Empleo de las energías de microondas y ultrasonido en el proceso

Facultad de Ingeniería Química
Universidad Tecnológica de La Habana
“José Antonio Echeverría”
Empleo de las energías de microondas y ultrasonido en el proceso
de extracción de mangiferina de hojas de Mangifera indica L.
Tesis presentada en opción al título de Máster en Química
Autora: Lic. Iliana Sevilla Fernández
Tutores: DraC. Jhoany Acosta Esquijarosa
DrC. Julio C. Llópiz Yurell
La Habana, 2016
A mi familia, amigos
y a Jhoany
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a todo el que participó en la elaboración de este trabajo sin los cuales no hubiese
sido posible realizar este sueño.
A mi tutor Llópiz, por sus consejos y apoyo.
A toda mi familia, mis padres y mis hermanos, que han sabido guiarme por el buen camino y
no se cansan de aconsejarme para bien.
A todos mis compañeros de trabajo por su preocupación constante para que yo pudiera
culminar mi tesis.
A los profesores de la Facultad de Química en la Universidad de la Habana por su ayuda y
preocupación.
A mis amigos Jeni, Turiño, por sus consejos y apoyo
Y por último a la persona que fue más que una compañera de trabajo, una amiga y una
hermana, a Jhoa y a toda su familia por acogerme como un miembro más.
A todos ustedes de todo corazón muchas gracias por todo su apoyo, confianza, dedicación y
sacrificio.
Resumen
RESUMEN
La mangiferina, glucosil xantona natural, presente en varias partes de Mangifera indica L.
(árbol del mango), posee gran variedad de efectos farmacológicos. La literatura refiere mayor
concentración de este metabolito en las hojas, por lo que su obtención a partir de esta fuente es
de gran importancia para el desarrollo de medicamentos. En Cuba se ha desarrollado un
procedimiento de obtención de mangiferina a partir de hojas de mango, mediante un método
tradicional en tanque agitado.
Los métodos no convencionales de extracción, como las microondas y el ultrasonido, se
caracterizan por su rapidez y eficiencia en la obtención de fitoconstituyentes. En el presente
trabajo se realizó la identificación de los componentes presentes en las hojas de mango, donde
se observó la presencia de sesquiterpenoides no oxigenados, ácidos fenólicos, taninos y, como
componente mayoritario, la mangiferina. Se determinaron las mejores condiciones de
extracción para la etapa de extracción de compuestos no polares y de extracción de
mangiferina mediante microondas a partir de hojas de mango, con el empleo de n-hexano y
agua como disolventes de extracción respectivamente, donde se obtuvo para cada etapa un
tiempo de irradiación de 5 min, una potencia de 900W y una relación disolvente/material
vegetal de 10 ml/g para un valor máximo de contenido de mangiferina extraída de
18,65 ± 1,53 mg/g. Además, se obtuvieron las mejores condiciones para ambas etapas
mediante ultrasonido, donde para la etapa de extracción de compuestos no polares, el mejor
valor experimental (29,03 ± 1,10 mg/g) se alcanza para un tiempo de 90 min y una relación de
47 ml/g, con el empleo de n- hexano como disolvente y para la etapa de extracción de
mangiferina, las mejores condiciones son un tiempo de extracción de 62 min, una relación de
49 ml/g y una concentración de etanol de 46,8% para un valor máximo de contenido de
mangiferina extraída de 24,16 ± 0,02 mg/g. El análisis comparativo realizado demostró que el
método de microondas es más ventajoso en cuanto al ahorro de tiempo y energía y al consumo
de disolventes, con rendimientos similares al método tradicional en tanque agitado.
Abstract
ABSTRACT
Mangiferin, a natural glucosil xanthone, presents in many parts of Mangifera indica L. (mango
tree) has many pharmacological effects. Literature refers a great concentration of this
metabolite in the leaves, that’s why its obtaining from this source has a high importance for
the development of medicaments. In Cuba a method of obtaining of mangiferin from mango
leaves using a traditional method in stirred tank, was developed.
The non-conventional methods of extraction such as microwave and ultrasound are
characterized for its decrease in time and high efficiency in the phytoconstituents obtaining. In
this work the identification of components in mango leaves were realized, observing the
presence of sesquiterpenoids no oxygenated, phenolic acids, tannins and as major compound
mangiferin. The influence of operational parameters were studied for the stage of extraction of
non-polar compounds and mangiferin extraction using microwave from mango leaves using nhexane and water as extraction solvents respectively, where the best operational conditions for
each stage were an irradiation time of 5 min, a power of 900 W and a ratio solvent/vegetal
material of 10 ml/g for a mangiferin content of 18.65 ± 1.53 mg/g. Also, we obtain the best
conditions for each stages using ultrasound, were for the stage of extraction of non-polar
compounds, the best experimental value (29.03 ± 1.10 mg/g) was reached for a time of 90 min
and a ratio of 47 ml/g using n-hexane as solvent and for the stage of extraction of mangiferin,
the best conditions were a time of 62 min, a ratio of 49 ml/g and an ethanol concentration of
46.8% for a content of mangiferin of 24.16 ± 0.02 mg/g. The comparative analysis showed
that microwave is better according with time, energy and solvent consumption, obtaining
similar values of efficiency comparing with the traditional method in stirred tank.
Índice
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1
CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 5
1.1 Uso de plantas medicinales con fines terapéuticos.................................................................... 5
1.1.1 Uso etnomédico del árbol del mango ................................................................................. 5
1.2 Composición química de las hojas del árbol del mango ........................................................... 5
1.3 Mangiferina ............................................................................................................................... 6
1.3.1 Aspectos físico químicos .................................................................................................... 6
1.3.2 Fuentes de obtención .......................................................................................................... 7
1.3.3 Propiedades farmacológicas ............................................................................................... 7
1.4 Métodos de extracción de metabolitos secundarios presentes en las plantas medicinales ........ 8
1.5 Extracción asistida por microondas ........................................................................................... 9
1.5.1 Fundamento del método ..................................................................................................... 9
1.5.2 Horno de microondas ....................................................................................................... 12
1.5.3 Factores que afectan la EAM ........................................................................................... 14
1.5.4 Ventajas y desventajas de la EAM ................................................................................... 15
1.5.5 Aplicaciones del empleo de la EAM en la extracción de metabolitos secundarios a partir de
plantas........................................................................................................................................ 15
1.5.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por microondas ........................................ 16
1.6 Extracción asistida por Ultrasonido (EAU) ............................................................................. 17
1.6.1 Fundamento del método ................................................................................................... 17
1.6.2 Principios básicos de los dispositivos basados en ultrasonidos ........................................ 17
1.6.3 Principio de extracción de fitoconstituyentes mediante la energía de ultrasonido ........... 18
1.6.4 Variables que influyen en la EAU .................................................................................... 20
1.6.5 Ventajas y desventajas de la EAU .................................................................................... 20
1.6.5 Aplicaciones de la EAU en la extracción de metabolitos secundarios a partir de plantas 21
1.6.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por ultrasonido......................................... 21
1.7 Métodos analíticos para la identificación y cuantificación de productos naturales................. 22
1.7.1 Cromatografía de capa delgada (CCD) ............................................................................ 22
1.7.2 Espectrometría ultravioleta (UV) ..................................................................................... 23
1.7.3 Espectrometría Infrarroja (IR) .......................................................................................... 23
Índice
1.7.4 Espectrometría de masas (EM)......................................................................................... 24
1.7.4 Resonancia Magnética nuclear (RMN) ............................................................................ 24
1.7.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) ....................................................... 25
1.8 Análisis crítico de la bibliografía ............................................................................................ 26
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 27
2.1 Materiales ................................................................................................................................ 27
2.1.1 Reactivos .......................................................................................................................... 27
2.1.2 Equipos ............................................................................................................................. 27
2.1.3 Recolección y preparación del material vegetal ............................................................... 27
2.2 Estudio del proceso de extracción mediante la energía de las microondas ............................. 28
2.2.1 Estudio de las mejores condiciones de extracción de la fracción apolar (desengrase) ..... 28
2.2.2 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el material
vegetal ....................................................................................................................................... 29
2.2.3 Estudio de las mejores condiciones para la etapa de extracción de mangiferina ............. 30
2.3 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido mediante ultrasonido a baja frecuencia ..... 31
2.3.1 Estudios preliminares del proceso de extracción de la fracción apolar por ultrasonido ... 31
2.3.2 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la fracción apolar
(desengrase) mediante el empleo del ultrasonido ...................................................................... 32
2.3.3 Estudios preliminares del proceso de extracción de mangiferina por ultrasonido ........... 33
2.3.4 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la mangiferina ............. 34
2.4 Técnicas analíticas empleadas ................................................................................................. 36
2.4.1 Determinación del contenido de fracción apolar .............................................................. 36
2.4.2 Determinación del contenido de mangiferina por CLAR ................................................. 36
2.4.3 Cálculo del contenido de mangiferina .............................................................................. 36
2.4.4 Cromatografía gaseosa acoplada a masas (CG-EM) ........................................................ 37
2.4.5 Cromatografía líquida acoplada a masas (CLAR-EM) .................................................... 37
2.5 Análisis estadístico de los resultados ...................................................................................... 37
CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 38
3.1. Identificación de los componentes presentes en las hojas de mango ..................................... 38
3.2 Resultados del estudio del proceso de extracción de la fracción apolar (FA) ......................... 45
3.2.1 Estudio de las variables que influyen en la extracción de la fracción apolar (desengrase)
mediante la energía de las microondas ...................................................................................... 46
3.2.2 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido de la fracción apolar (desengrase) mediante
el empleo del ultrasonido a baja frecuencia .............................................................................. 48
Índice
3.2.3 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de desengrase ...... 53
3.3 Resultados del estudio de la etapa de extracción de mangiferina............................................ 55
3.3.1 Verificación por CLAR de la presencia de mangiferina en extractos obtenidos mediante
ultrasonido y por microondas .................................................................................................... 55
3.3.2 Evaluación de disolventes para la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía de
microondas ................................................................................................................................ 56
3.3.3 Estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina mediante la
energía de microondas ............................................................................................................... 57
3.3.3 Estudio del proceso de extracción sólido – líquido de mangiferina mediante el empleo del
ultrasonido a baja frecuencia ..................................................................................................... 60
3.3.4 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de extracción de
mangiferina................................................................................................................................ 65
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 67
RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 68
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 69
ANEXOS .......................................................................................................................................... 79
Introducción
INTRODUCCIÓN
Los materiales vegetales son recursos invaluables y útiles diariamente, ellos proveen un medio
inagotable de materias primas a las industrias farmacéutica, cosmética y de alimentos
(Massibo, 2008).
La historia de la humanidad recoge diferentes estudios acerca de la utilización de variedades
de plantas para diversos fines. Sus primeros usos en la antigüedad
tuvieron propósitos
nutricionales, pero sus cualidades medicinales fueron descubiertas muy pronto por los pueblos
antiguos, que a partir de las propias necesidades del hombre, acompañadas del desarrollo de
las fuerzas productivas estimuló el empleo de medicamentos de origen natural (Bruneton,
1999).
El interés por las plantas se ha intensificado en los últimos tiempos, ya que muchas de ellas
sintetizan un amplio espectro de metabolitos y han sido probados sus efectos medicinales con
baja toxicidad y prácticamente efectos secundarios nulos. Debido a esto, las grandes
transnacionales tienen como objetivo primordial la búsqueda de nuevas fuentes de origen
vegetal y tienen en cuenta la amplia riqueza biótica presente en el planeta, donde existen aún
regiones sin explorar (Vinatoru, 2001).
Una importante planta medicinal es la Mangifera Indica L., la que es fuente de muchas
xantonas naturales y polifenoles; comúnmente usada en una amplia variedad de remedios
caseros para el tratamiento de numerosas enfermedades (Pal y col., 2013). Estudios
fitoquímicos de diversas partes de esta planta revelaron que contiene ácidos fenólicos, ésteres
fenólicos, flavonoides y la c-glicosilxantona, mangiferina (Ribeiro y col., 2008, Nuevas y col.,
2012).
Mangiferina es la denominación común de un compuesto químico nombrado 2--Dglucopiranosil-1,3,6,7-tetrahidroxi-9H-xanten-9-ona, según las reglas de la IUPAC. Esta
sustancia se encuentra presente en varias partes de Mangifera indica L., las raíces de
Anemarrhena asphodeloides Bunge (hierba China conocida por Zhi-Mu), las flores y los
extremos de las ramas de especies de Hypericum, las hojas de Hibiscus liliastrum, así como en
diferentes familias de angiospermas y helechos (Valdés y Germán, 2008). En la literatura se
reporta que la mangiferina posee actividad antioxidante, lo que ha sido asociado a la capacidad
1
Introducción
que tiene para atrapar el oxígeno singlete, especie radical de oxígeno de alta reactividad (Sato
y col, 1992; Mohan y col., 2013). Además se le ha reportado actividad antidiabética
(Muruganandan y col., 2005), antitumoral (Noratto y col., 2010), inmunomoduladora
(Wauthoz y col., 2007), antiinflamatoria (Carvalho y col., 2009) y antiviral (Zhu y col., 1993).
La etapa principal en el tratamiento del material vegetal, es la extracción de los analitos de la
matriz, que consiste en la transferencia de los compuestos al disolvente. Este proceso
raramente es selectivo, ya que el extracto está constituido por los componentes en estudio y
otros compuestos (compuestos endógenos, macromoléculas, y otros contaminantes), los cuales
pueden interferir durante el análisis y en las propiedades curativas de estos compuestos
(Letellier y Budzinski, 1999).
Las técnicas tradicionales de extracción como la maceración, la extracción por soxhlet y la
extracción por reflujo de plantas vegetales, se basan mayormente en la elección correcta de los
disolventes así como en el uso del calor y la agitación para aumentar la solubilidad de los
compuestos deseados y mejorar la transferencia de masa. Usualmente estas técnicas requieren
tiempos de extracción muy largos con lo que se corre un gran riesgo de degradación térmica
para la mayoría de los fitoconstituyentes (Luque y García, 1998). El largo tiempo empleado
requiere un uso intensivo de mano de obra, un gran consumo de energía calórica y limita el
número de muestras que pueden ser procesadas, lo que no es fiable para aspectos comerciales.
Además, el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos requiere un paso adicional de
recuperación y una subsiguiente evaporación para concentrar el extracto, lo que resulta en un
proceso más engorroso y también más perjudicial para el ambiente (Sanghi y
Kannamkumarath, 2004).
Debido a estas muchas desventajas de las técnicas de extracción tradicionales, las técnicas no
convencionales como la extracción por fluidos supercríticos, la extracción asistida por
microondas y la extracción asistida por ultrasonido han ganado en importancia (Dean, 2010).
Estos métodos disminuyen considerablemente el tiempo de extracción, lo que evita la
degradación térmica de constituyentes termolábiles y, además, reduce el consumo de
disolvente, lo que disminuye la contaminación al medio ambiente, con rendimientos más
elevados y menor costo de operación (Bagherian y col., 2011; Cui y col., 2014).
2
Introducción
Las microondas por su naturaleza, son radiaciones electromagnéticas no ionizantes, con una
frecuencia que oscila entre los 0,3 y 300 GHz y, correspondientemente, a una longitud de onda
de 1m a 1mm. Se caracterizan por desplazarse en forma de ondas sinusoidales. Su principal
efecto, cuando interactúan con un material receptivo, es de naturaleza térmica (Jain y col.,
2009). La rapidez en el calentamiento es la principal ventaja de las microondas frente a los
métodos tradicionalmente empleados en la extracción con disolventes. Permite, por tanto,
significativos ahorros de tiempo, disminución de los volúmenes de disolventes necesarios en
los tratamientos y en consecuencia de energía en el proceso, no contamina el medio ambiente
todo lo cual se traduce en reducción de los costos en general, lo que constituyen aspectos
deseables de alcanzar en todo proceso de extracción, además se obtienen altos recobrados de
los compuestos de interés. Su empleo es objeto de investigación continua en la extracción de
fitoconstituyentes con probadas actividades farmacológicas (Chan y col., 2011).
La extracción asistida por ultrasonido para productos naturales utiliza sonidos de alta
frecuencia, con el fin de extraer el compuesto de interés, del material vegetal. Las partículas
sólidas y líquidas vibran y se aceleran ante la acción ultrasónica, como resultado el soluto pasa
rápidamente de la fase sólida al disolvente (Gao y Liu, 2005). Esta técnica es la más
económica y posee los requerimientos instrumentales más bajos entre las últimas técnicas de
extracción desarrolladas (Rostagno y col., 2003).
En la literatura aparecen diferentes reportes o patentes relacionadas con la obtención de
mangiferina por métodos tradicionales. En Cuba se ha desarrollado un procedimiento para el
aislamiento y purificación de la mangiferina en tanque agitado. El mismo consta de una etapa
de extracción de los componentes apolares que facilita la extracción de la mangiferina en una
etapa posterior. Los rendimientos de extracción y el consumo de tiempo y disolvente sugieren
la necesidad de explorar otros métodos no convencionales de extracción. Además, existen
pocos reportes, o se muestran de forma incompleta los resultados asociados con la obtención
de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. mediante la extracción asistida por
microondas y la extracción asistida por ultrasonido.
De acuerdo a lo planteado se enuncia el siguiente Problema Científico: ¿Será posible sustituir
el método tradicional establecido en tanque agitado por métodos que apliquen las energías de
3
Introducción
microondas y de ultrasonido en la obtención de un extracto de mangiferina a partir de hojas de
Mangifera indica L. con ventajas técnicas y económicas?
Para dar respuesta al problema científico, se plantea la siguiente Hipótesis: Si se emplean las
energías de microondas y de ultrasonido y se seleccionan los mejores parámetros de
extracción para cada técnica, se podrá obtener el extracto de mangiferina a partir de hojas de
Mangifera indica L. con un rendimiento igual o superior respecto al método tradicional
evaluado en tanque agitado, con la consiguiente disminución del volumen de disolvente, el
tiempo y los costos de operación.
Por lo tanto el Objetivo General del trabajo es: Aplicar las energías de microondas y de
ultrasonido en la obtención de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L.A partir del
cual se derivan los siguientes Objetivos Específicos:
1. Identificar los componentes presentes en las hojas de Mangifera indica L.
2. Determinar las mejores condiciones en las etapas de separación de los compuestos
apolares y de extracción de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L.
mediante las energías de microondas y de ultrasonido.
3. Comparar los métodos de extracción asistida por microondas y extracción asistida por
ultrasonido con el método tradicional establecido en tanque agitado.
4
Revisión bibliográfica
CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 Uso de plantas medicinales con fines terapéuticos
Las plantas medicinales, base de la medicina verde, han sido utilizadas desde la antigüedad en
el tratamiento y prevención de enfermedades, por ser ellas fuentes de innumerables
compuestos químicos biológicamente activos que le confieren sus propiedades terapéuticas.
Los últimos años han mostrado una popularidad creciente en el uso de la medicina herbaria en
todo el mundo. Debido a este creciente interés, la obtención de extractos estandarizados de
manera más económica, segura y amigable con el medio ambiente, ha guiado a las
investigaciones al desarrollo de nuevos métodos y tecnologías, superiores a los métodos
convencionales de extracción. Además la extracción en muchos casos puede ser más
económica que la síntesis química de los compuestos de interés (Kimura, 2006).
1.1.1 Uso etnomédico del árbol del mango
En muchos países, se utiliza el extracto de las hojas, frutos, semillas, raíz y corteza del árbol
del mango (Mangifera indica L.) con propósitos medicinales para el tratamiento de diversas
enfermedades como la leucorrea, la disentería, las hemorroides, la bronquitis, los problemas de
la garganta, el asma, el estreñimiento, entre otras (Kant y col., 2009).
En Cuba, el uso etnomédico del extracto acuoso del árbol del mango ha sido ampliamente
estudiado. Se ha utilizado extensivamente en patologías como: cáncer, diabetes, asma
bronquial, infertilidad, lupus, prostatitis, hiperplasia prostática benigna, desórdenes gástricos,
y otras enfermedades frecuentes (Guevara y col., 2004).
1.2 Composición química de las hojas del árbol del mango
La hoja del árbol del mango, ha sido ampliamente estudiada y contiene, entre otros
componentes, sesquiterpenos: allo-aromadendreno (Craveiro y col., 1980); flavonoides: epi-3O-galato (-)-catequina (Tanaka y col., 1984), quercetina (Proctor y Creasy, 1969), rutina
(Shaft y Ikram, 1982); aceite esencial (Craveiro y col., 1980); xantonas: euxantona (Proctor y
Creasy, 1969), mangiferina, homomangiferina e isomangiferina (Tanaka y col., 1984; Pharm y
Phaim, 1991); triterpenos (Njaneyulu y col., 1982); bencenoides (Lu y col., 1982); taninos
(Tanaka y col., 1984) y esteroides: β-sitosterol (Njaneyulu y col., 1982).
5
Revisión bibliográfica
Un análisis aproximado de 100 g de hoja fresca refiere que contiene: calorías: 66%; agua:
81,7%; proteínas: 0,7%; grasas: 0,4%; carbohidratos: 16,8%; fibras: 0,9%; cenizas: 0,4%;
calcio: 10 mg; fósforo: 13 mg; hierro: 0,4 mg; sodio: 7 mg; potasio: 189 mg; caroteno: 2880
μg; tiamina: 0,05 mg; riboflavina: 0,05 mg; niacina: 1,1 mg y ácido ascórbico: 35 mg (Duke y
Atchlet, 1986).
En la literatura se reportan los resultados de la extracción y cuantificación de algunos
metabolitos secundarios presentes en la corteza, la semilla, la cáscara y las hojas verdes y
maduras existentes en 17 variedades diferentes de Mangifera indica en Brasil. El residuo fue
analizado por dos métodos, Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) y mediante la
técnica de Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a espectrometría de masa
(CLAR-EM). Se detectaron como los principales compuestos fenólicos presentes en cada una
de las partes estudiadas, la penta-O-galoil glucosa, el ácido gálico y el galato de metilo, donde
la mangiferina fue el principal metabolito detectado en cantidades de 4,94; 6,40; 18,33; 36,9 y
58,12 g/kg de material vegetal correspondientes a la cáscara, el fruto, la corteza, las hojas
maduras y las hojas verdes, respectivamente. Resulta significativo que los mayores contenidos
de mangiferina se presentan en las hojas, de ahí que se justifique la posibilidad de obtención
de este metabolito de esta parte de la planta (Barreto y col., 2008).
1.3 Mangiferina
1.3.1 Aspectos físico químicos
La mangiferina fue aislada por primera vez de las hojas de Mangifera indica L., en 1924 y su
estructura determinada en 1964 (Bhatia y col., 1967).
Mangiferina (figura 1) es una xantona cuya denominación común del compuesto químico
nombrado es 2-β-D-glucopiranosil-1,3,6,7-tetrahidroxi-9H-xanten-9-ona, según las reglas de
la IUPAC, aunque también aparece en la literatura como alpizarin, euxantogen, maniferin,
chedisarine, aphloiol, chinomin y hedysarid (DPN, 2005).
6
Revisión bibliográfica
Figura 1. Estructura de la mangiferina
Es un compuesto de color amarillo pálido, no posee sabor ni olor y tiene una masa molar de
421,22 g/mol y una temperatura de fusión de 272 °C con descomposición. Debe almacenarse a
temperatura ambiente, protegida de la humedad y la luz (DPN, 2005). Es soluble en etanol,
ligeramente soluble en agua y metanol y prácticamente insoluble en n-hexano, cloroformo,
acetona y éter dietílico (Acosta y col., 2016).
1.3.2 Fuentes de obtención
Esta sustancia se encuentra en muchas especies vegetales correspondientes a diferentes
familias y géneros vegetales y no hay preferencia entre ellos para su existencia, aunque su
nombre está muy relacionado con el género Mangifera, ya que en las especies que la
conforman es donde se concentra la mayor prevalencia del compuesto. Está presente en varias
partes de Mangifera indica L. (corteza y hojas), las raíces de Anemarrhena asphodeloides
Bunge (hierba China conocida por Zhi-Mu), las flores y los extremos de las ramas de especies
de Hypericum, las hojas de Hibiscus liliastrum, así como en diferentes familias de
angiospermas y helechos (Napralert, 2010).
1.3.3 Propiedades farmacológicas
Las características químicas de la mangiferina hacen suponer que tiene los atributos necesarios
para alcanzar tejidos y órganos de forma significativa por su elevada biodisponibilidad. La
aglicona que se produce a partir de ella (noratiriol), después de la pérdida del resto glicosídico
por la hidrólisis que debe ocurrir durante el metabolismo, tiene un efecto potente en la
captación de oxígeno singlete (Hsu y col., 1997).
En la literatura se ha reportado que la mangiferina posee actividad antioxidante (Prabhu y col.,
2006; Benping y col., 2016), antidiabética (Guo y col., 2011; Apontes y col., 2014),
7
Revisión bibliográfica
antitumoral (García y col., 2011; Khurana y col., 2016), inmunomoduladora (Guha y col.,
1996; Leiro y col., 2004), antiviral (Zhu y col., 1993) y antiinflamatorio (Gong y col., 2013).
Una búsqueda de patentes muestra la utilidad de esta sustancia en tratamientos de diferentes
enfermedades, tales como el caso de herpes, sangre, infección, cáncer y en padecimientos y
enfermedades relativas a la tercera edad. También existen registros de su aplicación en
infecciones parasitarias. Otro estudio indica el uso cosmético de la mangiferina, tales como:
sistema de liberación tópica, antiarrugas, desodorante, nutraceútica tópica y otras aplicaciones
cosméticas. Otras aplicaciones se han encontrado en la agricultura y en la industria alimentaria
referidas a alimentos fortificantes y a una preparación externa para el control calórico
(González y Domínguez, 2009).
1.4 Métodos de extracción de metabolitos secundarios presentes en las plantas
medicinales
La extracción, como término farmacéutico, se refiere a la separación de las porciones
medicinalmente activas de la planta o tejido animal, de los componentes inactivos o inertes,
mediante el uso de disolventes adecuados. (Swami y col., 2008).
Durante el proceso de extracción ocurren dos fenómenos paralelos: la lixiviación de las
sustancias solubles de células rotas y la disolución y difusión de las sustancias solubles de
células intactas. Mientras la lixiviación de las sustancias de las células rotas es rápida, la
difusión de las sustancias a través de la membrana de células intactas es lenta y requiere etapas
de humectación y ablandamiento para aumentar la permeabilidad de la membrana. Este
proceso comprende tres etapas gobernadas por procesos de equilibrio químico: la penetración
del disolvente en la célula, la disolución de las sustancias extraíbles y la difusión de la
disolución fuera de la célula vegetal (Sharapin, 2000).
Existen diversos procedimientos de extracción, los cuales pueden ser empleados en
dependencia de la complejidad de la muestra cuyos componentes se desean separar. Dentro de
los métodos de extracción tradicionales se encuentran: la decocción, la infusión, la digestión,
la maceración, la percolación, la extracción Soxhlet y la extracción en tanque agitado, los
cuales requieren altos tiempos de operación, grandes cantidades de disolventes, instalaciones
costosas, y son procesos contaminantes y de baja eficiencia energética, entre otras
limitaciones, que se manifiestan de manera aislada o en conjunto (Swami y col., 2008).
8
Revisión bibliográfica
Por estos motivos, desde hace algunos años se utilizan otras técnicas y métodos extractivos, de
los que se pueden mencionar la extracción mediante fluidos en condiciones supercríticas,
extracción asistida por ultrasonido (EAU), extracción acelerada por disolventes, extracción
con pulso eléctrico, extracción asistida por enzimas y la extracción asistida por microondas
(EAM) (figura 2). Estos tienen entre sus ventajas el ahorro de disolventes y energía, mayor
selectividad y disminución de los tiempos de operación (Azmir y col., 2013).
Figura 2. Métodos de extracción no convencionales. A: Extracción mediante fluidos en
condiciones supercríticas; B: EAU; C: EAM
1.5 Extracción asistida por microondas
La extracción asistida por microondas (EAM) consiste en el calentamiento del disolvente en
contacto con el material vegetal bajo la irradiación de microondas. El proceso implica la
perturbación de los enlaces por puente de hidrógeno, como resultado de la oscilación de
dipolos por la radiación en las moléculas y la migración de iones, con la consiguiente
penetración del disolvente en la matriz y transporte al seno del líquido de los componentes
extraídos (Alupulu, 2012).
1.5.1 Fundamento del método
Las microondas se sitúan en la región del espectro electromagnético desde la longitud de onda
1mm hasta 1m (0,3 – 300 GHz), por lo que constituye una radiación de baja energía no
ionizante. Actualmente las microondas se utilizan en las comunicaciones, la radiolocalización,
el blindaje de cámaras anecoicas y como fuentes de energía. Para evitar problemas de
interferencia, la región permitida a aplicaciones civiles se encuentra limitada entre 2450 MHz
y 915 MHz (Chan y col., 2011).
9
Revisión bibliográfica
La radiación de microondas tiene las mismas propiedades de otras ondas del espectro
electromagnético. La energía puede transmitirse mediante la radiación electromagnética y se
caracteriza por desplazarse en forma de ondas sinusoidales (según la teoría ondulatoria).
Siguen las leyes de la óptica y están sujetas a los fenómenos de reflexión y dispersión al
interactuar con las heterogeneidades internas y la superficie de los materiales. Se propagan en
línea recta, se refractan, difractan, interfieren y dispersan del mismo modo que lo hace
cualquier otra radiación del resto del espectro electromagnético.
Por su naturaleza, son consideradas radiaciones no ionizantes, esto quiere decir que no
modifican la estructura electrónica del material, a diferencia del efecto de otras radiaciones
más energéticas como los rayos X o la radiación gamma. Así pues, su principal efecto, cuando
interactúan con un material receptivo es de naturaleza térmica (Chemat y Cravotto, 2013).
El calentamiento por microondas está gobernado por dos fenómenos: conducción iónica, y
vibración bipolar, los cuales, en algunos casos pueden tener lugar simultáneamente. La
conducción iónica se refiere a la migración de los iones bajo la influencia del campo eléctrico
cambiante. La resistencia ofrecida por la disolución a la oscilación o vibración bajo el campo
eléctrico oscilante de la radiación de los iones genera calor, que eleva su temperatura.
Cuando se irradia un disolvente polar, las moléculas tienden a alinearse con el campo
eléctrico, pero el cambio de este ocurre a una velocidad que no permite que las moléculas se
acomoden completamente (figura 3), por lo que se generan vibraciones, que por efectos de
fricción provocan el calentamiento del cuerpo del líquido (Chan y col., 2011).
Figura 3. Efecto de las microondas sobre las moléculas de agua
10
Revisión bibliográfica
Cuando las ondas son absorbidas por el material, los dipolos existentes o los inducidos se
ponen en acción, esto es, vibran y rotan, lo que produce energía térmica en todo el seno del
material, básicamente por fenómenos de fricción a nivel atómico-molecular (Chan y col.,
2011).
La eficiencia con la cual los diferentes disolventes se calientan bajo las microondas depende
del factor de disipación o ―tangente de pérdida‖ (tan δ), el cual es una medida de la habilidad
del disolvente para absorber la energía de las microondas y pasarla en forma de calor a las
moléculas circundantes.
El factor de disipación viene dado por la ecuación:
, donde
es la constante
dieléctrica o permitividad, que describe la polarizabilidad de una molécula en un campo
eléctrico, es decir, es la medida de la habilidad de una molécula para absorber la energía de las
microondas. El factor de pérdida dieléctrica,
, mide la eficiencia de absorber la energía de
las microondas y convertirla en calor (Jain y col., 2009).
Para los líquidos polares la permitividad decrece, generalmente, al aumentar la tan δ. La
relajación rotacional asociada con la región de las microondas involucra, generalmente, la
rotación de la molécula entera aunque, excepcionalmente puede afectar la rotación de algunos
grupos funcionales polares en moléculas grandes ligeramente rígidas con sustituyentes
laterales. Es posible, por tanto, observar, en la región de las microondas, la rotación
intramolecular de los grupos funcionales OH y NH2 unidos a moléculas grandes.
Para la mayoría de los disolventes, el factor de disipación se incrementa con la temperatura.
Como resultado, la velocidad de calentamiento de estos disolventes es mayor con las
microondas que con el calentamiento térmico. Este fenómeno de sobrecalentamiento puede
conducir a un incremento de la temperatura de ebullición del disolvente, probablemente
debido a la limitada formación de centros de ebullición y al efecto de transferencia invertida
del calor desde la superficie donde éstos se forman (Chan y col., 2011).
Al seleccionar un disolvente para utilizarlo en un proceso de EAM se debe tener en cuenta,
además de la solubilidad del componente a extraer, la constante dieléctrica y el factor de
pérdida. En la tabla 1 se muestran los parámetros físicos para algunos de los disolventes más
empleados en la industria farmacéutica y extractiva (Chan y col., 2011).
11
Revisión bibliográfica
Tabla 1. Constantes físicas de los disolventes más comúnmente empleados
Disolventes
Agua
78,3
1570
100
Etanol
24,3
2500
78,3
Methanol
32,6
6400
64,7
n-hexano
1,69
200
68,7
Éter de petróleo
-
-
34-80
El mayor valor de constante dieléctrica lo presenta el agua, pero su capacidad para calentarse
es menor que para otros disolventes, como el metanol y el etanol, debido a su bajo valor de tan
δ, por lo tanto la velocidad con la que absorbe energía es menor que la velocidad de disipación
de esta. Este fenómeno explica el efecto de ―supercalentamiento‖, que ocurre cuando hay agua
en el sistema bajo estudio. Esto puede ser beneficioso o perjudicial, en dependencia de la
matriz, en algunos casos puede aumentar la difusividad de los metabolitos y acelerar la
extracción, o puede degradarlos. Por otra parte, el hexano y otros disolventes menos polares
permanecen transparentes a las microondas y no producen calor. De forma general se ha
demostrado que los requerimientos necesarios para lograr una adecuada penetración de esta
radiación son: constante dieléctrica moderada y altos factores de pérdida (Mandal y col.,
2007).
1.5.2 Horno de microondas
Todos los dispositivos de microondas tienen dos componentes principales: un generador de
microondas y un aplicador. La conexión de ambos componentes convierte la energía eléctrica
en microondas.
El magnetrón (figura 4) consiste en un cátodo calentado y un ánodo, separados en un alto
vacío por una diferencia de potencial elevada (aproximadamente 4 kV), colocado todo en un
campo magnético axial. Los electrones se emiten desde el cátodo y se aceleran hasta el ánodo
mediante el potencial entre ellos. El campo magnético hace que los electrones sigan
trayectorias curvas espirales alejándose del cátodo.
12
Revisión bibliográfica
Figura 4. Esquema de un magnetrón
El ánodo tiene un número par de cavidades (normalmente ocho), cada una de las cuales se
comporta como un circuito regulado. Cada cavidad actúa como un oscilador eléctrico que
resuena a una determinada frecuencia específica. La energía de los electrones se convierte en
energía de microondas en dichas cavidades (Chan y col., 2011).
El aplicador tiene la finalidad de asegurar la transferencia de la energía electromagnética al
material. Su diseño depende de la naturaleza, forma y dimensiones del material a tratar. Para
materiales de gran volumen, el aplicador es una cavidad de dimensiones grandes comparadas
con las del material y la longitud de onda. La forma del campo eléctrico formado por las ondas
estáticas dentro de la cavidad puede ser muy compleja.
Algunas áreas pueden recibir una gran cantidad de energía y otras casi ninguna. Para asegurar
una distribución homogénea, a menudo se usa un sistema de agitación para mover la zona de
máxima potencia por toda la cavidad. Haya muestra o no, las microondas se reflejan en las
paredes del horno, lo que produce un frente estacionario. Se debe asegurar una
reproducibilidad de las ondas al colocar la muestra que, si es pequeña, puede ocupar zonas de
muy diferente densidad de campo (Chan y col., 2011).
Los hornos de microondas pueden tener cavidad monomodo o multimodo. La cavidad
monomodo (Figura 5a) puede generar una frecuencia que excita solo un modo de resonancia y
la muestra se puede colocar en el máximo del campo eléctrico ya que la distribución del
campo es conocida. La cavidad multimodo (Figura 5b) es larga y la onda incidente es capaz de
afectar muchos modos de resonancia. Esta superimposición de los modos permite la
homogenización del campo (Chan y col., 2011).
13
Revisión bibliográfica
Figura 5. Esquema de diferentes configuraciones de hornos de microondas
1.5.3 Factores que afectan la EAM
La eficiencia de la EAM está fuertemente relacionada con la selección de los parámetros de
operación que afectan los mecanismos de extracción y el rendimiento. Los factores que
pueden influir en el desarrollo de la EAM son: naturaleza y volumen de disolvente, tiempo de
extracción, potencia del microondas, temperatura, características de la muestra y agitación
(Chung-Hung y col., 2011).
La elección correcta del disolvente es fundamental para obtener un proceso óptimo de
extracción, es establecida por la solubilidad del analito, por la interacción entre la matriz de la
planta y el disolvente, y finalmente por las propiedades de absorber las microondas (alta
constante dieléctrica) (Chung-Hung y col., 2011). Disolventes como etanol, metanol y agua
son suficientemente polares para ser calentados por las microondas. Disolventes no polares
con constantes dieléctricas bajas (Tabla 1) como hexano y tolueno no son los mejores para la
EAM. La selectividad de la extracción y la habilidad del disolvente para interactuar con las
microondas pueden ser variadas mediante mezclas de solventes (Wang y Weller, 2006).
Como en otras técnicas de extracción, el tiempo es otro parámetro cuya influencia necesita ser
tomada en consideración. Generalmente, cuando se aumenta el tiempo de extracción, la
cantidad de analitos extraídos aumenta, aunque hay un riesgo de que pueda ocurrir
degradación (Wang y Weller, 2006).
14
Revisión bibliográfica
1.5.4 Ventajas y desventajas de la EAM
En los últimos años la EAM ha tenido un creciente interés, debido a que permite la extracción
de solutos de matrices sólidas, con una eficiencia de extracción comparable a la de las técnicas
clásicas. El calentamiento ocurre de forma selectiva y homogénea sin prácticamente pérdida
de calor al medio ambiente y el mecanismo puede reducir considerablemente el tiempo de
extracción, usualmente entre pocos segundos a pocos minutos. Esto significa que requiere
menos consumo de disolvente y energía (Ferguson y col., 2012).
Además, presenta buena reproducibilidad, mínima manipulación de las muestras en el proceso
de extracción, es posible realizar varias extracciones en una misma corrida, se puede
automatizar el proceso, lo que provee una mejor exactitud y precisión, puede extraer trazas de
componentes, incluyendo metales pesados y residuos de pesticidas y el calentamiento puede
ser interrumpido bruscamente en cualquier momento. Por otro lado, se debe prestar especial
atención a los productos termolábiles, pues el calentamiento es muy rápido, y la temperatura
difícil de controlar si no se dispone del equipo adecuado, lo cual puede favorecer la
degradación de los mismos. Así, se han ideado métodos que combinan las microondas con
fluidos supercríticos y con ultrasonido, lo que hace los procesos de extracción más eficientes y
eficaces (Chan y col., 2011).
Las principales desventajas de la EAM son: (1) los disolventes no polares usualmente no se
pueden utilizar debido a su bajo poder absorbente de las microondas; (2) baja selectividad y
altamente dependiente de la naturaleza del disolvente y de la temperatura de extracción; (3)
coste elevado del equipo; (4) si el diseño del horno de microondas no es adecuado o la forma
del recipiente no es regular, la radiación será más intensa en unas zonas que en otras, lo que
permite la existencia de puntos fríos y calientes; y (5) sobrecalentamiento (Chung-Hung y col.,
2011).
1.5.5 Aplicaciones del empleo de la EAM en la extracción de metabolitos secundarios a
partir de plantas
La primera publicación relacionada con la eficiencia de calentamiento por microondas para
extracciones orgánicas apareció en 1986 cuando Ganzler y col. desarrollaron protocolos de
extracción de lípidos, antinutritivos y pesticidas de suelos, semillas, alimentos y piensos en
unos pocos mililitros de disolvente, irradiados por 30 s hasta 7 veces en un horno doméstico a
15
Revisión bibliográfica
una potencia de 1140 W. Desde esta fecha, numerosos laboratorios han estudiado las
posibilidades analíticas de esta nueva técnica de extracción, lo que se puede comprobar en la
gran cantidad de patentes y artículos publicados, que se refieren al método como novedoso y
económico, algunos de estos ejemplos se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Aplicaciones de la EAM en la obtención de fitoconstituyentes
Metabolitos
Cocaína
Origen
Bibliografía
Hojas de coca
Brachet y col., 2002
Antraquinonas Morinda citrifolia
Saponinas
Hemwimon y col., 2007
Frutas de Spondias Arif y col., 2011
mangifera Willd
Flavonoides y Hojas de Tunisian Taamalli y col., 2012
polifenoles
olive
Aceites
esenciales
Coffea arabica L.
Tsukuk y col., 2014
Carbohidratos
Cynara scolymus L.
Ruiz y col., 2016
1.5.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por microondas
En la literatura se encontraron pocos procedimientos relacionados con la obtención de
mangiferina mediante extracción asistida por microondas. Uno de estos es el desarrollado por
Venkatesh y colaboradores en el 2010, donde demostraron la factibilidad de la EAM sobre el
Soxhlet en la obtención de mangiferina a partir de hojas desengrasadas de Mangifera indica L.
Se obtuvo, a una potencia de 210 W durante 56 min y etanol como disolvente, un rendimiento
31,3 veces superior al método tradicional con 20 h de tratamiento.
De igual forma en otro trabajo se estudió la influencia de la potencia, la concentración de
etanol y el tiempo de irradiación en el contenido de mangiferina obtenida a partir de rizomas
de Curcuma amada. El mayor contenido (1,1156 mg/g) se obtuvo con una potencia de 550 W,
un tiempo de extracción de 50 s y una concentración de etanol de 80%. Los resultados
indicaron que la potencia del microondas y la concentración de etanol son los factores que más
influyen en el contenido de mangiferina. La presencia de mangiferina en el extracto final se
confirmó mediante Cromatografía líquida de Alta resolución (CLAR) y los grupos funcionales
son identificados mediante Infrarrojo – transformada de Fourier (FT-IR, por sus siglas en
inglés) y se comparó con un estándar de mangiferina (Kullu y col., 2013).
16
Revisión bibliográfica
1.6 Extracción asistida por Ultrasonido (EAU)
1.6.1 Fundamento del método
Ultrasonido es el nombre dado a cualquier onda o sonido cuya frecuencia es más alta que lo
que el oído humano es capaz de captar. Es un tren de ondas mecánicas, generalmente
longitudinales, originadas por la vibración de un cuerpo elástico y propagado por un medio
material. Se encuentran en el intervalo desde 20 kHz hasta los 500 MHz (Mulet y col, 2003).
Al igual que el sonido, los ultrasonidos viajan a través de un medio con una velocidad definida
y en forma de onda pero, a diferencia de las electromagnéticas, la onda del sonido es una
distorsión mecánica del medio mediante el cual se transporta la energía del sonido (Mulet y
col, 2003).
1.6.2 Principios básicos de los dispositivos basados en ultrasonidos
1.6.2.1 Generadores ultrasónicos
Los generadores o transductores ultrasónicos son aparatos que constan de un elemento,
primario o transformador, que está en contacto con el medio y que transforma la señal
eléctrica, magnética o mecánica en una onda ultrasónica. Esta señal es proporcionada por el
elemento secundario (Figura 6) (Mulet y col, 2003).
Figura 6. Esquema general de un generador ultrasónico
1.6.2.2 Tipos de ultrasonidos
De acuerdo a la intensidad acústica, se clasifican en ultrasonidos de baja intensidad o de señal
y en ultrasonidos de alta intensidad o de potencia (Mulet y col., 2003).
a) Ultrasonido de baja intensidad o de señal: Son señales de ultrasonido donde el producto
modifica la señal, y ésta proporciona información sobre dicho producto. Sus frecuencias
17
Revisión bibliográfica
oscilan entre los 100 kHz a 1 MHz con intensidades inferiores a 1 W/cm2. Son utilizadas para
determinar las cualidades de un material, o sea en aplicaciones que precisen de una inspección
no destructiva del material objeto de estudio.
b) Ultrasonido de alta intensidad o de potencia: Son señales que afectan o modifican un
proceso o un producto, como consecuencia del efecto de la cavitación provocada. Son fuentes
de energía. Estos ultrasonidos tienen una frecuencia más baja (18- 100 kHz) y una mayor
potencia. Suelen aplicarse mediante ondas continuas, aunque también puede hacerse mediante
pulsos. Se requiere de un medio líquido, un generador de energía y un transductor, el cual
convierte la energía eléctrica, magnética o cinética en energía acústica.
1.6.3 Principio de extracción de fitoconstituyentes mediante la energía de ultrasonido
La EAU utiliza sonidos de alta frecuencia con el fin de desprender el compuesto buscado del
material vegetal. Se basa en el fenómeno físico conocido por cavitación.
La cavitación es un proceso físico, casi exactamente igual al que ocurre durante la ebullición.
La mayor diferencia entre ambos consiste en cómo se efectúa el cambio de fase. La ebullición
eleva la presión de vapor del líquido por encima de la presión ambiente local para producir el
cambio a fase gaseosa, mientras que la cavitación es causada por una caída de la presión local
por debajo de la presión de vapor. O sea, si la energía inducida en forma de onda sonora es
suficiente, se pueden superar las fuerzas atractivas entre las moléculas del medio líquido, el
cual pasa a estado gaseoso, lo que genera bolsas de vapor (cavidades) que son las llamadas
burbujas de cavitación. Estas burbujas crecen (en un proceso conocido como ―difusión
rectificada‖) durante unos pocos ciclos, hasta llegar a un estado de equilibrio para una
determinada frecuencia aplicada. Finalmente las burbujas implotan, lo que provoca
microcorrientes. Esto ocurre asimétricamente cerca de las interfases sobre la superficie sólida,
como se muestra en la figura 7 (Mulet y col., 2003).
18
Revisión bibliográfica
Figura 7. Generación y destrucción de las burbujas por cavitación
La cavitación está influenciada por parámetros propios de la onda, como la frecuencia y la
intensidad; por las propiedades del medio y por las condiciones operatorias del sistema (Mulet
y col, 1999).
Debido a la cavitación, las partículas vibran y se aceleran ante la acción ultrasónica, lo cual
provoca la ruptura de las células de la planta, con lo que se disminuye el tamaño de las
partículas del material vegetal, por lo que se aumenta el área de exposición al disolvente y el
soluto pasa rápidamente de la fase sólida al medio. El ultrasonido, además, facilita la
rehidratación del tejido si se usan materiales secos, al abrir los poros, lo cual a su vez
incrementa el transporte de masa de los constituyentes solubles por difusión y procesos
osmóticos, lo que a su vez es adecuado en los procesos de extracción de sustancias
termolábiles (Toma y col., 2007).
El tiempo de vida de la burbuja de cavitación es del orden de los microsegundos y la
implosión violenta de las mismas genera, de manera localizada y transitoria, altas temperaturas
(5000 ºC en el interior de la burbuja), altas presiones (100 MPa) y la formación de especies
altamente reactivas tales como los radicales hidroxilos (HO•), los radicales hidroxiperoxilo
(HO2•) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Quesada y col., 2009).
La EAU en laboratorio no es difícil mediante el empleo de un baño, equipos que son de fácil
adquisición en el mercado de variadas marcas. También se pueden conseguir equipos de casas
comerciales a escala industrial para utilizar en procesos como homogeneización,
emulsificación, dispersión, molienda y limpieza. En el Anexo 1 se observan distintos equipos
19
Revisión bibliográfica
experimentales comúnmente utilizados en la extracción de sustancias asistida por ultrasonido
(Azuola y Vargas, 2007).
1.6.4 Variables que influyen en la EAU
Según Palma y Barroso, 2001, las variables que se deben analizar para optimizar esta técnica
son temperatura por calentamiento resistivo adicional; tipo de disolvente y volumen; tiempo
de extracción, potencia y frecuencia del ultrasonido y duración del ciclo aplicado.
Además, es necesario tener en cuenta las características del material vegetal: como el
contenido de humedad y el tamaño de partícula, ya que al reducir el tamaño de las partículas
del material vegetal se aumenta el área de exposición al disolvente y a la cavitación producida
(Wang y Weller, 2006).
Sin embargo, la presencia de una fase dispersa contribuye a la atenuación de la onda de
ultrasonido y la parte activa dentro del extractor está restringida a una zona localizada en las
afueras del emisor ultrasónico. Por consiguiente, este factor debe ser considerado
cuidadosamente en el diseño de extractores de ultrasonido (Wang y Weller, 2006).
La distribución de la onda ultrasónica dentro de un extractor es también un parámetro crucial
en el diseño del mismo, debido a que la potencia máxima de ultrasonido es observada en la
superficie del reactor y la intensidad ultrasónica decrece al aumentar la distancia de la
superficie radiante (Romdhane y col., 1995).
1.6.5 Ventajas y desventajas de la EAU
Los beneficios de la EAU se deben principalmente a los efectos mecánicos de la cavitación
acústica.
Es una alternativa barata, simple y eficiente. Su mayor beneficio incluye el incremento del
rendimiento y la cinética de extracción respecto a los métodos tradicionales, ya que
intensifican la transferencia de masa, la ruptura celular, lo que aumenta la penetración del
disolvente y los efectos capilares, lo que conlleva un menor tiempo y un menor costo. El
ultrasonido también puede reducir la temperatura de trabajo y permitir la extracción de
compuestos termolábiles. Existe disponibilidad de equipamiento a nivel industrial y es de
reconocida importancia en la reducción del empleo de disolventes orgánicos, por lo que se
considera una tecnología más limpia (Vilkhu y col, 2008).
20
Revisión bibliográfica
Comparado con otras técnicas novedosas de extracción como la EAM, el aparato de
ultrasonido es más barato y su operación es más fácil. Puede ser usada con cualquier
disolvente para extraer una amplia variedad de compuestos a partir de las plantas. Además, se
ha comprobado mediante distintos estudios, que la EAU puede asistir a otros métodos de
extracción no convencionales, tales como la extracción por fluidos supercríticos. No obstante
requiere un mayor consumo de disolvente y un mayor tiempo que la EAM (Azuola y Vargas,
2007).
1.6.5 Aplicaciones de la EAU en la extracción de metabolitos secundarios a partir de
plantas
La aplicación del ultrasonido como una técnica de laboratorio para la extracción a partir de
plantas ha sido ampliamente publicada. Estas publicaciones incluyen extracciones de aceites,
proteínas, flavonoides y compuestos fenólicos. En la tabla 3 se muestran algunos ejemplos de
la aplicación de esta tecnología en la extracción de metabolitos a partir de materiales
vegetales.
Tabla 3. Aplicaciones de la EAU en la obtención de fitoconstituyentes
Metabolitos
Origen
Bibliografía
Saponinas
Raíz de Ginseng
Jianyong y col., 2001
Antraquinonas
Rheum palmatum L
Lu y col., 2008
Melanina
Frutas de Auricularia
auricula
Zou y col., 2010
Flavonoides
Inula helenium
Jin y col., 2012
Fenoles
Vino
Tao y col., 2014
Antocianinas
Lonicera caerulea L.
Celli y col., 2015
1.6.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por ultrasonido
En la literatura consultada se encontraron pocos procedimientos relacionados con la obtención
de mangiferina mediante EAU.
Uno de ellos consiste en la determinación de las mejores condiciones de extracción de
mangiferina mediante la energía del ultrasonido a partir de Anemarrhena asphodeloides Bge a
través de un diseño ortogonal. Las condiciones más adecuadas fueron un tiempo de 30 min,
21
Revisión bibliográfica
una potencia de 40 W, una relación de 70 ml/g y etanol al 60% como disolvente para un
rendimiento respecto al material vegetal de 1,85% (Yang y col, 2006).
Otro estudio fue el realizado por Tang-Bin y col., 2014, donde evaluaron la influencia de
diferentes parámetros, mediante un diseño de superficie de respuesta, en el rendimiento de
mangiferina obtenida a partir de hojas de Mangifera indica L. Las condiciones óptimas fueron
concentración de etanol del 44%, relación líquido-sólido 38:1 ml/g y un tiempo de extracción
de 19,2 min a 60ºC bajo una potencia de irradiación de ultrasonido de 200 W. Bajo estas
condiciones se obtuvo un rendimiento de mangiferina de 58,46 ± 1,27 mg/g.
1.7 Métodos analíticos para la identificación y cuantificación de productos naturales
Para el análisis e identificación de xantonas en hierbas medicinales y formulaciones existen
diferentes métodos, entre ellos se encuentran la cromatografía de capa delgada (CCD), la
espectrofotometría ultravioleta (UV), la espectroscopía infrarroja (IR), la resonancia
magnética nuclear (RMN), la espectrometría de masas y la cromatografía líquida de alta
resolución (CLAR). De éstos, la CLAR ha sido ampliamente aceptada como un método de
rutina para la separación de xantonas y se ha aplicado para seguir procesos de extracción,
aislamiento y purificación de estos compuestos (Bo y Liu, 2004).
1.7.1 Cromatografía de capa delgada (CCD)
La CCD consiste en una placa fina que tiene impregnada la fase estacionaria. La muestra es
aplicada en la placa cercana al borde, como una mancha o banda. La separación se lleva a
cabo en una cámara cerrada que contiene la fase móvil, la cual asciende por capilaridad o
mediante la aplicación de un gradiente de presión externa. Las muestras se separan de acuerdo
a su afinidad por la fase estacionaria y por la fase móvil. Comparado con otros métodos
cromatográficos, se considera que la CCD presenta deficiencia en reproducibilidad y
exactitud, pero presenta algunos atributos que deben ser considerados como bajo costo, gran
capacidad de análisis de muestras, preparación mínima e integridad total de la muestra.
El parámetro fundamental utilizado para caracterizar la posición de una zona de la muestra en
el cromatograma es el factor de retardo o valor de Rf; este representa la relación entre la
distancia de migración de la muestra y el recorrido del frente del disolvente (Poole, 1999).
22
Revisión bibliográfica
En la literatura se reporta la caracterización de mangiferina obtenida a partir de hojas de
diferentes variedades de mango. Emplearon como adsorbente para la fase normal gel de sílice
60 F254 y como disolventes soluciones de acetato de etilo-acetona-ácido fórmico-agua
(8:2:1:1) y acetato de etilo-metanol-ácido fórmico-agua (8:2:1:1). Las placas fueron detectadas
con ácido sulfúrico al 10 % en metanol y calentadas a 110ºC por 10 min. El Rf de los
compuestos aislados estuvo en un intervalo entre 0,42 y 0,44, cercano al estándar (0,43)
cuando se empleó solución de acetato de etilo-acetona-ácido fórmico-agua (8:2:1:1) como
disolvente revelador. Mientras que el Rf estuvo en el intervalo de 0,61 a 0,63 al desarrollar
con disolución de acetato de etilo-metanol-ácido fórmico-agua (8:2:1:1) (Jutiviboonsuk y
Sardsaengjun, 2010).
1.7.2 Espectrometría ultravioleta (UV)
Para la espectrometría UV la región empleada es la ubicada entre las longitudes de onda de
200 y 400 nm, llamada UV cercano, de gran utilidad en la determinación estructural de
insaturación conjugada, aromaticidad o de ciertos grupos insaturados con pares electrónicos
libres (carbonilo, nitro, etc.) (Bart y Pilz, 2011).
Aparece en la literatura un trabajo relacionado con la caracterización de mangiferina extraída
en metanol a partir hojas de diferentes variedades de mango, donde aparecen en los espectros
UV tres picos principales a longitudes de onda de 262, 315 y 364 nm, los cuales coinciden con
el estándar de mangiferina evaluado (Jutiviboonsuk y Sardsaengjun, 2010).
En otro trabajo se compararon los espectros UV de muestras de mangiferina obtenidas a partir
de Mangifera indica L. mediante el método convencional y la energía de las microondas,
donde se obtienen picos a 365, 314, 267 y 241 nm con una absorbancia de 0,496; 0,635; 1,008;
1,079 respectivamente para el método convencional y picos a 365, 315, 257 y 240 nm con una
absorbancia de 0,536; 0,685; 1,393 y 1,190 para las microondas (Venkatesh y col., 2010).
1.7.3 Espectrometría Infrarroja (IR)
La sección de mayor utilidad práctica para nuestros propósitos, de la extensa región IR, es la
que se extiende entre 4000 y 650 cm-1 denominada región infrarroja media. El análisis IR
prueba ser una herramienta para la caracterización e identificación de compuestos o grupos
funcionales presentes en una mezcla de extractos de plantas, ya que ciertas agrupaciones
23
Revisión bibliográfica
atómicas dan lugar siempre a bandas en un determinado intervalo de frecuencias,
independiente de la naturaleza del resto de la molécula. (Eberhardt y col., 2007).
En un trabajo realizado por Kullu y col., 2013, se obtuvo el espectro de IR-Transformada de
Fourier (FT-IR) de mangiferina extraída por microondas a 550 W a partir de Curcuma amada.
Se identificaron cinco grupos funcionales, uno a 3399 cm-1 que muestra la presencia del enlace
antisimétrico C-H, un pico a 1658,70 cm-1 que indica la presencia del enlace del OH
secundario, otro pico a 1436,91 cm-1 del enlace CH-CH, otro a 1316,17 cm-1 del enlace C-O y
un pico a 1023,22 cm-1 que muestra la presencia del enlace C–C en la estructura de la
mangiferina. Este espectro fue comparado con un estándar de mangiferina lo que reveló la
similitud en los grupos funcionales.
1.7.4 Espectrometría de masas (EM)
La EM es una técnica de análisis basada en la separación de acuerdo a las razones masa/carga
de especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra. Se trata de una técnica
extremadamente sensible, de gran versatilidad y cuyos campos de aplicación experimentan un
crecimiento vertiginoso en nuestros días. Suministra información muy valiosa sobre los
compuestos químicos: la masa molecular, la fórmula global y, a partir del patrón de
fragmentaciones, la estructura molecular, así como la composición isotópica en sustancias
naturales o marcadas isotópicamente (Ferreres y col., 2011).
En un trabajo (Campa y col., 2011), se analizó el espectro de masas de la mangiferina y la
isomangiferina obtenida a partir de hojas de café mediante una fuente de ionización por
electrospray. El espectro de masas obtenido sugiere que ambos compuestos son isómeros y
que exhiben una señal a m/z 423 (M+H).
1.7.4 Resonancia Magnética nuclear (RMN)
La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es un método químico-físico basado en las
propiedades magnéticas de los núcleos atómicos. Muchos núcleos se comportan como
pequeños imanes, lo que genera un débil campo magnético. La ubicación de dichos núcleos en
una zona donde existe un campo magnético intenso hace que los estados que difieren en la
orientación de los momentos magnéticos nucleares posean diferente energía. La interacción
24
Revisión bibliográfica
del sistema con una radiofrecuencia adecuada produce transiciones entre dichos niveles
energéticos, que se detecta como una débil señal de absorción (Agiomyrgianaki y col., 2012)
En un trabajo realizado por Campa y col., 2011 se analizó el espectro RMN de la mangiferina
obtenida a partir de hojas de café a 400,13 MHz para 1H y a 100,62 MHz para
13
C. Los
espectros de RMN fueron interpretados mediante las versiones de gradiente convencional de
las secuencias COSY, HMQC y HMBC. El espectro 1H muestra tres singletes a 7,371; 6,845 y
6,374 ppm y un sistema complejo de 7 espines entre 3,0 y 5,0 ppm. El análisis de este sistema
de segundo orden revela un acoplamiento de la constante típica de la entidad de glucosa. El
corrimiento químico de RMN-13C a 73,6 ppm sugiere un enlace C-C entre el azúcar y la
aglicona.
1.7.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR)
La técnica CLAR es un método ampliamente utilizado en el análisis de xantonas y otros
metabolitos secundarios. Es un método de columna donde la fase móvil y la muestra son
forzadas a atravesar la fase estacionaria que se encuentra en la columna. Es aquí, donde tienen
lugar diversos tipos de interacciones entre sus componentes tales como: interacciones
bipolares, hidrófobas, puentes de hidrógeno e interacciones electrostáticas.
Las fases estacionarias que más han sido utilizadas son la C8 y la C18 y como fase móvil se
han utilizado mezclas de metanol-agua y metanol-ácido acético al 2,5% (Castiñeira, 2002).
En un trabajo (Campa y col., 2011), determinó la mangiferina en hojas de café mediante una
columna LiChrospher 100 RP- 18 (5 μm), y otra Cl8 y un detector de fotodiodo. El sistema de
elución usado (0,8 ml/min) contiene un eluente A, compuesto de una solución acuosa de ácido
fosfórico (2 mol/l), y un eluente B, compuesto de metanol. El tiempo de retención y las
características espectrales de cada muestra fueron comparados con una muestra de referencia
de mangiferina.
Otro artículo (Kullu y col., 2013), refiere el análisis por CLAR, equipado con un detector UV–
vis, de un extracto de Curcuma amada. La separación cromatográfica fue realizada en una
columna de fase reversa (C18, 4,6 X 250 mm) con una temperatura de la columna mantenida a
25ºC. La fase móvil usada fue acetonitrilo y ácido acético al 3% en una relación 16:84 a un
flujo de 0,5 ml/min. El volumen de inyección fue de 10 µl. los picos fueron evaluados basados
25
Revisión bibliográfica
en su absorbancia a 254 nm. El tiempo de retención y la concentración de las muestras fueron
comparados con el estándar puro de mangiferina. Se verifica la presencia de mangiferina a un
tiempo de retención de 6,51 min.
1.8 Análisis crítico de la bibliografía
En la bibliografía consultada se aprecia una tendencia creciente en el uso de las técnicas no
convencionales de extracción debido a las múltiples ventajas que se reportan. No obstante, se
observa que existe poca bibliografía sobre la obtención de mangiferina mediante microondas y
ultrasonido, por lo que se decidió abordar el estudio de la extracción de este metabolito
contenido en las hojas de Mangifera indica L. mediante el empleo de estas técnicas no
convencionales de extracción.
26
Materiales y métodos
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Materiales
2.1.1 Reactivos
El disolvente n-hexano fue suministrado por Merck (MERCK L-K 26455380920) con una
pureza superior al 99%. El etanol fue suministrado por UniChem (E14623-3J) con una pureza
de 99%. El agua desionizada empleada es proporcionada por el Centro de Investigación y
Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).
2.1.2 Equipos

Balanza analítica Sartorius R 200 D (precisión 0,0001g)

Balanza técnica Mettler Toledo P B 8001 (precisión 0,1g)

Bomba de vacío Edwards

Criostato Sanyo M K- 70

Rotoevaporador Büchi R- 124

Estufa eléctrica Electric Drying Oven modelo 101-2

Horno de microondas doméstico modificado SANYO EM-T109SS

Baño ultrasónico Sakura US-5E (Potencia 150W y Frecuencia 60kHz)

Cromatógrafo gas-masa Shimadzu QP-2010S

Cromatógrafo líquido-masa TermoFinigan LCQ-Ion Trap
2.1.3 Recolección y preparación del material vegetal
Se utilizaron hojas secas y molidas (3-5 mm de tamaño de partículas) de Mangifera indica L.
de la variedad ―Mango Macho‖ suministradas en abril del 2011 y de la variedad ―Super Hade‖
suministradas en diciembre del 2012, provenientes de la arboleda ubicada en la Estación
Experimental de Plantas Medicinales ―Dr. Juan Tomás Roig‖, en la localidad de San Antonio
de los Baños, provincia Artemisa. Fueron codificadas en el Herbario del Instituto de Ecología
y Sistemática del Ministerio de Ciencias y Tecnología (CITMA), con el número de herbario
41722.
27
Materiales y métodos
Las hojas de la variedad ―Mango Macho‖ contienen un 3,23% de mangiferina, un 9,0% de
humedad y 5,10% de fracción apolar (Sarduy, 2012). Mientras que las hojas de la variedad
―Super Hade‖ tienen un valor de humedad de 11,8%, un contenido de mangiferina de 2,15%
en base anhidra determinado por CLAR y un contenido de fracción apolar determinado por
soxhlet de 11,22% (Betancourt, 2013).
2.2 Estudio del proceso de extracción mediante la energía de las microondas
Los experimentos se llevaron a cabo en un horno de microondas doméstico modificado
SANYO EM-T109SS, de potencia variable con una frecuencia de operación de 2450 MHz
(Anexo 2). Se empleó un reactor de vidrio de fondo redondo de un litro de capacidad
(conectado a un condensador de serpentín y enchaquetado en posición de reflujo), el que se
ubica dentro de la cavidad del horno, colocado en el sitio de mayor radiación determinado
previamente por Pérez, 2012.
2.2.1 Estudio de las mejores condiciones de extracción de la fracción apolar (desengrase)
Para la evaluación de las variables que influyen en la etapa de desengrase, se emplearon hojas
de la variedad ―Super Hade‖ del árbol del mango. Se utilizó un diseño de superficie respuesta
Box-Behnken aleatorizado de 15 corridas incluyendo 3 puntos centrales por bloque, donde las
variables estudiadas fueron la potencia (W), el tiempo de irradiación (min) y la relación
volumen de disolvente por masa de material vegetal (ml/g), y se empleó n-hexano como
disolvente de extracción. Estos parámetros se escogieron según estudios previos realizados
para el que se empleó el método tradicional en tanque agitado (Sarduy, 2012). Como variable
respuesta se seleccionó el contenido de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial de
hojas.
En la tabla 4 se muestran los valores de los niveles estudiados en el diseño.
Tabla 4. Niveles de los factores experimentales
Factores
Bajo
Alto
Unidades
Tiempo
1,0
5,0
min
Potencia
540,0
900,0
W
Relación
10,0
20,0
ml/g
En la tabla 5 se muestra la matriz del diseño experimental empleado.
28
Materiales y métodos
Tabla 5. Matriz del diseño experimental de extracción de la fracción apolar
Experimentos
Potencia( W)
Relación(ml/g)
Tiempo(min)
1
540
15
1
2
540
20
3
3
720
20
1
4
720
15
3
5
900
15
1
6
540
10
3
7
540
15
5
8
720
10
1
9
720
15
3
10
720
10
5
11
900
10
3
12
720
20
5
13-15*
720
15
3
*Experimentos en el centro del plano
Fueron empleados en todos los casos 10 g de hojas molidas y homogenizadas. Una vez
concluido cada ensayo, el extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo
presión reducida. Posteriormente se concentró en el rotoevaporador a presión reducida hasta
sequedad.
2.2.2 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el
material vegetal
Para conocer el disolvente que mejor extrae la mangiferina se utilizaron 10 g de hojas verdes
de la variedad ―Macho‖ del árbol del mango previamente desengrasadas y se extrajo con
150 ml de disolvente a una potencia de 750 W durante un tiempo de 3 min. Se utilizó agua,
etanol al 96% y mezclas etanol – agua (80, 50 y 30%), cada ensayo se realizó por duplicado.
El extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida.
Luego se midió el volumen del licor obtenido. El seguimiento del proceso extractivo se realizó
mediante la cuantificación de la mangiferina por CLAR (Nuevas y col., 2012). Como variable
de respuesta se evaluó el contenido de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas.
29
Materiales y métodos
2.2.3 Estudio de las mejores condiciones para la etapa de extracción de mangiferina
Para evaluar las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina mediante la
energía de las microondas, se empleó un diseño de superficie respuesta Box-Behnken
aleatorizado de 15 corridas incluyendo 3 puntos centrales por bloque, donde las variables
estudiadas fueron la potencia (W), el tiempo de irradiación (min) y la relación volumen de
disolvente por masa de material vegetal (ml/g), y se empleó agua como disolvente de
extracción. Como variable respuesta se seleccionó el contenido de mangiferina respecto a la
masa inicial de hojas. Los niveles de los factores estudiados se muestran en la tabla 6.
Tabla 6. Niveles de los factores estudiados en el diseño experimental de extracción de
mangiferina
Factores
Bajo
Alto
Unidades
Tiempo
1,0
5,0
min
Potencia
540,0
900,0
W
Relación
10,0
20,0
ml/g
Se utilizaron 10 g de hojas desengrasadas de la variedad ―Macho‖ de mango en todos los casos
y los ensayos fueron realizados según la matriz experimental mostrada en la tabla 7.
Posteriormente se separó el extracto del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión
reducida. Al extracto obtenido se le determinó la concentración de mangiferina por CLAR.
30
Materiales y métodos
Tabla 7. Matriz del diseño experimental de extracción de mangiferina
Experimentos
Tiempo(min)
Relación (ml/g)
Potencia(W)
1
1
15
540
2
3
20
540
3
1
20
720
4
3
20
900
5
1
15
900
6
3
10
540
7
5
15
540
8
1
10
720
9
5
15
900
10
5
10
720
11
3
10
900
12
5
20
720
13-15*
3
15
720
*Experimentos en el centro del plano
2.3 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido mediante ultrasonido a baja
frecuencia
Los experimentos se llevaron a cabo en un baño ultrasónico (Anexo 3). Se empleó un reactor
de vidrio de fondo plano de un litro de capacidad, que se ubica dentro del baño. En todos los
ensayos se emplearon hojas de la variedad ―Macho‖ del árbol de mango.
2.3.1 Estudios preliminares del proceso de extracción de la fracción apolar por
ultrasonido
2.3.1.1 Influencia de la relación sólido-líquido en el proceso de extracción de la fracción
apolar
Para conocer la mejor relación para la extracción de la fracción apolar se utilizaron 5 g de
hojas verdes del árbol del mango que se extrajeron con n-hexano como disolvente durante un
tiempo de 1 h. Se emplearon como relaciones volumen disolvente/ material vegetal 10, 20, 30,
31
Materiales y métodos
40 y 50 ml/g. Cada ensayo se realizó por duplicado. Como variable respuesta se seleccionó la
masa de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial de hojas.
2.3.1.2 Influencia del tiempo en la extracción de la fracción apolar
Para el estudio de extracción de la fracción apolar en el tiempo se utilizaron 15 g de hojas de
mango, una relación volumen disolvente / material vegetal de 20 ml/g y n-hexano como
disolvente de extracción. Se tomaron alícuotas del líquido de extracción (4 ml) en los tiempos
de 5, 15, 45, 60 y 90 min. Posteriormente se separó el extracto del residuo vegetal de cada
muestra mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. La muestra se concentró hasta
sequedad. Como variable de respuesta se evaluó la masa de fracción apolar extraída, que se
determinó mediante un método gravimétrico.
2.3.2 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la fracción apolar
(desengrase) mediante el empleo del ultrasonido
Para la evaluación de los parámetros que influyen en la etapa de desengrase, se utilizó un
diseño factorial aleatorizado de 11 corridas incluyendo 2 puntos centrales, donde las variables
estudiadas fueron el tiempo de extracción (min) y la relación volumen de disolvente por masa
de material vegetal (ml/g) y se empleó n-hexano como disolvente de extracción. Como
variable respuesta se seleccionó la masa de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial
de hojas.
En la tabla 8 se muestran los valores de los niveles estudiados en el diseño.
Tabla 8. Niveles de los factores experimentales para la extracción de la fracción apolar
por ultrasonido
Factores
Bajo
Alto
Unidades
Tiempo
30
90
min
Relación
30
50
ml/g
En la tabla 9 se muestra la matriz del diseño experimental que se utilizó.
32
Materiales y métodos
Tabla 9. Matriz experimental del diseño de extracción de la fracción apolar por
ultrasonido
Experimentos
Relación
(ml/g)
Tiempo
(min)
1
40,0
90,0
2
30,0
60,0
3
30,0
90,0
4
50,0
30,0
5
30,0
30,0
6
50,0
90,0
7
40,0
30,0
8
50,0
60,0
9-11*
40,0
60,0
*Experimentos en el centro del plano
Fueron empleados en todos los casos 5 g de hojas de mango. Una vez concluido cada ensayo,
el extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida.
Posteriormente se concentró en el rotoevaporador a presión reducida hasta sequedad.
2.3.3 Estudios preliminares del proceso de extracción de mangiferina por ultrasonido
2.3.3.1 Influencia de la relación sólido-líquido en el proceso de extracción de mangiferina
Para conocer la mejor relación volumen/ masa de hojas para la extracción de mangiferina, se
utilizaron 5 g de hojas verdes del árbol del mango previamente desengrasadas. Para la
extracción se utilizó agua como disolvente durante un tiempo de 45 min. Se usó este
disolvente, ya que es el empleado para el método tradicional. Se utilizaron como relaciones
volumen disolvente/ material vegetal 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 ml/g y cada ensayo se realizó
por duplicado. Como variable respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a
la masa inicial de hojas.
33
Materiales y métodos
2.3.3.2 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el
material vegetal
Para conocer el disolvente que mejor extrae la mangiferina se utilizó 1 g de hojas verdes del
árbol del mango previamente desengrasadas y se extrajo con 20 ml del disolvente
seleccionado, durante un tiempo de 45 min. Se utilizó agua, etanol al 96% y mezclas etanol –
agua (70, 50 y 30%) y cada ensayo se realizó por duplicado. El extracto se separó del residuo
vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Luego se midió el volumen del licor
obtenido. El seguimiento del proceso extractivo se realizó mediante la cuantificación de la
mangiferina por CLAR (Nuevas y col., 2012). Como variable de respuesta se evaluó la masa
de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas.
2.3.3.3 Influencia del tiempo en la extracción de mangiferina
Para el estudio de extracción de mangiferina en el tiempo se utilizaron 15 g de hojas de mango
previamente desengrasadas, una relación volumen disolvente / material vegetal de 20 ml/g y
agua como disolvente de extracción. Se tomaron alícuotas del líquido de extracción (4 ml) en
los tiempos de 5, 30, 45, 60, 90 y 120 min. Posteriormente se separó el extracto del residuo
vegetal de cada muestra mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Como variable
respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas.
2.3.4 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la mangiferina
Para evaluar la influencia de las variables en la etapa de extracción de mangiferina mediante la
energía del ultrasonido, se empleó un diseño de superficie respuesta compuesto central
aleatorizado de 17 corridas que incluye 3 puntos centrales, donde las variables estudiadas
fueron la concentración de etanol (%), el tiempo de extracción (min) y la relación volumen de
disolvente por masa de material vegetal (ml/g). Los niveles de los factores estudiados se
muestran en la tabla 10.
34
Materiales y métodos
Tabla 10. Niveles de los factores estudiados en el diseño experimental para la extracción
de mangiferina mediante ultrasonido
Factores
Bajo
Alto
Unidades
Tiempo
30
90
min
Concentración de etanol
20
70
%
Relación
30
60
ml/g
Se utilizó 1 g de hojas de mango desengrasadas en todos los casos y los ensayos fueron
realizados según la matriz experimental mostrada en la tabla 11. Posteriormente se separó el
extracto del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Al extracto
obtenido se le determinó la concentración de mangiferina por CLAR. Como variable de
respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas.
Tabla 11. Matriz del diseño experimental para la extracción de mangiferina por
ultrasonido
Experimentos
Tiempo(min)
Relación(ml/g)
Concentración etanol (%)
1
60
20
45
2
90
60
70
3
30
30
70
4
110
45
45
5
90
30
70
6
60
45
0
7
30
60
20
8
30
30
20
9
60
45
90
10
10
45
45
11
60
70
45
12
90
30
20
13
30
60
70
14
90
60
20
15-17
60
45
45
35
Materiales y métodos
2.4 Técnicas analíticas empleadas
2.4.1 Determinación del contenido de fracción apolar
La determinación del contenido de fracción apolar se realizó mediante la siguiente ecuación:
(ecuación 1)
Donde:
m (FA):masa de fracción apolar (mg)
g (hojas): gramo de hojas empleadas en el experimento.
Para determinar la masa de la fracción apolar presente en las hojas extraída
experimentalmente, se utilizó un método gravimétrico. Primeramente, se pesó en la balanza
analítica el balón vacío en el que se concentró posteriormente el extracto, y seguidamente se
pesó el balón lleno. Después, por diferencia de peso se pudo determinar la masa de fracción
apolar extraída. Para este cálculo se utilizó la siguiente ecuación:
m (FA)= masa balón lleno - masa balón vacío
(ecuación 2)
2.4.2 Determinación del contenido de mangiferina por CLAR
Para realizar el análisis por cromatografía líquida de alta resolución se empleó una bomba de
gradiente L6200A (Merck-Hitachi) acoplada a un detector UV-VIS L-3000 ajustado a 254 nm.
Para realizar la separación cromatográfica se empleó una columna LiChrospher RP-18
(Merck) de 250 mm de largo y 4,6 mm diámetro interno y un tamaño de partículas de 5 µm.
La fase móvil consistió en una mezcla de ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo en una
relación 88:12 v/v. El volumen de inyección fue de 20 µl.
2.4.3 Cálculo del contenido de mangiferina
El contenido de mangiferina extraída se determinó según la ecuación siguiente:
(ecuación 3)
Donde:
m (MgF): masa de mangiferina extraída (mg)
La masa de mangiferina extraída se calcula a partir de la ecuación que se muestra a
continuación:
36
Materiales y métodos
m (MgF)= Vf * c(MgF)
(ecuación 4)
donde:
Vf: Volumen final del extracto.
c(MgF): Concentración final de mangiferina en el extracto determinada por CLAR.
2.4.4 Cromatografía gaseosa acoplada a masas (CG-EM)
Para el análisis por CG-EM se empleó un equipo Shimadzu QP-2010S acoplado con una
columna DB-5 MS de diámetro 30 m x 0,25 mm. El gas portador empleado fue helio a una
velocidad de flujo de 1 ml/min. La inyección se realizó a 250ºC y el volumen de inyección fue
de 1 µl.
2.4.5 Cromatografía líquida acoplada a masas (CLAR-EM)
Se realizó en un equipo equipado con una sonda de ionización por electrospray (ESI), una
trampa de iones y un detector DAD 996 (Waters, USA). Los espectros de masas se registraron
en modo de ESI positivo (ESI +) y negativo (ESI-) en el intervalo de 50 a 1500 Da y los
espectros ultravioleta entre 190 y 450 nm. Como gas nebulizador se usó nitrógeno seco a un
flujo de 10 ml/min, una presión de 4,1 bar; temperatura de 375 °C y como gas colisionador
helio. La fragmentación se realizó a una presión de 1,2*10-5 mbar. Los espectros de masas de
primer orden (EM) y de segundo orden (EM2) se obtuvieron a 1,2 V y 1,5 V, respectivamente.
La separación cromatográfica previa se llevó a cabo en una columna RP-18 de 250 x 4,6 mm a
un flujo de 1 ml/min. La fase móvil consistió en ácido fórmico 0,1 % (A) y acetonitrilo- ácido
fórmico 0,1 % (B). Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en
dimetilsulfóxido y el volumen de inyección fue de 5 μl.
2.5 Análisis estadístico de los resultados
Los resultados fueron analizados con el Software STATGRAPHICS Centurion XV Versión
15.2.05 StatPoint, Inc, 1982 – 2007a partir del análisis de varianza, diagramas de Pareto y los
gráficos de superficie de respuesta.
37
Resultados y discusión
CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Identificación de los componentes presentes en las hojas de mango
Para la identificación de los componentes en las hojas verdes de Mangifera indica L., los
metabolitos fueron extraídos mediante extracción por Soxhlet con n-hexano, acetato de etilo y
metanol como disolventes. Los extractos de n-hexano y acetato de etilo fueron analizados
mediante Cromatografía gaseosa acoplada a masas (CG-EM) y el extracto metanólico fue
analizado por Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas
(CLAR-EM).
La identificación de los componentes en las fracciones apolares fue realizada por comparación
del espectro de masas adquirido con el reportado por la base de datos NIST. La identificación
de los compuestos por CLAR-EM se realizó mediante la comparación de los espectros
obtenidos con los informados en la literatura por varios autores o por comparación con
patrones de los compuestos.
El cromatograma de la CG-EM para los componentes extraídos con n-hexano y la estructura
de los compuestos principales encontrados se muestran en la Figura 8.
QF_HEX
11
100
10
19
8
42
%
15
29
9
17
20
34
38
40
25
6
3
2
1
4
28
12
13
5
33
27
30
32
31
7
41
35
45
43
44
49
4748
46
51
50
0
53
52
rt
5.000
10.000
15.000
20.000
25.000
30.000
35.000
H2C
CH3
H3C
H
10
CH3
7
OH
H
H3C
CH3
H3C
CH3
β-elemeno (8) Aromandreno (11)
-guaieno (10)
Hinesol (6)
Figura 8. Cromatograma y estructuras principales de los componentes extraídos con nhexano
38
Resultados y discusión
En el Anexo 4 aparece la identificación de cada pico. La identificación muestra la presencia de
estructuras de sesquiterpenoides no oxigenados en el extracto. Los componentes principales
fueron -elemeno, -guaieno, aromandreno e hinesol, los cuales tienen reportado diferentes
actividades farmacológicas.
Aparece en la literatura un trabajo que refiere los aceites volátiles extraídos de las hojas de
Mangifera indica L. por destilación al vapor y analizados mediante CG-EM, donde se
identificaron 15 compuestos de la fracción oleosa. Los principales compuestos fueron βSelineno (28,89%), α-Gurjuneno (11,64%), α-Selineno (10,04%), Cariofileno (10, 01%), βElemeno (6,81%) y α-Humuleno (6,19%) (Li y col., 2007).
Otro estudio refiere la presencia de esteroides, flavonoides, azúcares reductores y glicósidos
cardiacos en el extracto de n-hexano obtenido a partir de hojas de Mangifera indica (variedad
Edward) (Aiyelaagbe y Osamudiamen, 2009).
En extracto de acetato de etilo (Figura 9) y en extracto metanólico (Figura 10) los principales
metabolitos identificados son compuestos fenólicos.
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
CH2
CH3
H3C
OH
CH2
β-selineno (5)
β-eudesmol
(6)Hinesol (19)
Figura 9. Cromatograma y estructuras de algunos compuestos identificados en extracto
de acetato de etilo
39
Resultados y discusión
OH
OH
OH
OH
HO
O
O
HO
OH
OH
OH
OH
(+) catequina
OH
HO
O
H3C
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
HO
(-) epicatequina
OH
O
O
O
OH
OH
OH
HO
OH
O
OH
mangiferina
homomangiferina
Figura 10. Cromatograma UV y estructuras de los principales compuestos identificados
en extracto metanólico
Compuestos oxigenados, como el ácido hexanoico, fueron los principales metabolitos
extraídos en el extracto de acetato de etilo (Anexo 5).
En el extracto metanólico se observó la presencia de 52 compuestos, los cuales fueron
identificados mediante el análisis de los espectros UV entre 190 y 450 nm y de la
40
Resultados y discusión
fragmentación de los espectros de masas de primer (EM) y segundo orden (EM2) de cada pico
y la información descrita en la literatura (Anexo 6).
Los compuestos con tiempo de retención 3,58 (1); 4,33 (2) y 8,27 (5) min presentaron un
espectro UV similar, con máximos de absorción a 230 y 265 nm, absorción típica de los ácidos
fenólicos. Los EM presentaron iones moleculares [M-H] a m/z 331, 169 y 153 Da
respectivamente. En el EM2 de (1) se observaron fragmentos a m/z 271 [M-H-60], 241 [M-H90], 211 [M-H-120] y 169 [M-H-162] que revelaron la presencia de una hexosa O-glicosilada
y el ión m/z 169 sugirió la presencia de ácido gálico. Para (2) y (5) en el EM2 se observó un
ión prominente a m/z 125 y 109 [M-H-44] respectivamente que se debe a la pérdida de 44 Da,
que corresponde a un grupo carboxilo. De acuerdo con estos resultados estos compuestos
fueron identificados como monogaloil glucosa (332,26 g/mol) (1), ácido gálico (170,11g/mol)
(2) y ácido 3,4 dihidroxibenzoico (154,23 g/mol) (5). La presencia de estos ácidos fenólicos en
las hojas de mango había sido informada previamente por Barreto y col., 2008.
El compuesto con tiempo de retención de 6,27 min (3) presentó máximos de absorción a 230 y
265 nm y el ión molecular a m/z 170 [M-H] en EM y otro a m/z 125 [M-H-44] en EM2, lo que
sugiere que sea probablemente un ácido fenólico, no obstante, este compuesto no pudo ser
identificado.
Los picos que eluyeron a 11,9 (6); 12,82 (7) y 20,34 (16) min fueron identificados como
maclurina 3-(2-galoil)-ß-D-glucósido (576,11 g/mol); iriflofenona 3-C-ß-D-glucósido (408,07
g/mol) y maclurina (262,21 g/mol). Los compuestos (6) y (16) presentaron el espectro UV
característico de estas benzofenonas con máximos a 230 y 285 nm y el (7) presentó máximos a
235 y 290 nm. En el EM se observaron sus iones moleculares [M-H] a m/z 575, 407 y 261 Da,
lo cual está en correspondencia con las masas molares calculadas. La presencia de fragmentos
en el EM2 para el compuesto (6) a m/z 423 [M-H-152], m/z 405 [M-H-170], m/z 313 [M-H152-110] y m/z 303 [M-H-152-120] se relacionaron con la pérdida de residuos como galoil
(152 Da), ácido gálico (170 Da) y glucosa con enlace C-C (120 Da). El fragmento a m/z 285
se debe a la pérdida de una molécula de agua del fragmento m/z 303 y el fragmento a m/z 261
correspondió al ión molecular de la maclurina. Para el compuesto 7, los fragmentos a m/z 317
[M-H-90] y m/z 287 [M-H-120] indicaron la pérdida de una unidad de glucosa con enlace CC. Para el compuesto 16 en el EM2 se observaron los fragmentos m/z a 151 y 106,9 que se
41
Resultados y discusión
deben a la pérdida de 110 y 151 Da del ión molecular. Iguales fragmentaciones han sido
registradas en EM para estos compuestos por Barreto y col., 2008.
Los picos con tiempo de retención 14,4 (8) y 19,3 (13) min, se sugieren como catequina y
epicatequina, respectivamente. Los espectros UV fueron similares y presentaron máximos de
absorción a 235 y 280, 315 y 365 nm. Los EM tienen un fragmento prominente a m/z 289
relacionado con el ión molecular de ambos compuestos. En el EM2 se observaron fragmentos
a m/z 245, 205 y 179 Da que se corresponde con la fragmentación típica informada en la
literatura para estas dos estructuras (Hui-Jing y Deinzer, 2007).
El compuesto con tiempo de retención 15,04 min (9), no pudo ser identificado. Presentó un
espectro UV con un máximo de absorción a 230 nm y otros dos más pequeños a 260 y
370 nm. El EM presentó un ión molecular de m/z 565 [M-H] por lo que este compuesto
presente una masa molecular de 566 g/mol. En el EM2 se observaron fragmentos a m/z 475,
445 y 385 Da producto de la pérdida de 90, 120 y 180 Da del ión molecular, que indica la
presencia de una hexosa O-glicosilada.
Los compuestos con tiempo de retención 17,80 (11) y 18,90 (12) min, fueron identificados
como mangiferina e isomangiferina. El compuesto 11 presentó máximos de absorción a 235,
255, 320 y 365 nm. Los EM y EM2 de estos compuestos fueron similares, en ambos se
observó un ión molecular a m/z 421 [M-H] para una masa molar de 422 g/mol y se observaron
fragmentos a m/z 331 [M-H-90], 301 [M-H-120] y 259 [M-H-162] que correspondieron a la
pérdida de una unidad de C-glucosa. La asignación de cada uno de los picos se realizó a partir
del trabajo de Shieber y col., 2003, quien informó que la mangiferina eluye antes de la
isomangiferina bajo condiciones cromatográficas similares a las utilizadas en este trabajo.
El compuesto con tiempo de retención 19,69 min (14) se identificó como homangiferina. Su
EM posee un ión molecular a m/z 435 [M-H] para una masa molar de 436 g/mol y fragmentos
a 315, 287 y 272 Da. En su EM2 se observó el mismo patrón de fragmentación de la
mangiferina y la isomangiferina, es decir, la pérdida de 90, 120 y 162 Da que corresponden a
la glucosa. El ión en m/z 272 [M-H-162] pertenece al derivado metoxilado de la mangiferina.
El pico con tiempo de retención de 20,79 min (17) presentó el ión molecular a m/z 693 [M-H]
y fragmentos a m/z 573 [M-H-120], m/z 421 [M-H-120-152] y m/z 403 [M-H-120-170]. La
pérdida de 120 Da indicó la presencia de un grupo benzoilo, mientras que la de 152 Da se
42
Resultados y discusión
debió a la existencia de un grupo galoil en la estructura, los cuales deben estar unidos en
diferentes sitios de la unidad de glucosa de acuerdo con su comportamiento cromatográfico.
En el espectro EM2 de los picos el fragmento predominante fue m/z 421 [M-H-272] que
presentó la fragmentación característica de la mangiferina, por lo que este compuesto se
identificó como 6’-O-galoil-2’-benzoil-mangiferina (694,24 g/mol).
Por su parte, los picos con tiempo de retención 21,59 (19); 21,95 (20); 22,85 (24), y 24,30 (27)
min presentaron espectros UV similares al de la mangiferina. En los EM se observó un ión
molecular a m/z 573 [M-H] y fragmentos a m/z 421 [M-H-152] y m/z 403 [M-H-170] que
indicaron la pérdida de ácido gálico. En el espectro EM2 se observó la presencia del ión
predominante a m/z 421 [M-H-152] con la fragmentación característica de la mangiferina. Los
tres primeros compuestos se identificaron como isómeros de posición de la 6’-O-galoilmangiferina (574,09 g/mol) y el último como 6´-O-galoilisomangiferina, por semejanza de su
espectro UV con el de la isomangiferina.
Los picos con tiempo de retención 23,62 (25); 23,98 (26); 24,73 (28) y 24,90 (29) min se
suponen que son isómeros de posición de la mangiferina o compuestos derivados de ella pues
sus espectros son característicos de las tetrahidroxixantonas. La diferencia se encuentra en la
zona de 300 a 400 nm, lo cual indica que los sustituyentes se encuentran en el anillo B de la
estructura. Los EM presentaron un ión molecular a m/z 421 [M-H] con poca intensidad y otro
muy intenso a m/z 403 [M-H-18], que se debe a la pérdida de una molécula de agua. En el
EM2 se observaron fragmentos a m/z 373 [M-H-18-30], 343[M-H-18-60], 313[M-H-18-90],
285[M-H-18-118], 271 [M-H-150] y 259 [M-H-162] que indican la pérdida de una hexosa con
enlace C-C a la xantona. El ion m/z 259 se corresponde con el ión molecular de la
tetrahidroxixantona. La diferencia en los tiempos de retención podría estar provocada por la
presencia de hexosas diferentes a la glucosa y en diferentes posiciones en el anillo B.
Los picos que aparecen a tiempo de retención de 25,19 (30) y 25,74 (32), 26,10 (33) y 28,08
(38) min se identificaron como isómeros de posición de la p-hidroxibenzoilmangiferina
(542,44 g/mol). Estos compuestos presentaron espectros UV y EM similares. La presencia del
ion en m/z 541, así como de los fragmentos a m/z 421 [M-H-120], 403 [M-H-138] y 259 [MH-120-162] indicaron la pérdida del ácido p-hidroxibenzoico (120 y 138 Da) y de una glucosa
con enlace C-C (162 Da).
43
Resultados y discusión
El pico con tiempo de retención de 31,40 min (45) presentó el espectro UV similar al de la
mangiferina con máximos de absorción a 235, 255, 315 y 360 nm y un ión molecular a m/z
259 [M-H]. Este compuesto se identificó como noratiriol (260,19 g/mol) por comparación con
el espectro publicado en la literatura (Barreto y col., 2008).
El compuesto (48), con tiempo de retención de 33,81 min se identificó como quercetina
(302,19 g/mol). El espectro UV presentó máximos a 235, 255 y 370 nm y el espectro EM
presentó un ión prominente a m/z 301 [M-H], mientras que el EM2 presentó iones a m/z 179 y
151 típicos de la fragmentación de este compuesto.
Aunque no se pudieron identificar, también están presentes algunos derivados de los
flavonoides. El análisis de los espectros UV sugiere que los compuestos con tiempo de
retención de 27,77 (37); 30,27 (42); 31,10 (44) y 33,52 (47) min pueden ser flavanonas o
isoflavonas pues presentaron un solo máximo de absorción muy intenso entre 270 y 290 nm y
casi ninguna banda de absorción entre 300 y 450 nm, lo cual se debe a la falta de conjugación
del anillo C3. Por otra parte, los picos con tiempo de retención de 25,50 (31); 26,82 (35);
27,53 (36); 30,63 (43); 32,70 (46); 35,01 (50) y 37,44 (51) min pueden ser flavonoles o
flavonas. Sus espectros UV presentan una banda absorción entre 240 y 260 nm y dos bandas
entre 300 y 400 nm típicos de estos compuestos. En los espectros de EM están presentes los
fragmentos con m/z 107, 109, 131, 151, 165, 175, 177, 181 y 195 Da que les son
característicos.
Como se observa, la mayoría de los compuestos identificados el extracto metanólico lo
constituyen xantonas C-glicosiladas derivadas de la mangiferina, benzofenonas, ácidos
fenólicos simples y flavonoides. Muchos reportes de extractos acuosos de hojas de mango
muestran la presencia de mangiferina, homomangiferina, catequina, epicatequina, flavonoides,
saponinas y taninos, sin trazas de alcaloides o antraquinonas (Zhou y Zhong-Li, 2005). Todos
estos compuestos tienen actividad farmacológica reportada y juegan un papel importante en la
prevención de las células del organismo contra lesiones provocadas por el agua oxigenada,
además neutralizan los radicales libres. Además, ha sido reportado que un alto contenido de
fenoles totales aumenta la actividad antioxidante.
44
Resultados y discusión
3.2 Resultados del estudio del proceso de extracción de la fracción apolar (FA)
El proceso actual de obtención de mangiferina incluye una etapa de desengrase o extracción de
la fracción apolar contenida en las hojas con el objetivo de facilitar el posterior proceso de
extracción de la mangiferina (Acosta, 2013). Por lo anterior, resulta necesario evaluar la etapa
de desengrase.
Teniendo en cuenta que existen diferencias en la composición química y en la época de
recolección de las hojas de las dos variedades de mango disponibles, empleadas en la etapa de
desengrase, se hace necesario evaluar la influencia del método de extracción tradicional
establecido (Sarduy, 2012) sobre el % másico de fracción apolar.
El análisis de varianza realizado al contenido de fracción apolar, que se muestra en la figura
11, indica que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los porcientos
másicos de extracción de la fracción apolar de ambas variedades, por ser el valor de
probabilidad (0,5241) mayor que 0,05. Esto es lógico si tenemos en cuenta que este proceso
solo depende de la capacidad extractiva del disolvente, en este caso el n-hexano. Es decir,
depende de la naturaleza o tipo de disolvente utilizado. El n-hexano una vez puesto en
contacto con el material vegetal, extrae el soluto contenido en las hojas hasta que llega al
equilibrio bajo las condiciones estudiadas.
Figura 11. Contenido de fracción apolar presente en las hojas de mango de las
variedades Macho y Super Hade
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos es factible comparar los métodos de extracción
por ultrasonido y el de microondas, con el de tanque agitado, cuando se trabaje indistintamente
45
Resultados y discusión
con estas variedades. No obstante se debe realizar un estudio de las diferentes variedades de
mango disponibles, con el objetivo de evaluar la mejor época de recolección.
3.2.1 Estudio de las variables que influyen en la extracción de la fracción apolar
(desengrase) mediante la energía de las microondas
Para evaluar la influencia de los parámetros de operación en la etapa de desengrase fue
empleado n-hexano como disolvente de extracción de la fracción apolar. En el estudio previo
realizado (Sarduy, 2012), para el método tradicional, este disolvente es el seleccionado de
acuerdo a los rendimientos en la extracción y el precio del mismo.
En la tabla 12 se muestran los resultados del diseño experimental en el cual el contenido de
fracción apolar respecto a la masa inicial de hojas fue la variable de respuesta elegida. Como
se observa los valores de rendimiento en la extracción de la fracción apolar toma valores en el
intervalo de 10,5 y 34,6 mg/g.
Tabla 12. Resultados del diseño experimental para la fracción apolar
No. de
corrida
Tiempo
(min)
(X1)
Relación (ml/g)
(X2)
Potencia (W)
(X3)
Contenido de FA
(mg FA extraída/g
hojas)
1
1
15
540
11,4
2
1
15
900
11,9
3
3
20
540
16,3
4
1
10
720
10,5
5
1
20
720
15,0
6
5
10
720
24,6
7
5
20
720
34,6
8
3
10
540
13,3
9
3
10
900
24,2
10
5
15
540
24,0
11
5
15
900
30,0
12
3
20
900
16,6
13-15*
3
15
720
14,6 ± 2,3
* réplicas en el punto central
46
Resultados y discusión
Mediante la aplicación del análisis de regresión múltiple a los datos experimentales, las
variables respuestas y las variables independientes se correlacionan a un polinomio de
segundo orden como se muestra en la ecuación 5.
Contenido de FA = -10,82 - 2,13*X1 + 1,03*X12
(ecuación 5)
El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores
del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustada) fueron 89,9 y 82,2%, respectivamente, los cuales sugieren un alto grado de
correlación entre los valores observados y predichos.
En la figura 12, se muestra el diagrama de Pareto (A), el gráfico de efectos principales (B) y el
gráfico de superficie de respuesta (C) obtenidos para el diseño.
A
B
C
Figura 12. Análisis de varianza para la extracción de la FA mediante microondas. A:
Diagrama de Pareto; B: Gráfico de efectos principales; C: Gráfico de superficie de
respuesta
El parámetro que tiene influencia significativa para un 95 % de confianza sobre el proceso es
el tiempo y su relación cuadrática, por ser el valor de probabilidad menor que 0,05 (0,0001 y
47
Resultados y discusión
0,0336 respectivamente); sin embargo no ocurre así para la relación, la potencia y su
interacción.
Al analizar los gráficos de Pareto y de efectos principales se puede observar que el tiempo
tiene una influencia positiva sobre el contenido de FA. Esto es debido a que un aumento del
tiempo de irradiación favorece el calentamiento por el incremento de la energía cinética de las
partículas, lo que aumenta la difusividad y por tanto, la cantidad de las sustancias que se
extraen, además del incremento de la solubilidad. Por otra parte, a mayor tiempo de
extracción, hay un mayor contacto entre el sólido y el líquido, lo que permite al disolvente
llegar a las zonas de más difícil acceso en los tejidos de la planta.
Se debe tener en cuenta que el n-hexano es un disolvente que no absorbe las microondas por sí
solo, por su baja polaridad y constante dieléctrica (1,69), por lo que el calentamiento
producido es debido al agua presente en la matriz de la planta que absorbe fácilmente las
microondas, además de los fragmentos de moléculas polares presentes.
Al tener en cuenta la influencia que ejerce cada uno de los factores estudiados y según el
gráfico de superficie de respuesta, las condiciones más favorables, de las estudiadas, para
llevar a cabo la extracción de la fracción apolar contenida en las hojas de mango mediante
EAM son: un tiempo de irradiación de 5 min, una potencia de 900 W y una relación de
10 ml/g para un valor máximo de la fracción apolar extraída de 32,7 mg/g.
3.2.2 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido de la fracción apolar (desengrase)
mediante el empleo del ultrasonido a baja frecuencia
En todos los experimentos se emplearon hojas de la variedad Macho de Mangifera indica L.
3.2.2.1 Efecto del tiempo en la extracción de la FA
Los resultados del estudio de extracción de la FA en el tiempo mediante ultrasonido aparecen
reflejados en la figura 13.
48
Resultados y discusión
Figura 13. Extracción de la fracción apolar presente en las hojas con el tiempo mediante
ultrasonido
Como se observa, los valores de fracción apolar extraída varían entre los 1,65 ± 0,69 y
4,13 ± 1,38 mg para los tiempos de 5 y 60 min respectivamente. El análisis de varianza
realizado a la cinética de extracción de la fracción apolar indica que existen diferencias
estadísticamente significativas entre las medias de las masas de fracción apolar para un 95%
de confianza, por ser el valor de probabilidad (0,0002) menor que 0,05. Se aprecia que, con el
aumento del tiempo, se favorece la extracción de fracción apolar hasta los 60 min, tiempo en
el cual se alcanza una meseta. Como no existen diferencias estadísticamente significativas
entre los 60 y los 90 min, se puede afirmar que la mayor extracción se alcanza a los 60 min de
iniciada la operación.
3.2.2.2 Efecto de la relación disolvente-material vegetal en la extracción de FA
Los resultados del estudio sobre la influencia de la relación disolvente-material vegetal en la
extracción de la FA presentes en las hojas de Mangifera indica L. variedad macho, se
muestran en la figura 14.
49
Resultados y discusión
Figura 14. Comportamiento de la relación volumen de disolvente/material vegetal en la
extracción de la FA presentes en las hojas de Mangifera indica L.
Los valores de rendimiento alcanzados oscilan desde 16,95 mg/g para cuando se utiliza una
relación volumen de disolvente/material vegetal de 10 ml/g, hasta 27,52 mg/g para una
relación de 40 ml/g. Como se observa existen diferencias estadísticamente significativas entre
las medias de los rendimientos de fracción apolar para un 95% de confianza, por ser el valor
de probabilidad (0,0002) menor que 0,05.
Se aprecia que con el aumento del volumen de disolvente se incrementa el rendimiento de
extracción, obteniéndose los mayores valores de rendimiento de fracción apolar extraída para
una relación disolvente/material vegetal de 40 y 50 ml/g, los cuales a su vez no mostraron
diferencias estadísticamente significativas entre sí, por lo que es recomendable trabajar con la
relación de 40 ml/g para garantizar el ahorro de disolvente.
3.2.2.3 Estudio de la influencia de los parámetros de extracción de la FA mediante
ultrasonido
El estudio de los parámetros que influyen en la etapa de desengrase se realizó con el empleo
de n-hexano como disolvente de extracción. Este disolvente fue elegido, debido a que brindó
excelentes rendimientos de extracción de fracción apolar en estudios previos (Sarduy, 2012).
Los parámetros que se evaluaron fueron el tiempo de extracción (X1) expresado en minutos
(min) y la relación volumen de disolvente/ material vegetal (X2) en ml/g. Los niveles de las
variables de estudio fueron seleccionados de acuerdo a los resultados preliminares obtenidos.
La variable respuesta seleccionada fue la masa de fracción apolar extraída respecto a la masa
inicial de hojas.
50
Resultados y discusión
En la tabla 13 se muestran los resultados del contenido de la fracción apolar (FA) en cada uno
de los experimentos realizados.
Tabla 13. Resultados del diseño experimental
Ensayo
Tiempo (min)
Relación (ml/g) (X2)
(X1)
Contenido FA (mg
FA/g hojas)
1
90
30
18,2
2
30
30
13,7
3
30
50
22,9
4
90
50
29,5
5
60
30
17,4
6
30
40
20,3
7
60
50
24,9
8
90
40
26,6
9-11
60
40
25,1 ± 1,7
El mayor valor de rendimiento de la FA (29,5 mg/g) se alcanzó para los niveles más altos del
diseño experimental (90 min y 50 ml/g) y el menor valor de rendimiento (13,7 mg/g) se
obtuvo para los niveles más bajos del diseño (30 min y 30 ml/g). Estos resultados son lógicos
pues los procesos difusivos por métodos de extracción convencionales y por ultrasonido, como
todo proceso cinético, se favorecen con un aumento de la relación volumen de
disolvente/material vegetal y del tiempo de contacto entre las fases, para sustancias que no se
descomponen con facilidad, como la de estudio.
El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores
del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 95,5 y 91,0%, respectivamente, lo que sugiere un alto grado de correlación
entre los valores observados y predichos.
Las variables objeto de estudio y las variables de respuesta se correlacionan en un polinomio
de segundo orden como se muestra en la ecuación 6
Contenido FA = -48,72 + 0,14*X1 + 2,86*X2 - 0,03*X22(ecuación 6)
51
Resultados y discusión
En la figura 15, se muestran el diagrama de Pareto (A), el gráfico de efectos principales (B) y
el de superficie de respuesta (C) del diseño.
A
B
C
Figura 15. Análisis de varianza para la variable contenido de FA extraída mediante
ultrasonido
Los parámetros que influyen estadísticamente para un 95% de confianza sobre el proceso
extractivo son: la relación, el tiempo y la relación cuadrática de la relación por ser los valores
de probabilidad 0,0004; 0,0034 y 0,0074 respectivamente, menores que 0,05.
El diagrama de Pareto confirma lo anteriormente expuesto, donde se observa que la relación es
el parámetro que presenta una mayor influencia, teniendo una influencia positiva sobre el
contenido de FA.
Al analizar el diagrama de efectos principales, se puede observar que el tiempo tiene una
influencia positiva sobre el porciento másico de la fracción apolar, observándose un efecto
cuadrático negativo aunque no tiene una influencia estadísticamente significativa. En el
gráfico correspondiente a los estudios cinéticos (Figura 13) se observa que para los 90 min, ya
se alcanzó una especie de meseta, es decir la masa de fracción apolar extraída no varía
52
Resultados y discusión
prácticamente con el tiempo, y si se compara con los resultados obtenidos en el diseño
experimental, podemos concluir que este tiempo podría ser suficiente para llevar a cabo la
etapa de desengrase de las hojas por ultrasonido.
Para el caso de la relación el contenido de FA aumenta hasta un máximo cercano a los valores
más altos estudiados donde comienza a disminuir, esto pudiera ser debido, a que una parte del
disolvente (n-hexano) es absorbido en las hojas, que se saturan con el disolvente y por tanto no
intercambia soluto, por lo que una disminución de la solubilidad es debido a la pérdida del
extrayente atrapado en la matriz.
A partir de los resultados obtenidos y el gráfico de superficie de respuesta, las condiciones
más favorables para la extracción de la FA a partir de hojas de Mangifera indica L., bajo las
condiciones evaluadas, mediante ultrasonido, al emplear n-hexano como disolvente son:
tiempo de irradiación de 90 min y una relación de 47 ml/g, para un rendimiento de FA de
29,0 ± 1,7 mg/g.
3.2.3 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de desengrase
Se comparó la eficiencia de la extracción de la fracción apolar para la mejor variante obtenida
por ultrasonido (EAU) y mediante la extracción asistida por microondas (EAM) con el método
de extracción en tanque agitado (TA) al utilizar n-hexano como disolvente. En la tabla 14 se
muestran los valores del rendimiento de fracción apolar, el tiempo de extracción y la relación
disolvente/ material vegetal que se tuvo en cuenta para el análisis de los métodos de
extracción.
Tabla 14. Comparación de los diferentes métodos de extracción de fracción apolar
Tipo de extracción
Parámetros
TA
EAM
EAU
Relación (ml/g)
20
10
47
Tiempo de extracción (min)
120
5
90
33,4 ± 1,0
32,7 ± 2,3
29,0 ± 1,7
Contenido de FA (mg/g)
Como se muestra en la tabla, los mayores valores de rendimiento de mangiferina se alcanzan
con el método tradicional (tanque agitado) y la extracción por microondas, aunque con el
empleo de la EAM se reducen los tiempos de operación y el consumo de disolvente. La
53
Resultados y discusión
operación con mayor tiempo de extracción en la obtención de mangiferina fue la extracción en
tanque agitado y la de mayor consumo de disolvente fue la EAU.
La figura 16 muestra los resultados del análisis de varianza realizado para el rendimiento,
donde se aprecia que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres
métodos de extracción utilizados, ya que el valor de probabilidad es mayor de 0,05 (0,06030).
Figura 16.Contenido de FA obtenido por diferentes métodos
Tanto para la extracción por microondas como para el método tradicional el estudio fue
llevado a cabo para un intervalo de relación al de 10 a 20 ml/g, mientras que para la EAU se
hace necesario el empleo de una relación de 47 ml/g. Este resultado es lógico para la EAU y se
explica debido a que mayores volúmenes de disolvente favorecen la transferencia de masa y la
cavitación.
Para el caso de las microondas, los mayores rendimientos de extracción de la fracción apolar
se logran con la menor relación (10 ml/g) lo cual coincide con lo reportado en la bibliografía,
ya que en la EAM elevadas proporciones de disolvente provocan menores recobrados debido a
una inadecuada agitación del disolvente por las microondas, puesto que ocurre menor
calentamiento, pues este depende de la absorción de las microondas por el disolvente.
Sin embargo, existe una gran diferencia en el tiempo en el cual se lleva a cabo la extracción de
la fracción apolar contenida en las hojas. En este sentido mediante un proceso de microondas
la extracción es 12 y 18 veces más rápida en comparación con el método de extracción por
ultrasonido y en tanque agitado respectivamente. Esto, sin dudas, es una de las ventajas del
uso de las microondas sobre otros métodos por emplear cortos periodos de tiempo.
54
Resultados y discusión
No obstante, cuando se emplea un proceso de ultrasonido la extracción es 2 veces más rápida
en comparación con el método de extracción en tanque agitado. Esto, sin dudas, constituye,
además, una ventaja del uso del ultrasonido sobre métodos convencionales.
3.3 Resultados del estudio de la etapa de extracción de mangiferina
Una vez concluida la etapa de desengrase, donde se eliminan mayoritariamente los
compuestos de polaridad baja (fracción apolar) presentes en las hojas de Mangifera indica L.,
la próxima etapa es la extracción de la mangiferina, que es el metabolito de interés. En todos
los casos fueron empleadas hojas desengrasadas de la variedad Macho de Mangifera indica L.
3.3.1Verificación por CLAR de la presencia de mangiferina en extractos obtenidos
mediante ultrasonido y por microondas
La figura 17 muestra el perfil cromatográfico de la mangiferina obtenida de hojas
desengrasadas de Mangifera indica L. después de utilizar el equipo ultrasónico (B) y el
microondas (C) y la mangiferina estándar de referencia (A). El tiempo de retención de
7,3 min. obtenido en ambos extractos, se corresponde con la mangiferina y concuerda con el
estándar de referencia, verificándose la presencia de este metabolito en extractos de hojas de
Mangifera indica L. obtenidos por ultrasonido y por microondas. Además, próximo a los
3 min aparecen unos picos, los cuales se corresponden con compuestos polares como se vio en
el epígrafe 3.1.
Figura 17. Cromatogramas correspondientes al estándar de referencia de la mangiferina
(A) y al extracto de mangiferina presentes en las hojas de mango después de usar el
equipo ultrasónico (B) y el de microondas (C)
55
Resultados y discusión
3.3.2 Evaluación de disolventes para la etapa de extracción de mangiferina mediante la
energía de microondas
En la evaluación de los candidatos a disolventes de extracción se utilizó el agua y mezclas
hidroalcohólicas, de acuerdo a la naturaleza química del metabolito de interés. En la figura 18
se muestra el contenido de mangiferina (mg/g) para cada disolvente evaluado. Se aprecia que
el mayor valor de rendimiento (26,31 ± 0,76 mg/g) se obtiene cuando se utiliza el etanol a una
concentración del 50%, esto está de acuerdo con las características de la mangiferina (figura
1), que es un polifenol de polaridad media.
Figura 18. Contenido de mangiferina extraída en los disolventes evaluados mediante
microondas
Según se observa en la figura anterior no existen diferencias estadísticamente significativas
entre los rendimientos obtenidos para las concentraciones de etanol 30, 50 y 80% debido a que
el valor de probabilidad es igual a 0,2839, mayor que 0,05. Los valores del rendimiento de la
mangiferina extraída aumentan con el incremento de la concentración de etanol desde 0 (agua)
hasta el 50%, donde alcanza su valor máximo. Este resultado coincide con otros trabajos
donde emplean igual disolvente para la extracción de compuestos fenólicos. Ejemplos de esto
se muestran en la tabla 15 para otros materiales.
56
Resultados y discusión
Tabla 15. Compuestos fenólicos extraídos con etanol al 50 %
Metabolitos
Especie vegetal (Planta)
Bibliografía
Isoflavonas
Glycinemax
Rostagno y col., 2007
Rutina
Euonymusalatus(Thunb.)
Sieb
Zhang y col., 2009
Quercetina
Cinnamomumzeylanicum
Coriandrumsativum
Polifenoles totales
Cuminumcyminum
Gallo y col., 2010
Crocussativus
Al utilizar agua como disolvente se obtiene un valor en la extracción de mangiferina de
24,32 ± 0,38 mg/g. No existieron diferencias estadísticamente significativas entre el empleo de
este disolvente y el etanol al 50%, que fue el que mejores resultados brindó. El agua es un
disolvente no tóxico y barato, comúnmente usado para la extracción de compuestos bioactivos.
Además, presenta una elevada constante dieléctrica (78,3), lo que permite que absorba las
microondas fácilmente.
3.3.3 Estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina
mediante la energía de microondas
El estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de la mangiferina fue
realizado con agua como disolvente de extracción. Se evaluó el efecto de la potencia (X1), el
tiempo (X2) y la relación volumen de disolvente/ material vegetal (X3). En todos los ensayos
realizados en el diseño experimental se emplearon 10 g de hojas desengrasadas de la variedad
Macho de Mangifera indica L. La extracción fue optimizada mediante la metodología de
superficie de respuesta. En la tabla 16 se muestran los resultados del diseño experimental
Boxh-Benken, que se utilizó. Los valores de mangiferina fueron determinados por CLAR.
57
Resultados y discusión
Tabla 16. Resultados de las corridas de las diferentes variantes del diseño experimental
de extracción de mangiferina mediante microondas
Exp.
Tiempo
(min)
(X1)
Relación
(ml/g)
(X2)
Potencia
(W)
(X3)
Contenido de
mangiferina
extraída
(mg / g hojas)
1
1
15
540
10,60
2
3
20
540
18,34
3
1
20
720
10,99
4
1
15
900
10,06
5
3
10
540
11,91
6
5
15
540
12,11
7
1
10
720
10,31
8
5
10
720
15,79
9
3
10
900
15,63
10
5
20
720
15,73
11
3
20
900
14,96
12
5
15
900
17,93
13-15*
3
15
720
14,07  1,53
El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores
del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 86,7 y 76,7%, respectivamente, lo que sugiere un alto grado de correlación
entre los valores observados y predichos.
La variable de respuesta y las variables objeto de estudio se correlacionan en un polinomio de
segundo orden como se muestra en la ecuación 7.
Contenido de mangiferina = -33,76 + 2,45*X1 - 1,51*X12 + 0,01*X1*X3 - 0,00669167*X2*X3
(ecuación 7)
La figura 19 muestra el diagrama de Pareto (A), la gráfica de efectos principales (B) y los
gráficos de superficie respuesta (C) obtenidos para el diseño.
58
Resultados y discusión
B
A
C
Figura 19. Análisis de varianza para la variable contenido de mangiferina extraída
mediante microondas
Los parámetros que tienen influencia significativa para un 95% de confianza, son el tiempo, su
relación cuadrática y las interacciones de los factores potencia y relación y tiempo y potencia
por ser los valores de probabilidad 0,0004; 0,0214; 0,0187 y 0,0302 respectivamente, menores
que 0,05.
De acuerdo al gráfico de interacción, se muestra que el tiempo aumenta hasta un valor máximo
donde comienza a decaer. Esto puede ser debido a que ocurra una posible degradación de la
mangiferina debido al calentamiento interno que provocaría este tipo de energía, ya que el
agua contenida en la matriz de la planta absorbe la energía de las microondas lo que provoca,
en el interior de las células, el fenómeno conocido como supercalentamiento, (en el agua la
velocidad de absorción de la energía de las microondas es mayor que la capacidad de
disipación). Este fenómeno de supercalentamiento localizado puede, en algunos casos,
promover eficientemente la extracción de los metabolitos por ruptura celular lo que provoca la
59
Resultados y discusión
desabsorción de los mismos, y en otros, la degradación de los metabolitos por el intenso
calentamiento de acuerdo al régimen de operación que se lleve a cabo.
Al tener en cuenta la influencia que ejerce cada uno de los factores estudiados, y según el
gráfico de superficie de respuesta, las condiciones más favorables de las evaluadas para llevar
a cabo la extracción de mangiferina contenida en las hojas desengrasadas de Mangifera indica
L. mediante la EAM, y con el empleo de agua como disolvente son: un tiempo de irradiación
de 5 min, una potencia de 900 W y una relación disolvente/ material vegetal de 10 ml/g para
un valor máximo de contenido de mangiferina de 18,65±1,53 mg/g.
3.3.3 Estudio del proceso de extracción sólido – líquido de mangiferina mediante el
empleo del ultrasonido a baja frecuencia
3.3.3.1 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el
material vegetal
En la evaluación de los candidatos a disolventes de extracción se utilizó el agua y mezclas
hidroalcohólicas de acuerdo a la naturaleza química del metabolito de interés. En la figura 20
se muestran los contenidos de mangiferina extraída (mg/g) para cada disolvente evaluado.
Figura 20. Contenido de mangiferina extraída en los disolventes evaluados mediante
ultrasonido
Según se observa en la figura anterior, el contenido de mangiferina extraída aumenta hasta una
concentración de etanol de 50%, donde alcanza su valor máximo de 13,67 ± 0,44 mg/g, y
posteriormente disminuye con el aumento de la concentración de etanol. Esto se debe a las
características del metabolito que se extrae, que es un polifenol, de polaridad media.
60
Resultados y discusión
3.3.3.2 Efecto de la relación disolvente-material vegetal en la extracción de mangiferina
Los resultados del estudio de la relación disolvente-material vegetal sobre la obtención de
mangiferina se muestran en la figura 21. El agua fue seleccionada como el disolvente de
extracción como en la tecnología tradicional y como la extracción por microondas para llevar
a cabo los estudios preliminares.
Figura 21. Comportamiento de la relación en la extracción de mangiferina presentes en
las hojas desengrasadas de Mangifera indica L.
Como se observa en la figura anterior, a medida que aumenta la relación se incrementa el
contenido de mangiferina extraída, que alcanza su valor máximo de 16,33 ± 0,29 mg/g, con la
mayor relación estudiada. Este comportamiento es esperado debido a que la extracción
ultrasónica es más eficiente cuando la cantidad de disolvente es elevada, ya que se favorece el
fenómeno de cavitación. Generalmente, grandes cantidades de disolvente pueden disolver
constituyentes más eficientemente, lo que lleva a un aumento del rendimiento de extracción.
Sin embargo, esto causa gastos de disolvente y algunos problemas en la siguiente etapa, donde
es necesario evaporar para concentrar y disminuir la cantidad de muestra a tratar. Debido a
esto, no se trabajó con mayores cantidades de disolvente.
3.3.3.3 Efecto del tiempo en la extracción de mangiferina
Para llevar a cabo los estudios cinéticos se utilizó agua como disolvente y una relación
volumen de disolvente/material vegetal de 20 ml/g, de forma similar al método tradicional
(Sarduy, 2012). La concentración de mangiferina obtenida fue determinada por CLAR. Los
resultados del estudio de extracción que se realizó, se muestran en la figura 22.
61
Resultados y discusión
Figura 22. Extracción de mangiferina en el tiempo mediante ultrasonido
Como se observa en la figura, el porcentaje de extracción de mangiferina se incrementa con el
aumento del tiempo de extracción ultrasónica, donde a partir de los 60 min. se alcanza una
meseta. El más alto rendimiento alcanzado fue de 1,11 ± 0,26 mg/ml a los 60 min.
3.3.3.4 Estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina
El estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de la mangiferina fue
realizado con 1 g de hojas desengrasadas en cada ensayo. La extracción fue optimizada
mediante la metodología de superficie de respuesta. En la tabla 17 se muestran los resultados
del diseño experimental rotacional central, que se utilizó. Los valores de mangiferina fueron
determinados por CLAR.
El contenido de mangiferina extraída, en las condiciones experimentales y de diseño
evaluadas, se obtuvo en el intervalo de 9,35 a 24,05 mg/g.
62
Resultados y discusión
Tabla 17. Resultados del diseño experimental
Concentración de
etanol (%)
(X3)
Contenido de
mangiferina
extraída
(mg/g)
Exp.
Tiempo (min.)
(X1)
Relación
disolvente/material
vegetal (ml/g) (X2)
1
60
45
90
11,60
2
30
30
70
15,77
3
30
60
20
16,82
4
90
60
20
17,55
5
60
70
45
16,50
6
90
60
70
17,91
7
60
45
0
9,59
8
110
45
45
14,28
9
30
60
70
15,43
10
10
45
45
9,35
11
90
30
20
10,80
12
30
30
20
13,20
13
90
30
70
13,52
14
60
20
45
14,20
15-17
60
45
45
24,04 ± 0,01
Mediante la aplicación del análisis de regresión múltiple a los datos experimentales, las
variables respuestas y las variables independientes se correlacionan en un polinomio de
segundo orden (ecuación 8).
Contenido de mangiferina = -30,87 - 0,004*X12 -0,01*X22 - 0,006*X32
(ecuación 8)
El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores
del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 83,0 y 72,8% respectivamente, lo que sugiere un alto grado de correlación
entre los valores observados y predichos. Los valores de probabilidad fueron utilizados para
chequear la significación de cada coeficiente. Los resultados muestran que los términos
cuadráticos son los significativos.
63
Resultados y discusión
En la figura 23, se muestran el diagrama de Pareto (A), el gráfico de efectos principales (B) y
los gráficos de superficie de respuesta (C) obtenidos para el diseño.
A
B
C
Figura 23. Análisis de varianza para la variable contenido de mangiferina extraída por
ultrasonido a baja frecuencia
En el diagrama de efectos principales se observa un incremento del rendimiento de
mangiferina con el aumento del tiempo hasta un nivel máximo a partir del cual este
rendimiento comienza a decaer, este comportamiento indica que tiempos de extracción muy
prolongados pueden provocar la descomposición química de la mangiferina. Aun cuando la
EAU se caracteriza por su utilización en el campo de los productos naturales para la
extracción de los metabolitos de interés, se ha referido que la composición de algunos
metabolitos puede ser deteriorada después de someterla a acción ultrasónica, debido a la
64
Resultados y discusión
producción de radicales libres generados por la cavitación. Por esto, es de vital importancia el
estudio del mecanismo de degradación ultrasónica de la mangiferina y de otros compuestos de
la Mangifera indica L., que no ha sido reportado en la literatura.
Con respecto al comportamiento de la concentración de etanol se observa que con el aumento
de la misma, hasta un 50%, se incrementa el rendimiento de extracción, pero a partir de este
valor máximo el rendimiento comienza a decaer. Esto puede ser explicado por el hecho de que
la mangiferina es una xantona (polifenol) con polaridad media y el etanol a una concentración
del 50% puede contribuir a su extracción, lo que ha sido observado para muchos compuestos
polifenólicos, tales como antraquinonas presentes en la raíz de Morinda citrifolia (Hemwimol
y col., 2006) y rutina y quercetina, en Euonymus alatus (Yang y Zhan, 2008).
En el gráfico de superficie de respuesta se muestra que las condiciones más para la extracción
de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. previamente desengrasadas, bajo las
condiciones evaluadas, son: tiempo de irradiación 62 minutos, relación volumen de disolvente/
material vegetal de 49 ml/g y una concentración de etanol de 46,8% lo que permite obtener un
valor de contenido de mangiferina extraída de 24,16 ± 0,02 mg/g.
3.3.4 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de extracción
de mangiferina
Se comparó la eficiencia de la extracción de mangiferina obtenida por ultrasonido y por
microondas con el método de extracción en tanque agitado (TA) (Sarduy, 2012). En la tabla
18 se muestran los valores del contenido de mangiferina extraída, el tiempo de extracción y la
relación que se tuvo en cuenta para el análisis de los diferentes métodos de extracción.
Tabla 18. Comparación de los diferentes métodos de extracción de mangiferina
Tipo de extracción
Parámetros
TA
EAM
EAU
Relación (ml/g)
20
10
49
Tiempo de extracción (min)
120
5
62
Contenido de mangiferina
extraída (mg/g) ± DS
18,90 ± 0,40
18,30 ± 1,50
24,16 ± 0,02
65
Resultados y discusión
Como se muestra en la tabla, los mayores valores de rendimiento de mangiferina se alcanzan
con el método de ultrasonido, aunque con el empleo de la EAM se reducen los tiempos de
operación y el consumo de disolvente. La operación con mayor tiempo de extracción en la
obtención de mangiferina fue la extracción en tanque agitado y la de mayor consumo de
disolvente fue la EAU.
Para el contenido de mangiferina no existen diferencias estadísticamente significativas entre el
método de extracción por microondas y en tanque agitado ya que el valor de probabilidad es
mayor de 0,05 (p=0,5639). Sin embargo, respecto al tiempo en que transcurre la operación, en
este caso el proceso de extracción por microondas es 24 veces más rápido en comparación con
el método de extracción en tanque agitado. Este resultado confirma lo referido en la literatura
que expresa la ventaja de las microondas sobre otros métodos de extracción.
Al comparar el método de extracción en tanque agitado con la EAU se observa que con este
último se reduce a la mitad el tiempo de extracción y el contenido de mangiferina extraída es
mucho mayor, lo que expresa la ventaja del ultrasonido con respecto a métodos tradicionales
en cuanto a eficiencia y tiempo de extracción.
Desde el punto de vista técnico podemos plantear que el proceso de obtención de mangiferina
mediante extracción asistida por microondas se ve favorecido en una reducción de la
proporción de disolvente a emplear y en la disminución del tiempo de operación, mientras que
los rendimientos obtenidos son similares estadísticamente cuando se compara con el método
de extracción en tanque agitado. Si bien el uso del ultrasonido permite la extracción de la
mangiferina con elevados rendimientos, no garantiza bajo las condiciones experimentales
establecidas, obtener mejoras en cuanto a volumen de disolvente empleado y en cuanto al
tiempo respecto al método tradicional y al de microondas.
66
Conclusiones
CONCLUSIONES
1. Se realizó la identificación de los componentes presentes en las hojas de mango, las cuales
contienen, básicamente, sesquiterpenoides no oxigenados, ácidos fenólicos y como
componente mayoritario la xantona mangiferina.
2. Se determinaron las condiciones más favorables para el proceso de extracción de la
fracción apolar y de mangiferina a nivel de laboratorio mediante microondas, donde se
obtuvieron como parámetros de operación, un tiempo de irradiación de 5 min, una
potencia de 900 W y una relación disolvente/material vegetal de 10 ml/g para ambas
etapas de extracción.
3. Se determinaron las condiciones más favorables para el proceso de extracción de la
fracción apolar y de mangiferina a nivel de laboratorio mediante ultrasonido y se
seleccionaron como parámetros de operación para la etapa de extracción de la fracción
apolar un tiempo de extracción de 90 min y una relación disolvente/material vegetal de
47 ml/g y para la etapa de extracción de mangiferina se obtuvo un tiempo de extracción de
62 min, una relación disolvente/material vegetal de 49 ml/g y una concentración de etanol
del 46,8%.
4. Se comparó la eficiencia de las etapas de extracción de la fracción apolar y de mangiferina
para la mejor variante obtenida por ultrasonido y por microondas con el método de
extracción establecido en tanque agitado, demostrándose la eficiencia de las microondas
sobre ambos métodos, debido al ahorro de tiempo y consumo de disolventes, con lo que se
disminuye el impacto sobre el medio ambiente.
67
Recomendaciones
RECOMENDACIONES
1. Realizar un estudio de las diferentes variedades de Mangifera indica L. existentes en el
lugar de suministro para poder seleccionar la más adecuada para su utilización y
establecer el procedimiento apropiado para el proceso de extracción de mangiferina en
varias regiones del planeta.
2. Caracterizar, según normas internacionales, el extracto final de mangiferina obtenido
por ambos métodos, para un uso más diversificado.
68
Referencias bibliográficas
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Acosta J. (2013). Procedimiento de obtención de Mangiferina a partir de hojas y corteza de
Mangifera indica Linn. La Habana, Cuba.
Acosta J, Sevilla I, Salomón S, Nuevas L, Romero A, Amaro D. (2016). Determinación de
la solubilidad de la magiferina en diferentes disolventes usados en la industria
biofarmacéutica. J Pharm Pharmacogn Res. 4(2):50.
Agiomyrgianaki A, Petrakis P, Dais P. (2012). Influence of harvest year, cultivar and
geographical origin on Greek extra virgin olive oils composition: A study by NMR
spectroscopy and biometric analysis. Food Chem. 135:2561–2568.
Aiyelaagbe O and Osamudiamen P. (2009). Phytochemical Screening for Active
Compounds in Mangifera indica Leaves from Ibadan, Oyo State. Plant Sciences Research.
2(1):11-13.
Alupulu, A. (2012). Microwave Extraction of Active Principles from Medicinal Plants.
Science Bulletin B. 74 (2):1454-2331.
Apontes P, et al. (2014). Mangiferin stimulates carbohydrate oxidation and protects against
metabolic disorders induced by high-fat diets. Diabetes. 63:3626.
Arif M, Fareed S and Hussain S. (2011). Estimation of antioxidant activity of microwave
assisted extraction of total phenolics and flavonoids contents of the fruit Spondias
mangifera Willd.Asian Journal of Traditional Medicines. 6(4): 145-153.
Azmir J, Zaidul I, Rahman M, Sharif K, Mohamed A, Sahena F, Jahurul M, Ghafoor K,
Norulaini N, Omar A. (2013). Techniques for extraction of bioactive compounds from
plant materials: A review. Journal of Food Engineering. 117:426–436.
Azuola R, Vargas P. (2007). Extracción de sustancias asistida por ultrasonido (EAU).
Tecnología en Marcha. 20(4):30-40.
Bagherian H, Ashtiani FZ, Fouladitajar A, and Mohtashamy M. (2011). Comparisons
between Conventional, Microwave- and Ultrasound-Assisted Methods for Extraction of
Pectin from Grapefruit. Chemical Engineering and Processing. 50: 1237-43.
69
Referencias bibliográficas
Barreto JC, Trevisan MTS, Hull WE, Erben G, De Brito ES, Pfundstein B, Wurtele G,
Spiegelhalder B, and Owen RW. (2008). Characterization and Quantitation of
Polyphenolic Compounds in Bark, Kernel, Leaves, and Peel of Mango (Mangifera indica
L.). J Agric Food Chem. 56:5599-610.
Bart H, Pilz S. (2011). Industrial Scale Natural Products Extraction. Wiley-VCH Verlag &
Co. KGaA.
Benping Z, Jun F and Yan C. (2016). Antioxidant Effect of Mangiferin and its Potential to
be a Cancer Chemoprevention Agent. Letters in Drug Design & Discovery. 10(3).
Betancourt R. (2013). Extracción asistida por microondas de mangiferina a partir de hojas
de Mangifera indica L. y su comparación con el método de extracción en tanque agitado
Trabajo de diploma para optar por el título de ingeniero químico. La Habana: CUJAE.
Bhatia V, Ramnathan J, Sbshadri T. (1967). Constitution of mangiferin. Tetrahedron.
23:1363-8.
Bo T, Liu H. (2004). Separation methods for pharmacologically active xanthones. J.
Chromatogr. B. 812:165-74.
Brachet A, Christen P, Veuthey J. (2002). Focused microwave-assisted extraction of
cocaine and benzoylecgonine from coca leaves. Phytochemical Analysis. 13:162-9.
Bruneton J. (1999). Pharmacognosy and Phytochemistry of Medicinal Plants. Segunda
Edición, París: Editorial: Lavoisier Publishing, Unidades: 1-4.
Campa C and col. (2011). Process for the extraction of mangiferin and isomangiferin.
(Ird). Patent: US20110046077 A1.
Carvalho R, Justulin L, Felisbino S, Vilegas W, Bruni F. Lopes-Ferreira M, Hiruma-Lima
C. (2009). Effect of mangiferin on the development of periodontal disease: Involvement of
lipoxin A4, anti-chemotaxic action in leukocyte rolling. Chem Biol Interact. 179:344–50.
Castiñeira M. (2002). Control de Medicamentos 2.
Celli GB, Ghanem A, Brooks MSL. (2015). Optimization of ultrasound-assisted extraction
of anthocyanins from haskap berries (Lonicera caerulea L.) using Response Surface
Methodology. Ultrason. Sonochem. 27:449–455.
70
Referencias bibliográficas
Chan C, Yusoff R, Ngoh G, Kung F. (2011). Microwave-assisted extractions of active
ingredients from plants. Journal of Chromatography A. 1218:6213- 25.
Chemat F, and Cravotto G. (2013). Microwave-assisted extraction for bioactive
compounds. Theory and practice. Food Engineering Series. 238.
Chung-Hung C, Yusoff R, Gek-Cheng N, Wai-Lee F. (2011). Microwave-assisted
extractions of active ingredients from plants. Journal of Chromatography A. 1218:6213–
6225.
Craveiro A, Andrade C, Matos F, Alencar J, Machado M. (1980). Volatile constituents of
Mangifera indica Linn. Rev Latinoamer Quim. 11:129.
Cui HY, Murthy HN, Moh SH, Cui YY, Lee EJ, Paek KY. (2014). Comparison of
conventional and ultrasound-assisted methods for extraction of nutraceutical compounds
from Dendrobium candidum CyTA. J. Food. 12, 355–359.
Dean J. (2010). Extraction techniques in analytical sciences. Wiley, New York. 167–183.
DPN: (2005). Dictionary of Natural Products on CD-ROM. Chapman and Hall/CRC.
London,
UK:
Chemical
Book,
http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB8723435.htm.
Duke J, Atchlet A. (1986). Handbook of proximate analysis tables of higher plants. Boca
Raton, USA: CRC Press. 105.
Eberhardt T, Li X, Shupe T, Hse C. (2007). Chinese tallow tree (Sapium sebiferum)
utilization: characterization of extractives and cell-wall chemistry. Wood Fiber Sci.
39:319–324.
Ferguson P, Harding M, Young J. (2012). Green analytical chemistry. In: Zhang W, Cue B
(eds). Green techniques for organic synthesis and medicinal chemistry. Wiley, Chichester.
Ferreres F, Gil-Izquierdo A, Vinholes J, Grosso C, Valentão P, Andrade P. (2011).
Approach to the study of C-glycosyl flavones acylated with aliphatic and aromatic acids
from Spergularia rubra by high-performance liquid chromatography–photodiode array
detection/electrospray ionization multi-stage mass spectrometry. Rapid Commun. Mass
Spectrom. 25:700–712.
71
Referencias bibliográficas
Gallo M, Ferracane R, Graziani G, Ritieni A, Fogliano V. (2010). Microwave Assisted
Extraction of Phenolic Compounds from Four Different Spices. Molecules. 15:6365-74.
Ganzler K, Salgó A and Valkó K. (1986). Microwave extraction. A novel sample
preparation method for chromatography.J Chromatogr. 371:299-306
Gao M and Liu C. (2005). Comparison techniques for the extraction of flavonoides from
cultures cells of Saussurea medusa Maxim. World Journal of Microbiology &
Biotechnology. 21:1461-1463.
García D, Delgado R, Bougarne N, Haegeman G, Berghe WV. (2011). Gallic acid
indanone and mangiferin xanthone are strong determinants of immunosuppressive
antitumour effects of Mangifera indica L. bark in MDA-MB231 breast cancer cells.
Cancer letters. 305:21-31.
Gong X, Zhang L, Jiang R, Ye M, Yin X, Wan J. (2013). Anti-inflammatory effects of
mangiferin on sepsis-induced lung injury in mice via up-regulation of heme oxygenase-1.
J. Nutr. Biochem. 24(6):1173-1181.
González J, Domínguez M. (2009). Informe sobre la Gestión de la Información en Patentes
sobre Mangiferina.
Guevara M, González S, Álvarez A, Riaño A, Garrido G, Nuñez A. (2004). Uso
etnomédico de la corteza de Mangifera indica L. en Cuba. Revista Cubana Plant Med. 9:19.
Guha S, Ghosal S, Chattopadhyay U. (1996). Antitumor, inmunomodulatory and anti-HIV
effect of mangiferin, a naturally occurring glucosylxanthone. Chemother. Basel. 42:443.
Guo F, et al. (2011). Beneficial effects of mangiferin on hyperlipidemia in high-fat-fed
hamsters. Mol. Nutr. Food Res. 55, 1809.
Hemwimol S, Pavasant P, Shotipruk A. (2006). Ultrasound-assisted extraction of
anthraquinones from roots of Morinda citrifolia. Ultrasonics Sonochemistry. 13:543–548.
Hemwimon S., Pavasant P, and Shotipruk A. (2007). Microwave assisted extraction of
antioxidative arthraquinones from roots of Morinda citrifolia. Separation and Purification
Technology. 54, 44–50.
72
Referencias bibliográficas
Hsu M, Raung S, Tsao L, Lin C, Wang J. (1997). Examination of the inhibitory effect of
norathyriol in formylmethionyl-leucyl-phenylalanine induced respiratory burst in rat
neutrophils. Free RadicBiol Med. 23(132):1035-45.
Jain T, Jain V, Pandey R, Vyas A, Shukla S. (2009). Microwave assisted extraction for
phytoconstituents - An overview. Asian J Research Chem. 2(1).
Jianyong W, Lidong L, Foo-tim C. (2001). Ultasound-assisted extraction of ginseng from
ginseng roots and cultured ginseng cells. Ultrasonics Sonochemistry. 8.
Jin W, Yong-Ming Z, Chun-Yan G, Shao-Meng Z, Chun-Lei L, Dan-Shen Z, and Xue-Mei
B. (2012). Ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from Inulahelenium.
Pharmacognosy Magazine.
Jutiviboonsuk A and Sardsaengjun C. (2010). Mangiferin in Leaves of Three Thai Mango
(Mangifera indica L.) Varieties. IJPS. 6(3):122-129.
Kant S, Kumar V, Kumar Y, Sadish S, Kumar S. (2009). Phytochemical and
pharmacological investigations on mangiferin. Herba polonica. 55(1):126-139.
Khurana RK, Kaur R, Lohan S, Singh KK, Singh B. (2016). Mangiferin: a promising
anticancer bioactive.Pharm Pat Anal. 5(3):169-81.
Kimura I. (2006). Medical benefits of using natural compounds and their derivatives
having multiple pharmacological actions. Yakugaku Zasshi. 126:133-43.
Kullu J, Dutta A, Constales D, Chaudhuri S, Dutta D. (2013). Experimental and modeling
studies on microwave-assisted extraction of mangiferin from Curcuma amada. Biotech. 3.
Leiro J, Garcia D, Arranz JA, Delgado R, Sanmartin ML, Orallo F. (2004). An
Anacardiaceae preparation reduces the expression of inflammation-related genes in
murine macrophages. Int Immunopharmacol. 4:991-1003.
Letellier M and Budzinski H. (1999). Microwave assisted extraction of organic
compounds. Analusis. 27:259-71.
Li X, Ohtsuki T, Shindo S, y col. (2007). Mangiferin identified in a screening study guided
by neuraminidase inhibitory activity. Planta Médica. 1195-6.
73
Referencias bibliográficas
Lu W, Dan L, Changli B, Jingyan Y, Ziming W, Yuhua S, Hanqi Z. (2008). Ultrasonic
extraction and separation of anthraquinones from Rheum palmatum L. Ultrasonics
Sonochemistry. 15:738–746.
Lu Z, Mao H, He M, Lu S. (1982). Studies on the chemical constituents of mango
(Mangifera indica) leaf. Chung Ts’ao Yao. 13:3-6.
Luque M and Garcia L. (1998). Soxhlet extraction of solid matrices: an outdated technique
with a promising innovative future. Anal. Chim. Acta. 369:1-10.
Mandal V, Mohan Y, Hemalatha S. (2007). Microwave Assisted Extraction - An
Innovative and Promising Extraction Tool for Medicinal Plant Research. Pharmacognosy
Reviews. 1(1):7-18.
Massibo M, He Q. (2008). Major mango polyphenols and their potential significance to
human health. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 7:309–19.
Mohan G, Deepak M, Viswanatha L, Savinay G, Hanumantharaju V, Rajendra E, Praveen
H. (2013). Anti-oxidant and anti-inflammatory activity of leaf extracts and fractions of
Mangifera indica. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 311-4.
Mulet A, Carcel J, Bon J and San Juan N. (2003). New food drying technologies- Use of
ultrasound. Food Science and Technology International. 9(3):215-221.
Muruganandan S, Gupta S, Gupta P, Lal J. (2005). Effect of mangiferin on hyperglycemia
and atherogenicity in streptozotocin diabetic rats. J Ethnopharmacol. 97:497–501.
Napralert Database, Univ. Illinois, Chicago, USA. http://wwwag.uiuc.edu/ffh/narra.html
Suscripción en http://stneasy.cas.org. Fecha de consulta: 18 de Mayo 2010.
Njaneyulu V, Harischandra Prasad K, Sambasiva G, Indian J. (1982). Triterpenoids of the
leaves of Mangifera indica. Pharm Sci. 44:58-9.
Noratto G, Krenek K, Talcott S, Stringheta P, Mertens-Talcott S. (2010). Anticarcinogenic
effects of polyphenolics from mango (Mangifera indica) varieties. J Agric Food Chem.
58:4104–12.
74
Referencias bibliográficas
Nuevas L, Acosta J, Salomon S, Zumalacarregui B. (2012). Identification of components
presents in leaves from mango (Mangifera indica L.) used in Cuba as nutraceutical.
Memorias de evento Fraponatura. Revista Cubana de Farmacia. 46(2).
Pal P, Sinha K, Sil P. (2013). Mangiferin, a Natural Xanthone, Protects Murine Liver in
Pb(II) Induced Hepatic Damage and Cell Death via MAP Kinase, NF-κB and
Mitochondria Dependent Pathways. PLoS ONE. 8(2).
Palma M and Barroso C. (2001). Ultrasound assisted extraction and determination of
tartaric and malic acids from grapes and winemaking by-products. Analytica Chimica
Acta. 458:119-130.
Pérez JC. (2012). Extracción asistida por microondas de los lípidos de las semillas de
Cucurbita pepo L. Tesis en opción al título de Licenciado en Química. Universidad de La
Habana: Facultad de Química.
Pharm S, Phaim K. (1991). The extraction and determination of the flavanoidmangiferin in
the bark and leaves of Mangifera indica L. Tap Chi Duoc Hoc. 5:8-19.
Poole C. (1999). Planar chromatography at the turn of the century. J Chromatogr A.
856:399-427.
Prabhu S, Jainu M, Sabitha KE and Devi CS. (2006). Role of mangiferin on biochemical
alterations and antioxidant status in isoproterenol-induced myocardial infarction in rats. J.
Ethnopharmacol. 107:126.
Proctor J, Creasy L. (1969). The anthocyanin of the mango fruit. Phytochemistry. 8:2108.
Quesada I, Julcour C, Jáuregui U, Wilhelm A, Delmas H. (2009). Sonolysis of levodopa
and paracetamol in aqueous solutions. Ultrasonics Sonochemistry. 16:610-616.
Ribeiro S, Barbosa L, Queiroz J. (2008). Phenolic compounds and antioxidant capacity of
Brazilian mango (Mangifera indica L.) varieties. Food Chem. 110:620-626.
Romdhane M, Gourdon C, and Casamatta G. (1995). Local investigation of some
ultrasonic devices by means of a thermal sensor. Ultrasonics. 33:221–227.
Rostagno M, Palma M and Barroso C. (2003). Ultrasound-assisted extraction of soy
isoflavones. Journal of Chromatography A. 1012:119-128.
75
Referencias bibliográficas
Rostagno M, Palma M, Barroso G. (2007). Microwave assisted extraction of soy
isoflavones. Analytica Chimica Acta. 588:274–82.
Ruiz L, García MJ, Alonso B, Ramos L, Sanz ML. (2016). Extraction of bioactive
carbohydrates from artichoke (Cynara scolymus L.) external bracts using microwave
assisted extraction and pressurized liquid extraction. Food Chemistry. 196:1156-1162.
Sanghi R and Kannamkumarath S. (2004). Comparison of extraction methods by Soxhlet,
sonicator and microwave in the screening of pesticide residues from solid matrices. J.
Anal. Chem. 59(11):1032-36.
Sarduy Y. (2012). Trabajo de diploma para optar por el título de ingeniero químico.
Evaluación de etapas de extracción sólido-líquido para la obtención de mangiferina a partir
de hojas verdes de Mangifera indica L. La Habana: CUJAE.
Sato T, Kawamoto A, Tamura S, Tatsum Y, Fujii T. (1992). Mechanism of antioxidant
action of Pueraria glycoside (PG)-1 (an-isoflavonoid) and mangiferin (a xanthonoid).
Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49:721-4.
Shaft N, Ikram M. (1982). Quantitative survey of rutin-containing plants. Part 1. Int J.
Crude Drug Res. 20(4):183-6.
Sharapin N. (2000). Fundamentos de tecnología de productos fitoterapéuticos. Santa Fe de
Bogotá, DC, Colombia: Ed Roberto Pinzón. 27-60.
Schieber A, Berardini N and Carle R. (2003). Identification of flavonol and xanthone
glycosides from mango (Mangifera indica L.) peels by high-performance liquid
chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J Agric Food Chem.;
51(17):5006-11.
Swami S, Preet S, Longo G, Dutt D. (2008). Extraction technologies for medicinal and
aromatic plants. Trieste, Italy: United Nations Industrial Development Organization and
the International Centre for Science and High Technology.
Taamalli A, Arráez D, Barrajón E, Ruiz V, Pérez A, Herrero M, Ibañez E, Micol V,
Zarrouk M, Segura A, Fernández A. (2012). Use of advanced techniques for the extraction
76
Referencias bibliográficas
of phenolic compounds from Tunisian olive leaves: Phenolic composition and cytotoxicity
against human breast cancer cells. Food and chemical toxicology.
Tanaka T, Sueyasu T, Nonaka G, Nishioka I. (1984). Tannins and related compounds.
XXI. Isolation and characterization of galloyl and p-hydroxybenzoyl esters of
benzophenone and xanthone c-glucosides from Mangifera indica L. Chem Pharm Bull.
32(7):2676-86.
Tang-Bin Z, En-Qin X, Tai-Ping H, Ming-Yuan H, Qing J and Hua-Wen L. (2014).
Ultrasound-Assisted Extraction of Mangiferin from Mango (Mangifera indica L.) leaves
using Response Surface Methodology. Molecules.19:1411-1421.
Tao Y, Wu D, Zhang Q, Sun D. (2014). Ultrasound-assisted extraction of phenolics from
wine lees: modeling, optimization and stability of extracts during storage. Ultrason
Sonochem. 21(2):706-15.
Toma M, Vinatoru M, Panikwnyk L, Mason TJ. (2007). Investigation of the effects of
ultrasound on vegetal tissues during solvent extraction. Ultrasonics Sonochemistry. 8:137142.
Tsukuk A, Santos Júnior H, Oigman S, de Souza R, Bizzo H, Rezende C. (2014).
Microwave-assisted extraction of green coffee oil and quantification of diterpenes by
HPLC. Food Chemistry. 164:266–271.
Valdés M, Germán A. (2008). Estudio de mercado de la mangiferina. 1-74.
Venkatesh P, Soumya V, Hariprasath K, Prasad R. (2010). Microwave assisted extraction
of Mangiferin from Mangifera indica L. IRJP. 1(1):209-12.
Vilkhu K, Mawson R, Simons L, Bates D. (2008). Applications and opportunities for
ultrasound assisted extraction in the food industry — A review. Innovative Food Science
and Emerging Technologies. 9:161–9.
Vinatoru M. (2001). An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive
principles from herbs. Ultrasonics Sonochemistry. 8:303-13.
Wang L and Weller C. (2006). Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants.
Trends Food Sci. Technol. 17:300-12.
77
Referencias bibliográficas
Wauthoz N, Balde A, Balde S, Van Damme M, Duez P. (2007). Ethnopharmacology of
Mangifera indica L. Bark and Pharmacological Studies of its Main C-Glucosyl xanthone,
Mangiferin. International Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences Global
Science Books. 116.
Yang Y, Zhang F. (2008). Ultrasound assisted extraction of rutin and quercetin from
Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. Ultrasonics Sonochemistry. 15:308-13.
Yang X, Dai J, Rui G, Tang J, Chen X. (2006). Study on ultrasonic extraction techniques
of mangiferin in Anemarrhena asphodeloides Bge. Food Science and Technology. 3.
Zhang F, Yang Y, Su P, Guob Z. (2009). Microwave-assisted Extraction of Rutin and
Quercetin from the Stalks of Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. Phytochem. Anal. 20:33–7.
Zhao L y col. (2012). Ultrasound-Assisted Extraction of Syringin from the Bark of Ilex
rotunda Thumb Using Response Surface Methodology. Int J Mol Sci.; 13:7607-16.
Zhou B, Zhong-Li L. (2005). Bioantioxidants: From Chemistry to Biology. Pure Apply
Chemistry. 77:1887-03.
Zhu X y col. (1993). Antiviral activity of mangiferin against herpes simplex virus type 2 in
vitro. Zhongguo yao li xue bao. 14(5):452-4.
Zou Y, Xie C, Fan G, Gu Z, Han Y. (2010). Optimization of ultrasound-assisted extraction
of melanin from Auricularia auricula fruit bodies. Innov. Food Sci. Emerg.Technol.
11:611–615.
78
Anexos
ANEXOS
Anexo 1. Equipos más comúnmente empleados en la EAU
Anexos
Anexo 2. Horno de microondas doméstico modificado SANYO EM-T109SS
Anexo 3. Baño ultrasónico Sakura US-5E
Anexos
Anexo 4. Principales compuestos identificados en la fracción de n-hexano
Pico
Nombre Compuesto
Pico
Nombre Compuesto
1
Octanal
31
3-Metildibenzotiofeno
2
Dodecanal
32
Metil 13Metilpentadecanoato
3-5
Hidrocarburos saturados
33
Metil 2Metilhexadecanoato
6
2-Butiloctanol
34
3-Eicoseno
7
Pentametilheptilbenceno
35
Hidrocarburo insaturado
8
-Elemeno
36
Metil 10-Octadecenoato
9
-Selineno
37-38
Hidrocarburos saturados
10
-Guaieno
39
Metil 2-Oxohexadecanoato
11
Aromandreno
40
N-fenil-1-naftalenamina
12
-Elemeno
41
Desconocido
13
Bulnesol
42
Esqualeno
14
1-Etildecilbenceno
43
Desconocido
15
Hidrocarburo saturado
44
3-Campesterol
16
Alquilbenceno
45
3,5-4,4-dimetilcolesta8,14-dien-3-ol acetato
17
Ledol
46
Desconocido
18
Alquilbenceno
47
-Sitosterol
19
Hinesol
48
Terpenoide Pentacíclico
(Amirina o Oleaneno)
20-25 Alquilbencenos
49
-Amirina
26
Espatulenol
50
D:C-Friedoolean-3-ona
( Multifluorenona )
27
Nootkatona
51
Cicloartano-3 ,25-diol
28
3,8-Dimetil-4-(1metilideno)-(8S-cis)2,4,6,7,8,8-hexahidro5(1H)-azulenono
52
4-Estigmasten-3-ona
29
1-Octadecenoato
53
24-Metilencicloartanol
30
Hidrocarburo saturado
Anexos
Anexo 5. Principales compuestos identificados en la fracción de acetato de etilo
Pico
Componente
1
Ácido hexanoico
2
1,1-Etoxipropoxiethano
3
-Chamigreno
4
Sesquiterpenoide Oxigenado, C15H24O
5
-Selineno
6
-Eudesmol
7
2,5-Dihidroxi--metilfenetil alcohol
8
Derivado del Naftalenometanol (sesquiterpenoide oxigenado, C15H26O)
9
N-fenil-2-naftalenamina
10
Hidrocarburo saturado ramificado
Anexos
Anexo 6. Principales compuestos identificados en el extracto metanólico y espectros UV y
de masa de primer y segundo orden obtenidos
Compuesto
Monogaloil
glucosa
(1)
Tiempo
de
retención
(min)
3,58
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
230
Espectros de masa de
segundo orden
271
331
265
250
Wavelength (nm)
ácido gálico
(2)
4,33
300
80
211 241
169
169
160
240
150
320
200
m/z
m/z
270
250
125
169
230
169
125
100
100
124
125.0
150
300
350
Wavelength (nm)
400
100
200
300
400
m/z
600
463
350
400
445
301
500
373
403
137
171
315
343
260
250
125.5
m/z
m/z
365
168
450
m/z
475
493
400
160
126
113
125
300
350
Wavelength (nm)
144 152
m/z
583
250
6,66
136
125
230
265
Desconocido
(4)
128
150
m/z
161
6,27
300
373
423
ácido fenólico
(3)
250
Wavelength (nm)
171
200
500
550
Anexos
295
230
300 400
m/z
320
400
200
250
250
15,04
300
350
Wavelength (nm)
400
100
150
200
m/z
230.0
250
289.2
370.0
250
150
300
565.2
260.0
300
350
Wavelength (nm)
544.6
91.0
471.2
158.8 402.9
100
200
300 400
m/z
500
407
350
205
179
137
151
365
245
137
159
280
Desconocido
(9)
300
m/z
400
245
320
235
315
480
317
329
159
179
207
243
240
m/z
400
m/z
289
14,37
160
152
285
313
327
333
405
423
439
240
290
300
350
Wavelength (nm)
144
303
500
261
193
407
285
303
200
235
113
Catequina
(8)
128 136
m/z
287
100
300
350
Wavelength (nm)
250
120
407
12,82
112
150
m/z
285
230
250
Iriflofenona 3-C-ß-Dglucósido
(7)
153
100
200
m/z
289
400
113
137
159
11,92
300
350
Wavelength (nm)
575
250
Maclurina 3-(2galoil)-ß-D-glucósido
(6)
109
153
260
Espectros de masa de
segundo orden
287
317
ácido 3,4
dihidroxibenzoico
(5)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
109
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
8,27
250
445.1
415.1
385.1
343.2
331.1
300
350
565.1
475.0
487.2
400
450
m/z
500
550
Anexos
100
120
151
105
140
160
110
120
130
m/z
m/z
255
140
150
331
301
17,80
300
350
Wavelength (nm)
421
250
310
137
275
Mangiferina
(11)
Espectros de masa de
segundo orden
151
235
109
113
Desconocido
(10)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
91
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
17,31
240
160
240 320
m/z
400
235
360
50
300
350
Wavelength (nm)
100
150
200
m/z
250
300
331
301
160
240
300
350
Wavelength (nm)
160
240
320
m/z
400
315
272
287
315
400
320
272
287
320
360
350
m/z
260
250
250 300
m/z
435
250
137
159
315
19,69
200
179
205
275
Homomangiferina
(14)
150
400
435
80
289
400
250
345
300
350
Wavelength (nm)
400
245
19,30
350
m/z
289
250
300
400
255.0
310.0
355.0
Epicatequina
(13)
259
271
320
m/z
207
235.0
160
405
18,90
400
301
Isomangiferina
(12)
300
350
Wavelength (nm)
421
250
272
301
331
365
403
320
300
350
m/z
400
Anexos
250
150
200
300
573
400
500
200
300 400
m/z
421
259
283
301
331
240
500
400
100
200
300 400
m/z
500
327
175
421
573
405
300
350
Wavelength (nm)
285
159
365
400
480
m/z
235
260
280
320
320
285
100
600
m/z
403
421
435
283
301
331
400
250
421
600
543
300
350
Wavelength (nm)
261.0
m/z
400
m/z
365
381
410
311
106.9
260
250
168.8
218.0
199.1
403
200
400
400
240
320
m/z
387
405
300
350
Wavelength (nm)
350
151.0
320
21,59
300
m/z
342
158
179
479
375
317
329
150 200
m/z
250
573
20,98
200
403
260
280
320
250
Isómero de posición del
6’-O-galoil-mangiferina
(19)
100
400
235
250
480
693
20,79
400
261.2
151.1
158.7
181.2
249.0
196.4
132.8
109.4
91.0
300
350
Wavelength (nm)
320
m/z
365
Isómero de posición del
6’-O-galoil-2’-benzoilmangiferina
(18)
240
285
250
6’-O-galoil-2’-benzoilmangiferina
(17)
160
303
235
80
260
20,34
400
91
Maclurina
(16)
300
350
Wavelength (nm)
301
331
250
207
113
91
325
259
269
287
280
Espectros de masa de
segundo orden
449
261
235
159
Flavona o Isoflavona
(15)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
301
405
421
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
20,14
400
480
Anexos
100
200
300 400
m/z
421
403
283
301
331
320
400
480
m/z
260
80
400
80
160
400
80
160
160
240
m/z
320
400
300 350
Wavelength (nm)
240 320
m/z
300
m/z
400
300
260
350
350
m/z
421
235
250
400
400
331
365
389
331
260
320
22,61
200
301
235
250
150
331
400
259
22,50
300
350
Wavelength (nm)
421
250
259
271
301
331
365
Derivado de la mangiferina
(23)
240
235
320
Derivado de la mangiferina
(22)
500
331
400
301
22,20
300
350
Wavelength (nm)
421
250
259
360
Derivado de la mangiferina
(21)
573
421
235
260
280
320
Espectros de masa de
segundo orden
301
331
389
389
Isómero de posición del
6’-O-galoil-mangiferina
(20)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
137
159
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
21,95
250
300
350
Wavelength (nm)
400
200
259
271
403
301
400
259
331
290
350
m/z
301
260
300
400
573
22,85
240
320
m/z
169
272
283
301
331
Isómero de posición del
6’-O-galoil-mangiferina
(24)
300 350
Wavelength (nm)
421
250
271
360
331
320
400
600
m/z
800
250
300
350
m/z
400
Anexos
200
403
806
271
400
400
600
800
300
m/z
250
300
240
400
200
320
400
m/z
480
560
211
241
169
403
421
271
301
331
400
400
240
320
m/z
400
255
403
403
24,73
300
350
Wavelength (nm)
350
m/z
275
320
250
373
403
800
343
806
600
260
360
Derivado de la mangiferina
(28)
400
m/z
453
200
271
400
573
24,30
300
350
Wavelength (nm)
271
355
259
271
285
301
313
320
6´-O-galoilisomangiferina
(27)
400
403
421
255
250
350
m/z
301
331
23,98
300
350
Wavelength (nm)
403
250
259
271
285
301
311
313
320
373
255
360
Derivado de la mangiferina
(26)
Espectros de masa de
segundo orden
403
Derivado de la mangiferina
(25)
Espectros de masa
de primer orden
Espectros UV
421
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
23,62
300
600
350
400
m/z
403
255
320
360
250
300
350
Wavelength (nm)
400
200
400
600
m/z
800
259
271
285
301
311
24,90
400
m/z
807
Derivado de la mangiferina
(29)
300
350
Wavelength (nm)
403
250
807
360
259
271
285
301
311
320
250
300
m/z
350
400
Anexos
80
160
320
240
400
100
200
300 400
m/z
500
400
80
160
240 320
m/z
400
403
283
400
m/z
480
259
271
320
160
240
320 400
m/z
80
160
240 320
m/z
560
300
350
m/z
400
300
350
Wavelength (nm)
400
400
373
360
313
271
301
255
275
320
259
271
235
250
480
403
400
403
300
350
Wavelength (nm)
400
331
343
359
367
385
403
421
360
259
269
285
299
403
315
350
x 10
313
260
26,55
300
m/z
235
250
250
541
26,10
300
350
Wavelength (nm)
313
331
343
260
250
isómeros de posición de la
phidroxibenzoilmangiferina
(34)
320
403
235
360
isómeros de posición de la
phidroxibenzoilmangiferina
(33)
385
300
350
Wavelength (nm)
400
403
250
320
m/z
301
331
245
283
360
445
160
235
260
25,74
400
m/z
310
isómeros de posición de la
phidroxibenzoilmangiferina
(32)
240
150
171
193
205
216
231
282
297
325
400
541
25,50
300 350
Wavelength (nm)
x 10
389
421
355
Espectros de masa de
segundo orden
421
265
320
250
Flavonoles o flavonas
(31)
403
445
235
301
isómeros de posición de la
phidroxibenzoilmangiferina
(30)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
389
403
421
435
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
25,19
300
350
m/z
400
Anexos
417
260
100
200
300 400
m/z
160
240
m/z
300
500
350
235
255
400
80
250
300
m/z
350
350
m/z
400
200
300
m/z
500
300
400
500
275
100
260
280
320
360
250
300
350
Wavelength (nm)
100
150
200
m/z
250
300
250
350
m/z
x 10
109
121
139
235
109
113
137
159
165
28,39
400
150
400
x 10
165
159
365
300
350
Wavelength (nm)
301
260
315
403
269
283
250
343
367
385
403
421
300 400
m/z
235
250
400
207
200
301
100
239
283
301
400
541
28,08
300
350
Wavelength (nm)
403
421
x5
250
Desconocido
(39)
200
400
260
325
isómeros de posición de la
phidroxibenzoilmangiferina
(38)
320
275
235
500
541
27,77
300 350
Wavelength (nm)
403
419
Flavanona o isoflavona
(37)
450
259
271
285
313
360
191
272
320
250
400
m/z
403
400
343
27,53
300
350
Wavelength (nm)
403
250
297
360
541
159
305
Flavonoles o flavonas
(36)
Espectros de masa de
segundo orden
555
235
403
417
Flavonoles o flavonas
(35)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
249
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
26,82
200
m/z
250
Anexos
400
80
320
150
200
403
373
331
240
320
m/z
400
320
400
150
250 300
m/z
300 350
Wavelength (nm)
400
80
160
320
240
m/z
320
283
207
148
165
313
259
240
m/z
200
400
250
300
403
350
350
m/z
235
313
403
250
137
159
360
231
259
273
235
331
219
231
259
269
283
200
403
240
m/z
313
160
309
325
331
80
403
400
121
139
165
331
137
300
350
Wavelength (nm)
403
421
301
500
367
300 400
m/z
367
200
260
305
250
300
350
Wavelength (nm)
80
160
400
200
250
300
m/z
350
403
355
367
191
205
219
231
254
269
283
163
317
305
137
31,10
350
313
100
164
181
192
207
175
207
300
350
Wavelength (nm)
235
250
Flavanona o isoflavona
(44)
300
m/z
290
30,63
250
403
250
Flavonoles o flavonas
(43)
299
313
331
259
139
400
x 10
310
30,27
240
m/z
240
270
Flavanona o isoflavona
(42)
160
301
29,09
300
350
Wavelength (nm)
541
250
219
235
165
260
275
310
271
240
360
Desconocido
(41)
Espectros de masa de
segundo orden
403
Desconocido
(40)
Espectros de masa
de primer orden
Espectros UV
301
317
331
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
28,98
Anexos
Espectros de masa de
segundo orden
255
235
x 10
259
Noratriol
(45)
Espectros de masa
de primer orden
Espectros UV
259
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
31,40
32,70
400
100
200
300
m/z
400
80
160
240
m/z
500
200
231
220
m/z
240
367
Flavonoles o flavonas
(46)
300
350
Wavelength (nm)
367
250
216
360
187
519
315
235
100
349
258
308
323
350
165
300
m/z
400
500
259
100
150
200
250
m/z
300 350
Wavelength (nm)
400
100
200
m/z
250
301
300
150
257
273
151
259
151
179
150
200
m/z
250
160
250
300
Wavelength (nm)
350
240
m/z
320
150
205
215
173
139
280
247
113
137
147
159
181
x 10
200
250
m/z
367
235
248
273
34,44
247
367
250
113
370
179
235
255
Desconocido
(49)
217
192
151
327
200
300
301
33,81
250
m/z
150
290
235
250
300
350
Wavelength (nm)
Desconocido
(48)
200
320
121
33,52
165
Flavanona o isoflavona
(47)
300
350
Wavelength (nm)
259
250
360
519
320
258
260
300
350
Anexos
150
200
250 300
m/z
385
281
291
309
313
325
231
453
400
131
157
175
203
219
385
421
291
240 320
m/z
235
350
x 10
250
m/z
300
350
200
315
250
300
Wavelength (nm)
360
350
100
150
200
m/z
250
350
258
231
255
300
x 10
202
235
250
m/z
339
231
247
258
272
298
150
220
240
m/z
260
273
200
258
41,74
150
273
250
300
350
Wavelength (nm)
151
360
109
320
258
271
275
Desconocido
(52)
160
367
37,44
80
300
350
Wavelength (nm)
229
Flavonoles o flavonas
(51)
Espectros de masa de
segundo orden
367
250
355
219
260
305
113
137
159
235
113
137
159
Flavonoles o flavonas
(50)
Espectros de masa de
primer orden
Espectros UV
113
137
159
Compuesto
Tiempo
de
retención
(min)
35,01