DAG - Agilent

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Resolución de Problemas de Laboratorio
en Biología Molecular (4 julio 2013)
EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN
CON ÁCIDOS GRASOS SOBRE EL PESO
Y LA MICROBIOTA INTESTINAL DE
RATONES OBESOS
Jorge R. Mujico1, Gyselle C. Baccan2, Alina Gheorghe1,
Ligia E. Díaz1 & Ascensión Marcos1
1 Grupo
de Inmunonutrición
(http://www.inmunonutricion-csic.com)
Departamento de Metabolismo y Nutrición
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición
(ICTAN-CSIC)
Madrid, Spain
2 Instituto
de Ciencias de la
Salud
Universidad Federal de Bahía
Salvador, Brasil
Introducción
• Prevalencia mundial del sobrepeso y la obesidad
• Obesidad: trastornos metabólicos y
cardiovasculares, tales como diabetes tipo 2,
aterosclerosis, hipertensión e infartos
• Nuevas sustancias que podrían ser utilizadas para
controlar el peso corporal y mejorar la salud de los
pacientes obesos
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Introducción
• Estudios en modelos experimentales y humanos:
• La composición de la microbiota intestinal de las
personas obesas es diferente respecto de las
delgadas
• Los cambios en la dieta o la pérdida de peso pueden
conducir a alteraciones de la microbiota intestinal (Ley
et al., 2006; Santacruz et al., 2009; Delzenne et al.,
2011; Jumpertz et al., 2011)
• La microbiota intestinal desempeña un papel importante
en la regulación del almacenamiento y metabolismo de las
grasas (Bäckhed et al., 2004; Cani and Delzenne, 2009)
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Introducción
La composición de la microbiota puede dar lugar a una respuesta
inmune saludable o predisponer a la enfermedad:
Alteraciones en el desarrollo normal de la microbiota podrían
afectar al desarrollo inmunológico y potencialmente predisponer a
los individuos a desarrollar diversas enfermedades inflamatorias
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Introducción
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Hipótesis de partida
El consumo de una dieta alta en
grasas (DAG) está asociado a una
inflamación crónica y sistémica "de
bajo grado", que puede alterar la
composición de la microbiota
intestinal y ésta, a su vez, afectar al
proceso de desarrollo de la obesidad
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Objectivo
El objetivo del presente estudio ha sido
investigar la capacidad de ciertos ácidos
grasos para modular tanto el peso corporal
como la microbiota intestinal en un modelo
in vivo de obesidad inducida por DAG
S1: Compuesto derivado del ácido oleico
(1.500 mg/kg/día)
S2: Combinación de ácidos grasos omega-3
(ácidos eicosapentaenoico y docosahexaenoico,
3.000 mg/kg/día)
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Materiales & Métodos
Ochenta ratonas hembra ICR (CD-1®) de
8 semanas de edad fueron alimentadas con:
•
Dieta Control (DC, )
•
DAG no suplementada (DAG, )
•
DAG suplementada con S1 (DAG-S1, )
•
DAG suplementada con S2 (DAG-S2, )
Tres jaulas por cada grupo experimental
(jaula A, n 8; jaulas B y C, n 6)
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Composición de las dietas
Dieta Control (DC)
Dieta Alta en Grasas (DAG)
Carbohidratos
Proteínas
Grasa Saturada
Grasa Mono-insaturada
Grasa Poli-insaturada
Fibra Soluble
Fibra Insoluble
50
% (p/p)
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Análisis de la microbiota fecal
Los DNAs fueron extraídos de las muestras
de heces (jaulas B y C) utilizando las
QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen)
Las concentraciones fueron determinadas
mediante fluorimetría (Fluorescent DNA
Quantification Kit, Bio-Rad)
La cuantificación de los distintos grupos de
bacterias se realizó mediante PCR
cuantitativa y SYBR Green I (Agilent)
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Cebadores o primers
Para la PCR cuantitativa en tiempo-real se utilizaron los siguientes
primers* (específicos de distintos grupos de bacterias):
Ensayo PCR
Secuencia (5'–3')
Tamaño
Reference
amplicón (pb)
Bacterias totales
F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
R: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
200
Filo Firmicutes
F: 5'-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3'
126
R: 5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3'
Guo 2008
Cluster Clostridial XIVa
F: 5'-GCGGTRCGGCAAGTCTGA-3'
R: 5'-CCTCCGACACTCTAGTMCGAC-3'
81
RamírezFarias 2009
Grupo Lactobacillus
F: 5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'
R: 5'-CACCGCTACACATGGAG-3'
341
Rinttila 2004
177
Castillo 2006
F: 5'-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-3'
Orden Enterobacteriales R: 5'-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3'
Fierer 2005
Filo Bacteroidetes
F: 5'-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3'
R: 5'-AGCTGACGACAACCATGCAG-3'
126
Guo 2008
Bifidobacterium spp.
F: 5'-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3'
R: 5'-RCCACATCCAGCRTCCAC-3'
243
Rinttila 2004
*Estos primers fueron comercialmente sintetizados por Isogen
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Resultados & Discusión (I)
La DAG indujo un aumento del
peso corporal, que disminuyó tras
suplementar la dieta con S1
60
Área Bajo Curva
Peso Corporal (g)
0
DC
DAG-S1
0
0
Semanas
*
*
3500
DAG / DAG-S2
7
*
DC
DAG
DAG-S1 DAG-S2
*P<0,05 (Kruskal-Wallis)
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*
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Resultados & Discusión (I)
Peso Grasa Visceral (g)
DC
DAG
DAG-S1
DAG-S2
**
*
6
**
4
2
0
DC
DAG
DAG-S1 DAG-S2
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Resultados & Discusión (II)
• Las curvas estándar tuvieron coeficientes de
correlación entre 0,990-0,999
• Usando la fórmula E = [10(-1/pendiente) - 1], las
eficiencias para cada ensayo individual
estuvieron entre 86,0-101,4%
Ensayo PCR
Pendiente
Eficiencia Coeficiente
PCR (%)
correlación
Bacterias totales
-3,288
101,4
0,999
Filo Firmicutes
-3,382
97,6
0,999
Cluster Clostridial XIVa
-3,439
95,3
0,999
Grupo Lactobacillus
-3,709
86,0
0,999
Orden Enterobacteriales -3,379
97,7
0,990
Filo Bacteroidetes
-3,401
96,9
0,999
Bifidobacterium spp.
-3,613
90,2
0,997
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Resultados & Discusión (II)
Unidades Relativas
0
DAG
DAG-S1 DAG-S2
Cluster Clostridial XIVa
0
*
0
100
DC
DC
DAG
DAG-S1 DAG-S2
0
DAG
DAG-S1 DAG-S2
Orden Enterobacteriales
*
Unidades Relativas
Unidades Relativas
100
DC
*
Grupo Lactobacillus
100
Unidades Relativas
Filo Firmicutes
100
DC
DAG
DAG-S1 DAG-S2
*P<0,1 vs. CD (Kruskal-Wallis)
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Resultados & Discusión (II)
Filo Firmicutes
80
Peso Corporal (g)
El análisis de
0
correlaciones (Test de
Spearman) reveló que
el peso corporal
0
Unidades Relativas
100
Cluster Clostridial XIVa
positivamente con el
Peso Corporal (g)
80
0
correlacionaba
Filo Firmicutes
(P=0,0154) y el Cluster
Clostridial XIVa
0
Unidades Relativas
100
(P=0,0022)
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Resultados & Discusión (III)
Bifidobacterium spp.
0
Filo Bacteroidetes
100
Unidades Relativas
Unidades Relativas
100
DC
DAG
DAG-S1 DAG-S2
0
DC
DAG
DAG-S1 DAG-S2
La suplementación con S1 restauró la proporción de
bacterias que habían disminuido con la DAG (por
ejemplo, Bifidobacterium spp.)
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Resultados & Discusión (III)
Bacteroidetes Phylum
Peso Corporal (g)
80
0
0
Unidades Relativas
100
La suplementación con S1 restauró la proporción de
bacterias que habían disminuido con la DAG (por
ejemplo, Bifidobacterium spp.)
El análisis de correlaciones (Test de Spearman) reveló
que el peso corporal correlacionaba negativamente con
el Filo Bacteroidetes (P=0,0279)
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Conclusiones
El consumo de una DAG produjo cambios en la
microbiota fecal, que estaban asociados con la
aparición del fenotipo obeso
La suplementación de DAG con S1 contrarrestó la
disbiosis intestinal inducida por DAG, además de
disminuir el peso corporal
DAG
Delgado
DAG-S1
Obeso
Estos resultados apoyan el papel de ciertos ácidos
grasos como nutrientes interesantes relacionados
con la prevención de la obesidad
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Agradecimientos
Los resultados aquí presentados son parte del
estudio PRONAOS
Los autores agradecen el apoyo financiero de:
o El Programa CENIT (Consorcios Estratégicos
Nacionales en Investigación Técnica)
o BTSA-Biotecnologías Aplicadas (la compañía
que proporcionó los ácidos grasos)
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