descargar - Facultad de Ciencias Veterinarias

Departamento de Microbiología
FCV- UNA
MATERIALES DEL LABORATORIO
Erlenmeyer
Probetas
Placas de petri
Portaobjetos/cubreobjetos Vaso Beaker Tubo de ensayo con gradilllas Pipetas graduadas
Pipetas automáticas
Hisopos
Horno de pasteur
Tips
Eppendorf o microtubos Guantes descartables
Mechero de bunsen Balanza Eléctrica digital Ansa bacteriológica
Autoclave
Heladera
1
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
CLASE PRÁCTICA 1
EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
El laboratorio de microbiología montado posee características especiales que lo
distingue de otros tipos como el laboratorio de química, física, parasitológica,
anatomopatológica, etc. Puede estar organizado para realizar varias funciones o bien ser
altamente especializado, dependiendo esto de su equipamiento humano y material. El
laboratorio de microbiología esta equipado para cumplir con los fines de la universidad a
saber:
1- Docencia
2- Investigación
3- Diagnostico
4- Extensión Universitaria
-
1- Ubicación: En lo posible aislado de otras dependencias para evitar la difusión del material
que se manipula. Evitar las personas ajenas al servicio.
2- Las aguas servidas: Deben ser sometidas a tratamiento antes de ser eliminados. Las
personas que entran en el área restringida deben tener cuidado o tomar ciertas precauciones
para evitar sacar materiales contaminantes o introducirlos dentro del laboratorio.
3- Área Física: a-) Área sucia: donde se realiza el manipuleo de las muestras, donde queda
el material, se procede a desinfección y autoclavado de todos los materiales.
b-) Área limpia: Una vez autoclavado, se lava y se esteriliza, queda listo para su uso.
Equipos:
- Vidriería: Vaso Beaker - Erlenmeyer - Tubos de distintas medidas, pipetas, placas
de petri.
- Aparatos: Como autoclave, Horno de Pasteur.
- Estufas: A temperaturas variadas.
- Heladeras: Para guardar drogas y muestras.
- Centrífuga: Para centrifugar sangre, orina, etc.
- Microscopio: Imprescindible en el laboratorio.
- Baño María.
Mechero de Bunzen: A gas.
Conducta personal y de grupo.
Los trabajos de laboratorio de los estudiantes exige el cumplimiento de un conjunto de
reglas de conducta, tanto personal como de grupo para asegurar un cierto orden.
Citamos las reglas de Salle: Fundamentales principios de bacteriología, rogando su
estricto cumplimiento.
1) No depositar prendas personales sobre la mesa de trabajo.
2) Entrar en el laboratorio con guardapolvo, para proteger la ropa de la calle y contra
posibles contaminaciones.
3) No traer comida ni comer en el laboratorio. Aprenda a no colocar en la boca lápices ni
útiles de laboratorio.
4) Humedecer los rótulos con agua y no con la lengua.
5) Observar el mayor cuidado posible en el uso de aparatos y equipos de laboratorio.
6) El ansa de platino debe ser esterilizado antes y después de su uso.
7) No fumar.
8) Apagar teléfono celular – radio.
9) No tomar tereré, mate, etc.
2
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
CLASE PRÁCTICA 2
MICROSPCOPIA
Microscopio Óptico: consta de varios sistemas:
 Sistema de soporte: - Pie
- Brazo o vástago
- Revolver
- Platina
- Carro
 Sistema de iluminación: - Fuente de iluminación
- Espejo (para luz externa)
- Condensador (de campo claro, de campo oscuro, de
contraste)
- Diafragma
- Filtros (azules, excitadores, frenadores, atenuadores del
rojo)
 Sistema óptico:
- Lentes objetivos
- Lentes oculares )mono y binoculares)
- Prismas (para los binoculares)
 Sistema de ajuste o enfoque: - Macrométrico
- Micrométrico
3
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
 Tipos de microscopio
- Microscopio compuesto es un aparato óptico hecho para agrandar objetos, consiste en un
número de lentes formando la imagen por lentes o una combinación de lentes posicionados
cerca del objeto, proyectándolo hacia los lentes oculares u el ocular. El microscopio
compuesto es el tipo de microscopio más utilizado.
- Microscopio óptico también llamado "microscopio liviano", es un tipo de microscopio
compuesto que utiliza una combinación de lentes agrandando las imágenes de pequeños
objetos. Los microscopios ópticos son antiguos y simples de utilizar y fabricar
- Microscopio digital tiene una cámara CCD adjunta y esta conectada a un LCD, o a una
pantalla de computadora. Un microscopio digital usualmente no tiene ocular para ver los
objetos directamente. El tipo triocular de los microscopios digitales tienen la posibilidad de
montar una cámara, que será un microscopio USB.
- Microscopio fluorescente o "microscopio epi-fluorescente" es un tipo especial de
microscopio liviano, que en vez de tener un reflejo liviano y una absorción utiliza
fluorescencia y fosforescencia para ver las pruebas y sus propiedades.
- Microscopio electrónico es uno de los más avanzados e importantes tipos de microscopios
con la capacidad más alta de magnificación. En los microscopios de electrones los electrones
son utilizados para iluminar las partículas más pequeñas. El microscopio de electrón es una
herramienta mucho más poderosa en comparación a los comúnmente utilizados microscopios
livianos.
4
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
CLASE PRACTICA 3
COMPORTAMIENTOS DE LAS BACTERIAS ANTE AGENTES FÍSICOS Y
QUÍMICOS
A) Agentes físicos
1) Temperatura: El calor actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la
célula y fragmentando las membranas celulares. El tiempo requerido para la esterilización esta
universalmente relacionado con la temperatura de exposición.
Hay parámetros que pueden ser usados para indicar el grado de resistencia al calor que tienen
los microorganismos:
-
El punto térmico letal es la temperatura más baja en la cual muere una población
bacteriana en determinado tiempo.
El tiempo térmico letal es el menor tiempo necesario para matar el 100% de una
población de microorganismos a determinada temperatura bajo condiciones
específicas del medio.
 Calor seco: - Calor directo: flameado de la llama del.
- Incineración: se emplea para destruir cadáveres y materiales de desechos.
 Calor húmedo:- Con presión: el autoclave utilizado a 1.5 atmósferas de presión, a 121
° C durante 15 a 30 min., con este método la mayoría de las formas vivientes mueren
incluyendo sus esporas.
- Sin presión: Ebullición alcanza una temperatura de 100 ° C, la cual
destruye en unos 10 min. las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias y
muchos virus. Las esporas y ciertos virus, como el de la hepatitis humana o el de la
AIE no son inactivados.
- Tindalización: consiste en tres calentamientos de 60-80 °C durante 30
min., separado por dos incubaciones a 37 °C durante 24 Horas. Se emplea sobre
elementos en los cuales la alta temperatura puede alterar sus propiedades, por ejemplo:
hidratos de carbono o leche pasteurización.
Las bajas temperaturas no son nocivas para los gérmenes si es que se aplican en forma lenta
y gradual (1°C x min.), sirve incluso para conservar con vida a la bacteria.
2) Humedad y desecación: las bacterias responden de distintas maneras a la humedad, por
ejemplo los estreptococos requieren de humedad, en cambio los bacilos tuberculosos prefieren
medios secos. La desecación: el aire seco produce la muerte de la mayoría de las bacterias,
por el contrario las esporas resisten por largos periodos incluso años. Ej. Bacillus antracis
3) Presión y vacío: la acción del vacío esta relacionada con el frío o la congelación a muy
bajas temperaturas, (liofilización). El vacío por si solo ejerce muy poca o nula acción sobre
los microbios.
4) Luz: La energía se trasmite a través del espacio por las radiaciones (una de sus formas).
Dentro de estas se encuentran las electromagnéticas de alta energía o ionizantes: comprende
los rayos alfa, beta, gama y roentgen (rayos X). Radiaciones no ionizantes: comprenden a las
radiaciones ultravioletas (UV) e infrarrojas (IR)
5
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
5) Sonidos: La acción letal de los ultrasonidos se debe al fenómeno de cavitación (formación
de burbujas de aire dentro del citoplasma) que lleva a la desintegración del microorganismo
por ruptura de su pared, liberando los antigenos, enzimas, etc.
6) Electricidad: carecen de acción bacteriana, tanto la corriente de tipo continua como la
alterna, sean de bajo, medio o alto voltaje. Solamente son letales cuando engendran calor por
otros motivos.
B) Agentes Químicos
1) Concentración salina, sales: Hay sales nocivas y también sales útiles y necesarias para el
crecimiento bacteriano, la mayoría de las bacterias precisan del Cloruro de Na, para poder
germinar. Las sales bactericidas son las que tienen metales pesados como las de Mercurio y
Plata, que tienen eficacia germicida hasta en dosis de una parte por millón.
2) Ácidos y bases: el elevado poder bactericida de los ácidos y bases, esta relacionada con el
grado de disociación de los mismos, la acción germicida de los ácidos inorgánicos, difiere
algo una del otro, pero son mas eficaces que los ácidos orgánicos. En cuanto a los álcalis, el
ión metálico tiene de por si acción intensa. Los ácidos y álcalis se usan en la limpieza y
desinfección de vidriería del laboratorio.
3) Iones Metálicos: las sales de Hg y Ag desnaturalizan las proteínas en concentración altas
pero son perjudiciales para los tejidos humanos. se emplean en concentraciones bajas, en estas
condiciones actúan combinándose con los grupos sulfhídricos. El Hg se pude emplear con
seguridad para uso externo
4) Detergentes y Compuestos cuaternarios: los detergentes actúan desorganizando la
función normal de las células. Estos detergentes llamados también tensio-activos, actúan
sobre la tensión superficial en los que se disuelven disminuyéndolas debido a que poseen un
grupo hidrófilo y otro lipófilo. Según su carga eléctrica pueden ser:
- Aniónicos (jabón natural, sales biliares)
- Catiónicos, siendo estos derivados del amonio cuaternario y los que tienen poder
bactericidas.
5) Halógenos: se encuentra el yodo, que se usa en solución alcohólicas al 10% (tintura de
yodo) y combinado con detergente y sustancias orgánicas y el cloro empleado en forma de
cloruro gaseoso bióxido hipoclorito y cloraminas. Para desinfección pueden usarse el agua
oxigenada, permanganato de K, la tintura de yodo y la povidona yodada.
6) Alcoholes: el alcohol etílico es coagulante y deshidratante, su mayor poder bactericida lo
tiene entre el 60 a 80 %.
7) Aldehídos: los dos aldehídos mas usados son el aldehido fórmico o formol y el aldehído
glutárico o glutaraldehido, el formol con acción coagulante sobre las proteínas se presenta en
solución acuosa al 40 % (formalina), al 10% se lo utiliza para el embalsamiento de cadáveres
y en conservación a piezas histológicas (fijación). El glutaraldehido en solución al 2% es
activo contra bacterias, esporas, virus y ciertos hongos, usándose para desinfección de equipo
de endoscopia, guantes e instrumentos que no aguantan la esterilización por calor.
8) Fenoles y Cresoles: el fenol es de acción coagulante, muy bactericida en solución del 1-2
%, como derivados del fenol, se tienen el hexaclorofeno con menor toxicidad y mayor
6
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
causticidad y los cresoles que son derivados metálicos y pueden usarse también en la
desinfección de la piel. La clorhexidina por ser muy activa, poco toxica, de acción rápida en
segundos y efectos residual prolongado es muy usada en cirugía para lavado de manos.
 Características del desinfectante
1 Poder germicida: el desinfectante debe poseer un elevado poder germicida, esto es debe
“matar a las bacterias en soluciones muy diluidas”.
2 Estabilidad: para que un desinfectante sea relativamente útil debe ser relativamente “estable
en presencia de materia orgánica”. Algunos de los desinfectantes más activos se combinan
con la materia orgánica formando compuestos insolubles y precipitándose casi totalmente, por
ello su actividad puede disminuir rápidamente hasta el punto de no ser letal para los
microorganismos.
3 Homogeneidad: los desinfectantes deben ser de composición homogénea. Las sustancias que
se compran pura o cristalizadas son ideales desde este punto de vista.
4 Solubilidad: El desinfectante ideal seria el que “se disolviera en todas las proporciones
posibles en el agua”. Ej. Alcohol.
5 Atoxicidad para seres superiores: El desinfectante ideal no debe ser toxico para el hombre y
animales superiores. La mayor parte de los desinfectantes eficaces son algo nocivo para los
tejidos.
6 Falta de acción corrosiva: Teniendo en cuenta que los desinfectantes frecuentemente se ponen
en contacto con metales, tejidos y otros productos es de desear que no los atasquen, tiñan ni
dañen.
7 Penetración: Los desinfectantes difieren mucho en su poder de penetración en los productos a
esterilizar. El desinfectante ideal debe penetrar rápida y eficazmente.
8 Economía: El desinfectante ideal debe ser barato, pero el precio no puede juzgarse por el
volumen, sino por su efecto letal. Un desinfectante puede ser más caro que otro por unidad de
volumen, pero puede tener el doble de poder germicida.
9 Poder de eliminación de suciedad y grasa: Una fina capa de aceite o grasa sobre la superficie a
desinfectar puede anular totalmente la acción de ciertos desinfectantes. Naturalmente las que
son capaces de eliminar la suciedad y las grasas de todas clases son mucho más eficaces.
10 Poder desodorante: El desodorante capas de combinarse y destruir las sustancias malolientes,
es preferible a otro que no tiene estas propiedades con tal que no tenga olor desagradable.
CLASE PRÁCTICA 4
MEDIOS DE CULTIVO
Se entiende por medio de cultivo a una sustancia o conjunto de sustancias que reúnan
las condiciones que permitan la multiplicación in vitro de las bacterias que allí se siembran.
7
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
Los microorganismos en crecimiento se multiplican, y por lo tanto requieren
nutrientes. Entre las finalidades de un medio de cultivo se incluyen: 1) el aislamiento de
microorganismos en colonias puras, 2) el estudio de características culturales, 3) el estudio de
actividades metabólicas, 4) la preparación de vacunas y antígenos, 5) la conservación de cepas
bacterianas en colección, 6) la obtención de grandes masas microbianas para estudios físicos y
químicos, 7) la obtención de bacterias con fines industriales (preparación de productos
lácteos, vitivinícolas, antibióticos, enzimáticos y ensilajes).
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
A) Según su estado físico (consistencia)
1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón
caldos. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión
bacteriana de una determinada concentración.
2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente
gelificante (agar). Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos medios
inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas
colonias.
3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un
agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus
usos es la investigación de la movilidad de las bacterias
B) Según su utilización
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio
más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común y otros el agar tripticasa de soja,
el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas
normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de
microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros
productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores o es
posible añadir suplementos artificiales.
3) Medios selectivos: El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el
crecimiento de una población microbiana específica.
8
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
4) Medios inhibidores: Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de
sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una
población determinada. Un ejemplo de medio inhibidor es el MacConkey que permite el
crecimiento de las bacterias Gram negativas e impide el crecimiento de las Gram positivas.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que
ayuden a diferenciar géneros o especies de bacterias. Ej. El medio MacConkey es un medio
diferencial porque permite distinguir las bacterias que fermentan la lactosa de aquellos que no
lo hacen.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden
sembrarse inmediatamente. Su utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se
obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Ejemplo típico de este
grupo es el Medio de Stuart.
1. Medios comunes
2. Enriquecimiento 3. Selectivos
5. Diferenciales
PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Materiales:
- Mechero
- 1 agitador
- 1 erlenmeyer de 500 mL
- 1 balanza
- 1 espátula
- 1 probeta de 250 mL
- 10 cajas placas de Petri estériles desechables
- Papel aluminio
- Pincel
- Trapo
- Reactivos para el medio de cultivo
Equipo
- Autoclave
Procedimiento:
1. Pesar los reactivos necesarios para preparar 250 mL de medio. Colocarlos en el matraz.
2. Con la probeta, medir 250 mL de agua destilada y añadirla al erlenmeyer con el polvo.
3. Tapar el erlenmeyer con pedazo de aluminio y colocarlo sobre el agitador.
4. Cuando la solución esté homogénea, retirarla del agitador.
9
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
5. El autoclave estará prendido previamente por la profesora. Con su ayuda, introducir el
erlenmeyer en el interior de la autoclave. Cerrarla siguiendo las indicaciones de la Profesora.
6. Una vez que empiece a salir vapor, cerrar la válvula del autoclave, para que la presión
comience a subir. Tiene que llegar hasta 121ºC durante 15 minutos.
7. Transcurridos los 15 minutos, desconectar el autoclave. Comenzar a abrir la válvula para
liberar el vapor y que la presión comience a bajar. El autoclave puede abrirse únicamente
cuando el manómetro marque cero. ¡Antes NO, ya que podría explotar!
8. El autoclave se abre desde atrás, procurando que nadie quede de frente hacia donde
se abre la tapa, ya que saldrá mucho vapor caliente que causa quemaduras. Una vez
que se abrió con cuidado, con ayuda del guante de asbesto, sacar el erlenmeyer.
9. Verter el medio en las placas de Petri estériles siguiendo la técnica aséptica. Las placas no
pueden ser destapadas a menos que sea entre los mecheros o dentro de la campana de flujo
laminar. Las tapas no se tocan por dentro con los dedos, ni se sacan del área de esterilidad.
10. Permitir que el medio solidifique a medio ambiente por unos minutos y una vez solido el
medio de cultivo, las placas se cierran adecuadamente y se etiquetan indicando el medio,
equipo, grupo y fecha de elaboración. Guardar en el refrigerador para utilizar en la siguiente
práctica.
CLASE PRACTICA 5
1. TOMA DE MUESTRA
Para la recolección de muestra, tener en cuenta que debe ser:
 Representativa
 Cantidad de volumen adecuado
 Esterilidad
 Animal sin previo tratamiento con antibiótico, si existe tratamiento esperar 48
hs para la colecta de muestras.
 Datos de los animales: Especie, edad, sexo, localidad, vacunas, numero de
animales afectados, síntomas, enfermedad aguda o crónica, tratamiento, diagnostico
presuntivo.
2. TIPOS DE MUESTRA
 Otocultivo: Hisopado ótico en medio de transporte Stuart o en frasco estéril,
con hisopo estéril.
 Urocultivo: chorro medio, sondeo vesical, punción vesical.
 Piel: punción-aspirado, hisopado
 Coprocultivo: heces, hisopado rectal, en envases estériles.
 Organos: representativos de las lesiones, tomados en forma estéril durante la
necropsia en placas estériles.
 Fluidos: Leche, liq. Pericardico, etc…
3. OBSERVACION EN FRESCO DE LA MUESTRA
 Sin coloración: Sin la utilización de colorantes de contraste, se observa la
muestra (con o sin liquido de montar) al microscopio
10
Departamento de Microbiología
FCV- UNA


Con coloración: acorde al diagnóstico presuntivo. Tinción Gram o coloración
de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la
visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria
Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Recoger muestra estéril
- Hacer un extendido sobre un portaobjeto con formas de espiral
- Dejar secar a temperatura ambiente
- Fijar la muestra al calor (flameando el portaobjetos 3 veces aprox.)
- Una vez realizado el frotis se procederá a realizar la coloración de Gram
- Agregar cristal violeta sobre el extendido y esperar 1 minuto. Este tinte
dejará de color morado las bacterias Gram positivas.
- Enjuagar con agua corriente.
- Agregar lugol y esperar 1 minuto.
- Enjuagar con agua corriente.
- Agregar alcohol y/o acetona por goteo y esperar 15 segundos.
- Enjuagar con agua hasta escurrir todo el excedente de colorante.
- Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color rosado
las bacterias Gram negativas.
- Enjuagar con agua. Chorro suave ya sea con pipeta o directo de la llave.
Permitir secar la lamina. Para observar al microscopio óptico es
conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión (para bacterias)
- Obs: los tiempos dependen de cada marca comercial.
Frotis teñido con la coloración de Gram para su posterior identificación.
4. CULTIVO
En microbiología, un cultivo es un método utilizado para la multiplicación de
microorganismos, tales como bacterias y hongos, en el que se prepara un medio óptimo para
favorecer el proceso deseado. Un cultivo es empleado como un método fundamental para el
estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades en medicina
humana y veterinaria. Un microorganismo se puede sembrar en la superficie de un medio
sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van desde azúcares
simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar
o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra que contiene muchos tipos de
bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no
cambian de localización quedando atrapadas en el agar; tras muchos ciclos reproductivos,
11
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por
decenas de millones de células bacterianas similares a la original.
Como realizar un cultivo:
-
-
-
-
Cerca del mechero se descarga la muestra en la placa de petri con el medio de cultivo
seleccionado.
Se esteriliza el ansa por medio de calor directo en el mechero de bunsen, enfriando en
el agar el ansa se pasa a realizar las estrías por agotamiento, que son líneas en zigzag
que tienen como finalidad ir de la mayor concentración a la menor de carga bacteriana
obteniendo así colonias aisladas.
Las formas de las estrías y su distribución se pueden realizar de distintas maneras el
objetivo es desconcentrar la cantidad de bacterias para poder trabajar con colonias de
bacterias puras.
Se pueden trazar imaginariamente cuadrantes, donde en el primer cuadrante se realizan
las mayor cantidad de estrías una debajo de la otra, en el segundo cuadrante las estrías
se separaran más y serán en menor cantidad, en el cuarto aumentar más la distancia
entre estrías y finalmente en el último cuadrante el ansa se debe esterilizar con el
mechero de bunsen, enfriar nuevamente en el agar y realizar las ultimas estrías esto
para reducir la carga a cero y así obtener colonias aisladas, esterilizar el ansa y cerrar
la placa.
Una vez realizado el cultivo la muestra será incubada en la estufa generalmente a 37°C
dependiendo del tipo de microorganismo a ser aislado y se dejarán por 24-48 horas.
Se revisarán al termino de las horas correspondientes para evaluar el desarrollo de las
colonias bacterianas y describir su desarrollo en dicho medio de cultivo.
12
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
CLASE PRÁCTICA 6
PRUEBAS CONFIRMATORIAS
Observación en fresco
Cultivo
- Directo
- Coloración
- Origen de la muestra
- Posibles agentes etiológicos
- Características nutricionales de los
microorganismos.
Pruebas bioquímicas
Sensibilidad - Antibiograma
 IDENTIFICACION SEGÚN TINCIÓN DE GRAM
13
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
 Enfermedades provocadas por Estafilococos
-
Puede causar infecciones en el tracto urinario, pueden causar infecciones de la piel
como foliculitis, furúnculos, impétigo, y celulitis que están limitadas a una pequeña
área de la piel, también puede segregar sustancias tóxicas que pueden conllevar a
enfermedades como una intoxicación alimenticia o el Síndrome de Shock Tóxico.
 Enfermedades provocadas por Estreptococos





El estreptococo del grupo A causa:
Infección en la garganta: garganta adolorida, enrojecimiento, a veces con plaquetas
blancas en las amígdalas
Escarlatina: erupción color rojo en el cuerpo
Impétigo: infección en la piel
Síndrome del shock tóxico
Celulitis y fascitis necrotizante (enfermedad necrotizante)
 Los estreptococos del grupo B pueden causar infecciones sanguíneas, neumonía y
meningitis en los recién nacidos
14
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
 Enfermedades producidas por bacilos grampositivos formadores de esporas:
Los bacilos grampositivos formadores de esporas son las especies de los géneros
Bacillus y Clostridium. Estos bacilos son cosmopolitas y debido a que forman esporas,
pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. El género Bacillus es aerobio, en
tanto que los clostridios son anaerobios obligados.
De las numerosas especies de ambos géneros, Bacillus y Clostridium, que
causan enfermedades importantes en el hombre. El ántrax sigue siendo una
enfermedad importante de los animales. y en ocasiones del hombre. Bacillus cereus
causa envenenamiento por alimentos y a veces infecciones oculares y otras
localizadas. Los clostridios causan varias enfermedades graves mediadas por toxinas:
Clostridium tetani, tétanos; Clostridium bofulinum, botulismo; Clostridium
perfringens, gangrena gaseosa; y Clostridium difficile, colitis seudomembranosa.
Enfermedades producidas por bacilos gram positivos no formadores de esporas:
-
Corynebacterium: Causa difteria y otras especies acompañan a infecciones
oportunistas.
Listeria monocytogenes: (listeriosis) causa meningitis, septicemia en recién nacidos y
en adultos inmunodeprimidos
15
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
 Pruebas Bioquímicas
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a
medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos
microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad
de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioquímicas se
dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias
del microorganismo en estudio.
Algunas pruebas bioquímicas de interés pueden ser:
-
Triple azúcar de Hierro (TSI): Fermentación de glucosa y lactosa
SIM: Producción de Indol, Movimiento y acido sulfhídrico
Caldo de rojo metilo/ Voges Proskauer (RM/VP): Producción
Acetilmetilcarbinol
Urea: Producción de ureasa
Citrato de Simmons: Utilización de Citrato de Sodio
LIA: Lisina descarboxilasa
SIM: Movilidad
Fermentación de Hidratos de Carbono

de
TSI (Triple azúcar de hierro)
1. Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a
amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el
medio permanecerá de color rojo.
2. Si la bacteria problema fermenta lactosa y/o sacarosa, acidificará el medio en su
superficie volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio
continuará de color rojo.
3. Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se
presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente
ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este
hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.
4. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora
de gas.
16
Departamento de Microbiología
FCV- UNA

LIA (Lisina Descarboxilasa)
1) Lisina descarboxilasa (LIA) positiva
2) Lisina descarboxilosa (LIA) positiva productora de acido sulfhidrico
3) Lisina descarboxilasa (LIA) negativa

CITRATO
1) Citrato de Simmons positivo
2) Citrato de Simmons negativo

SIM
1) Indol positivo
2) Indol negativo
3) Movimiento negativo/Movimiento positivo
 UREA
1) Urea de Christensen negativo
2) Urea de Christensen positivo
17
Departamento de Microbiología
FCV- UNA

ROJO METILO/VOGES PROSKAUER
1) Rojo metilo positivo/Rojo metilo negativo
2) Voges proskauer negativo /Voges proskauer positivo
 FERMENTACION DE HIDRATOS DE CARBONO
1) La fermentación se puede observar mediante el cambio de color del medio de amarillo a
rojo o fucsia para indicar positiva la fermentación, por medio del viraje del pH.
 Enfermedades ocasionadas por oxidasa negativa (Enterobacterias):
La mayoría de las especies son oportunistas, pero algunas son altas y específicamente
patógenas y causan enfermedad entérica, urinaria o sistémica. Las enterobacterias pueden
vivir libres en la naturaleza y habitualmente forman parte de la FLORA NORMAL DEL
COLON HUMANO. Pueden encontrarse transitoriamente en la piel (especialmente perianal),
el tracto genital femenino y, muy ocasionalmente, el tracto respiratorio superior de los
individuos sanos. Las enterobacterias aparecen en una mayor proporción en la flora de
individuos hospitalizados, especialmente en aquellos que sufren enfermedades graves y
debilitantes.
Escherichia coli es la especie más comúnmente encontrada en la flora normal, seguida
en orden de importancia por Klebsiella, Proteus y Enterobacter. Los géneros Salmonella,
Shigella y Yersinia son patógenos primarios para el hombre y no forman parte de la flora
normal. Ciertos serotipos de E.coli son patógenos primarios.
RECORDAR: las enterobacterias forman parte del 80 % de infecciones por GRAM (-)
y además constituyen el 50 % de los aislamientos clínicos relevantes
 Enfermedades producidas por oxidasa positiva
- Brucelosis: La brucelosis está causada por varias especies de Brucella que infectan a
animales: cerdos y ganado vacuno. Después de varios días o semanas (período de incubación)
comienzan a manifestarse el síntoma principal es el aborto, fiebre, dolor de articulaciones.
- Enfermedad causada por pseudomonas: Pseudomonas aeruginosa, habitante permanente
del suelo y agua dulce, causa varias enfermedades que pueden ser difíciles de tratar porque
esta bacteria es notablemente resistente a la mayoría de los antibióticos, infecciones del tracto
urinario, la mayoría de las infecciones de oído, infecciones sobre quemaduras extensivas y
pneumonías en pacientes con fibrosis quísticas.
18
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
- Enfermedades causadas por Bordetella y Haemophillus: La tos ferina, está causada por
Bordetella pertussis, un aeróbio que se adquiere de otras personas y que se desarrolla en la
garganta. Después de un período de incubación de 7 a 16 días comienzan los síntomas,
parecidos a un resfrío, luego durante los próximos 7 a 14 días se desarrolla una tos rápida e
intensa ininterrumpida.
Haemophillus influenzae habitante común de la garganta en personas sanas es un anaeróbio
facultativo. Esta bacteria crece en la garganta y laringe produciendo una severa epiglotitis que
puede provocar ahogos.
CLASE PRACTICA 5
ANTIBIOGRAMA – SENSIBILIDAD A ANTIBIOTICOS
Como actuán los antibióticos?
19
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
 Método de Difusión en Agar
La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitro se puede determinar por
varios métodos la difusión en agar se utiliza de rutina en laboratorios clínicos en bacterias.
Están indicadas en los casos en que la bacteria infectante sea capaz de mostrar resistencia a
los antibióticos usados habitualmente para tratamiento. Las pruebas se deben realizar sobre
cada uno de los microorganismos con probable rol patógeno aislados en una muestra clínica.
 Categorías de interpretación
1. Sensible (S)
Esta categoría implica que una infección dada por la cepa en estudio puede ser tratada
apropiadamente con la dosis de antibiótico recomendada para el tipo de infección y la especie
infectante.
2. Intermedio (I)
Incluye cepas que a un determinado antibiótico puede ser alcanzada en sangre y tejidos. Esta
categoría sugiere que puede alcanzarse éxito clínico aumentando la concentración del
antimicrobiano en el sitio de la infección, siempre que las dosis usadas puedan ser
incrementadas.
3. Resistente (R)
Las cepas resistentes no son inhibidas por las concentraciones séricas normalmente
alcanzadas a dosis habituales y/o caen en el rango donde son comunes mecanismos
específicos de resistencia microbiana.
 Reactivos para la Prueba de difusión por disco.
- Medio Agar Müeller Hinton
- Discos de antibióticos
- Agua destilada
- Ansa bacteriológica
- Tubos
- Hisopos estériles
- Placas de petri
- Mezclador (Mixer)
Procedimiento para la realización del test de difusión por disco para sensibilidad
 Preparación del inoculo
- Para preparar el inoculo, seleccionar 3 a 5 colonias de igual morfología de la placa de
cultivo.
- Preparar una suspensión en 4 a 5 ml con agua destilada y las colonias seleccionadas.
- Mezclar hasta alcanzar la turbidez del estándar 0,5 de la escala de Mc Farland.
 Inoculación de las placas
20
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
-
-
Después de ajustado el inoculo sembrar a las placas de Müeller Hinton por medio de
un hisopo estéril. Presionar el hisopo por las paredes del tubo por encima del nivel del
liquido a fin de escurrir el exceso de inoculo.
Inocular por hisopado en tres direcciones rotando la placa 60° cada vez para asegurar
una completa distribución del inoculo. Como paso final se debe hisopar la
circunferencia de la placa. De esta manera se deberían obtener zonas de inhibición
uniformemente circulares y desarrollo homogéneo.
 Aplicación de los discos
- Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculado con pinza estéril, aplicando
una ligera presión a una distancia no menor de 24 mm desde un centro al otro. Debido
a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser reubicado
una vez que tomo contacto con el agar.
- Incubar las placas a 35° por 24 horas.
 Lectura de las placas e interpretación de resultados
- Después de 24 horas de incubación examinar cada placa y medir los diámetros de las
zonas de inhibición, se mide con regla o calibre, sosteniendo la placa sobre un fondo
oscuro e iluminada con luz refleja.
- Los tamaños de la zona de inhibición serán interpretados en las tablas
correspondientes y los organismos se informarán: sensibles, intermedios o resistentes
frente al antimicrobiano ensayado.
Preparacion del inoculo
Inoculación de las placas
Aplicación de los discos
21
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
Lectura de las placas e interpretación de los resultados
CLASE PRÁCTICA N° 8
DETERMINACIÓN DE HONGOS
 Observación en directo
-
-
Identificar la muestra de acuerdo al número designado por el libro de recepción de
muestras.
Preparar la mesa de trabajo con los materiales necesarios, portaobjetos, cubre objetos,
hidróxido de potasio 40% como medio de montar, pinzas, placa de petri estéril, papel
desechable, ansa, etc.
Colocar sobre la placa estéril o papel desechable, el portaobjetos de modo a trabajar
asépticamente.
Colocar la muestra en el portaobjetos tratando de tomar representativamente siendo
ideal, pelos afectados, piel de la zona afectada, etc.
Con pipeta Pasteur embeber con hidróxido de potasio al 40%, la muestra, mediante
goteo.
Colocar el cubreobjetos
Llevar al microscopio donde se observará con el menor de los aumentos, para ir
aumentando gradualmente para enfocar correctamente.
Recorrer todo el campo buscando lentamente observar alguna morfología
correspondiente a hongos o levaduras y evaluando los pelos.
 Cultivo de muestra
-
-
Identificar la muestra de acuerdo al número designado por el libro de recepción de
muestras.
Preparar la mesa de trabajo con los materiales necesarios, placa de petri con medio de
cultivo para hongos (Sabouraud) seca, ansa, mechero, alcohol, papel desechable, etc.
Si se trata de hisopado otico se debe descargar el hisopo varias veces en el primer
cuadrante.
Luego estriar con el ansa estéril.
Si fuesen muestras de raspados, descargarlas en el centro del medio de cultivo.
Incubar a 22°C o 37°C por 24 a 48 horas.
Para interpretar los resultados del crecimiento de las colonias se deben evaluar en
placa las características de las mismas leyendo colores y características del reverso y
del anverso.
De esta manera se pueden clasificar en hongos y levaduras los cuales deberán ser
observados al microscopio.
22
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
-
-
-
Al portaobjetos se le adicionará una gota de liquido de montar, como el azul de
lactofenol si es que los hongos son despigmentados, si son pigmentados (negros) con
líquido de montar de Patterson que no posee colorantes.
Se tomarán las colonias crecidas en las placas con ansa en gancho estéril, se picará una
buena porción de colonia que se colocará en el portaobjetos con el liquido de montar
y cubrirá con el cubreobjetos.
Llevar al microscopio donde se observará con el menor de los aumentos, para ir
aumentando gradualmente para enfocar correctamente.
Recorrer todo el campo buscando lentamente observar alguna morfología
correspondiente a hongos o levaduras y así identificarlas
Observación
Para la identificación de hongos se deben considerar tanto la observación en directo como la
obtenida luego del crecimiento en medios de cultivo ya que se deben verificar la
patogenicidad o no de algunos ambientales mediante criterios microbiológicos.
 Identificación al microscopio
 GéneroAspergillus.
Hifomicetos.
Aspergillus flavus
 Género Epidermophyton
Teleomorfos
Epidermophyton floccosum
23
Departamento de Microbiología
FCV- UNA
 Género Microsporum
Microsporum canis
 Género Trichophyton
Trichophyton mentagrophites
24