Daño genotóxico y citotóxico producido por mercurio sobre células

Daño genotóxico y citotóxico producido por mercurio sobre
células sanguíneas de (Cyprinus carpio)
Judith Angelica Nuñez Betancourt*a , Marcela Galar Martínez+a , Sandra Garcia Medinaa ,
Leobardo Manuel Gómez Oliván b
a +
Laboratorio de Toxicología Acuática, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN, Av. Wilfrido
Massieu s/n, esq. Manuel Stampa, Unidad Profesional Adolfo López Mateos, México, D.F. CP 07700.
Tel: (52) 55 57 29 63 00 ext 52373, e-mail: [email protected]
b
Laboratorio de Toxicología Ambiental, Facultad de Química, UAEMex, Paseo Colón intersección
Paseo Tollocan, Colonia Residencial Colón, Toluca, Estado de México, México, CP 50100. Tel:
(52) 7222173890, e-mail: [email protected]
Área del Conocimiento: Biomarcadores/bioindicadores
Resumen:
El mercurio es uno de los metales pesados más importantes para los sistemas acuáticos, ya que no
son eliminados por procesos naturales, puede incorporarse a la cadena alimenticia debido a los
procesos de bioacumulación y produce efectos tóxicos graves. En peces por ejemplo, se ha
demostrado que este metal produce trastornos en la conducta sensorial, alimentaria, reproductiva
y del nado. Sin embargo, respecto al daño genotóxico y citotóxico, existe poca información y este
tipo de estudios son indispensables para identificar los mecanismos por los que actúa. El objetivo
del presente trabajo fue evaluar el efecto citotóxico y genotóxico del mercurio, en sangre de la
carpa común (Cyprinus carpio). Para ello se expusieron los organismos a diferentes
concentraciones subletales del metal (0.001 mg/L y 0.01 mg/L) durante 12, 24, 48, 72 y 96 y
pasado el tiempo de exposición se obtuvieron muestras sanguíneas, en las que se evaluaron los
siguientes biomarcadores: el daño DNA mediante el ensayo de micronúcleos y la apoptosis se
mediante la técnica de marcaje in situ del DNA fragmentado (TUNEL). Los resultados mostraron
que el mercurio produjo una notable inducción de la frecuencia de micronúcleos, así como de la
apoptosis de células sanguíneas en ambas concentraciones de prueba a todos los tiempos de
exposición; en ambos casos alcanzando su máximo a las 48 h, para posteriormente decaer,
aunque siempre por arriba del testigo. Estos resultados ponen de manifiesto la genotoxicidad y
citotoxicidad producida por el mercurio y la necesidad de continuar los estudios toxicológicos de
este metal.
Palabras Clave: Mercurio; genotoxicidad; citotoxicidad; carpa común
Abstract:
Mercury is one of the most important heavy metals to aquatic systems, since it is not
removed by natural processes, can be incorporated into the food chain due to
bioaccumulation processes and produce serious toxic effects. In fish, for example, has been
shown that this metal produces disorders in sensory, food, reproductive and swimming
behavior. However, regarding to genotoxic and cytotoxic damage, there is little information
and such studies are essential to identify the mechanisms by which it operates. The aim of
this study was to evaluate the cytotoxic and genotoxic effects of mercury in blood of
common carp (Cyprinus carpio). Test organisms were exposed to different sublethal
concentrations of the metal (0.001 mg / L and 0.01 mg / L) for 12, 24, 48, 72 and 96 and
after the exposure time blood samples were obtained and the following biomarkers were
evaluated: DNA damage using the micronucleus assay and apoptosis by the technique of in
situ labeling of fragmented DNA (TUNEL). The results showed that mercury produced a
marked induction of micronuclei frequency and apoptosis of blood cells in both test
concentrations at all exposure times, in both cases peaking at 48 h and then decline, although
always above the control. These results demonstrate the genotoxicity and cytotoxicity caused
by mercury and the need for further toxicological studies of this metal.
Keywords: Mercury; genotoxicity; cytotoxicity; common carp
1. Introducción
El agua es indispensable para la vida de todos los organismos, siendo además utilizada
por el hombre en múltiples actividades tales como la agricultura, la industria, la recreación y por
supuesto domésticas. Sin embargo, el crecimiento poblacional y el vertido de contaminantes a los
embalses, ha ocasionado que este recurso se vea severamente amenazado.
Entre los contaminantes más dañinos para los ecosistemas acuáticos y la biota asociada, se
encuentran los metales. Algunos de ellos son esenciales para la vida de los organismos, tal es el
caso del cromo, el cobre, el fierro, el molibdeno, el selenio y el zinc, pero son tóxicos a
concentraciones elevadas en el medio. Otros, como los denominados metales pesados, entre los que
se encuentran el plomo, el cadmio y el mercurio son extremadamente tóxicos.
Los metales pesados son considerados entre los contaminantes más importantes para los sistemas
acuáticos, ya que no son eliminados por procesos naturales y pueden incorporarse a la cadena
alimenticia debido a los procesos de bioconcentración, bioacumulación y/o biomagnificación
[1].
En el ambiente acuático el Hg existe tanto en formas inorgánicas y orgánicas, pero el
metilmercurio es el compuesto más toxico y el más común de los compuestos órgano-
mercuriales. Este tóxico se forma en los sedimentos acuáticos por metilación bacteriana del Hg
inorgánico. En aguas neutras, se favorece la formación de dimetilmercurio volátil, el cual puede
escapar a la atmosfera [2].
El mercurio es uno de los metales que más ha atraído la atención de la ciencia, debido principalmente a
los severos efectos tóxicos que produce, evidenciados sin duda por el episodio acaecido en la Bahía de
Minamata, Japón. Es un agente neurotóxico que en humanos se manifiesta como eretismo mercurial:
excitabilidad, trastornos emocionales, alteraciones en la memoria y en la capacidad de concentración.
En casos más graves el daño neurológico produce retraso psicomotor, incoordinación, ataxia,
movimientos involuntarios, parálisis, sordera o ceguera.
En especies acuáticas este metal es capaz de producir diversos efectos tóxicos. Devlin (2006), demostró
que en los peces Pimephales promelas expuestos a 25 g.L-1 se produce un decremento en la síntesis de
proteínas. Así mismo, en diversas especies acuáticas y en sus depredadores han sido observados
incrementos en la producción enzimática, decremento de la función vascular, cambios en parámetros
sanguíneos, respuesta inmune y renal, así como cambios en el comportamiento [3, 4]. El efecto más
importante de la contaminación ambiental por mercurio se produce a nivel acuático, debido a que
el metilmercurio es una toxina que se absorbe rápidamente. Se acumula en los tejidos grasos de
los peces a concentraciones y niveles elevados, dañando principalmente el sistema nervioso [5].
En particular en peces como el Salmo salar, Pomatoschistus microps, Cyprinus carpio, Liza aurata,
Ictalarus melas, se ha observado la acumulación de este metal en las branquias, riñón, hígado,
músculo y cerebro; modificación de la actividad de enzimas antioxidantes, lipoperoxidación (LPX)
e incremento en los niveles de biomoléculas
ricas en grupos sulfhidrilos (-SH)
(glutatión reducido y metalotioneínas); así como trastornos en la conducta sensorial,
alimentaria, reproductiva y del nado por exposición [1].
La capacidad de producir especies reactivas de oxígeno del mercurio ha sido vinculada con daños
genéticos y citotóxicos en mamíferos, por lo que es posible que se presenten este tipo de efectos en
organismos acuáticos, tales como la carpa común [6].
La carpa común es un pez de agua templada a semifria, que soporta altos niveles de oxígeno y
pH, amoniaco, nitratos, nitritos y fosfatos y ha sido empleada con frecuencia como especie
bioindicadora en estudios de toxicidad [7].
2. Materiales y métodos
2.1 Colecta y mantenimiento de la carpa (Cyprinus carpio)
Las carpas se obtuvieron del centro acuícola carpícola Tiacaque, Estado de México y se
distribuyeron en peceras de vidrio de 40 L de capacidad (20 peces en cada una). Se
colocaron sistemas de filtración para mantener el agua limpia y favorecer la circulación y
aireación. Se mantuvieron a temperatura ambiente, con ciclos de luz-obscuridad natural y se
alimentaron diariamente con alimento de alta calidad (Nutripec, nutrimentos purina). El peso
de los órganismos empleados para los estudios fue de 13.11 ± 1.11 g y una longitud de 7.76 ±
0.19 cm. Los peces se aclimataron 2 semanas antes de la realización del estudio.
2.2 Estudio de toxicidad
Se formaron 3 lotes de 2 carpas cada uno por triplicado, cada uno en acuarios de plástico de 10
L de capacidad, con aireación constante y ciclos de luz-obscuridad naturales y fueron
expuestos a 0.001 y 0.01 mg/L de Hg, en forma de cloruro de mercurio. El tercer lote
corresponde al testigo sin exposición a Hg. Las concentraciones empleadas equivalen al
límite máximo permisible ( LMP) para la protección de vida acuática y a un 1/10 de la CL50
determinada previamente en el laboratorio, respectivamente. Transcurridas 12, 24, 48, 72 y 96
h, se obtuvieron muestras de sangre por punción de la arteria/ vena caudal y se determinó la
genotoxicidad mediante la cuantificación de la frecuencia de micronúcleos y la citotoxicidad
por evaluación de apoptosis mediante la técnica de TUNEL. La muestra se dividió en dos
partes, la primera en fresco para la prueba de micronúcleos y la segunda se preservó en solución
conservadora del kit para citología líquida (Productos Biológicos de México) para la
determinación de apoptosis.
2.2.1 Evaluación de frecuencia de micronúcleos
Se realizó un frotis de la muestra sanguínea obtenida de cada organismo después de la
exposición, se fijaron con etanol puro durante 20 min y se dejaron secar a temperatura
ambiente. Posteriormente se tiñeron con una solución de Giemsa al 10% durante 9 min.Fueron
examinados un total de mil eritrocitos para cada muestra en el microscopio de luz y la frecuencia
de micronúcleos en las células (MN) se expresó como número por mil (%) MN [8].
2.2.2 Evaluación de la apoptosis
Se tomaron 300 μL de las células en la solución conservadora y se centrifugaron a 300 rpm
durante 5 min a 4° C. El botón se resuspendió en 50 μL de la solución de montaje (kit citología
liquida- PBM). Se tomó 1 µL de la suspensión celular y se colocó en un portaobjetos con
polilisina (Sigma), se secó la preparación a 60°C durante 5 min. Una vez seco el material
celular, se fijó con acetona fría por 10 min y se hidrataron con cambios sucesivos de xileno y
etanol (del 100% al 50%) y agua. A c o nt inu a c ió n se realizó un pretratamiento con proteína
K (20 µg/mL., Bioline) por 10 min y se lavó la muestra tres veces con PBS, añadiendo 60 μL
de la enzima TdT a 37°C durante 60 min. Por ultimo, las células se lavaron las muestras tres veces con
PBS y se agregó el conjugado anti-FITC para el marcaje de las células apopticas, incubándolo
en una cámara húmeda por 30 min a temperatura ambiente. Se lavaron las muestra 4 veces
con PBS por 2 min a temperatura ambiente. Finalmente se contrastó el marcaje con IP (1.5
µg/mL). Las laminillas se observaron en el microscopio de fluorescencia (Zeiss) con un
sistema de captura de Media Cybernetics y un filtro de 450-490nm. En el ensayo, se incluyó un
grupo testigo positivo tratando la muestra con DNasa I (1 µg/mL), mientras que el testigo negativo
se consiguió al tratar una muestra sanguínea al igual que las del ensayo, pero no se le aplicó la
solución de la enzima TdT. La apoptosis se expresó como el número de células TUNEL
positivas por cada 100 células.
2.2.3 Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados mediante ANOVA no paramétrica de Kruskall Wallis con p <
0.05.
3. Resultados
3.1 Evaluación de micronúcleos
Figura 1. Frecuencia de micronúcleos en los organismos expuestos a diferentes concentraciones de
mercurio. Cada valor representa la media de 6 organismos ±EE. a Indica la diferrencia
b
significativa con respecto a su testigo. Indica una diferencia significativa entre 0.001 mg/L y 0.01
mg/L , prueba de ANOVA de no paramétrica de Kruskal-Wallis con p< 0.05.
La figura 1 muestra los resultados referentes al efecto genotóxico del Hg sobre la sangre de la carpa
común, expresados como frecuencia de micronúcleos. Como puede observarse los organismos
expuestos a ambas concentraciones presentan un incremento significativo en el porcentaje de
frecuencia de micronúcleos a partir de las 12 hasta las 96 h en comparación con sus testigos (p<0.05),
siendo el efecto dependiente del tiempo y la concentración. Es importante mencionar que a partir de as
48 h el porcentaje de micronúcleos comienza a disminuir, aunque nunca recupera el valor presentado
por el grupo testigo.
3.2 Evaluación de la apoptosis
Figura 2. Porcentaje de células apoptóticas en los organismos expuestos a diferentes concentraciones
a
de mercurio. Cada valor representa la media de 6 organismos ± EE. Indica la diferencia significativa
b
con respecto a su testigo. Indica una diferencia significativa entre 0.001 mg/L y 0.01 mg/L, prueba
de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis con p< 0.05.
Los resultados referentes al porcentaje de células en apoptosis se presentan en la figura 2. Como puede
observarse, en los organismos expuestos a ambas concentraciones de Hg se presentó un incremento en
el porcentaje de células apoptóticas a partir de las 12 y hasta las 96 h en comparación con el testigo,
siendo el efecto dependiente del tiempo y la concentración y aunque el daño es más evidente en la
concentración más alta (0.01 mg/L, 1/10 CL50) no se encontró diferencia significativa entre estos. Es
importante mencionar que a partir de las 48 h el porcentaje de células apoptóticas comienza a
disminuir, aunque nunca recupera el valor presentado por el grupo testigo.
4. Discusión
El mercurio es un metal sin función biológica conocida, que es tóxico incluso a concentraciones
bajas. Su toxicidad y biotransformación han sido extensamente estudiadas, sin embargo la toxicidad del
mercurio inorgánico aun permanece en discusión, probablemente debido a las diferencias bioquímicas,
fisiológicas y anatómicas entre los modelos estudiados, así como las variedades de técnicas empleadas
para su análisis [9]. Además, su posible genotoxicidad y citotoxicidad en organismos acuáticos no han
sido evaluadas.
La identificación de MN es una prueba importante y potente para la evaluación de genotoxicidad ya
que es simple, sensible e independiente de las características del cariotipo de los animales de prueba.
En el presente estudio se evaluaron los efectos genotóxicos producidos por dos concentraciones de Hg
(LMP para la protección de vida acuática y 1/10 CL50) usando como modelo biológico a la carpa
común. En ambos grupos de prueba, LMP y 1/10 CL50 (fig. 1) se encontró un aumento gradual de la
frecuencia de MN a partir de las 12 hasta las 48 h, en donde se observó una máxima frecuencia de éstos
y disminuyó paulatinamente hasta las 96 h. Estos resultados coinciden con lo observado en el pez
Channa punctata expuesto a contaminantes acuáticos, que presentan una mayor frecuencia de MN
dependiendo de la concentración del contaminante al que está expuesto el organismo. En este estudio
se presentó un aumento en función del tiempo de exposición en la inducción de MN en la sangre
periférica de los peces expuestos a una concentración subletal de Hg (II). También informaron que al
someter a los individuos a un tiempo de exposición más prolongado se observa un incremento en la
inducción de MN seguido de una estabilización ligera y una disminución gradual [10].
Esto concuerda en lo observado en Cyprinus carpio expuesto a diferentes concentraciones de mercurio
0.001 mg/L y 0.01 mg/L (LMP y 1/10 CL50), en donde se encontró que al aumentar el tiempo de
exposición se presenta una mayor frecuencia en la inducción de MN, seguido por una estabilización
ligera y una disminución gradual. Como puede observarse durante los primeros tiempos de exposición
el Hg ejerce un notable efecto genotóxico, pero conforme éste transcurre probablemente el material
genético es reparado y el daño revertido. Sin embargo, es posible que una mayor concentración del
metal inhiba la división normal de las células, produciendo daño a cromosomas en los eritrocitos y el
ADN durante la replicación, además de una posible activación de procesos como la muerte celular [11].
Así, en este trabajo el incremento de células apoptóticas (fig. 2) coincide con un mayor daño al ADN,
aunque independientemente del grado de daño la frecuencia de apoptosis es la misma. Es probable que
se esté observando una activación de los mecanismo de defensa para reducir el daño, a fin de estabilizar
la frecuencia de MN relativamente y por ende las consecuencias biológicas de éstos [11].
El mecanismo de la genotoxicidad inducida por el mercurio es bastante complejo; este metal posee una
gran afinidad por las macromoléculas y se une al ADN tanto in vitro como in vivo, lo que conduce a
alteraciones en la estructura [12]. Además, se ha demostrado que este metal aumenta los de niveles
especies reactivas de oxígeno en los tejidos y células por el agotamiento de los antioxidantes celulares
y presenta una fuerte interacción con los grupos sulfhidrilo (-SH) de diversas biomoléculas, entre estas
el glutatión, aumentando la producción de radicales libres [13]. La generación de daño oxidativo parece
estar relacionado con mecanismos genotóxicos y la interferencia con los procesos de reparación del
ADN y la replicación [14]. La inhibición de los procesos de reparación del ADN puede ser un
mecanismo importante en la genotoxicidad del metal, en contraste con el daño directo del ADN [9].
Los iones de Hg pueden inducir estrés oxidativo mediante la generación de ROS a través de la
interrupción del transporte de electrones en la cadena mitocondrial [15]. Este fenómeno suele ocasionar
una degeneración celular, activar las rutas señalizadoras para iniciar la muerte celular. Es más, se ha
observado en linfocitos expuestos a compuestos de Hg incrementa el citocromo C en el citosol,
activando las ruta de señalización intrínseca de la muerte celular [16].
Kim y Sharm (2006) encontraron en macrófagos de murinos expuestos in vitro a HgCl un incremento
en la actividad de las caspasas 3 y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), proponiendo que la muerte
observada en las células se generaba por una mezcla de muerte celular ocasionada por la necrosis y la
apoptosis [17]. Dichos efectos están íntimamente relacionados con la generación de especies reactivas
de oxígeno. Por otro lado, en linfocitos humanos se encontró que el Hg es capaz de alterar los niveles
de las proteínas de la familia Bcl-2, dichas proteínas se encuentran involucradas los procesos
antiapoptoticos, por lo que la actividad de las caspasas no es regulada presentándose la muerte por
apoptosis [16]. Finalmente, el propio daño del material genético es capaz de desencadenar las rutas
señalizadoras intrínsecas a través del p53, el cual activa la expresión de genes pro-apoptosis, como
BAX o PUMA. En este contexto no existe antecedentes de que el Hg inorgánico sea capaz de activar la
muerte celular por esta vía, sin embargo en ratones expuestos a compuestos orgánicos de Hg se
encontró un incremento significativo en los niveles de P53, Bax Bad y la caspasa 3 en células
alveolares de tipo II del epitelio [18]. El análisis de la geno/citotoxicidad en células sanguíneas de los
organismos expuestos a metales, como el Hg, puede ayudar a entender el mecanismo mediante el cual
los contaminantes ejercen su toxicidad. Los tóxicos no solo pueden afectar a nivel molecular, sino
también iniciar una cascada de respuestas en los niveles superiores, incluyendo los tejidos, afectando la
salud de los organismos, la reproducción, la demografía y genética de las poblaciones, además de
procesos como la extinción de las especies [19]. Por lo tanto, los estudios sobre los biomarcadores de
geno/citotoxicidad pueden ser utilizados para explicar el impacto de la toxicidad de los xenobióticos en
los ecosistemas acuáticos.
5. Conclusiones
El Hg es un agente genotóxico y citotóxico, ya que se observó un incremento en la frecuencia de
micronúcleos, así como en la la proporción de células apoptóticas en los eritrocitos de la carpa común
(Cyprinus carpio), siendo el daño en ambos casos dependiente de la concentración y el tiempo de
exposición. Finalmente, la concentración de 0.001 ppm de Hg que se considera como el LMP para la
protección de la vida acuática no es apto para el desarrollo de la carpa común (Cyprinus carpio) en este
estudio.
Agradecimientos
Este estudio se realizó gracias al apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (proyecto
181541) y del Instituto Politécnico Nacional a través de la Secretaría de Investigación y Posgrado
(proyecto SIP 20110418).
Referencias
[1] Vieira ,L.R., Gravato ,C., Soares ,A.M.V.M., Morgado ,F., Guilhermino ,L. 2009. Acute effects of
copper and mercury on the estuarine fish Pomatoschistus microps: linking biomarkers to behavior.
Chemosphere. 76:1416–1427.
[2] Manahan ,S. E. 2007. Introducción a la química ambiental. Reverte. 151-152.
[3] Devlin, E.W. 2006. Acute toxicity, uptake and histopathology of aqueous methyl mercury to
fathead minnow embryos. Ecotoxicol. 15(1): 97-110.
[4] Boening, D. W. 2000. Ecological effects, transport and fate of mercury: a general review.
Chemosph. 40(12):1335-1351.
[5] Nemerow, L.N., Avijit ,D. 1998. Tratamiento de vertidos industriales y peligrosos. Ediciones Díaz
Santos España, 696.
[6] Ehrenstein ,C., Shu ,P., Wickenheiser ,E.B., Hirner ,A.V., Dolfen ,M., Emons ,H., Obe G. 2002.
Methyl mercury uptake and associations with the induction of chromosomal aberrations in Chinese
hamster (CHO) cells. Chemico-Biological Interactions, 141: 259-274.
[7] Garanko ,N.N., Arkhipchuk ,V.V. 2005. Using the nucleolar biomarker and the micronucleus test
on in vivo fishfin cell. Ecotoxicology and Environmental Safety.62:42-52.
[8] Cavas¸T., Ergene-G¨oz¨ukara, S. 2005. Induction of micronuclei and nuclear abnormalities in
Oreochromis niloticus following exposure to petroleum refinery and chromium processing plant
effluents. Aquatic Toxicology. 74: 264–271.
[9] Kalafanić , M., Kopjar , N., Besendorfer , V. 2004. The influence of mercuric chloride on neoblast
division in regenerating planarian Polycelis felina (Daly.) Water, Air, and Soil Pollution 156: 195–210.
[10] Kligerman, D. 1982. Fishes as biological detectors of the effects of genotoxicagents.In: Heddle, J.
(Ed.), Mutagenicity: New Horizons in Genetic Toxicology. Academic Press, New York.435–456.
[11] Nepomuceno, J.C., Ferrari, I., Spano, M.A., Centeno, A.J., 1997. Detection of micronuclei in
peripheral erythrocytes of Cyprinuscarpio exposed to metallic mercury. Environmental and Molecular
Mutagenesis.30: 293–297.
[12] Grover, P., Saleha Banu, B., Dana Devi, K. and Begum, S. 2001. In vivo genotoxic effects of
mercuric chloride in rat peripheral blood leukocytes using comet assay, Toxicology. 167:191–197.
[13] Guilherme, S., Válega, M., Pereira, M.E., Santos, M.A., Pacheco, M. 2008. Antioxidant and
biotransformation responses in Liza aurata under environmental mercury exposure – Relationship with
mercury accumulation and implications for public health. Marine Pollution Bulletin. 56:845–859.
[14] Hartwig, A. 1995. Current aspects in metal genotoxicity. Biometals. 8:1–3 II-Young ,K.,ChangKee, H. 2006. Comparative evaluation of the alkaline comet assay with the micronucleus test for
genotoxicity monitoring using aquatic organisms. Ecotoxicology and Environmental Safety.64: 288297.
[15] Berntssen, M.H.G., Aatland, A., Handy, R.D. 2003. Chronic dietary mercury exposure causes
oxidative stress, brain lesions, and altered behaviour in Atlantic salmon (Salmo salar) parr. Aquatic
Toxicoly. 65: 55–72.
[16] Shenker ,B.J., Guo ,T.L., Shapiro ,I.M. 2000. Mercury-induced apoptosis in human lymphoid
cells: evidence that the apoptotic pathway is mercurial species dependent. Environmental Research.
Section A, 84: 89-99.
[17] Kim, S.H., Sharma, R. P. 2006. Mercury-induced apoptosis and necrosis in murine macrophages:
role of calcium-induced reactive oxygen species and p38 mitogen-activated protein kinase signaling.
Toxicology and Applied Pharmacology.196: 47-57.
[18] Lu ,T. H., Chenm ,C. H., Lee, M.J., Ho, T. J., Leung ,Y .M., Hung ,D .Z., Yen C, C., He ,T. Y.,
Chen ,Y. W. 2010. Methylmercury chloride induces alveolar type II epithelial cell damage through an
oxidative stress-related mitochondrial cell death pathway. Toxicology Letters. 194:70-78.
[19] Monteiro ,D.A., Rantin ,F.T., Kalinin ,A.L. 2010. Inorganic mercury exposure: toxicological
effects, oxidative stress biomarkers and bioaccumulation in the tropical freshwater fish matrinxã,
Brycon amazonicus (Spix and Agassiz, 1829). Ecotoxicology. 19:105–123.