IV Encuentro IBIMOL ESTRÉS OXIDATIVO Y NITROSATIVO EN
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IV Encuentro IBIMOL ESTRÉS OXIDATIVO Y NITROSATIVO EN SISTEMAS BIOLÓGICOS. FENÓMENOS AMBIENTALES 10 de Diciembre de 2014 Sesión 1 Papel del estrés oxidativo y nitrosativo en algas e invertebrados PAPEL DEL ESTRÉS OXIDATIVO Y NITROSATIVO EN INVERBRADOS Puntarulo S*, Gonzalez PM Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] La hipótesis de este trabajo fue que la condición oxidativa celular en el medio hidrofílico de invertebrados expuestos a situaciones de estrés de origen natural es adecuadamente controlado mediante mecanismos de respuesta endógena. Se evaluó el índice contenido de radical ascorbilo (A•)/contenido de ascorbato (AH−) en glándula digestiva (GD) del bivalvo, Mytilus edulis platensis (d’Orbigny, 1842) en invierno y verano. Se observó que la relación A•/AH− fue del mismo orden en las GD de M. edulis platensis que en M. edulis chilensis, siendo en ambos casos superior a los valores registrados en GD de otros invertebrados antárticos y subantárticos y en microalgas en condiciones fisiológicas. La dependencia estacional de la capacidad antioxidante fue determinada mediante la actividad de las enzimas catalasa, superóxido dismutasa y glutatión transferasa y del contenido de alfa tocoferol. Se determinó una disminución significativa del contenido de antioxidantes en invierno en comparación con los datos observados en muestras aisladas durante el verano. Sin embargo, no se observaron diferencias estacionales significativas ni en el valor del índice A•/AH− ni en la velocidad de oxidación de 2,7 diclorofluoresceina diacetato (indicador de la generación de especies reactivas en el tejido) entre las muestras recogidas en invierno y verano. Tanto el contenido de nitratos y nitritos como del óxido nítrico, resultaron significativamente mayores en las muestras aisladas durante el invierno en comparación a las obtenidas durante el verano. En base a los resultados obtenidos se puede observar que cada organismo presenta una condición oxidativa propia dependiente de un conjunto de factores intrínsecos y externos que le son propios, y que frente a desafíos naturales, como los cambios estacionales, la capacidad antioxidante se modifica para mantener las condiciones oxidativas en valores que no comprometan la integridad celular. La marea roja se refiere a la muerte de peces, el envenenamiento de mamíferos marinos y humanos a través de la ingestión de moluscos contaminados por toxinas presentes en el fitoplancton o microalgas que constituyen su alimentación. Las toxinas se concentran en los moluscos sin producir la muerte de los invertebrados. El estudio de la condición oxidativa y nitrosativa en GD en muestras aisladas durante la época de la marea roja (primavera) mostró cambios significativos en comparación con los datos previos. Estos resultados sugieren que frente a situaciones que afectan el desenvolvimiento natural del ciclo biológico de los invertebrados (presencia de toxinas en la alimentación) se producen modificaciones en el estado estacionario de las especies activas estableciéndose condiciones de estrés oxidativo y nitrosativo, aunque no se comprometa la sobrevida del animal. Se continuará realizando estudios de las vías de señalización para caracterizar, con un enfoque mecanístico, la situación oxidativa observada. CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Y BIOMARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO Malanga G *, Puntarulo S Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] Los organismos acuáticos están expuestos a una amplia variedad de cambios ambientales tanto naturales (radiación UV, temperatura, salinidad, disponibilidad de oxígeno) como antropogénicos (metales pesados, hidrocarburos, residuos industriales y urbanos, y pesticidas). Todos estos factores pueden causar un desbalance entre la generación y eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas del nitrógeno (RNS), llevando a una situación de estrés, alteraciones en el sistema antioxidante y/o daño oxidativo en los tejidos. Entre la amplia batería de herramientas empleadas para evaluar el efecto de la contaminación en los organismos acuáticos, el estado oxidativo es uno de los más estudiados. En los últimos años además de los marcadores de estrés oxidativos empleados en los programas de monitoreo ambiental que incluyen actividad enzimática y daño a lípidos, se ha comenzado a emplear índices daño/protección, tales como contenido de radicales lipídicos/contenido de α-tocoferol o contenido de TBARS/contenido de α-tocoferol, los cuales podrían proporciona un diagnóstico temprano y sencillo de condiciones de estrés en los organismos acuáticos porque evalúan en forma integral el estado oxidativo celular. En nuestro laboratorio, se han empleado estos índices en numerosos sistemas biológicos, tales como microalgas, moluscos y peces. Los efectos oxidativos han sido analizados frente a la exposición a agentes variados, entre ellos Fe y otros metales pesados, contaminación urbana, portuaria, pesticidas, en organismos expuestos in situ y en condiciones de laboratorio. La información obtenida mediante el uso de este índice puede ser considerada como un poderoso aliado para la detección de las etapas iniciales de estrés oxidativo, en medios celulares lipofílicos e en respuesta al impacto de los factores ambientales naturales y antropogénicos sobre las comunidades acuáticas. Financiado por UBA, CONICET y ANPCyT. MAREA ROJA: PAPEL DEL ESTRÉS OXIDATIVO Y NITROSATIVO EN HEMOCITOS DEL BIVALVO MYTILUS EDULIS PLATENSIS González PM*, Puntarulo S Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] El mejillón Mytilus edulis platensis tiene importancia económica para el consumo interno en nuestro país. La marea roja es un fenómeno mundial cuyo vector más común para esta especie es la diatomea Pseudonitzschia sp. que produce ácido domoico con propiedades neurotóxicas. Existe una correlación positiva entre los eventos de marea roja y niveles elevados de nutrientes (Fe3+, PO43-, y NO3-). Los mejillones tienen un sistema vascular abierto por donde circula la hemolinfa con células de tipo inmunológicas llamadas hemocitos. Estas son capaces de reconocer células invasoras y de generar reacciones contra las mismas fagocitando, secretando factores humorales y produciendo reacciones de estallido oxidativo. La hipótesis plantea que la marea roja produce estrés oxidativo y nitrosativo en los mejillones a través de diferentes procesos involucrando un incremento en la concentración de NO. Los animales usados en el presente trabajo fueron colectados en el Golfo San Matías, Río Negro, a 16 m de profundidad durante el invierno (2012) y la marea roja (2013). Las células fueron extraídas de la hemolinfa y contadas en microscopio óptico. La velocidad de oxidación de la DCFH-DA por los hemocitos aislados resultó significativamente incrementada durante la marea roja en comparación con el invierno. Las concentraciones de Fe total y del pool de Fe lábil no fueron significativamente diferentes entre ambas temporadas. La actividad de la enzima catalasa (CAT) se incrementó significativamente en marea roja en comparación con el invierno (60%); mientras que la actividad de la enzima glutatión transferasa no mostró diferencias significativas en función de las estaciones. El contenido de NO por EPR fue de 3,5 ± 0,1 y 7,1 ± 0,9 nmol/1x106 cel en invierno y marea roja, respectivamente. El contenido de nitratos y nitritos, analizado por el método de Griess, también fue significativamente mayor en marea roja que en invierno (185 ± 26 y 81 ± 16 pmol/1x106 cel, respectivamente). Estos datos preliminares constituyen información experimental original que relaciona el desbalance oxidativo y fundamentalmente nitrosativo en hemocitos expuestos a la toxina de la marea roja. Queda evidenciada la relevancia, no sólo para el conocimiento de la fisiología de los invertebrados, sino también en el aspecto económico en relación a la comercialización de los moluscos. Financiado por UBA, Conicet, ANPCyT EFECTOS AMBIENTALES SOBRE ALGAS FOTOSINTÉTICAS Ostera JM*, Malanga G, Puntarulo S Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] En el marco del cambio climático, el aumento de la radiación UVB (RUVB), como consecuencia de la disminución de ozono, puede producir un reemplazo de organismos fitoplanctónicos grandes y zooplancton hacia aquellos más pequeños, modificando la eficiencia de la “bomba biológica” y liberando CO2 a la atmósfera en lugar de incorporarlo a la trama trófica del océano. Además, este fenómeno afecta principalmente a las zonas polares con incrementos de temperatura, disminuciones en la salinidad y un aumento del aporte de agua dulce en las comunidades costeras. Los cambios en la salinidad ademásde causar afectos directos, fisiológicos o bioquímicos, sobre estos organismos también producen efectos indirectos a través de cambios en la disponibilidadde metales trazas (e.g. Fe) en el ambiente. Cualquiera de estos efectos ambientales afectaría la productividad del fitoplancton y produciría modificaciones en la red trófica. Recientemente, se intentó remediar esta situación mediante la suplementación con masivas cantidades de Fe en el Atlántico Sur. Sin embargo, no se evaluaron las posibles consecuencias negativas sobre la integridad de la comunidad biológica marina mediante el daño oxidativo causado por Fe. El objetivo general del presente proyecto es el estudio comparativo de los mecanismos de respuesta frente a la sobrecarga de Fe, en microalgas de climas templados y antárticos. Para comprender los factores que regulan la productividad de los océanos, se propone identificar la posible existencia de fenómenos adaptativos del metabolismo oxidativo y nitrosativo en las microalgas provenientes de ambientes extremos en situaciones fisiológicas y de sobrecarga de Fe. Se estudió una diatomea de origen antártico, Navicula sp, bajo condiciones de laboratorio. La suplementación con Fe hasta una concentración de 100 µM produjo un aumento en la biomasa, sugiriendo que el Fe a concentraciones menores puede ser considerado un factor limitante para el crecimiento. Estos resultados son consistentes con datos previos de nuestro laboratorio empleando cultivos del alga de climas templados Chlorella vulgaris suplementados con 500 µM Fe. Los resultados obtenidos sobre el efecto del Fe en el crecimiento de los cultivos de la diatomea antártica señalan que a pesar de que el Fe resulta un factor indispensable para el normal desarrollo de los cultivos, un exceso en su disponibilidad afectaría significativamente dicho crecimiento, aún en estas algas provenientes de un ambiente marino con un elevado contenido de Fe natural (3,6 nM-5,7 μM Fe). Estos estudios son la base experimental del análisisdel posible papel del Fe como catalizador de procesos oxidativos en las diatomeas en crecimiento. Financiado por UBA, Conicet, ANPCyT Sesión 2 Radiación UV y cambio global DAÑO OXIDATIVO Y RESPUESTA ANTIOXIDANTE EN MICROCYSTIS AERUGINOSA POR EXPOSICIÓN A RADIACIÓN UV a b c Hernando M* , Rosso L , Malanga G , Houghton Ca, Giannuzzi Lb, Sedan Db, Andrinolo Db a Comisión Nacional de Energía Atómica, Depto. Radiomicrobiología CAC. bArea de Toxicologia, Dpto. de Cs Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas. UNLP. cIBIMOL-Fisico Química, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. [email protected] Debido a la recurrente disminución del ozono estratosférico durante la primavera, los ecosistemas acuáticos están siendo expuestos a dosis incrementadas de radiación ultravioleta B biológicamente activa (RUVB, 280–315nm), no solo en ambientes antárticos y sub-antárticos, sino también en latitudes templadas. Durante los inicios de la vida en la tierra, las cianobacterias han tenido que evolucionar en condiciones extremas de altas dosis de radiación solar, incluyendo RUVB. Este hecho nos permite plantear la hipótesis de la existencia de una rápida protección antioxidante (horas) frente a un aumento en las dosis de radiación. Con el objetivo de evaluar los efectos de la radiación ultravioleta (RUV, 280-400 nm) sobre respuestas fisiológicas, metabolismo y producción de toxinas en una cepa nativa de Microcystis aeruginosa (CAAT 2005-3), se realizaron tres tratamientos de exposición: (i) P (photosynthetically available radiation PAR, 400-700nm), (ii) UVA (PAR+RUVA, 315-700 nm) and (iii) UVB (PAR+RUVA+RUVB, 280-700 nm). Se determinó un umbral de dosis de RUVB, 380 nm y PAR de 90, 9.78 y 9800 kJ m-2 respectivamente, por debajo del cual no se determinaron efectos en parámetros de estrés o producción de toxinas. Para dosis de RUVB entre 90 y 94 kJm-2, a pesar de una disminución de clorofila-a, en cianobacterias expuestas a UVB, fue evidente una disminución significativa en la concentración de especies reactivas del oxígeno (ROS, velocidad de oxidación de 2´-7´- diclorofluoresceina diacetato) debido al consumo de superóxido dismutasa (medido por Assay Kit, Cayman Chemical Company) y un aumento significativo en la actividad de catalasa. Dentro de este rango de dosis también se observa una disminución en la inhibición fotosintética (medida por inoculación de NaH14CO3, evaluando el número de asimilación de carbono) producida por RUV. Para dosis de RUVB mayores a 94 kJm-2, todos los parámetros de estrés y la inhibición fotosintética, aumentan significativamente, siendo el mayor porcentaje de inhibición por RUV, debido a la RUVA. En relación a la producción de toxinas, para las mayores dosis recibidas, la concentración de microcistina (Mcyst, medida por HPLC como concentraciones equivalentes Mcyst-LR) fue significativamente mayor en UVB comparando con UVA y P. Nuestros resultados sugieren que altas dosis de RUVB puede producir estrés oxidativo en exposiciones de corto plazo (4-5 horas), cuando la generación de ROS sobrepasa la defensa antioxidante. Células de M. aeruginosa poseen una alta capacidad de percibir ROS en escalas de horas y rápidamente inician mecanismos de protección antioxidante en respuesta a fluctuaciones en la irradiancia solar. Agradecimientos: a la Dra. S. Díaz quien nos facilitó el radiómetro (Biospherical Inc.) y a los Drs. Opezzo y Costa por compartir equipamiento de laboratorio. EFECTO COMBINADO DE CAMBIOS EN TEMPERATURA Y SALINIDAD SOBRE COMUNIDADES PLANCTÓNICAS MARINAS ANTÁRTICAS. ESTRÉS OXIDATIVO Y FISIOLOGÍA ASOCIADOS AL CAMBIO CLIMÁTICO a b c Visintini N* , Hernando M , Varela D , Malanga Gd, Puntarulo Sd, Ferreyra Ge, Schloss Ia,e a Instituto Antártico Argentino, CABA, Argentina. bComisión Nacional de Energía Atómica, Dpto. Radiobiología, Buenos Aires, Argentina. cUniversidad de Victoria, British Columbia, Canadá. dIBIMOL-Fisico Química, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. eISMER Université du Québec à Rimouski, Québec, Canadá. [email protected] La estructura de las comunidades fitoplanctónicas polares es afectada, debido al cambio climático global, por cambios en temperatura y salinidad, sin embargo poco se han estudiado los efectos de estas variables sobre las respuestas ecofisiológicas de comunidades costeras completas obtenidas de ambientes naturales. En este estudio, las muestras fueron a condiciones de baja salinidad (30 PSU) y alta temperatura (4ºC). durante 6 días en microcosmos (100 L), con agitación y temperatura controlada; los tratamientos fueron: baja salinidad y alta temperatura (S-T+), baja salinidad y temperatura ambiente (S-To), salinidad ambiental con temperatura incrementada (SoT+) y salinidad ambiente con temperatura ambiente (control, SoTo). Los resultados muestran una disminución significativa en la biomasa de los microcosmos S-To, así como un incremento en S-T+. La tasa de crecimiento exponencial en S-T+ alcanzó 1,1 (d-1), siendo significativamente mayor comparada con la observada en S-To (0,4 d-1, p< 0.01). Este incremento fue acompañado de consumo de nitratos. La composición taxonómica de la comunidad, mostro cambios significativos luego de 6 días. Se observó un incremento significativo en la biomasa relativa en células con diámetro entre 5 y 20 µm en condiciones S-T+ y temperatura incrementada con salinidad ambiental, (S-T+). Por otro lado, se evidenció un incremento en la abundancia relativa, medida por clorofila, de células con diámetro < a 5 µm en condiciones S-To y controles. La evaluación de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) mediante la oxidación de la 2´-7´- diclorofluoresceína diacetato (DFC-DA), mostro una disminución significativa en comunidades expuestas a SoT+ (0,7 UA µg chl-a-1) comparada con microcosmos de SoTo (1,5 UA µg chl-a-1). Sin embargo, el daño oxidativo a lípidos, fue significativamente mayor en S-To (0,16 nmol chl-a-1) comparado con ToSo o con SoT+ (0,06 nmol chl-a-1) luego de 1 día de exposición, con una disminución en los días sucesivos hasta alcanzar los valores iniciales (0,06 nmol chl-a-1). La concentración de α-tocoferol disminuyó en S-To comparando el día inicial con el fin del experimento y se observó una disminución significativa en SoT+ en el primer día del experimento. Se hallo una disminución significativa en la eficiencia de la fotosíntesis en células expuestas a baja tratamientos de baja salinidad durante el primer día de exposición en S-T+ y durante el segundo día en S-To. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas luego de 6 días de exposición. En relación a la respiración celular, durante el día 1 fue significativamente mayor en S-T+ comparado al resto de los tratamientos, permaneciendo alta hasta el final del experimento. Nuestros resultados sugieren la existencia de mecanismos selectivos de protección contra peroxidación lipídica, tasa de crecimiento y absorción de nitratos, relacionados con condiciones de temperatura aumentada. En consecuencia, se podría alterar selectivamente la composición de las comunidades fitoplanctónicas, modificando la fijación de carbono en las costas antárticas tanto en condiciones de alta temperatura como de baja salinidad siendo sus efectos aditivos pero no sinérgicos. IMPACTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO, LA BIOMASA Y LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS POR MICROCYSTIS AERUGINOSA a a Rosso L , Crettaz Minaglia M , Houghton C*b, Sedan Da, Malanga Gc, Giannuzzi La,d, Krock Be, Andrinolo Da,d, Hernando Mb a Area de Toxicología, Dpto. de Cs Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas. UNLP. bComisión Nacional de Energía Atómica, Depto. Radiomicrobiología CAC. cIBIMOL-Fisico Química, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. dCONICET, Buenos Aires, Argentina. eAlfred Wegener Institute, Bremerhaven, Alemania. [email protected] La proliferación de M. aeruginosa puede tener consecuencias negativas para el hombre y los ecosistemas, ya que produce la hepatotoxina microcistina (MC), de la cual se han determinado 90 isoformas. El objetivo del presente estudio fue determinar la influencia de la temperatura en el crecimiento, pigmentos fotosintéticos, producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), actividad de catalasa y producción de toxinas por cepas de M. aeruginosa. Los cultivos crecieron en medio BG-11 a temperaturas controladas de 23ºC; 26ºC (control) y 29ºC, con un fotoperiodo de 14 hL: 10 hO, y una intensidad de luz de 30 μE m-2 s-1. La biomasa celular se determinó por recuentos recuento celular y concentración de clorofila. La velocidad de oxidación de la 2´-7´- diclorofluoresceina diacetato (DCF-DA) fue determinada espectroflurométricamente y la actividad catalasa fue determinada espectrofotométricamente. Las MC fueron cuantificadas por cromatografía líquida, seguida en tándem por espectrometría de masas (LC-MS/MS). Se observó una diferencia significativa en las tasas de crecimiento durante la fase exponencial para los tres tratamientos, alcanzando 0,3; 0,53 y 0,76 d-1 para 23ºC, 26ºC y 29ºC, respectivamente. La biomasa celular se incrementó significativamente como consecuencia del aumento de temperatura. Sin embargo, la clorofila celular disminuyó durante los 7 días de exposición. La velocidad de oxidación de DCF-DA fue significativamente mayor en 29ºC comparada con la observada en 26ºC y 23ºC. La actividad de catalasa no varió significativamente en 26ºC a lo largo del experimento, sin embargo los valores a 29ºC fueron significativamente mayores en los días 1 y 4 comparando con los otros dos tratamientos. La mayor concentración de MC medida como MC-LR equivalentes (0,125 ng céls-1) disminuyó significativamente los días 2 y 4, siendo menor al control para este último día en células expuestas a 29ºC. La misma respuesta fue observada en tres isoformas de MC; sin embargo, en otra de ellas, se observó un aumento significativo en la concentración celular alcanzando 0,007 ng céls-1 en el día 4 de exposición, valor que no difirió significativamente del control. Como resultado de la experimentación realizada se concluye que las cianobacterias tienen una gran adaptabilidad a los efectos de la temperatura, siendo la catalasa uno de los mecanismos de respuesta involucrados. La producción de toxinas fue afectada por el aumento de temperatura, aunque no queda claro si hay una disminución en la producción o estas moléculas cumplen una función antioxidante unida a los fotosistemas como ha sido sugerido en publicaciones recientes. Sesión 3 Bioquímica y fisiología del estrés en plantas SÍNTESIS DE ÓXIDO NÍTRICO EN PLANTAS Galatro A*a, Simontacchi Mb, Puntarulo Sa a Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET, Junín 956, 1113AAD, CABA. bInstituto de Fisiología Vegetal (INFIVE) CONICET-UNLP, Diag 113 y 61, La Plata. [email protected] El óxido nítrico (NO) participa en numerosos procesos claves en las plantas tanto en condiciones fisiológicas como de estrés. Si bien no han sido encontrados ni el gen ni la proteína con alta similitud de secuencia con las NOS conocidas, una actividad NOS-like ha sido extensivamente descripta en plantas. Las plantas pueden sintetizar NO a través de múltiples vías (oxidativas o reductivas). En nuestro laboratorio hemos descripto una generación de NO dependiente de L-arginina en hojas de soja, cotiledones y cloroplastos aislados empleando resonancia paramagnética electrónica. Los cloroplastos aislados son capaces de producir NO, en condiciones de suministro de nitrito y L-arginina a través de vías independientes. Recientemente exploramos la hipótesis que el contenido de NO en cotiledones de soja está relacionado con la funcionalidad de los cloroplastos. Empleando microscopía de fluorescencia confocal y técnicas de EPR demostramos que los cloroplastos contribuyen a la síntesis de NO in vivo. La detección de NO en coincidencia con los máximos en peso fresco, contenido de clorofila y eficiencia cuántica del fotosistema II apoyan la hipótesis de una fuerte relación entre los niveles de NO y la funcionalidad de los cloroplastos. Además la exposición a herbicidas produjo una disminución en el contenido de NO en coincidencia con una pérdida de la funcionalidad de los cloroplastos. Por otra parte exploramos la capacidad de sintetizar NO en cotiledones de soja frente a distintas fuentes de nitrógeno (soluciones nutritivas con nitrato o amonio como fuente de N2). En estas condiciones los cotiledones de soja en condiciones fisiológicas son capaces de sintetizar NO en cantidades comparables independiente de la fuente de nitrógeno suministrada. Estos resultados sugieren que los cloroplastos son organelas que contribuyen a la síntesis de NO in vivo, y que la funcionalidad de los mismos es esencial para mantener los niveles de NO en los cotiledones. Por otra parte diferentes fuentes de NO parecen operar para la acumulación de NO en los cotiledones de soja siendo probable que en distintas condiciones por ejemplo la falta de un sustrato, un camino pueda resultar más operativo que otro para mantener los niveles celulares de NO necesarios para el normal funcionamiento y desarrollo. ACOPLAMIENTO DE LA SEÑALIZACIÓN DURANTE EL ESTRÉS ABIOTICO: ROL DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES (MPT) OXIDATIVAS COMO DETERMINANTES DEL POTENCIAL DEL CRECIMIENTO VEGETAL Mendez AAE, Vinacour ME, Matayoshi CL, Benavides MP, Pena LB, Gallego SM* Cátedra Química Biológica Vegetal, Instituto de Química y Fisico-química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini" (IQUIFIB), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] El cambio climático y el avance de los niveles de contaminación de las zonas cultivables impactan de forma directa sobre el crecimiento de las plantas, modificando su supervivencia y/o su productividad. Se ha demostrado que bajo condiciones adversas de crecimiento se altera el balance redox celular, incrementándose el nivel de las especies activas del oxígeno (EAO). Si bien un estallido oxidativo conduce a daños irreversibles en la célula, al día de hoy se ha sumado la idea de que frente a una situación de estrés se producen olas oxidativas que actuarían como señal. Es en este punto donde las modificaciones postraduccionales (MPT) oxidativas y los sistemas de reversión adquieren relevancia, ya que pueden resultar intermediarios en los mecanismos de señalización celular. De este modo, el daño oxidativo a proteínas ha dejado de considerarse un proceso general y azaroso, para convertirse en uno con alto grado de selectividad, que permitiría acoplar las señales de oxidación con la función particular de la proteína, o podría regular la producción de otras MPT y, de esta forma, actuar como nexo entre el reconocimiento del estrés y la respuesta específica de la célula. En animales se ha determinado que numerosas (MPT) de ciclinas D (CYCDs) regulan su funcionalidad, entre ellas la conjugación con ubicuitina, la fosforilación y la sumoilación. En nuestro laboratorio hemos iniciado estudios de expresión, ubicuitinación y carbonilación de ciclina D y CDKA en trigo durante condiciones de estrés abiótico. Nuestra hipótesis general se basa en que las MPT oxidativas de estas porteínas son intermediarias en la traducción de la señal para limitar el crecimiento en plantas sometidas a estrés abiótico. Nuestras metas son poder relacionar MPT oxidativas en las distintas ciclinas D con el potencial de proliferación celular e iniciar estudios sobre la dinámica de reversión de la oxidación de proteínas en respuesta al estrés abiótico. ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS. IMPORTANCIA DE LAS POLIAMINAS Y EL ÓXIDO NÍTRICO EN LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO NITROGENADO Y EL CRECIMIENTO EN PLANTAS DURANTE LA RESPUESTA AL ESTRÉS POR CD Groppa MD*, Iannone MF, Díaz Herrera S, Recalde L, Vázquez A, Zawoznik MS, Gallego SM, Benavides MP Química Biológica Vegetal-Instituto de Química y Físicoquímica Biológica (IQUIFIB), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] La limitación del crecimiento de las plantas como consecuencia del estrés abiótico está generalmente acompañada por un desbalance del estado redox que lleva a la producción de estrés oxidativo por aumento de las especies activas del oxígeno (EAO), o estrés nitrosativo por aumento de las especies activas del nitrógeno (EAN). Por su parte, entre los principales agentes de estrés ambiental se encuentra la acumulación de metales pesados como el Cd. En la regulación del crecimiento están implicadas las poliaminas (PAs), moléculass nitrogenadas estrechamente relacionadas a la respuesta al estrés biótico y abiótico. Las PAs forman H2O2 durante su catabolismo y recientemente se ha reportado que pueden generar óxido nítrico (NO), una de las principales moléculas que participan en las modificaciones de proteínas. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio nos han permitido saber que el NO es un mediador de la toxicidad del Cd en plantas de trigo, estando involucrado en la reducción del crecimiento de las raíces, que regula negativamente la actividad de la nitrato reductasa (NR) y podría participar en la regulación de la enzima, Nos interesa saber si dicha enzima clave en el metabolismo nitrogenado puede ser blanco de modificaciones nitrosativas que modifiquen su funcionalidad. En este sentido hemos iniciado el estudio de la participación de las PAs como generadoras de NO y reguladoras de la NR. También hemos comenzado a estudiar al nitrógeno como una molécula clave no sólo en la nutrición mineral sino además en la señalización celular, obteniendo resultados preliminares que indican que la deficiencia de nitrógeno en el medio de cultivo redunda en un mayor crecimiento de las plantas de trigo cuando crecen bajo estrés por Cd. Nuestro principal objetivo en este proyecto es estudiar si los niveles de EAO y EAN se modifican por el estrés por Cd y si estas especies reactivas regulan la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés, particularmente los relacionados con el metabolismo de PAs y los de asimilación y transporte de nitrógeno, y si, por su parte, las PAs como moléculas nitrogenadas pueden regular o modificar la formación H2O2 y NO, modulando así la respuesta al estrés por Cd. Para ello, estableceremos dos niveles de estudio, uno que involucra evaluar la respuesta de plantas de interés agrónomico y otro utilizando Arabidopsis thaliana como modelo, ya que se encuentran colecciones disponibles de semillas mutantes que proveen la herramienta ideal para el estudio propuesto. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN NAM: SU ROL SOBRE EL ENVEJECIMIENTO DE LAS HOJAS Y LA ACUMULACIÓN DE FE EN GRANOS Checovich ML*a, Galatro Ab, Simontacchi Mc, Santa María GEa a Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Instituto Tecnológico Chascomús (IIB-INTECH), CONICETUNSAM. Av. Intendente Marino Km 8,5, Chascomús. bFisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. cInstituto de Fisiología Vegetal (INFIVE) CONICET-UNLP, Diag 113 y 61, La Plata. [email protected] La alimentación humana se encuentra asociada al consumo de unas pocas especies, fundamentalmente arroz, trigo y maíz. Pero los granos de estos cultivos suelen poseer bajas concentraciones de varios de los elementos esenciales requeridos en nuestra dieta. De modo que, uno de los principales objetivos para el mejoramiento de los cultivos es la identificación de genes que se asocien con una alta concentración de nutrientes en los granos. El estudio de la variabilidad genética en trigo permitió identificar en uno de sus ancestros el factor de transcripción NAM-B1, cuya introgresión en especies actuales aumenta la concentración de proteína, hierro (Fe) y Zinc (Zn) en grano. En forma recíproca, en trigos actualmente cultivados, la reducción en la expresión de todos los homólogos de NAM-B1 por RNAi ocasiona una disminución de la concentración de los nutrientes y un retardo en el envejecimiento o amarillamiento de las hojas. Dado que la senescencia de las hojas está íntimamente relacionada con la removilización de nutrientes hacia el grano, el retraso que ocurre bajo la down regulación de los genes NAM puede explicar la baja concentración de Fe en grano. Para contrastar esta hipótesis nuestro estudio se focalizó en evaluar –a través de la comparación de plantas con niveles normales (Wt) ó reducidos (Dr) de expresión de los genes NAM- el curso de la senescencia en términos de la degradación de los cloroplastos, los que constituyen un importante reservorio de Fe en la hoja. Como parámetros de senescencia foliar se midieron en la hoja más próxima a la espiga –hoja bandera (hb)– el contenido de clorofila y la funcionalidaddel fotosistema II. La primer cosecha se efectuó cuando ambos indicadores no difirieron entre genotipos, y la segunda cuando las diferencias empezaron a ser significativas. En cada cosecha se determinó la concentración de Fe en grano y en Hb, y se estudió por citometría de flujo y microscopía electrónicala cantidad, morfología y tamaño de los cloroplastos. Los datos de la primer cosecha muestran que el genotipo Wt presentó mayor concentración de Fe en grano antes que los indicadores de senescencia foliar y la morfología de los cloroplastos difirieran entre genotipos. Estos datos sugieren que en etapas tempranas de llenado de grano existiría cierta independencia entre la traslocación de Fe y la senescencia de la Hb. EFICIENCIA EN EL USO Y ADQUISICIÓN DE FÓSFORO EN PLANTAS CULTIVADAS: PARTICIPACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO Ramos Artuso F*a, Galatro Ab, Simontacchi Ma a Instituto de Fisiología Vegetal (INFIVE) CONICET-UNLP, Diag 113 y 61, La Plata. bFisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] El fósforo (P) es un nutriente esencial para las plantas y la extracción permanente del mismo mediante las cosechas agrícolas obliga a reponer el P extraído de los suelos a fin de mantener el nivel de rendimiento de los cultivos. Por tratarse de un elemento de ciclo sedimentario, su extracción se realiza del subsuelo, en minas de origen mineral u orgánico, y no de la atmósfera, como es el caso del nitrógeno. Por estas características puede definirse al P como un recurso finito y no renovable, estimándose que el pico de máxima disponibilidad se alcanzará en los próximos 50 años, y a partir de dicho momento, por dificultades en la extracción y reducción de la disponibilidad la oferta se verá gradualmente reducida. Las plantas han desarrollado adaptaciones para subsistir en suelos de reducida dotación de P, implicadas en el control de su captura, retención y conversión a biomasa. Modificaciones en la morfología radical, acidificación de la rizósfera, liberación de ácidos orgánicos y fosfatasas por la raíz, y reducción de la cantidad de ARN en los tejidos, son algunas de las respuestas de las plantas frente a la carencia de P. El óxido nítrico (NO) resulta indispensable para modular numerosas respuestas fisiológicas; afectando la arquitectura de la raíz, actuando como mediador en la acción de fitohormonas y regulando la expresión de genes. Para estudiar el efecto del déficit de P y su interacción con NO se cultivaron plantas de maíz en solución hidropónica tipo Hoagland con dotación completa de nutrientes y luego de siete días se separaron dos tratamientos, uno con suministro normal de P (0,5 mM H3PO4) y otro sin agregado de P. El efecto del NO se analizó empleando Snitrosoglutatión (GSNO) en concentración 0,1 mM, agregado con cada cambio de solución nutritiva. Se analizaron parámetros morfológicos, contenido de pigmentos fotosintéticos, antocianinas, y distribución de P dentro de las plantas luego de 17 días de tratamiento. Las plantas expuestas a restricción de P presentaron una mayor longitud de raíz, y una reducción significativa en la partición de biomasa entre parte aérea y raíz, con respecto a las plantas sin limitación de nutrientes. El agregado de NO afectó la dinámica de distribución de P dentro de la planta, el crecimiento y la cantidad de clorofila. Sesión 4 Estrés oxidativo y nitrosativo en sistemas biológicos EFECTOS DEL SILDENAFIL SOBRE LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL DE CORAZÓN DE RATA Zaobornyj T*, Almeida A, Valdez LB, Boveris A Cátedra de Fisicoquímica, Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. Junín 956, 1113AAD, CABA. [email protected] El sildenafil es un análogo estructural del GMPc que actúa inhibiendo a la fosfodiesterasa 5, enzima encargada de degradar el GMPc, acentuando y perpetuando los efectos derivados del óxido nítrico (NO), tales como la vasodilatación. Estudios realizados en animales mostraron la capacidad del sildenafil de limitar el tamaño del área infartada, mejorar la función contráctil post isquemia-reperfusión y reducir la incidencia de arritmias; imitando la cardioprotección observada en el precondicionamiento isquémico. La hipótesis de trabajo se asienta sobre la idea de que las mitocondrias desempeñan una función crítica en el control del metabolismo celular ya que constituyen no solamente la fuente de energía celular sino también reservorios de Ca2+ y sitio de producción de señales químicas tales como anión superóxido y el NO. Teniendo en cuenta que las patologías isquémicas representan la principal causa de morbi-mortalidad en la actualidad; y que existen trabajos que indican que el sildenafil sería un fármaco capaz de proteger al corazón ante la falta aguda de oxígeno, el objetivo de este trabajo fue caracterizar el efecto in vitro del sildenafil sobre la función mitocondrial. Se realizaron determinaciones utilizando mitocondrias aisladas de corazón de rata en presencia de citrato de sildenafil. Los resultados muestran que el sildenafil, en concentraciones de hasta 200 µM, no afecta la velocidad de consumo de O2 en cortes de tejido ni en mitocondrias aisladas, utilizando tanto sustratos del complejo I o del complejo II de la cadena de transporte de electrones. Asimismo, no se observaron cambios en la actividad enzimática de los complejo I-III, II-III y IV ni despolarización de las organelas. Sin embargo, dichas concentraciones de sildenafil redujeron (40%) la velocidad de producción mitocondrial de H2O2. Se prevé establecer un protocolo de isquemia-reperfusión con tratamiento agudo y crónico con sildenafil con el fin de caracterizar los efectos de dicho fármaco como cardioprotector y estudiar la función mitocondrial para evaluar los efectos sobre dicha organela durante el fenómeno de isquemia-reperfusión. Se trabajará en tejido, en cardiomiocitos y en mitocondrias aisladas. STENTS DEGRADABLES DE Fe: IMPORTANCIA DEL pH Y LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN INSOLUBLES EN LA EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD Fagali NS*a, Grillo CAa, Puntarulo Sb, Fernández Lorenzo MAa,c. a Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA), CCT La Plata - CONICET, Dpto. de Química, Fac. de Cs. Exactas, UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina.bFisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA.cFacultad de Ingeniería, UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina. [email protected] El Fe puro y algunas de sus aleaciones se han propuesto para la fabricación de stents temporales biodegradables dada su susceptibilidad a una rápida corrosión en medios biológicos. Sin embargo, la disolución del stent podría originar efectos colaterales en las células aledañas al implante tales como estrés oxidativo, inflamación, etc. Los mecanismos por los que estos procesos se llevan a cabo aún no están suficientemente dilucidados dado que la evaluación in vivo en la zona del implante resulta compleja. El objetivo de este trabajo fue determinar la importancia de los iones Fe3+ solubles liberados, los cambios de pH y los productos insolubles de la degradación en la evaluación de la citotoxicidad de estos biomateriales .Para evaluar el efecto de Fe liberado, se incubaron células CHO-K1 con medio de cultivo (MC) suplementado con diferentes concentraciones de sal de Fe3+ (FeCl3.6H2O; 1-5 mM) cuyos pH variaron entre8,4 y 5,6. El “efecto de pH” se determinó empleando MC con pHs ajustados a los obtenidos a las distintas concentraciones de sal de Fe3+. Se determinaron la actividad mitocondrial (MTT), el daño oxidativo a lípidos (TBARS), la concentración de Fe soluble en MC y el contenido de Fe intracelular (métodos colorimétricos).En la evaluación de ambos efectos (“Fe” y “pH”) se observó que la actividad mitocondrial fue menor que la de las células control en todo el rango estudiado. En el rango 1-2 mM de Fe3+, la disminución de la actividad se atribuyó exclusivamente al descenso de pH. Mientras que en el rango 3-4 mM, hay formación de precipitados y el efecto deletéreo debido al Fe3+ fue mayor que el causado sólo por el pH. En presencia de Fe, se determinó mayor producción de TBARS que en las células control para todo el rango estudiado, que fue independiente de los cambios de pH. Tanto la disminución en la actividad mitocondrial como el aumento en la producción de TBARS parecen estar asociados al contenido de Fe intracelular más que a la concentración de Fe soluble en el MC. Por otro lado, los resultados mostraron que el mecanismo y velocidad de degradación dependen fuertemente de la relación Fe/proteínas en el medio. La biocompatibilidad de materiales degradables en base a Fe no sólo depende de los iones Fe3+ liberados solubles sino también de los cambios de pH producidos durante la degradación y la formación de productos insolubles en la interfase Fe/células. Sesión 5 Distintas aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia de Spin Electrónico (ESR) ALGUNAS APLICACIONES DE ESR EN QUÍMICA Y BIOLOGÍA Facorro GB, Rubin de Celis E, Piehl LL* Cátedra de Física. Departamento de Fisicomatemática. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 956, (1113) CABA, Argentina. [email protected] La espectroscopía de Resonancia de Espín Electrónico (ESR) permite la detección de radicales libres en distintos sistemas mediante diversas técnicas. En líneas generales, se puede tener como objetivo: 1) la detección de radicales libres presentes en un sistema: en forma directa, si el radical es estable o de vida media corta; o indirecta, para radicales de vida media muy corta, mediante el uso de atrapadores de espín (spin trapping). 2) introducir un radical libre estable en un sistema a fin de obtener información de estructura, movimientos moleculares, fluidez, reacciones de oxido-reducción, etc. Esto incluye el uso de una sonda de espín (spin probing) o la marcación in situ de un componente del sistema (spin labelling). El presente resumen tiene como objetivo mostrar la aplicación de estas diferentes metodologías a diversas líneas de investigación propias o en colaboración con otras Cátedras e Institutos, realizadas en el Laboratorio de Resonancia de Espín Electrónico de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. 1) En forma directa se detectaron y estudiaron radicales libres producidos por irradiación. En otro estudio, se detectó la producción de radicales libres estables de diversas cumarinas producidos al ser incluidas en los medios de cultivo de células leucémicas de la línea U-937 y se determinó su mecanismo de acción en la producción de apoptosis por detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) mediante spin trapping. Usando esta última técnica, se detectaron ROS en cerebros de ratas en un modelo de asfixia perinatal y óxido nítrico en retinas de ratas sometidas a iluminación continua. Por otra parte, la técnica de spin trapping permitió estudiar el mecanismo de activación del peróxido de hidrógeno por complejos de polianfolitos con cobre y cobalto en catálisis heterogénea. 2) Mediante el uso de los ácidos 5 y 16-doxil esteárico como sondas de espín, se estudiaron cambios en la fluidez de membrana (microviscosidad y orden) en: glóbulos rojos en presencia de diferentes concentraciones de aluminio, arsénico o cromo; espermatozoides en diversas situaciones y liposomas sometidos a estrés oxidativo en ausencia y presencia de antioxidantes. Por otra parte, la introducción del radical libre estable TEMPO a un sistema permitió el estudio de la capacidad antioxidante debida al ácido ascórbico, metodología que fue aplicada al estudio de la capacidad antioxidante del plasma en dos diferentes estudios: ratas sometidas a hipoxia y/o intoxicación con plomo, y pacientes renales crónicos (en diálisis) con y sin suplemento de dicha vitamina. DETERMINACIÓN DE FLUIDEZ DE MEMBRANA EN ESPERMATOZOIDES POR ESR Piehl LL* Cátedra de Física. Departamento de Fisicomatemática. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 956, (1113) CABA, Argentina. [email protected] Los espermatozoides de mamífero deben sufrir aún dos procesos luego de la espermatogénesis, para ser capaces de fecundar a un ovocito: la maduración epididimaria y la capacitación espermática. Esta última consiste en una serie compleja de eventos moleculares que involucran, entre otros, cambios en la membrana plasmática tales como alteración en la distribución de fosfolípidos y eflujo de colesterol de la membrana de la cabeza del espermatozoide, con el consecuente incremento de su fluidez; y la activación de señales de transducción con incremento en la fosforilación en tirosina de diversas proteínas. Por otra parte, durante los procesos de criopreservación de espermatozoides, se producen cambios similares a la capacitación espermática conocidos como crio-capacitación. Las hipótesis planteadas involucran la inhibición de los cambios biofísicos en la membrana de los espermatozoides porcinos, junto con otros eventos que ocurren en la capacitación y la crio-capacitación, ante la presencia de lípidos de vesículas membranosas presentes en el plasma seminal (exosomas), liposomas o aditivos usados en criopreservación. Para evaluar los cambios en membrana, se utilizó espectroscopía de Resonancia de Espín Electrónico (ESR) usando como sondas de espín los ácidos 5 y 16-doxil esteáricos (5-DE y 16-DE) para evaluar fluidez de membrana y 3β-doxil-5α-colestano (3DC) como análogo del colesterol. Estos estudios se complementaron con técnicas microscópicas de evaluación de las células, determinación de colesterol y análisis de proteínas fosforiladas en tirosina por Western blot. El estudio de los exosomas mostró baja fluidez de membrana, alto contenido de colesterol y esfingomielina y composición proteica compleja. Los exosomas inhibieron el eflujo de colesterol, el aumento de fluidez en membranas apicales y la desfosforilación en tirosina de un polipéptido de 14 kD, todos procesos asociados a la capacitación espermática. Liposomas de composición lipídica similar a las vesículas imitaron dichos efectos. Se observó además transferencia de dos proteínas de las vesículas a los espermatozoides, lo cual sugiere una interacción entre ambos. En espermatozoides sometidos al descenso de temperatura de 17 a 5 ºC, etapa donde se produce la criocapacitación, se observó que la fracción soluble de la yema, utilizada como fuente de lípidos, mantenía la fluidez de la parte externa de la membrana (evaluada mediante la sonda 5-DE), mientras que fluidificó la parte interna de la misma (evaluada con 16-DE). Se ensayaron también liposomas de composición fosfolipídica semejante a la yema y a los exosomas. El uso de la sonda 3DC permitió estudiar la interacción de los espermatozoides con dichos aditivos. ESTUDIO DE N-ÓXIDOS DE AMIDINOQUINOXALINA COMO ATRAPADORES DE ESPÍN NOVEDOSOS Gruber N*a, Orelli LOa, Stipa Pb, Facorro Gc, Rubin de Celis Ec, Piehl LLc a Departamento de Química Orgánica. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. CONICET. Junín 956, 1113, CABA, Argentina. bS.I.M.A.U. Department – Chemistry Division, Università Politecnica delle Marche, via Brecce Bianche 12, I-60131 Ancona, Italy. cCátedra de Física. Departamento de Fisicomatemática. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 956, 1113, CABA, Argentina. [email protected] Los radicales libres producidos en sistemas biológicos presentan en general vida media demasiado corta como para ser detectados directamente por espectroscopía de Resonancia de Espín Electrónico (ESR). Por este motivo, se recurre al uso de atrapadores de espín (espín traps), sustancias diamagnéticas que reaccionan con los radicales libres transientes para dar productos paramagnéticos (aductos de espín) de vida media adecuada para ser detectados y caracterizados en experimentos de ESR. Si bien existen atrapadores de espín comerciales (entre los más usados se encuentran el 5,5-dimetil-3,4-dihidro-2H-pirrol N-óxido o DMPO y la N-tert-butil-α-fenilnitrona o PBN), todos ellos presentan limitaciones, por lo que sigue siendo de interés la búsqueda de nuevas moléculas que presenten eficiencia en la reacción de “spin trapping”, aductos estables y señales de ESR características del radical atrapado. En este marco se presenta una serie de nitronas derivadas del núcleo de pirimidoquinoxalina como atrapadores de espín novedosos. Tres características estructurales de estos compuestos permiten anticipar su capacidad de originar aductos de espín estables: la ausencia de H - a la función N-óxido, la incorporación de un anillo aromático fusionado y la presencia de un grupo funcional amidina (atractor de electrones). Todas las nitronas sintetizadas demostraron capacidad para atrapar radicales metilo, generados por la reacción de Fenton en presencia de dimetilsulfóxido. Los aductos de espín correspondientes se destacaron por su elevada persistencia y fueron caracterizados por ESR con el apoyo de técnicas de simulación y cálculo. Las cinéticas de formación y descomposición de los aductos fueron estudiadas e interpretadas según factores estéricos y electrónicos, con contribución de cálculos DFT y MP2. Por otra parte, en ensayos de competición con el atrapador de espín comercial DMPO, si bien se observó una reacción más inmediata de los radicales con el DMPO, la señal de los aductos con los nuevos atrapadores ensayados fue mucho más persistente que la de aquellos correspondientes a dicho atrapador comercial. X N N N Ar O ·CH3 X N N O N Ar Espectro ESR
