Guía de ejercicios. Segunda parte 2014

Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias
Bioquímicas y Farmacéuticas
Guía de ejercicios
Química Biológica
2014
0
QUÍMICA BIOLÓGICA – 2014
CADENA RESPIRATORIA. FOSFORILACION OXIDATIVA
1.
Los grupos prostéticos hemo de los citocromos mitocondriales son esencialmente idénticos en
su estructura. ¿Puede explicar en términos generales, cómo es posible que sus potenciales de
media celda difieran en más de 0,2 V?
2.
Cuatro transportadores: a, b, c y d, cuyas formas reducidas y oxidadas pueden ser distinguidas
espectrofotométricamente, se requieren para la respiración en un sistema de transporte de
electrones bacteriano. En presencia de sustrato y oxígeno, tres inhibidores diferentes bloquean
la respiración, obteniéndose los patrones de los estados de oxidación que aparecen en la Tabla.
¿Cuál es el orden de los transportadores en la cadena desde los sustratos hasta el oxígeno?
Tabla: Efecto de los inhibidores sobre los niveles de oxidación de los transportadores en una
vía hipotética de transporte de electrones (+ y - indican las formas totalmente oxidadas y
reducidas, respectivamente).
INHIBIDOR
1
2
3
a
+
+
b
+
-
c
-
d
+
+
+
3.
Cadena de transporte de electrones mitocondrial:
a) Identifique sus complejos, componentes que aceptan y donan electrones en cada complejo.
b) Enumere los inhibidores que conozca de cada complejo y sus mecanismos de acción.
c) Identifique los complejos que producen suficiente energía para bombear protones.
d) Explique cómo se forma el gradiente de pH y de carga e indique como contribuyen a formar
la fuerza protomotriz.
5.
Un laboratorio farmacéutico le envió a usted muestras de dos nuevos compuestos metabólicos
para caracterizarlos como posibles antibióticos. Utilizando una preparación aislada de
mitocondrias de hígado e incubada con piruvato, O2, ADP, y Pi, usted observa que la adición
del compuesto "A" bloquea tanto el transporte de electrones como la fosforilación oxidativa.
Cuando agrega el compuesto "B" además del "A", observa con sorpresa que se restablece el
transporte de electrones pero no la fosforilación oxidativa. a) ¿Cómo clasificaría estos
compuestos teniendo en cuenta su modo de acción en el transporte de electrones y la
fosforilación oxidativa? b) Nombre un par de sustancias conocidas que podrían dar el mismo
resultado.
6.
Si la rotenona se agrega a la cadena transportadora de electrones mitocondrial, determinar si las
siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas:
a) el índice P/O del NADH se reduce de 2,5 a 1,5
b) la velocidad de oxidación del NADH disminuye a 2/3 de su valor inicial.
c) la oxidación del succinato permanece normal.
d) el flujo de electrones está inhibido en el sitio 2.
7.
Una suspensión de mitocondrias consume 24 µmol O2/min en presencia de malato y glutamato.
Al agregar 2,3 mmoles de ADP y Pi en exceso el consumo se acelera a 178 µmol O2/min
durante 3 min para luego retornar a la velocidad inicial. a) Explique a qué se debe la
1
aceleración transitoria del consumo de oxígeno. b) calcule el control respiratorio e índice P/O.
c) Explique cómo afectaría un inhibidor de la transferencia de energía (inhibidor ATPasa) a la
velocidad de consumo de oxígeno y el índice P/O.
8.
Se agregaron 0,1 ml de una suspensión conteniendo partículas submitocondriales (con una
concentración de proteína de 5 mg/ml) a 2,9 ml de una solución amortiguadora (pH: 7,2) en
una cubeta termostatizada de un oxígrafo. Las medidas de consumo de oxígeno obtenidas ante
el agregado de diferentes compuestos se muestran en el gráfico adjunto. En base a estos datos:
a) Calcule la velocidad de consumo de O2 en cada caso, expresándola en µmol/min.mg de
proteína. b) Calcule el índice P/O. c) Caracterice lo mejor posible a los compuestos X, Y, Z y
A. d) ¿Qué velocidad de consumo de O2 esperaría medir si a los 3,9 minutos (flecha en línea de
puntos) se agregara nuevamente ADP y Pi (iguales cantidades que anteriormente)? ¿Durante
cuánto tiempo?
9.
El gráfico muestra el trazado obtenido en un oxígrafo al incubar partículas submitocondriales a
30°C, en un medio a pH: 7,5. Caracterice cada uno de los compuestos agregados (A, B, C,
etc.). Justifique brevemente el efecto de cada compuesto sobre la velocidad de consumo de O2.
2
A
B
C
D
B
[O2] (mM)
E
F
E
G
H
I
Tiempo (min)
10.
a) La inyección de dinitrofenol a una rata produce un aumento inmediato en su temperatura
corporal. ¿Puede explicar por qué?
b) La oligomicina y el cianuro inhiben la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es piruvato
o succinato. El dinitrofenol puede ser usado para distinguir entre estos dos inhibidores.
Explique.
11.
Relacione los siguientes compuestos con sus respectivos comportamientos:
a) rotenona
b) dinitrofenol
c) antimicina A
12.
1) inhibe la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es
piruvato pero no cuando el sustrato es succinato.
2) inhibe la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es
piruvato y/o succinato.
3) permite que el piruvato sea oxidado por la mitocondria aún
en ausencia de ADP.
El consumo de O2 obtenido de una suspensión de partículas submitocondriales usando
succinato como sustrato fue:
Estado 4 = 40 µmoles O2/min
Estado 3 = 80 µmoles O2/min
Estado desacoplado = 200 µmoles O2/min
Se agrega luego 50 µl de una sustancia X y se vuelve a medir la velocidad de consumo de O 2
en los 3 estados anteriores. Indique qué velocidad de consumo de O2 obtendría en cada estado
si:
a) X = malonato
b) X = oligomicina
c) X = rotenona
3
13.
Indique si las afirmaciones hechas a continuación son verdaderas o falsas. Justifique.
a) El dispositivo molecular para la respiración se encuentra sólo en las células eucariotas.
b) Las proteínas transportadoras de electrones que tienen FAD como grupo prostético se
denominan citocromos.
c) La relación P:O es igual a 2,5 para el FADH2 en la mitocondria.
d) El amital bloquea la formación del ATP de la oxidación del isocitrato, pero no de la
del succinato.
e) En presencia de un desacoplante la energía obtenida del transporte de electrones se
disipa como calor.
f) Si la concentración de ADP intracelular es baja, la adición de un desacoplante retarda
el transporte de electrones.
14.
Se prepararon mitocondrias y se determinó el consumo de O2 en 0,2 ml de la preparación en
estado 4, en estado 3 y desacoplado, en presencia y en ausencia de una sustancia M (ver tabla).
Indique que tipo de inhibidor es M y justifique su respuesta.
CONDICIÓN
ESTADO 4
ESTADO 4
ESTADO 3
ESTADO 3
DESACOPLADO
DESACOPLADO
15.
SUSTANCIA M
(nM)
0
0,5
0
0,5
0
0,5
CONSUMO DE 02 (mol O/min)
11
4
70
7
205
9
a) Se determinó (en presencia de distintas concentraciones de las sustancias "A" y "B") la
velocidad de consumo de oxígeno en mitocondrias intactas en las siguientes condiciones:
estado "3", estado "4" y en presencia de un desacoplante. El sustrato empleado fue
malato-glutamato. Los resultados se grafican abajo. Indique si la sustancia "A" y “B” son
inhibidores de la síntesis de ATP, de la cadena respiratoria o un desacoplante. Justifique
brevemente.
120
120
100
80
60
40
20
0
0
10 20 30 40 50 60 70
[A]
desacoplado
estado 3
estado 4
consumo de O2
consumo de O2
140
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
[B]
4
b) Se estudió el efecto de distintas concentraciones de las sustancias "C" y "D" (inhibidores
del transporte de electrones) sobre el consumo de oxígeno en partículas submitocondriales
utilizando como sustrato: NADH, succinato y ascorbato + TMPD. Precise lo mejor posible el
lugar de acción de la sustancia "C" y "D" en la cadena respiratoria. Justifique brevemente.
60
50
consumo de O2
consumo de O2
60
40
30
20
10
0
50
40
30
20
10
0
0
10 20 30 40 50 60 70
[C]
Succinato
NADH
ASC + TMPD
0
10
20
30
40
50
60
70
[D]
16.
Se incubaron 10 µl de una suspensión conteniendo partículas submitocondriales (concentración
de proteína de la suspensión: 10 mg/ml) con una solución amortiguadora de pH y una
concentración de NADH inicial de 20 µM, en un volumen final de 1 ml. Al cabo de 20 minutos
se determinó la concentración de NADH espectrofotométricamente y se obtuvo un valor de
16 µM. A partir de este momento se agregaron al medio 50 µl de una solución de ADP de
concentración 0,40 mM y fosfato en exceso. El ADP agregado se consumió totalmente en
20 min. Se midió nuevamente la concentración de NADH, obteniéndose un valor de 4 µM.
a) Calcule la velocidad de consumo de O2 expresándola en µmol/min.mg de proteína antes y
después del agregado de ADP y fosfato. b) Calcule el índice P/O. c) Si en este momento
agregamos rotenona, succinato, fosfato en exceso y 50 µl de ADP (concentración 1,5 mM) y se
observa que éste se agota totalmente al cabo de 100 minutos, calcule la velocidad de consumo
de O2 en µmol/min.mg proteína usando el índice P/O teórico correspondiente.
17.
Se incuba una suspensión de partículas submitocondriales en buffer pH 7,2 a 37ºC (1 ml
volumen total), se realizan agregados de distintos compuestos y se analiza la concentración de
oxígeno en el medio mediante un oxígrafo. En base a los resultados observados: a) Determine
qué compuestos podrían ser A, B, C y D. Justifique brevemente la elección. b) Determine
cómo evolucionaría el consumo de oxígeno si E fuese Ascorbato + TMPD. c) Calcule el índice
P/O del sistema (concentración final de ADP agregado: 400 nM, fosfato agregado en exceso).
d) Determine en cada etapa del gráfico si existe gradiente de protones transmembrana o no. e)
Calcule la cantidad total de ATP sintetizado y la cantidad de NADH consumido (en nmoles)
entre los minutos 0 y 11.
5
conc O2 (nM)
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
NADH
ADP+Pi
A
B
C
D
Para pensar e investigar
El tejido adiposo marrón, presente en cuello y espalda de recién nacidos, pero ausente en adultos, contiene
numerosas mitocondrias. Dichas mitocondrias producen menos de un ATP por átomo de oxígeno consumido
durante la oxidación de NADH.
a) Sugiera una función fisiológica para la baja relación P/O en este tejido.
b) Sugiera posibles mecanismos para mantener esta baja relación.
0
5
tiempo 10
(min)
FOTOSÍNTESIS
FASE LUMINOSA
1. Responda con V o F
 La luz azul es más energética que la amarilla.
 Las plantas son verdes porque la clorofila absorbe y utiliza la luz verde.
 En la mayoría de los organismos fotosintéticos el último aceptor de electrones es el CO2.
 Todos los fotótrofos llevan a cabo la fotosíntesis en una organela especializada, el
cloroplasto.
 Cuando existe flujo de electrones lineal en las plantas los e- del O2 se utilizan finalmente para
reducir al NADP+.
2.
El herbicida 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (DCMU o diuron) es un inhibidor de la
fotosíntesis debido a que compite por el sitio de unión de uno de los componentes de la cadena.
La figura muestra el perfil de evolución de O2 y fotofosforilación de cloroplastos tratados con
DCMU. Al tiempo 1 a los cloroplastos se les agregó el Reactivo de Hill (Fe(CN)6K3), un
aceptor alternativo de electrones del fotosistema II. a) En base a la estructura del DCMU y a
estos resultados de la figura, sugiera el sitio en la cadena fotosintética donde estaría actuando el
DCMU. b) ¿Cuál será el estado redox de los demás componentes de la cadena en presencia de
DCMU? c) Al tiempo 2 se agregó metilamina a la suspensión con DCMU; en base a los
resultados ¿dónde actúa este inhibidor?
6
DCMU
3.
Cinco μl de una suspensión de tilacoides se mezclaron con acetona al 80 % en un volumen
final de 1 ml. La absorbancia a 652 nm fue de 0,21. La concentración de clorofila en la
suspensión de tilacoides original se calculó como: Concentración (mg/ml) = 5,6 x Abs 652 nm.
Una muestra de 0,3 ml de la suspensión de tilacoides que contiene fosfato en exceso se agrega
a 2,7 ml de una solución tamponada conteniendo ferricianuro de potasio 4 mM. La mezcla se
incubó con luz saturante a 30 °C y se midió producción de O2 siendo inicialmente de 15
μM/min. Luego se agregaron 4 μl de ADP y la velocidad de producción de O 2 se incrementó a
32 μM/min durante 30 segundos, tras lo cual regresó a su valor original. a) Exprese las
velocidades de producción de O2 en μmoles/mg Clorofila.hora b) Asumiendo que el índice
P/2e- = 1,2, ¿Cuál fue la concentración de la solución de ADP utilizada?
4.
Una muestra de 0,15 ml de una suspensión de membranas tilacoides (con una concentración de
clorofila de 2 mg/ml) se agregó a 2,85 ml de una solución tamponada conteniendo un aceptor
artificial de electrones del fotosistema I. La mezcla se incubó con luz roja, a una intensidad
saturante, y la producción de O2, medida con un electrodo, se muestra en el gráfico. a) Calcule
la velocidad de producción de O2 (en µmol/min.mg de clorofila en cada caso). b) Calcule el
índice P/2e- c) Caracterice lo más posible a los compuestos X, Y y Z. d) Finalmente, se
agregaron 100 µl de una solución 5 mM de un compuesto H capaz de ceder electrones a la
plastocianina. ¿Cuál sería la naturaleza de H? Explique de qué forma evolucionaría la
velocidad de producción de O2, síntesis de ATP y reducción del aceptor alternativo luego del
agregado del mismo.
H
0.30
1 µl Y
1 ul Z
0.28
0.26
10 µl X
[O ] (mM)
2
0.24
LUZ
6 µl ADP 25 mM
+ 3 µl Pi 100 mM
0.22
0.20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Tiempo (min)
7
FIJACIÓN DEL CARBONO
1.
Una suspensión de algas fue expuesta a 14CO2 y H332PO4 por un tiempo suficiente para que se
alcance el equilibrio de ambos isótopos en los intermediarios del Ciclo de Calvin, pero no el
suficiente para marcar significativamente al pool de carbohidratos almacenados (almidón).
Después de alcanzada esta condición de equilibrio, en presencia de luz, la cantidad de cada
isótopo incorporado en una molécula determinada es directamente proporcional a la
concentración del metabolito en cuestión. La figura de abajo muestra los cambios en la
cantidad de 14C y 32P en 3 fosfoglicerato (3PGA) durante una secuencia luz oscuridad luz.
a)
¿Cuál es el precursor inmediato de 3PGA en la luz? b) ¿Cuál es el precursor inmediato de el
3PGA en la oscuridad después de varios minutos? c) Breve y concisamente explique ¿Por qué
la concentración de 3PGA se eleva agudamente cuando la luz se apaga y luego cae? ¿Qué
isótopo es proporcional a la concentración de 3PGA? ¿Por qué?
2.
Una planta con metabolismo fotosintético C3 es crecida bajo luz y condiciones de elevada
concentración de CO2 (figura). Luego es transferida a una cámara donde la relación O2/CO2 es
similar a la ambiental con una temperatura de 25°C. Finalmente, la temperatura de esta cámara
es incrementada a 40°C. Durante estos ensayos se midieron la concentración de 3fosfoglicerato y de un ácido orgánico de dos átomos de carbono (X). Explique el perfil de
acumulación de estos compuestos señalando la naturaleza de X.
3.
Ud. quiere analizar la compartamentalización de las reacciones fotosintéticas en una planta C 3.
Para ello somete una suspensión de células de dicha planta a un pulso de 14CO2 en presencia de
8
luz. Luego, rompe las células y mediante un protocolo de centrifugación obtiene dos
fracciones, una correspondiente al sobrenadante (SN1) y otra al pellet (fracción cloroplástica,
CP1). Para tener un duplicado repite todo el procedimiento obteniendo nuevamente dos
fracciones (SN2 y CP2). A continuación realiza los siguientes ensayos:
I) Determinación de clorofila mediante extracción con acetona:
Abs 660nm
blanco
SN1(1µl)
CP1(1µl)
SN2(1µl)
CP2(1µl)
0,001
0,103
0,304
0,008
0,287
II) Gel de poliacrilamida con SDS teñido con Coomassie:
SN1
CP1
SN2
CP2
RuBisCO
III) Identificación de los compuestos marcados con 14C.
a) Explique los resultados obtenidos en el ensayo II teniendo en cuenta también los resultados
del ensayo I. b) ¿Qué preparaciones elegiría para realizar el ensayo III? c) Indique los
intermediarios de qué vías metabólicas aparecerán marcados en ambas fracciones. Justifique.
4.
Se aíslan protoplastos de una planta C3 en un medio isoosmóstico y luego se iluminan en
presencia de 14CO2. A continuación se separa el sobrenadante de la fracción cloroplástica. a)
Explique qué compuesto/s de la fracción cloroplástica puede/n aparecer marcados. b) ¿Qué
compuesto/s de la fracción sobrenadante puede/n aparecer marcados? ¿Por qué? c) Calcule la
energía (en forma de moléculas de ATP) y el poder reductor (en forma de moléculas de
NADPH) necesarios para sintetizar una molécula de sacarosa. Considere que la sacarosa se
sintetiza a partir de las siguientes reacciones:
UDP-glucosa + fructosa-6-P
sacarosa-6-P + UDP (sacarosa P sintasa)
Sacarosa-6-P
sacarosa + P (sacarosa fosfatasa)
9
LÍPIDOS
ESTRUCTURA Y CUANTIFICACIÓN
1.
Designar los productos de las siguientes reacciones:
a) hidrólisis de 1-estearoil-2,3 dipalmitoil-glicérido con Na(OH) diluido.
b) hidrólisis de 1-estearoil-2-oleil-fosfatidil-serina con una base concentrada, seguida de
hidrólisis ácida.
c) Tratamiento de 1-palmitoil-2-linoleil-fosfatidil colina con fosfolipasa D.
2.
Se realizó una electroforesis a pH 7 de una mezcla de lípidos que contenía:
a) cardiolipina
b) fosfatidilglicerina
c) fosfatidiletanolamina (PE)
d) fosfatidilserina (PS)
e) O-lisilfosfatidiletanolamina
Indique cómo se desplazarán estos compuestos: hacia el ánodo, hacia el cátodo o permanecerán
en el origen
3.
La siguiente tabla muestra la proporción de lípidos de la membrana plasmática
de E. coli.
Lípido
Fosfatidiletanolamina
Fosfatidilglicerol
Difosfatidilglicerol (cardiolipina)
Colesterol
Fosfatidilcolina
Esfingomielina
Contenido
69
30
1
0
0
0
El porcentaje de los ácidos grasos de dos cepas diferentes se detalla a continuación:
Acidos grasos
Cepa A
Cepa B
Acido palmítico (hexadecanoico)
40
66
Acido palmitoleico (cis-9-hexadecanoico)
24
22
Acido vaccenoico (cis-11-octadecenoico)
36
12
Sobre la base de los datos expuestos, prediga cuál de ambas cepas fue crecida a mayor
temperatura. Indique los efectos del cambio en la composición lipídica y justifique.
4.
Se cuantificó una solución de un triglicérido de origen natural empleando el método
colorimétrico (Chabrol-Charonnat) y el enzimático. El fundamento del primer método consiste
en que los lípidos insaturados, incluyendo los ácidos grasos no saturados (libres y esterificados)
y el colesterol y sus ésteres reaccionan con la vainillina en medio fosfórico, previa acción del
ácido sulfúrico en caliente. El cromógeno rosa así formado es proporcional a la concentración
de lípidos totales de la muestra y se detecta fotocolorimétricamente a 530 nm. El método
enzimático se basa en la determinación del contenido de glicerol mediante las siguientes
reacciones, midiéndose la producción de NADH a 340 nm:
Glicerol + ATP --------> Glicerol-1-P + ADP
10
Glicerol-1-P + NAD+ --------> Dihidroxicetona-1-P + NADH + H+
Con el método de Chabrol-Charonnat se obtuvo una absorbancia a 530 nm de 0,2 (restando el
blanco) para una alícuota de muestra de 0,1 ml, mientras que 0,3 ml de un testigo (2,5 mg/ml) de
trioleína presentó una absorbancia de 0,45 en iguales condiciones de trabajo. Con el segundo método
se obtuvo una Abs340nm de 0,414 para una alícuota de 0,01 ml en un volumen final de reacción de 1
ml. a) Determine la concentración de triglicérido en mM utilizando el método adecuado. Considere
un ε = 6,22 mM-1 cm-1, PM trioleína = 885.
5.
Llega a su laboratorio una muestra de lípido. Un análisis preliminar demuestra que se trata de
un compuesto puro, que podría corresponder a un éster del colesterol, al gangliósido GM2 (de
composición glucosídica glucosa/galactosa/N-acetil-galactosamina y N-acetil-neuramínico) o
su lisoesfingolípido. Usted comprueba que dicho lípido no forma bicapas lipídicas en
condiciones adecuadas. Se hidrolizaron 0,65 g de muestra en un volumen final de 10 ml. Con
50 μl del mismo se realizó la reacción de Chabrol-Charonnat y se obtuvo una absorbancia de
0,452, mientras que la absorbancia utilizando 50 μl de de un testigo de ácido oleico 100 mM
fue 0,232 y la del blanco 0,012. La titulación hasta punto final de los ácidos grasos de 100 μl
de muestra consumió 1 ml de Na(OH) 10 mM. Considere los siguientes PM: Colesterol = 387;
ácido oleico = 282,5; esfingosina = 291; Glu-Gal_NacGal-amina-Nac-Na = 788. a) ¿Qué lípido
constituye la muestra? Describa lo más detalladamente posible su estructura. b) ¿Cuál es su
concentración?
6.
A partir de una muestra de tejido un investigador logró purificar un compuesto que ahora desea
caracterizar. Luego de una hidrólisis completa de la molécula se realizan las siguientes
determinaciones:
I. Dosaje del contenido de fosfato: negativo;
II. Determinación de triglicéridos por el método enzimático: negativo;
III. Reacción de Roe: negativo;
IV. Reacción de Somogyi-Nelson: una alícuota de 0,1 ml de la muestra presentó una Abs de 0,2.
Un testigo de glucosa 0,5 M presentó una Abs de 0,25 en una alícuota de 0,1 ml;
V. Al dar positiva la reacción de Chabrol-Charonnat se sospecha la presencia de un lípido
insaturado en la muestra. La titulación de dicho ácido con álcali reveló que su concentración
es de 0,2 M.
Escriba en fórmulas una posible estructura ¿En qué tejidos y localización celular se encuentra
este compuesto?
7.
Con el objetivo de caracterizar un compuesto lipídico puro, una muestra del mismo se hidrolizó
en un Vf=10 ml para realizar los siguientes análisis:
I. Con el método de Chabrol-Charonnat se obtuvo una Abs=0,6 para una alícuota de 0,4 ml. Un
testigo de ácido oleico 100 mM (25 μl) presentó una Abs=0,45 por el mismo método.
II. Con el método enzimático se obtuvo una Abs=0,51 para una alícuota de 0,01 ml en un
volumen de reacción de 1 ml. Considere un camino óptico de 1 cm y ε =6,22 mM-1.cm-1.
III. La titulación de los ácidos grasos presentes en 200 μl consumió 0,33 ml de NaOH 10 mM.
IV. Las reacciones de Somogyi-Nelson y Roe dieron resultado negativo.
Teniendo en cuenta estos resultados indique: a) ¿Qué tipo de lípido constituye la muestra?
Escriba en fórmulas una posible estructura y determine su concentración. b) ¿A qué valores de
longitud de onda se realizan las mediciones en los métodos espectrofotométricos mencionados?
Justifique su respuesta.
11
8.
Con el objetivo de caracterizar un lípido incógnita se procedió a su hidrólisis completa, y
posteriormente se realizaron las siguientes determinaciones:
I. Contenido de glicerol por el método enzimático: utilizando una alícuota de 0,02 ml en un
volumen final de 1 ml se obtuvo una absorbancia a 340 nm de 0,40 (ε = 6,22 mM-1 cm-1).
Dosaje del contenido de fosfato: Mediante el método de Tausky-Schorr con una alícuota de
0,18 ml se obtuvo una absorbancia de 0,33. La pendiente de una curva de calibración en Abs
vs μmoles de fosfato fue 0,88.
II. Titulación hasta punto final de los ácidos grasos de 0,25 ml de la muestra consumió 0,1 ml de
NaOH 10 mM.
III. Reacción de Chabrol-Charonnat: se obtuvo una absorbancia a 530 nm de 0,15 utilizando una
alícuota de 0,25 ml. Una alícuota de 0,3 ml de un testigo de trioleína 3 mM presentó una
absorbancia de 0,25 en iguales condiciones de trabajo.
IV. Reacción de Somogyi-Nelson y Roe: negativa.
a) Escriba una estructura posible del lípido. b) Calcule su concentración. c) Si este lípido tuviera que
ser degradado en una célula, ¿podría dar origen a glucosa en forma neta? Justifique.
METABOLISMO DE LÍPIDOS. DEGRADACIÓN
1.
Los triacilglicéridos constituyen una importante fuente de energía en los seres vivos. La
tripalmitina es degradada por lipasas a glicerol y 3 moléculas de ácido palmítico
(hexadecanoico). El ácido graso es luego degradado según la reacción:
Acido palmítico + 7 FAD + 7 NAD + 8 CoA + 7 H2O + ATP ----> 8 acetil-CoA + 7 FADH2 + 7
NADH + 7 H+ + AMP + PPi
Teniendo en cuenta que cada FADH2 dará como resultado 1,5 moléculas de ATP al oxidarse en
la cadena respiratoria y que cada NADH dará 2,5 moléculas de ATP: a) Calcule la cantidad total de
moléculas de ATP que se obtendrán por la degradación completa de tripalmitina a CO2 y H2O. b)
¿Cuántos mmoles de glucosa se podrían sintetizar en forma neta a partir de 2,5 mmoles de
tripalmitina? c) ¿Dónde reside la mayor parte de la energía biológicamente disponible por átomo de
carbono de los triacilglicéridos (ácido graso o glicerol)?
2.
El palmitato se activa a palmitoil-CoA en el citosol antes de oxidarse en la mitocondria. Si a un
homogenado de hígado se agregan palmitato y 14C-CoA, el palmitoil-CoA aislado de la
fracción citosólica es radioactivo, mientras que el aislado de la mitocondria no lo es. Explique
estas observaciones.
3.
Indique las diferencias existentes entre la β-oxidación de ácidos grasos en mitocondrias y
peroxisomas. Esquematice la vía con los intermediarios y las enzimas involucradas en dicho
proceso.
4.
Se agrega palmitato uniformemente marcado con 3H (2,48 x 108 cpm/mmol de palmitato) a una
preparación mitocondrial que lo oxida a Acetil-CoA. Este se aísla e hidroliza a acetato. La
actividad específica del acetato aislado fue 1 x 107 cpm /mmol. Explique si este resultado está
de acuerdo con el mecanismo de la β oxidación de los ácidos grasos. ¿Cuál fue el destino final
del 3H?
12
5.
La β-oxidación completa de un mol del siguiente Acil-CoA insaturado hasta Acetil-CoA,
¿Cuántos moles de los metabolitos indicados produce? CH3-CH=CH-CH2-CH2-CO-SCoA (El
doble enlace C=C tiene configuración TRANS)
A
B
C
D
E
6.
Acetil-CoA NADPH
3
0
2
0
3
0
3
0
2
3
FADH2 NADH
1
2
2
2
3
3
2
2
2
0
La hidrólisis de un triacilglicérido con Na(OH) diluido genera los siguientes ácidos grasos: 1C17:0, 2- C18:0, 3- C18:2 Δ 9,12. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es la correcta al
oxidar completamente los ácidos grasos hasta acetil-CoA.
A
B
C
D
E
Acetil-CoA NADP
25
1
26
1
26
0
25
0
26
1
NADH
26
24
26
24
25
NADPH FADH2
1
23
0
22
1
24
0
22
0
23
Suponga que Ud. está sometido a una dieta privada de carbohidratos: a) ¿Qué ocurre con la
utilización de las grasas como fuente de energía? b) En este caso, ¿sería mejor consumir ácidos
grasos de cadena par o impar? Explique
7.
Escriba las fórmulas estructurales de los cuerpos cetónicos, la vía de formación de los mismos
y su función. Indique en qué condiciones metabólicas puede aparecer una elevada
concentración de los mismos en un ser humano.
METABOLISMO DE LÍPIDOS. SÍNTESIS
1.
Escriba una ecuación balanceada para la biosíntesis de ácido esteárico (octadecanoico) a partir
de acetil CoA, NADPH y ATP.
2.
La reacción catalizada por la acetil-CoA carboxilasa es el principal punto de regulación en la
biosíntesis de ácidos grasos. Algunas de las propiedades de esta enzima se detallan más abajo:
a) El agregado de citrato aumenta la Vmáx de la enzima en un factor cercano a 10.
b) La enzima existe en dos formas interconvertibles que difieren marcadamente en sus
actividades, monómero inactivo y un polímero filamentoso activo.
c) El citrato se une preferentemente a la forma filamentosa, mientras que el palmitoil-CoA se
une preferencialmente al monómero.
Explique por qué estas propiedades de la enzima son consistentes con su rol regulatorio en la
biosíntesis de ácidos grasos.
13
3.
Un extracto de hígado dializado catalizará la transformación de acetilCoA a palmitato y CoA si
es suplementado con Mg2+, NADPH, ATP, HCO3- y citrato. Tenga en cuenta esta reacción
cuando responda a las siguientes preguntas: a) Si se suplementa con H14CO3-, ¿qué otros
compuestos se marcarán durante la reacción? ¿En qué compuestos se acumulará 14C como
resultado de la reacción? b) ¿Cómo participa el citrato en la reacción? c) ¿Qué conclusiones
puede sacar del hallazgo de que la reacción es inhibida por la avidina?
4.
Considere que trabaja con una preparación que contiene todas las enzimas y cofactores
necesarios para la biosíntesis de ácidos grasos a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. a) Si se
adicionan como sustratos [2-2H] acetil-CoA (marcada en los tres H del C2 del acetilo con
deuterio, un isótopo pesado del H, fórmula estructural: C(2H)3---CO---SCoA) y un exceso de
malonil-CoA frío (sin marca): ¿Cuántos átomos de deuterio se incorporan en cada molécula de
palmitato (16:0) formada? ¿Cuál es su localización dentro de la molécula? Explique. b) Si se
adicionan como sustratos acetil-CoA fría (sin marca) y [2-2H] malonil-CoA (marcado en los
dos H del C2 del malonilo, fórmula estructural: COOH---C(2H)2--- CO---SCoA)
a) ¿Cuántos átomos de deuterio se incorporan en cada molécula de palmitato (16:0) formada?
b) ¿Cuál es su localización dentro de la molécula? Explique.
5.
A un animal normal bien alimentado se le aplica una inyección intravenosa de acetato
radiactivo marcado con 14C en el grupo metilo. Algunas horas después el animal es sacrificado,
el glucógeno y los triacilglicéridos se aislan del hígado y se determina la distribución de la
radioactividad. a) Explique cómo esperaría que fueran los niveles de radioactividad en los dos
materiales aislados. b) Utilizando fórmulas estructurales, indique los átomos de carbono que
serán marcados más rápidamente en los triglicéridos.
6.
Normalmente, la enzima ácido graso sintetasa condensa un grupo malonil con un acetilo para
formar un tioéster acetoacetil unido a la enzima. El grupo acetoacetilo luego sufre las
reacciones de β reducción antes de condensarse con otro grupo malonil para formar un grupo
β-cetoacil de 6 carbonos. Sin embargo, en ausencia de piridín nucleótido reducido (NADPH),
el grupo acetoacetilo se condensa con un grupo malonil para formar un 3,5 dicetohexanoil
tioéster sobre la enzima. Este intermediario no fisiológico luego subre una ciclación
intramolecular que produce ácido triacético lactona (TAL) y regenera la enzima activa como se
muestra abajo. Mycobacterium smegmatus, a diferencia de la mayoría de las bacterias, tiene
una ácido graso sintetasa de alto peso molecular, multienzimática. Esta, al igual que las otras,
puede sintetizar TAL. Los siguientes datos muestran la síntesis de ácidos grasos y TAL por la
ácido graso sintetasa de M. smegmatus. en distintas condiciones de incubación.
14
a) ¿Qué características de esta enzima son inusuales? b) ¿Qué puede deducir sobre la reacciones de β
reducción catalizadas por este complejo enzimático a partir de la información de arriba?
7.
Se incuban cultivos de células hepáticas humanas en un medio conteniendo como fuente
energética glucosa no radioactiva y ácidos grasos (mezcla de cadenas par e impar) marcados
con C14 uniformemente. A diferentes cultivos se agregan inhibidores de las siguientes enzimas:
I- Piruvato DH, II- isocitrato DH, III- propionil CoA carboxilasa, IV- enoil ACP reductasa y
V- CAT2: Carnitina Acil Transferasa 2.
a) Indicar para cada caso si existirá generación de CO2 luego del agregado de cada inhibidor, y
en caso de que exista, si éste será radioactivo o no (marcado o no con C 14). Explicar en cada
caso su respuesta. b) Indicar si existirá síntesis de ATP dentro de la mitocondria en cada uno
de los casos anteriores.
8.
La leptina es una proteína codificada en el gen de la obesidad (OB). Se ha establecido que
desempeña un rol importante en el control de la obesidad a través de la inhibición del apetito y
la estimulación de la oxidación de ácidos grasos. La leptina induce la fosforilación de una
isoforma de acetil-CoA carboxilasa. Teniendo en cuenta que el malonil-CoA inhibe la enzima
carnitina aciltransferasa I, explique el efecto de la leptina sobre la oxidación de los ácidos
grasos.
METABOLISMO DE COMPUESTOS NITROGENADOS
1.
a) Nombre el -cetoácido que es formado por transaminación de cada uno de estos
aminoácidos: alanina, aspartato, leucina, fenilalanina y tirosina. Para cada aminoácido escriba las
reacciones de transaminación en las que intervienen como sustrato dador y utilizando -cetoglutarato
como aceptor. Nombre las transaminasas correspondientes. b) ¿A partir de cuál de estos aminoácidos
NO puede sintetizarse glucosa en forma neta? ¿Qué particularidad presenta la enzima que cataliza su
transaminación?
2. Describa el ciclo de la glucosa-alanina. ¿Qué función cumple? Explique por qué la síntesis de
glutamina no es la vía preferencial de transporte de amonio del músculo al hígado.
3. a) Describa la forma en que los animales eliminan el exceso de NH3. ¿Qué ventajas considera
que otorga la forma de eliminación en cada tipo de organismo? b) Escriba la ecuación balanceada
global del ciclo de la urea. c) La integración de este ciclo con el ciclo de Krebs disminuye el
costo energético para la eliminación del NH3. Explique.
15
4. Se han descripto deficiencias genéticas asociadas a cada una de las enzimas del ciclo de la urea.
En algunos casos, la disfunción lleva a hiperamonemia (elevados niveles de amonio en sangre)
pero en otros esta sintomatología no es tan marcada. Esta diferencia se basa en la capacidad del
riñón en eliminar, a través de la orina, el/los intermediario/s del ciclo. El diagnóstico inicial de la
enzima afectada se realiza a partir de la determinación de los niveles de ciertos metabolitos en
plasma y orina. El tratamiento de la enfermedad puede incluir, además de una dieta baja en
proteínas, el suministro de benzoato y/o fenilpiruvato. Estos compuestos captan el amonio en
exceso a través de la acción de las enzimas que se describen debajo generando compuestos que
luego son eliminados.
Benzoato + glicina
ácido hipúrico
(glicina N-acetil transferasa)
Fenilpiruvato + glutamina+ acetilCoA
N-fenil acetil glutamina
(acetilCoA:glutamina acetiltransferasa)
En la tabla se resumen las características de tres enfermedades que afectan en cada caso a una de las
enzimas del ciclo de la urea (Arginosuccinato sintetasa, Arginosuccinato liasa y Arginasa) y su
tratamiento.
Enfermedad
Aciduria arginosuccínica
Moderada-baja
Citrulinemia
Arginemia
Significativa
Significativa
Metabolitos en plasma
*Elevados
niveles
arginosuccinato.
*Elevados
niveles
Arginina y orotato.
Metabolitos en
Orina
Tratamiento
Elevados
niveles
de
arginosuccinato.
*Dieta baja en proteínas.
*Elevados
niveles
de
citrulina y orotato.
*Bajos niveles de Arg y
Orn.
Presencia de bajos niveles
de citrulina.
*Dieta baja en proteínas.
*Suministro de Arginina,
benzoato de sodio y/o
fenilpiruvato
Nivel de hiperamonemia
de
de
Presencia de bajos niveles
de Arginina.
*Dieta bajas en proteínas.
*Suministro de benzoato de
sodio y/o fenilpiruvato,
pero no de Arg.
Enzima afectada
a) Asigne en cada caso cual es la enzima afectada. b) ¿Por qué se acumula oriato en sangre en la
citrulinemia y arginemia? c) ¿Por qué no es necesario el suministro de benzoato o fenilpiruvato en el
caso de aciduria? d) ¿Cuál es el compuesto eliminado en la orina en el caso de citrulinemia tratada
con arginina? f) ¿Cuál de los compuestos es más efectivo en la detoxificación del amonio, benzoato o
fenilpiruvato? ¿Por qué?.
5. En un estudio se hizo ayunar a gatos de corta edad y luego se les suministró una sola comida
completa en aminoácidos pero sin arginina. A las 2 h los niveles de amonio sanguíneo
aumentaron desde un nivel normal de 18 g/L a 140 g/L y los gatos mostraron los síntomas
clínicos de toxicidad del amonio. Un grupo control alimentado con una dieta completa en
aminoácidos o una dieta completa en aminoácidos en la que se había sustituido la arginina por
ornitina no mostró síntomas clínicos extraños. a) ¿Cuál era el objetivo del ayuno en el
experimento? b) ¿Qué es lo que hizo aumentar los niveles de amonio? ¿es la arginina un
aminoácido esencial en los gatos? c) ¿Por qué se puede sustituir arginina por ornitina?
6. Un animal en ayuno es alimentado con alanina uniformemente marcada [C14]. Al cabo de unas
horas, el análisis de sangre muestra la presencia de glucosa [C14]. Explique esta observación.
Indique si se detectaría glucosa [C14] en sangre si bajo las mismas condiciones se suministrara:
16
a) fenilalanina [C14], b) cisteína [C14], c) leucina [C14]. En uno de los casos anteriores se detectan
grandes cantidades de acetoacetato en orina, ¿cuál es el aminoácido?
7. Los 3 carbonos del lactato y de la alanina presentan el mismo estado de oxidación y los animales
pueden usar uno u otro como fuente de carbono, indistintamente. a) Compare el rendimiento de
ATP (moles de ATP/ mol de sustrato) para la oxidación completa a CO2 y H2O del lactato y de la
alanina teniendo en cuenta el gasto energético producido por la excreción del NH4+ formado. b)
¿Cuál es el rendimiento de la degradación de serina? Compare con los resultados del ítem
anterior. c) Nombre otro aminoácido que pueda sufrir el mismo tipo de reacción que la serina.
8. Describa las dos rutas a través de las cuales la treonina es degradada en animales. En función de
los esqueletos hidrocarbonados intermediarios implicados, ¿qué tipo de aminoácido es la
treonina, cetogénico, glucogénico o ambos?
9. Un cultivo de algas filamentosas utilizó el 15 % del ATP producido por la degradación aeróbica
completa de la glucosa para fijar N2. a) ¿Cuántos NH4+ incorporó si tenía un volumen de 500 ml
y la glucosa descendió de 3 a 1,2 mM? b) ¿Qué característica estructural deben poseer estas
algas? c) ¿Cómo se incorpora el amonio a los aminoácidos? d) Explique las diferencias entre
plantas y mamíferos, justifique con reacciones.
10. a) Escriba la ecuación balanceada de la síntesis de serina a partir de Glucosa y NH4+. b) Escriba
la vía de obtención de glicina a partir de serina.
11. Existen dos rutas para la transformación de Aspartato en Asparagina a expensas de ATP. Muchas
bacterias poseen una asparagina sintetasa que utiliza el ión amonio como dador de nitrógeno. Los
mamíferos poseen una asparagina sintetasa que emplea la glutamina como dador de nitrógeno.
Teniendo en cuenta que la última reacción requiere un ATP extra (para la síntesis de Glutamina),
explique por qué los mamíferos emplean esta vía. Escriba las reacciones involucradas en ambos
casos.
12. Escriba la ecuación neta para la síntesis de aspartato a partir de Glucosa, CO2 y amonio.
17
ÁCIDOS NUCLEICOS
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
1.
¿Cuál es la secuencia de bases de la cadena de ADN complementaria al siguiente fragmento:
5´TGATCAGGTCGACAA 3´?
2.
Escriba en fórmulas los siguientes oligonucleótidos, indicando las uniones químicas que
participan: pCpGpU y pdApdCpdT. Indique cuáles serían otras posibles formas de anotar los
oligonucléotidos mencionados.
3.
En muestras de ADN aislados de dos especies de bacterias no identificadas, la adenina
representa el 32% y el 17% del total de bases, respectivamente. ¿Qué proporciones relativas de
A, G, C y T esperaría encontrar en las dos muestras de ADN? Una de las bacterias fue aislada
de una vertiente caliente (64°C) ¿podría decir qué ADN proviene de esta bacteria? Fundamente
su respuesta.
4.
La estructura de doble hélice del ADN se pierde por calentamiento. La transición desde la
hélice al desorden tiene lugar en un rango estrecho de temperatura, lo que sugiere que el
proceso es cooperativo. La temperatura al punto medio de transición es llamada Temperatura
de fusión (Tf). Para varias moléculas de ADN hay una relación lineal entre Tf y la fracción
molar de GC (fGC). En NaCl 0,2 M esta relación es:
Tf(°C)= 69,3 + 41 fGC
a) Proponga la base estructural para la dependencia de la Tf sobre f GC
b) Ordene las siguientes moléculas de ADN según su temperatura de fusión:
A)
B)
C)
AAGTTCTCTGAA
TTCAAGAGACTT
AGTCGTCAATGCAG
TCAGCAGTTACGTC
GCACCTCTCAGG
CCTGGAGAGTCC
5.
Una solución de ADN de doble hebra se calienta y luego se enfría a temperatura ambiente
durante un intervalo de dos minutos. ¿Cómo cambiará la absorbancia a 260 nm durante el
enfriamiento si:
a) la solución se calentó por encima de la Tf?
b) la solución se calentó por debajo de la Tf?
6.
Plantee qué experimentos llevaría a cabo para determinar si una muestra biológica de ácidos
nucleicos es:
a) ADN o ARN,
b) simple o doble cadena.
Justifique en cada caso la respuesta.
18
7.
Usted recibe una muestra de material genético de origen viral para su estudio químico y
estructural. La muestra presentó las siguientes características:
a) fue insensible al tratamiento con NaOH 5N.
b) el tratamiento con una endoribonucleasa produjo un sólo fragmento de peso molecular
8x105.
c) al elevar la temperatura se produjo un marcado aumento de la absorbancia a 260 nm.
Con los datos precedentes caracterice tanto como le sea posible a la muestra, justificando en
cada caso su respuesta.
8.
Describa las técnicas más comunes de separación en geles de moléculas de ADN y de ARN.
¿Cómo se pueden visualizar estas moléculas en los geles? ¿Cómo se determina el peso
molecular de un fragmento de ADN corrido en un gel?
9.
a) Suponga que desea marcar radioactivamente de manera selectiva el ADN (es decir, sin
marcar el ARN) de células bacterianas en división, ¿qué molécula radioactiva añadiría al medio
de cultivo?
b) Ud. desea preparar un ADN con sus átomos de fósforo estructural marcado uniformemente
con 32P ¿qué precursor radioactivo debería añadir a la solución? Señale la posición de los
átomos radioactivos.
10.
El fragmento de ADN con la siguiente secuencia fue tratada con una ADN polimerasa,
utilizando el cebador marcado de manera fluorescente (*) y con cada una de las mezclas de
nucleótidos indicadas a continuación. Los didesoxinucleótidos fueron añadidos en cantidades
relativamente pequeñas (ddNTP): a) dATP, dTTP, dCTP, dGTP, ddTTP (se muestra en el gel);
b) dATP, dTTP, dCTP, dGTP, ddGTP; c) dATP, dCTP, dGTP, ddTTP; d) dATP, dTTP, dCTP,
dGTP. El asterisco representa un marcador fluorescente en el cebador indicado:
*5´AGCCCTGTAA3´
3´TCGGGACATTATTACGCAAGGACATTAGAC 5´
El ADN resultante fue separado por electroforesis en gel de
poliacrilamida y las bandas fluorescentes localizadas. Se muestra el
patrón de bandas obtenida con la mezcla de nucleótidos Suponiendo
que todas las mezclas fuesen analizadas en el mismo gel
a) ¿Qué apariencia tendrían los restantes carriles? Explique. b)
Teniendo en cuenta la ecuación Tf = 69,3 + 41fGC (fGC= fracción
molar de GC), determine la Tf del fragmento de ADN secuenciado.
c) Si ese fragmento de ADN doble hebra se somete a una
temperatura de c1) 95ºC; c2) 60ºC y luego se deja enfriar a
temperatura ambiente, mientras se mide la absorbancia de la muestra, grafique Abs en función del
tiempo transcurrido.
d) Determine el PM y la longitud en nm de la secuencia doble hebra.
11.
Represente una estructura típica del ARN de transferencia. Destaque las estructuras más
relevantes. Indique qué tipo de bases puede encontrar además de las 4 más comunes. Sugiera el
propósito de las bases inusuales.
12.
Watson y Crick predijeron el modo semiconservativo de la replicación partiendo de las reglas
de apareamiento de bases de la doble hélice. Posteriormente Meselson y Stahl probaron esta
predicción utilizando células de Escherichia coli con ADN marcado isotópicamente a las que
19
se les permitía replicar su ADN a partir de precursores no marcados y analizando la
distribución del isótopo en las moléculas de ADN hijas después de 1, 2 y 3 generaciones.
Meselson y Stahl emplearon el isótopo pesado de nitrógeno (15N) como marca de densidad para
el ADN y utilizaron la sedimentación por equilibrio en solución de CsCl para separar el ADN
totalmente sustituido con 15N del semisustituido (14N-15N) y el ADN no sustituido (14N).
Si se cultiva E. coli (originalmente marcada con 15N) en un medio con 14N por tres
generaciones (un aumento de ocho veces en población), ¿cuál de las siguientes distribuciones
de ADN entre las tres clases mayores de densidad esperaría encontrar después de la extracción
del ADN?
15
a)
b)
c)
d)
e)
13.
N
1/8
1/8
0
0
0
15
N-14N
1/8
0
1/8
2/8
4/8
14
N
6/8
7/8
7/8
6/8
4/8
Los dibujos siguientes representan el patrón de ultracentrifugación en gradiente de densidad del
ADN celular obtenido en el experimento de Meselson-Stahl.
a) Indique cuál de los patrones anteriores corresponden al patrón de gradiente de densidad
obtenido en la 1°, 2° y 3º generación de células en el experimento realizado por MeselsonStahl?
b) Indique cuáles serían los patrones obtenidos para las 1º y 2º generaciones de células si el
modo de replicación fuera conservativo.
Para cada caso describa las proporciones relativas de cada tipo de DNA que estaría presente en
el extracto.
Para investigar y aprender
En el siguiente enlace encontrarán algunos de los experimentos que llevaron a descubrir que el ADN era la
molécula responsable de la herencia genética.
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Basemol/base_molecular_de_la_herencia.htm#Experimentos transformación
En este enlace hallarán el artículo original publicado por Watson y Crick en 1953, Nature 171: pp. 737–738.
http://www.kennislink.nl/upload/94565_391_1046253050072-watson_crick.pdf.
Si les interesa conocer algo acerca de las contribuciones de Rosalind Franklin a la elucidación de la estructura
del ADN y pensar por qué no ha sido debidamente reconocida, pueden comenzar leyendo el siguiente enlace
http://www.mujeryciencia.es/2008/10/04/rosalind-franklin/
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