Onion gynogenesis Ginogénesis en cebolla

Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
Ginogénesis en cebolla
María Teresa Ponce
Cátedra de Fisiología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Cuyo. Alte Brown 500. Chacras
de Coria. Mendoza Argentina. C.P. M5528 AHB. E mail: [email protected]
Resumen
La inducción de haploides a través de la ginogénesis in vitro,
permite la obtención de líneas que luego de la duplicación de sus
cromosomas, pueden ser utilizados en planes de mejoramiento para
la producción de híbridos comerciales. Esta técnica ha sido utilizada
en cebolla desde finales de los ´80 y sus principales ventajas son
el corto tiempo hasta la obtención del doble haploide y el nivel
de homocigosis que se puede alcanzar, teniendo en cuenta que la
cebolla es una planta bienal y alógama con alto grado de depresión
por consanguinidad. Como desventaja se debe mencionar la baja
tasa de inducción de haploides. El genotipo, la planta donadora, las
condiciones de cultivo de las plantas donadoras y los reguladores del
crecimiento son los principales factores que afectan el rendimiento
de la misma. En este trabajo se presenta una descripción general de
la técnica y de los factores que afectan su rendimiento.
Palabras clave adicionales: Allium cepa, haploides, cultivo in
vitro
Onion gynogenesis
Summary
Haploid induction in onion via gynogenesis allows obtaining inbred
lines that after chromosome duplication can be used in commercial
hybrid production. This technique has been used since last 80th and
shorter time to double haploid attainment and homozygosis level
achieved are the principal advantages, considering that onion is
allogam biannual plant with high inbreeding depression. In contrast,
low regenerant rate is the principal disadvantage. Genotype, donor
Introducción
El término ginogénesis es utilizado para describir la
posibilidad de obtener plantas haploides a partir del
gametofito femenino. La inducción espontánea in situ
de plantas haploides se conoce desde 1922, cuando
Blakeslee (2) describe este fenómeno en Datura.
La inducción espontánea de haploides es un evento
“raro” de un uso práctico limitado. El principal
progreso en la obtención de plantas haploides fue en
1966 cuando Guha & Maheshwari (18) describieron
por primera vez la inducción in vitro de haploides vía
el cultivo de anteras. Debido a este acontecimiento el
estudio de la inducción de haploides vía ginogénesis
fue postergada por más de una década (43). Pasado
ese período, la ginogénesis comienza nuevamente a
ser estudiada en varias plantas de uso agrícola y la
inducción de haploides ginogenéticos fue reportada
en distintos géneros y especies.
Los métodos para inducir plantas haploides vía
ginogénesis pueden dividirse en dos categorías.
La primera es la inducción in situ por polinización
irregular, que puede ser asistida por el rescate in
vitro del embrión haploide y la segunda categoría
es la inducción in vitro cultivando los órganos
reproductivos femeninos no polinizados.
• Inducción in situ: existen para esta técnica tres
posibilidades. La primera forma consiste en utilizar
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
plant, growth condition of donor plants and growth regulators
are the main factors affecting the yield of this method. A general
description of the technique and factors affecting the yield are
presented.
Additional Key Words: Allium cepa, haploids, in vitro culture
polen de la misma especie; este polen debe llevar
un gen específico el cual causa un incremento en el
porcentaje de embriones haploides; el maíz es un
típico ejemplo (25). La segunda posibilidad consiste
en la utilización de polen de una especie silvestre o de
otro género. Esto requiere en algunos casos el rescate
in vitro del embrión para asegurar la sobrevivencia
del haploide, esta técnica ha sido utilizada en trigo
(26) y papa (20) entre otros. La tercer posibilidad para
provocar la inducción de haploides es el uso de polen
irradiado de la misma especie, el que puede madurar
en la planta o ser cultivado in vitro. De esta última
técnica existen muchos ejemplos como en melón
(40), zapallo (42), cebolla (11), etc.
• Inducción in vitro: esta técnica consiste en el
cultivo de órganos femeninos no polinizados. De
acuerdo con Yang & Zhou (43) la primera inducción
exitosa de haploides vía ginogénesis fue obtenida
por San Noeum (39) en cebada. Esta técnica ha sido
eficiente en un gran número de especies (Cuadro
1). La ventaja de esta técnica consiste en que no
existe la posibilidad de obtener híbridos a partir de
una polinización legítima y la desventaja consiste
en que se puede desarrollar un individuo a partir de
otro tejido no esporofítico por lo que es necesario
confirmar el origen haploide del mismo. Para la
inducción de órganos femeninos reproductivos, los
elementos más importantes son la composición del
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
medio y el genotipo utilizado. Allium cepa y Beta
vulgaris son las especies más estudiadas, en las
cuales se ha obtenido la inducción de haploides por
medio del cultivo in vitro de órganos femeninos no
polinizados (3).
La obtención de líneas homocigotas en cebolla
(Allium cepa L.) representa un paso necesario
tanto para la producción de híbridos como para la
acumulación de genes útiles (8). Esta especie bienal
y alógama no tolera bien la autofecundación (23). La
obtención de líneas homocigotas demanda alrededor
de 10 años mientras que por medio del cultivo in vitro
de flores y ovarios no polinizados para la obtención
de haploides y la posterior duplicación del número de
cromosomas, permite la obtención de haplodiploides
(HD) en dos años. Estos presentan alto grado de
homogeneidad y de estabilidad genética (8). En lo
expuesto en el párrafo anterior radica la importancia
de la técnica como complemento de programas de
mejoramiento genético en cebolla.
En el Cuadro 2 se presenta un resumen de los
distintos trabajos publicados sobre ginogénesis
in vitro de cebolla y en los capítulos siguientes se
desarrollará en detalle este tema.
Cuadro1. Especies y medios de cultivo de óvulos y ovarios no polinizados para la obtención de haploides
Especie
Medio Basal
Componentes adicionales
Referencia
Allium porrum
MS
1 M Naa + 8 M 2-ip + 3
o 6 % sacarosa
Schum et al. 1993
Arachis hypogaea
MS
2 mg·L-1 NAA + 0,5 o 1 mg·L-1
BA
Liang et al. 1990
Beta vulgaris
Zhu & Wu (Zhu &
Wu 1979)
2 mg·L-1 2,4-D + 8 %
sacarosa
Hosemans & Bossoutrot 1983
N6 (Chu 1978)
2,85 M IAA + 0,94 M KT
o 0,88 mM BA
Ferrant &Bouharmont
1983
Cayratia japónica
MS
2,3-4,6 M 2,4-D y TDZ
Zhou et al. 1994
Cucumis melo,
Cuccumis sativus
MS
0,4 mg·L-1 2,4-D + 2 - 4
mg·L-1 IAA + 0,02 mg·L-1
KT + 3 % sacarosa
Dryanovsca & Ilieva
1983
Dryanovsca 1985
Hordeaçum vulgare
Miller (Miller 1963)
2 mg·L-1 2,4-D + 10%
sacarosa
San Noeum 1979 CA
Wang & Kuang 1981
N6
0,5 mg·L-1 4-D + 1 mg·L-1
NAA + 1-2 mg·L-1 MCPA
+0,5-1 mg·L-1 KT + 2 %
sacarosa
Huang et al. 1982
Nicotiana tabacum
Gamborg (Gamborg
& Eveleing 1968)
0,5 -1 mg·L-1 IAA + 2 o 4
mg·L-1 KT + 2 % sacarosa
Zhu & Wu 1979; Zhu
et al. 1981
Oryza sativa
Miller
3 mg·L-1 NAA + 2.000 mg·L-1
extracto de levaduras - 6 %
sacarosa
Beaville 1980
N6
2 mg·L-1 2,4-D + 0,25 mg·L-1
MCPA
Zhou & Yang 1981;
Kuo et al. 1982
Solanum tuberosum
MS
0,1 -1mg·L-1 KT + 0,5 - 1
mg·L-1 IAA + 3 % sacarosa
Triticum aestivum
MS
1 mg·L-1 KY + 0,5 mg·L-1 IAA
Hvilkovskaya 1982;
Hvilkovskaya &
Zenkteler 1983
Zhu et al. 1981
N6
2,6-4,4 mg·L-1 2,4-D + 2-2,8
mg·L-1 IAA+ 6 mg·L-1 KT + 6 %
sacarosa
Mukhambetzhanov
1992
MS
3 mg 2,4-D + 2.000 mg·L-1
extracto de levaduras + 100
mg·L-1 caseina hidrolisada +
2 % sacarosa
Uchimaya et al. 1971
Zea mays
Por referencias consultar (31)
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
Cuadro 2. Detalle de los principals trabajos en ginogénesis in vitro de cebolla
Explanto
Medio Basal
Componentes adicionales
Referencias
Ovarios
1-2-3-5 y 6 a
10 daa
B5
2 mg·L-1 2,4 -D + 1 mg·L-1
BA
2-5-10-15 % sacarosa
Murem 1989
Flores ovarios
y óvulos 3-5
daa
Inducción: sales MS, Vitaminas
N&N
100 mg·L-1 Inositol, 3 %
sacarosa, 200 mg·L-1
prolina, 6% agar
distintas combinaciones
de aux., cit, y Ag3
(TIBA)
100 mg·L-1 Inositol, 3 %
sacarosa, 200 mg·L-1 Lprolina, 6 % agar
distintas comibanciones
de aux., cit, y Ag3
(ANA + 2ip)
Campion & Alloni
1990
100 a 500 100 mg·L-1
inositol
sacarosa 3 a 10 %
800 mg·L-1 glutamina
200 mg·L-1 L-prolina
0,3-1-10 mg·L-1 adenina
6% agar
ANA, IBA, 2-4D
BA-2ip
AG3
Campion 1992
Regeneración: idem anterior
Flores y
ovarios 3-5
daa
Inducción: MS entero, 1/2 y 4/5,
B5 y BDS
Regenaración ídem anterior
Inducción: B5, 2 mg
2,4-D + 1mg BA, 10
% sacarosa (14 días)
Regeneración: BDS,
200 mg L-prolina,
+ 10 mg adenina
Flores y
ovarios 3-5
daa
Inducción: BFD distintos
períodos,mejor 15 d.
Regenaración: BDS,
En ambos casos vitaminas
propias
2 mg·L-1·L-1 2,4-D + 1 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa
2 mg·L-1 ANA + 2 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa
sin Reg. Crec. 10 %
sacarosa
Campion et al. 1995
Flores 3-5 daa
Inducción (flores) B5
2 mg·L-1 2,4-D + 2 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa 6
% agar
200 mg·L-1 L-prolina + 400
mg·L-1 inositol y 2 mg·L-1
ANA + 1 mg·L-1 2-ip o
2 mg·L-1 TDZ + 40 %
sacarosa, 6 % agar
Bohanec et al. 1995
2 mg·L-1 2,4-D + 2 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa, 6
% agar o 2 % gellum
gum.
100 mg·L-1 PAA + 1
mg·L-1 BA, 10 %
sacarosa, 6 % agar.
200 mg·L-1 L-prolina +2
mg·L-1 TDZ, 10 %
sacarosa, 6 % agar
200 mg·L-1 L-prolina +
0,2 mg·L-1 TDZ, 10 %
sacarosa, 6 % agar o 2
% gellum gum
Jakse et al. 1996
2 mg·L-1 2,4-D + 2 mg·L-1
BA, 7,5 % sacarosa
7 % agar
Geoffriau et al. 1997a
Regeneración: óvulos y ovarios
BDS
Flores 3-5 daa
Inducción B5 (10 a 14 días)
Regeneración: BDS
Flores 3-5 daa
B5
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Cuadro 2. Detalle de los principales trabajos en ginogénesis in vitro de cebolla (continuación)
Explanto
Medio Basal
Referencias
Ovarios
1-2-3-5 y 6 a
10 daa
B5
2 mg·L-1 2,4 -D + 1 mg·L-1
BA
2-5-10-15 % sacarosa
Murem 1989
Flores ovarios
y óvulos 3-5
daa
Inducción: sales MS, Vitaminas
N&N
100 mg·L-1 Inositol, 3 %
sacarosa, 200 mg·L-1
prolina, 6% agar
distintas combinaciones
de aux., cit, y Ag3
(TIBA)
100 mg·L-1 Inositol, 3 %
sacarosa, 200 mg·L-1 Lprolina, 6 % agar
distintas comibanciones
de aux., cit, y Ag3
(ANA + 2ip)
Campion & Alloni
1990
100 a 500 100 mg·L-1
inositol
sacarosa 3 a 10 %
800 mg·L-1 glutamina
200 mg·L-1 L-prolina
0,3-1-10 mg·L-1 adenina
6% agar
ANA, IBA, 2-4D
BA-2ip
AG3
Campion 1992
Regeneración: idem anterior
Flores y
ovarios 3-5
daa
Inducción: MS entero, 1/2 y 4/5,
B5 y BDS
Regenaración ídem anterior
Inducción: B5, 2 mg
2,4-D + 1mg BA, 10
% sacarosa (14 días)
Regeneración: BDS,
200 mg L-prolina,
+ 10 mg adenina
Flores y
ovarios 3-5
daa
Inducción: BFD distintos
períodos,mejor 15 d.
Regenaración: BDS,
En ambos casos vitaminas
propias
2 mg·L-1·L-1 2,4-D + 1 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa
2 mg·L-1 ANA + 2 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa
sin Reg. Crec. 10 %
sacarosa
Campion et al. 1995
Flores 3-5 daa
Inducción (flores) B5
2 mg·L-1 2,4-D + 2 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa 6
% agar
200 mg·L-1 L-prolina + 400
mg·L-1 inositol y 2 mg·L-1
ANA + 1 mg·L-1 2-ip o
2 mg·L-1 TDZ + 40 %
sacarosa, 6 % agar
Bohanec et al. 1995
2 mg·L-1 2,4-D + 2 mg·L-1
BA, 10 % sacarosa, 6
% agar o 2 % gellum
gum.
100 mg·L-1 PAA + 1
mg·L-1 BA, 10 %
sacarosa, 6 % agar.
200 mg·L-1 L-prolina +2
mg·L-1 TDZ, 10 %
sacarosa, 6 % agar
200 mg·L-1 L-prolina +
0,2 mg·L-1 TDZ, 10 %
sacarosa, 6 % agar o 2
% gellum gum
Jakse et al. 1996
2 mg·L-1 2,4-D + 2 mg·L-1
BA, 7,5 % sacarosa
7 % agar
Geoffriau et al. 1997a
Regeneración: óvulos y ovarios
BDS
Flores 3-5 daa
Inducción B5 (10 a 14 días)
Regeneración: BDS
Flores 3-5 daa
Componentes adicionales
B5
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Técnica para la obtención
ginogenéticos en cebolla
de
haploides
A continuación se describe una técnica general.
1. Cultivo de bulbos
Existen dos posibilidades: una es la plantación a
campo y la otra es la plantación en invernáculo.
a) Plantación a campo: el manejo es igual que el
cultivo que tiene por objeto la producción de semillas.
Se utilizan bulbos seleccionados y almacenados a 10
ºC durante un par de meses. Es conveniente plantar
en forma escalonada para extender el período de
floración. Se puede comenzar a principios de julio,
para la localidad de Chacras de Coria, Mendoza.
Las plantaciones tardías producen umbelas de
escasa calidad. Se aconseja el uso de un fertilizante
nitrogenado en las primeras etapas del cultivo. Es
necesario el control de Trips, ya que sobreviven a
la esterilización provocando luego infecciones; un
producto que se utiliza es Confidor al 0,1 %, aficida
sistémico que controla muy bien los trips. Se recurre
a este producto ya que se debe evitar el mojado de la
planta que tiene como consecuencia el aumento de
las infecciones bacterianas. Otra práctica que puede
ayudar a disminuir las infecciones in vitro de origen
bacterianos es el agregado a campo de Agrimicina (2
g·L-1), dos a tres aplicaciones a partir de la emergencia
del escapo.
b) Plantación en invernáculo: se deben
utilizar macetas de 20 cm de diámetro y 25 cm de
alto o de mayor tamaño. Por lo demás el manejo
es similar al de campo. La mayoría de los grupos
que están trabajando en ginogénesis en cebolla han
optado por esta forma de cultivo ya que se reducen
al máximo las infecciones in vitro y además se puede
manejar el ambiente, cosa que como se discutirá
más adelante puede ser ventajosa. Nuestro grupo de
trabajo utiliza el cultivo a campo ya que la calidad de
la umbela obtenida en invernáculo es mala debido a
temperaturas muy cálidas en primavera.
2. Recolección
Antes de entrar en el tema específico de la recolección
del material se describirán las características de
la floración y las flores de cebolla. Cada planta de
cebolla produce entre uno y 20 escapos y cada umbela
tiene hasta 2.000 flores, de color blanco o levemente
violáceo, que se ubican en pequeñas cimas formadas
por entre 5 y 10 flores (14).
Las flores son actinomorfas y hermafroditas. Poseen
perigonio compuesto por tépalos connados en la base
dispuestos en dos series de tres y dos ciclos de tres
estambres, más largos que los tépalos. El ovario es
súpero con estigma trilobado (35).
Aunque las flores son hermafroditas, no son
autógamas por presentar protandria. La apertura
floral es irregular y puede prolongarse por más de
dos semanas. La floración de una umbela puede durar
desde tres a cinco semanas y la de una planta aún
más. En una misma umbela pueden encontrarse flores
con distinto grado de desarrollo (10).
Si bien la floración puede extenderse como ya se
dijo por más de un mes, en los quince días intermedios
se abre el 85 % de las flores, repartiéndose el 15 %
restante entre los primeros y últimos 7 días (14).
Para la recolección de flores se puede cosechar la
umbela y en el laboratorio seleccionar las flores, o
se puede cortar directamente la flor a campo. De esta
última forma se le da tiempo al resto de las flores a
adquirir el tamaño adecuado para ser utilizadas.
La recolección se realiza de 3 a 5 días antes de la
antesis, momento en que según Guha & Johri (19) el
saco embrionario se encuentra en el estado de célula
madre de la megáspora. No obstante Michalik et al.
(29) hace referencia al tamaño de la flor y no a su
edad, siendo el tamaño óptimo dependiente de la
cultivar (Figura 1).
Figura 1. Tamaño de flores. La flecha indica el tamaño adecuado para ser introducida in vitro
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
3 - Esterilización
Martínez et al. (27) determinaron que la mejor
desinfección se logra con tres enjuagues con agua
destilada estéril con Tween 20 y posterior aspersión con
alcohol 96º. En nuestro laboratorio se usó inmersión
en alcohol 96º por un minuto seguida de solución de
lavandina comercial al 10 % por 15 minutos y tres
enjuagues con agua destilada estéril. Finalmente se
adoptó la metodología propuesta por Bohanec & Jakse
(5), que consiste en el uso de ácido dicloro isocianúrico
a una concentración de 16,6 g·L-1.
4 - Medio de cultivo
El medio que ha mostrado ser más efectivo es el
propuesto por Bohanec (5) que consiste en el medio
de Dunstan & Short (12), BDS con los siguientes
componentes adicionales 10 g·L-1 de sacarosa, 200
mg·L-1 de L-prolina, 500 mg·L-1 de inositol y 2 mg·L-1
de 2-4D + 2 mg·L-1 de BA. El medio se solidifica con
6 g·L-1 de Bacto-Difco agar y el pH del medio se ajusta
a 6 antes del autoclavado a una atmósfera de presión
por 15 minutos.
5 - Siembra
Las flores estériles se dejan con un pedicelo de 0,5
cm y se entierran en forma vertical en el medio de
cultivo. Normalmente se usan cajas de Petri de 9 a
10 cm de diámetro, con 25 ml de medio y se pueden
sembrar hasta 30 flores por caja, (Figura 2).
Las flores en condiciones in vitro se abren a los
dos días después de la inoculación, el estilo se elonga
durante los dos días siguientes pero las anteras
detienen su desarrollo y no se abren, no teniendo
lugar la polinización (19).
6 - Condiciones de cultivo:
Las condiciones de cultivo más utilizadas son un
fotoperíodo de 16 h de luz, 24 ± 2 ºC y una intensidad
de luz blanca de 70 μE·m-2·s-1. En cuanto a la luz,
cabe destacar que las flores in vitro crecen bien con
intensidades lumínicas menores.
7 - Rescate de los regenerantes
Luego de un mes a cuarenta días de cultivo en
las condiciones arriba descriptas se comienzan las
observaciones dos veces por semana. Normalmente
el regenerante rompe el carpelo y emerge, es una
estructura totalmente independiente de los tejidos
circundantes. Estos regenerantes se colocan en tubos
de ensayo en medio BDS diluido a la mitad adicionado
con 3 g·L-1 de sacarosa, 7 g·L-1 de Bacto-Difco agar,
200 mg·L-1 de L-prolina, 500 mg·L-1 de inositol y
sin reguladores del crecimiento. Las condiciones de
cultivo son iguales a las de las flores, aumentando la
intensidad lumínica a 100 μE·m-2·s-1 (Figura 3 y 4).
8 - Verificación del estado de ploidía
Se puede realizar por medio del recuento de
cromosomas, en ápices de raíces usando la técnica
de Feulgen o también por citometría de flujo. Para la
primera técnica se deben extraer ápices de raíces en
activo crecimiento, se sumergen en una solución de
colchicina al 0,1 % por tres horas y posteriormente
se fijan en solución 3:1 etanol, ácido acético glacial,
luego se realiza un tratamiento de digestión con ClH
1 N a 60 ºC por 8 minutos. Finalmente se realiza
el squashing en solución de ácido acético al 45 %
y se tiñe con hematoxilina al 1 %; el preparado se
observa en microscopio. La segunda técnica de
Figura 2. Flores de cebolla después de 3 días de inoculadas en medio de cultivo BDS
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
Figura 3. Regenerante emergiendo del interior de la flor.
citometría de flujo consiste teñir con 4’, 6-diamidin2-fenilindol (DAPI) el DNA y posteriormente medir
la fluorescencia emitida por el DNA teñido. Esta
técnica tiene dos etapas, en la primera el tejido se
corta en muy pequeños trozos con hoja de afeitar en
una solución de ácido cítrico y Tween 20, (2,1 mg
en 100 ml de agua desionizada + 0,5 g de Tween)
y posteriormente se agrega la solución de tinción
que consiste en 100 ml de agua desionizada, 7,1 g
de fosfato diácido de sodio dihidratado y 1,5 ml de
solución stock de DAPI, (la solución stock de DAPI
se prepara mezclando 3,5 mg de DAPI con 10 ml
de agua desionizada). Finalmente se filtra y se lee
en el citómetro de flujo. Es importante destacar que
según el tipo de aparato utilizado la preparación de la
muestra puede variar.
9 - Verificación de la homocigosis
Al analizar el estado de ploidía de los regenerantes
se encuentran con cierta frecuencia individuos
diploides. Estos individuos pueden ser de origen
somático, en ese caso serán heterocigotas, o pueden ser
individuos diploidizados en forma espontánea (9). Se
hace necesario entonces verificar si la planta es homo
o heterocigota, para lo cual se recurre a marcadores
moleculares como las isoenzimas. Bohanec et al. (4)
utilizan el análisis de esterasas.
10 - Clonación
La clonación de los haploides se realiza para obtener
un número suficiente de individuos para realizar los
tratamientos de duplicación. Para esto se utiliza el
mismo medio de cultivo adicionado con 1 mg·L-1 de
BA.
11 - Tratamientos de duplicación
Figura 4. Haploide normal creciendo en medio de cultivo
de Murashige Skoog.
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
La sustancia más utilizada para la duplicación del
número de cromosomas es la colchicina. También
existen otras sustancias como la orizalina, amiprophosmetil (APM), la trifluralina y la pronamida. La
efectividad de los tratamientos con colchicina depende
de su concentración y de la duración del tratamiento.
En nuestro laboratorio, los mejores resultados se
obtuvieron cuando se usó una concentración de
colchicina de 0,25 g·L-1 durante 48 h. En este caso
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
se realizó el tratamiento en medio de cultivo BDS
a la mitad con 30 g·L-1 de sacarosa y 7 % de agar,
sin reguladores del crecimiento. La colchicina
debe agregarse por filtración esterilizante ya que es
termolábil.
12 - Verificación del estado de ploidía
Esto se realiza según lo especificado en el punto 8.
13 - Aclimatación
Las vitroplantas de cebolla toleran muy bien el
transplante, prácticamente no es necesario cubrir con
plástico.
14 - Transplante a campo y evaluación por parte
del mejorador
Factores que afectan a la ginogénesis in vitro de
cebolla
Los factores más importantes que afectan a la
ginogénesis in vitro de cebolla son: el genotipo,
las condiciones de cultivo de la planta donadora, el
explanto utilizado, el medio de cultivo y los reguladores
del crecimiento. En la etapa de duplicación del
número de cromosomas los factores más importantes
son: la sustancia duplicadora utilizada, la duración
del tratamiento y las condiciones bajo las cuales se
realizan los tratamientos.
1 - Genotipo
Es bien sabido que el genotipo es el factor más
importante que afecta a la respuesta in vitro de la
ginogénesis. Todos los autores que trabajan en este tema
dan evidencia de este fenómeno. Muren (32) clasifica a
las plantas donadoras en: plantas de alta, media y baja
respuesta, cuando el porcentaje de regenerantes es más
de 2, entre 1 y 2 y menos de 1, respectivamente. La
frecuencia de regenerantes reportada por Campion et
al. (9) a partir de flores y ovarios de seis cultivares se
encuentra entre 0,1 y más de 5 %. Geoffriau et al. (16),
estudiando 22 variedades de distinto origen geográfico,
encontraron desde variedades recalcitrantes con 0 %
de regenerantes hasta variedades de alta respuesta con
17 %; estos autores también encontraron variación en
la respuesta según el origen geográfico y aún dentro
del mismo genotipo señalaron un efecto de la planta
donadora. Dentro de una misma variedad, cultivar,
híbrido, etc., existen plantas con mayor respuesta
que otras. Bohanec & Jakse (5) concluyeron que las
variaciones en el porcentaje de regenerantes dependen
del genotipo, la planta donadora y el origen geográfico.
En este último caso el material proveniente de América
rindió cinco veces más embriones ginogenéticos que
los europeos y japoneses. Con respecto a los genotipos
cultivados en la Argentina la cv. Cobriza responde
más que Valcatorce y ésta más que Navideña, con
4,8 %, 2,9 % y 0,83 % de embriones ginogenéticos
respectivamente (37).
2 - Edad de la flor
Muren (32) estudió la relación existente entre la edad
de la flor y la producción de regenerantes. Encontró
que los ovarios que más embriones ginogenéticos
produjeron fueron obtenidos de flores recolectadas
entre 3 y 5 daa. En ese estado, el saco embrionario se
encuentra al estado de célula madre de la megáspora
(19) y probablemente toda la fase de meiosis ocurre
in vitro durante los primeros días del cultivo.
Sin embargo, Michalik et al. (29) correlacionaron
tamaño de flor con rendimiento de embriones,
encontrando diferencias según el genotipo, no
obstante la flor con mayor respuesta fue la de 3,4 a
4,5 mm de diámetro.
En el momento de la inoculación de las flores de la
línea híbrida B0223B, Musial et al. (33) encontraron
sacos embrionarios maduros e inmaduros, pero al
analizar las flores 7 días después de ser cultivadas
in vitro encontraron mayoritariamente sacos
embrionarios maduros; esto indica que el saco
embrionario inmaduro sigue su desarrollo normal
in vitro. Los mismos autores encontraron que los
embriones haploides se generan a partir del saco
embrionario y plantearon la hipótesis de que los sacos
embrionarios inmaduros tienen mayor capacidad
partenogenética que el maduro.
3 - Tipo de explanto utilizado
Para la obtención de haploides vía ginogénesis se
pueden utilizar óvulos, ovarios o flores. Muren (32)
utilizó exclusivamente óvulos mientras que Campion
y Alloni (6) inocularon flores a las que luego de un
período de 15 a 20 días se les extrajo los óvulos que
se colocaron en un medio de regeneración. Bohanec et
al. (4) utilizaron flores en la etapa de inducción y luego
compararon el rendimiento de embriones ginogenéticos
obtenidos a partir de óvulos y ovarios, encontrando
mayor tasa de regenerantes cuando trabajaron con
ovarios. Geoffriau et al. (16) por primera vez introducen
flores y no realizan repique, pero no comparan este
procedimiento con los propuestos por otros autores.
Bohanec & Jakse (5) concluyen que el uso de flores
presenta una eficiencia igual que el uso de flores y
ovarios o flores y óvulos, con la ventaja que es menos
laborioso y de menor costo.
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
4 - Condiciones de cultivo de la planta
donadora
Actualmente la mayoría de los grupos que trabajan
en este tema utilizan plantas cultivadas en invernáculo.
Keller (24) encontró que una misma cultivar rindió
significativamente más embriones cuando las plantas
crecieron en un fitotrón que cuando lo hicieron en
invernáculo.
Campion & Schiavi (8) compararon el cultivo
en invernáculo de una misma cultivar en dos
épocas distintas y también encontraron diferencias
significativas en la obtención de regenerantes.
Puddephat et al. (38) lograron aumentar 10 veces la
tasa de regenerantes cuando las plantas cultivadas en
maceta en invernáculo fueron colocadas en cámaras
de crecimiento al inicio de floración a una temperatura
constante de 15 ºC.
Michalik et al. (30) compararon el rendimiento
en haploides de flores obtenidas a partir de plantas
cultivadas a campo y cultivadas en cámaras a 14 ºC;
este tratamiento mejoró el porcentaje de inducción en
los cuatro genotipos ensayados.
No se conoce el efecto del pretratamiento sobre
la capacidad generativa de los óvulos. En el campo
de las especulaciones podría pensarse que las bajas
temperaturas disminuyen la velocidad de los eventos
celulares en el saco embrionario dando más tiempo
para recibir el estímulo de los reguladores del
crecimiento presentes en el medio de cultivo.
5 - Medio de cultivo
Cada tipo de tejido tiene un requerimiento
nutricional específico y es probable que el desarrollo
del tejido esperofítico en cebolla también lo tenga; no
obstante, la elección del medio de cultivo en este caso
tiene una base empírica.
El medio basal más extensamente utilizado es el
BDS (12) y en menor medida B5 (15) (Cuadro 2).
Sobre la base de que varios aminoácidos, vitaminas
e inositol, estimulan la partenogénesis (31) se ha
ensayado la adición de L-prolina, inositol y sulfato de
adenina (6, 4, 22).
La concentración de sacarosa es uno de los factores
que más afectan el rendimiento de la técnica. Muren
(32) determinó que la concentración más adecuada
para la inducción es de 10 %. No se cuenta con
información sobre otras fuentes carbonadas.
Otro componente de importancia es el agente
gelificante. Jakse et al. (22) determinaron que si bien el uso
de Gellaum gum en lugar de agar aumentó el porcentaje
de regenerantes, la sobrevivencia final de los mismo fue
menor con este gelificante sintético. La mayoría de los
trabajos consultados utilizan agar-agar al 7 %.
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
6 - Reguladores de crecimiento
Existen dos esquemas de producción de haploides
ginogenéticos en cebolla, como se mencionó en
el punto 3. Uno consiste en dos etapas, la primera
de inducción de la ginogénesis y la segunda de
regeneración de los haploides. El otro esquema
consiste en el uso de un solo paso.
Se discutirá primero sobre los reguladores utilizados
en la etapa de inducción, luego en la de regeneración
y por último los reguladores utilizados en el caso de
una sola etapa.
La ausencia de reguladores de crecimiento permite
la formación de haploides pero con una frecuencia
muy baja (37), por lo tanto la adición de los mismos
es necesaria.
En la mayoría de los trabajos consultados los
medios de inducción incluyen la combinación de
auxinas y citocininas, principalmente 2-4D y BAP.
En la etapa de regeneración el pasaje a un medio
sin reguladores arrojó los mejores resultado en los
trabajos de Campion et al. (7) y Campion et al. (9),
mientras que la presencia de Tiadiazurón mejoró la
tasa de regeneración en el híbrido XPH 3371 (22).
El esquema de un solo paso ha sido utilizado por
Muren (32); Geoffriau et al. (16); Martínez et al. (27);
Bohanec & Jakse (5); Ponce et al. (37). En todos los
casos se utilizó 2-4D y BAP a razón de 2 mg·L-1 de
cada uno.
Otros reguladores de crecimiento utilizado son las
poliaminas. Martínez et al. (28) mejoraron la tasa de
regenerantes cuando utilizaron 4 mM de putrescina
durante 15 días y luego las flores se repicaron a un
medio con 0,1 mM de espermidina.
Ninguno de los trabajos consultados discute sobre
el efecto que poseen los reguladores del crecimiento
agregados al medio de cultivo, sobre la inducción del
embrión haploide más allá de aumentar, disminuir o
no modificar la tasa de regenerantes.
En las próximas líneas trataremos de indagar sobre
el posible rol de estos reguladores en la inducción
de la partenogénsis basándonos en los conceptos
generales de auxinas y citocininas.
En la polinización el polen aporta el ácido indol
acético que estimula la división celular del huevo
fecundado, posteriormente es el endosperma el que
aporta la auxina y finalmente el embrión comienza
a sintetizarla (41). Por otra parte se ha determinado
la presencia de citocininas en óvulo, embrión y
endosperma de algunas especies (1). En estos casos
no se sabe si estas citocininas se sintetizan in situ o
provienen de las raíces o de los ápices vegetativos.
Tanto las auxinas como las citocininas actúan
promoviendo la división celular. Teniendo en cuenta
el ciclo celular, las auxinas intervienen induciendo la
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
síntesis de las ciclinas kinasas que actúan en el pasaje
de G1 a S y de G2 a mitosis. Las citocininas actúan
induciendo la síntesis de las fosfatasas responsables
de la activación de las ciclinas kinasas que intervienen
en el pasaje de G2 a mitosis. Además las citocininas
intervienen en la citocinesis (41).
En un desarrollo partenocárpico no existe el aporte
auxínico por parte del polen y como ya se mencionó,
es probable que las citocininas necesarias para el
desarrollo del óvulo sean aportadas por otros tejidos
de la planta.
Tanto la ausencia de polen como la ausencia del
resto de la planta (la flor se separa de la planta para
ser cultivada in vitro) justifican el agregado exógeno
de auxinas y citocininas con el objeto de promover
la división de la oósfera y de esa formar un embrión
haploide.
7 - Condiciones de cultivo
No existen grandes variaciones en este tema en
general no se incluyen como un factor más dentro
de los ensayos. Los trabajos consultados concuerdan
en la utilización de fotoperíodo de 16 horas de luz
blanca y de una intensidad variable. En cuanto a la
temperatura se citan valores que oscilan alrededor de
25 ºC.
Factores que afectan a la duplicación del número
de cromosomas
El uso de la ginogénesis como herramienta en
el mejoramiento genético de cebolla depende en
gran medida de tener un sistema eficiente para la
duplicación del número de cromosomas, debido a
que la duplicación espontánea es un fenómeno de
muy baja frecuencia, menos del 10 % (4) y a que las
plantas haploides son estériles.
Los factores que afectan a esta etapa de la técnica
son: el tipo de explanto utilizado, la sustancia
duplicadora, la duración y las condiciones bajo las
cuales se realiza el tratamiento.
1 - Tipo de explanto
Es lógico suponer que a mayor tamaño del
explanto menor será la tasa de duplicación, ya que la
probabilidad de que la sustancia que se utilice llegue
a todas las células que se encuentran en división se
reduce cuando el tamaño del explanto aumenta.
Campion et al. (9); Geoffriau et al. (17) y Nowak
(34) utilizaron trozos basales de las microplantas
cortados longitudinalmente.
Jakse & Bohanec (21) proponen el uso del embrión
haploide pero no realizan comparaciones con los
10
procedimientos convencionales. No obstante esta
metodología presenta las ventajas de disminuir el
tiempo y la mano de obra y las desventajas de poder
perder la planta a causa del tratamiento y no detectar
los individuos diploidizados espontáneamente.
2 - Sustancias utilizadas para la duplicación
Campion et al. (9); Geoffriau et al. (17) y Nowak (34)
reportan una eficiencia en la duplicación con colchicina
cercana al 70 %. Según Nowak (34) la trifluralina
fue tan eficiente como la colchicina con respecto a
la duplicación de cromosomas pero la regeneración
de plantas fue inferior, es decir presentó un mayor
efecto tóxico a las concentraciones ensayadas. Jakse
& Bohanec (21) compararon la eficacia de la orizalina
y el amiproposmetil, encontrándolas similares a una
concentración 50 μM.
3 - Condiciones bajo las cuales se realizan los
tratamientos
La concentración y la duración de los tratamientos
con antitubulínicos son determinantes en los resultados.
Campion et al. (9) utilizaron concentraciones de
colchicina de 1 a 1.000 mg·L-1 durante 24 y 72 h,
determinando que la mejor concentración fue de 10
mg·L-1 durante 24 h. Jakse & Bohanec (21) trabajaron
con medio sólido durante 24 o 72 horas y medio
líquido sometido a 3 niveles de vacío por media o
una hora. Las mejores condiciones fueron el medio
líquido por 24 h.
Conclusiones
La ginogénesis in vitro de cebolla es una herramienta
útil para la inducción de haploides. Actualmente
esta técnica está siendo utilizada en los programas
de mejoramiento en distintas partes del mundo. Sin
embargo, no siempre los protocolos propuestos son
eficientes para cultivares de interés agronómico. En
nuestro caso la cultivar Valcatorce INTA, genotipo de
gran interés para la obtención de líneas homocigotas,
no obstante es la que ha demostrado tener la más baja
tasa de obtención de haploides. Otro aspecto que
representa una dificultad en el uso de esta técnica es
la duplicación del número de cromosomas, aspecto
que es el más conflictivo.
A lo largo de todo el proceso tanto las flores
como los haploides obtenidos son sometidos a la
presencia de auxinas y citocininas que pueden como
ya es conocido causar variaciones somaclonales (36),
además de la colchicina cuyo efecto mutagénico ya
ha sido citado en sorgo por Franzke & Rose (13). Lo
expuesto sugiere la importancia de evaluar los posibles
Avances en Horticultura 5. 2007. Edición on-line
Ponce, M.T.. Ginogénesis en cebolla
cambios a nivel genético, (mutaciones) o epigenéticos
(cambios fenotípicos) que puedan aparecer.
Si bien el genotipo es el factor más determinante en
la obtención de haploides, las causas de la inducción
de la expresión de la totipotencia en la oósfera es
un aspecto aún no estudiado y de gran interés, ya
que conociendo los mecanismos que la regulan
sería posible manipularlos para aumentar la tasa de
regenerantes.
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