-Vigilar la calidad del agua a través de la determinación de los niveles de
bacterias como indicadores de contaminación fecal mediante la técnica del Número Más
Probable (NMP).
-Analizar la presencia de bacterias del género Vibrio sp. En moluscos bivalvos de
La Ensenada de La Paz y áreas adyacentes a La Bahía de La Paz.
9
ÁREA DE ESTUDIO
La Bahía de la Paz se localiza en la costa sur oriental de la península de Baja
California, entre los 24° 06’ y 24° 47’ N y los 110° 16’ y 110° 45’ W. Es el cuerpo de
agua más grande a lo largo de la costa del Golfo de California, siendo una superficie
aproximada de 1200 km cuadrados. Esta limitada al norte por punta cabeza de mechudo
y el extremo meridional de la Isla de San José, al sur de la barra arenosa del mogote, al
este por la Isla Espíritu Santo y el canal de San Lorenzo, y al oeste por el litoral de una
planicie costera, la cual se caracteriza por un leve declive constituido por sedimentos
aluviales (Osuna-Valdez, 1986).
Se encuentra rodeada por varias islas pequeñas y de tamaño moderado. Más de la
mitad de la línea de costa de la Bahía de la Paz es rocosa, adicionando a esta las playas
rocosas de las islas ubicadas en su interior. En lo que se refiere a las condiciones físicas,
las corrientes superficiales que penetran a la Bahía de la Paz son influenciadas y
generadas por el viento y las mareas. En el invierno existe una corriente paralela a la
costa en dirección suroeste, que va desde punta San Carlos a la Paz, y en el verano una
corriente con dirección noreste. Las variaciones en la salinidad son leves, el promedio
para el verano es de 35.5%. Y para el invierno de 35.2%. Las temperaturas del agua
superficial en la Bahía de La Paz oscilan entre 20° y 29°C, para el invierno y verano
respectivamente (Osuna-Valdez, 1986).
Consta de dos cuerpos de agua costeros denominados Ensenada de La Paz y Bahía
de La Paz, ambos tienen una comunicación permanente por medio de la Boca, la que con
régimen de marea entrante, renueva el agua de la ensenada, con la proveniente de la
bahía (Jiménez-Illescas et al., 1997). En la parte sureste de la bahía se ha desarrollado
una laguna costera denominada Ensenada de la Paz, de profundidades someras y
protegida del mar abierto por una barrera arenosa denominada El Mogote, con una gran
importancia ecológica, por sus características de temperatura, salinidad y otros factores
físicos. La zona sur de la laguna es claramente más somera que la norte indicando que la
procedencia principal del material sedimentario hacia la laguna. En la costa sur del canal
que conduce a dicha laguna se encuentra el Puerto de La Paz, capital del estado de Baja
California Sur (Jiménez-Illescas et al., 1997).
10
ESTACIONES
Figura 1.- Área de estudio. Estaciones de Muestreo en la Ensenada de La Paz y áreas
Adyacentes tomado de Extracted coast line data 2010. NGDC NOAA (National
geofisical data center)
11
ESTACIONES DE MUESTREO
1. - Pichilingue
2.- Acuacultores
(Playa Eréndira)
3. - Comisión Federal de Electricidad
4. - Marina Costa Baja
5. - Hotel La Concha
6. - Marina Palmira
7. - Playa Malecón (Centro)
8. - Mogote (Misiones)
9. - Vista Coral
10. - Palmitas (Mogote)
11. - CIBNOR
12. - Centenario
13.- Chametla
14.- Hotel Crown Plaza
15.- CICIMAR-IPN
METODOLOGÍA
1.- MUESTREO DE CAMPO
Se realizaron colectas mensualmente, iniciándose en junio del 2006 y finalizando
en Abril del 2007, realizando un análisis de la concentración de microorganismos
indicadores de contaminación fecal en moluscos bivalvos. Como indicadores de
contaminación se consideraron las bacterias de coliformes fecales y Vibrio sp. Para ello
se establecieron quince estaciones de muestreo diez ubicadas dentro de La Ensenada de
La Paz y cinco en el área adyacente de La Bahía de La Paz.
Colecta de muestras de agua para su análisis bacteriológico
La colecta de las muestras de agua destinadas para análisis bacteriológico, se
realizó en junio del 2006 y finalizando en Abril del 2007, estableciéndose 15 estaciones
de muestreo diez ubicadas dentro de La Ensenada de La Paz y cinco en el área adyacente
de La Bahía de La Paz.
12
Mensualmente se recolectaron por estación una muestra de agua en bolsas
estériles de plástico whirl-pak de 500 mL de capacidad, la toma de muestras de agua se
realizó a 10 cm de la superficie e inmediatamente puestas en hielo para su transporte en
hieleras térmicas. La duración total del recorrido para la toma de muestras fue de tres
horas y cada muestra fue etiquetada para su posterior identificación. Mismas que se
procesaron dentro de las primeras 6 horas de haberse colectado. El contenido de cada
bolsa se destinó para la realización de análisis bacteriológicos (Determinación de
bacterias coliformes totales y fecales), las cuales se mantuvieron en una hielera que
contenía refrigerantes para mantenerlas a baja temperatura. (NOM-230-SSA1-2002).
Colecta de muestras de moluscos para la determinación de su calidad
bacteriológica
Las muestras de moluscos se tomaron en los mismos puntos que las de agua, en
el fondo marino con ayuda de una draga tipo Van Veen, utilizando todos los bivalvos
que se recogieron en el fondo. Después de recolectar las piezas de bivalvos se colocaron
en bolsas de plástico selladas. En cada muestreo se recolectaron las muestras para dar los
50 gr de licor y de tejido que se requieren para realizar el estudio bacteriológico. Las
muestras se transportaron y etiquetaron, así mismo y se conservaron durante el muestreo
entre 2 y 4 ºC hasta su proceso, utilizando refrigerantes evitando el contacto directo del
producto con estos. Las muestras de moluscos se recolectaron en un período menor de
tres horas transportándose al laboratorio para su proceso dentro de las primeras seis
horas de haberse colectado. Siguiéndose las recomendaciones marcadas en el manual de
procedimientos de laboratorio para el análisis del agua y moluscos bivalvos (NOM-031SSA1-1993).
13
MÉTODO DE ANÁLISIS
Moluscos Bivalvos
Limpieza de la concha
Como primer paso el analista, se lavó las manos con agua y jabón. Para proteger
las manos se utilizaron guantes de plástico duro. Se limpiaron las conchas utilizando un
cepillo y agua de la red para remover cualquier contaminante de las valvas, se
enjuagaron y se dejaron secar al aire. Se procedió abrir los moluscos bivalvos bajo
condiciones asépticas.
Extracción del contenido de las conchas
Antes de proceder a extraer el contenido de la concha, se repitió el lavado de las
manos y de los guantes protectores con agua y jabón, se enjuago con agua y con alcohol
al 70%. Se utilizó para abrir el bivalvo con un cuchillo de hoja delgada sosteniéndose en
la mano y se colocó este en la unión de las puntas de las conchas, forzando la entrada del
cuchillo entre las valvas con un movimiento de presión dirigiéndolo hacia abajo para
recolectar el líquido de la concha, se cortaron los músculos abductores y se extrajo la
carne mezclándolos en un frasco estéril según lo establecido para su análisis
bacteriológico (NOM-031-SSA1-1993).
Se pesó en forma aséptica 50 g, de bivalvo con todo el líquido de las valvas y la
carne. Utilizando una licuadora y espátula estéril se licuo hasta quedar bien mezclado
para homogenizar durante 2 minutos. Se cortaron las muestras en trozos pequeños antes
de licuarlos, se vertieron los 50 gr de este compuesto a un frasco que contenía 500 mL
de agua peptonada alcalina pH 9.0. Se incubo por un lapso de 18 a 24 hrs.
Después de la incubación y sin agitar los frascos se transfirió el inoculo de la
película (crecimiento superficial), con una asa bacteriológica a un medio selectivo con
tiosulfato, citrato, bilis, sacarosa (TCBS) y se tomó muestra con ayuda de un hisopo de
algodón inoculando un tubo con 10 mL de agua peptonada alcalina de pH de 9.0. Los
14
tubos Se incubaron de 6 – 8 horas a 37°C. Y se incubaron las placas de agar TCBS
durante 18- 24 horas a 37°C (Giono et al., 1994).
Después de incubarse los tubos se tomaron 3 asadas de la superficie con cuidado
de no agitar el tubo. Se sembraron 3 asadas en placas de gelosa TCBS. Aislando
colonias por estría cruzada. Flameando el asa entre cada estría. Se incubo de 18 a 24
horas a 37°C. Transcurrido el lapso de tiempo en ambos se examinaron las placas a fin
de determinar si estas presentaban características propias de V. cholerae. Se realizaron
pruebas bioquímicas, seleccionándose colonias sospechosas de Vibrio cholerae y se
sembró cada una en: Medio MIO, agar TSI, agar LIA y caldo Arginina, Prueba de
oxidasa.
(Ver ANEXO)
La identificación de las bacterias aisladas para Vibrio sp. Fue realizada por el
método convencional mediante identificación de pruebas bioquímicas, NOM-031-SSA11993 y NOM- 016-SSA-1994 y para la vigilancia, control, manejo y tratamiento del
cólera.
Análisis bacteriológico del agua
Se determinó según la técnica del número más probable (NMP) de bacterias
coliformes totales y fecales mediante la técnica de fermentación en tubos múltiples,
todas las muestras fueron sembradas en sistema de cinco tubos, conteniendo campanas
de Durham y 10 mL del medio de cultivo. Se sembraron 1.0 mL de muestra en cada tubo
a diferentes diluciones (tres diluciones 10-1, 10-2,10-3).
De cada dilución se tomó una alícuota de 1 mL y se transfirió a tubos que
contenían caldo lauril sulfato se utilizaron cinco tubos por cada dilución (serie 5/5/5)
incubaron a 35 ± 0.5ºC por 48 hrs. Los tubos que presentaron turbiedad y producción de
gas, fueron inoculados en Caldo Bilis Verde Brillante e incubados a 35 ± 0.5º C como
prueba confirmatoria para coliformes totales, en el caso de los coliformes fecales la
prueba confirmativa se llevó a cabo con caldo EC incubados a 44.5 ± 0.5ºC en un baño
de agua. Después de 24 hrs. Se examinaron los tubos considerando positivos aquellos
que presentaron turbidez y producción de gas en las campanas de Durham. Mediante
15
tablas estadísticas NOM-112-SSA1-1994 se obtuvo el número más probable de bacterias
coliformes totales y fecales
RESULTADOS
Los moluscos bivalvos por su tipo de alimentación pueden ser un vehículo de
transmisión de microorganismos patógenos, estos organismos se encuentran
ampliamente distribuidos en las costas de los mares, estuarios y diversos cuerpos
acuícolas, muchas de las veces y por razones antropogénicas, representando áreas con
alto contenido de materia orgánica (Andrews et al, 1975). Se ha reconocido que brotes
de cólera y varias formas de gastroenteritis se adquieren por la ingestión de agua o
alimentos contaminados (Brown y Dorn, 1977).
Los resultados obtenidos del análisis de 180 muestras de moluscos bivalvos
pertenecientes en su mayoría a la familia Verenidae, indican que se detectó la presencia
de las especies de Vibrio vulnificus y Vibrio alginolyticus, así mismo se determinó la
presencia de organismos coliformes fecales. Se esperaba que los resultados obtenidos
por la técnica de tubos múltiples de coliformes totales y fecales en las muestras de agua,
no rebasara él límite de acuerdo con el criterio de NOM-112-SSA1-1994, según los
límites permisibles.
Las muestras de agua fueron agitadas vigorosamente y se hicieron inoculaciones de 1.0,
0.1 y 0.01 m1 para el análisis de Coliformes Totales y Coliformes Fecales. El examen de
coliformes fue realizado por la técnica de tubos de fermentación o número más probable
(NMP), en el cual los caldos lauril y verde brillante fueron usados para la prueba
presuntiva y confirmativa de coliformes totales, mientras que los caldos lauril y de EC
(Escherichia coli3) fueron empleados para la prueba presuntiva y confirmativa,
respectivamente de los coliformes fecales en agua.
En la Tabla II se muestran los resultados obtenidos por la técnica de tubos
múltiples de coliformes totales en las muestras de agua, en lo general la Bahía y
ensenada no rebasan los límites permisibles.
16
Los valores más elevados fueron de 920/100 mL y 540/100 mL, en la estación 6,
que corresponden a La Marina Palmira, en los meses de junio y diciembre del 2006 y
febrero y abril del 2007, rebasando los límites permisibles para aguas y en la estación 14
con 2400/100mL, en el mes de marzo del 2007.
La concentración de coliformes totales, que durante los meses de junio, julio,
agosto, septiembre, febrero y marzo se rebasaron los límites permisibles de organismos
coliformes totales en más del 50% de las estaciones.
Coincidiendo con los meses de verano (junio – septiembre) época de vacaciones
así mismo en los meses de febrero y marzo que correspondió a las fiestas de Carnaval.
Durante todo el resto del año el NMP de bacterias coliformes totales en agua fueron
bajos o no se detectaron (Tabla II).
En el caso de las bacterias coliformes fecales en agua (Tabla III), se rebasaron los
límites recomendados en la estación 6 correspondiente a La Marina Palmira durante los
meses de junio, julio, diciembre y abril no así en el resto del año en los cuales no se
detectaron o fueron cuentas muy por debajo de los límites permisibles. Acuerdo por lo
que se establecen los criterios ecológicos de la calidad del agua.
Respecto a los coliformes fecales de las demás estaciones (Tabla III) en lo
general, se encuentran por debajo de los límites permisibles con excepción de las
estaciones 3, 7, 9 y 14 en las que cabe señalar que rebasan los límites permisibles y que
coinciden con los aportes de lluvia, época de vacaciones y fiestas de carnaval. En
general se puede apreciar que durante el verano se aumenta considerablemente las
bacterias coliformes fecales en agua.
Los resultados obtenidos por el método establecido para Vibrio cholerae no
rebasó los límites permisibles, En general la Ensenada de la Paz y áreas adyacentes no
se detectó la presencia de Vibrio cholerae. Según los límites permisibles para moluscos
bivalvos para moluscos bivalvos NOM-031-SSA1-1993. Se aislaron de las estaciones
de Hotel Crown Plaza y Marina Palmira: Vibrio vulnificus y Vibrio alginolyticus.
Vibrio vulnificus en la estación Hotel Crown Plaza, es una bacteria de la misma
familia de aquellas que causan el cólera. Ésta normalmente vive en las cálidas aguas
17
marinas y es parte de un grupo de Vibrio llamados "halofílicos" debido a que requieren
de la sal. V. vulnificus puede causar enfermedades en aquellos que comen mariscos
contaminados o tienen una herida abierta expuesta al agua marina. Entre las personas
sanas, la ingestión de V. vulnificus puede causar vómito, diarrea y dolor abdominal.
Vibrio alginolyticus en la estación Marina Palmira, esta especies la más
halotolerante, soporta una concentración del 10% de NaCl, y la más abundante en el
agua de mar, muy común en el hábitat marino. Causa infecciones gastrointestinales en el
hombre y, ocasionalmente, extraintestinales. Posee escasa virulencia y se asocia con
frecuencia a otros patógenos, su poder invasivo es bajo y las infecciones que origina
suelen ser benignas y autolimitadas. No fue considerado patógeno hasta 1973, pero
desde entonces el número de procesos infecciosos en los que ha sido implicado ha ido en
aumento.
Se le ha asociado con enteritis, infecciones de tejidos blandos, sobre todo en
heridas conjuntivitis externa y otitis externa las más frecuentes.
La mayoría de estas infecciones se adquiere por exposición al medio marino o
por contacto con productos derivados de éste (Hoge et al., 1989).
18
Figura 2. Vibrio vulnificus en medio TCBS, aislada estación No. 14 del Hotel
Crown Plaza en muestras de moluscos bivalvos en la Ensenada de la Paz.
Figura 3. Vibrio algynoliticus en medio TCBS, aislada de la estación No. 6
correspondiente a Marina Palmira en muestras de moluscos bivalvos en la
Ensenada de la Paz.
19
TABLA II.- COLIFORMES TOTALES NMP/100mL EN AGUA DE
SUPERFICIE
ESTACION JUNIO JULIO AGOSTO SEPT. OCT. NOV.
1
23
49
79
23
0
49
2
0
0
2
0
0
0
3
0
8
0
2
0
2
4
0
4
0
5
0
0
5
0
0
0
2
0
0
6
240
94
50
0
2
920
7
13
2
9
0
8
0
8
0
2
0
0
0
0
9
13
0
0
0
0
50
10
0
0
0
0
0
0
11
11
0
0
0
0
0
12
0
2
0
0
0
0
13
0
0
0
0
0
0
14
0
2
79
34
350
49
15
0
0
5
0
0
4
DIC.
5
0
0
0
0
540
5
0
79
2
0
0
0
17
23
ENERO
49
2
0
0
2
33
49
0
79
0
0
0
2
22
23
FEB.
5
0
9
5
0
540
170
2
33
2
0
0
11
11
17
MARZO ABRIL
79
23
0
2
130
13
17
22
2
0
140
540
33
11
0
0
130
33
0
0
0
0
0
0
0
0
49
2400
8
0
TABLA III. - COLIFORMES FECALES NMP/100 mL EN AGUA DE
SUPERFICIE
ESTACION JUNIO JULIO AGOSTO SEPT OCTUBRE NOV.
1
13
79
5
23
0
33
2
0
0
2
0
0
0
3
0
10
0
0
0
0
4
0
4
0
2
0
0
5
0
0
0
0
0
0
6
130
90
13
2
920
240
7
13
2
7
0
8
0
8
0
2
0
0
0
0
9
0
10
2
2
0
49
10
0
0
0
0
0
0
11
2
0
2
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
13
0
0
0
0
0
0
14
0
49
79
33
130
9
15
0
2
11
2
0
2
DIC
2
0
0
0
0
540
5
0
79
2
0
0
0
4
13
ENERO FEBRERO MARZO ABRIL
49
5
10
23
2
0
0
2
0
2
13
23
0
2
8
22
2
0
2
0
33
23
17
350
49
130
17
5
0
2
0
0
79
33
33
23
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
13
0
0
13
11
33
2400
33
3
8
0
20
DISCUSIÓN
El medio marino, que ocupa prácticamente las tres cuartas partes de la superficie
de la tierra, en las zonas costeras entra en relación con el hombre, directamente por
razones laborales o deportivas, o indirectamente por la manipulación o consumo de
productos del mar. Es bien conocido que la contaminación de las aguas costeras por los
vertidos de aguas residuales ha sido, y es aún, una constante fuente epidemiológica de
salmonelosis, hepatitis y otras infecciones; un aspecto menos divulgado es la patología
infecciosa ocasionada por bacterias autóctonas marinas de la familia Vibrionaceae
(Pérez et al., 1983).
En los últimos 10 años ha existido una creciente preocupación por la
introducción directa o indirecta de desechos en el medio ambiente marino. Cerca del
70% de la contaminación proviene de las actividades antropogénicas terrestres, en la
cual los desechos domésticos, industriales y agrícolas son eliminados finalmente en las
costas (Inda 1998).
El contacto directo o consumo de mariscos podrían representar un peligro para la
salud humana, ya que estas descargas llevan una importante diversidad de bacterias
patógenas que pueden causar graves enfermedades sobre la población (Braga et al.,
2000).
Un ejemplo de estos efectos nocivos son la reciente aparición del Vibrio
parahaemolyticus con más de 1.500 personas afectadas en enero del 2004 (RodríguezBenito et al., 2004). Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de
resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo
para la salud pública al estar en contacto con el ser humano (Giono et al., 1994).
La importancia del aislamiento de V. cholerae en moluscos, se suma a la ya
conocida problemática de la salud pública en México por el consumo generalizado, en
forma cruda o con una cocción ineficiente, de los productos de la pesca en diversas
partes del país (Quiñones-Ramírez, 2000).
21
En los últimos años se han descrito en nuestro país diversos casos de infección
por especies del género Vibrio, que llaman la atención sobre la posibilidad de que este
tipo de infecciones sea más frecuente de lo que se cree (Pérez et al., 1983).
El hallazgo de vibriones halofilicos en alimentos frescos de origen marino,
constituyen un peligro potencial y continuo de intoxicación alimentaria para el
consumidor, motivo por el cual es recomendable un monitoreo continuo de estos,
especialmente durante el verano (CDC/NCID, 1994). En el caso de V. alginolyticus, se
le debe reconocer la importancia en su detección tanto en las aguas como en los
moluscos que se consumen en la zona para que así se puedan identificar y determinar su
patogenicidad (Cerezo et al., 1991).
La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la
determinación de la calidad de las aguas para recreación como son La Ensenada y Bahía
de La Paz. El haber determinado la presencia de coliformes fecales en estos alimentos
indica, una contaminación proveniente de una fuente terrestre (CIEMA, 1985). Desde el
punto de vista de salud pública la presencia de este grupo indicador es importante por su
relación con bacterias patógenas provenientes de animales de sangre caliente
(Fapohunda et al., 1994).
Es importante la investigación de bacilos del grupo coliforme de origen fecal y
no fecal en virtud de que son indicadores de posibles diseminaciones de enfermedades
gastrointestinales lo que hace relevante el hecho de poder determinar con precisión el
grado de contaminación del cuerpo de agua con materias fecales humanas(QuiñonesRamírez, 2000).
La técnica del Numero Más Probable (NMP) consiste en un cálculo matemático
y estadístico para determinar cuantitativamente los microorganismos coliformes
presentes en una muestra (SSA, 1993). Sin embargo el NMP constituye únicamente una
prueba presuntiva, ya que podría obtenerse un resultado similar por la presencia de otras
bacterias, lo que hace necesario realizar la prueba confirmatoria para evitar resultados
falsos positivos (Rheinheimer, 1994), misma que se realizó durante este trabajo
22
confirmando la presencia de coliformes fecales en las estaciones de la Ensenada de La
Paz y áreas adyacentes antes mencionadas.
Los organismos utilizados como indicadores biológicos de contaminación fueron
las bacterias coliformes fecales por las ventajas que representan, entre ellas se pueden
mencionar las siguientes: Se considera que niveles bajos de coliformes fecales son
buenos indicadores de ausencia de organismos patógenos. Su evaluación es
relativamente simple y directa (Andrews et al; 1975).
No se multiplican fuera del tracto intestinal de animales de sangre caliente Su
presencia en sistemas acuáticos es evidencia de contaminación de origen fecal
(Fapohunda et al., 1994).
En el presente trabajo se realizó un análisis de muestras de agua de mar y de
moluscos bivalvos para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme
que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente,
la detección de coliformes fecales nos da una indicación sensible de dicho tipo de
contaminación aunque no se comprobó la presencia de Vibrio cholerae en las muestras
si se detectó la presencia de Vibrio vulnificus, V. alginolitycus lo cual representa un
riesgo para la salud de la población (Carney et al., 1975).
Del grupo de coliformes fecales se encontraron por arriba de los límites
permisibles de acuerdo a la técnica del número más probable (NOM-112-SSA1-1994),
este es un indicativo de la presencia de microorganismos patógenos que pueden llegar a
causar enfermedades gastrointestinales. Además existen reportes donde se especula
sobre la posible relación que existe entre estos y Vibrio cholerae, pero esto es un hecho
que cuando se manifiesta V. cholerae existe presencia de coliformes fecales (SSA,
1993).
Ya que aunque comúnmente se les puede encontrar en el medio marino y soporta
gran variedad de condiciones físicas pero puede producir infecciones que incluyen
bacteriemias particularmente importantes en huéspedes inmunocomprometidos otitis
externa y media, infecciones respiratorias e infecciones del tracto urinario(OPS, 1993).
23
Por lo cual es importante mantener un monitoreo constante de la Ensenada y
áreas adyacentes a la Bahía de la Paz. Para evaluar las fuentes de contaminación actuales
y potenciales, procedentes de las actividades humanas, los factores ambientales que
tienen incidencia en la dispersión y dilución del contaminante (Rheinheimer, 1994).
V. vulnificus también puede causar un infección en la piel cuando las heridas
abiertas son expuestas al agua marina tibia. Estas infecciones pueden llevar a la ruptura
de la piel y ulceración (OMSS, 2000). Sin embargo como consecuencia de la
contaminación y debido a que los moluscos bivalvos son organismos que filtran grandes
volúmenes de agua para alimentarse (Rodríguez-Benito et al., 2004). Reteniendo además
del plancton, detritus orgánicos, entre los cuales se encuentran microorganismos
patógenos como bacterias y virus, los cuales se acumulan en su tracto digestivo y al ser
consumidos crudos pueden ocasionar enfermedades potencialmente peligrosas, aunado a
la presencia de otros contaminantes como son metales pesados, plaguicidas,
hidrocarburos y ocasionalmente toxinas de florecimientos algales (Carney et al., 1975).
La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la
determinación de la calidad de las aguas para recreación como son La Ensenada y Bahía
de La Paz. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de
resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo
para la salud pública al estar en contacto con el ser humano (Pérez et al., 1983). El
análisis de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo
coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de
sangre caliente, da una indicación sensible de dicho tipo de contaminación (SSA, 1993).
24
CONCLUSIONES.
Podemos concluir que La Ensenada y Bahía de la Paz mantienen las condiciones
adecuadas para ser utilizadas como aguas de recreación. En el caso de la estación 7
correspondiente a la estación del Centro (Malecón) y en general se recomienda llevar un
seguimiento frecuente sobre todo en las playas ya que son visitadas por el turismo
nacional y por la misma población.
Los resultados obtenidos han demostrado la presencia de las especies V.
vulnificus y V. alginolyticus, considerados como patógenos, los cuales podrían
significativamente contribuir en la aparición de brotes de gastroenteritis y otras
afecciones, asociadas al consumo de moluscos bivalvos crudos o parcialmente cocidos o
al contacto directo.
De acuerdo a los resultados obtenidos se recomienda tomar las muestras de agua en los
próximos monitoreos en puntos fijos que al haber sido muestreados con anterioridad
hayan revelado problemas de contaminación, el muestreo debe incrementarse cuando se
presenten epidemias, en tiempo de lluvias, etc. Igualmente el seguimiento debe ser más
frecuente para observar las variaciones que sufre ya sea por cambios climáticos o por
cualquier otra circunstancia. Concluyendo que se debe mantener la vigilancia de la
calidad del agua, a través del Monitoreo en los puntos fijos mencionados con
anterioridad
dentro de la Ensenada y áreas adyacentes a la Bahía de la Paz,
considerando importante dar un seguimiento en las estaciones de
Pichilingue,
Acuacultores, CFE, Marina Costa Baja, Hotel La Concha, Marina Palmira, Playa
Malecón (Centro), Mogote
Vista Coral, Mogote, CIBNOR, Centenario, Chametla,
Hotel Crown Plaza y CICIMAR-IPN.
Los resultados obtenidos hacen evidente que se debe de realizar un monitoreo
constante, con el fin de que se tenga la información suficiente y actualizada sobre la
situación que existe en los niveles de contaminación. El presente escrito es uno de los
pocos trabajos que se han realizado en moluscos bivalvos para la búsqueda de V.
cholerae en La Ensenada y áreas adyacentes a la Bahía de La Paz.
25
ANEXO
GÉNERO Vibrio
Varias especies de Vibrio son patógenas así como para animales marinos. Existen
más de 20 especies de las cuales solo las 12 siguientes se han encontrado en muestras
clínicas humanas:
Tabla IV.- Especies del genero Vibrio
Aislado en muestras
clínicas humanas
Vibrio Cholerae O1
Vibrio cholerae no O1
Vibrio damsela
Vibrio fluvialis
Vibrio furnissii
Vibrio cincinnatiensis
Vibrio alginolyticus
Vibrio charchariae
Vibrio hollisae
Vibrio metschnikovii OXVibrio mimicus
Vibrio parahemolyticus
Vibrio vulnificus
No aislado en muestras clínicas
V. aesturianus
V. angullarum I y II
V. Campbellii
V. costicola
V. diazotrophicus
V. fischeri
V. gazogenes
V. harveyi
V. loegi
V. natriegens
V.nereis
V.ordali
V orientalis
V. pelagius
V. splendidus
(Giono et al, 1991)
Las cepas puras de Vibrio cholerae cuando reaccionan con el antisuero somático
del grupo O1 son denominadas Vibrio cholerae O1; así como aquellas cepas de Vibrio
cholerae que pertenecen a otros serovares, de los cuales existen 72 serotipos y son
denominados Vibrio cholerae del grupo NO O1, ya que no reacciona con otros
antisueros del grupo O1. Vibrio cholerae O1 incluye dos clases de biotipos, el clásico y
la variante eltor. Los dos biotipos se encuentran separados en dos serotipos principales:
el Owaga y el Inaba y raramente en un tercero, el Hikojima (Giono et al., 1991).
26
MECANISMO DE PATOGENICIDAD
Las cepas de Vibrio cholerae O1 producen una toxina colérica cuya acción sobre
la mucosa del intestino delgado es responsable de la diarrea característica de la
enfermedad.
MECANISMO DE TRANSMISION
El reservorio natural es el hombre, aunque también se sugiere la presencia de
reservorios ambientales. El cólera se mantiene siguiendo un ciclo de transmisión
hombre-medio ambiente-hombre. La transmisión se realiza normalmente por la
ingestión de agua o alimentos contaminados por heces o vomitas de enfermos, en menor
medida por la ingestión de alimento contaminado por agua sucia, heces, manos sucias y
moscas. Los Vibrio pueden persistir en el agua por largo tiempo, así la ingestión de
alimentos crudos o mal cocidos procedentes de aguas contaminadas ha ocasionado
brotes en algunos países.
Tabla V.- VIABILIDAD DEL V.
ALIMENTOS MARINOS Y AGUA
ARTICULOS
CHOLERAE
Pescados y mariscos
Camarones salados, mariscos,
Ostiones, filete de pescado,
pescado ahumado, pescado seco
Agua
Agua de mar
Agua de pozo
ELTOR
EN
TIEMPO DE SUPERVIVENCIA EN DIAS
*(30-32°C)
Alimentos cocinados:
Pescado, camarones
BIOTIPO
(5-10°C)
3–5
2–5
2–5
4 – 14**
10 – 13
7 – 13
60
18
*Tiempo de supervivencia (días) A temperatura ambiente (30 – 32° C), en refrigeración
(5 – 10 °C).
** Mas de tres semanas conservadas en refrigerador.
Fuente: Manual de buenas prácticas y lucha contra el cólera OPS No. 40
27
TRANSMISION COLERA POR ALIMENTOS
Alimentos congelados: La congelación por debajo de 20°C reducirá, pero no
eliminara completamente, la presencia de organismos en los alimentos.
Los peces que viven en las profundidades del mar, en lugar de ser infectados dentro de
su propio hábitat pueden llegar a contaminarse durante el proceso de pesca y
manipulación posterior. El hecho de que los pescados estén congelados, no significa que
el V. cholerae esté muerto. V. cholerae puede sobrevivir por largo tiempo es estado de
congelación. Teóricamente estos alimentos poseen un riesgo de transmisión del cólera
cuando el producto es ingerido crudo o si se provoca contaminación cruzada con otros
alimentos.
Es factible que los crustáceos y moluscos contengan como huésped a V. cholerae
debido a que la congelación no los elimina.
Estos poseen un gran riesgo en la transmisión del cólera en caso de que estos productos
sean ingeridos crudos, provoquen la contaminación cruzada con otros alimentos o bien,
pueden contaminarse durante el proceso de empaque por una manipulación séptica no
supervisada.
Mariscos frescos: Los mariscos que provienen de aguas costeras profundas
pueden estar contaminados, por lo que deben estar cocinados correctamente. Los peces
de mar profundo no están contaminados en su propio hábitat, sino una vez pescados y
después de ciertas manipulaciones. La transmisión del cólera a través de alimentos
puede ser evitada cocinándolos perfectamente bien (temperatura adecuada: >70°C),
previniendo la contaminación de alimentos ya cocinados, evitando el contacto con otros
productos crudos o la manipulación por personal infectado. La refrigeración previene la
manipulación del organismo del cólera pero también puede prolongar la supervivencia del
mismo.
Moluscos bivalvos: Es más factible que los moluscos contengan como huésped a
Vibrio cholerae debido a que la congelación no los elimina. Estos poseen un gran riesgo
en la transmisión del cólera en caso de que estos productos sean ingeridos crudos,
provoquen contaminación cruzada con otros alimentos o bien pueden contaminarse
durante el proceso por manipulación.
28
Alimentos enlatados: Los alimentos contenidos en latas, están libres de poseer V.
cholerae, desde el momento en que las latas son procesadas de acuerdo al método
“Codex Standard”
Alimentos secos y otros alimentos: Los alimentos secos no contienen V. cholerae
debido a que sufrieron un proceso brusco de secado. El aceite de pescado no es capaz de
contener V. cholerae.
Fuente: Manual de buenas prácticas y lucha contra el cólera OPS No. 40
29
50 gr de muestra
ENRIQUECIMIENTO
MÉTODO DIRECTO
SEMBRAR 10 mL EN
AGUA PEPTONADA
8 h, 37 °C
CULTIVO EN
AGUA
PEPTONADA EN
FRASCO DE 450
SEMBRAR
PLACA DE TCBS
18-24 h
ml
EN
18-24 h, 37 °C
COLONIAS
VERDE
CULTIVO EN
COLONIAS
AMARILLA
TRANSFERIR A MIO, LIA, TSI
CALDO PEPTONADO Y ARGININA
TCBS
18-24 h, 37 °C
TRANSFERIR COLONIAS
AMARILLAS A MIO, LIA, TSI, CALDO
PEPTONADO Y CALDO ARGININA
(MEDIOS CON NaCl al 3%)
18-24 h, 37 °C
PRUEBA DE OXIDASA
PRUEBA DE OXIDASA
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
POLIVALENTE O1
PARA V. parahaemolyticus
24 h, 37 °C
AGLUTINACIÓN CON ANTISUERO
(-) V. cholerae NO O1
(+) v.cholerae O1
AGLUTINACIÓN CON
ANTISUEROS
ESPECIFICOS OGAWA E
INABA
Figura 4. Aislamiento y caracterización de Vibrio cholerae a partir de mariscos.
Giono et al., 1991
30
IDENTIFICACION DEL GENERO Vibrio
Las cepas de Vibrio se prefieren que sean aisladas en un medio de cultivo especial como
lo es el TCBS (agar de tiosulfato citrato bilis sacarosa) el cual no se debe utilizar si tiene
más de 24 horas de haberse preparado. En el agar TCBS las colonias típicas de V.
cholerae son amarillas planas un poco convexas aproximadamente de 2 mm de
diámetro. Hay que enfatizar que no todas las colonias amarillas son de Vibrio cholerae.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Seleccionar colonias sospechosas de Vibrio cholerae y sembrar cada una en:
Medio MIO
Agar de hierro y triple azúcar (TSI)
Agar de hierro y lisina (LIA)
Caldo arginina
liquida o
picadura hasta el fondo
estría y picadura
estría y doble picadura
depositar el inoculo y sellar con vaselina
aceite mineral estéril
IDENTIFICACION DE Vibrio cholerae
Después de la incubación se procede a revisar las pruebas bioquímicas para revisar
si concuerda con la Vibrio cholerae. (Tabla VI.- Identificación de diferentes especies del
Genero Vibrio).
Las especies V. parahaemolyticus, V. alginolyticus son organotroficas y
requieren de NaCl al 8% para desarrollarse. De ellos, el más importante es V.
parahaemolyticus que se ha demostrado como causante de brotes de gastroenteritis en
Japón y en los Estados Unidos, asociados al consumo de ostiones, jaibas, camarones,
langosta y otros contaminados o mal cocinados. Vibrio alginolyticus es la bacteria más
ampliamente distribuida en el medio marino Las características del patógeno bacteriano
más común aislados en eventos de vibriosis. V. alginolyticus se ha aislado en infecciones
de oído en pacientes inmunosuprimidos, con quemaduras y en Australia en 20 de 36
heridas asociadas a contaminación de agua de mar (Sindermann, 1990).
31
V. vulnificus es muy parecido a V. parahaemolyticus, produce una citoxina y su
infección se asocia al consumo de ostiones crudos y se ha aislado en casos de septicemia
y de casos mortales en individuos con cirrosis, diabetes o algún otro padecimiento
compatible con inmunodeficiencia. En V. mimicus se ha descrito la producción de una
enterotoxina semejante a la colérica, es capaz de causar diarrea e infecciones oticas.
La especie V. fluvialis se le ha aislado en heces humanas y en casos de diarrea en
Bangladesh, Indonesia y la especie V. furnissii se ha aislado del agua y heces de
animales y en humanos en enfermos con gastroenteritis aguda. V. damsela puede
infectar heridas contaminadas con agua de mar (Sindermann, 1990).
Diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por otras especies de Vibrio próximos a
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus es un bacilo Gram negativo, halotolerante, incluido en la
familia Vibronaceae, cuyas propiedades están próximas a Vibrio cholerae. Produce una
gastroenteritis febril, a veces acompañada de diarrea en las que las heces aparecen
teñidas de sangre. El papel enteropatógeno de este germen ha sido demostrado clara y
repetidamente en Japón, donde constituye una causa importante de infecciones
alimentarias. Los alimentos implicados son generalmente los de origen marino y
moluscos crudos o insuficientemente cocinados, los Vibrio se encuentran en estos
productos ya en el momento de captura. El periodo de incubación es de 6 – 20 horas y
los síntomas son: dolor abdominal, vómitos, náuseas y diarrea. Fiebre frecuente.
Por ser Vibrio Parahaemolyticus un habitante normal en el medio marino, no puede
evitarse que esté presente en los alimentos de este origen. Los alimentos marinos
contaminados por agua superficiales y consumidos crudos parecen constituir el origen
más importante de los procesos producidos por estos Vibrio (Sindermann, 1990).
32
Tabla VI.- Identificación de diferentes especies del Género Vibrio(Giono et al.,
1991)
MICROORGANISMO
COLONIA
TSI
LIA
M I
O
CALDO
PEPTONAD
O
ARGININ
A
ROJO
DE
METILO
V.
P
OXIDAS
A
CALDO NUTRITIVO
CON NaCl (%)
0
V. cholerae
V. alginolyticus
AMARILLA
A(K)/A
K/K
AMARILLA
A/A
K/K
V. charchariae
V. cincinnatiensis
A(K)/A
K/K
AMARILLA
A(K)/A
K/K
(A)
V. damsela**
AMARILLA
K/A
K/K
(A)
V. fluviales
AMARILLA
A/A
K/A
V. furnissii2
AMARILLA
A(K)/A
K/A
V. hollisae
VERDE
K/A
K/A
V. metschnnikovii3
AMARILLA
A/A
K/A
V. mimicus
VERDE
A(K)/A
K/K
AZULVERDE
AZULVERDE
K/A
K/K
A(K)/A
K/K
V.parahaemolyticus
V. vulnificus
+ + +
+ + V
/
- + + - -
+
+
-
+/+
+
+
-
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-/+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+/-
+
+
+
V
+
+
+
-
-
- - /
+
+ - /
+
+ - /
+
+ + + /
+
+ +
+ +
+ +
+
+/
-
+
+
1
3
6
8
1
0
GAS
12
+ + + V - - - + + + + + /
- + + + - - - + + + + - /
- + + + - - -
-
-
-
+
+
- + + + + - /
- + + + + - +
/
- + + + - - -
+
-
- + + + V - -
-
+
+
+
+
+
+
+ + + V - - - + + + + - - + + + - - /
-
-
33
-
-
Tabla VII.- Características de Vibrio y otras bacterias afines
Característica
Crecimiento en TCBS
Vibrio Aeromonas Pseudomonas
Plesiomonas
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+/-)
(+)
Crecimiento en anaerobiosis
Crecimiento en areobiosis
Requerimiento de NaCl
Oxidasa
Fermentación D-glucosa
(Cerezo et al., 1994)
34
Figura 5. Determinación del NMP (número más probable) de
coliformes tomado de
CCAYAC-M-004
35
APÉNDICE
MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES
MEDIO TCBS
(AGAR SACAROSA, SALES BILIARES-CITRATO-TIOSULFATO)
Medio empleado para el aislamiento de Vibrio cholerae y otros Vibrio enteropatógenos
Formula por litro
Agar
Azul de bromotimol
Azul de timol
Bilis de buey
Citrato férrico
Cloruro de sodio
Citrato de sodio
Desoxicolato de sodio
Extracto de levadura
Polipeptona
Sacarosa
Tiosulfato de sodio
pH final
14 g
0.04 g
0.04 g
5g
1g
10 g
10 g
3g
5g
10 g
20 g
10 g
6.8_+0.2
Preparación: Suspender 88 gramos del polvo en un litro de agua destilada calentar
agitando constantemente hasta su ebullición y completa disolución. Dejar hervir un
minuto, enfriar a 45°C. Ajustar el pH indicado con NaOH 1 N y vaciar en cajas petri
estériles 30 mL por placa. El vaciado se realiza en condiciones asépticas. No se
esteriliza.
AGUA PEPTONADA ALCALINA:
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
10.0g
10.0g
1000 mL
Ajustar el pH a 9.0 con NaOH y envasar 10 mL en tubos de vidrio de 16 x 150 con tapón
de rosca. Esterilizar 15 lb por 15 minutos. Enfriar y tapar para evitar que el pH
descienda, guardar en refrigeración hasta el momento de usarlos.
36
PRODUCCION DE INDOL
CALDO DE TRIPTÓFANO O DE PEPTONA:
Peptona
Cloruro de sodio
Triptófano
Agua destilada
2.0 g
0.5 g
1.0 g
100 mL
Rehidratar los ingredientes. Una vez disueltos, vaciar 4 mL en tubos de vidrio 13 x 100
con tapón de rosca y esterilizar 15 libras de presión durante 15 minutos.
PARA DEMOSTRAR LA PRESENCIA DE INDOL
REACTIVO DE EHRLICH
P-dimetilaminobenzaldehido
Alcohol amílico o isoamilico
HCL concentrado
10 g
150 mL
50 mL
Disolver el aldehído en el alcohol, agregar lentamente el ácido a la mezcla aldehído
alcohol.
CALDO LACTOSADO
NOTA: Este medio se puede usar alternativamente para muestras de agua de mar, áreas
de cultivo o para moluscos bivalvos.
Ingredientes:
Extracto de carne
Peptona de gelatina
Lactosa
Agua destilada
3.0 g
5.0 g
5.0 g
1000 mL
Preparación:
Disolver los ingredientes en un litro de agua, calentar ligeramente si es necesario hasta
que el medio este completamente disuelto o utilizar el medio completo deshidratado,
siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que después
de la esterilización, este sea de 6.9 +/- 0.2. Distribuir en tubos de ensayo con tapa de
rosca con campana Durham. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121°C. Enfriar
rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor.
37
CALDO VERDE BRILLANTE LACTOSA BILIS
Ingredientes:
Peptona
Lactosa
Oxgall
Verde brillante
Agua destilada
pH 7.2 +/- 0.1
10 g
10 g
20 g
0.0133 g
1 litro
Preparación:
Disolver la peptona y la lactosa en 500 mL de agua destilada. Adicionar 20 g de Oxgall
disueltos en 200 mL de agua destilada. El pH de la solución debe ser de 7.0 a 7.5.
Mezclar y agregar agua hasta un volumen de 975 mL. Ajustar el pH a 7.4 Adicionar 13.3
mL de una solución acuosa de verde brillante al 0.1 % en agua destilada, agregar agua
hasta completar un litro. Distribuir en tubos de fermentación, asegurando que el medio
cubra las campanas de fermentación de Durham. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.
CALDO EC (E. coli)
Ingredientes:
Bacto triptosa
Bacto lactosa
Bacto sales biliares No.3
Fosfato dipotasico
Fosfato monopotasico
Cloruro de sodio
Agua destilada
pH final: 6.9+/- 0.2 a 25°C
20.0 g
5.0 g
1.5 g
4.0 g
1.5 g
5.0 g
1000 mL
Preparación:
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se
disuelva por completo. Ajustar el pH si es necesario. Distribuir en porciones de 10 mL
en tubos de ensaye con campanas Durham y esterilizar en autoclave durante 15 minutos
a 121°C.
38
AGAR MC CONKEY
Ingredientes:
Proteasa peptona o polipeptona
Peptona o gelizante
Lactosa
Sales biliares No. 3
Cloruro de sodio
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua destilada
pH final: 7.1 +/- 0.2 a 25°C
3.0 g
17 g
10 g
1.5 g
5.0 g
0.03 g
0.001 g
13.5 g
1000 mL
Preparación:
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para
disolver por completo. Ajustar el pH si es necesario. Esterilizar a 121°C durante 15
minutos. Enfriar a 50°C – 60°C. Vaciar en cajas Petri.
REGULADOR DE FOSFATOS SOLUCION CONCENTRADA
Ingredientes:
KH2P04
Agua destilada
34 g
500 mL
Preparación:
Solución concentrada.- Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 con
solución de hidróxido de sodio 1.0 N, llevar a un litro de agua y esterilizar durante 15
minutos a 121°C. Conservar en refrigeración.
Solución de trabajo.- Tomar 1.25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con
agua. Distribuir en porciones de 99, 90, y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121°C.
Durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la
solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
39
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