Posters - Sociedad Española de Inmunología
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Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 63 Posters Inmunología Vol. 26 / Supl. 1/ Marzo 2007: 63-128 SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD-1 Moderadores: Mª Carmen Gelpí Sabater (Barcelona), Enrique García Olivares (Granada) 1. PRESENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA ÁCIDA DE LA GLIA EN PACIENTES DIABÉTICOS Y SUJETOS SANOS. Otero I, Camiña F, Rodríguez J, Rodríguez-Segade S, Peakman M, Varela R. Departamento de Bioquímica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela. La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destrucción de las células productoras de insulina de los islotes de Langerhans del páncreas. Esta destrucción está mediada por distintas células del sistema inmune que infiltran el interior de los islotes en el periodo prediabético y destruyen específicamente a las células &#61538; productoras de insulina. Aunque la infiltración observada en la DM1 parece estar restringida en gran medida a los islotes, todavía son pocos los antígenos identificados que podrían dirigir el proceso. Algunos de estos antígenos se expresan exclusivamente en los islotes, como la pre-proinsulina, pero muchos otros muestran una expresión más amplia y han sido detectados en el tejido nervioso periférico, como por ejemplo, la decarboxilasa del ácido glutámico (GAD) y más recientemente la proteína ácida de la glía (GFAP). GFAP es un autoantígeno en la DM1 descrito recientemente, expresado por las células de Schwann que rodean los islotes. En este trabajo se demuestra la presencia de antoanticuerpos circulantes contra GFAP en plasmas de pacientes diabéticos de tipo 1 (DM1) y de tipo 2 (DM2), mediante Inmunoblotting y ELISA. Para ello hemos clonado, expresado y purificado GFAP como una proteína de fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP) para usarla en la detección de autoanticuerpos. Nuestros resultados muestran que hasta un 75% de los pacientes DM1 tienen autoanticuerpos anti-GFAP en el suero, frente a sólo un 25% de los sujetos sanos de la misma edad (p= 0,021; Test de Fisher). Un alto porcentajede los pacientes DM2 también muestran autoanticuerpos anti-GFAP, casi un 50%; sin embargo, la presencia de estos autoanticuerpos podría estar relacionada con la edad porque un porcentaje similar (52%) de los sujetos sanos con el mismo rango de edad también muestran autoanticuerpos anti-GFAP. Estos resultados muestran que GFAP es un antígeno reconocido específicamente por el sistema inmune de los paciente DM1, pero que con los años se induce una respuesta tanto en individuos sanos como en DM2. Debido a que la neuropatía y el daño a nervios es una de las complicaciones más frecuentes en la diabetes, nuestros resultados sugieren que, al menos en parte, este daño puede ser debido a la respuesta inmune contra componentes del sistema nervioso. 2. LINFOCITOS T REGULADORES EN PACIENTES CON ENFERMEDAD INFLATORIA INTESTINAL TRATADOS CON CITAFÉRESIS ABSORTIVA. Alonso M, Echaniz P, Juan MD de, Arenas JI, Cuadrado E. Hospital Donostia. La citaféresis de monocitos y granulocitos se ha demostrado útil en el tratamiento de enfermos con colitis inflamatorias pero el meca- nismo de acción terapéutico es mayormente desconocido. Dada la implicación de los linfocitos T reguladores en el control de la autoinmunidad, hemos especulado que el efecto terapéutico podría relacionarse con un incremento y función de esta población celular Material y métodos. Hemos estudiado 4 pacientes de colitis ulcerosa y 2 con enfermedad de Crohn tratados con citaférsesis absortiva (adacolumnR, 5 sesiones semanales); dos de ellos presentaban lesiones cutáneas severas asociadas (pioderma gangrenoso y eritema nodoso). Muestras de sangre se tomaron antes y un mes despues del tratamiento. El numero de linfocitos T reg se determinó por citometría de flujo y cuantificación de la expresión de FOXP3 en los linfocitos CD4 por PCR a tiempo real. Paralelamente se cuantificó la expresión de TGF beta. Resultados. Los resultados fueron muy heterogéneos no apreciándose correlación entre el efecto terapéutico sobre la enfermedad inflamatoria intestinal y las variaciones de linfocitos reguladores o la expresión de FOXP3 y TGF beta. Sin embargo, las lesiones cutáneas se resolvieron rápidamente con el tratamiento y en ambos casos aumentaron el número de linfocitos Treg y los niveles de FOXP3 y TGF beta. El efecto beneficioso del tratamiento se confirmó en una posterior recidiva del pioderma gangrenoso. Conclusión. Aunque los resultados no apoyan que el efecto terapéutico de la citáferesis en las colitis inflamatorias se deba a la movilización de linfocitos Treg, la resolución de las lesiones cutáneas observada en los dos casos si parece asociada a tal efecto. 3. VARIABILIDAD CLINICA EN LA FORMA DE PRESENTACION DEL SINDROME POLIGLANDULAR AUTOINMUNE TIPO III. Carbone J. Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón. Madrid. Introducción. En una reciente clasificación de síndromes poliglandulares autoinmunes (SPA, Amerio et al, 2006), se define como SPA tipo III (SPA-III) a la asociación de enfermedad tiroidea autoinmune con: diabetes autoinmune, adeno y/o neurohipofisitis o fallo ovárico prematuro (SPA-III-A); anemia perniciosa, enfermedad celiaca, hepatitis autoimmune o CBP (SPA-III-B); vitiligo, miastenia gravis (SPA-IIIC); o con enfermedades del colágeno, vasculitis o enfermedad hematológica autoinmune (SPA-III-D). El retraso diagnóstico de algunas de estas enfermedades autoinmunes conlleva un riesgo de desarrollo de complicaciones graves y/o secuelas. Diseño: Estudio retrospectivo de caso clínico. Objetivo. Presentación de casos clínicos en los que no se había sospechado el diagnóstico de SPA. Setting: Clínica Senra, Madrid. Pruebas diagnósticas realizadas en distintos centros. Caso 1. Una mujer de 29 años, procedente de Cadiz, tenía diagnosticado un hipotiroidismo autoinmune y recibía tratamiento sustitutivo hormonal. Asocia vitiligo y polidactilia. Cuando acude a la consulta refiere cansancio, tinnitus, vértigo y palpitaciones de 5 meses de duración. Se solicitan estudios en los que se constata: anemia megaloblástica (Hb 9,1 g/dl, VCM 125,45 fl, HCM 41 pg); niveles muy bajos de vitamina B12 (<88 pg/mL), anticuerpos anti-células parietales gástricas y anti-factor intrínseco; gastritis atrófica (biopsia) y niveles elevados de gastrina. Se establece un diagnóstico de anemia perniciosa 63 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 64 POSTERS en el contexto de un SPA-III- B+C. Un estudio neurológico realizado por la deficiencia de vitamina B12 evidenció compromiso de cordón posterior (potenciales somatosensoriales anormales). El retraso en la terapia con vitamina B12 puede causar una secuela neurológica permanente, por lo que se inició inmediatamente terapia con vitamina B12 IM. Los síntomas y la anemia de la paciente se corrigieron. Caso 2. Una mujer de 18 años, procedente de Zaragoza, acude a la consulta por hipogammaglobulinemia (IgG 547, IgA 58 mg/dl) y por la coexistencia inexplicable de múltiples problemas. Ha sido evaluada por varios especialistas. Es portadora de la mutación del Factor V de Leiden. En un plazo de 2 años (2004-2006) la paciente presenta secuencialmente: hipotiroidismo autoinmune (Tiroiditis de Hashimoto), adenohipofisitis (alteraciones de campo visual, hiperprolactinemia y aumento de tamaño y de captación de gadolinio por hipófisis, sin microadenoma), síndrome de dolor regional complejo tipo 1, radiculopatía espontánea múltiple cervical y lumbar con prolapso y destrucción discal invalidantes, y fallo ovárico prematuro. No hay datos de síndrome linfoproliferativo ni de trombosis. La capacidad para formar anticuerpos esta conservada. Se establece un diagnóstico de SPA-III-A. Conclusiones. Se insiste en la necesidad de una evaluación completa encaminada a descartar otras enfermedades autoinmunes en pacientes seleccionados con tiroiditis autoinmune. La patología discal múltiple (se ha postulado la posible naturaleza autoinmune de esta entidad) no se ha descrito previamente en el SPA. 4. ICTUS LACUNAR RECURRENTE EN PACIENTE JOVEN CON TÍTULOS BAJOS DE ANTICUERPOS ANTIBETA2GLICOPROTEINAI. IMPORTANCIA DEL TRATAMIENTO PRECOZ. Alecsandru D1,2, Sánchez-Ramón S1, Rodríguez-Mahou M1, Oliver Miñarro D1, Fernández-Cruz E1. 1Unidad de Inmunología Clínica, Servicio de Inmunología, Hospital Gregorio Marañon, Madrid. 2Servicio de Inmunología Clínica, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Introducción y objetivos. Los criterios diagnósticos del síndrome antifosfolípido (SAF) incluyen al menos una manifestación clínica (trombosis vasculares y morbididad obstétrica), y al menos un dato de laboratorio: presencia en suero de anticoagulante lúpico, anticuerpos (Ac) anticardiolipina IgM e IgG (ELISA) a títulos moderados o altos en al menos 2 ocasiones separadas 12 semanas y recientemente los Ac antibeta2glicoproteina-I IgM e IgG (ELISA) a títulos moderados o altos en al menos 2 ocasiones separadas 12 semanas entre sí. Quedan fuera del diagnóstico pacientes con títulos bajos de Ac relacionados con el SAF y por tanto, se plantea el dilema de la indicación del tratamiento anticoagulante precoz y permanente en estos pacientes. Paciente y métodos. Paciente mujer de 37 años, con antecedente de hirsutismo no filiado y cefalea crónica de 10 años de evolución, es remitida a nuestra consulta por presentar ictus lacunar sensitivo derecho de repetición (2 episodios en abril y junio de 2006) asociado a títulos séricos bajos de Ac antibeta2glicoproteina-I IgG (ELISA, OrgenTec Diagnostika GmBH). No presentaba factores de riesgo cardiovascular. Refería alteraciones de la sensibilidad perioral y lingual y pérdida de equilibrio ocasional, como secuelas del último episodio de ictus, astenia marcada, fenómeno de Raynaud distal en extremidades y tumefacción en cara, manos y miembros inferiores. No presentaba lívedo reticularis, no aftas orales, no artralgias ni fotosensibilidad. No otra sintomatología de interés. Se inició tratamiento con acenocumarol (manteniendo INR 2-3) y se realizó un estudio inmunológico. 64 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 Resultados. Los datos de laboratorio evidenciaban la presencia de Ac antibeta2glicoproteina-I IgG en dos ocasiones a títulos bajos, 10 y 12 U/ml, respectivamente (vn 0-8 U/ml). Ac. Anticardiolipina IgG e IgM y anticoagulante lúpico negativos. Inmunoglobulinas séricas normales, salvo IgE elevada (484 KU/L). Factores C3, C4 y factor B del complemento normales. Ac. antinucleares, ENA (anti-SSA/Ro, antiSSB/La, anti-RNP/Sm, anti-SM), ANCAs, factor reumatoide, crioglobulinas fueron negativos. Homocisteina plasmática normal. Sistemático de sangre (serie roja, blanca y plaquetaria), bioquímica de sangre, perfil tiroideo (T4Libre, TSH): Normales. Serologías a hepatitis B y C y VIH negativas. Se realizó un estudio ecocargiográfico transtorácico, que fue normal. Discusión y conclusiones. Una serie de manifestaciones no-trombóticas, no incluidas en los criterios de diagnóstico, han sido asociadas al SAF. Entre ellas se encuentran la enfermedad vascular, epilepsia, corea, mielitis transversa, síndrome esclerosis múltiple-like, manifestaciones cutáneas (lívedo reticularis, ulceras cutáneas, lesiones pseudovasculíticas), necrosis femoral avascular, hemorragia alveolar difusa, síndrome de distress respiratorio agudo e hipertensión pulmonar. Se ha descrito también la asociación de cefalea o migraña, alteraciones cognitivas, con la presencia en suero de Ac antifosfolípidos, si bien no existe la evidencia necesaria para incluir estas alteraciones en los criterios diagnósticos del SAF. La paciente, una joven con historia de dos episodios de trombosis cerebral y sin otros factores de riesgo cardiovascular, recibió terapia anticoagulante precoz como profilaxis secundaria de nuevos procesos trombóticos asociados a los Ac antifosfolípidos, si bien a títulos bajos que no permiten incluirla bajo el diagnóstico de SAF. En este tipo de pacientes con títulos de Ac antibeta2glicoproteina-I bajos en al menos dos ocasiones, proponemos la valoración individual y en función de su clínica, del momento de la detección en suero de los anticuerpos (aislado o en el contexto agudo) y de la presencia o ausencia de otros factores de riesgo trombótico, instaurar una terapia o profilaxis secundaria precoz que permita evitar futuras manifestaciones clínicas (potencialmente más severas) relacionadas con el SAF. 5. VALORACION DE UN EXTRAÑO PATRÓN DE ANA PRESENTE EN PACIENTES PREFERENTEMENTE INFECTADOS POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C. Castro-Serrano R. Laboratorio de Referencia de Cataluña. En este trabajo exponemos la presencia de un patrón desconocido, que se observa en el citoplasma de la células Hep 2, por inmunofluorescencia indirecta. Patrón que presenta una imagen lineal única en la célula, redondeando al núcleo o extendida en el citoplasma, que se asemeja al Aparato de Golgi. Esta imagen se observó en 36 muestras de pacientes (0,05%) de los ANA realizados en nuestro laboratorio entre los años 2005-06, de los cuales 21 muestras pertenecían a pacientes de hepatitis C (VHC) y 14 muestras a pacientes con patologías diversas. El total de pacientes diagnosticados de VHC fue de 340, de los que un 3,1% dieron positivos. Todos VHC habían sido confirmados por RIBA, respondiendo mayoritariamente al genotipo GHC1b, y eran pacientes que fueron tratados con interferón alfa. Los títulos observados variaban entre 1/80 a 1/ 640. En una exposición previa presentada por otros autores se relacionó la presencia de este patrón con el tratamiento recibido con interferon alfa. Nosotros vimos que, aunque los ANA de pacientes con el Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 65 INMUNOLOGÍA VHC previamente al tratamiento, no presentaban esta imagen y si durante, o después del tratamiento, también que se presentaban en pacientes con otras patologías y que no habían sido tratados con interferón alfa. A su vez observamos que, al estudiar estas muestras positivas con otros portas de Hep2, o en tejidos de riñón, hígado, estómago de ratón/rata, no dieron ninguna imagen de positividad. En esta presentación exponemos de forma preliminar: 1º de la presencia de esta imagen puntualmente en un tipo de porta de Hep2 y 2º su posible relación o no con la terapia aplicada en estos pacientes. 6. ANTICUERPOS ANTI CELULAS CALICIFORMES Y ANTI CELULAS PANCREATICAS EXOCRINAS EN EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. Rodríguez R1, Panés J2, Viñas O1. 1Gastroenterología, 2Inmunología. Hospital Clinic. Barcelona. Introducción. La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) incluye la Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU). Estas enfermedades son frecuentes en nuestro medio, son de etiología desconocida y se caracterizan por la presencia de inflamación crónica intestinal. El diagnóstico diferencial entre éstas dos entidades tiene implicaciones terapéuticas i pronósticas importantes, pero las técnicas convencionales (endoscopia, histología) no permiten diferenciar un 1020% de los casos. Objetivos. Estudiar la utilidad de la determinación sérica de anticuerpos anti-células caliciformes (ACC) y anti-células pancreáticas (ACP) para el diagnóstico de pacientes con sospecha de EII y en la diferenciación entre EC y CU. Comparar la eficacia diagnóstica de la determinación de estos anticuerpos con los anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos (ANCA) y anti-Saccaromyces cerevisiae (ASCA). Determinar si la utilización combinada de estos anticuerpos incrementa la precisión en el diagnóstico. Ver si la determinación de estos anticuerpos guarda alguna relación con el fenotipo de la EC o con la extensión en la CU. Pacientes y métodos. En este estudio hemos incluido las muestras de suero en una población normal de 50 individuos y 119 pacientes con EII (65 con EC y 54 con CU). En cada muestra se determinaron los ANCA mediante inmunofluorescencia indirecta sobre leucocitos polimorfonucleares, fijados en un porta. Los ASCA tipo IgG e IgA mediante técnicas de Elisa (Palex Medical SA). Y la determinación de los anticuerpos ACC y ACP tipo IgG e IgA mediante técnica de inmunofluorescencia indirecta (Euroimmun). Resultados. 1. No se detectaron antiguerpos IgG ANCA, IgG ASCA ni IgAAGC en ninguna muestra de los controles sanos pero sí se encontaron IgA ASCA (2%), IgG ACC (2%), IgA APC (10%) IgG APC 6% en algunos controles sanos. 2. En comparación del grupo control las sensibilidades para los Acs IgA e IgG ACC como marcadores de Enfermedad Inflamatoria Intestinal son muy bajas (13 y 11% respectivamente), pero las especificidades (98-100%) son idénticas tanto para los ANCA como para los ASCA (99-100%). Para los Ac ACC IgA e IgG encontramos sensibilidades superiors (21-38%) pero la especificidad es menor (90-94%). Sin embargo cuando se detectan simultaneamente Acs IgA e IgG en la muestra de un paciente la especificidad es del 98%. 3. En contraposición de los ASCA, no encontramos diferencias significativas en la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos ACC y POSTERS APC de isotipo de IgA y IgG entre los grupos de pacientes con EC y CU. Conclusiones. Estos datos sugieren que la determinación de anticuerpos IgA y IgG ACC y ACP puede constituir un marcador serologico de valor relativo para el diagnostico de la Enfermedad Inflamatoria Intestinal pero no parece ser útil para el diagnóstico difernecial entre EC y CU. 7. ÓPTIMA DETECCIÓN DE AC ANTI MITOCONDRIALES M2, AC ANTI SP100 Y AC ANTI GP210 POR ELISA, COMPARACIÓN CON MÉTODOS CONVENCIONALES. Perdomo H, Alvarez Doforno R, Lozano M, Salcedo C, Marco E, Marcos MJ, Yañez F, Fontan Casariego G. Hospital Universitario La Paz, Madrid. Introducción. Los Ac anti mitocondriales (AMA) son marcadores serológicos de la cirrosis biliar primaria (CBP), sin embargo Ac anti nucleares (ANA) se detectan en aproximadamente 50% de estos pacientes. La mayoría de los laboratorios usan inmunofluorescencia indirecta (IFI) para detectarlos y los dos patrones de ANA que predominan en la CBP son membrana nuclear porosa y múltiples puntos nucleares. No siempre es fácil detectarlos debido a que los pacientes pueden presentar una o varias especificidades a la vez, así como ser positivos para otros autoanticuerpos. Los Ac que dan estos patrones reconocen la proteína de membrana nuclear gp210 y la proteína cuerpo nuclear sp100 respectivamente. Objetivo: Comparar técnicas convencionales de inmunofluorescencia indirecta (IFI) e inmunobloting frente a ELISA de antígenos recombinantes para la detección y caracterización de AMA, Ac anti sp100 y Ac anti gp210. Materiales y métodos. Se estudiaron 74 sueros de pacientes ensayados por IFI sobre portas de triple tejido de rata y células HEp-2 (Euroimmun, Lübeck) que presentaban positividad para AMA patrón M2, Ac anti múltiples puntos nucleares y Ac anti membrana nuclear ya sea patrón poroso ó liso. Para la caracterización de AMA por inmunobloting se empleó la fracción citosolica purificada de extracto de hígado humano. Para la detección de los AMA M2, Ac anti sp100 y Ac anti gp210 se utilizó un ELISA específico (INOVA Diagnostics, San Diego, CA). Los pacientes se agruparon según el diagnostico en CBP, otras hepatopatías y otras patologías. Como sueros seronegativos se analizaron 10 controles sanos. Resultados. El perfil serológico de los sueros ensayados por IFI fue 42,8% para AMA, 41,7% Ac anti múltiples puntos nucleares y 29,8% Ac con patrón membrana nuclear. La correlación entre IFI y ELISA fue buena, sobre todo en el grupo de pacientes con diagnostico CBP. En el grupo diagnostico de otras patologías aumentó la frecuencia de Ac anti M2 por ELISA sobre todo a títulos medios, solo dos casos se confirmaron por otra técnica. En este grupo disminuyó la detección de Ac anti gp210 debido a que mayoritariamente el patrón que se observa por IFI corresponde a membrana nuclear lisa. Los Ac anti sp100 se detectan en los tres grupos de pacientes de manera similar. Conclusión. La IFI es un método sencillo que requiere personal con experiencia para la interpretación de patrones. El ELISA es un método sencillo que permite identificar los Ac sobre todo en aquellos casos de múltiples especificidades. Entre IFI y ELISA específico (INOVA Diagnostics, San Diego, CA) se encontró una buena correlación sobre todo en los pacientes con diag- 65 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 66 POSTERS nostico CBP, en este grupo los AMA M2, Ac anti sp100 y Ac anti gp210 solos o en combinación tienen un significado muy importante de marcadores serológicos. En el grupo de otras patologías la presencia de los AMA M2 y Ac anti sp100 deben ser estudiados en seguimiento y cuidadosamente valorados en el contexto clínico del paciente ya que su significado es incierto. Los Ac anti gp210 son altamente específicos de la CBP, ocasionalmente reactividades similares se encuentran en otras enfermedades reumáticas. 8. ESTUDIO DE LOS FACTORES SOLUBLES QUE INTERVIENEN EN LA REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN DE IGM EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Espiño M, Álvarez-Cermeño JC, Sádaba MC, Gómez-Rial J, García-Barragán N, Díaz-Sánchez M, González-Porqué P, Villar LM. Hospital Ramón y Cajal. Introducción. La esclerosis múltiple es una enfermedad crónica del sistema nervioso central (SNC) que se caracteriza por presentar desmielinización, inflamación y daño axonal. La presencia de bandas oligoclonales de IgM frente a lípidos de la mielina (BOCML+) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) se asocia con una peor evolución de la enfermedad. Estos anticuerpos son producidos por linfocitos B CD5+ presentes en el SNC de los pacientes. Clásicamente se ha descrito que esta subpoblación de linfocitos B se activa sólo mediante la presencia de su antígeno sin precisar de la colaboración de otras células del sistema inmune. Sin embargo, datos recientes indican que hay una serie de citoquinas que intervienen en su desarrollo y diferenciación. Objetivo. Estudio del perfil de citoquinas presentes en LCR de pacientes con esclerosis múltiple con y sin síntesis intratecal de IgM. Metodología. Detección de bandas oligoclonales: la presencia de bandas oligoclonales de IgG e IgM se determinó mediante isoelectroenfoque (IEF) e inmunoblotting. Pacientes: Se estudiaron 79 pacientes con EM, de los cuales 31 eran BOCML+ y 48 no mostraban bandas oligoclonales frente a lípidos (BOCML-), y 17 controles con otras enfermedades neurológicas. Cuantificación de los niveles de citoquinas y quimioquinas. Se realizó mediante kits de ELISA comerciales. Se estudiaron las siguientes citoquinas y quimiocinas: Osteopontina, IL-5, IL6, IL-9 e IL-10. Resultados. IL5: No se pudo detectar esta citoquina en las muestras estudiadas. Osteopontina, IL-9 e IL-10: No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos en LCR. CXCL12: Observamos un aumento significativo en el LCR de los pacientes BOCML+ con respecto a los BOCML- (p= 0,01) y al grupo control (p= 0,01). IL6: Encontramos valores elevados en los pacientes con brote con respecto a aquellos en fase estable (p= 0,003) y con respecto al grupo control (p= 0,019). CXCL13: En el grupo control no se pudo detectar esta quimioquina en LCR. En la EM encontramos un aumento significativo en el grupo BOCML+ en brote vs el BOCML- (p= 0,007). Este aumento correlaciona con los valores de IgM en LCR que están aumentados en los pacientes BOCML+ en brote (p< 0,0001). Conclusiones. El aumento de los valores de IgM en LCR presente en los pacientes con BOCML+ puede venir mediado por un reclutamiento de linfocitos BCD5+ hacia el SNC mediado por CXCL13 en las fases activas de la enfermedad. El aumento de CXCL12 en el LCR de estos pacientes puede contribuir al mantenimiento de esta población en LCR. 66 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 9. ANTICUERPOS ANTI-INCENP EN UN PACIENTE CON EL SÍNDROME DE GRAHAM LITTLE-PICCARDI-LASSUEUR. Rodríguez-Bayona B, Ruchaud S, Rodríguez C, Linares M, Astola A, Ortiz M, Earnshaw WC, Brieva JA, Valdivia MM. Servicios de Inmunología y Dermatología, H.U. Puerta del Mar; Wellcome Trust Centre for Cell Biology, School of Biological Sciences, University of Edimburgh; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Puerto Real. El síndrome de Graham Little-Piccardi-Lassueur (GLPL) es una rara dermatosis que cursa con alopecia cicatricial progresiva del cuero cabelludo, pérdida de vello púbico y axilar e hiperqueratosis folicular. Presentamos el caso de una paciente afectada por dicho síndrome en el que se pone de manifiesto una respuesta de auto-anticuerpos (auto-Ac) frente a antígenos nucleares asociados a cromosomas y cuerpo medio. Para analizar la presencia y patrón de tinción de los auto-Ac se testó el suero de la paciente mediante técnicas de inmunofluorescencia e inmnunoblot, utilizando para ello cultivos de líneas celulares de mono, hamster, ratón, bovina y humana. El suero autoinmune mostró un patrón moteado atípico que afectaba principalmente a los centrómeros y a la región central del huso. La distribución del auto-Ag a lo largo de las distintas fases del ciclo celular se correspondía con la dinámica de un grupo de proteínas dependientes de ciclo celular: las proteínas passengers cromosómicas. La expresión de un complejo de proteínas en baculovirus permitió el análisis por inmunoblot de la reactividad del suero GLPL, determinando que la proteína INCENP era el principal auto-Ag reconocido por el suero. Conclusiones: Se describe una respuesta autoinmune en el síndrome GLPL dirigida frente a la proteína centromérica INCENP. SESIÓN 2: INMUNOGENÉTICA Moderadores: Dolores Jaraquemada López (Barcelona), Manuel Muro Amador (Murcia) 10. DETECCION DE ANTICUERPOS HLA CLASE II EN DAÑO PULMONAR AGUDO RELACIONADO A LA TRANSFUSION (TRALI). Muro M2, Rivera J1, Ferrer F1, Botella C2, Salgado G2, Lucas D2, López M2, Sanchis MJ2, Alemany JM2, Minguela A2, Garcia-Alonso AM2, Vicente V1, Álvarez-López MR2. 1Centro Regional de Hemodonación de la Comunidad Autonoma de la Región de Murcia y 2Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia. TRALI es una seria complicación de la transfusión sanguínea. Aunque la incidencia actual es realmente desconocida (en Europa entre 1.3/1000000-1/7900), el síndrome se piensa que esta severamente pobremente diagnosticado e informado, debido a la carencia de criterios diagnósticos sensitivos y específicos, y a la poca difusión fuera de los bancos de sangre. Todos los productos sanguíneos se han asociado con TRALI. Con este síndrome, se han asociado anticuerpos anti-granulocitos y anti-HLA class I en donantes y receptores, y muy recientemente en lípidos de la sangre almacenada, tan bien como anti-HLA class II. En los ultimos años, la tecnología para detectar anticuerpos ha cambiado y se ha incrementado el poder y la especificidad del ensayo, especialmente con el uso de la cito- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 67 INMUNOLOGÍA metria de flujo y luminex. Nosotros presentamos un caso de TRALI que ocurrió en un paciente de 74 después de una transfusión de plasma. El screening de anticuerpos anti-HLA clase I y clase II, y el análisis de especificidad se realizaron por Labscreen (Mixed, PRA, One Lambda, CA) y los tipajes HLA de los donantes y receptor fueron realizados por técnicas PCR-SSO. Las pruebas cruzadas se realizaron por técnicas CDC entre todos los donantes implicados y el receptor. Identificamos anticuerpos anti-HLA clase II en un donante (%PRA=80), sin anti-HLA clase I (%PRA=0), y se correlacionó ampliamente con los 2 antígenos HLA portados por el receptor (DRB1*11 y DRB1*13). La presencia de anticuerpos anti-HLA clase II sin antiHLA clase I ha sido informado en muy pocos casos y estos hechos podrían facilitar el entendimiento de la patogénesis de este síndrome. 11. ANÁLISIS DEL GEN CD209 EN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. Núñez C1, Oliver J2, Mendoza JL3, Taxonera C3, Gómez-García M2, Martín J2, Martínez A1. 1Servicio de Inmunología Clínica, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Instituto de Parasitología y Biomedicina, CSIC, Granada. 3Unidad de Enfermedad Inflamatoria Intestinal, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Introducción. La enfermedad inflamatoria intestinal, que engloba la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), presenta un origen complejo con factores genéticos y ambientales implicados. En la etiología de ambas enfermedades existen factores genéticos comunes así como factores característicos de cada enfermedad. CD209 es una molécula de superficie presente en células dendríticas implicada en el reconocimiento de patógenos y activación de la respuesta inmune. Se ha descrito un polimorfismo funcional en este gen que in vitro afecta a su transcripción y que se ha relacionado con susceptibilidad o severidad a ciertas infecciones. El objetivo de este trabajo es conocer la posible influencia de CD209 en la susceptibilidad a EC y CU. Material y métodos. Se llevó a cabo un estudio caso-control incluyendo un total de 515 pacientes con EC, 497 pacientes con CU y 731 individuos sanos empleados como control. Las muestras fueron recogidas en el Hospital Clínico San Carlos (Madrid) y el Hospital Virgen de las Nieves (Granada), todas ellas correspondían a individuos blancos de origen español. Todas las muestras fueron tipadas para el polimorfismo rs4804803 existente en el promotor del gen CD209 mediante el empleo de sondas TaqMan. La comparación de frecuencias entre enfermos y controles se llevó a cabo empleando el test chi-cuadrado o el test exacto de Fisher cuando fue necesario. Resultados. El estudio caso-control no mostró ningún resultado significativo en el estudio conjunto de IBD o de cada enfermedad por separado. A continuación, los enfermos fueron estratificados por los principales factores genéticos implicados: CARD15 positivamente a EC, y HLA-DR3 negativamente a CU. En los enfermos de CU se observó una ligera tendencia a aumentar la susceptibilidad en enfermos positivos para HLA-DR3 (portadores del alelo rs4804803 G, p= 0,04 OR= 1,73 (1.00-3.01) cuando se comparan DR3 positivos frente a DR3 negativos). Discusión. El gen CD209 no parece estar implicado en el desarrollo de la enfermedad de Crohn. Sin embargo, podría desempeñar algún papel en el origen o desarrollo de la colitis ulcerosa en individuos positivos para HLA-DR3. POSTERS 12. NUEVA REGIÓN CROMOSÓMICA ASOCIADA A COLITIS ULCEROSA. Márquez A, Mendoza JL, Taxonera C, Díaz Rubio M, Urcelay E. Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Un estudio reciente describe una nueva región cromosómica en 2q24.3 con influencia en la susceptibilidad a diabetes tipo 1. En dicha región se encuentran ubicados los genes «interferon-induced helicase» (IFIH1), «grancalcin» GCA y el canal de potasio KCNH7. Todos ellos son potenciales genes candidatos a alterar la susceptibilidad a enfermedad inflamatoria intestinal (EII). El primero codifica un receptor citoplásmico de reconocimiento de infección viral lo cual es importante ya que infecciones por distintos virus se han implicado en la patología de la EII. La proteína codificada por GCA se expresa específicamente en neutrófilos y monocitos/macrófagos, y es particularmente abundante en células provenientes de focos de infección bacteriana. Por otra parte, no es extraña la perturbación de la homeostasis iónica en EII. Estudiamos tres polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) que previamente habían mostrado su efecto protector en diabetes: rs13422767, localizado «upstream» del gen IFIH1; rs1990760, que provoca un cambio aminoacídico Ala946Thr en el gen IFIH1 y rs2068330 en el intrón 14 de KCNH7. La discriminación alélica se realizó mediante la tecnología TaqMan MGB (Applied Biiosystems, Foster City Ca, EEUU). También se estimaron los haplotipos conformados por dichos polimorfismos mediante el algoritmo EM incluido en Arlequín Ver. 2000. El estudio individual de cada SNP no reveló diferencias significativas entre controles sanos y enfermos de colitis ulcerosa (CU) o de enfermedad de Crohn (CD). Ahora bien, tras estratificación por género, se observó en las pacientes de CU un efecto protector de los alelos mutantes de las variantes localizadas en los genes IFIH1 y KCNH7 [enfermas de CU portadoras alelo mutante vs. enfermos: p= 0,0027; OR (95% IC)= 0,51 (0,32-0,81) y p= 0,004; OR (95% IC)= 0,54 (0,34-0,84), respectivamente], no así para el rs13422767. Esta estratificación por sexo no alteró la ausencia de efecto en CD. El estudio de haplotipos no aportó información adicional. En conclusión, la región cromosómica donde se localizan los genes IFIH1-GAC-KCNH7 influye selectivamente en la susceptibilidad a padecer colitis ulcerosa en mujeres, no influyendo en los pacientes masculinos de colitis ni en el riesgo a padecer enfermedad de Crohn. 13. ESTUDIO DEL POLIMORFISMO DEL PRION P M129V EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. León VJ1, Leon AJ2, Alonso Sardon M3. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Laboratorio de Pediatria e Inmunologia, Univ. de Valladolid. 3Dept. Med. Preventiva. Univ. De Salamanca. Introducción. La Artritis Reumatoide AR es un desorden inmunodegenerativo que ha sido asociado con la presencia de depositos de proteinas anormales, en los cuales pueden influir de la Proteina B Amiloide PrPC (PrionC) en sus formas insolubles PrP SC. Los Priones estan localizados en la membrana citoplasmatica. Presentan radicales a los que se ligan moleculas de Cobre, y juegan un papel esencial en el transporte transmembrana del cobre y en el mecanismo antioxidante celular. los heterozigotos del PrNP al polimorfismo Met 129 Val presentan un efecto protector ó al menos un mayor periodo de incuvación de ciertas enfermedades con componente autoinmune. El proposito del presente estudio es relacionar la presencia de este polimorfismo en enfermos de AR. 67 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 68 POSTERS Material y métodos. Nuestro estudio se efectuó sobre 28 pacientes de AR, de y 48 sujetos controls se incluyeron en nuestro estudio. Un fragmento de 775 bp del gen PrNP fué amplificado empleando los primers (for: 5'-GTG GCC ACA TGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev: 5'-GTG AAA CAG GAA GAC C -3'). La PCR fue efectuada utilizando 10 ng de ADN genomico en 20 mcl de mezcla de reacción. Las condiciones de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg, 72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min. El producto de la PCR fué digerido con el enzima de restricción NspI y revelado en geles de agarosa al 2%. Resultados. La distribución alelica en el grupo control fué: 42% M/M, 45% M/V, 13% V/V. En pacientes de AR : 44% M/M, 44% M/V, 12% V/V. No hemos encontrado diferencias entre el grupo control y enfermos de EM (El test Chi-square, p< 0,05). 14. RELACIÓN ENTRE LOS GENES CYP46 Y DRB1*03 EN ARTRITIS REUMATOIDE. Leon VJ1, Montilla CA2, Hernandez-Cerceño ML1, Ingelmo Rodriguez MT3. 1Serv Analisis Clinicos, 2Serv Reumatologia. Hospital Universitario de Salamanca. 3A Primaria, CS Sta Marta del Tormes, Salamanca. Introducción. La Artritis Reumatoide, AR, es un desorden complejo con multitud de factores genéticos implicados en su desarrollo y patologia clinica. Cada vez existen más evidencias que implican al transporte transmembrana celular del colesterol en con la AR. El gen CYP 46 codifica la enzima 24 colesterol hydrolasa juega un papel importante en la salida al exterior celular del colesterol citoplasmatico . Recientemente se ha comenzado a asociar un polimorfismo del Intron 2 del gen CYP 46 conel riesgo a adquirir la AR. En el presente estudio, examinamos la posible asociacion del polimorfismo del gen CYP 46 y el gen HLA DRB1*03 con AR . Material y métodos. El presente estudio se efectuo en 32 enfermos diagnosticados de AR, 38 de otras enfermedades reumatologicas (OER) y 98 controles. El gen DRB1*03 fue determinado con el kit Classic SSP DQ »Low resolution» de Dynal. El gen CYP 46 fué estudiado mediante una PCR emplenado los primers For 5'-TGA AAA CGA GTT TCC CGT CC-3' y Rev-5'-GTG TGA CCA GGT AAC AGT CA-3', las condiciones de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 s, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y finalmente 72º 10 min. El amplicon de 285 bp fué digerido co el enzima de restricción MspI, el alelo CYP C presenta dos fragmentos de 209 y 76 bp. Resultados. La distribución del polimorfismo en AR es: 51,7% TT, 41,3% TC, 3,3% CC, en OER: 56,6% TT, 40,0% TC , 6,9% CC, y en el grupo control: 42,8 TT, 46,9 TC 10,2 CC Existen diferncia significativa ente el grupo control y los grupos de enfermos (Chi-square test P< 0,001). La distribucion de DRB1* 03 es 15,6% en AR, 16,4 en OER y 14,6% en grupo control. No se encontraron diferencias significativas en la correlación CYP 46 y DRB1*03 (Chi-square test, p< 0,05). 15. ESTUDIO DE ALGUNOS ALELOS HLA EN ENFERMEDADES REUMATOLÓGICAS. Leon VJ1, Leon AJ2, Gómez Castro S3, Hernandez-Cerceño ML1. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Laboratorio de Pediatria e Inmunologia, Univ. de Valladolid. 3Serv Reumatologia, Hospital Universitario de Salamanca. Introducción. Los estudios epidemiológicos de alelos HLA relacionados con la susceptibilidad ó resistencia a ciertas enfermedades, la presencia de determinado alelo HLA modula la presentación anti- 68 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 génica inhibiendo o activando la respuesta inmune frente a exo o auto antígeno, presentan el inconveniente del alto precio de los estudios genómicos clásicos HLA, para soslayar este inconveniente hemos aplicado el análisis individualizado del alelo HLA A3, B7, DR2 y DR4, mediante PCR, habiendo selecionado estos alelos por su relación en otras enfermedades autoinmunes. Material y métodos. 47 pacientes diagnosticados de diversas enfermedades reumatológicas (32Artritis Reumatoide, AR, 15 espondiloartropatias, EP ), y 80 sujetos sanos control, fueron el objeto de nuestro estudio. El ADN fue extraído mediante el kit DNA Direct II (Dynal), fundamentado en una resina con núcleo metálico que permite separar el complejo ADN-resina mediante un imán. Los primers para el estudio del gen HLA A3 : For 5' AgC gAC gCC gCg AgC CA 3', Rev 5' CAC TCC Acg CAC gTg CCA 3' ; para HLA B7: For 5` ggA gTA TTg ggA CCg gAA C 3`, Rev 5´ TAC Cag CgC gCT CCA gCT 3'; para DR2: For 5´ TCC TgT ggC AgC CTA AgA g 3´, Rev 5´ CgC TgC ACT gTg AAg CTC TC 3´ y DR4: For 5´gTT TCT Tgg AgC Agg TTA AAC A 3´, Rev 5´ CgC TgC ACT gTg AAG CTC TC 3´. Las condiciones de PCR fueron: 95º, 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y 72º 10 min. Los amplicones fueron visualizados en electroforesis de agarosa al 2% Resultados. La frecuencia génica de alelo HLA A3 fue 21,3% en AR, 19,2% EP (13,6% en GC), el alelo HLA B7 se un 18,3% AR, 17,5% EP (12,5% en GC) el alelo DR 2 17,6% en AR, 17,2 EP (15,5% en el GC), El DR4 32,4% AR, 28,3% EP ( 15,6% GC). Las diferencian estatisticas entre las frecuencias génicas , Chi Cuadrado, entre enfermos y controles no fueron significativas, p< 0,05, a excepción de las del alelo DR4 , p< 0,001, siendo este ultimo alelo el más prometedor como posible marcador aplicado al grupo de Enfermedadrs Reumatologicas. 16. IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO ALELO DE HLA MEDIANTE TIPAJE DE ALTA RESOLUCIÓN. Bernardo I, Castillo-Rama M, Calleja S, Romo E, Paz-Artal E, Grande C, Serrano A, Castro MJ. Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid. El locus más polimórfico del sistema HLA es HLA-B, con más de 800 alelos diferentes identificados hasta el momento. En este estudio, se describen los pasos seguidos para caracterizar un nuevo alelo de HLA en un paciente incluido en una búsqueda de donante de médula ósea. Para el tipaje serológico de clase I se emplearon placas de tipaje con anticuerpos monoclonales (Lote 3A; One Lambda Inc, Canoga Park, CA). Después se realizó una PCR utilizando primers específicos de secuencia (PCR-SSP) seguida de un dot-blot reverso (INNO-LiPA; Innogenetics, Ghent, Belgium) para obtener el tipaje de baja resolución. A continuación se completó el tipaje de alta resolución mediante el empleo de un kit de tipaje por ADN específico de alelo (Micro SSP&#61652; DNA typing trays, One Lambda Inc), con resultados concluyentes para todos los alelos salvo para uno del locus B. Con el fin de comparar la secuencia nucleotídica del paciente con las bases de datos disponibles, se realizó una secuenciación directa, utilizando primers específicos de los exones 2, 3 y 4, y el resultado obtenido fue comparado con las secuencias del BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; http://www.ncbi.nlm.nhl.gov/BLAST). La mayor identidad encontrada fue con el alelo HLA-B*4004 (819 de 822 nucleótidos), seguido por HLA-B*4008 (817 de 822). El exón 2 del propósi- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 69 INMUNOLOGÍA tus era idéntico al del alelo HLA-B*4008 y el 3 al de HLA-B*4004 (el exón 4 era, en los 3 casos, idéntico a la secuencia de referencia, HLAB*070201). Se hipotetiza que este nuevo alelo podría haber surgido a raíz de una recombinación entre el exón 2 de HLA-B*4008 y el 3 de HLA-B*4004, aunque no pudo comprobarse al no disponer de muestras del progenitor que lo transmitió. 17. PAPEL DEL GEN MHC2TA EN LA ARTRITIS REUMATOIDE. Sánchez-López M, Varadé J, Fernández-Gutierrez B, Concha EG de la. Hospital Clinico San Carlos. Madrid. La expresión de los genes del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHCII) está casi exclusivamente regulada por el transactivador de clase II (MHC2TA). Un polimorfismo situado en el promotor del MHC2TA (-168A/G, rs3087456) se asocia a un incremento en la susceptibilidad a la artritis reumatoide (AR), a la esclerosis múltiple y al infarto de miocardio en la población del Norte de Europa. Sin embargo, esta asociación no ha sido replicada posteriormente en cohortes independientes. Ante esta aparente controversia nos propusimos el estudio del efecto de este gen en la susceptibilidad a AR. Para poder estimar el patrón de haplotipos en este gen, se analizó dicho polimorfismo y otro cambio G/C localizado en el exón 11 (nt16114 de la secuencia codificante, rs4774). En el estudio caso-control se emplearon 350 pacientes con artritis reumatoide y 519 controles sanos de Madrid. El genotipado se realizó con TaqMan assays-on-demand en un analizador 7900HT, siguiendo las condiciones recomendadas por Applied Biosystem (Foster City, California, USA). Se infirieron los haplotipos con el algoritmo de expectación-maximización implementado por el software Arlequín V2.0. El resultado del estudio caso-control para cada marcador independiente no evidenció ninguna asociación con el riesgo a padecer AR. Sin embargo, al comparar los haplotipos presentes en los pacientes frente a los hallados en controles, se observó una diferencia en la distribución global, evidenciando un haplotipo protector (-168*A/1614*C, p= 0,006; OR= 0,7); y otro de riesgo (-168*G/1614*C, p= 0,019; OR= 1,6). Se estudió la posible interacción génica entre el MHC2TA y el epítopo compartido («shared epitope», SE) en el gen DRB1, el principal factor genético de susceptibilidad a AR conocido hasta la fecha. Al comparar el haplotipo de riesgo MHC2TA G/C en los pacientes estratificando por SE, se observó una diferencia significativa entre los subgrupos SE positivo y SE negativo (8,2% vs 4%; p= 0,029). Comparado con controles los individuos EC positivos tienen una mayor probabilidad de portar el haplotipo de riesgo (OR= 1,81, p= 0,012). En conclusión, el gen MHC2TA influye en la predisposición a AR, si bien el polimorfismo -168A/G situado en la región promotora no tiene un papel etiológico per se. 18. GENERACIÓN DEL GRUPO DE ALELOS HLA-B*41 DEDUCIDA A PARTIR DE SECUENCIAS DE INTRONES. MartinezLaso J1, Moscoso J2, Zamora J2, Gomez-Casado E2, Arnaiz-Villena A2. 1Instituto de Salud Carlos III, Madrid. 2Universidad Complutense y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid, Madrid. La generación de alelos HLA-B*41 se ha analizado a partir de las secuencias del exón 1, intrón 1, exón 2, intrón 2 y exón 3. Los resultados muestran que primero se originó el alelo B*4102 por un mecanismo de recombinación entre el alelo B*400102 y B*0801 ó B*4201 en el que esta- POSTERS ba implicado en intrón 2. Los alelos B*4101, B*4104 y B*4107 pudieron surgir a partir de B*4102 tras un fenómeno de conversión génica que arrastró 3 fragmentos diferentes de secuencias pertenecientes a parte del intrón 2 y el exón 3 de los alelos B*45, B*50 ó B*49. La aparición de los alelos B*4105 y B*4106 pudo tener lugar por mutaciones puntuales en el alelo B*4101, y la generación del alelo B*4103 no está clara debido a la ausencia de intrón 2. En este trabajo se incide sobre la importancia de los intrones en la generación del polimorfismo del gen HLA-B. 19. POLIMORFISMO DEL GEN HLA-E EN POBLACIONES AMERINDIAS DE MEXICO (MAZATECOS), COLOMBIA (INDIOS WAYU) Y CHILE (MAPUCHES). EVOLUCIÓN DEL GEN MHCE. Arnaiz-Villena A1, Vargas-Alarcon G2, Serrano-Vela JI1, Martinez-Laso J3, Silvera-Redondo C4, Granados J2, Reguera R1, Moscoso J1. 1 Universidad Complutense y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 2Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán, Mexico. 3Instituto de Salud Carlos III. 4Universidad de Barranquilla. HLA-E es un gen de histocompatibilidad de clase I no clásico (HLAIb) con un polimorfismo limitado. Sólo se han descrito 8 alelos que dan lugar a 3 proteínas diferentes. El polimorfismo del gen HLA-E se ha estudiado en 6 poblaciones amerindias y mestizas del continente americano y se ha comparado con resultados obtenidos en otras poblaciones. Además, se han calculado las frecuencias alélicas entre poblaciones amerindias, caucasoides, orientales, indias asiáticas y negroides. HLA-E*0101 es el alelo más frecuente en todas las poblaciones, excepto en afrocolombianos y amerindios wayu, cuyos grupos sanguíneos revelan una mezcla importante con poblaciones caucasoides y africanas. Los grupos amerindios de mazatecos (Norteamérica) y mapuches (Sudamérica) presentan frecuencias similares de alelos HLA-E, mientras que los indios wayu se parecen más a los afrocolombianos. Por su parte, las poblaciones mestizas mexicanas y colombianas muestran frecuencias parecidas a las de poblaciones amerindias, en las que predominan los alelos HLA-E*0101 y HLA-E*010302. Las poblaciones negroides y los indios asiáticos también presentan una distribución parecida de los aleos HLA-E. Aunque las frecuencias alélicas varían de unas poblaciones a otras, el bajo polimorfismo es común en todas ellas, no habiéndose encontrado ningún alelo nuevo en las 6 poblaciones estudiadas ahora. Esta poca variabilidad también es patente el los genes MHC-E de primates como el chimpancé (1 alelo), el bonobo (2 alelos), el gorila (2 alelos), el orangután (1 alelo), el macaco rhesus (8 alelos), el macaco cangrejero (2 alelos) y el cercopiteco verde (2 alelos). 20. EVOLUCIÓN Y FUNCIÓN DE LOS GENES MHC-E, MHC-F Y MHC-G. Moscoso J, Serrano-Vela JI, Pacheco R, Reguera R, Arnaiz-Villena A. Universidad Complutense y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. La región de histocompatibilidad de clase I incluye los llamados genes MHC clásicos (A, B y C) y no clásicos (E, F y G), además de pseudognes y genes truncados. Las moléculas MHC-E, -F y -G son consideradas como tolerogénicas, ya que no sólo interaccionan con células NK, sino también con subpoblaciones de linfocitos T y algunas otras células. Además, tienen un papel importante en la aceptación del feto. De nuestros resultados observamos que existe una fuerte presión selectiva que favorece la invariabilidad de los genes MHC-E, -F y -G tanto en humanos como en otros primates. 69 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 70 POSTERS 21. ORIGEN DE LA POBLACIÓN NAHUA (AZTECA O MEXICA) DE MEXICO SEGÚN LOS GENES HLA: EL POBLAMIENTO DE AMÉRICA Y LA SINGULARIDAD DE LOS AMERINDIOS. Moscoso J1, Vargas-Alarcon G2, Martinez-Laso J3, Serrano-Vela JI1, Reguera R1, Granados J2, Arnaiz-Villena A1. 1Universidad Complutense y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 2Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán, Mexico DF. 3Instituto de Salud Carlos III. Se han estudiado los genes HLA en un grupo aislado de Nahuas (Aztecas o Mexicas) que habitan en las montañas del centro de Mexico (Santo Domingo Ocotitlan). Las relaciones genéticas entre los amerindios y poblaciones del resto del mundo se han establecido utilizando las frecuencias de alelos HLA para calcular distancias genéticas y construir dendrogramas Neighbor-Joining y análisis de correspondencia. En total se han comparado 13818 cromosomas. Se han encontrado 3 nuevos haplotipos extendidos HLA en Nahuas (A30-B49-DRB1*1001DQB1*0501; A2-B52-DRB1*1402-DQB1*0301; A68-B61-DRB1*1602DQB1*0303), siendo el primero de ellos el más frecuente en esta población. Tanto las distancias genéticas como el análisis de correspondencia muestran claramente que los Mexicas de Santo Domingo Ocotitlan tienen una estrecha relación genética con algunos de los grupos mexicanos más antiguos (Mayas, Zapotecos, Mixtecos), lo que sugiere que la lengua de los Nahuas (Nahuatl) pudo ser impuesta a grupos mexicanos aislados; de lo contrario habría que pensar que los Aztecas ya vivían en Mexico mucho antes del siglo XII, momento en el que se postula que llegaron allí. 22. ORIGEN DE LOS TEENEKS (HUASTECOS) DEL GOLFO DE MEXICO SEGÚN LOS GENES HLA. Arnaiz-Villena A1, Moscoso J1, Serrano-Vela JI1, Murguia E2, Reguera R1, Granados J3, Vargas-Alarcon G3. 1Universidad Complutense y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 2Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez, Mexico DF. 3Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán, Mexico. Se han calculado las frecuencias de alelos HLA de los indios Teenek (Huastecos) del golfo de Mexico y se han comparado con las de otras poblaciones amerindias y del resto del mundo (en total se han analizado 15694 cromosomas de 73 poblaciones diferentes). El estudio confirma el reducido polimorfismo que se observa en los genes HLA de poblaciones amerindias y muestra una homogeneidad en dichas poblaciones que los diferencia de otros grupos de indios americanos como los Na-Dene o los Eskimos. También se pone de manifiesto la ausencia de correlación entre genes y lenguas a nivel microgeográfico: los Teeneks hablan una lengua Maya a pesar de la poca relación genética que tienen según se observa en nuestros resultados. 23. GENERACIÓN DEL GRUPO DE LOS ALELOS HLAB*1516/B*1567/B*1595/B*1517 DESDE LOS PRIMATES NO HUMANOS. Román A, Cervera I, Head J, Rodriguez M, Fuentes P, Gutierrez-Solar B, Martínez-Laso J. Unidad de Inmunoterapia Celular. Instituto de Salud Carlos III. Centro Nacional de Microbiología. Majadahonda. Madrid. La generación de los alelos B*1516, B*1517, B*1567 y B*1595 se ha analizado utilizando las secuencias de los exones 1, 2 y 3 y de los intro- 70 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 nes 1 y 2, tanto de humanos como de primates no humanos. Los resultados mostraron que para la formación de dichos alelos habrían sido necesarias tres fases evolutivas: 1) Una fase situada en los primates no humanos con la presencia de un ancestro común para B*1516/1517 generado por dos eventos independientes de conversión génica. Estos incluyen un fragmento del exón 1 y un fragmento que engloba el final del exón 2 y el principio del intrón 2, respectivamente. 2) Esta segunda fase se puede situar tanto en el hombre como en los primates no humanos donde se generarían dos vías evolutivas diferentes que darían lugar por un lado a un ancestro de B*1516 y por otro a un ancestro de B*1517. 3) Por último, en la tercera fase se produciría una evolución intra especie humana. En esta fase y siguiendo las dos vías de evolución del apartado anterior, se generarían los alelos HLA-B*1516 y HLAB*15170101. HLA-B*1516 sería el resultado de una conversion génica en el exón 3 y una mutación puntual en el exón 2 y HLA-B*15170101 se formaría por otra conversión génica en el exón 3. Del alelo HLAB*1516 se formarían los alelos B*1567 and B*1595 mediante mutaciones puntuales específicas. Del mismo modo los alelos B*151701012 y B*151702 se generarían mediante mutaciones puntuales en el intrón 2 y en el exón 3, respectivamente. En conclusión, se puede establecer la hipótesis en la que los alelos B*1517, B*1516 B*1567 y B*1595 se habrían generado mediante dos vías diferentes de evolución que provendrían de una única vía cuyo origen estaría en los primates no humanos. 24. LOS POLIMORFISMOS CDX2, BSMI Y FOKI DEL GEN VDR PERMITEN DIFERENCIAR A LOS PACIENTES CELIACOS DE SUS HERMANOS SANOS HLA IDÉNTICOS. Manzanares B1, Casado A2, González R1, Sánchez F3, Rodríguez-Reynosod MF3, Jiménez J3, Santamaría M1, Quesada JM2, Peña J1. 1Servicio Inmunología, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. 2Sanyres (Grupo PRASA), Unidad de Metabolismo Mineral, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. 3Servicio Gastroenterología Pediatrica, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. Introducción. La enfermedad celiaca (MIM 212750) es un desorden crónico autoimmune causado por una intolerancia al gluten en sujetos genéticamente susceptibles. Aunque la participación del Complejo Mayor de Histocompatibilidad es muy importante, se conoce que éstos no son los únicos genes involucrados en su patogenia. Los enfermos celiacos presentan con cierta frecuencia alteraciones en el metabolismo de la vitamina D. También es conocido que la vit D tiene un efecto inmunomodulador y que ejerce su función a través de unos receptores polimórficos (VDR). Recientemente se han demostrado diferentes asociaciones entre los polimorfismos de VDR y diferentes enfermedades autoinmunes. Por tanto, en el presente estudio nos planteamos determinar si los polimorfismos de VDR permitirían diferenciar aquellos hermanos HLA idénticos a los pacientes que tienen menor riesgo de padecer celiaquía. Pacientes y métodos. Se estudiaron un total de 50 familias que tenían al menos un hijo con enfermedad celiaca y algún hermano HLA idéntico al paciente. Se tiparon los locus HLA-A, B, DRB1, DQB1 y DQA1 de los padres, el paciente y sus hermanos para confirmar la identidad HLA. El paciente y su(s) hermano(s) HLA idéntico fueron genotipados para el polimorfismo de VDR (CDX 2, Fok I, Bsm I) usando una amplificación por PCR seguido por digestión por endonucleasas de restricción y electroforesis en geles de agarosa. También se estudiaron 225 controles. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 71 INMUNOLOGÍA Resultados. La comparación de los genotipos VDR de los pacientes con sus hermanos HLA idénticos demostró que la proporción de «heterocigotos» GA (CDX-2), Bb (Bsm-I) TC (Fok-I) para los tres polimorfismos estudiados era significativamente superior en el grupo de los hermanos sanos. Ninguno de los 50 pacientes celiacos estudiados resultó ser heterocigoto a la vez para los tres polimorfismos. En el grupo control también encontramos una mayor proporción estadísticamente significativa de sujetos heterocigotos respecto a los pacientes celiacos. 25. IL12 EN ENFERMEDAD CELIACA EN LA POBLACIÓN ESPAÑOLA. Alecsandru D1, Polanco I2, Maluenda C3, Núñez C1, Figueredo MA1. 1 Servicio de Inmunología Clínica, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Servicio de Gastroenterología Pediátrica, Hospital La Paz, Madrid. 3Servicio de Pediatría, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Introducción y objetivos. La Enfermedad Celiaca (EC) es una enfermedad crónica del intestino delgado proximal, producida por una intolerancia inmunológica permanente a determinadas proteínas del gluten. Los genes HLA y no-HLA junto con el gluten y otros posibles factores ambientales están involucrados en la etiología de la enfermedad celiaca. La IL-12 es un inductor de la maduración de los linfocitos T en subtipo Th1, y de la producción de IFN-γ, altamente expresado en las lesiones celiacas. Varios estudios han emitido la hipótesis de que la IL12, un heterodímero formado por las subunidades p35 y p40, juega un papel importante en la patogénesis de la EC. El gen de p40 (IL12B) está ubicado en 5q33.3, y hemos estudiado el papel de 2 microsatélites y 2 SNPs, situados en esta región, en la susceptibilidad a EC en nuestra población. Material y metódos. Se han estudiado los microsatélites D5S2038 y D5S1352 y el SNPs 1188A/C (rs3212227) en el gen de la IL12, y el SNP rs1368297 (en EBF, gen cercano al anterior) en enfermedad celiaca en la población española mediante estudios caso-control y familiares. Los microsatélites D5S2038 y D5S1352 se han estudiado por PCR con primers fluorescentes seguido de electroforesis capilar en el secuenciador automático AbiPrism 3100 (Applied Biosystems). El análisis de los SNPs 1188A/C y EBF se ha realizado mediante ensayos TaqMan (C_2084293 y respectivamente C_2085085) en las condiciones recomendadas por el fabricante (Applied Biosystems). El estudio ha incluido 378 pacientes, además de sus familiares y 472 controles sanos de la población española. Se han analizado los microsatélites y SNPs por separado, y los haplotipos extendidos formados por ellos se han deducido en familias o han sido estimados con el algoritmo EM. Las frecuencias alélicas y haplotípicas en pacientes y controles han sido comparadas utilizando la prueba Chi-cuadrado y el test de Fisher cuando ha sido necesario (valores esperados<5), utilizando el paquete informático Epi Info v6.02. Resultados. No hemos observado asociaciones estadísticamente significativas en los microsatélites y los SNPs estudiados considerados de uno en uno. Hemos encontrado asociaciones de la enfermedad con los haplotipos de dos microsatélites D5S2038_5-D5S1352_3 (p=0,015; OR=0,62) y D5S2038_8-D5S1352_4 (p=0,017; OR=1,87). No hemos observado asociaciones significativas con los haplotipos formados por los 2 SNPs estudiados y tampoco con los haplotipos formados por el SNP del gen EBF y los 2 microsatélites. En el estudio de los haplotipos del SNP 1188A/C con los 2 microsatélites hemos encontrado asociaciones de los minihaplotipos 1188A-D5S2038_2 (p=0,023; OR=3,16) y 1188AD5S1352_2 (p=0,023; OR=1,39). No se observaron diferencias significativas en el estudio TDT. POSTERS Conclusiones. Los polimorfismos de la IL12 estudiados no se asocian con la enfermedad celiaca en la población española, tras aplicar la corrección de Bonferroni. Resultados similares se han obtenido en estudios realizados en las poblaciones italiana y escandinava, y sugieren que la expresión aumentada de la IL12 en los enfermos celiacos puede ser una consecuencia de la enfermedad, y no causa de ella. 26. ANALISIS DEL POLIMORFISMO DE CARD15 EN ENFERMEDAD CELIACA. Rodríguez-Gutiérrez JF1, Sampalo A1, SánchezVelasco P2, Rubio A3, Brieva JA1, Nieto A1. 1Inmunología. Hospital Puerta del Mar. Cadiz. 2Inmunología, Hospital Marqués de Valdecilla, Santander. 3Pediatría, Hospital SAS de Jerez. La enfermedad celíaca se reconoce como un proceso genético complejo. Aprox. un 40% del riesgo genético reside en la región HLA. Estudios recientes señalan la importancia de la inmunidad innata en la patogénesis de la celiaquía, abriéndose así un nuevo abanico de posibles genes candidatos. CARD15 codifica Nod2, proteína que reconoce componentes de la pared bacteriana e induce respuesta inmune innata. Algunas variantes de CARD15 se han asociado consistentemente a enfermedad de Crohn. Por otro lado, un estudio prospectivo muy reciente muestra una alta prevalencia de celiaquía en pacientes afectados de enfermedad de Crohn. En este estudio analizamos el posible papel de CARD15 en la susceptibilidad a enfermedad celíaca. Se genotiparon los SNPs R702W, G908R y L1007fsinsC en un grupo de 101 pacientes con diagnóstico de celiaquía siguiendo los criterios de la ESPGHAN y en 117 controles sanos no relacionados. La frecuencia de portadores de 702W estaba ligeramente incrementada en controles (10% vs 12%). Sin embargo, la frecuencia de 908R estaba significativamente aumentada en pacientes (8% vs 1,8%; p= 0,04; OR= 4,95, 95%CI 0,94-34,6). La variante L1007fsinsC también se encontraba aumentada en pacientes (4,9% vs 10,8%) si bien la diferencia no alcanza significación. Curiosamente, los haplotipos 908R y L1007fsinsC comparten algunos marcadores polimórficos que no están presentes en haplotipos 702W. Por tanto, se realizó un análisis considerando ser portador de 908R o L1007fsinsC como factor de riesgo. En este caso una fuerte asociación con la enfermedad se hizo evidente (OR= 4,17, 95%IC 1,21-15,76; p= 0,009). Este estudio muestra que polimorfismos en CARD15 o en otros genes en fuerte desequilibrio de unión con ellos pueden conferir una susceptibilidad diferencial a enfermedad celíaca. 27. POLIMORFISMOS EN EL GEN DE LA INTERLEUQUINA 6 EN PACIENTES ESPAÑOLES CON DÉFICIT DE IGA. LópezMejías R1, Cruz García-Rodríguez M2, Ferreira A2, Fontán G2, Fernández-Arquero M1. Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Introducción. La deficiencia selectiva de IgA es la inmunodeficiencia primaria mas común en individuos de raza blanca, con una frecuencia de aparición de 1/600 individuos. Es una enfermedad multifactorial en la cual intervienen diversos factores genéticos, dentro de los cuales el HLA es el factor de susceptibilidad más importante descrito hasta el momento. La interleuquina 6 (IL-6) es una citoquina que, entre otras funciones, estimula el crecimiento de los linfocitos B diferenciados en células plasmáticas e in vitro causa un aumento en la producción de IgA. Además, niveles excesivos de esta citoquina han sido observados en 71 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 72 POSTERS pacientes con determinadas enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide. En este gen se han descrito varios polimorfismos que se han estudiado para evaluar su posible relación con susceptibilidad a enfermedades como la diabetes y la artritis reumatoide. Nuestro objetivo será analizar el posible papel que dichos polimorfismos en el gen de la IL-6 puedan desempeñar en el desarrollo del déficit de IgA. Material y métodos. Se han analizado un total de 195 enfermos con déficit de inmunoglobulina A diagnosticados en el servicio de inmunología del Hospital La Paz de Madrid y 417 sujetos sanos. Todos los individuos eran blancos y de origen español. Así mismo, ambos progenitores de 72 de estos enfermos fueron analizados para llevar a cabo un estudio familiar. Se analizaron nueve polimorfismos de un único nucleotido (SNPs) localizados a lo largo del gen de la IL-6: rs1546762, rs1880242, rs206982, rs1800797, rs3087226, rs2069830, rs2069849, rs2069861 y rs1818879. Para todos los SNPs, el tipaje se llevó a cabo mediante el uso de ensayos Taqman, siguiendo las instrucciones recomendadas por la casa comercial (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La comparación de frecuencias entre la muestra enferma y control se realizó mediante tests chi-cuadrado o test exacto de Fisher cuando los valores esperados eran menores de 5. Las frecuencias haplotípicas fueron estimadas mediante el algoritmo EM (Expectation-Maximization) incorporado en el software para Genética de Poblaciones Arlequin. El estudio familar se llevó a cabo mediante la aplicación de un TDT (transmission disequilibrium test). Resultados. Todos los polimorfismos estudiados se ajustan a las proporciones esperadas bajo Hardy-Weinberg. La comparación de frecuencias alélicas y genotípicas entre enfermos y controles no mostró ningún resultado estadísticamente significativo. Sin embargo, el análisis de haplotipos reveló un haplotipo, concretamente CGGGCCA, que parecía proteger frente al desarrollo de la enfermedad (OR=0,35 I.C. 0,17-0,72; p =0,002; p corregida <0,05). Este resultado no pudo ser observado en el estudio con familias, probablemente debido a su menor potencia estadística por el reducido número de familias. Discusión. El gen IL6 parece estar implicado en el desarrollo del déficit de IgA. Estudios posteriores serán necesarios para comprobar si existe algún polimorfismo que caracterice este haplotipo y sea el único responsable de la asociación observada. 28. ASOCIACION SEXO ESPECIFICA DEL POLIMORFISMO C1857T DEL GEN PTPN22 CON ACALASIA IDIOPÁTICA. Cenit MC1, Santiago JL1, Benito MS1, Ruiz de León A2, Mendoza JL2, Díaz-Rubio M2, Concha EG de la1. 1Servicio de Inmunología Clínica, y 2Servicio de Gastroenterología, H. Clínico San Carlos. Madrid. Introducción y objetivos. La acalasia idiopática es un desorden de la motilidad esofágica caracterizado por aperistalsis y por una insuficiencia del esfínter esofágico inferior para relajarse durante la deglución. Está desencadenada principalmente por una pérdida del efecto inhibitorio del plexo mientérico del esófago. Entre las posibles causas propuestas para esta enfermedad se incluyen: degeneración neuronal, infección vírica, predisposición genética y destrucción mediada por el sistema inmune del plexo mientérico. En apoyo de la etiología autoinmune se han descrito tres grupos de evidencias: la presencia de células T y eosinófilos en el tejido esofágico, los elevados títulos de autoanticuerpos contra el plexo mientérico que aparecen en algunos 72 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 pacientes y la alta prevalencia de ciertos antígenos del HLA de clase II. Nuestro objetivo fue estudiar por primera vez en la acalasia el polimorfismo C1858T localizado en el gen PTPN22 (protein tyrosin phosphatase N22) que se ha encontrado asociado a varias enfermedades autoinmunes, lo que apoyaría su carácter autoinmune. Metodología. Realizamos un estudio caso-control con 231 pacientes diagnosticados de acalasia y 554 controles sanos, todos españoles de la Comunidad de Madrid. Tanto en enfermos como en controles se analizó el SNP PTPN22 C1858T (rs2476601) por sondas TaqMan mediante Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Las diferencias en frecuencias alélicas y genotípicas fueron calculadas por el estadístico Chi-cuadrado y las asociaciones fueron estimadas mediante odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95% (Epi Info v. 6.02, CDC, Atlanta,USA). Resultados. En el estudio global de la población no encontramos una asociación significativa del alelo 1858T con un aumento del riesgo a sufrir acalasia (OR= 1,38; p= 0,13). Sin embargo, la distribución de este alelo fue significativamente diferente entre mujeres y hombres enfermos (OR= 2,06; p= 0,042) y también entre pacientes mujeres y controles (OR= 1,94; p= 0,01), pero no entre hombres enfermos y controles (OR= 0,94; p= 0,85). Cuando estratificamos por el principal alelo HLA de susceptibilidad y por la presencia de anticuerpos anti-plexo mientérico, solo las mujeres DQA1*0103 negativas (OR= 2,23; p= 0,004), auto-anticuerpos positivos (OR= 2,14; p= 0,035) o las que presentan ambos caracteres simultáneamente (OR= 2,62; p= 0,017) fueron significativamente diferentes de controles. Conclusiones. Describimos por primera vez al alelo 1858T del gen PTPN22 como factor de susceptibilidad para mujeres españolas con acalasia. Se trata de un factor de riesgo adicional al HLA de clase II, lo que apoya el carácter autoinmune de la acalasia incluso en aquellas pacientes sin factores HLA de susceptibilidad conocidos. 29. ESTUDIO DE ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO C1858T DEL GEN PTPN22 EN LA INFECCIÓN POR TRYPANOSOMA CRUZI. Robledo G1, Calzada JE1, González CI2, Martín J1, González A1. 1Instituto de Biomedicina y Parasitología López-Neyra, CSIC, Granada. 2Facultad de Salud. Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia. Introducción. Se ha sugerido recientemente que las proteínas tirosín fosfatasas (PTPs) son fundamentales en procesos celulares críticos en la respuesta inmune y que alteraciones en ellas están implicadas en el desarrollo de diferentes enfermedades humanas desde el cáncer a las deficiencias del sistema inmune. Una de estas PTPs, la PTPN22 (protein tyrosine phosphatase nonreceptor 22), localizada en el cromosoma 1p13.3, interviene en la señalización del receptor de las células T. Se ha descrito un polimorfismo de PTPN22 (C1858T; rs2476601; R620W), situado en el motivo P1 de este gen, que inhibe la activación de células T y está asociado con susceptibilidad a múltiples enfermedades autoinmunes así como a infección por M. tuberculosis. Basándonos en estas premisas, evaluamos la posible influencia del polimorfismo C1858T del gen PTPN22 en la susceptibilidad a infección por T. cruzi y en el desarrollo de síntomas cardíacos. Métodos. Se analizaron dos cohortes caso-control independientes provenientes de zonas endémicas de Colombia y Perú. Los pacientes de enfermedad de Chagas se clasificaron, a su vez, entre cardiomiopáticos (n= 126 en colombianos y n= 28 en peruanos) y asintomáticos (n=113 en colombianos y n= 44 en peruanos). El genotipado del poli- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 73 INMUNOLOGÍA morfismo PTPN22 C1858T se realizó mediante PCR a tiempo real con sondas Taqman. Resultados. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las dos cohortes de pacientes chagásicos analizadas juntas o por separado y sus controles, en cuanto a la distribución alélica y genotípica del polimorfismo PTPN22 C1858T. Tampoco encontramos diferencias significativas entre pacientes cardiomiopáticos y asintomáticos separadamente o combinando ambas poblaciones. Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que el polimorfismo analizado del gen PTPN22 no parece estar implicado en el desarrollo de la enfermedad de Chagas. 30. POLIMORFISMO GENÉTICO DE TAP Y LMP EN BRUCELOSIS HUMANA Y SUS COMPLICACIONES. Bravo MJ, Lavado R, Miranda JM, Fernández N, Colmenero JD, Martín J, Alonso A, Caballero A. Servicio de Inmunología, Hospital Carlos Haya, Málaga. Introducción. La brucelosis es una zoonosis causada por una bacteria del género Brucella. La enfermedad afecta a humanos en áreas donde permanece endémica, especialmente en países de la cuenca Mediterránea. La inmunidad frente a Brucella depende de forma crucial de las células T antígeno específicas que median en la activación de los macrófagos, que son los mayores efectores en la eliminación de este patógeno intracelular. Los antígenos proteicos bacterianos se presentan a células T cooperadoras con fenotipo CD4+. Sin embargo, algunos antígenos de Brucella se expresan en el contexto del MHC de clase I, que provoca la activación de células T citotóxicas, con fenotipo CD8+. Hay dos grupos de proteínas, que participan en el procesamiento antigénico, los transportadores de péptidos (TAP) y los polipéptidos de bajo peso molecular (LMPs). El grupo génico LMP/TAP está codificado en el cromosoma 6, en el CMH, en la región de clase II entre los loci DQB1 y DPB1, ambos son polimórficos y están relacionados con enfermedades del tipo autoinmunes y enfermedades infecciosas del tipo lepra y tuberculosis. Debido a su papel en el procesamiento antigénico, su localización dentro del CMH y su polimorfismo, pensamos que los genes que codifican para el procesamiento y transporte antigénico que median en la vía endógena como son TAP y LMP son considerados como importantes candidatos para la asociación con susceptibilidad para brucelosis humana. Objetivo. El presente estudio se diseñó con el objeto de determinar si existe asociación entre el polimorfismo genético de TAP y LMP y la brucelosis humana. Métodos. Se han estudiado 61 pacientes de brucelosis humana y 102 individuos sanos. El análisis del polimorfismo de los genes TAP y LMP se realizó mediante PCR-RFLP con sitios de restricción creados durante la amplificación. Para estudios de asociación los valores de P se calcularon utilizando el test de &#967;2 con corrección de Yates. Los valores de P menores de 0,05 se consideraron significativos. Resultados. No encontramos diferencias en las frecuencias de los genotipos LMP y TAP entre los pacientes y los controles. Al considerar los pacientes con ausencia y presencia de formas focales o complicadas, encontramos un aumento significativo del genotipo TAP2A/TAP2F en los pacientes con formas focales cuando se comparó con el grupo de pacientes sin formas focales (16% vs 0%, P= 0,02), aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas al corregir por el número de comparaciones. POSTERS Conclusión. Este estudio pone de manifiesto que los genes de procesamiento y transporte antigénico (LMP y TAP) no confieren susceptibilidad genética ni protección frente a la brucelosis humana. 31. POLIMORFISMOS DEL PROMOTOR DE MCP-1 Y DE CCR2 EN PACIENTES CON HEPATITIS CRÓNICA POR VIRUS C. Montes-Cano MA, García-Lozano JR, Aguilar-Reina J, RomeroGómez M, Barroso N, Núñez-Roldán A, González-Escribano MF. Servicio de Inmunología. HU Virgen del Rocío. Sevilla. Antecedentes. La infección por virus de la hepatitis C (HCV) conduce al desarrollo de hepatitis crónica en más del 80% de los infectados, mientras que solo 10%-20% aclara espontáneamente el virus. La evolución de los pacientes que desarrollan hepatitis crónica es también diversa y así el 20-30% desarrolla fibrosis progresiva y cirrosis, mientras que en el resto de los casos la evolución oscila entre la ausencia de fibrosis y el desarrollo de un grado moderado de la misma. La respuesta al tratamiento es también diversa encontrándose pacientes no respondedores, respondedores que recaen y pacientes que presentan respuesta sostenida. La diferente evolución de la infección por HCV podría estar influenciada por diferentes factores genéticos tanto del huésped como del hospedador. Entre los factores genéticos del hospedador que podrían condicionar la evolución se encuentran las quimioquinas. MCP-1 es una ‚-quimioquina que tiene un importante papel como mediador en los procesos de inflamación crónica y como regulador de la homeostasis de citoquinas en el hígado. El principal receptor de MCP-1 es CCR2 cuya expresión aumenta considerablemente en situaciones de inflamación crónica. Objetivo. Estudiar la posible relación de los polimorfismos -2518 G/A de MCP-1 y 190 G/A y rs3138042 G/A de CCR2 en el desarrollo de hepatitis crónica y en la evolución de la misma y respuesta al tratamiento en pacientes infectados por HCV. Material y métodos. Se incluyeron en el estudio 284 pacientes con hepatitis crónica, 65 pacientes con aclaramiento viral espontáneo y 193 controles no infectados. Los pacientes con hepatitis crónica se estratificaron según el índice de Scheuer de fibrosis en F0-F2 (n=202) and F3F4 (n=82) y según su respuesta a la terapia antiviral en individuos con respuesta sostenida (SR, n=84) y sin respuesta sostenida (NSR, n=91). El genotipado de los 3 SNPs estudiados se realizó utilizando diversos métodos de PCR. Resultados. La única diferencia significativa observada fue un aumento de la frecuencia del alelo 190 CCR2 A en el grupo de pacientes con hepatitis crónica comparado con el grupo de controles no infectados (15,0% vs 10,1%, p=0,03; OR=1,57; 95% CI 1,03-2,39) y con el grupo de controles que aclaraban espontáneamente el virus (9,2%) si bien la comparación no alcanzaba la significación estadística en este caso (p=0,09). Conclusión. El polimorfismos 190 CCR2 A podría influir en el desarrollo de hepatitis crónica en pacientes infectados por virus C. 32. GENOTIPOS KIR EN PACIENTES CON TUBERCULOSIS. Guerrero MA, Ocejo-Viñals G, Sánchez-Velasco P, Ausín F, Fariñas C, Leyva-Cobián F. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Introducción. Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) son miembros de un grupo de moléculas reguladoras que se encuentran en 73 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 74 POSTERS algunas células del sistema inmune. Existen isotipos inhibidores y estimuladores de la actividad de las células NK. Es por ello por lo que se cree que este tipo de receptores juegan un papel importante en el control de la respuesta inmune, lo cual podría explicar la asociación observada entre ciertos genes KIR y diferentes enfermedades. Materiales y métodos. Se incluyeron un total de 78 pacientes con tuberculosis (TB) y 60 controles, ninguno de ellos relacionado, todos ellos de la Comunidad Autonómica de Cantabria. Se estudió la presencia o ausencia de genes KIR (killer cell immunoglobulinlike Receptor), mediante técnica de PCR-SSO-Luminex y análisis de los datos mediante el software LifeMatch. El test exacto de Fischer fue utilizado para realizar las comparaciones estadísticas. Resultados. El número de pacientes con TB que presentan KIR2DL difiere significativamente comparado con el grupo de controles sanos (30 vs 14, p= 0,025). El número de controles sanos que presentan KIR3DL1 difiere significativamente comparado con el grupo de pacientes con TB (54 vs 60, p= 0,035). Del mismo modo el número de controles que presentan KIR2DS5 difiere significativamente respecto del grupo de pacientes con TB (31 vs 25, p= 0,016). Conclusión. Nuestros resultados muestras diferencias en la expresión de genes KIR inhibidores (KIR2DL2, KIR3DL1) y activadores (KIR2DS5) entre pacientes con TB y controles sanos en nuestra población. Al tratarse de una muestra pequeña, sería necesario incluir un número mayor de pacientes con TB en el estudio, para confirmar si estos datos se mantienen. 33. DISTRIBUCIÓN DE LA FRECUENCIA DE LAS VARIANTES GENOTÍPICAS DE +874(A→T) EN CÁNCER DE MAMA ESPORÁDICO EN LA PROVINCIA DE MÁLAGA. Lavado R1, Bravo MJ1, Miranda JM1, Fernández-Arcás N1, Alés I2, Alonso A1, Benavides M2, Caballero A1. 1Servicio de Inmunología y 2Sección de Oncología Médica, Hospital Regional Universitario Carlos Haya, Málaga. Antecedentes y estado actual del tema. El cáncer de mama es una de las neoplasias más frecuentes entre mujeres occidentales. El IFN-γ es una citocina secretada por linfocitos T (CD4+ y CD8+) activados por antígenos, que son los efectores de la respuesta inmune mediada por células. Es, junto al TNF-α, el principal activador de macrófagos y células NK. El efecto neto de IFN-γ es promover las reacciones inflamatorias ricas en Th1 y macrófagos, por lo que altos niveles del mismo favorecerían teóricamente una respuesta antitumoral. Objetivos. Análisis de la frecuencia de los genotipos de IFN-γ asociados con alta, media y baja producción de dicha citocina en pacientes con cáncer de mama. Material y método. En un grupo de 96 pacientes y 94 controles sanos pertenecientes a la misma región geográfica, se analizó por PCRSSP el punto polimórfico +874(A→T) del gen que codifica IFN-γ. Este punto polimórfico da lugar a tres posibles genotipos: AA, AT y TT, asociados con baja, media y alta producción de la citocina respectivamente. Los resultados se analizaron mediante una χ2 con corrección de Yates, Odd Ratios (OR) con un 95% de intervalo de confianza. Se aplicó el Test exacto de Fisher en los casos en los que n ≤ 5. Resultados. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para ninguno de los alelos analizados. Dado que ha sido previamente descrita una asociación entre el alelo HLAB7 y susceptibilidad a padecer cáncer de mama en nuestra área geográfica, se analizó la distribución de frecuencias de los alelos de IFN- 74 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 γ en pacientes HLA-B7 frente a pacientes con cualquier otro alelo. No se hallaron diferencias estadísticamente significativas. Conclusión. En base a nuestros resultados, concluimos que ninguna de las variantes alélicas del punto +874(A → T) de IFN-γ relacionadas con diferentes niveles de producción de la citocina se asocian con susceptibilidad o protección frente al cáncer de mama en nuestra área geográfica. 34. DISTRIBUCIÓN DEL POLIMORFISMO DEL PRION P M129V EN PACIENTES DE ALZHEIMER. León VJ1, Cacho JL2, Rodriguez Perez R2, Ortin A2. 1Serv. Analisis Clinicos. 2Serv. Neurología, Hospital Universitario de Salamanca. Introducción. La Enfermedad de Alzheimer, EA, es un desorden neurodegenerativo que ha sido asociado con la presencia de depositos de proteinas anormales, los cuales pueden ser producidos por la conversion de la Proteina B Amiloide PrPC (PrionC) en una forma insoluble PrP SC. Los Priones estan localizados en la neurona preferentemente en las vesiculas sinapticas así como en la membrana citoplasmatica. Presentan radicales a los que se ligan moleculas de Cobre, y juegan un papel esencial en el transporte transmembrana del cobre y en el mecanismo antioxidante celular. Esta establecido que algunas mutaciones del PrPS Causa algunas, raras, formas familiares de enfermedad de priones, sin embargo los heterozigotos del PrNPal polimorfismo Met 129 Val presentan un efecto protector ó al menos un mayor periodo de incuvación de ciertas enfermedades neurodegenerativas. El proposito del presente estudio es relacionar la presencia de este polimorfismo en enfermos de EA. Material y métodos. 44 pacientes de Alzheimer, de acuerdo con los criterios de NINCDS-ADRDA, y 42 sujetos controls se incluyeron en nuestro estudio. Un fragmento de 775 bp del gen PrNP fué amplificado empleando los primers (for: 5'-GTG GCC ACA TGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev: 5'-GTG AAA CAG GAA GAC C -3'). PCR fue efectuada utilizando 10 ng de ADN genomico en 20 mcl de mezcla de reacción. Las condiciones de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg, 72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min. El producto de la PCR fué digerido con el enzima de restricción NspI y revelado en geles de agarosa al 2%. Resultados. La distribución alelica en el grupo control fué: 42% M/M, 45% M/V, 13% V/V. En pacientes de EM: 48% M/M, 42% M/V, 10% V/V. No hemos encontrado diferencias entre el grupo control y enfermos de EA (El test Chi-square, p< 0,01). 35. MIF (MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR): ESTUDIO DE ASOCIACIÓN CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE EN POBLACIÓN ESPAÑOLA. Mas A, Heras V de la, Bartolomé M, Arroyo R, Martínez A. Hospital Clínico San Carlos, Madrid. Introducción. La citoquina MIF está implicada en la patogénesis de varias enfermedades autoinmunes. Nuestro objetivo consistió en analizar el papel en la susceptibilidad a padecer Esclerosis Múltiple en la población española de dos polimorfismos funcionales situados en el promotor de MIF, el SNP -173G/C y el microsatélite (CAAT)n en la posición -794. El haplotipo de riesgo (CAAT)7/-173C se había ya descrito previamente asociado a otras enfermedades autoinmunes. Pacientes y métodos. se realizó un estudio caso-control con 412 pacientes españoles de Esclerosis Múltiple y 534 controles sanos de la misma población. El genotipado para el SNP -173G/C se efectuó Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 75 INMUNOLOGÍA mediante un ensayo TaqMan, mientras que para el microsatélite se procedió a realizar una PCR con «primers» marcados con fluorescencia seguida de electroforesis capilar. Los haplotipos presentes fueron estimados con el algoritmo de expectación-maximización. Resultados. Los portadores del alelo -173C, del alelo (CAAT)7, o del haplotipo que contiene a ambos no evidenciaron una predisposición significativamente mayor a padecer Esclerosis Múltiple (p= 0,17, p= 0,16 y p= 0,2, respectivamente). La estratificación de los enfermos atendiendo al factor de susceptibilidad HLA-DRB1*1501 mostró diferencias significativas al comparar los portadores del (CAAT)7 frente a los controles sanos (p= 0,05; OR= 1,53). Asimismo, el haplotipo de riesgo (CAAT)7/173C se encontró significativamente elevado en los enfermos HLADRB1*1501 positivos frente a los controles (p= 0,046; OR= 1,54). Conclusiones. La asociación de los polimorfismos del gen MIF encontrada en los enfermos HLA-DRB1*1501 positivos puede sugerir un papel de este gen en la patogénesis de la Esclerosis Múltiple, aunque serán necesarios estudios adicionales para confirmar nuestros resultados en otras poblaciones. 36. DISTRIBUCION DE POLIMORFISMOS EN GENES DE CITOKINAS EN PACIENTES DE ESCLEROSIS MULTIPLE. León VJ1, Cacho JL2, Bowakin D2, Sevillano MD2. Serv. Análisis Clínicos, 2Serv. Neurología. Hospital Universitario de Salamanca Hemos estudiado 24 pacientes de Esclerosis Multiple, EM, de acuerdo con los criterios de POSER, y 28 sujetos control. El ADN fue obtenido a partir de sangre entera, con el kit DNA Direct II de Dynal, los polimorfismos fueron analizados empleando el kit Citokine genotiping Kit (Pel-freez). Los polimorfismos hallados para el grupo control fueron: IL-1alpha/ - 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/ 45 CT/15 TT), IL-1beta/ 396 (60 CC/35CT/5 TT),IL-1RA/mspa 11100 (5 CC/47.5 CT/47,5 TT), IL1R/psti 1970 (50 CC/40 CT/10 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 45 GT/40 TT), IL-2/ 166 (50 GG/40 GT/10 TT), IL-4/ 1098 (10 GG/ 27.5 GT/ 62,5 TT), IL-4/ - 590 (72.5 CC/25 CT/ 2,5 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (60 AA/35 AG/5 GG), IL-6/ - 174 (20 CC/ 40CG/40 GG), IL-6/ 565 (12.5 AA/52,5 AG/35 GG), IL-10/ - 592 (5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (50 CC/40 CT/10 TT) IL-10/ - 1082 (25 AA/50AG/25 GG), IL-12/ - 1188 (62.5 AA/32.5 AC/5CC), IFN gamma/utr 5644 (32.5 AA/42,5 AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80 GG), TNF alpha/ - 308 (10 AA/25 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (25 CC/50 CT/25 TT), TGF beta1/codon 25 (0 CC/15 CG/85 GG) Los polimorfismos para el grupo de pacientes EM IL-1alpha/ - 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (35 CC/ 50 CT/15 TT), IL1beta/ 3962 (55 CC/35CT/10 TT),IL-1RA/mspa 11100 (0CC/50 CT/50 TT), IL1R/psti 1970 (45 CC/52.5 CT/7.5 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 50 GT/35 TT), IL-2/ 166 (55 GG/35 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/ 22 GT/ 70 TT), IL-4/ - 590 (75CC/25 CT/ 0 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (75 AA/15 AG/10 GG), IL-6/ - 174 (15CC/ 45CG/40 GG), IL-6/ nt 565 (10 AA/50 AG/40 GG), IL-10/ - 592 (5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (55 CC/35 CT/10 TT) IL-10/ - 1082 (20 AA/50AG/30 GG), IL-12/ - 1188 (60 AA/35 AC/5 CC), IFN gamma/utr 5644 (35 AA/40AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80 GG), TNF alpha/ - 308 (5 AA/30 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (25 CC/50 CT/25 TT), TGFbeta1/codon 25 (0 CC/10CG90 GG) El test de Chi-Cuadrado no muestra diferencis significativas p< 0,05, entre los polimorfismos del grupo control y EM. POSTERS 37. POSIBLE ASOCIACION DE POLIMORFISMOS DEL PRION P Y NIVELES DE COBRE SERICO. León VJ1, León JA2, Garcia JL3, Hernández Galante B1. 1Servicio de Análisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Laboratorio Pediatria e Inmunologia. Univ de Valladolid. 3Centro Investigación del Cancer Salamanca. Introducción. Los priones son receptores celulares que ha sido asociados con la presencia de depositos de proteinas anormales, que pueden ser producidos por la conversion de la Proteina B Amiloide PrPC (PrionC) en una forma insoluble agregada PrP SC que es neurotoxica. Los Priones estan localizados en la neurona preferentemente en las vesiculas sinapticas así como en la membrana citoplasmatica. Presentan radicales a los que se ligan moleculas de Cobre, jugando un papel esencial en el transporte transmembrana del cobre y en el mecanismo antioxidante celular. Esta establecido que algunas mutaciones del PrPS Causa algunas, raras, formas familiares de enfermedad de priones, sin embargo los heterozigotos del PrNP al polimorfismo Met 129 Val presentan un efecto protector en ciertas enfermedades neurodegenerativas. El objetivo de nuestro estudio ha sido relacionar el polimorfsmo Met 129 Val del PrNp y los niveles de cobre serico presentes en un grupo control. Material y métodos. Se selecionaron 46 sujetos sanos, a los que se le extrajo ADN genómico mediante el kit Tripure (Roche). Mediante PCR se obtuvo un fragmento de 775 bp del gen PrNP amplificado con los primers (for: 5'-GTG GCC ACA TGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev: 5'GTG AAA CAG GAA GAC C -3'). La PCR fue efectuada empleando 10 ng de ADN genomico en 20 mcl de mezcla de reacción. Las condiciones de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg, 72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min. El producto de la PCR fue digerido con el enzima de restricción NspI y revelado en geles de agarosa al 2%. El cobre sérico fué medido mediante absorción atómica en un equipo Shimadzu AA670. Resultados. La distribución alelica en el grupo control fué: 42% M/M, 45% M/V, 13% V/V. Estos resultados resultaron similares a otros efectuados en poblaciones caucasianas, No hemos hallado correlación entre el nivel de cobre serico y los polimorfismos Met 129 Val del gen PrNP. 38. ASOCIACION DE POLIMORFISMOS MBL-2 (MANNOSEBINDING LECTIN 2) CON ENFERMEDAD CELIACA. Manzanares B1, González RA1, Rodríguez-Reynoso MF2, Jiménez J2, Carrillo J1, Sánchez-Ruiz F2, Santamaría M1, Peña J1. 1Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. 2Unidad Gastroenterología Pediátrica, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. Introducción. La lectina de unión a la manosa (MBL) representa actualmente una molécula de creciente interés debido a su papel en la inmunidad innata. La misma es codificada por el gen MBL2 (10q11.2q21). Se han descrito 7 haplotipos principales: HYPA, LYPA, LXPA, LYQA, HYPD, LYPB, LYQC. La deficiencia de MBL incrementa la susceptibilidad a infecciones y puede afectar el curso de enfermedades autoinmunes como recientemente se ha publicado en el caso de artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico. Por tanto nos propusimos estudiar el polimorfismo del gen MBL-2 en EC, así como comparar los EC y sus hermanos HLA idénticos. Pacientes y métodos. Se han estudiado 50 familias de pacientes celiacos seguidos en la unidad de gastroenterología Pediátrica del Hospital Reina Sofía de Córdoba. Todas estas familias tenían al menos un hermano HLA idéntico. Se tipó a los miembros de la familia en los locus HLA-A, B, DRB1, DQA1 y DQB1 (INNOLIPA). Para el polimorfismo 75 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 76 POSTERS de MBL2 se utilizó un ensayo que permite la detección simultánea de las 6 variaciones más relevantes de este gen (INNOLIPA MBL-2). Resultados. De los polimorfismos estudiados aquel que presenta mayores diferencias entre la población de celiacos por una parte y los controles o hermanos HLA idénticos no enfermos por otra es en -221 G>C observándose un 45,5%, 30% y 33,3% respectivamente. También hemos encontrado diferencias entre las familias de celiacos (enfermos o no) y controles en la presencia o no del haplotipo HYPA (WT) (52% en controles, frente a celiacos 41,8% y sus hermanos HLA idénticos 42%). El haplotipo más frecuente en celiacos y sus hermanos es LXPA, mientras que este haplotipo en controles es muy poco frecuente. Conclusiones. Diferentes polimorfismos en el gen MBL permite diferenciar pacientes celiacos de sus hermanos sanos HLA idénticos, mientras que otros polimorfismos nos muestran un mayor riesgo de que algún miembro de la familia sea celiaco. 39. LA SUSCEPTIBILIDAD A LA DIABETES TIPO 1 CONFERIDA POR EL POLIMORFISMO C1857T DEL GEN PTPN22 VARIA CON EL SEXO Y LA EDAD DE DEBUT DE LA ENFERMEDAD. Santiago JL1, Calle H de la2, Figueredo MA1, Concha EG de la1. 1Servicio de Inmunología Clínica, H. Clínico San Carlos, Madrid. 2Servicio de Endocrinología, H. Ramón y Cajal. Madrid. Introdución y objetivos. El gen PTPN22 (protein tyrosin phosphatase N22) codifica para una fosfatasa específica de linfocitos en los que actúa como inhibidor de la activación de las células T lo que se traduce en una eliminación menos eficaz de los linfocitos autorreactivos. El polimorfismo C1858T localizado en este gen se ha encontrado asociado en diferentes poblaciones a varias enfermedades autoinmunes incluida la diabetes tipo 1 (T1D). Se ha descrito que la actividad fosfatasa es mayor cuando el alelo 1858T esta presente, por lo que el propósito de este estudio fue confirmar el papel de esta variante en la predisposición a la T1D por primera vez en población española. Metodología. Realizamos un estudio caso-control con 316 enfermos diabético tipo 1 (157 hombres y 159 mujeres) y 554 controles sanos todos de la Comunidad de Madrid. La edad de debut varia entre 1 y 55 años (media: 17,3 ± 10,0 y mediana: 15 años) siendo todos ellos insulino dependientes en el momento del estudio. Tanto en enfermos como en controles se analizó el SNP PTPN22 C1858T (rs2476601) por sondas TaqMan mediante Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Las diferencias en frecuencias alélicas y genotípicas fueron calculadas por el estadístico Chi-cuadrado y las asociaciones fueron estimadas mediante odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95% (Epi Info v. 6.02 ,CDC, Atlanta, USA). Resultados. Por primera vez en población española replicamos la asociación del alelo 1858T con el riesgo a sufrir T1D (OR= 1,73; p= 0,004). Además, la distribución de este alelo fue diferente entre mujeres diabéticas y controles (OR= 2,06; p= 0,001) pero no entre hombres enfermos y controles (OR= 1,41, p= 0,16). Asimismo, una asociación significativa dependiente de sexo pudo establecerse después de estratificar por la edad. Fijamos el punto de corte en la mediana ya que en distribuciones asimétricas, como la edad de debut en T1D, es mejor estadístico de centralización que la media. Así encontramos que en pacientes jóvenes existían diferencias significativas entre mujeres y hombres enfermos (OR= 2,61; p= 0,022). Conclusiones. Nuestros resultados parecen sugerir que el alelo 1858T del gen PTPN22, implicado en la susceptibilidad a T1D, podría 76 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 jugar un papel diferente en mujeres y hombres diabéticos en las etapas más tempranas de debut de la enfermedad. SESIÓN 3: CÉLULAS DENDRÍTICAS Y MACRÓFAGOS. PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA. VACUNAS E INMUNOTERAPIA Moderadores: Pedro Aparicio Alonso (Murcia), África González Fernández (Vigo) 40. EXPRESIÓN DE HLA-G POR LA CÉLULAS DECIDUALES DENTRÍTICAS HUMANAS. Tirado I, Muñoz-Fernández R, Blanco O, Mata C de la, Leno E, Abadia-Molina AC, García Olivares E. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada. La decidua humana de primer trimestre contiene una población de células dentríticas (DC) mieloides inmaduras con un fenotipo: CD11c+ DC-SIGN+ CD14± CD83-. Esta población decrece en aborto espontáneo, al parecer, porque las DC emigran a los ganglios linfoides locales para madurar y estimular a las Th. Las DC deciduales, por otra parte, forma complejos con la NK deciduales. No conocemos que función tienen estos complejos, pero el hecho de que las DC presenten claros signos de apoptosis, sugiere que las NK deben desarrollar un proceso de edición de las DC deciduales. El HLA-G, es un antígeno monomórfico, con una distribución muy restringida fundamentalmente limitada al trofoblasto. Aunque no está totalmente probado, existen evidencias que sugieren que este antígeno se une a los receptores inhibidores de las NK deciduales para inhibir la actividad citotóxica de estas células frente a trofoblasto. En el presente trabajo, hemos estudiado mediante citometría de flujo la expresión de HLA-G en las DC deciduales de primer trimestre. Las DC han sido identificadas por la expresión de DC-SIGN. Hemos observado una proporción significativa de DC expresan HLA-G, lo que sugiere que mediante esta expresión las DC controlan la actividad citotóxica que desarrollan las NK sobre ellas. 41. EL PAPEL DE LA HIPOXIA EN LA ACTIVACIÓN DE LOS MACRÓFAGOS. Acosta-Iborra A, Elorza A, Olazabal I, MartínPuig S, Martín-Cofrades N, Sánchez-Madrid F, Landázuri MO. Hospital Universitario de la Princesa. Los macrófagos son células mieloides que provienen de monocitos circulantes que migran a los tejidos transformándose en macrófagos residentes. Estos macrófagos constituyen la primera línea de defensa frente a infecciones y juegan un papel muy importante en la inflamación. En estas áreas inflamadas hay una disminución de las tensiones de oxígeno debido a la oclusión de los vasos sanguíneos y los macrófagos residentes son capaces de responder rápidamente a estas variaciones de oxígeno. En hipoxia los macrófagos responden activando un gran número de genes como VEGF, EPO, enzimas glicolíticas, etc. La expresión de estos genes, en hipoxia, está controlada, a nivel de transcripción, por el Factor de transcripción Inducible por Hipoxia (HIF). HIF es un heterodímero a/b que se expresa de manera constitutiva. En presencia de oxígeno la subunidad HIF-a va a ser hidroxilada, en 2 residuos de prolina, por las prolil-hidroxilasas (PHDs) lo que permite que sea reconocida por Von Hi ppel Lindau (VHL) marcando Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 77 INMUNOLOGÍA POSTERS a la subunidad HIF-a para su degradación vía proteosoma. En ausencia de oxígeno las PHDs no pueden hidroxilar a la subunidad HIF-a, por lo que se estabiliza, viaja al núcleo, heterodimeriza con la subunidad HIF-a, y se unen a los Elementos de Respuesta a Hipoxia (HRE) controlando la expresión de los genes ya mencionados. En el presente trabajo se estudia como la hipoxia regula funciones básicas de los macrófagos como son la fagocitosis y la presentación antigénica a linfocitos T. absolutos de las subpoblaciones de DCs en donantes de sangre de un rango de edad comprendido entre los 18 y 65 años. Los valores obtenidos indican, como dato destacable y en concordancia con observaciones previas, una disminución significativa de la subpoblación pDC con la edad, mientras que la subpoblación cDC no muestra modificaciones significativas. Los resultados de este estudio pueden considerarse como valores de referencia para las determinaciones analíticas que incluyan el análisis cuantitativo de las DCs en sangre periférica. 42. PAPEL DE LA HIPOXIA EN EL FOCO INFLAMATORIO. Elorza A, Olazabal I, Acosta-Iborra B, Martín-Puig S, Martín-Cofrades N, Sánchez-Madrid F, Landázuri MO. Hospital Universitario de la Princesa. 44. LA ESTIMULACIÓN CON IL-12+IL-18 INDUCE A LA PRODUCCIÓN DE IFN-GAMMA EN MACRÓFAGOS. Darwich L, Coma G, Peña R, Bofill M. Institut de Recerca de la SIDA- Fundació IrsiCaixa. Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona. En un proceso inflamatorio el tejido responde con una serie de cambios metabólicos, uno de los más importantes es el debido a la disminución de la tensión de oxígeno (hipoxia), que es debida a la interrupción del flujo sanguíneo local; mientras que en un tejido sano la tensión de oxígeno está generalmente comprendida entre 2.5 y 9% de O2 (20 y 70 mmHg), en un tejido dañado se pueden formar áreas transitorias o crónicas de hipoxia, en las cuales se alcancen tensiones de O2 de menos del 1% (10 mmHg). Los macrófagos tienen que actuar en estos sitios hipóxicos, donde son capaces de funcionar mediante la alteración de su expresión génica, mediada por la up-regulación del factor de transcripción inducible por hipoxia, HIF, y la adaptación consiguiente de su actividad metabólica a este ambiente adverso. HIF es un heterodímero a/b que se expresa de manera constitutiva. En presencia de oxígeno la subunidad HIF-a va a ser hidroxilada, en 2 residuos de prolina, por las prolil-hidroxilasas (PHDs) lo que permite que sea reconocida por Von Hippel Lindau (VHL) marcando a la subunidad HIF-a para su degradación vía proteosoma. En ausencia de oxígeno las PHDs no pueden hidroxilar a la subunidad HIF-a, por lo que se estabiliza, viaja al núcleo, heterodimeriza con la subunidad HIF-b, y se unen a los Elementos de Respuesta a Hipoxia (HRE) controlando la expresión de los genes ya como EPO, VEGF, enzimas glicolíticas. En el presente trabajo hemos estudiado como la hipoxia puede regular a los macrófagos en la expresión de marcadores de superficie implicados en su activación, y en procesos como la fagocitosis y la presentación antigénica. Existe cierta controversia acerca de la acción autocrina de la IL-12 y IL-18 en células del linaje mieloide, y en concreto en monocitos y macrófagos. El objetivo de este estudio ha sido determinar la producción in vitro de IFN-gamma en cultivos de monocitos, monocitos madurados a macrófagos y monocitos diferenciados en dendríticas, que han estado co-estimulados con IL-12 + IL-18, mediante las técnicas de ELISPOT y ELISA. A partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de 5 voluntarios sanos se realizó una separación positiva de monocitos mediante anticuerpo anti-CD14 y de células CD4+, obteniendo unas purezas superiores al 95% y 98% respectivamente. Por un lado se procedió a la estimulación de monocitos no diferenciados con IL12 + IL18 a fin de realizar una cinética de producción de IFN-gamma que abarcaba de 24h a 144 horas de cultivo, obteniéndose lecturas cada 24h. Como controles positivos se utilizaron CMSP y células CD4+ a diferentes concentraciones. No se observó producción de IFN-gamma en los monocitos durante ese periodo de co-estimulación, por ninguna de las dos técnicas. Por otro lado se cultivaron monocitos aislados en presencia del factor de estimulación de colonias de macrógagos (M-CSF) o en presencia del factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF,) más IL-4, durante 7 días para diferenciar los monocitos a macrófagos o a células dendríticas, respectivamente. Al cabo de una semana se lavaron los cultivos, se añadió IL-12 e IL-18 y se midió la producción de IFN gamma a las 72h. A diferencia de los cultivos de monocitos inmaduros que no son capaces de producir IFNgamma bajo la estimulación continua de IL-12+IL-18, los monocitos diferenciados a macrófagos producen elevados niveles de IFN-gamma en las mismas condiciones de cultivo. Las células dendríticas derivadas de monocitos producen IFN gamma pero en menor cantidad. Conclusión. Los macrófagos pero no los monocitos producen IFNgamma en presencia de IL-12 y IL-18 confirmando la función autocrina del IL-12 e IL-18 en células mieloides. 43. DETERMINACIÓN DE LOS VALORES ABSOLUTOS DE LOS SUBTIPOS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS EN SANGRE PERIFÉRICA DE INDIVIDUOS SANOS. Pérez-Cabezas B, NaranjoGómez M, Fernández MA, Grífols JR, Pujol-Borrell R, Borràs FE. Laboratori d'Immunobiologia i Diagnòstic Molecular (LIRAD). Banc de Sang i Teixits (BST). Dept. de Biologia Cel.lular, Fisiologia i Immunologia. Universitat Autònoma de Barcelona. Institut Investigació Germans Trias i Pujol. 08916. Badalona (Barcelona). Las células dendríticas (DC) desempeñan funciones fundamentales para la respuesta inmmune, tanto en su componente innato como adaptativo. En sangre periférica pueden identificarse dos subtipos mayoritarios de DCs, denominados DC convencionales (cDC) y DC plasmacitoides (pDC). En diversas situaciones patológicas, así como en el envejecimiento, los valores absolutos de estas subpoblaciones pueden verse modificados y su capacidad funcional alterada. En este trabajo se han determinado, mediante citometría de flujo, los valores 45. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE ISOFORMAS DE «SPLICING» Y VARIANTES POLIMÓRFICAS DE DC-SIGN: IMPACTO DEL DOMINIO DEL «CUELLO» EN LA MULTIMERIZACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE PATÓGENOS. Sierra-Filardi E, Serrano-Gómez D, MartínezNuñez R, Caparrós E, Muñóz-Fernández MA, Corbí AL. Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). DC-SIGN es una lectina tipo C que se expresa en células dendríticas mieloides (DC) y en algunas subpoblaciones de macrófagos. DC- 77 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 78 POSTERS SIGN reconoce estructuras glicosiladas en la superficie de un gran número de patógenos (HIV, Mycobacterium, HCV), participa en la formación de la sinapsis inmunológica al interaccionar con ICAM-3 de los linfocitos T vírgenes, interviene en la migración transendotelial de DCs al unirse a ICAM-2 en el endotelio, y facilita la interacción entre DCs y neutrófilos al reconocer la integrina CD11b/CD18. DC-SIGN presenta una región formada por ocho repeticiones de 23 aminoácidos («cuello»), que posibilita la multimerización de la lectina y lo que conlleva un aumento de la avidez de DC-SIGN por sus ligandos. Se ha descrito la existencia de isoformas generadas mediante «splicing» alternativo y variantes polimórficas a nivel genómico que difieren en el número estas repeticiones, lo que podría afectar a sus capacidad de reconocimiento de patógenos. En este trabajo se demuestra que las isoformas generadas mediante «splicing» alternativo se expresan en células dendríticas derivadas de monocitos tanto a nivel de RNA como a nivel proteico, que la multimerización de DC-SIGN en la membrana depende del dominio lectina, y que es inhibida por la glicosilación del «cuello». Estas variantes, aún presentando diferente grado de multimerización en la membrana, mantienen su capacidad de reconocer patógenos. Parece, por tanto, que la agrupación de moléculas de DC-SIGN inducida por los patógenos es suficiente para incrementar la avidez de estas isoformas por sus ligandos. Por otro lado, se identifican variantes polimórficas de DC-SIGN que sólo poseen siete dominios repetidos de la región del «cuello». Su análisis estructural muestra que no tienen alterada la capacidad de multimerización y revela la existencia de hetero-oligómeros entre las variantes y la forma de ocho repeticiones. Además, estudios funcionales sugieren que su capacidad de reconocimiento de patógenos es similar a la de la forma prototípica de DC-SIGN. En definitiva, estos resultados ayudarán a determinar las bases moleculares de la asociación entre las variantes polimórficas de DCSIGN y la susceptibilidad alterada a infecciones virales (HIV, Dengue) y bacterianas (Mycobaterium tuberculosis). 46. MODULACIÓN DE LAS ACTIVIDADES FUNCIONALES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS POR BACTERIAS PROBIÓTICAS. Aragoneses-Fenoll L, Dominguez-Soto A, Jimenez E, Rodríguez JM, Corbí AL. Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Los probióticos se definen como «microorganismos vivos cuya ingestión en número adecuado ejerce efectos beneficiosos para la salud que van más allá de sus efectos nutritivos». De hecho, ciertos probióticos son capaces de modular la respuesta inmunitaria. Tomando como base este hecho, nuestra hipótesis es que el efecto inmunomodulador de los probióticos tiene su origen en su acción sobre las células dendríticas, esenciales para la inmunidad innata y para la iniciación y regulación de la respuesta adaptativa. Con el objeto de clarificar los mecanismos de la actividad inmunomoduladora de probióticos hemos llevado a cabo ensayos de unión de diferentes cepas de bacterias probióticas a células dendríticas humanas derivadas de monocitos (MDDC), y hemos determinado su capacidad de inducir maduración fenotípica y funcional, evaluando además la posible inducción de citoquinas polarizadoras (IL-12p70, IL10). Nuestros resultados indican que todas las cepas ensayadas (L. reuteri, L. casei, B. lactis, Lb. gasseri, L. rhamnosus) son capaces de unirse a MDDC de manera Ca2+- y DC-SIGN independiente. Sin embargo, las 78 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 diversas cepas difieren en su capacidad inducir maduración fenotípica (aumento de moléculas coestimuladoras, CD83 y CD86, disminución de la lectina DC-SIGN) y funcional (producción de IL-10). Lactobacillus gasseri ha resultado ser la bacteria que induce una maduración más potente, y Lactobacillus reuteri es la única capaz de inducir activación de NF-κB vía TLR-2. Por este motivo hemos seleccionado ambas cepas para llevar a cabo estudios sobre los cambios de expresión génica inducidos en MDDC por bacterias probióticas. Los resultados obtenidos serán presentados y se discutirá la posible implicación de los genes identificados en la generación de respuestas inmunitarias tipo Th1 y Treg. 47. COGNATE INTERACTION BETWEEN T- AND ACTIVATED B- CELLS INDUCE AN INCREASED RELEASE OF FUNCTIONAL MHC-II ON B CELL EXOSOMES. Muntasell A, Roche P. Experimental Immunology Branch, National Institutes of Health, USA. Exosomes are membrane microvesicles released by haematopoietic cells in an exocytic manner. Recently, dendritic cell derived exosomes raised a great deal of interest with the demonstration of their potent immunostimulatory functions in tumor models. Although exosomes are currently used as therapeutic tools to stimulate immune responses against solid tumors in phase II clinical trials, little is known about their physiological role. To study the role of APC-derived exosomes in antigen presentation to CD4 T cells, we characterized the origin, function, and the regulated secretion of pMHC-II on B cell exosomes. We found that activated spleen B cells release 10% of specific peptide-MHC-II complexes (pMHC-II) on exosomes every day. Analysis assessing the trafficking pathway followed by MHC II molecules showed that exosomes mostly concentrate pMHC-II that had been previously expressed on the surface of the donor cells. While these exosomes were unable to activate naïve CD4 T cells, they very efficiently induced proliferation of and cytokine secretion by primed CD4 T cells. Interestingly, we found that cognate interactions between T and B cells induce an increased release of pMHC-II bearing B cell-exosomes. This regulated secretion of exosomes from the B cell is an active mechanism that could similarly be triggered upon specific pMHC-II cross-linking. Based on these results we propose that T cell-induced secretion of pMHC-II on B cell exosomes is a mechanism that allows antigenic pMHC-II complexes to escape from degradation in the donor APC. This secreted «burst» of exosomes could act in vivo as an spatial expansion of the APC surface to increase antigen availability for the surrounding additional T cells. 48. EL ÁCIDO RETINOICO INCREMENTA EL EFECTO TOLEROGÉNICO DE LA VITAMINA D3 SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONOCITOS. Atencia R, Arrieta A, Riñón M, Prada A, Maruri N. Hospital de Cruces. Uno de los campos emergentes en la inmunología del siglo XXI es el que estudia las posibilidades de manipulación de las células dendríticas para obtener fenotipos capaces de inducir lo que se conoce como tolerancia inmunológica. Entre ellas, la acción in vitro de la vitamina D3 es uno de los mejor documentados. Nuestro trabajo valora las posibilidades de potenciar el efecto tolerogénico de la vitamina D3 sobre las células dendríticas mediante su combinación con moléculas de la familia de los retinoides, como el ácido retinoico, de las que se conoce su capacidad de establecer sinergis- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 79 INMUNOLOGÍA mos en otros modelos experimentales de diferenciación celular. Para ello, se han realizado cultivos de células dendríticas en presencia de Vitamina D3, 9-cis ácido retinoico y bexaroteno así como de combinaciones de Vitamina D3 y uno de estos retinoides, valorando su influencia sobre el proceso de maduración de las células dendríticas derivadas de monocitos mediante el. Los resultados del análisis del fenotipo de superficie nos permiten confirmar de forma preliminar nuestra hipótesis de que existe un efecto aditivo sobre la maduración de las células dendríticas derivadas de monocitos cuando se combinan agonistas de los RxR y Vitamina D3 y que este efecto se manifiesta en una mayor inhibición de la expresión de moléculas coestimuladoras si se comparan con los resultados de los cultivos tratados sólo con Vitamina D3 análisis del fenotipo de superficie por citometría de flujo. Los ensayos funcionales (cultivos mixtos, producción de IL-12) han proporcionado resultados iniciales que apuntan en la misma dirección. La obtención mediante tratamientos in vitro de células dendríticas con capacidad tolerogénica proporcionaría una herramienta terapéutica aplicable en distintas patologías (autoinmunidad, trasplante...). 49. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES DEL METABOLISMO DEL HIERRO EN LA ACTIVACIÓN CLÁSICA Y ALTERNATIVA DE MACRÓFAGOS. Burgui I, Sierra-Filardi E, Puig-Kröger A, Corbí AL. Centro de Investigaciones Biológicas. La correcta activación de macrófagos ante diferentes situaciones patológicas, como el ataque por agentes patógenos o el desarrollo de tumores, determina el éxito de la resolución de dichas patologías. Así, es posible clasificar la activación de macrófagos como clásica (inducida por citoquinas de tipo Th1, lo que favorece una función microbicida o tumoricida) o alternativa (inducida por citoquinas de tipo Th2, promoviendo la eliminación de parásitos). Además de los diferentes fenotipos según la activación, existen distintos tipos de macrófagos en estado basal. Con objeto de identificar genes con un papel fundamental en las distintas clases de macrófagos hemos analizado los perfiles de expresión génica de macrófagos en estado basal (obtenidos en presencia de GM-CSF o M-CSF) y activados por la vía clásica o alternativa (en presencia de IFNγ o IL-4 respectivamente). Entre ellos, cabe destacar la expresión diferencial de genes implicados en el metabolismo del hierro, como la enzima hemo oxigenasa-1 (HO-1) o CD163. Los estudios efectuados hasta el momento indican que esta ruta condiciona las funciones efectoras y el fenotipo de macrófagos tras su activación. 50. ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T MEDIANTE CÉLULAS DENDRÍTICAS PULSADAS CON PÉPTIDOS DERIVADOS DE LA PROTEÍNA P53. Marcos I, Visús C, Martínez-Lorenzo MJ, Godino J, Mayordomo JI, Tres A, DeLeo A. Instituto Aragones de Ciencias de la Salud y Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa-Zaragoza. Diversos estudios han demostrado que la mayoría de pacientes con cáncer no logra generar una respuesta inmune eficaz, capaz de impedir el crecimiento del tumor. Estos resultados se han corroborado en modelos animales observándose que cuando los antígenos son presentados al sistema inmune por las propias células tumorales se genera una respuesta inmune ineficaz. Por el contrario, si son pre- POSTERS sentados por células presentadoras de antígenos profesionales, como es el caso de las células dendríticas, se genera una reacción eficaz. La inmunización con células dendríticas preincubadas con antígenos tumorales reconocidos por linfocitos T no sólo ha inducido protección frente a una posterior inyección de tumor sino que ha inducido la regresión de tumores establecidos en modelos animales. Este proyecto pretende determinar la capacidad funcional de las células dendríticas obtenidas a partir de precursores hematopoyéticos para presentar antígenos tumorales a linfocitos T. El gen p53 es un gen supresor de tumores por lo cual desempeña un importante papel en la apoptosis y control del ciclo celular. Diversos estudios han demostrado que la degradación de esta proteína en el proteosoma del citoplasma da lugar a péptidos altamente inmunogénicos. Los trabajos que se están desarrollando en la actualidad están dirigidos hacia la presentación de dichos péptidos a los linfocitos T. Algunos autores han descrito que la modificación de algunos aminoácidos de esos péptidos (aquellos asociados a la unión o reconocimiento por parte de los linfocitos T) podrían mejorar la respuesta inmune. El objetivo de este trabajo fue valorar la eficacia de las células dendríticas para presentar diversos péptidos tumorales derivados de la proteína p53, así como la respuesta que generan los linfocitos T una vez que han sido estimulados por dichas células dendríticas. Para desarrollar el trabajo se utilizaron células dendríticas cultivadas a partir de monocitos obtenidos de aféresis realizadas a pacientes sanos y posteriormente estimulados en presencia de IL-4 y GMCSF. Se realizaron cocultivos de estas células dendríticas, previamente pulsadas con el péptido p53 wt149-157 y otros dos derivados de este (T150L Phospho y T150L), con linfocitos T. La activación celular se analizó mediante ELISPOT cuantificando la presencia de células secretoras de IFN-γ y granzima B. En los resultados obtenidos referentes a los valores de células secretoras de IFN-γ en los ensayos de ELISPOT realizados se observó una mayor activación con el péptido salvaje (p53-wt) y con el T150L Phospo frente al péptido T150L. Cuando se analizaron mediante ensayos de ELISPOT, el número de células que producían granzima-B, no se observaron diferencias significativas en la activación celular comparando los tres tipos de péptidos utilizados. 51. AUMENTOS EN EL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS MIELOIDES Y DISMINUCIÓN DE PLASMACITOIDES EN PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B). Sánchez MA1, Villarroel M1, Hernández A1, Mur S1, Barcenilla H1, Díaz D1, Prieto A1, Reyes E1, Monserrat J1, Sanroman IL3, Alvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC,IMMPA. Dpto. Medicina. UAH. 2Ser. de enfermedades del sist. inmune y oncología.HUPA.Alcalá de Henares. 3Serv. de hematologia del Hospital Universitario de Guadalajara. Introducción. Las células dendríticas (DCs) de sangre periférica comprenden diferentes subtipos que están involucrados en la inducción de la respuesta inmune frente a tumores. Se ha comprobado como las células dendríticas están afectadas en pacientes con enfermedades autoinmunes y enfermedades degenerativas crónicas. En los pacientes con leucemia linfática crónica (LLC-B) se desconocen las alteraciones que puedan existir en las células dendríticas. Objetivo. Definir las alteraciones en las cifras sanguíneas de las células dendríticas en los pacientes con leucemia linfática crónica (LLC-B). 79 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 80 POSTERS Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de sangre periférica de varios pacientes de LLC-B y controles sanos. El estudio fenotípico fue realizado mediante citometría de flujo de 4 colores utilizando el kit de enumeración de células dendríticas de MiltenylBiotec-MACS®. Las células dendríticas de sangre periférica fueron marcadas con anticuerpos monoclonales anti-BDCA 1 (mieloides tipo 1), anti-BDCA 2 (plasmacitoides) y anti-BDCA 3 (mieloides tipo 2) en poblaciones CD19-CD14EMA- (excluyendo a linfocitos B, monocitos y células no viables). Resultados. En los pacientes con LLC-B se observaron aumentos significativos en el número absoluto de células dendríticas mieloides de tipo 1 (BDCA 1+) y tipo 2 (BDCA 3+) con respecto de los controles sanos. La magnitud de estos incrementos fue del 46% para las células dendríticas mieloides de tipo 1 y del 34% para las células dendríticas mieloides tipo 2. Por otra parte se observo una disminución significativa en el número absoluto de las células dendríticas plasmacitoides (BDCA 2+) que fue un 33% inferior al encontrado en los controles sanos. Conclusión. La leucemia linfática crónica de células B no solo se caracteriza por alteraciones en el número de células B y una alteración de la funcionalidad de sus linfocitos T sino que además presentan aumentos en el número absoluto de células dendríticas mieloides y una disminución de las plasmacitoides. 52. VECTORIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS A TRAVÉS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y SU UTILIZACIÓN EN HIPERTERMIA MAGNÉTICA PARA TERAPIA ONCOLÓGICA. Sáez-Gutiérrez B1, Marcos Campos I1, Asín L1, Tabuenca Pérez P1, Mayordomo Cámara JI1, Goya, GF2, Ibarra R2, Tres Sánchez A1. 1Servicio de Oncología Médica, Hospital Clínico Unive. 2Servicio de Oncología Medica. Hospital Clínico Universitario «Lozano Blesa». El objetivo central de este trabajo es el estudio de la viabilidad de la utilización de Células Dendríticas (CDs) marcadas con Nanopartículas (NPs) magnéticas, como vectores de material magnético para la aplicación de Hipertermia Magnética (MHT) en modelos tumorales animales. El proceso para lograr este objetivo es intrínsicamente multidisciplinar e incluye diversos desafíos específicos de cada área, a saber: 1. El diseño e ingenieria de NPs biocompatibles funcionalizadas para una máxima eficiencia en la generación de calor por MHT. 2. .El desarrollo de protocolos eficientes y altamente repetitivos de cultivo y marcaje de CDs con NPs biocompatibles. 3. La determinación del papel de las células tumorales en la inducción de características de células endoteliales en las CDs cultivadas in vitro. 4. Verificar la incorporación de las CDs marcadas con NPs a los vasos tumorales mediante técnicas histológicas y magnetométricas. 5. Estudiar la dinámica de destruccion de la vasculatura tumoral con la aplicación de campos magneticos (MHT). Las células a ser utilizadas serán obtenidas a partir de cocultivos de células tumorales y CDs (en la misma placa separadas por una membrana permeable) en condiciones de cultivo que favorecen la diferenciación de células mielomonocíticas a CDs. Una vez diferenciasdas, estudiaremos en estas últimas la expresión de marcadores característicos de células endoteliales (VEGFR-2, vWF, VE-caderina) por citometría de flujo y «western blot». Estas CDs, marcadas con nanopartículas magnéticas, serán inyectadas en un modelo murino de melanoma donde se estudiará su papel en la vascularización del tumor por RMN, magnetometría e Histología. Finalmente se realizarán experiencias ex vivo e in vivo para determinar la eficiencia de la tecnica MHT en la destruccion de la vasculatura tumoral en el modelo animal desarrollado. 80 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 53. LA ADMINISTRACIÓN COMBINADA DE LOS ADYUVANTES POLY(I:C) Y ANTI-CD40 Y DE UN ANTÍGENO INDUCE POTENTES EFECTOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS ANTITUMORALES. Llopiz D, Dotor J, Zabaleta A, Lasarte JJ, Prieto J, Borrás-Cuesta F, Sarobe P. Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona. La escasa inmunogenicidad de las células tumorales es una de las principales causas de la ausencia de respuestas inmunitarias antitumorales. Uno de los principales retos de la inmunoterapia frente al cáncer se centra en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que mejoren la presentación de antígenos tumorales a los linfocitos T. Con este objetivo analizamos la eficacia de la administración de los adyuvantes poly I:C y un anticuerpo agonista anti-CD40 junto con un antígeno tumoral. La administración intravenosa simultánea de estos adyuvantes y de ovoalbúmina (OVA), considerada como antígeno tumoral en el timoma de ratón EG7.OVA, generó una respuesta de linfocitos T potente y duradera, que protegió a corto y largo plazo frente al crecimiento tumoral. En un contexto terapéutico, la administración intratumoral repetida de los adyuvantes y OVA permitió la remisión completa de tumores establecidos en un 100% de los animales. Del mismo modo, la administración intratumoral e intravenosa de los adyuvantes y OVA indujo la remisión de los tumores tratados y de tumores contralaterales no tratados. Los linfocitos T fueron en todos los casos responsables del efecto terapéutico y profiláctico inducido por estos protocolos. En conclusión, la administración de los adyuvantes poly I:C y anti-CD40 y de un antígeno tumoral podría ser una estrategia eficaz de inmunoterapia antitumoral. 54. POSIBLES APLICACIONES TERAPÉUTICAS DEL ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO ANTI- CD69 (HAIM-29). Díaz Freitas B, Valladares M, Magadán S, Sancho D, Sánchez-Madrid F, González-Fernández A. Universidad de Vigo. La glicoproteina CD69 es una molécula de activación temprana (AIM) de los linfocitos, de las células Natural Killer y de los eosinófilos activados. Aunque se desconoce su ligando, CD69 está implicada en el incremento de calcio intracelular, en la liberación de citocinas y en la proliferación celular. Actualmente, se relaciona a la molécula CD69 con una amplia variedad de enfermedades de origen inflamatorio y/o autoinmune, (Artritis Reumatoide, Hepatitis Vírica Crónica, Lupus Eritematoso, Diabetes Mellitus Insulina Dependiente). Nuestro grupo generó un anticuerpo monoclonal (mAb) completamente humano (hAIM-29) de isotipo IgM/l, que reconoce específicamente a la molécula CD69 humana. Este mAb fue obtenido a partir de ratones transgénicos portadores de genes para las cadenas pesada μ y ligeras κ y λ de las inmunoglobulinas humanas. El mAb hAIM29, al tratarse de una inmunoglobulina completamente humana, podría ser un posible agente terapéutico de gran interés en enfermedades donde existe activación leucocitaria o una alta expresión de este marcador, ya que no tendría las restricciones (inmunogenicidad) que presentan algunos de los anticuerpos murinos que se emplean en terapia. Para evaluar si el mAb hAIM-29 tiene potencial terapéutico, analizamos por citometría de flujo muestras de líquido sinovial de pacientes diagnosticados con Artritis Reumatoide. Nuestro anticuerpo es capaz de reconocer específicamente a células inflamatorias CD69+ del líquido sinovial de los pacientes, y en presencia de complemento, es capaz de provocar la lisis celular de las células que poseen en Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 81 INMUNOLOGÍA POSTERS su membrana está molécula de activación. Datos obtenidos con sangre periférica muestran que el anticuerpo no reconoce a células mononucleares en ausencia de activación, pero hAIM-29 tiñe células activadas en presencia de éster de forbol, y las lisa en presencia de complemento. Nuestros resultados indican que el anticuerpo hAIM29 podría ser útil para el tratamiento de pacientes con Artritis Reumatoide y otras enfermedades donde estuviesen implicadas células CD69+. 56. HLA-G COMO MARCADOR ESPECÍFICO DE EVOLUCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS CD34/CD133 Y DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS DE CORDÓN UMBILICAL. Martinez-Laso J1, Peñaloza J2, Vidart J2, Herrainz MA2, Picazo JJ3, Román A1, Head J1, Rodriguez M1, Rodríguez-Avial I3, Jordá J4. 1Unidad de Inmunoterapia Celular. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III. 2Servicio de Ginecología y Obstetricia. Hospital Clínico de San Carlos. 3Servicio de Microbiología 55. LAS CÉLULAS NK ESTIMULADAS CON IL-15 Y CPG ODN A, POTENCIAN LA CITOTOXICIDAD CELULAR ANTI-LINFOMA B MEDIADA POR RITUXIMAB. Moga E, Álvarez E, Cantó E, Vidal S, Rodríguez-Sánchez JL, Sierra J, Briones J. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona. La expresión de HLA-G se testó en las distintas subpoblaciones CD34/CD133 de células madre hematopoyéticas y en las células dendríticas de sangre de cordón umbilical. Se midió la expresión en superficie celular e intracelularmente por citofluorometría de flujo y se obtuvo la presencia de transcritos por RT-PCR con primers específicos. Los resultados mostraron la presencia de HLA-G tanto en superficie como intracelular en las subpoblaciones de células madre hematopoyéticas y en las células dendríticas. El análisis de los diferentes marcadores presentes en las células madre mostró una correlación absoluta de la presencia de CD1a (marcador de células dendríticas inmaduras) con HLA-G. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares cuando se testó este marcador en las células dendríticas de cordón umbilical y en las generadas a partir de células CD34 positivas. La isoforma G1 se detectó en todos los casos estudiados y sólo en unos pocos apareció la isoforma G5. Estos datos difieren de los obtenidos para este tipo de células en sangre periférica de adulto donde sólo se consiguió una expresión parcial en superficie y una secreción limitada de la forma soluble en las células dendríticas derivadas de las CD34 positivas. Estos resultados demuestran que estos tipos de células presentan un comportamiento diferente si se considera la sangre de cordón umbilical y la de sangre periférica. Estos datos concuerdan con los resultados diferenciales de los trasplantes de células progenitoras dependiendo de su origen (cordón umbilical, medula ósea y sangre periférica). Por lo tanto, se puede afirmar que HLA-G estaría implicado en el proceso de diferenciación de las células madre hematopoyéticas hacia las células dendríticas y su influencia en el comportamiento inmunológico de los progenitores de cordón umbilical. Introducción. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es uno de los principales mecanismos de acción del Rituximab (Ac monoclonal anti-CD20) frente al linfoma B. Las células NK, a través de receptores estimuladores FcγRIIIa, juegan un papel fundamental en la ADCC mediada por Rituximab. Hemos estudiado el papel que juegan moléculas activadoras de células NK, como la IL-15, y de oligodesoxinucleótidos con secuencias CpG (ODN A), en la ADCC inducida por el Rituximab en el linfoma B. Material y métodos. La ADCC se analizó mediante estudios de liberación de 51Cr. Para ello se utilizaron como células efectoras células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células NK purificadas y PBMCs depleccionadas de células NK, obtenidas de donantes sanos, que fueron cultivadas durante 18 horas con IL-15 (10 ng/ml) o CpG ODN A (5 μg/ml). Tras esta incubación, las células efectoras se co-cultivaron, durante 4 horas, con células de linfoma B (línea celular Raji, CD20+) marcadas con 51Cr en presencia de Rituximab (10 μg/ml) o IgG1 control (10 μg/ml). Tras este tiempo se detectó la liberación de 51Cr en el sobrenadante del co-cultivo. Los resultados de la ADCC se valoraron a partir del porcentaje de lisis obtenido de ratios diferentes. Dada la contribución del polimorfismo del receptor FcγRIIIa en la ADCC se genotiparon, mediante PCR alelo-específica y digestión enzimática, las células mononucleadas de los donantes para la mutación FcγRIIIa-158V-F. Resultados. Las PBMCs activadas con IL-15 o con ODN A potenciaron significativamente la ADCC de las células de linfoma B tratadas con Rituximab. Así, la ADCC de PBMCs activadas con IL-15 se incrementó el doble respecto a la ADCC de PBMCs no activadas (73% ± 7% vs 37% ± 4% lisis respectivamente) (media ± DE) (p< 0,001). Y por otro lado, cuando se comparó la ADCC de PBMCs estimuladas con ODN control vs ODN A el incremento fue del 36% ± 8% al 61% ± 11% respectivamente (p= 0,02). Células NK purificadas mostraron un incremento de la ADCC cuando su estímulo fue la IL-15 pero no con ODN A. Sin embargo, con ambos estímulos las células NK fueron la población efectora más importante, ya que PBMCs depleccionadas de estas células y posteriormente activadas no mostraron ADCC. Este incremento de la ADCC se observó tanto con células efectoras homocigotas (FcγRIIIa-V/V) como con heterocigotas (FcγRIIIa-V/F). Conclusión. La adición de IL-15 o ODN A incrementa la citotoxicidad mediada por el Rituximab frente a células de linfoma B. Estos datos tienen implicaciones clínicas en el tratamiento del linfoma B, ya que su utilización como adyuvantes en combinación con el Rituximab podría aumentar su efecto terapéutico. 57. FARMACOCINÉTICA Y FARMACODINÁMICA DE INMUNOTOXINAS DIRIGIDAS CONTRA LA ENDOGLINA EN RATONES. Ferreras JM, Citores L, Iglesias R, San Miguel A, Girbés T. Universidad de Valladolid. En los últimos años se han desarrollado terapias antiangiogénicas y antiangiostáticas para el tratamiento de tumores(1). Uno de los agentes antiangiogénicos utilizados son los anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de la neovasculatura(2). Entre ellos están los anticuerpos dirigidos contra la endoglina (CD105), que se sobreexpresa en la neovasculatura y que es un marcador tumoral(2). Para potenciar el efecto antiangiogénico del anticuerpo hemos ligado covalentemente las RIPs (proteínas inactivadoras de ribosomas) de tipo 2 no tóxicas ebulina l y nigrina b(3) con el anticuerpo MJ7 (antiendoglina de ratón). Los conjugados obtenidos (immunotoxinas) son citotóxicos para las células B16MEL4A5 (melanoma de ratón) que expresan la endoglina. Con el fin de utilizar estas inmunotoxinas en modelos de ratones con tumores, se las hemos inyectado por vía intravenosa a ratones control y hemos determinado sus principales parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos. 81 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 82 POSTERS Los resultados obtenidos indican que la inmunotoxina preparada con la nigrina b es más estable que la inmunotoxina preparada con ebulina l mientras que ambas presentan una toxicidad similar. Por lo tanto la inmunotoxina preparada con la nigrina b es un candidato mejor para llevar a cabo los estudios sobre los efectos de esta inmunotoxina en tumores desarrollados en ratones. Bibliografía 1. Folkman J. (2006) Annu Rev Med. 57: 1-18. 2. Benitez J, Ferreras JM, Munoz R, Arias Y, Iglesias R, Cordoba-Diaz M, del Villar R, Girbes T. (2005) Med Chem. 1: 65-70. 3. Girbes T, Ferreras JM, Arias FJ, Stirpe F. (2004) Mini Rev Med Chem. 4: 461-476. 58. RESPUESTA NY-ESO-1 ESPECÍFICA EN CÉLULAS CD8 Y CD4 DE RATONES TRANSGÉNICOS INMUNIZADOS CON LENTIVIRUS. Casado JG, Colombetti S, Dojcinovic D, Luescher I, Lévy F. Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne Branch, University of Lausanne, Epalinges, Switzerland. Departmento de Fisiología, Área de Inmunología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres. Los vectores lentivirales poseen la capacidad de infectar células dendríticas que permiten la expresión estable de un gen y el desarrollo de una repuesta in vivo CD8 cuantitativa y cualitativamente superior. En este trabajo hemos analizado la respuesta inmune en ratones HLA-A2 transgénicos inmunizados con lentivectores de tercera generación que codifican para la proteína NY-ESO-1. La inmunización subcutánea con lentivectores disparó una respuesta de células CD8+ NYESO-1 (157-165) específicas mayor que la obtenida después de la inmunización con péptidos NY-ESO-1 (157-165). Las células CD8+ NY-ESO1 (157-165) específicas mostraron un fenotipo efector/memoria (CD127pos, CD62Lneg) mientras que el análisis por citometría del repertorio de TCRs demostró un uso predominante de las cadenas Vbeta4 y Vbeta6. Por otro lado, para analizar la respuesta CD4 hemos inmunizado ratones dobles transgénicos HLA-A2/HLA-DR4 con el lentivector que codifica para NY-ESO-1. La respuesta CD4 se monitorizó utilizando tetrámeros HLA-DR4 específicos para la región 87-101 y 119-143 y cuantificando la producción de IFN-gamma. Finalmente, la inmunización de ratones transgénicos con el lentivector que codifica para la proteína NY-ESO-1 estimuló una respuesta CD8 frente a otros epítopos inmunodominantes que será identificados. En conclusión, la vacunación con vectores lentivirales que codifican para el gen NY-ESO-1 es una herramienta para estimular in vivo una respuesta específica en células CD4 y CD8. 59. TLR4-MEDIATED SURVIVAL OF MACROPHAGES IS MYD88DEPENDENT AND REQUIRES TNF-α AUTOCRINE SIGNALLING. Knaus U, Alvarez-Barrientos A, Maroto B, Boscá L, Lombardo E. Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Madrid. Modulation of macrophage survival is a critical factor in the resolution of inflammatory responses. Exposure to LPS protects innate immune cells against apoptosis, although the precise pathways responsible for prolongation of macrophage survival remain to be fully established. The goal of this study was to characterize the mechanism of TLR4-mediated survival of murine bone marrow derived macrophages upon M-CSF 82 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 withdrawal in more detail. Using a combination of knockout mice and pharmacological inhibitors allowed us to show that TLR4 and TLR2 stimulation promotes long-term survival of macrophages in a MyD88, PI3K, ERK and NF-κB-dependent manner. LPS-induced long-term, but not short-term, survival requires autocrine signalling via TNF-α and is facilitated by a general cytoprotective program, similar to that mediated by M-CSF. TLR4-mediated macrophage survival is accompanied by a remarkable upregulation of specific cell surface markers, suggesting that LPS stimulation leads to the differentiation of macrophages towards a mixed «macrophage/dendritic cell-like» phenotype. 60. RELEVANCIA DEL CONTEXTO VIRAL Y DIVERSIDAD DE VÍAS DE PROCESAMIENTO ANTIGÉNICO PARA EPÍTOPOS CTL DE LA PROTEÍNA F DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL. Johnstone C, Guil S, Rico MA, García-Barreno B, López D, Melero JA, Val M del. Unidades de Inmunología Viral, Proteómica y Biología Viral, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC-UAM. Se ha estudiado en diferentes contextos virales el procesamiento antigénico de los epítopos de la proteína F del virus respiratorio sincitial (VRS) F85-93 y F249-258 presentados a linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) por la molécula de MHC de clase I murina Kd. El epítopo F85-93 es presentado por una vía clásica endógena dependiente de los transportadores asociados al procesamiento de antígeno (TAP) cuando la proteína F se expresa en el contexto de VRS o de virus vaccinia recombinante (rVV). Al menos en células infectadas con rVV codificando la proteína F nativa o citosólica se requiere el proteasoma para el procesamiento del epítopo. En células infectadas con un rVV que codifica la proteína F nativa, existe una vía adicional independiente de TAP para F85-93. Por el contrario, el epítopo F249-258 es presentado únicamente por vías independientes de TAP, siendo la presentación sensible a brefeldina A (BFA) cuando la proteína F está en el contexto natural de VRS, o fundamentalmente resistente a BFA cuando la proteína está codificada en rVV. Por lo tanto, identificamos vías de procesamiento antigénico con diferentes mecanismos y localizaciones subcelulares, que son accesibles a epítopos presentados por la misma molécula de MHC de clase I y procesados a partir de la misma proteína pero en diferentes contextos virales. Estos resultados subrayan tanto la diversidad de vías disponibles como la influencia de la infección del virus en la presentación de epítopos a CTL. SESIÓN 4: INMUNIDAD E INFECCIONES. INMUNORREGULACIÓN Moderadores: Javier Martín Ibáñez (Granada), Alfredo Minguela Puras (Murcia) 61. DIFERENCIAS EN LTCD4+CD28+, LTCD8+CD28+ Y CÉLULAS NK EN PACIENTES ADVP CON INFECCION POR HIV/HCV VS INFECCION POR HCV+. Cianchetta Sivori M, Garcia R, Paravisini A, Raso S, Llorente P, Gorgolas M, Fernandez-Guerrero M. Fundación Jimenez Díaz. Servicio de Inmunología. Madrid. Introducción. En el presente trabajo se estudian los diferentes factores de la respuesta inmune en pacientes monoinfectados HCV o coinfectados HIV/HCV, incluyendo las células NK de la inmunidad inna- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 83 INMUNOLOGÍA ta y los valores de LTCD4+CD28+ y LTCD8+CD28+ como células responsables de la citotoxicidad y cooperación en la inmunidad. Método. Fueron incluidos 88 pacientes, ADVP: 21 HIV/HCV coinfectados, 27 HCV monoinfectados, 20 HIV monoinfectados y 20 controles HIV-/HCV-. Se determinaron, en sangre periférica, los valores de LT CD4+CD28+, CD8+CD28+ y células NK (CD3-CD56+26+) por citometría de flujo (citómetro FacsCalibur BD). La carga viral de HIV y HCV fue determinada por amplicor Cobas Ultrasensible y PCR en tiempo real Taqman, respectivamente. Resultados. En los LTCD4+, la proporción de la expresión de CD28+ decreció significativamente junto con los niveles de LTCD4+ en pacientes HIV+ monoinfectados y en pacientes coinfectados (HIV/HCV). Se encontró una disminución de LTCD4+CD28+ en pacientes HIV+ monoinfectados en comparación con pacientes HCV+ monoinfectados (63,95 ± 29% versus 89,39 ± 6% p= 0,0002) y con pacientes coinfectados (HIV/HCV) (63,95± 29% versus 78,42 ± 16% p= 0,05). El porcentaje de LTCD8+ en pacientes coinfectados estaba incrementado, y se mantuvo dentro de los parámetros normales en los pacientes HCV monoinfectados. Sin embargo los LTCD8+CD28+ estaban disminuidos en pacientes coinfectados (HIV/HCV) en comparación con los pacientes HCV+ (49,65 ± 13% versus 67,08 ± 10% p< 0,001). Las células NK se mantuvieron dentro de la normalidad en los cuatro grupos. Conclusiones. El precursor de células citotóxicas (CD8CD28) está disminuido en los pacientes coinfectados (HIV/HCV) en comparación con los pacientes HCV monoinfectados. Este resultado revela que la respuesta del sistema inmune esta más afectada en pacientes coinfectados (HIV/HCV) que en pacientes monoinfectados HCV, posiblemente reflejando la influencia de la infección HIV sobre la respuesta de LTCD8+ especifica de HCV. Esto podría contribuir a explicar porque los pacientes coinfectados no son capaces de controlar la infección por HCV, permitiendo una progresión más rápida de la enfermedad hepática. 62. EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE ALOPURINOL SOBRE LA EXPRESIÓN CLÍNICA DE LA ENFERMEDAD DE BEHCET Y MARCADORES DE ACTIVACIÓN INMUNE. INFORME DE UN CASO. Figueroa-Vega N, Arriaga J, Galicia O, Martínez-Morales F, Abud-Mendoza C, Gonzalez-Amaro R. Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, UASLP. La enfermedad de Behcet (EB) es una condición inflamatoria con vasculitis sistémica, alteraciones inmunes y con opciones terapéuticas diversas. El alopurinol es un inhibidor de la xantina oxidasa que posee un importante efecto anti-oxidante y que por lo tanto puede tener un potencial efecto antiinflamatorio. Se reporta el estudio de una paciente con EB que recibió terapia adyuvante con alopurinol y en la que se registró su evolución clínica y de diversos parámetros inmunes. Antes de la terapia con alopurinol, la paciente tenía una EB de 7 años de evolución caracterizada por lesiones ulcerosas orales y faríngeas intensamente dolorosas e incapacitantes, úlceras genitales, fiebre y dermatosis acneiforme aislada pero diseminada, así como una pobre respuesta a la terapia convencional. Posterior a la administración de alopurinol (300 mg/día por una semana), la paciente presentó una mejoría clínica notable, con desaparición de todas las lesiones cutáneas y de mucosas y un notable descenso en la escala análoga visual de dolor (8 a 0). Se encontró además un descenso significativo en marcadores de inflamación (velocidad de sedimentación globular, proteína C reactiva), así como una disminución importante en el estallido respirato- POSTERS rio de neutrófilos y la expresión de CD11b (integrina alfa M beta 2). Por otra parte, también se detectó una disminución en los niveles de linfocitos CD4+CTLA-4+ y un aumento de linfocitos Ts (CD8+CD28–) y de células CD4+ productoras de TGF-beta e IL-10. Además se encontró una disminución de la expresión de CD69 posterior a la activación de células mononucleares con PMA y de ICAM-1, CD11b y CD11c en células sin estimular. Por último, se detectó un incremento en la producción de TNF-alfa por monocitos. Posteriormente, se suspendió la administración de alopurinol y se inició terapia con colchicina; una semana después, reaparecieron las lesiones cutáneas y de mucosas y la escala análoga visual de dolor se incrementó de 0 a 4. Los resultados de este caso sugieren que el alopurinol tiene un potencial terapéutico en la EB y que ejerce diferentes efectos sobre el proceso inflamatorio y el sistema inmune. 63. ESTUDIO MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO DE CITOQUINAS EN RESPUESTA AL STRESS QUIRÚRGICO EN DOS TÉCNICAS ANALGÉSICAS. Jurado Roger A2, Rodríguez Morales R1, Martínez Fernández E, Santana Pineda M, Rodríguez Huertas F. 1Servicio de Anestesiología y Reanimación. Hospital del SAS de Jerez FRA. Cádiz. 2Servicio de Laboratorio. Hospital Infanta Margarita de Cabra. Córdoba. Introducción. La cirugía produce un trauma tisular inevitable y con ello una reacción inflamatoria cuya misión es atraer defensas celulares. La lesión tisular provoca la liberación de potentes mediadores de la inflamación y el dolor. Por su parte, los anestésicos pueden modificar la función inmunitaria, tanto al reducir la respuesta al estrés, como al ejercer efectos directos sobre las células inmunológicas. Objetivo. El propósito de este estudio es analizar los cambios producidos en diferentes momentos del intra y postoperatorio, en pacientes sometidas a histerectomía, introduciendo como variable dos técnicas analgésicas de uso habitual. Para ello se midió el cortisol, la PCR, citoquinas proinflamatorias (IL-1B, IL-6, IL-8, TNF e IL-12) y antinflamatorias (IL-10). Materiales y métodos. Estudio clínico randomizado y prospectivo a doble ciego en pacientes sometidas a histerectomía abdominal bajo anestesia general balanceada. Las pacientes (n=29) fueron divididas en dos grupos de forma aleatoria; en uno de ellos se realizó analgesia con remifentanilo en perfusión y rescate analgésico con morfina y AINEs; en el otro se efectuó analgesia con fentanilo a demanda según valores hemodinámicos. Se recolectó sangre venosa periférica en estado basal, en el momento de la incisión quirúrgica, y en la 1ª, 4ª y 24ª horas del postoperatorio. El cortisol se determinó mediante quimioluminiscencia (Nichols Advantage Chemiluminescence Cortisol Immunoassay). La PCR se determinó mediante Inmunoturbidimetría (Roche). La determinación de citoquinas se realizó mediante Citometría de flujo en un ensayo tipo CBA (Cytometric bead array) para la detección de citoquinas anti y proinflamatorias (Becton Dickinson). El CBA emplea una mezcla de partículas revestidas de anticuerpos para capturar analitos solubles como las citoquinas. Cada tipo de partícula estará revestida de un anticuerpo de captura dirigido contra una citoquina determinada y tiene la capacidad de emitir una intensidad de fluorescencia específica que se detecta en Fl3. La unión de la citoquina soluble a la partícula se pone de manifiesto con un segundo anticuerpo marcado con ficoeritrina que se detecta en Fl2. La concentración del analito se calcula mediante el uso de una curva con estándares conocidos. El CBA permite detectar citoquinas a concentraciones entre 20 y 5.000 pg/ml. 83 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 84 POSTERS VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 Análisis estadístico: Las diferencias entre los dos grupos se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney para datos independientes. Asimismo se realizaron comparaciones de las variables en los diferentes momentos del intra y postoperatorio mediante la prueba de rangos de Friedman. Resultados: • Ambos grupos de pacientes resultaron comparables tanto en los datos epidemiológicos como en los clínicos (quirúrgicos y anestésicos) (TablaI). • Los valores de PCR mostraron un valor máximo (estadísticamente significativo) en la muestra de 24 horas con respecto a la basal (Fig. 3). Tabla I. Datos epidemiológicos y clínicos Grupo Fentanilo Promedio ± DE Número de pacientes 15 Edad (años) 51,1 ± 13,4 Peso (kg) 72,1 ± 24,2 Duración de la cirugía (min) 77 ± 26 Duración de la anestesia (min) 92 ± 30 • Grupo Remifentanilo Promedio ± DE 14 48,6 ± 11,3 72,9 ± 21,3 84 ± 29 96 ± 28 Figura 3. PCR. Resultados. • El cortisol presenta un aumento progresivo que es estadísticamente significativo en la 1ª y 4ª hora, y un descenso posterior (Fig. 4). No se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos de pacientes en las Citoquinas estudiadas, ni en los valores de PCR y de Cortisol. Los resultados de los diferentes parámetros estudiados se resumen en la Tabla II. Tabla II. Resultados IL-10 pg/ml Rp Fb IL-6 pg/ml Rp Fb Prot.Cr mg/dl Rp Fb Cortisol µg/dl Rp Fb Basal Incisión 1ª hora 4ª hora 24 horas 2,89(0,4) 2,08(0,5) 4,46(1,2) 4,47(1,3) 0,77(0,3) 1,13(0,3) 14,506(2,4) 14,84(2,9) 2,26(0,3) 2,28(0,4) 3,62(1,3) 4,92(1,4) 0,458(0,4) 0,968(0,5) 10,12(2,2) 12,527(2,7) 2,43(0,5) 1,90(0,4) 4,68(1,9) 5,87(1,8) 0,734(0,4) 0,83(0,5) 22,624*(5,1) 26,224*(6,7) 15,27*(2,1) 16,68*(2,8) 105,52*(21,2) 108,94*(22,7) 0,603(0,4) 0,815(0,4) 36,707*(6,8) 38,823*(8,9) 7,56*(1,6) 7,49*(1,8) 67,82*(14,5) 51,58*(17,8) 8,01*(1,7) 8,775*(1,5) 18,935(4,2) 16,128(4,5) Abreviaturas: Rp: Remifentanilo en perfusión; Fb: Fentanilo en bolos. P< 0,05 (Rp vs Fb); Valores: Media (Desviación Standard). *Diferencias significativas respecto a los niveles basales. • La IL-6 e IL-10 mostraron cambios estadísticamente significativos analizando la cinética de cada parámetro en los diferentes tiempos del estudio, observándose un pico máximo de producción en la cuarta hora (Figs. 1 y 2). Figura 1. IL-6. Resultados. Figura 2. IL-10. Resultados. 84 Figura 4. Cortisol. Resultados. Conclusiones. En nuestro estudio no se han encontrado diferencias en la respuesta al estrés quirúrgico (valorada mediante el análisis de citoquinas pro y anti-inflamatorias, cortisol y PCR) entre estas dos técnicas analgésicas. 64. ¿INFLUYE EL GRADO DE INFLAMACIÓN EN EL FENOTIPO DE CÉLULAS T REGULADORAS EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE? Pérez-García V, Peris-Pertusa A, Marín-Alberca G, Navarro-Blasco FJ, Romero-Sánchez J, Sempere-Ortells JM. División de Inmunología del departamento de Biotecnología de la Universidad de Alicante. Introducción. Las células T reguladoras (Treg) tienen un papel importante en el mantenimiento de la autoinmunidad fisiológica y en la prevención de las enfermedades autoinmunes. Su función reguladora parece estar mediada por contacto directo célula-célula o mediante la liberación de citocinas, pudiendo inhibir las respuestas Th1 y Th2. Objetivos. Pretendemos caracterizar los diferentes fenotipos de Treg en pacientes con Artritis Reumatoide (AR), tratando de identificar posibles marcadores que puedan ser considerados típicos de esta enfermedad y/o estar ligados a los brotes o a los periodos de remisión. Métodos. Se han incluido 28 pacientes tratados y los hemos clasificado según el estado de activación de la AR, empleando el «Disease Activity Score» (DAS 28). De estos pacientes, 15 estaban en remisión (DAS 28 ≤ 3,2), 9 con una actividad de la enfermedad moderada (3,2 < DAS 28 ≤ 5,1) y 4 con enfermedad muy activa (DAS 28 > 5,1). La mayoría de estos pacientes fueron tratados con Metrotexate (dosis bajas) y/o Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 85 INMUNOLOGÍA anticuerpos anti-TNF. Como controles sanos, analizamos 26 individuos. Se analizó la expresión de los antígenos de membrana CD28, CD38, CD45RBlow, CD62L, CD134, CD152 y CD154 en células CD4+ de sangre periférica, con o sin coexpresión de CD25 intermedia/alta (CD4CD25) o solamente alta (CD4CD25HD), por inmunofluorescencia directa de tres colores con anticuerpos monoclonales (Becton Dickinson) y citometría de flujo (EPICS-XL, Coulter). Resultados. Los datos preliminares indican que los pacientes presentan porcentajes más bajos para CD4/CD25 (p< 0,001), CD4/CD25HD (p< 0,001), CD4/CD28 (p= 0,007), CD4/CD38 (p= 0,009), CD4/CD62L (p= 0,004), CD4/CD25/CD28 (p= 0,01) y más altos para CD4/CD45RBlow (p= 0,005), CD4/CD25/CD152 (p= 0,004), CD4/CD25HD/CD62L (p= 0,01) y CD4/CD25HD/CD152 (p< 0,0001). Según los diferentes grupos de DAS 28, los pacientes muy activos mostraron, frente a los que estaban inactivos, un aumento significativo de CD152 (p= 0,05) en la población CD4/CD25 y CD4/CD25HD, con tendencia al aumento de expresión de CD62L y disminución de expresión de CD28. No observamos correlaciones significativas con los niveles en plasma de Proteína C Reactiva y factor reumatoide. Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que la disminución en el porcentaje de células CD4CD25 Treg en la sangre de pacientes con AR, se compensaría con un aumento de expresión de antígenos relacionados con respuestas inhibitorias y un posible aumento de otras poblaciones con carácter inmunorregulador (CD4+CD45RBlow), a fin de controlar la inflamación. El grado de inflamación de los pacientes (según DAS 28) parece influir en los distintos niveles de expresión de algunos antígenos de membrana en la población CD4CD25HD Treg, siendo mayor la expresión de CD152 y CD62L y menor la de CD28, en los pacientes más activos (DAS 28 > 5.1). 65. LAS CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES PROTEGEN DE LA APOPTOSIS A LAS CÉLULAS T. Blanco O, Tirado-González I, Muñoz-Fernández R, Mata C de la, Leno E, Abadia-Molina AC, Garcia Olivares E, Ruiz-Ruiz MC. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología. Las células deciduales estromales (DSC) son células características de la decidua y representan el principal componente celular de este tejido. Las DSC desarrollan actividades inmunitarias que podrían estar relacionadas con los mecanismos de tolerancia meterno-fetal. Uno de estos mecanismos de tolerancia en la interfase materno-fetal se basa en la expresión de CD95L por el trofoblasto, lo que determina la inducción de apoptosis en los linfocitos maternos. Hemos observado por citometría de flujo que las DSC expresan CD95 y CD95L, aunque estas células presentan resistencia a la inducción de apoptosis, medida mediante ciclo celular con citometría de flujo, utilizando el anticuerpo anti-Fas CH-11c y TRAIL. Estas dos últimas moléculas provocan, no obstante, apoptosis en las células Jurkat. En contacto con las DSC, se produjo una protección de la apoptosis inducida en células Jurkat. Esta protección se indujo tanto con DSC indiferenciadas como en DSC diferenciadas mediante progesterona. Los mecanismos de protección se debieron a contacto célula-célula (DSC-Jurkat), y no dependió de la liberación de moléculas protectoras por las DSC, ya que no encontramos ese efecto protector en el sobrenadante de DSC, pero sí cuando utilizamos estas células tratadas con paraformaldehído. Esta actividad protectora de las DSC es probablemente reflejo de la función estromal que desarrollan estas células en la decidua. POSTERS 66. EL EFECTO PROTECTOR DEL TACROLIMUS Y DEL SIROLIMUS EN UN MODELO DE LESIÓN POR REPERFUSIÓN HEPÁTICA SE ACOMPAÑA DE UNA DISMINUCIÓN DEL BALANCE TH1/TH2 Y DE UN INCREMENTO EN CD4+CD25+. Arias-Díaz J, Ildefonso JA, Jiménez E, Muñoz JJ, Zuloaga J, Balibrea J, Zapata A. Departamento Cirugía y Dpto. Biología Celular, Universidad Complutense, Madrid. Introducción. El fenómeno de isquemia-reperfusión (I-R) es el principal responsable de la lesión hepática resultante del trasplante hepático y estados de shock. La recuperación tras I-R hepática depende tanto del grado de lesión inicial como de la capacidad regenerativa de los hepatocitos restantes. Resultados recientes asignan un papel central a los linfocitos T en la patogénesis de dicha lesión, así como capacidad para modificar la regeneración hepática. Por otro lado, se desconoce en gran medida la influencia del tacrolimus y del sirolimus, fármacos utilizados como inmunosupresores en el trasplante hepático, sobre las subpoblaciones linfocitarias en el hígado sometido a I-R. Objetivo. Estudiar el efecto del tacrolimus y del sirolimus sobre un modelo de I-R hepática, analizando las modificaciones resultantes en las subpoblaciones linfocitarias intrahepáticas. Métodos. Ratas Wistar macho se asignaron aleatoriamente a 3 grupos experimentales: grupo 1 (intervención simulada), grupo 2 (hepatectomía) y grupo 3 (I-R). La I-R consistió en la oclusión durante 60 min. de la arteria hepática y la vena porta derechas (lóbulo lateral derecho), seguido del desclampaje y extirpación de los lóbulos medio y lateral izquierdo. Todos los animales recibieron tacrolimus (6 mg/kg), sirolimus (2 mg/kg) o bien placebo 60 min. antes de la intervención. A las 2 y 24 h se sacrificaron las ratas obteniendo muestras de sangre, hígado y ganglio submandibular. Se realizó un análisis citofluorimétrico de linfocitos aislados de hígado y ganglio. Asimismo, sobre criosecciones de hígado, se llevaron a cabo inmunodetecciones de distintos marcadores celulares y de laminina. También se usó anticuerpo anti-Ki-67 para determinar la regeneración hepática, mientras que la apoptosis se cuantificó mediante TUNEL. Los resultados se presentan como las medias (±SEM). Las comp araciones se hicieron mediante ANOVA y el análisis de supervivencia mediante Kaplan-Meier. Resultados. Ambos fármacos redujeron la mortalidad, así como la LDH plasmática, el grado de lesión histológica hepática, la apoptosis y la infiltración por PMN (HIS48) y linfocitos T, todas ellas incrementadas a las 2 h en el grupo 3, aunque no modificaron el aumento de infiltración por monocitos-macrófagos (ED1). El sirolimus también antagonizó el incremento en células NK. El tacrolimus produjo un incremento de núcleos Ki-67+ en los grupos 2 y 3, mientras que el sirolimus mostró un efecto opuesto. En los hígados del grupo 3 se observó un aumento a las 2 h en el cociente Th1 (CD45RC high) / Th2 (CD45RC low), efecto que fue antagonizado por ambos fármacos (0,11 ± 0,01, tacrolimus, 0,08 ± 0,01x, sirolimus, vs 0,24 ± 0,03, control, p< 0,001, ambos), los cuales produjeron también un aumento progresivo en la proporción de linfocitos T CD25+ entre los CD4+ en el hígado de los grupos 2 y 3 (20,3 ± 2,6, tacrolimus, 26,2 ± 3,4, sirolimus, vs 8,4 ± 1,1, control, grupo 3 a 24 h, p< 0,05 y p< 0,01, respectivamente), manteniéndose dicho efecto hasta las 24 h. Estas modificaciones no fueron observadas en el ganglio. Conclusión. Tanto el tacrolimus como el sirolimus muestran un efecto protector frente a la lesión por reperfusión hepática. Dicho efecto se acompaña de una disminución a corto plazo en el balance Th1/Th2 y un aumento progresivo en linfocitos T CD4+CD25+. 85 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 86 POSTERS 67. PATRÓN DE EXPRESIÓN DE CD28 EN CÉLULAS T CD8+ EN PACIENTES CON MONOINFECCIÓN POR VIH Y VHC Y COINFECCIÓN POR VIH/VHC. Paravisini A, Cianchetta M, Raso S, Llorente P, Gorgolas M, Garcia R, Fernandez-Guerrero M. Fundación Jiménez Díaz. Introducción. Los pacientes coinfectados VIH/VHC presentan una más rápida evolución a cirrosis. La coexistencia de ambos virus en un mismo individuo crea complejas interacciones, cambiando la historia natural de ambas infecciones. De forma independiente se ha observado una disminución en la expresión de CD28 en las células T CD8+ en sangre periférica de individuos infectados por VIH y por VHC. En este estudio hemos determinado el patrón de expresión de CD28 sobre linfocitos T CD8+ en pacientes monoinfectados por VIH y HCV y en pacientes coinfectados VIH/VHC. Métodos. 88 pacientes ADVP: 21 pacientes coinfectados VIH/VHC, 27 pacientes monoinfectados VHC, 20 pacientes monoinfectados VIH, y 20 pacientes control VIH-VHC-. Ninguno de ellos con tratamiento previo. Se determino la expresión de CD28 en linfocitos T CD8+ de sangre periférica por FacsCalibur citometria de flujo. Los resultados se expresan como media ± 1SD. Resultados. El porcentaje de CD28- en linfocitos T CD8+ esta disminuido en la coinfección VIH/VHC en comparación con los paciente VIH (52,1 ± 15,6 vs 82,9 ± 15,6 p= <0,0001) y aumentado en comparación con los pacientes VHC (52,1 ± 15,6 vs 35,05 ± 12,87 p= <0,0001). Por el contrario la media de expresión CD28- en linfocitos T CD8+ en pacientes VIH-VHC- fue 38.0±13.64. Conclusiones. La coinfección VIH/VHC disminuye el porcentaje de expresión de CD28 en los linfocitos T CD8+. Por otra parte, la expresión de CD28 en los pacientes VHC+ fue similar a la descrita en los pacientes control. Este resultado sugiere un efecto dominante del VIH en los pacientes coinfectados en comparación con aquellos monoinfectados por el VHC. 68. INHIBICIÓN DE FOSFODIESTERASA 7 EN LINFOCITOS T. González C, Hernández J, Gil C, Castaño T, Bravo B, Jérez MJ, Ke H, Ballester S. Instituto de Salud Carlos III. La actividad enzimática de las fosfodiesterasas (PDEs) consiste en la degradación de nucleótidos cíclicos (AMPc y GMPc). La inhibición de estas PDEs impide esta reacción, permitiendo que AMPc y GMPc actúen en la célula como segundos mensajeros. Algunos inhibidores de PDE poseen un potente efecto antiinflamatorio, siendo los inhibidores de PDE4 (como el Rolipram) los más caracterizados. Sin embargo, los efectos secundarios de los inhibidores de PDE4 disponibles han llevado a la búsqueda de inhibidores específicos de otras PDEs como la PDE7, o de inhibidores duales de PDE4 y PDE7 que presenten menores efectos negativos. Actualmente existen escasos inhibidores selectivos de PDE7 y su eficacia biológica no ha sido bien caracterizada. Por ello, hemos iniciado un estudio sobre compuestos de nueva síntesis para su análisis en cuanto a actividad de inhibición de PDE7 y posibles efectos biológicos. Los derivados del sistema de benzotiadiazina habían mostrado interesantes actividades como inhibidores de PDE7, aunque sin conseguirse actividades específicas eficaces. Por tanto, se ha llevado a cabo la síntesis de nuevos análogos derivados de tioxoquinazolinona con diferentes sustituyentes en su estructura. Han sido determinadas las actividades inhibitorias sobre PDE7 de estos nuevos compuestos y, en base a ellas, se han seleccionado aque- 86 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 llos que presentan menores IC50. Los ensayos de toxicidad de estos inhibidores frente a linfocitos T, fueron realizados en el clon D10.G4.1 mediante la técnica de citometría de flujo utilizando Ioduro de Propidio. Los resultados obtenidos en estos ensayos han permitido descartar los compuestos más tóxicos. La determinación de los niveles de AMPc intracelular en linfocitos T tratados con estos inhibidores ha mostrado que la inhibición de PDE7 no produce altos niveles de AMPc, pero es capaz de sinergizar con el efecto producido por la inhibición de PDE4. Se ha analizado el efecto de la inhibición de PDE7 sobre algunos parámetros de activación de linfocitos T, como la proliferación mediada por TCR y la activación de los factores de transcripción NFkB, NFAT y Stat6. Se ha encontrado un efecto negativo de concentraciones crecientes de estos inhibidores sobre la proliferación de células T, mediante ensayos de proliferación. También se ha observado que la inhibición de PDE7 está acompañada de una disminución de la actividad de NFkB en linfocitos T, y que este efecto no es revertido por el inhibidor de PKA (KT5720). Esta disminución de la actividad de NFkB podría estar relacionada con un efecto antiinflamatorio de la inhibición de PDE7. Sin embargo, ni NFAT ni Stat6 son modificados por la inhibición de PDE7. No obstante, la combinación de inhibidores de PDE4 y PDE7 muestra una disminución del factor de transcripción Stat6. Por tanto, los datos obtenidos hasta ahora muestran que la inhibición de PDE7 afecta a la actividad de los linfocitos T, sugiriendo que PDE7 podría ser una buena diana en enfermedades mediadas por este tipo celular. 69. LA TERAPIA ANTI-RETROVIRAL FRENTE A LA INFECCIÓN POR EL VIH-1 (TARGA) PODRÍA ESTAR INVOLUCRADO EN LA MODULACIÓN DE LA CAPACIDAD FUNCIONAL DE CÉLULAS CD8 VIH-1 ESPECÍFICAS. García-Jurado G, Lozano JM, Luque J, Kindelán JM, Natera C, Rivero A, De la Rosa O, González R, Solana R, Peña J. Hospital Universitario Reina Sofía. Servicio de Inmiunología. Córdoba. La respuesta de las células CD8 específicas se encuentra significativamente alterada en la infección por VIH-1, impidiendo el control de la replicación viral. Esta situación se mantiene a pesar de los niveles significativamente altos de células CD8 específicas, incluso en las últimas fases de la infección. En los últimos años, el tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) ha reducido considerablemente la capacidad replicativa del virus y ha demostrado reconstituir parcialmente los daños observados en el sistema inmune de los pacientes infectados. Sin embargo, aún no queda claro si las mejoras introducidas con el TARGA afectarían a la respuesta de las células CD8 específicas en la infección por el VIH-1. Con el objetivo de responder a esta cuestión, hemos evaluado la distribución de las subpoblaciones CD8 específicas así como su perfil funcional en términos de expresión de IFN-γ, TNF-α y perforina, en un grupo de pacientes infectados por el VIH-1 y que siguen tratamiento TARGA. En este sentido, se han analizado simultáneamente la producción de citocinas y, la expresión de perforina y el perfil fenotípico diferenciador de células CD8 VIH-1 específicas, en una cohorte de 14 sujetos VIH-1 positivos y divididos en dos grupos según recibieran TARGA al menos durante dos años seguidos –tratados –, o fueran asintomáticos y naïve para el TARGA –no tratados–. Los resultados indican que el porcentaje de células CD8 VIH-1 Gag-específicas fue significativamente más alto en el grupo de pacien- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 87 INMUNOLOGÍA tes –no tratados– que en el grupo de de –tratados–. Sin embargo, cuando las subpoblaciones CD8 VIH específicas fueron analizadas en ambos grupos, no se destacó diferencias significativas en la distribución de células memoria y memoria efectora en ambos grupos de pacientes, según el criterio seguido de análisis naïve (CCR7+CD45RA+), memoria (CCR7+CD45RA-), (CCR7-CD45RA-) y efectora (CCR7-CD45RA+). Cuando la produccion intracelular de INF-γ, TNF-α y perforina fue analizada, se encontró un incremento significativo en la capacidad secretora de INF-γ en la población CD8+CD45RA+ VIH-Gag específicas en el grupo de pacientes - no tratados - De igual modo, se observó un aumento significativo de la población VIH-1 específica CD8+ con capacidad de expresar perforina en individuos - no tratados - que no fue constatada en el grupo de individuos - tratados -, mientras que la expresión de TNF-α intracelular no mostró diferencias significativas entre ambos grupos, a pesar de que fueron más elevadas en los individuos infectados que en el grupo control sano. En resumen, podemos asumir que el grupo de individuos infectados por VIH-1 que NO reciben TARGA presentaron frecuencias similares de células memoria/efectora CD8+ específicas, pero la capacidad funcional de las mismas en términos de producción de citoquinas y perforina no se encontró afectada a diferencia del grupo de pacientes que recibieron tratamiento anti-retroviral. No obstante, no podemos excluir que, al presentar el grupo –no tratado– mayor carga viral, los cambios observados puedan deberse a un efecto directo del virus y no a la ausencia de TARGA. 70. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE NKRS EN INDIVIDUOS VIH-1+ INCLUIDOS EN UN PROYECTO DE INTERRUPCIÓN PROGRAMADA DEL TARGA. Luque J, García-Jurado G, Lozano JM, González R, Soriano N, Leal M, Peña J. Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba y Servicio de Infecciosos, Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. La infección por el VIH-1 es en la actualidad una pandemia que afecta a más de 40 millones de personas. Hasta la fecha la única forma efectiva de controlar la replicación viral es el TARGA, pero se desconoce el efecto real que produce en el sistema inmune. En la actualidad se está incluyendo la interrupción estructurada del tratamiento (IET) como método para paliar los efectos no deseados del TARGA. Con el objetivo de conocer si la IET aumenta la respuesta inmune innata, nos proponemos estudiar el perfil de receptores NK (NKRs) en las dos subpoblaciones descritas de células NK. Para el estudio se tomaron muestras de 11 pacientes incluidos en una cohorte de IET, en los puntos de inicio, interrupción y reinicio del TARGA. Los criterios para la inclusión de los pacientes en la cohorte fueron: CV<50c/mm3, CD4+>500c/mm3 al menos durante los últimos 12 meses y un recuento nadir de CD4+>250c/mm3. El estudio se ha llevado a cabo mediante citometría de flujo, utilizando los anticuerpos monoclonales, anti-CD3, anti-CD56 y anti-CD94 Becton Dickinson (Mountain View, CA); anti-NKp46, anti-KIR2DS4, anti-KIR2DL1, antiNKG2A, anti-NKG2C R&D systems (Abingdon, UK), anti-ILT2 PharMingen (Oxford, U.K.). Las muestras se procesaron en FACScalibur (Becton Dickinson) y el análisis de las muestras se realizó mediante el software Flowjo (TreeStar company). Cuando se analizó el perfil de distribución de los NKRs en la subpoblación NKdim de las células NK (CD3-CD56+dim) se observó que la interrupción programada del TARGA disminuyó los niveles de los receptores NKG2 ligado a CD94 y aumentó los niveles de los recep- POSTERS tores KIR2D incluidos en el estudio (KIR2DL1 y KIR2DS4). Un aumento significativo se observó en el caso de los niveles de ILT-2 y NKp46 tanto en la población NKdim como en la NKbright. La inclusión de nuevo del TARGA en los pacientes del estudio, restableció los niveles de NKRs observados antes de la IET. Estos resultados indican que la IET podría modificar el perfil de expresión de NKRs aunque no induce un evidente perfil inhibidor o activador en las células NK. En resumen, es necesario un mayor número de estudios para conocer el verdadero impacto de la interrupción estructurada del tratamiento (IET) sobre la respuesta inmune innata de los pacientes infectados por VIH-1 que ayude a entender si una suspensión de la terapia contra VIH por cortos periodos de tiempo mejora la capacidad del sistema inmunológico a controlar la infección. 71. CARACTERIZACIÓN DE SUBPOBLACIONES MONOCITARIAS EN SANGRE PERIFÉRICA EN PACIENTES CON NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD. Rodriguez Pastore MI1, Sánchez Luengo MA, Mallo Palomares AB1, D'Angelo Mendoza EA1, San Antonio E1, Torralba Gonzalez de Suso M2, Mateos Hernandez J2, Monserrat Sanz J1, Reyes Martín E1, Rodriguez-Zapata M1,2, Alvarez-Mon M1. 1Unidad I+D asociada CNBCSIC. Laboratorio de Enfermedades del Sistema Inmune y Oncología. Departamento de Medicina. Universidad de Alcalá. 2Servicio de Medicina Interna del Hospital Universitario de Guadalajara. Introducción. La incidencia de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) en España se encuentra en torno a los 420/100.000 habitantes, la mortalidad es del 1% en los pacientes hospitalizados y ambulatorios aumentando al 36% en los pacientes que requieren ingreso en una unidad de cuidados intensivos. Diferentes mecanismos inmuneinflamatorios han sido implicados en la patogénesis de la NAC. La caracterización de monocitos de sangre periférica en enfermedades infecciosas como la NAC no ha sido aún clarificada. Es conocida la heterogeneidad en la población monocitaria de sangre periférica siguiendo criterios tanto morfológicos, fenotípicos como funcionales. Se han observado modificaciones en la distribución de subpoblaciones monocitarias en función de la expresión de los marcadores de superficie de CD14 y CD16 en diferentes enfermedades inflamatorias e infecciosas. En estas células se han descrito patrones de migración diferenciales relacionados con la expresión de moleculas de adhesión y quimioreceptores como CD62L y CX3CR1. El objetivo de nuestro estudio es la caracterización de las posibles alteraciones en subpoblaciones monocitarias en relación con características inmunofenotípicas. Metodología. Hemos analizado células mononucleares de sangre periférica en 20 pacientes con NAC, en el momento del diagnóstico y sin tratamiento antibiótico previo y en 20 sujetos sanos pareados en edad y sexo. Se realizó un estudio multiparamétrico con citometría de flujo cuantitativa de cuatro colores con los siguientes anticuerpos monoclonales: CD14, CD16, CD62L y CX3CR1. Resultados. Hemos encontrado un aumento significativo de la población CD14+CD16+ y asi como disminución de la población CD14+CD16- en los pacientes con NAC con respecto a los controles (p< 0,002 y p< 0,006 respectivamente). Siendo la subpoblación CD14 high CD16low la que mostró un incremento mayor (p< 0,01). Y también evidenciamos un aumento significativo de la expresión de CD62L y CX3CR1 en la población CD14+CD16+ en los pacientes con respecto a los controles (p< 0,003 y p< 0,01, respectivamente). 87 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 88 POSTERS Conclusiones. Nuestros resultados podrían indicar una redistribución en las subpoblaciones monocitarias de sangre periférica con adquisición de marcadores con función efectora y de migración a tejidos inflamados como el pulmón en la NAC. 72. PRIMOINFECCIÓN TUBERCULOSA EN EL TRATAMIENTO CON FÁRMACOS ANTAGONISTAS DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (INFLIXIMAB) POR UVEÍTIS RECURRENTE. Micheloud D, Velastegui A, Sanchez Ramón S, Gil J, Fernández-Cruz E. Hospital Gregorio Marañon, Madrid. Introducción. En los últimos años, el auge de la terapia biológica ha demostrado su eficacia en diferentes patologías de base autoinmune. Sin embargo, se ha producido un notable incremento de procesos infecciosos, algunos de gravedad, asociado a la utilización de estas terapias. La presentación clínica de las infecciones suele ser atípica y esto dificulta el diagnóstico. Caso clínico. Varón de 28 años con antecedentes de síndrome tóxico a los 3 años de edad (1981), que cursó como una neumonía intersticial y hepatopatía y artralgias de causa no filiada a los 14 años de edad. En seguimiento por la Unidad de Retina desde 2001 por cuadro de pars planitis (uveitis intermedia) de ojo derecho (OD) recurrente. Presentó un episodio de uveitis en OD en enero de 2003, tratada con ciclopléjicos con discreta mejoría. En otoño de 2003, nueva recurrencia de uveitis en OD, iniciándose tratamiento con prednisona, ciclosporina y azatioprina, con pauta descendente de la terapia corticoidea según evolución clínica. El paciente es remitido a la Unidad de Inmunología Clínica para descartar enfermedad autoinmune sistémica. No presentaba manifestaciones sugestivas de enfermedad autoinmune sistémica. La cuantificación de inmunoglobulinas séricas, estudio de factores del complemento fueron normales. Proteína C reactiva negativa. Los auto-anticuerpos (ANOEs, anticuerpos antifosfolípidos y ANCAs) fueron negativos. Subpoblaciones linfocitarias de distribución y recuento normal, estudio linfoproliferativo a mitógenos normal. Serología a hepatitis B y C, VIH, CMV, toxoplasma y lúes fueron negativas. Serología IgG positiva a VEB. Prueba de Mantoux negativa. Se descartó asociación a patología sistemica (en especial, con enfermedad de Behçet, síndrome de Reiter, esclerosis multiple, lupues eritematoso sistémico), entre otras. Se diagnosticó como uveítis unilateral recurrente en OD de causa no filiada refractaria a terapia inmunosupresora convencional. Debido a la persistencia de actividad inflamatoria ocular, que se extendió al ojo izquierdo, se decidió tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-TNF-α (infliximab, Remicade®). Radiografía de tórax normal y se realizó tinción de BAAR en esputo (x3) que fue negativa. El paciente recibió infliximab (5mg/kg iv) a las 0 y 2 semanas, con buena tolerancia y rápida respuesta clínica, objetivándose remisión completa de la actividad inflamatoria con recuperación del campo visual. A los 20 días de comenzar el tratamiento, el paciente comienza con fiebre elevada de 39-40º con deterioro del estado general, sudoración profusa y lesiones vesiculares en miembros superiores. Se ingresa en Urgencias, presentando leucocitosis 11.900 (78% granulocitos), LDH 890; hemocultivos y urocultivos negativos. Rx de tórax: adenopatías mediastínicas paratraqueales derechas. Se comienza con antibioticoterapia empírica con cefalosporina de tercera generación, el paciente evoluciona febril y con mayor deterioro del estado general, razón por la cual se realizó TAC torazo-abdominal donde sólo se evidencia un leve infiltrado intersticial en lóbulo superior izquierdo y adenopatías menores de 1 cm en hilio derecho y 1,5 cm paratraqueal. El cultivo de espu- 88 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 to fue negativo. Se realizaron determinaciones de Inmunoglobulinas, Complemento y subpoblaciones linfocitarias que fueron normales. Se modificó tratamiento con imipenen + gentamicina y tratamiento antituberculostático empírico con asociación de izoniacida 50 mg, pirazinamida 300 mg y rifampicina 120 mg (5 cp/día en una sola toma) y fluconazol 100 mg/día. El paciente persiste febril, se realizó fibrobroncoscopia con lavado broncoalveolar y punción del ganglio paratraqueal. No hubo rescate microbiológico, en el cultivo en el lavado broncoalveolar y la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) para M. Tuberculosis fue negativa La punción transbronquial no fue significativa, razón por la cual se realizó mediatinoscopía con extirpación ganglionar, la PCR para TBC del material fue negativa, pero en los cultivos se aisló Mycobacterium Tuberculosis. El paciente continúa con el tratamiento antituberculostático en la actualidad, con buena evolución. Discusión. Las infecciones por bacterias intracelulares (Histoplasma, L. monocytogenes) pueden evitar la acción bactericida y desarrollarse formando granulomas, como en el caso de la infección por M. Tuberculosis, en la que el TNF-α tiene la función de limitar la capacidad patogénica del bacilo. Sin embargo, al inhibir su función no existe apoptosis de los macrófagos, permitiendo su diseminación y reactivación en caso de infección latente. La TBC se ha asociado más frecuentemente al uso de infliximab que a otros anticuerpos anti-TNF-α monoclonales. Generalmente se ha presentado en casos clínicos en los 3 primeros meses de tratamiento y en el 70% después de la 3 dosis. En nuestro paciente se presento a la 5 semana de comenzar la terapia con infliximab. Sus manifestaciones suelen ser atípicas como en este caso, la clínica inusual puede retrasar el diagnostico y contribuir a la morbimortalidad. La TBC extrapulmonar diseminada (33%) es la forma más habitual en este grupo de pacientes. Sin embargo, en este caso fue una forma localizada de TBC extrapulmonar, con PCR para M. Tuberculosis negativa, la cual posee una sensibilidad del 80% y especificidad del 97%. Conclusión. El tratamiento con antagonistas de TNF-α tiene que ser supervisado estrechamente para detectar la aparición de potenciales efectos adversos y realizar su diagnostico y tratamiento en forma precoz. 73. ANTICUERPOS FRENTE A HELICOBACTER PYLORI EN PACIENTES CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA. Respaldiza N, Mateos I, Sanchez Agüera M, Friaza V, Morilla R, De la Horra C, Montes-Cano MA, Rivero L, Muñoz-Lobato F, Varela JM, Medrano FJ, Torronteras R, Calderón E. CIBER de Epidemiología y Salud Pública. Servicios de Medicina Interna y Microbiología. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. Introducción. La infección por Helicobacter pylori es una de las infecciones bacterianas más comunes en humanos. Esta infección se ha asociado con diferentes enfermedades gástricas y relacionada con diversas patologías extra-gastrointestinales, incluyendo enfermedad coronaria, rosácea o enfermedades pulmonares crónicas. En nuestro medio no existe información sobre la tasa de infección por H. pylori en enfermedades extra-gastrointestinales. Objetivo. Obtener información sobre la seroprevalencia de la infección por H. pylori en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) de nuestro medio Pacientes y metodología. Se incluyeron 37 pacientes con EPOC y 46 controles de los que se obtuvieron muestras séricas para evaluar la presencia de anticuerpos IgG anti-Helicobacter pylori. Los sueros fueron analizados mediante un ELISA comercial (Enzygnost Anti-Heli- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 89 INMUNOLOGÍA POSTERS cobacter pylori II/IgG; Dade Behring. Marburg, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante. Resultados. En 29 de los 37 pacientes con EPOC (78,4%) se demostró la presencia de anticuerpos frente a H. pylori y en 28 de los 46 controles (61%), sin diferencias significativas entre ambas tasas (p= 0,14). Por otra parte, en los pacientes con EPOC no existieron diferencias en la tasa de anticuerpos frente a H. Pyroli en relación con la edad, el sexo, el consumo de tabaco o parámetros respiratorios funcionales (FEV-1%). Conclusiones. Existe una alta tasa de exposición a la infección por H. Pylori en pacientes con EPOC de nuestro medio, pero similar a la de la población general. Este hecho, junto a que no existen diferencias en la tasa de anticuerpos frente a este microorganismo relacionadas con las características clínicas de los pacientes con EPOC sugieren que no existe relación entre la EPOC y la infección por H. Pylori. 74. ELEVACIÓN DE CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS EN PACIENTES CON EPOC COLONIZADOS POR PNEUMOCYSTIS JIROVECII. Montes-Cano M, Rivero L, Morilla R, Friaza V, Respaldiza N, Muñoz F, Medrano FJ, Varela JM, Calderón EJ, De la Horra. Servicio de Medicina Interna. CIBER de Epidemiología y Salud Pública. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. Introducción. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por una limitación permanente del flujo aéreo debida a la inflamación crónica de la pared bronquial. Diversos estudios han descrito un aumento en los niveles de IL-8, MCP-1 y TNFalfa en el esputo inducido de estos pacientes. La repuesta inflamatoria local y sistémica parece estar condicionada por la interacción de factores, entre los que se incluyen aspectos genéticos, características de la respuesta inmunitaria, tabaco, agresiones externas o la posible presencia de agentes infecciosos. Actualmente, se conoce la existencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC, además en modelos animales se ha demostrado que Pneumocystis provoca un aumento de interleuquinas proinflamatorias; lo que permite plantear la posibilidad de que la colonización por P. jirovecii juegue algún papel en la fisiopatología de la EPOC. Objetivo. Identificar los cambios inducidos por P. jirovecii en la respuesta inflamatoria a nivel sistémico en pacientes con EPOC. Material y métodos. Se incluyeron 51 pacientes diagnosticados de EPOC. La identificación de P. jirovecii se realizó mediante PCR tipo Nested en muestras respiratorias. La respuesta inflamatoria se analizó mediante ELISA comercial (R&D systems) para IL-8, IL-6 y TNFalfa, y Endogen para la determinación de MCP-1, en muestras séricas. Resultados. Se identificó la presencia de P. jirovecii en 28 pacientes con EPOC. Los niveles de citoquinas en los pacientes con y sin colonización por P. jirovecii se resumen en la tabla. Citoquinas/Pacientes (pg/ml) EPOC sin Pj (N= 23) EPOC con Pj (N= 23) P Test T-Student IL-8 (medida ± SD) TNF-alfa (medida ± SD) IL-6 (medida ± SD) MCP-1 (medida ± SD) 13,89 ± 13,87 3,57 ± 2,03 5,34 ± 5,45 726,99 ± 67,5 21,26 ± 9,25 8,15 ± 10,6 16,95 ± 25,6 1012 ± 25,06 0,028 0,047 0,038 0,0048 Los pacientes con EPOC con y sin colonización por P. jirovecii no mostraron diferencias significativas respecto a edad, sexo, hábito tabáquico, función respiratoria medida mediante VEF-1%, recuento sanguíneo de linfocitos y de leucocitos. Conclusiones. Nuestros resultados muestran una asociación entre colonización por P. jirovecii y aumento de respuesta inflamatoria a nivel sistémico en pacientes con EPOC. Son necesarios estudios más amplios para esclarecer el posible papel de la colonización por Pneumocystis en la fisiopatología de la EPOC. Este estudio ha sido financiado con ayudas del Ministerio de Ciencia y Tecnología. SAF 2003-06061 y FIS CP 04/217. 75. INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO -174 G/C EN LA PRODUCCIÓN LOCAL DE IL-6 EN PACIENTES CON NEUMONÍA INTERSTICIAL IDIOPÁTICA. Montes-Cano MA1, Muñoz-Lobato F1, de la Horra C1, Friaza V1, Rivero L1, Rodríguez-Becerra E2, Respaldiza N1, Martín-Juan J1, Morilla R1, Medrano FJ1, Varela JM1, Calderón EJ1. 1CIBER de Epidemiología y Salud Pública. Servicios de Medicina Interna y 2Neumología. Hosp. U. Virgen del Rocío. Sevilla. Introducción. Las Neumonías intersticiales idiopáticas (NII) constituyen un grupo heterogéneo de desórdenes de causa desconocida. La lesión causada en el parénquima pulmonar conduce a una cascada de procesos inflamatorios, que originan fibrosis. IL-6 es una molécula inflamatoria implicada en estos procesos, en cuyo promotor existe un polimorfismo descrito que regula los niveles plasmáticos de esta citoquina. El genotipo GG se asocia a una mayor producción a nivel sistémico, pero existe poca información sobre su influencia a nivel local. Objetivo. Analizar los niveles de IL-6 en lavado broncoalveolar (LBA) y su correlación con el polimorfismo -174 G/C en pacientes con NII. Pacientes. Se incluyeron un total de 39 pacientes (31 hombres y 8 mujeres), con una edad media de 61,4 años ± 12,5 y rango (32–81) años. Todos los casos tenían diagnóstico confirmado de NII y se les realizó un LBA. Métodos. La identificación del polimorfismo de la región promotora de IL-6 se realizó por técnicas de PCR-RFLP. Para el alelo G se obtuvo un fragmento de 163 bp y para el alelo C dos fragmentos de 111 y 52 bp respectivamente. Los niveles locales de IL-6 fueron medidos por técnica de ELISA, utilizando un kit comercial (R&D biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos resultados fueron normalizados en base a la concentración total de proteína y expresados en picogramos/mg de proteína. Resultados. A continuación la tabla muestra los resultados obtenidos respecto de las frecuencias genotípicas y alélicas para el polimorfismo -174 G/C de IL-6. Así mismo, se reflejan los niveles de concentración media de IL-6 local, en función de los fenotipos alto o bajo productor. Genotipos IL-6 GG GC CC Fenotipos Il-6 Alto productor (GG) Bajo productor (GC+CC) NII Alélos NII n=39 (%) 20 (51,3) 16 (41,0) 3 (7,7) NII N=39 (%) 20 (51,3) 19 (48,7) IL-6 G C 2n= 78 (%) 56 (71,8) 22 (28,2) Concentración media IL-6 44,6 49,4 P ns Conclusión. Nuestros datos sugieren que el polimorfismo -174 G/C del promotor del gen IL-6 no afecta la expresión de esta citoquina a nivel local en pacientes con NII. Parcialmente financiado por laboratorios Pfizer (Beca ATV-IIG-158). 89 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 90 POSTERS 76. 8 COLORS MULTIPARAMETRIC FLOW CYTOMETRY STUDY OF CYTOKINE PRODUCTION BY FOXP3 EXPRESSING CELLS. Acuña L, Barcenilla H, Monserrat J, Prieto A, Díaz D, Villarroel M, Sánchez MA, Hernández A, Reyes E, Alvarez-Mon M. Universidad de Alcalá, Madrid. Regulatory T cells play a key role maintaining the homeostasis of the immune system. They have been well defined as CD4+CD25high cells that express the transcription factor Foxp3. However, in humans the expression of Foxp3 is not exclusively confined to CD4+CD25high cells, a population of CD25low cells with naïve phenotype also expresses Foxp3 at lower levels than CD25high cells. In addition, activated human T cells are able to express Foxp3. Objective: By the use of multiparameter flow cyometry in eight colors we have studied the production of cytokines by different subsets of T cells defined by the expression of Foxp3. Materials and Methods: We have studied peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 6 healthy controls. Freshly or activated PBMC were cultured for six hours in the presence or the absence of PMA (50 ng/ml) plus Ionomycin (1 μg/ml). Monensin (2 μM) was added to the cultures to retain the produced cytokines within the producer cells. For surface labelling, we used antibodies against the following antigens: CD3, CD8, CD45RA, CD25 CD27 CD31 and for intracellular labelling, antibodies against: TNFα, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-10 and Foxp3. Results: We have found significant differences in the intracellular production of TNFα, IFNγ and IL-2 in the different subsets defined by Foxp3 expression and also by their naïve or memory phenotype. Foxp3+ cells express reduced levels of most of the cytokines especially INFg compared to the foxp3- cells. Conclusion: The combination of intracellular cytokines and foxp3 staining at the single cell level allow to distinguish subsets of T cells with different function. 77. IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DE LA PROTEÍNA CORE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C, RESPONSABLE DE SU EFECTO INMUNOMODULADOR. Domínguez-Villar M, Muñoz-Suano A, Anaya-Baz B, Aguilar S, Esperanza Gomez, Rodríguez-Iglesias M, Garcia-Cozar FJ. Universidad de Cádiz. Introducción. La proteína core del virus de la hepatitis C es una proteína no estructural de 191 aminoácidos con funciones inmunogénicas y reguladoras conocidas. En células epiteliales, se ha descrito que la proteína puede tener localización subcelular tanto nuclear como citoplasmática, y que su translocación al núcleo depende de la proteólisis de su región C-terminal. Nosotros hemos demostrado previamente que VHC infecta linfocitos CD4 en muestras clínicas de pacientes con hepatitis crónica por VHC, induciendo una situación de tolerancia perférica. En células inmunes, la localización subcelular de las proteínas del virus y su relación con el efecto del virus auún no se ha analizado. Nuestro estudio se centra en estudiar la localización subcelular de distintas regiones de VHC-core en células CD4+ y en identificar la región de la proteína responsable de la inducción de anergia. Resultados. Hemos construido truncaciones de la proteína core del VHC, teniendo en cuenta su distribución en dominios (aas 1-191, 1-171, 1-78, 1-126, 78-126, 126-191) y hemos analizado la localización subcelular de cada una de ellas, así como el efecto de las mismas en la activación del factor de transcripción NFAT, en su translocación al núcleo, y en la respuesta proliferación y de producción de IL2 de célu- 90 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 las CD4+. Así hemos podido determinar la región de HCV responsable de algunos de sus efectos sobre el sistema inmune. 78. MECANISMOS DE EVASIÓN INMUNOLÓGICA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN LINFOCITOS PRIMARIOS. Domínguez-Villar M, Muñoz-Suano A, Anaya-Baz B, Aguilar S, Esperanza Gomez, Rodríguez-Iglesias M, Garcia-Cozar FJ. Universidad de Cádiz. Introducción. EL VHC es la causa principal de hepatitis transfusional en el mundo, y su infección se cronifica en el 80% de los casos, evolucionando en la mayoría de las ocasiones hacia cirrosis y carcinoma hepático. Aunque el hepatocito es el lugar primario de replicación del virus, se ha demostrado que el VHC también infecta células T CD4+ tanto in vitro como in vivo y nosotros hemos demostrado que está presente en linfocitos de pacientes infectados. Una posible causa de la cronificación de la enfermedad es la débil o inexistente respuesta de células CD4+ frente a la infección por el virus. Se ha demostrado que la proteína core del VHC expresada en células Jurkat provoca una situación de no proliferación similar a la anergia de células T, caracterizada por la disminución en la producción de IL2 y alteración en la ruta de señalización de las MAPkinasas y nosotros hemos demostrado que altera la proliferación y activa un programa transcripcional responsable de la evasión del virus. En nuestro estudio nos centramos en el efecto de la expresión de la proteína core del VHC en células primarias T CD4+ obtenidas de donantes sanos. Resultados. La expresión de la proteína core del VHC en células CD4+ obtenidas de blastos PHA, provoca la activación de NFAT y su translocación al núcleo, una disminución en la proliferación celular y producción de IL2 así como un aumento de la secreción de IL4 en concordancia con lo descrito en la clínica. 79. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS COSTIMULADORES EN PACIENTES CON PAPILOMATOSIS LARÍNGEA PERSISTENTE POR EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (HPV). Anaya-Baz B, Domínguez-Villar M, Muñoz-Suano A, Aguilar-García S, Gomez E, García-Cozar FJ, Rodríguez-Iglesias MA. Universidad de Cádiz. El virus del papiloma humano (VPH) es el causante de una de las enfermedades de transmisión sexual mas frecuentes. En un porcentaje bastante elevado de casos, HPV evade el sistema inmune, no desarrollándose una respuesta inmune eficiente con la consecuencia de una infección persistente, y el desarrollo en última instancia de cáncer. Entre las regiones anatómicas que se ven afectadas por el HPV, no solo se encuentra el cervix uterino sino también el epitelio de la laringe, causando en algunos casos una papilomatosis laringea persistente. Nosotros hemos observado previamente que la evasión de HPV, podría ser debida a una alteración causada por proteínas del virus en la expresión de moléculas costimuladoras por parte de las células dendríticas que presentan péptidos de HPV; por lo que consideramos de interés evaluar la expresión de dichas moléculas en pacientes con papilomatosis laringea. En este estudio hemos analizado la expresión de las moléculas costimuladoras B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) en pacientes con papilomatosis laríngea persistenten, utilizando para ello, CTLA4Ig que reconoce ambas moléculas. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 91 INMUNOLOGÍA POSTERS Nuestros resultados muestran una tendencia al aumento de la expresión de CD80 y/o CD86, en monocitos y células dendríticas de pacientes con paplilomatosis laringea. SESIÓN 5: INMUNODEFICIENCIAS Moderadores: Eduardo Fernández-Cruz Pérez (Madrid), María José Recio Hoyas (Madrid) 80. ANÁLISIS MUTACIONAL DEL GEN TNFRSF13B (TACI) EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN (IDVC). Detková D1, Arostegui JI2, Hernández M1, Rius J2, Plaza S2, Gracia J de1, Salgado-Perandrés S1, Caragol I1, Español T1, Yagüe J2. 1Unitat d'Immunologia, Hospital Universitari Vall d'Hebron y 2Servei d'Immunologia Hospital Clínic, Barcelona. La IDVC es la inmunodeficiencia primaria sintomática más frecuente. Su origen genético es desconocido en la mayoría de los casos. Unicamente en un 10% de ellos se han demostrado defectyos en ICOS, CD19, BAFFR y TACI. TACI (transmembrane activator and CAML interactor) es un miembro de la superfamilia de los receptores de TNF. Está involucrado en la respuesta inmunitaria T-independiente y en el cambio de isotipo de inmunoglobulinas. El análisis mutacional del gen de TACI en nuestro grupo de 70 pacientes adultos no emparentados diagnosticados de IDVC (criterios ESID) reveló la prevalencia de las mutaciones del 7%(5/70). Todas las mutaciones fueron localizadas en el exon 3. Cuatro de los cinco pacientes presentaron una mutación missense C104R (dos heterocigotos y dos homocigotos) y uno presentó una mutación missense C89Y en heterocigosis (mutación no descrita anteriormente en la literatura). Todos los pacientes con la mutación C104R estaban clasificados en el grupo BM2 (número conservado de las células B de memoria con y sin cambio de isotipo) y uno de los cuatro presentó enfermedad autoimmune y esplenomegalia. El paciente con la mutación C89Y se clasificó en el grupo BM1 (disminución de las células B de memoria con cambio de isotipo) y tiene historia familiar de IDVC (hermana fallecida con IDVC a los 17 años). Se ha realizado el análisis mutacional del gen TNFRSF13B en los familiares de los 5 pacientes y en 100 controles sanos. Estos resultados serán útiles en el mejor entendimiento del papel de TACI en la patogenia de esta inmunodeficiencia. 81. HIPOGAMMAGLOBULINEA SEVERA Y DEPLECCIÓN DE CELULAS B ASOCIADA CON TIMOMA (SINDROME DE GOOD). Salgado Cecilia G1, Botella-Martínez C*, López Alvarez MR1, Alemany-Frances L2, González-Billabeitia E2, Torres-Lanzas J1, Ferri-Ñiguez B1, Bernal-Ramos A1, Muro Amador M1, García-Pacheco M1, Alvarez-López MR1, Minguela-Puras A1, GarcíaAlonso AM1. 1Immunologia, Cirugía torácica y anatomía patológica, Servicio Universitario Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia. 2Neumología y oncología. Hospital Morales Meseguer. Murcia. El síndrome de Good, es una inmunodeficiencia primaria que se caracteriza por hipogammaglobulinemia asociado a timoma. Fué descrito por primera vez en 1954 por el Dr. Rober Good, es un caso raro de inmunodeficiencia combinada T y B que normalmente aparece en adultos en la 4ª o 5ª decada de vida. Los timomas son tumores benignos pero alrededor del 6-11% de pacientes con timoma puede desarrollar progresivamente inmunodeficiencia. Las manifestaciones clínicas del Síndrome de Good son timoma, aumento de la susceptibilidad a infecciones oportunistas hipogammaglobulinemia y disminución o ausencia de células B. La causa y patogenia de este desorden son desconocidas, aunque hay algunas evidencias que sugieren defectos básicos en la médula osea. Describimos el caso de un varón de 31 años, previamente sano al que en 2003 se le detectó, mediante radiografía de rayos X, una opacidad de 11 cm en el lóbulo inferior derecho del pulmón. Un mes antes el paciente había presentado síntomas sistémicos como fiebre nocturna, pérdida de peso, tos y expectoración con mucosidad. Se le practicó una biopsia cuyo estudio anatomopatológico fue informado como timoma cortical de predominio linfocítico sin evidencia de malignidad. Posteriormente el paciente fue sometido a lobectomía inferior derecha. Después de varios episodios de neumonia, infecciones bronquiales y rinosinusales, en enero de 2005 el paciente presentó sepsis y neumonia por lo que fué enviado a nuestro hospital para una evaluación inmunológica. Dicha evaluación reveló un número total de leucocitos normal pero con niveles extremadamente bajos de inmunoglobulinas séricas, niveles muy bajos de células B periféricas, parálisis del desarrollo de las células B en estadio pre-B en médula osea y otros defectos de la inmunidad celular, como linfopenia de células T CD4+, una ligera inversión del cociente CD4+/CD8+, aumento en el número de células T doble negativas CD3+CD4-CD8-TCRalfa-beta+ y respuesta proliferativa reducida en cultivos de proliferación in vitro frente a antiCD3 o anti-CD3/anti-CD28, pegados a placa. Tras ser diagnosticado como Síndrome de Good el paciente fué sometido a tratamiento sustitutivo con IgG endovenosa, y desde entonces se encuentra asintomático y libre de infecciones. Las principales causas de muerte en pacientes con Síndrome de Good son generalmente, a consecuencia de infecciones, enfermedades autoinmunes o complicaciones hematológicas. Nuestros datos sugieren que los pacientes con timoma deberían evaluarse inmunologicamente de forma periodica tras el diagnóstico con objeto de detectar oportunamente posibles alteraciones del sistema inmune e iniciar cuanto antes un tratamiento efectivo para prevenir las complicaciones que puedan poner en riesgo la vida del paciente. 82. AN EDUCATIONAL PROGRAMME ORIENTED TO THE SELF-CARE OF PATIENTS WITH PRIMARY ANTIBODY DEFICIENCIES. Carbone J, Moreno N. Asociación Española de Déficits Inmunitarios Primarios. In the setting of chronic diseases, it is increasingly recognize the critically important potential of effective everyday self-care decision making for reducing the burden of illness and the strain on health service systems. People living with primary immunodeficiencies must take personal long-term, day-to-day responsibility for care. An important role of doctors and the healthcare system is to help them do this. We report on the experience with a one-year educational programme for patients with primary antibody deficiencies developed as a pilot experience in the Community of Madrid. The aim of the programme was to provide basic knowledge regarding the immune system and the management of primary antibody deficiencies with emphasis in aspects of self-care. In the first step of the programme 91 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 92 POSTERS (January 2005) a 1-hour educational session was presented to 50 patients and their relatives with an overview of the primary immunodeficiencies and their management. At the end of the educational session, patients and relatives were asked to know if they were interested in the development of a one-year pilot educational programme oriented to the self-care. A total of 15 patients and relatives participated in 10 monthly sessions of the educational programme (Second step: September 2005-June 2006). The contents of the educational programme included: The immune system; the primary immunodeficiencies with emphasis in primary antibody deficiencies; all aspects of treatment of primary antibody deficiencies (indication, sustitutive therapy with immunoglobulins, antibiotics, nutrition, hygiene, dental care, common complications and its management, transplantation, sexualty, genetic council, psychological support, social, legal, work and economic issues); importance of the self-care for the management of patients and barriers to its development. Methodology. Monthly two-hour sessions. First hour: The same doctor developed the educational contents in a very informal way, with constant interaction with patients. Second hour: the doctor, a phycologist and a social worker provided personal or group information regarding different aspects of the care of primary antibody deficiencies. Evaluation. At the end of the programme a questionnaire was developed by patients and relatives to evaluate the development of the programme and if they had adquired any new information useful for the day-to-day care of their immunodeficiencies. Results: All patients and relatives agreed to indicate as important issues: the possibility of sharing personal experiences and the opportunity to reach knowledges difficult to adquire in the hospital. An increased knowledge of different aspects of the disease was observed during continuing evaluation along the course. The course was rated as 9/10 in usefulness by patients and relatives. A decision was reach to start a second-year «advanced» training programme including basic knowledge for the autoadministration of IVIG or SCIG. The experience indicated that no more than 10-15 patients and relatives should be included in the sessions to facilitate a more fluid and continued interaction between patients and faculties. Conclusion. An educational intervention might be useful to improve the primary immunodeficiency patients' knowledge and self-care of the disease. 83. NUEVA MUTACIÓN EN EL GEN TNFRSF13B EN PACIENTE CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN. MartínezPomar N, Ferrer JM, Pons J, Iglesias J, Cambra A, Escobar D, Matamoros N. Servicio Inmunología, Hospital Son Dureta, Palma de Mallorca. La Inmunodeficiencia Variable Común (IVC) es un síndrome heterogéneo que se caracteriza por hipogammaglobulinemia de origen desconocido y predisposición a sufrir infecciones de repetición. Recientemente se ha descrito que un 8% de los pacientes presentan mutaciones en el gen TNFRSF13B. Objetivo: Analizar dicho gen en la población de pacientes afectos de IVC de Baleares (n=43). Metodología. En este trabajo inicial se han analizado 10 pacientes. Se ha amplificado los exones 1-5 del gen TNFRSF13B mediante PCR-SSP y posterior secuenciación de los productos mediante un secuenciador automático de ADN ABI 3100. Resultados. El análisis de ADN genómico de los individuos afectos muestra que 1 paciente es heterocigoto para una nueva mutación c.119A>G, localizada en el exón 3 que origina el cambio de aminoácido p.E117G. El análisis comparativo de la secuencia proteica revela que 92 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 el aminoácido implicado en esta mutación está muy conservado entre especies. El paciente presenta IVC asociada a timoma. La no existencia de historia familiar de inmunodeficiencia primaria sugiere que se trata de una mutación de novo. Conclusiones. Creemos importante que se incorpore de forma rutinaria el estudio genético de las moléculas implicadas en la patogénesis de la IVC con el fin de conocer mejor esta patología, clasificar mas detalladamente a los pacientes, aportar consejo genético y facilitar el desarrollo de futuras terapias correctivas del defecto. En futuros trabajos analizaremos la repercusión de la mutación en la expresión y funcionalidad de TACI. 84. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LINFOCITOS B TRISÓMICOS EN UN CASO DE TRISOMÍA 8 CONSTITUCIONAL EN MOSAICO. Martí S, Galán F, Casero J, Fernández J, Rubio G. Inmunología, Pediatría, Bioquímica, Universidad Miguel Hernández, Hospital Universitario de Sant Joan, Sant Joan d'Alacant. Introducción. La trisomía 8 completa es rara y se asocia con abortos espontáneos. Por el contrario, la trisomía 8 constitucional en mosaico (CT8M) es compatible con la vida. Su origen estaría en la ganancia somática de un cromosoma 8 en etapas tardías del desarrollo de un zigoto normal. La CT8M se muestra con una gran variabilidad fenotípica, se asocia a un riesgo elevado de neoplasias y es casi inexistente la bibliografía sobre la función inmunitaria de estos pacientes. Objetivos. Estudio inmunitario de un caso de CT8M. Pacientes y métodos. Se presenta el caso de un lactante de 7 meses con anomalías cardiacas, neurológicas, óseas, nefro-urológicas y rasgos dismórficos, diagnosticado de CT8M. Utilizando mAb específicos y dynabeads se han separado células de los diferentes linajes leucocitarios y mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) se ha determinado la presencia de trisomía 8. Se han llevado a cabo determinaciones rutinarias de expresión de marcadores de diferenciación leucocitarios y respuesta específica. Resultados. Del análisis citogenético mediante sonda centromérica (CEP8) y sonda completa (WCP8) resultó que la totalidad de las células B de sangre periférica mostraban trisomía 8, mientras que el resto de los leucocitos mostraban mosaicismo con aproximadamente la mitad de células trisómicas. Los datos de expresión en PBMC de CD3, CD4, CD8, CD11a/CD18, CD19, CD29, CD43, CD45, CD54, CD56, CD58 y TCR γδ, resultaron normales. Por la edad del lactante, se llevó a cabo un estudio de función B in vivo valorando respuesta IgM (Isohemaglutininas, G. hemático del lactante 0), resultando títulos 1:8-1:16 (anti-A) y 1:1 (anti-B). El niño está siguiendo el calendario de vacunación normal y a los 20 meses se le llevará a cabo un estudio serológico para valorar respuesta específica. Hasta el momento, los intentos de transformar las células trisómicas con el EBV han resultado infructuosos. 85. PRESENTACIÓN DEL REGISTRO ESPAÑOL DE INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (REDIP) ONLINE. Escobar D, Martínez-Pomar N, Milà J, Cambra A, Matamoros N. Servicio de Inmunología, Hospital Son Dureta, Palma de Mallorca. Introducción. El REDIP inició su desarrollo en 1993. Hasta enero de 2005 se registraron 2600 casos. A partir de dicha fecha se inició la implementación del REDIP en su versión Internet. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 93 INMUNOLOGÍA Objetivo: Se presenta el Registro Español de Inmunodeficiencias Primarias basado en su nueva aplicación en Internet (http://web.hsd. es/redip) desarrollada para facilitar la accesibilidad al análisis de los datos registrados e implicar en mayor medida a los facultativos. Metodología. La base de datos ha sido desarrollada con un acceso limitado a la información básica para el público y un acceso exclusivo a la base de datos para los usuarios previamente registrados. Resultados. El número de casos registrados desde su funcionamiento online es 511. Aproximadamente el 90% de los casos registrados se han realizado en las comunidades de Madrid, Andalucía, Islas Baleares y Cataluña. Hasta enero de 2005, en que se inició la implementación del REDIP online, se habían registrado 2600 casos, siendo la distribución por grandes grupos de diagnóstico: Deficiencias Predominantemente de Anticuerpos 68,0%; Inmunodeficiencias Combinadas 12,4%; Deficiencias del Sistema del Complemento 12,0%; Deficiencias de Fagocitos 4,5% y otras inmunodeficiencias 3,2%. En el registro online, cuyo funcionamiento se inició en enero de 2005, la distribución es: Deficiencias Predominantemente de Anticuerpos 74,0%; Inmunodeficiencias Combinadas 6,4%; Deficiencias del Sistema del Complemento 6,0%; Deficiencias de Fagocitos 3,1% y otras inmunodeficiencias 10,5%. La puesta en funcionamiento de la versión online del Registro Europeo en el año 2002 (ESID, http://www.esid.org) ha obligado al REDIP a crear una conexión online a través de la cual cada facultativo podrá enviar sus casos al ESID de forma centralizada a través del REDIP. Conclusiones. EL REDIP ha tenido una función de difusión y conocimiento demográfico, características clínicas y de tratamiento de las IDP en nuestro país que con la versión online favorecemos el mantenimiento, participación y consolidación del Registro. 86. ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA: 26 AÑOS DE EXPERIENCIA EN EL H.VALLE HEBRÓN. Caragol I1, Margareto C2 , Soler P2, Hernandez M1, Español T1. 1Unidad de Inmunología. 2Unidad de Inmunología Pediátrica, Hospital Universitari Vall d'Hebron, Barcelona. Introducción. La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es una inmunodeficiencia primaria poco frecuente (1/200.000) causada por defectos genéticos del sistema NADPH oxidasa que causa infecciones por organismos catalasa positivos y hongos. Objetivos. Evaluar las características clínicas e inmunológicas de los pacientes diagnosticados de EGC. Material y métodos. Pacientes diagnosticados de EGC en nuestro centro entre 1980 y 2006: Total 15 (11 niños y 4 adultos). Estudio de la capacidad oxidativa por el Nitroblue Tetrazolium Test (NBT) y por CMF a partir de 1995. Estudios mutacionales realizados en Zurich (Dr. J.P. Hossle), Ámsterdam (Dr. D. Roos) y Madrid (Dr A. Ferreira) Resultados. Niños: 11 varones. Datos al diagnóstico: edad media:37 meses; clínica, por orden de frecuencia: abscesos o adenopatías abscesificadas (Staphylococcus aureus, Serratia liquefaciens y Klebsiella sp.), neumonía (Rhodococcus equi, Salmonella typhimurium, Pneumocistis jiroveci), osteomielitis (Aspergilus sp), sepsis (Staphylococcus aureus), ITU (Klebsiella sp.) y aftas bucales. Evolución: 72 procesos infecciosos similares destacando 2 leishmaniasis diseminadas con síndrome hemofagocítico. Adultos: 2 varones y 2 mujeres. Edad media al diagnóstico: 23 años. Mortalidad total:33%(5/15): 4 sepsis y uno por complicaciones post-trasplante renal. Genotipo: Forma ligada al cromosoma POSTERS X: 7 niños y 2 adultos; Forma autosómica recesiva: 2 adultos; Sin estudio: 4 casos. Conclusiones. 1. Las características clínico-inmunológicas, edad al diagnóstico y genotipo de nuestra serie son similares a las publicadas. 2. Destacan la incidencia de Leishmaniasis y la infección por Rhodococcus. 87. BASES MOLECULARES DEL DÉFICIT DE C7 EN DOS FAMILAS ESPAÑOLAS. Barroso S1, Álvarez AJ1, López-Trascasa M2, Lara JM1, Guzmán C1, Morales C1, Núñez-Roldán A1, Sánchez B1. 1Servicio de Inmunología, HHUU Virgen del Rocío, Sevilla. 2Servicio de Inmunología, Hospital La Paz, Madrid. Las deficiencias de componentes del complemento se asocian con un aumento en el riesgo de padecer infecciones sistémicas recurrentes, principalmente por Neisseria meningitidis. Se han descrito diversas mutaciones que dan lugar a una deficiencia del componente C7 del complemento. En este trabajo, se han estudiado las bases genéticas del déficit de C7 en 2 pacientes no emparentados en los que se sospechaba una deficiencia de algún componente del complemento por presentar una historia de infecciones meningocócicas así como una actividad hemolítica en suero (CH50) indetectable. Un análisis subsiguiente reveló que los niveles de C7 en el suero de estos pacientes eran indetectables, por lo que se procedió a la amplificación y posterior secuenciación de los 17 exones del gen que codifica C7 para determinar las bases moleculares responsables del déficit. En el paciente 1 se encontró una mutación no descrita previamente en homocigosis; un cambio de una base en el exón 15 (C2107T) que da lugar a la aparición de un codón de parada que trunca la porción terminal de la proteína (Q681X). El padre del paciente 1, su madre y hermana eran heterocigotos para esta mutación y, sorprendentemente, los padres no se hallaban emparentados. En la paciente 2 se encontró otra mutación no descrita previamente en el exón 2 (G90A), que origina la aparición de un codón de parada que trunca prematuramente la proteína C7 (W8X); esta mutación se hallaba también en la madre y en una hermana de la paciente (hermana 1). Por otra parte, la paciente 2, su padre y sus 2 hermanas (hermanas 1 y 2) exhibían una mutación de cambio de sentido en el exón 9 (G1135C) que da lugar a un cambio de aminoácido (G357R). Esta mutación había sido descrita por vez primera en individuos de origen judío sefardita marroquí, aunque también la hemos encontrado en la población española. Es de interés resaltar que, aunque la hermana 1 presentaba los mismos defectos moleculares en el gen que codifica C7 que la paciente 2, se hallaba asintomática. En este estudio hemos detectado 2 mutaciones nuevas que originan déficit de C7 apoyando la idea de que las bases moleculares de esta deficiencia son heterogéneas, ya que en diferentes individuos aparecen distintos defectos moleculares. Por otra parte, algunos defectos tienen prevalencia en individuos de ciertas poblaciones o que viven en áreas geográficas definidas. 88. EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE RECEPTORES TOLL-LIKE (TLR) EN MONOCITOS DE PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN (IVC). Escobar D, Pons J, Iglesias J, Martínez-Pomar N, Matamoros N, Ferrer JM. Inmunología. Hospital Son Dureta. Introducción. La inmunodeficiencia variable común (IVC) es un grupo heterogéneo de desórdenes caracterizados por hipogammaglo- 93 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 94 POSTERS bulinemia e infecciones de repetición, principalmente respiratorias, causadas fundamentalmente por Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. Se han descrito mutaciones asociadas a IVC (ICOS, TACI, CD19) en algunos pacientes pero el defecto molecular subyacente es, en general, desconocido. Distintas alteraciones del sistema inmunitario han sido descritas en estos pacientes. Algunas publicaciones recientes apuntan a deficiencias en la maduración y función de las células dendríticas (CD) obtenidas a partir de monocitos de sangre periférica. Objetivos. Evaluar la funcionalidad del sistema inmunitario innato en monocitos de sangre periférica de pacientes con IVC, valorando la integridad y funcionalidad de los receptores toll-like (TLR). Metodología. Estudiamos por citometría de flujo la expresión de TLR-2 y TLR-4 en monocitos de sangre periférica, así como la producción de interleucinas (mediante CBA o ELISA) tras estimulación con distintos ligandos de TLR y extractos bacterianos de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. Resultados. La expresión de TLR-2 es significativamente mayor en los monocitos de los pacientes con IVC que en los controles. No hay diferencias en la expresión de TLR-4. La estimulación con algunos ligandos de TLR-2 (SLTA) y TLR-4 (LPS) induce mayor producción de TNFalfa por monocitos de pacientes con IVC que en controles. Sin embargo, no hay diferencias cuando los monocitos se estimulan con extractos bacterianos. Conclusión. Alteraciones en la expresión y función de TLR en monocitos de pacientes con IVC podrían explicar las deficiencias en la maduración y función de las CD descritas en algunos pacientes. 89. LACTANTE CON DEFICIENCIA DE ADA Y MUTACIÓN HOMOCIGOTA R235Q. Mora-López F, Nieto A, Bernal M, Rodríguez-Gutiérrez JF, Brieva JA, Sampalo A. Servicio de inmunología. Hospital Universitario Puerta del Mar. La deficiencia de ADA es la 2ª causa de Inmunodeficiencia Combinada Severa (IDCS) y la primera de las formas de herencia autosómica recesiva (AR). Se han descrito alrededor de 70 mutaciones causales, algunas con peculiar relación genotipo-fenotipo clínico. Reportamos el caso de un lactante varon de 2 meses y origen marroquí con esta inmunodeficiencia en el que hemos detectado una mutación homocigota (R235Q) en el exon 8 del gen codificante para la ADA. Se ha comprobado que en células de E. coli Sθ3834, la mutación R235Q produce una forma practicamente inactiva de la enzima. Dicha mutación sólo se ha descrito en en dos pacientes de origen japonés con deficiencia de ADA, en los cuales aparecía en heterocigosis compuesta con otras mutaciones del gen (Q119X y del314A). Es la primera vez que se encuentra esta mutación en forma homocigota como causante de IDCS. El paciente es además homocigoto para el polimorfismo D8N que produce una forma de enzima con actividad dism inuida, aunque no asociada a IDCS. El lactante debutó al més de vida con fiebre, diarrea, linfopenia, ulceras perianales y distress respiratorio. Los niveles de Ig eran indetectables, excepto una IgG de 508 mg/dl. La historia familiar sugería una posible herencia AR, ya que ambos padres eran consanguineos, y/o una herencia ligada a X: dos hermanos y tres tíos-abuelos paternos todos varones falleci- 94 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 dos en el periodo de lactancia. El fenotipo T- B- NK-/+ apuntaba a un defecto de ADA o de recombinación (RAG1, RAG2, Artemis). La gravedad y persistencia de las lesiones perianales (incluso se planteó una colostomía temporal) junto con la historia familiar sugerente, obligaron a descartar una posible EGC añadida. Una actividad enzimática de la ADA en eritrocitos prácticamente indetectable (< 0,07 UI/gHb) confirmó el diagnóstico en el paciente. El estudio de histocompatibilidad reveló que tanto el único hermano vivo como el padre eran HLA-identicos al paciente. A los dos meses se efectuó el trasplante de MO en el hospital Val´dHebron con evolución favorable hasta la fecha. Se discuten las peculiaridades clínicas y genéticas del caso. 90. INMUNODEFICIENCIA POR DÉFICIT DE ADENOSINA DEAMINASA (ADA): ESTUDIO DE UN CASO. Pruneda L1, VIDAL JR1, Tricas L1, Ramos Polo E2, BousoÑo C2, Concha Torre A2, Touza P2, Mayordomo J2, Benlloch T3, Hershfield MS4, Diaz de Heredia C5, Lera E5, Olive T5, Caragol I6, Español T6. 1Servicio de Inmunología, HUCA, Oviedo. 2Servicio de Pediatría, HUCA, Oviedo. 3Unidad de Diagnóstico de Enzimopatías, Departamento de Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid. 4Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA. 5Servicio de Hematología, Hospital Valle d'Hebron, Barcelona y 6Servicio de Inmunología, Hospital Valle d'Hebron, Barcelona. Paciente de 11 meses sin consanguinidad familiar que ingresa con neumonía intersticial debida a adenovirus. Su historial clínico a la edad de 6 meses mostraba: retraso en el desarrollo, frecuentes resfriados, dos infecciones respiratorias y un episodio de gastroenteritis. Sus niveles de linfocitos decrecieron de 1.000 a 90 linfocitos/mm3. Al ingreso presentó unos niveles de 78 linfocitos/mm3, siendo 39% LT (18% CD4+ y 16% CD8+), 22% LB y 24% NK. La mitad de los linfocitos T expresaban antígeno HLA-DR. El nivel de inmunoglobulinas era normal para su edad. La actividad enzimática de ADA en eritrocitos fue indetectable. Esta actividad fue normal en los padres, en niveles bajos (padre: 0,45 U/g Hb y madre: 0,33 U/g Hb) y también en una hermana de 3 años (0,98 U/g Hb). El análisis genético del gen ADA reveló que la paciente presenta dos mutaciones diferentes: L107P y R156C. El alelo L107P fue heredado del padre y el alelo R156C es de herencia materna. Ambos progenitores son heterocigotos y portadores de un alelo salvaje de ADA. La hermana de la paciente heredó ambos alelos salvajes. El estudio de histocompatibilidad, para la realización de un transplante de médula ósea, mostró que la paciente y su hermana eran idénticas. Sus grupos sanguíneos eran AB y B, respectivamente. La paciente fue sometida a un transplante de médula ósea sin tratamiento condicionante previo. Dos meses más tarde, mediante análisis de microsatélites de ADN, se observó quimerismo en la población linfoide. Transcurridos 9 meses del transplante de médula ósea la paciente evoluciona favorablemente, con niveles de linfocitos de 1335/mm3: 73% LT (33% CD4+ y 35% CD8+), 9% LB y 16% NK. La respuesta proliferativa frente a fitohemaglutinina y al antígeno toxoide tetánico y diftérico es normal. El grupo sanguíneo de la paciente continúa siendo AB. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 95 INMUNOLOGÍA POSTERS SESIÓN 6: AUTOINMUNIDAD-2 Moderadores: Julia Sequí Navarro (Madrid), Luisa María Villar Guimerans (Madrid) 91. CD4+FOXP3+ REGULATORY T CELLS ARE DECREASED IN PERIPHERAL BLOOD OF RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS. Chara L, Chevarria J, Diaz D, Sanchez A, Prieto A, Monserrat J, Albarran F, Cuende E, Perez A, Turrion A, Ubeda M, Muñoz L, Lario M, Nieto M, Sanchez M, Barcenilla H, Acuña L, Villarroel M, Alvarez-Mon M. CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid, Spain. Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital «Príncipe de Asturias», Alcalá de Henares, Madrid. Background. The balance between T regulatory cells and proinflammatory effector cells has shown to be a great relevance for the development and persistence of autoimmune disease, becoming this regulatory cell population important to the development of a therapeutic target of interest in autoimmune arthritic conditions such as rheumatoid arthritis. Objectives. To determine the distribution of T regulatory cells of peripheral blood of rheumatoid arthritis patients compared with healthy controls, and to relate that distribution with the disease activity. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 15 rheumatoid arthritis patients and 12 healthy controls were purified and characterized in a FACSCalibur analyzer using fluorochrome-labeled monoclonal antibodies for CD3, CD4, CD25 membrane antigens combined with intracellular staining of FOXP3 molecule. Likewise, the DAS28 score was calculated in each patient in order to determine the disease activity. Comparisons between patients and healthy controls were carried out using the non parametric Mann-Whitney test and considered significant when p< 0,05. Results. A significant decrease in the CD3+CD4+FOXP3+ cell population was found in peripheral blood lymphocytes from rheumatoid arthritis patients with respect to healthy controls, more over a significant decrease in the CD3+CD4+FOXP3+ cell population was found in peripheral blood lymphocytes of patients with active disease (DAS28 > 3,2), observing a negative correlation between the percentage of CD3+CD4+FOXP3+ and DAS28 score value (r= -0,78; p< 0,05). Conclusions. There is an important decrease of T regulatory cells in rheumatoid arthritis patients that correlates inversely with the disease activity, being this way an important therapeutic target and biological marker of this disease. 92. SPONTANEOUS AND INDUCED APOPTOSIS ARE MARKEDLY DECREASED IN T LYMPHOCYTE SUBSETS FROM PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS. Chara L1, Diaz D1, Sanchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Chevarria J1, Prieto A1, Albarran F2, Cuende E2, Perez A2, Turrion A2, Sanchez M1, Barcenilla H1, Acuña L1, Villarroel M1, Alvarez-Mon M1, 2. 1CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital «Príncipe de Asturias», Alcalá de Henares, Madrid. Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has been involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). We have analyzed the apoptosis in specifically defined naïve/effector/memory T lymphocyte circulating subpopulations of RA patients. Objective. To quantify spontaneous and induced apoptosis in lymphocytes of RA patients with regard to a control population of sex and age matched healthy individuals. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 RA patients diagnosed according to the Am C Rh criteria (4 with active untreated RA and 3 with refractory disease) and 5 healthy controls were purified and characterized using monoclonal antibodies and annexin V by eight color flow cytometry in a FACSAria sorter. The apoptotic index (AI) of lymphocyte subsets were determined after 24 hour culture under two conditions: spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinin induction. Results. A marked decrease in spontaneous ex vivo apoptosis was found in peripheral blood T lymphocytes from RA patients. This decreased apoptosis was found in effector (CD45RA+/–CD27), naïve (CD45RA+CD27+) and memory (CD45RA–CD27+) subsets of both CD4 + and CD8 + T lymphocyte subpopulations. Similar impressive decreases in AI were found in mitogen-induced T cell apoptosis. Apoptosis of lymphocytes from refractory RA patients was always lower than that found in T lymphocytes from active RA patients. Conclusions. Patients with active RA show an impressive decrease in spontaneous and mitogen-induced apoptosis within naïve/effector/memory CD4+ and CD8+ T-cell subsets. This decrease in T lymphocyte apoptosis was specially marked in refractory RA patients. 93. CHARACTERIZATION OF THE DISTRIBUTION OF THE MONOCYTIC AND DENDRITIC CELLS SUBSETS IN RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS. Chara L1, Diaz D1, Chevarria J1, Sanchez A2, Prieto A1, Albarran F2, Cuende E2, Perez A2, Turrion A2, Monserrat J1, Ubeda M1, Muñoz L1, Lario M1, Nieto M1, Sanchez M1, Barcenilla H1, Acuña L1, Villarroel M1, Alvarez-Mon M1,2. 1CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital «Príncipe de Asturias», Alcalá de Henares, Madrid. Background. Since the recent evolution of the immunopathologic thought proposes that reumatoid arthritis is an innate autoimmune pathology, the knowledge of the distribution of the different monocytic and dentritic cells (DC) subsets in these patients is important to understand the immunopathogenic process of this disease. Objectives. To determine the distribution of the different monocytic and dendritic cells (DC) subsets from rheumatoid arthritis patients compared with healthy controls, and to relate that subset distribution with the disease activity. METHODS: Peripheral blood mononuclear cells from 15 rheumatoid arthritis patients and 12 healthy controls were purified and characterized in a FACSCalibur cytometer using fluorochromelabeled monoclonal antibodies for CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD56, HLA-DR, and CD123 antigens. The DAS28 score was calculated in each patient in order to determine the disease activity. Comparisons between patients and healthy controls were carried out using the non parametric Mann-Whitney test and considered significant when p< 0,05. Results. A significant decrease in the percentage of CD14+highCD16- monocyte subset was found in peripheral blood from rheumatoid arthritis patients with respect to healthy controls, 95 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 96 POSTERS no significant differences were found in the CD14+lowCD16+ subset. On the other hand, a significant decrease in the percentage of plasmacyotid DCs (Lin-HLA-DR+CD123+CD11c-) subset was found in peripheral blood monocytes from rheumatoid arthritis patients with respect to healthy controls, as well as a significant increase in the myeloid DC subsets (Lin-HLA-DR+CD123-CD11c+high and Lin-HLA-DR+CD123-CD11c+ low). There were no significant differences in the distribution of these subsets between the patient group with active disease (DAS28 > 3.2) and the group with controlled disease (DAS28<3,2). Conclusions. There is an altered distribution of the different monocytic and dendritic cells subsets in peripheral blood of rheumatoid arthritis patients characterized by a decrease in the «classical» monocyte subset and a decrease in the plasmacytoid dendritic cell subset, probably due to their traffic to the inflamed synovial membrane. This phenomenon could be independent of the disease activity. 94. CITOQUINAS ANALIZADAS POR EL MÉTODO CBA EN EL LÍQUIDO SINOVIAL DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. Martínez-Lorenzo MJ, Royo-Cañas M, Anel A, Lasierra P, Rivas M, Larrad L. Instituto Aragones de Ciencias de la Salud y Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica inflamatoria caracterizada por una intensa activación inmune y una gran variedad de manifestaciones sistémicas. El proceso inflamatorio guía a la destrucción del cartílago y hueso. Aunque el proceso inflamatorio no se conoce muy bien, el gran número de células T infiltradas en la membrana sinovial y la producción local de citoquinas derivadas de células T sugiere que las células T tienen un papel importante en la respuesta autoinmune de pacientes con artritis reumatoide. En la artritis reumatoide parece haber una respuesta de tipo Th1 dominante, una subclase de células T CD4+. Sin embargo, las células T CD8+ parecen jugar un papel importante en la patología de la artritis reumatoide (Martínez-Lorenzo, 2006). El objetivo de este trabajo fue analizar la presencia de citoquinas en el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide en diferentes estadíos de la enfermedad comparando con líquido sinovial de donantes sanos (traumatismo leve). Las citoquinas analizadas fueron: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18, TNF-α e IFN-γ además del péptido citrulinado (CCP) y las proteínas de la familia del receptor del TNF en su forma soluble: Fas, FasL y APO2L. El método para analizar IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ fue el CBA-BD (Cytometry Beads Analysis), ELISA para IL18, Fas, FasL y APO2L, e inmunocaps para el péptido citrulinado. No se observaron diferencias importantes en la cantidad de IL-4, IL-6 y TNF-α en líquidos sinoviales de pacientes con AR respecto de donantes control. Se observó una ligera disminución en los niveles de IL-2. La disminución fue más acusada en el caso de la IL-10. Sin embargo, se observaron niveles elevados de IL-15 e IL-18. Dichos niveles aumentaron conforme aumentaba el grado de la enfermedad. Los niveles de IFN-γ y péptido citrulinado (CCP) fueron similares en donantes trauma o control respecto de pacientes con artritis reumatoide en estadíos I y II de la enfermedad. Sin embargo, los niveles tanto de IFN-γ como de CCP aumentaron 6 veces en el caso de líquidos 96 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 sinoviales procedentes de pacientes con artritis reumatoide en estadios III y IV. La cantidad de Fas soluble en los líquidos sinoviales de pacientes con AR fue el doble respecto de donantes trama o control. En cuanto a los niveles de FasL soluble, se observó que ésta aumentaba con el curso de la enfermedad. Los niveles aumentaron hasta 10 veces en los líquido sinoviales de pacientes en estadíos III y IV. Finalmente, el nivel de APO2L/TRAIL aumentaba conforme aumentaba el estadío de la enfermedad. 95. PURIFICACIÓN DE IGM OLIGOCLONAL FRENTE A FOSFATIDILCOLINA A PARTIR DE SUERO DE UN PACIENTE CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Sádaba MC, González-Porqué P, Álvarez-Cermeño JC, Espiño M, García-Barragán N, Gómez Rial J, Villar LM. Hospital Ramón y Cajal, Madrid. Antecedentes y objetivos. La presencia en líquido cefalorraquídeo (LCR) de IgM oligoclonal (BOCM) frente a lípidos de la mielina, mayoritariamente fosfatidilcolina (PC), predice un curso agresivo en los pacientes con EM. El objetivo de este trabajo es poner a punto un método para purificar dichos anticuerpos. Con el fin de estudiar su patrón de reconocimento celular. Material y métodos. Se partió para la purificación de 10 ml. de suero de un paciente que mostraba las mismas bandas oligoclonales de IgM frente a PC en suero y en LCR. Para obtener la fracción IgM se sometió el suero a cromatografía sobre Sephacril S-500 (Ge Healthcare). La concentración proteica de cada fracción se determinó mediante espectrofotómetría y se cuantificó IgG, IgM y albúmina de las mismas mediante nefelometría (BNII Dade Behring). 2- Los anticuerpos IgM específicos frente a PC se purificaron mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de octilsefarora a la que previamente se había unido PC. La unión de la PC a la columna re realizó mediante incubación con PC (Sigma), diluida a una concentración de 0,2 mg/ml en fosfato 50 mM, NaCl 3M. Para purificar la IgM frente a PC, la fracción de IgM total purificada se pasó a traves de dicha columna. La IgM específica unida a la PC se eluyó con glicina/NaOH 0,1 M pH 11,5. Se tituló la IgM específica frente a PC en el eluido, y paso de muestra, así como en la muestra original. Así mismo estudió su patrón de reconocimiento mediante isoelectroenfoque e inmunodetección. Resultados y conclusiones. Se ha puesto a punto un método para purificar IgM oligoclonal frente a PC a partir de suero de pacientes de EM. Con este método se han obtenido 25 µg de IgM específica a partir de 10 ml. de suero. Esto nos permitirá estudiar el patrón de reconocimiento celular de estos anticuerpos. 96. LA ELECCIÓN DEL ENSAYO PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTICARDIOLIPINA ES DECISORIA PARA DIAGNOSTICAR EL SÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDO (SAF). Cabezón A, Arribas F, Gil A, Cuesta MV, Madero R, Pascual-Salcedo D. Hospital Universitario La Paz, Madrid. Introducción. El síndrome antifosfolípido (SAF) es una forma de trombofilia autoinmune adquirida, asociado con una morbilidad y mortalidad significativa. Puesto que sus manifestaciones clínicas son comunes a otras causas, es imprescindible demostrar la presencia man- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 97 INMUNOLOGÍA tenida de anticuerpos antifosfolípidos [ac anti-cardiolipina (aCL), ac anti-beta-2-glicoproteina I (αβ2GPI) o anticoagulante lúpico (AL)], para establecer correctamente el diagnóstico del SAF. Sin embargo, la enorme variabilidad de los ensayos para detectar estos anticuerpos genera, en ocasiones, serias dificultades para el diagnóstico fiable del síndrome. Objetivo. Analizar las variaciones que existen en la detección de aCL y a‚2GPI entre distintos inmunoensayos en fase sólida (ELISA). Métodos. Se ha estudiado la presencia de aCL y αβ2GPI en sueros de 80 pacientes (40 para isotipo IgG y 40 para isotipo IgM) con manifestaciones trombóticas y ausencia de AL. Se han empleado ELISA de 12 laboratorios diferentes para los aCL y de 9 para los αβ2GPI y sus resultados se han comparado con los de los ensayos manuales(1,2). Además de las características propias de los antisueros y de los diferentes umbrales de corte, los ELISA difirieron fundamentalmente en la naturaleza del antígeno con que están recubiertas las placas. Para detectar aCL 4 ensayos recubren la placa sólo con cardiolipina, 4 emplean cardiolipina saturada con β2GPI humana, 2 emplean cardiolipina saturada con β2GPI bovina, 1 kit emplea una mezcla de 4 fosfolípidos, y en 2 de ellos no se especifica el origen de la β2GPI. Resultados. Los valores obtenidos mostraron una enorme variabilidad entre los distintos ensayos. La comparación estadística entre los ELISA para detectar aCL indicó una correlación baja entre los ensayos para los dos isotipos. El índice de correlación intraclase (ICI) tuvo valores máximos de 0,49 para aCL IgG y de 0,55 para aCL IgM, pero en algunos casos la correlación entre los ensayos fue prácticamente nula (ICI= 0,02). Los valores del índice <Kappa> (<K>) de concordancia cualitativa entre ensayos fueron a veces tan bajos (0,29 a –0,12 para IgG y 0,43 a –0,01 para IgM), que las coincidencias en los resultados podrían ser atribuibles estadísticamente al azar. En el ensayo de αβ2GPI los valores del ICI y del índice <Kappa> fueron más altos (ICI entre 0,84 a 0,24 para IgG y 0,99 a 0,29 para IgM y <Kappa> 0,67 a 0,11 para IgG y 0,76 a 0,32 para IgM), indicando que la variación interensayo para este anticuerpo fue menor. En los ensayos de algunas casas comerciales se detectaron pacientes con presencia únicamente de a‚2GPI en ausencia de aCL y AL. Conclusión. En pacientes con trombosis y sin actividad AL, la elección del ensayo para detectar anticuerpos anti-fosfolípidos es decisorio para establecer el diagnóstico de SAF. Dada la inconsistencia de los resultados resulta necesario llegar a un consenso metodológico para unificar las características de los ensayos en orden a esclarecer las dudas que aún persisten en el diagnóstico del SAF. Bibliografía 1. 2. Loizou S. et al. Clin Exp Inmmunol 62 (1985). Matsuura E. et al. J Exp Med 179 (1994). 97. UTILIDAD CLÍNICA DE LOS AUTOANTICUERPOS FRENTE A LA MUTACIÓN CITRULINADA DE VIMENTINA (ANTIMCV) EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE (AR). San Miguel A, Martín Santos J, Martin L, Alonso N, Iglesias R, Martin Gil FJ. Hospital Universiatario Rio Hortega. Valladolid. Introducción. La AR es una de las enfermedades sistémicas autoinmunes más frecuentes, cuya etiología se desconoce. El diagnóstico de AR depende principalmente de las manifestaciones clínicas. La vimetina es una proteína del citoesqueleto de diferentes POSTERS células, como células endoteliales, fibroblastos, condrocitos, osteocitos y leucocitos. La citrulinación es la pérdida del grupo amino de muchas proteínas por acción de deaminasas que transforman la Larginina en L-citrulina. Las deaminasas citrulinan vimetina entre otras proteínas del líquido sinovial. Por biotecnología se consiguió obtener formas mutadas de vimetina citrulinada (anti-MCV), lo cual mejoró el antígeno respecto del antígeno original descubierto en el año 1994, llamado vimetina citrulinada o anti CCP (anti-cyclic citrullinated peptides). Además de la especificidad y la sensibilidad, la concentración de anticuerpos anti-MCV expresada en U/ml, guarda correlación con el score de actividad para AR, y permite diferenciar formas agresivas de formas leves de la enfermedad. Hay que resaltar que la concentración de anticuerpos es influenciada por diferentes alternativas terapeuticas. El ensayo de MCV (Mutated-Citrullinated Vimetin) de Orgentec; es una técnica de utilidad para el diagnóstico de AR, especialmente cuando existe sospecha firme, y la detección del factor reumatoideo es no reactiva. También en pacientes que presentan episodios de dolor e inflamación articular, que no se pueden clasificar bien etiológicamente. Objetivos. Se han determinado los niveles de Anti-MCV en un grupo de 74 pacientes con AR de los cuales 17 eran varones y 57 mujeres, todos ellos diagnosticados clínicamente de AR. Comparandolos posteriormente con otros parámetros clásicos como son: PCR, FR, anticuerpos antinucleares (ANAs) título y patrón y anigenos extraibles del núcleo (ENAs), SSa, SSb, RNP, Sm y Scl-70. Material y métodos. Se ha utilizado un inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de autoanticuerpos tipo IgG frente a MCV (Orgentec) en 74 pacientes diagnosticados clínicamente de AR. Resultados y discusión. Hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas al comparar los valores de controles que eran 12 mujeres embarazadas sin AR, con una edad media de 31 ± 3,5 años, en comparación con los 74 pacientes de la Consulta de Reumatología y diagnosticados clínicamente de AR (15,9 ± 11,4 U/ml vs 87,3 ± 98,6 U/ml, p< 0,05), que tenían una edad media de 50 ± 15 años. Los niveles de PCR encontrados en los pacientes con AR, presentaron unos valores medios de 15,3 ± 20,5 mg/L y unos valores medios de FR de 93,3 ± 16,7 UI/L En cuanto a los ANAs fueron positivos en 9 pacientes y los ENAs, se distribuyeron: - 1 paciente: Título 1/160, Patron Homogeneo.-2 pacientes, 1/160, SSA+ y SSB+, 1 paciente 1/320.- 2 pacientes, 1/640, P.Centromero, SSA+ y SSB+. - 1/1.280, P. Homogeneo, SSA+. - 2 pacientes, 1/1.280 P. Espiculado, SSA+No hemos encontrado, asociación estadísticamente significativa al comparar mediante regresión lineal los valores de Anti-MCV y de FR, los de Anti-MCV y de PCR, ni al comparar los niveles de PCR y de FR (p > 0,05). Un estudio de literatura en 1.149 pacientes diagnosticados de AR comprobó la relevancia diagnóstica y el valor pronóstico del anti-MCV ELISA comparado con el anti-CCP ELISA. En un grupo de pacientes separado del estudio se demuestra que el anti-MCV ELISA solo es mejor marcador pronóstico que la combinación de anti-CCP y FR. También se encontró una buena correlación del anti-MCV y la actividad de la enfermedad con el DAS-Score. Estos resultados demuestran la superioridad de la vimentina citrulinada mutada de forma natural comparada con el fragmento sintético. La determinación de anti-MCV que en diferentes estudios ha demostrado ser un 98% más específica en pacientes con AR y tener una sensibilidad del 82%. Por tanto, se trata de un marcador precoz de AR temprana, y que en estudios prospectivos demostró la progresión de artritis no diferenciada en AR en el 40% de los pacientes. 97 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 98 POSTERS VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 98. EVALUACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CCP DE TERCERA GENERACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ARTRITIS REUMATOIDE EN POLIARTRITIS INDIFERENCIADAS TRAS 4 AÑOS DE SEGUIMIENTO. Caro-Oleas JL1, Fernández-Suárez A2, Porrino C3, Reneses S4, Wichmann I1, NúñezRoldán A1. 1Servicios de Inmunología y 4Reumatología, Hospitales Universitarios Virgen del Rocío, Sevilla. 2Área de Biotecnología (Análisis Clínicos), Hospital Alto Guadalquivir, Ándujar; 3Área Integrada de Biotecnología (Análisis Clínicos), Hospital de Poniente, El Ejido. 44 individuos con poliartritis indiferenciada, siendo todos FR y Ac. anti-CCP negativos. Conclusiones. A la vista de los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede concluir que la concurrencia de un resultado positivo para el FR y los Ac. anti-CCP en un paciente con poliartritis de inicio, que no cumpla los criterios diagnósticos de la ACR para el diagnóstico de AR, puede ser un útil indicador predictivo de la presencia de una futura AR. Introducción. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica cuya detección resulta difícil en estadios tempranos. Tanto el factor reumatoide (FR), que forma parte de los criterios de la American College of Rheumatology (ACR), como los anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (Ac. anti-CCP), han mostrado ser útiles para el diagnóstico y seguimiento de la AR. La dificultad para conseguir un diagnóstico definitivo de AR, o de otro tipo de enfermedad reumática, se refleja en los resultados recogidos en nuestro hospital en los que se encontró, que el 24% de los pacientes con poliartritis de inicio seguidos durante un año tras la primera consulta, no completaron los criterios diagnósticos de la ACR de ninguna enfermedad reumática, quedando clasificados como poliartritis indiferenciadas. El objetivo de este trabajo es realizar una nueva revisión a fecha de enero de 2007, tras cuatro años de seguimiento, de los pacientes con poliartritis indiferenciada que permanecían sin diagnóstico de certeza tras el primer año, y correlacionar los nuevos diagnósticos obtenidos con los niveles de Ac. anti-CCP y FR. Material y métodos. Se recogieron muestras de suero a todos los pacientes procedentes de Atención Primaria, Servicios de Urgencias y Consultas Externas de Reumatología que fueron derivados por primera vez a la Unidad de Poliartritis de Inicio del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. Todos ellos fueron incluidos (edad ≥ 16 años; tiempo evolución ≥ 4 semanas ≤ 1 año; 2 o más articulaciones inflamadas) en un registro informatizado prospectivo desde enero de 2002. Tras seguimiento de un año, desde la primera consulta, se establecieron los diagnósticos según los criterios de la ACR. Transcurrido este tiempo 56 individuos seguían manteniendo el diagnóstico de poliartritis indiferenciada. Se revisaron las historias clínicas de la totalidad de estos pacientes a fecha 1 de enero de 2007 (tras cuatro años de seguimiento), para verificar la aparición de otro diagnóstico diferente durante este tiempo. En todos ellos, se han determinado los Ac. anti-CCP utilizando el método QUANTA LiteTM CCP3 (3ª generación) IgG ELISA (INOVA Diagnostic Inc., San Diego U.S.A.) y el FR (anti-total) por nefelometría en BN® II (Dade Behring, Marburg, Germany) usando el método N latex RF method (Dade Behring) Resultados. Del total de 56 pacientes con poliartritis indiferenciada incluidos en este estudio, 12 casos completaban criterios diagnósticos para alguna enfermedad reumática. Los diagnósticos encontrados son 3 artritis reumatoide seronegativas, 8 artritis reumatoide seropositivas y una artritis psoriásica. Los niveles de Ac. anti-CCP fueron positivos (y elevados) en 5 de los 12 pacientes diagnosticados de AR, presentando también todos ellos FR positivo. Por otra parte, de los 7 pacientes con Ac. anti-CCP negativos, 6 fueron diagnosticados de AR (3 seropositivos y 3 seronegativos para el FR) y sólo uno mostró un diagnóstico distinto. El paciente con artritis psoriásica presentaba niveles muy bajos de Ac. anti-CCP y FR positivo. Tras cuatro años de seguimiento y tras ésta última revisión, todavía quedan 99. UTILIDAD DIAGNOSTICA DE LA CCP EN EL DIAGNOSTICO DE AR EN ELÁREA SANITARIA 1 DE LA COMUNIDAD DE MADRID. Pérez F, Lucendo MJ, Fragoso MA, Juan CS, Hernandez E, Garcia M, Herranz M. CEP Vicente Soldevilla, Area Sanitaria 1. Hospital Virgen de la Torre. 98 Introducción. Los anticuerpos frente a los péptidos citrulinados (CCP) han sido descritos recientemente y en poco tiempo han despertado un gran interés desde el punto de vista diagnóstico y pronóstico, para evaluar el riesgo de desarrollar Artritis reumatoide Material y métodos. Se han estudiado 300 sueros de pacientes, seriados remitidos a nuestro laboratorio para la evaluación del factor reumatoide. El estudio de CCP se realizó mediante el método de Elia CCP (Phadia, Uppsala, Suecia). Resultados. Con un punto de corte de 10 Elia U/ml, la sensibilidad para Elia CCP fue de 87,8% , especificidad 96,7%, frente a 62% y 80% respectivamente del factor reumatoide. El valor predictivo negativo y positivo fue de 97,8% y 95,3% para Elia CCP, frente a 87% y 92% respectivamente del factor reumatoide. Conclusiones. El mayor valor predictivo positivo de CCP sugiere ser un marcador de gran utilidad en la evaluación del riesgo e inicio de acciones preventivas. Elia CCP es el primer sistema de análisis totalmente automatizado para anticuerpos CCP existente hasta la fecha. 100.FRACTURA ATRAUMÁTICA DE METATARSO EN PACIENTE CON SÍNDROME DE ANTICUERPOS ANTIFOSFOLÍPIDOS. Alecsandru D1, Fernandez-Cruz E2, Rodríguez-Mahou M2, Rodríguez-Mendez A3, Carbone J2. 1Servicios de Inmunología, Hospital Clínico San Carlos y 2Hospital Gregorio Marañón, Madrid. 3Servicio de Medicina Interna, Hospital Virgen del Valle, Toledo. Introducción y objetivos. Las fracturas de stress de metatarsianos (sin traumatismo previo, en hueso sano) se producen como resultado de descargas repetitivas, cíclicas y de larga duración, y son más comunes en personas predispuestas como militares y atletas. Han sido descritas también en enfermedades metabólicas y más frecuentemente en el sexo femenino. El síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAAF) es una enfermedad caracterizada por episodios recurrentes de trombosis arterial o venosa y/o pérdidas fetales en presencia en suero de anticuerpos anticardiolipina (ACA) o anticuerpos anti-beta-2-gligoproteina I o presencia de anticoagulante lúpico. Entre las manifestaciones no-trombóticas del SAAF se encuentra la necrosis ósea avascular y el sitio más frecuente de aparición es la cabeza femoral. Presentamos una paciente con SAAF primario, con fractura de metatarsiano sin otros factores de riesgo. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 99 INMUNOLOGÍA Paciente y métodos. Paciente mujer de 43 años, sin factores de riesgo trombótico, que acude a la Consulta de Inmunología Clínica del HGUGM por presentar un episodio de trombosis de vena central de la retina de OI (confirmado por angiografía) en presencia de títulos elevados de ACA IgM. Antecedente: 3 episodios de epiescleritis. No presenta otra sintomatología sugestiva de proceso autoinmune sistémico. Se diagnosticó un SAAF primario y se inició tratamiento con acenocumarol (INR 2-3). Dos años después la paciente refiere dolor en el pie izquierdo sin otra sintomatología y tras un estudio radiológico se confirma el diagnóstico de fractura de 5º metatarsiano. Se descartaron factores de riesgo y traumatismo. Familiares: una hermana con tiroiditis autoinmune. Resultados. ACA IgM a títulos elevados en 4 ocasiones; positividad de anticuerpos anti-beta-2-glicoproteína-I IgM; anticuerpos antitiroglobulina (869-1553 UI/ml) con perfil tiroideo normal y sin manifestaciones clínicas; ANA positivos a título bajo (1/80), anticuerpos anti-ADN negativos; inmunoglobulinas séricas, complemento y actividad hemolitica del complemento normales; calcemia, fosfatasa alcalina y perfil metabólico normales. Estudio de otras coagulopatías normal. Conclusiones. Solo un caso de características similares (SAAF y sin otros factores de riesgo de fractura de metatarso) ha sido descrito en la literatura. Es probable que los microinfartos óseos aparecidos por la interacción de los anticuerpos antifosfolípidos con el endotelio vascular lleven a la lesión ósea y fractura posterior, aunque no se han demostrado signos de trombosis. La fractura de metatarso, una manifestación rara del SAAF, puede ser el primer síntoma de la enfermedad o aparecer durante su curso, lo cual se debe tener en cuenta para el oportuno diagnóstico y tratamiento. 101.ESTUDIO COMPARATIVO DE DOS ENSAYOS PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-SP100. Lucena JM, Montes Cano M, Caro JL, Respaldiza N, Alvarez A, Sánchez Román J, Núñez Roldán A, Wichmann I. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla. Los anticuerpos anti-Sp100 se han descrito en la cirrosis biliar primaria (CBP) con una prevalencia de entre 13-44%. Se ha propuesto que, incluso en ausencia de anticuerpos antimitocondriales, Sp100 podría ser un marcador para CBP. Por el contrario, otros autores han propuesto que este anticuerpo puede estar presente en otras enfermedades hepáticas distintas a CBP o en patologías del tejido conectivo. Puesto que el patrón típico de múltiple nuclear dots (MND) por inmunofluorescencia indirecta (IFI) correspondiente a Sp100 en ocasiones es difícil de interpretar, sobre todo en casos de solapamiento con otros anticuerpos, el desarrollo de ELISAs confirmatorios ha sido de gran ayuda. En este estudio se han comparado los niveles de anticuerpos anti-Sp100 de pacientes mediante dos ELISAs: (a) el kit Sp100 producido por IMTEC, Immunodiagnostica GMBH, Berlin, Alemania, y (b) el kit QuantaLite<TM> Sp100 producido recientemente por INOVA Diagnostics, San Diego, EEUU. Analizamos aquí la correlación entre ambos ensayos y comparamos su eficiencia para el diagnóstico de la CBP. También comentamos la reactividad en otras enfermedades. Estudiamos 77 sueros por IFI con el patrón típico de MND con los siguientes diagnósticos: 32 CBP, 5 hepatopatías no CBP, 12 Lupus eritematosos sistémicos (LES), 4 conectivopatías no LES, 6 enfermedades POSTERS esqueléticas, 2 enfermedades pulmonares fibrosantes, 5 enfermedades hematológicas, 12 casos con enfermedades misceláneas, incluyéndose además un grupo de control IFI negativo. La presencia de anticuerpos positivos a MND/Sp100 se detectó no sólo en enfermedades hepáticas, principalmente CBP, sino también en otras entidades clínicas, confirmándose por ambas técnicas. Los tests funcionan con la misma eficiencia, a pesar de su diferente sistema de cuantificación y diferente antígeno recombinante de cebado: (a) está basado en una curva standard clásica y (b) en una calibración semicuantitativa sobre un valor de corte. Discrepancias menores podrían explicarse por diferencias en el epítopo inmunodominante utilizado en los ELISAs. El antígeno usado en (a) es una secuencia recombinante truncada, inmunodominante, de 26 kD, correspondiendo a los aminoácidos 240-474, nucleótidos 7471454. El antígeno usado por (b) incluye varios segmentos de aminoácidos contenidos en la región 240-474. Las CBP AMA negativas mostraban niveles inferiores de Sp100. Los LES Sp100+ mostraban niveles elevados en ambos tests, reconociendo pues el mismo epítopo que las CBP. En resumen, concluimos que ambos ELISAs muestran una eficiencia similar en la detección de anticuerpos anti-Sp100 en pacientes MND positivos. El diagnóstico de CBP debe establecerse en el contexto clínico adecuado, dado que en otras enfermedades, especialmente el LES, también pueden estar presentes niveles elevados de anticuerpos antiSp100. SESIÓN 7: ALERGIA Y OTROS Moderadores: Ignacio Moneo Goiri (Madrid), Gonzalo Rubio Pedraza (Murcia) 102.INFLUENCIA DEL TIPO DE MEMBRANA DE HEMODIALISIS EN LA LINFOPENIA Y LA ACTIVACION LINFOCITARIA EN PACIENTES HEMODIALIZADOS. Hernández A1, Sánchez MA1, Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Pérez J3, Arriba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH. 2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá de Henares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara. Introducción. El deterioro de la función renal se asocia a alteraciones de las células mononucleares de sangre periférica en los enfermos de insuficiencia renal y la hemodiálisis acentúa estas alteraciones. Objetivo: Estudiar en que medida el tipo de membrana utilizada en el proceso de hemodiálisis afecta a las células mononucleares de pacientes de insuficiencia renal crónica comparando las alteraciones asociadas al proceso de hemodiálisis. Materiales y métodos. En el estudio se han incluido 12 pacientes de insuficiencia renal crónica, de características similares, divididos en dos grupos según la membrana de diálisis que se utilizó en el proceso (7 pacientes con membrana tipo FX-80 y 5 con P-17L). Se extrajeron células mononucleares de sangre periférica justo antes y después del proceso de diálisis. El estudio inmunofenotípico se realizó por citometría de flujo de 4 colores. Resultados. Los pacientes sometidos a hemodiálisis con membrana P17L presentan una menor linfopenia tras el proceso, además se obser- 99 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 100 POSTERS va una menor depleción de linfocitos B y linfocitos T tanto CD4 como CD8. Por otra parte el porcentaje de linfocitos CD71+, CD40L+, CD62L+ y CCR7+ se vieron incrementados tras la hemodiálisis con la membrana P17L mientras que el porcentaje de linfocitos CD86+ y CD25+ se vieron incrementados en el caso del uso de la membrana FX80. Conclusiones. La hemodiálisis realizada con la membrana P17L produce una menor linfopenia que la inducida por la membrana FX80. Sin embargo los pacientes sometidos a hemodiálisis con P17L presentan mayor grado de activación celular que los sometidos a hemodiálisis con la membrana FX-80. 103.REGULACIÓN DE LA CONTRACTILIDAD DE LAS CÉLULAS FOLICULARES DENTRÍTICAS POR CITOQUINAS. MuñozFernandez R, Tirado I, Blanco O, Mata C de la, Leno E, AbadiaMolina AC, Garcia Olivares E. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad de Granada. Las células foliculares dentríticas (FDC) son células de los folículos linfoides que participan en la respuesta secundaria de las células B y rescatan a estas células de la apoptosis. Nuestro grupo ha demostrado que las FDC son células mesenquimales relacionadas con las MSC (mesenchymal ítem cells). También hemos observado que las FDC se comportan como miofibroblastos, pues expresan alfa-SM-actina y presentan contractilidad in vitro. En el presente trabajo hemos estudiado la inducción de contractilidad por distintas citoquinas de las FDC con el método de contractilidad en geles de colágeno. Las citoquinas Th1, IL-2 e IFNγ incrementaron la contractilidad de las FDC, mientras que la citoquina Th2 IL10 produjo un descenso de la contractilidad de estas células. Otras citoquinas como el TNF y LTα1β2, implicadas en la diferenciación de las FDC, también incrementaron la contractilidad de las FDC. Al observar la expresión de alfa-SM-actina mediante inmunofluorescencia las células tratadas con las distintas citoquinas, observamos que aquellas citoquinas que inducían contractilidad de las FDC presentaban una mayor incorporación de alfa-SM-actina a las fibras de estrés, mientras la IL-10, que produce un descenso de la contractilidad, produjo una inhibición de la incorporación de esta molécula a las fibras de estrés. Estos resultados demuestran la participación de la alfa-SM-actina en la actividad contráctil de las FDC y la regulación de esta actividad por citoquinas. 104.DEFINICIÓN DE UN PERFIL DE ALERGENOS ÚTIL EN EL DIAGNÓSTICO IN VITRO DE ALERGIA EN LA POBLACIÓN PEDIÁTRICA DE CANTABRIA. Villegas Zambrano N, Sánchez Castañón M, Gómez C, López-Hoyos M. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario «Marqués de Valdecilla». La sospecha de alergia es una de las consultas más frecuentes en Pediatría. En el diagnóstico in vitro la práctica habitual consiste en realizar un cribado de alergenos aéreos y/o alimentarios mediante el empleo de sistemas con mezclas de alergenos. En caso de cribado positivo, debería determinarse las especificidades. Objetivo. Determinar la prevalencia de resultados de IgE específica en las muestras de pacientes pediátricos remitidos a nuestro laboratorio, con el fin de determinar el panel de IgE específica útil para su uso una vez obtenido un resultado de cribado positivo. 100 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 Métodos. Se analizaron los resultados de 369 pacientes pediátricos remitidos consecutivamente a nuestro laboratorio desde Atención Primaria y Especializada (Pediatría, Digestivo y Neumología) solicitando un panel de cribado de aeroalergenos o combinado. Se excluyeron los remitidos desde Alergología Pediátrica para evitar sesgos. Se determinó la IgE total sérica mediante nefelometría (BNII, Dade Behring) y la IgE específica mediante el sistema de CAP (ImmunoCAP250, Phadia), considerándose un resultado positivo de IgE específico todo aquel &#8805; 0,35 KUA/L. Resultados. Los alergenos frente a los que más IgE específicas se determinaron fueron: D. Pteronysimus (n= 254), espiguilla (n=278), hierba timotea (n=278), caspa de gato (n=225), caspa de perro (n=218), leche total (n=179), clara de huevo (n=131). De ellas, fueron positivos: 71%, 29%, 28%, 14%, 7%, 23% y 26%, respectivamente. El 41% de los pacientes fueron positivos al tiempo para D. Pteronysimus, espiguilla y hierba timotea. De los pacientes positivos para IgE frente a leche total, 33% fueron positivos para a-lactoalbúmina, 28% para b-lactoglobulina y 26% para caseína, mientras que el 26% no mostró IgE específica frente a ninguno de estos componentes. El 24% de los pacientes con IgE específica frente a la clara de huevo tuvieron también reactividad con la yema de huevo. Además, el 42% de los niños con IgE específica frente a la clara de huevo también la tuvieron frente a la leche total. Finalmente, la IgE específica frente a otros alergenos menos solicitados (A. Fumigatus, pollo, mariscos, pescados y otros alimentos), mostró un porcentaje de resultados positivos inferior al 5%. Conclusión. Aunque el estudio adolece de datos clínicos, desde un punto de vista de gestión del laboratorio los datos definen un perfil de IgE específica a emplear en caso de cribado de alergia in vitro positivo. En caso de cribado a aeroalergenos positivos, el perfil se compone de D. Pteronysimus, espiguilla, hierba timotea, caspa de gato, caspa de perro y, en caso de cribado a alimentos positivo, el perfil incluye clara de huevo y leche total. El resto de alergenos deberán solicitarse de forma específica por el Pediatra en caso de clara sospecha clínica. 105.ALTERACIONES DE LAS CIFRAS DE SUBPOBLACIONES MONOCITARIAS EN PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B). Sánchez MA1, Villarroel M1, Hernández A1, Mur S1, Barcenilla H1, Díaz D1, Prieto A1, Reyes E1, Monserrat J1, Sanroman IL3, Alvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC,IMMPA. Dpto. Medicina. UAH. 2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología.HUPA.Alcalá de Henares. 3Serv. de hematologia del Hospital Universitario de Guadalajara. Introducción. Los monocitos y macrófagos están involucrados en la respuesta antitumoral. Los monocitos de sangre periférica constituyen una población celular heterogénea de células que comprende varias subpoblaciones. Las principales subpoblaciones de monocitos son diferenciadas en base a la expresión de los marcadores CD14 y CD16. Así se distinguen diferentes poblaciones, una población CD16+CD14+ y otras dos quecarecen de la expresión de CD16 y que se diferencian por una mayor (high) o menor (low) expresión del antígeno CD14. Los pacientes con LLC-B presentan alteraciones linfocitarias fenotípicas funcionales pero se desconoce si presentan alteraciones en las cifras sanguíneas de subpoblaciones monocitarias. Objetivo: Caracterizar las cifras de las diferentes subpoblaciones monocitarias de sangre periférica en los pacientes con LLC-B. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 101 INMUNOLOGÍA Materiales métodos. Para el estudio inmunofenotípico se utilizaron células mononucleares de sangre periférica de 4 pacientes con LLCB sin tratamiento y de 4 controles sanos. En el estudio inmunofenotípico de las diferentes poblaciones de monocitos se utilizaron anticuerpos monoclonales frente a los antígenos CD14, CD16, CXCR1 y CD62L para su uso en citometría de flujo de 4 colores. Resultados. En los pacientes con LLC-B se observaron alteraciones significativas en el número absoluto de monocitos de sangre periférica con respecto a los controles sanos. Destacando un aumento del 50% del número de monocitos totales en los pacientes respecto a los controles sanos a su vez existe un aumento significativo del 24% en el número de los monocitos CD16+CD14+ y el 39% de los monocitos CD16-CD14+low. Por el contrario se observa una disminución significativa del 15% en los monocitos CD16-CD14+high. Estas alteraciones se observan también en los monocitos que coexpresan los marcadores CD62L y CXCR1, así los monocitos CD14+low que coexpresan esos marcadores se encuentran aumentados en un 137% con respecto a las cifras de los controles mientras que los monocitos CD14+highestán disminuidos en un 59%. Conclusiones. Las cifras sanguíneas de subpoblaciones monocitarias se encuentran significativamente alteradas en pacientes con LLCB. 106.APLICACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES EN LA DETECCIÓN DE DINOFLAGELADOS MARINOS MEDIANTE MICROSCOPÍA CONFOCAL Y CITOMETRÍA DE FLUJO. Garet E, Pérez D, Carrera M, Barreiro A, Muñoz S, Guisande C, González-Fernández A. Universidad de Vigo. Antecedentes. Algunas microalgas marinas son productoras de potentes toxinas que afectan a numerosas especies, incluido el hombre. Su sobrecrecimiento, conocido coloquialmente como mareas rojas tóxicas, provoca graves pérdidas económicas en actividades como acuicultura y pesca. Algas del género Alexandrium producen con frecuencia potentes neurotoxinas, que son acumuladas por organismos filtradores como el mejillón, causando intoxicación en los consumidores de estos organismos contaminados. La temprana y correcta identificación de estas especies tóxicas es crucial para poder tomar medidas preventivas. Tradicionalmente, la monitorización de las mareas rojas, involucra técnicas lentas y poco precisas como la identificación morfológica bajo microscopia óptica. Se propone como alternativa el uso de anticuerpos monoclonales, que aplicados al medio marino, ofrecerían ventajas como: sensibilidad, especificidad y rapidez, además de la posibilidad de automatizar fácilment e el estudio de muestras de plancton con técnicas como la citometría de flujo. Objetivos. Optimizar la identificación de la microalga Alexandrium minutum, utilizando anticuerpos monoclonales específicos obtenidos en nuestro laboratorio (M90.3 y M54.3), mediante citometría de flujo. Materiales y métodos. Cultivos monoespecíficos de microalgas de distintas especies del género Alexandrium, y representantes de otras clases filogenéticas, fueron mantenidos bajo condiciones controladas de luz y nutrientes. Células en fase exponencial de crecimiento se recogieron por centrifugación y se fijaron usando paraformaldehído. A continuación se lavaron e incubaron con los anticuerpos monoclonales M90.3 y M54.3. La reacción fue evidenciada con anticuerpos secundarios conjugados con biotina y streptavidina-FITC o -PE. Las células marcadas fueron analizadas mediante microscopía confocal y citometría de flujo. POSTERS Resultados. Ambos anticuerpos, M90.3 y M54.3, mostraron una tinción específica de la especie A. minutum, tanto por microscopía confocal como por citometría de flujo, sin observarse reacción cruzada con ninguna de las restantes especies testadas. El análisis mediante citometría de flujo, incrementa la rapidez y eficiencia de la detección de microalgas marinas. Conclusión. La aplicación de anticuerpos monoclonales específicos frente a una de las especies productoras de mareas rojas tóxicas, A. minutum, en técnicas de inmunofluorescencia utilizando citometría de flujo, puede ser una herramienta rápida, simple y altamente específica que permita la detección temprana de esta microalga en muestras de plancton marino. 107.INMUNODETECCIÓN DE LARVAS DE MEJILLÓN CON ANTICUERPOS MONOCLONALES: OPTIMIZACIÓN Y APLICACIÓN FUTURA EN MONITORIZACIÓN DE MUESTRAS DE PLANCTON. Pérez D, Lorenzo S, Alves D, Fuentes JM, González-Fernández A. Universidad de Vigo. El cultivo de mejillón se basa en el engorde de su semilla en cuerdas colgadas de estructuras flotantes llamadas «bateas». Para su colocación estratégica en las Rías, es crucial conocer la distribución espacio temporal de las larvas de mejillón. La dificultad estriba en que larvas de distintas especies de moluscos son muy semejantes (ostra, almejas, berberechos, etc.), lo que hace necesaria una caracterización morfológica individual de cada larva. Nuestro grupo obtuvo, en colaboración con grupos de investigación marina, anticuerpos monoclonales murinos frente a larvas de mejillón. Los anticuerpos (22,8 y 36,5) reconocen tanto a larvas de cultivo (obtenidas tras fertilización in vitro de los gametos), como de plancton. Con el uso de estos anticuerpos pretendemos diseñar un método rápido y riguroso, capaz de identificar a las larvas de mejillón, y que pueda ser aplicado en la monitorización rutinaria de muestras de plancton, evitando la técnica tradicional de observación de cada larva bajo microscopio óptico o electrónico. Para ello es necesario optimizar tanto el procesado de las muestras complejas de plancton (limpieza, separación de larvas), como los distintos pasos de la inmunodetección de larvas (tiempos mínimos de incubación, cantidad de anticuerpo requerido en inmunofluorescencia), así como la técnica más óptima (citometría, microscopía de fluorescencia o confocal) que permita el análisis de gran número de muestras de forma eficaz, y en el menor tiempo posible. En cuanto al procesamiento de las muestras, hemos optimizado un método que permite la separación de las larvas de los moluscos del resto organismos presentes en el plancton, en tan solo 2 minutos, mediante centrifugación con gradiente. Con respecto a la Inmunofluorescencia de las larvas, el trabajo realizado muestra que tras probar distintos tiempos de incubación para el anticuerpo primario (mínimo 5 y máximo 120 minutos), no encontramos diferencias significativas entre los distintos tiempos estudiados, mientras que es muy importante para los anticuerpos secundarios (siendo necesarios tiempos mínimos de 60 minutos). Con respecto a la técnica más óptima de detección, tanto el microscopio de fluorescencia como la citometría son válidos para la identificación de las larvas teñidas. Sin embargo, el tamaño de las larvas limita el uso de citómetros de flujo convencionales. Conclusión. Hemos conseguido adaptar la técnica para su uso en la rutina diaria del recuento de larvas de mejillón. La optimización del proceso de identificación de larvas de mejillón mediante inmunofluorescencia permite el procesado de un mayor número de muestras, con mayor rapidez y especificidad. La inmunodetección de larvas de meji- 101 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 102 POSTERS llón es una clara alternativa a la lenta y tediosa observación microscópica que se realiza actualmente. 108.MONITORIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE MXA, UN GEN INDUCIBLE POR INTERFERON ALFA, EN EL TRATAMIENTO DE LA HEPATITIS C CRÓNICA. Fernández-Arcás N, Ibáñez A, Miranda JM. Servicio de Inmunología, Hospital Carlos Haya, Málaga. Introducción. El interferón alfa, tratamiento de elección en la hepatitis crónica por Virus C, ejerce su actividad antiviral mediante la inducción de cientos de genes. Entre los más estudiados se encuentra el gen MxA, cuya expresión génica es considerada el parámetro más específico para medir la actividad biológica del interferón alfa, ya que es inducido específicamente y de manera dependiente de la dosis de interferones tipo I. Objetivo: Evaluar la expresión del gen MxA en diferentes etapas del tratamiento con interferón alfa, en pacientes afectos de hepatitis crónica por Virus C. Material y métodos. Se realizó un estudio programado desde el inicio del tratamiento con interferón pegilado, de 20 pacientes afectos de hepatitis crónica por el Virus C. El seguimiento de la eficacia de la terapia se comprobó mediante la determinación de la Carga Viral (CV) en sangre del virus C, en las semanas 0, 1, 4, 12, 24, 48 y 6 meses postratamiento. Los individuos con carga viral indetectable 6 meses después de finalizado el tratamiento fueron clasificados como «Respondedores Sostenidos» (RS) y como «No Respondedores» (NR) aquellos pacientes con carga viral positiva. La evolución de la expresión génica de MxA durante el tratamiento con interferón, se estudió mediante la cuantificación del RNA del gen MxA por PCR a tiempo real, con la misma periodicidad que la CV. Resultados. La respuesta sostenida al tratamiento con interferón fue del 70% (14 pacientes), siendo en todos ellos indetectable el virus en semana 4 del tratamiento. Por el contrario, el 30% (6 pacientes) se clasificaron como No Respondedores, con carga viral detectable en todos ellos en semana 4. Los niveles de RNA del gen MxA determinados para los pacientes RS, fueron equivalentes a los hallados en los pacientes NR antes de iniciar el tratamiento con interferón. En los pacientes NR no se observó variación en la expresión génica a lo largo del tratamiento, mientras que los pacientes RS incrementaron los niveles de RNA del gen MxA, una media de 1.10 veces en la semana 12 y una media de 1.31 veces en la semana 48 con respecto a la semana 0. Conclusiones. Aunque se observa un aumento en la expresión génica de MxA durante el tratamiento, que podría estar implicado en el éxito de la terapia con Interferón en los pacientes con Respuesta Sostenida, es necesario un estudio más amplio para valorar si éste discreto aumento puede asociarse realmente a una mayor eficacia en la eliminación del Virus C. Por otra parte, es muy interesante la observación de que todos los pacientes que No responden al tratamiento recidivan precozmente, ya que todos presentan carga viral positiva en la semana 4, mientras que la CV es negativa en todos los pacientes RS. Si estos datos se confirman en estudios más amplios, la determinación en semana 4 de la CV podría utilizarse como marcador precoz de respuesta al tratamiento con Interferón (actualmente se valora en semana 12), evitando de este modo 8 semanas de tratamiento y sus posibles efectos secundarios en pacientes cuya terapia es ineficaz. 102 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 109.CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS IgG, IgA E IgM, COMPLEMENTO C3 Y C4 Y PROTEÍNA C REACTIVA. ESTUDIO DE VARIABILIDAD INTER E INTRALABORATORIO TALLER DE INMUNOQUÍMICA 2006. Rodríguez Molina JJ1*, Villar Guimerans LM2*, Sequí Navarro J3*, Juárez Rubio C4*, Alsina Donadeu M5**, Amengual Guedan MJ6**, Cámara Hijón C7**, Ferrer Balaguer J8**, García Delgado R9**, García Pacheco JM10**; Jiménez Garófano C11**; López Hoyos M12**, López Trascasa M13**, Martínez Cáceres EM14**, Muñoz Calleja C15**, Nocito Colón M16**, Sanchez Mozo P17**, Varela Peña P18**. *Coordinadores Taller Inmunoquímica 2006. **Grupo de trabajo Taller Inmunoquímica 2006. 1H G U Gregorio Marañón, Madrid; 2H Ramón y Cajal, Madrid; 3H Carlos III, Madrid; 4H de Sant Pau. Barcelona; 5H Mútua de Terrassa; 6UDIATCD. Corporació Sanitaria Parc Taulí. Sabadell; 7H San Pedro de Alcántara. Cáceres; 8H Son Dureta. Palma de Mallorca; 9Fundación Jiménez Díaz . Madrid; 10H Virgen Arrixaca. Murcia; 11H Central de la Defensa. Madrid; 12H U Marqués de Valdecilla. Santander; 13H U «La Paz». Madrid; 14H U Germans Trias i Pujol. Badalona; 15H de la Princesa. Madrid; 16H Clínico de Valladolid; 17C H U Juan Canalejo. La Coruña y 18H 12 de Octubre. Madrid. Un aspecto básico en los procesos de aseguramiento de la calidad de los Laboratorios es el conocimiento objetivo de las condiciones técnicas de trabajo. La participación en los Talleres de Inmunoquímica de la Sociedad Española de Inmunología constituyen una herramienta de gran valor para la autoevaluación objetiva de la calidad técnica. En el Taller de Inmunoquímica 2006 se abordó un estudio de intercomparación consistente en la distribución de una muestra de suero procesada 10 veces consecutivas por los Laboratorios participantes para cuantificar las Inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, las proteínas de Complemento C3 y C4 y la Proteína C Reactiva. Cada Laboratorio siguió la metodología y procedimientos técnicos habituales de los respectivos Laboratorios. Los parámetros analizados están estandarizados por la Internacional Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.(IFCC). El objetivo inicial del estudio es evaluar la Variabilidad Inter e Intralaboratorio en el grupo de trabajo del Taller IQ 2006 en relación con los parámetros analíticos enumerados. Un segundo objetivo es la valoración de los errores aleatorio, sistemático y total para cada Laboratorio y parámetro y su comparación con tablas internacionales de errores máximos admisibles. Los resultados globales se muestran en la tabla adjunta: Parámetro IgG Media (mg/dL) 1128,92 Desv estándar (mg/dl) 52,00 % CV 4,61 Error máximo admisible (mg/dL) 225,78 IgA IgM C3 C4 Prot C React 234,79 130,25 13,33 7,60 5,68 5,84 161,80 33,58 9.88 2,72 6,11 8,11 1.10 nd nd 56,35 29,64 8,17 nd 36,47 Conclusiones del estudio. a) se ha podido evaluar los errores aleatorio, sistemático y total de cada Laboratorio para los parámetros considerados. b) los errores totales por parámetro en cada laboratorio son inferiores a los errores máximos admisibles. c) la homogeneidad de los laboratorios es aceptable, con la excepción de algunas diferencias observadas asociadas a diferencias en los reactivos utilizados. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 103 INMUNOLOGÍA POSTERS SESIÓN 8: CÉLULAS NB. CÉLULAS B Moderadores: Ángel Corbí López (Madrid), José Antonio Brieva Romero (Cádiz) 110. ALTERACIONES DE LAS CÉLULAS NK SEGÚN EL TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE LOS ENFERMOS DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA. Hernández A1, Sánchez MA1, Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Calvino M3, Arriba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1, 2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH. 2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá de Henares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara. Introducción. Los pacientes de insuficiencia renal crónica están sometidos a diversos tratamientos alguno de los cuales puede influir en su ya de por si alterado sistema inmune. Objetivo: Estudiar cómo afecta el tratamiento farmacológico al estado inmunológico de los pacientes de insuficiencia renal crónica. Materiales y métodos. En este estudio incluimos 33 pacientes de insuficiencia renal crónica (criterio de inclusión: creatinina plasmática>5 mg/dl y examinados en consulta de nefrología externa). Obtuvimos las células mononucleares de la sangre periférica y el estudio inmunofenotípico se realizó por citometría de flujo de 4 colores. Se compararon pacientes que están siguiendo un tratamiento farmacológico determinado, con los enfermos de insuficiencia renal crónica que no lo siguen. Resultados. Observamos que las mayores diferencias entre grupos de pacientes clasificados en función del tratamiento con respecto a aquellos que no reciben tratamiento se encuentran en las cifras de células Natural Killer (CD3-CD56+), que se ven aumentadas en un 68% en los pacientes tratados con hipolipemiantes. El aumento fue de un 30% en los pacientes tratados con análogos de vitamina D, de un 22% en pacientes tratados con anticoagulantes orales y de un 29% en los tratados con calcio. Por el contrario las cifras de células NK están disminuidas un 22% en los pacientes tratados con diuréticos y un 16% en aquellos pacientes tratados con fármacos antianémicos (hierro y sales de hierro). Conclusiones. Los pacientes de insuficiencia renal crónica tratados con hipolipemiantes, análogos de vitamina D, anticoagulantes orales y/o calcio, comparándolos con los pacientes que no siguen este tratamiento, tienen aumentadas sus cifras sanguíneas de células NK, al contrario que los pacientes tratados con diuréticos y con fármacos del hierro. 111. INMUNOSENESCENCIA Y CAPACIDAD DE CONJUGACIÓN DE SUBPOBLACIONES NK Y CÉLULAS NKT EN HOMBRES Y MUJERES. Martí S, Casero J, Rubio G. Inmunología, Bioquímica, Universidad Miguel Hernández, Hospital Universitario de Sant Joan, Sant Joan d'Alacant. Introducción. Durante la inmunosenescencia se producen cambios que afectan a la función de todos los componentes del sistema inmunitario. Estudios previos reflejan una disminución de la actividad NK y NKT en este proceso, aunque pocos datos informan sobre parámetros de conjugación de diferentes subpoblaciones NK y NKT. Objetivos. Determinar y establecer diferencias entre los parámetros de conjugación AUI, Á (relativo a la afinidad) y KD en diferentes subpoblaciones NK y NKT, en función de la edad y sexo. Metodología. Células mononucleares de sangre periférica se han marcado con anticuerpos monoclonales (mAb) frente a marcadores de diferenciación NK (CD3, CD56 y CD94/NKG2) diferenciándose 5 subpoblaciones NK diferentes: 56+94+, 56+94-, 56++94+, 56++94-, 56-94+ y 3+56+ (NKT). Se han analizado por citometría de flujo de 4 fluorescencias. Las subpoblaciones marcadas (FL2-4) se han separado mediante sorting y se han determinado las isotermas de conjugación a células K562.S5, subclón de la línea celular K562, obtenido por nuestro grupo que carece de receptor para Fc de inmunoglobulinas (CD32-), marcadas con CA-AM (FL1). Los donantes se han clasificado por edad (niños: 10 ± 2, jóvenes: 25 ± 5, adultos: 50 ± 5, ancianos: 75 ± 5) y sexo. Resultados y Conclusiones. En todos los grupos de edad y sexo CD56-CD94+ presenta los valores de AUI más altos (303 ± 13), mientras que en CD56++94+ son los más bajos (39 ± 11). CD56dim presenta valores de AUI significativamente más altos en hombres que en mujeres en todos los grupos de edad, mientras que en el resto de subpoblaciones los valores son, en general, similares. Las mujeres presentan más tendencia a mantener la capacidad de conjugación con la edad, sobre todo en CD56-94+. Tras tratamiento con IL-2, CD56bright muestra mayor capacidad de estimulación en todos los grupos de edad y sexo, mientras que los/as jóvenes presentan mayor respuesta a IL-2 que los ancianos en todas las subpoblaciones. Aunque nuestros datos señalan la existencia de un grupo de ancianos/as que mantienen valores altos de AUI, en general, se observa que la capacidad de conjugación es menor en niños/as que en jóvenes y que se produce una disminución de esta con la edad en todas las subpoblaciones estudiadas. 112. INFLUENCIA DE UNA DIETA RICA EN FLAVONOIDES DE CACAO SOBRE LA SÍNTESIS SISTÉMICA Y MUCOSAL DE INMUNOGLOBULINAS. Ramiro-Puig E, Ramos-Romero S, Pérez-Berezo T, Ramírez-Santana C, Pérez-Cano F, Castellote C, Permanyer J, Izquierdo-Pulido M, Franch A, Castell M. Facultad de Farmacia; Universidad de Barcelona. Introducción y objetivo. Está claramente establecido que la dieta tiene un papel importante en el mantenimiento de una óptima funcionalidad inmunitaria. Paralelamente, crece el interés por los alimentos funcionales, considerados como aquellos que, más allá de su valor nutritivo, ejercen efectos beneficiosos en el organismo. En este sentido, el objetivo del presente trabajo se ha centrado en establecer el efecto de dos dietas ricas en cacao, alimento rico en flavonoides, sobre la síntesis de inmunoglobulinas (Ig) tanto a nivel sistémico como intestinal. Material y métodos. Se ha dispuesto de ratas Wistar alimentadas con dos dietas ricas en cacao Natural Forastero (4 y 10%) desde el destete hasta las 6 semanas de edad. Tras 2 y 3 semanas de recibir la dieta, se han obtenido muestras sanguíneas y fecales, en las que se determinó la concentración de los principales isotipos de Ig por técnicas de ELISA. El último día, se extrajo el bazo para cuantificar su capacidad secretora espontánea de Ig mediante ELISPOT (IgA) y ELISA (IgM e IgG). También se obtuvieron ganglios linfáticos mesentéricos y placas de Peyer y se realizan lavados intestinales para determinar su capacidad secretora de IgA (ELISPOT y ELISA). Resultados. Las concentraciones séricas de IgG, IgM e IgA disminuyeron hasta un 63, 35 y 35%, respectivamente, en los animales sometidos a la dieta con 10% de cacao (P<0,01) y no se modificaron tras la dieta con 4% de cacao. La capacidad secretora de IgM e IgG de esplenocitos se cuantificó en sobrenadantes tras 3 y 6 días de cultivo. La secreción 103 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 104 POSTERS esplénica de IgM disminuyó significativamente en los animales sometidos a la dieta con 4% de cacao, alcanzando la máxima inhibición tras 3 días de cultivo (~66%, P<0,01). La dieta con 10% de cacao, además de reducir la secreción de IgM, inhibió la producción de IgG. Asimismo, esta misma dieta (10%) disminuyó el número de células esplénicas secretoras de IgA. En ganglios linfáticos mesentéricos, la capacidad secretora de IgA no se modificó por ninguna de ambas dietas. Sin embargo en placas de Peyer, el número de células con elevada capacidad secretora de IgA disminuyó tras la dieta con 10% de cacao. Este efecto se reflejó por una disminución de la IgA secretada al lumen intestinal, cuantificada en lavado intestinal y muestras fecales. Conclusión. Una dieta rica en cacao, a través de sus flavonoides u otros componentes, ejerce un efecto inmunorregulador de la síntesis de anticuerpos tanto a nivel sistémico como mucosal. 113. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DE LAS PROTEÍNAS SNARE EN LAS CÉLULAS NK HUMANAS. Delgado-Pérez L, Campos-Caro A. Unidad de Investigación. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz. El principal mecanismo por el que las células NK ejercen su actividad citotóxica es la exocitosis de los lisosomas de secreción. Existen varias enfermedades hereditarias en las que este proceso se encuentra alterado y entre ellas la causada por la mutación del gen de la sintaxina 11 un miembro de la familia de proteínas SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptors)- y la causada por la mutación del gen de la munc 13-4 -un regulador de las proteínas SNARE-. Sin embargo, y a pesar de que las proteínas SNARE se consideran en eucariotas los mediadores universales de la fusión entre membranas, se desconoce qué miembros de esta familia de proteínas participan en la exocitosis citotóxica de las células NK. Con la finalidad de identificarlos se realizaron técnicas de RT-PCR y western blot a partir de las líneas celulares NK-92 y NK-L (como modelo de célula NK con actividad citotóxica) e IM9 (como control de célula linfoide con actividad secretora dependiente de proteínas SNARE) así como de células NK aisladas de sangre periférica. Se identificaron los transcritos primarios y las proteínas correspondientes a varios SNARE previamente identificados como elementos de la vía exocítica en otros tipos celulares de origen hematopoyético: VAMP-2, 4, 7 y 8; Sintaxina 2, 3 y 4; y SNAP-23. En experimentos preliminares de microscopía de fluorescencia confocal realizados en la línea NK-92 se ha confirmado la expresión de algunas de estas proteínas y se ha obtenido información sobre su distribución intracelular. Así, la sintaxina 4 se distribuye por la membrana plasmática y VAMP-2, SNAP-23 y sintaxina-3 lo hacen en vesículas. Respecto a su distribución en relación con los lisosomas de secreción se observa que la de sintaxina-3 es coincidente y la de VAMP-2 es excluyente. En conclusión, las células NK humanas expresan proteínas SNARE cuya localización intracelular sugiere un posible papel de las mismas en la exocitosis de los lisosomas de secreción. 114. ALTERACIONES EN EL FENOTIPO Y FUNCIÓN DE CÉLULAS NKT INVARIANTES EN ANCIANOS SANOS. Gayoso I, Peralbo E, Pita ML, Tarazona R, Solana R. Hospital Universitario Reina Sofia. Sección Inmunología. Introducción. Está ampliamente descrito que la respuesta inmune se encuentra afectada con la edad, proceso denominado inmunose- 104 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 nescencia. La inmunosenescencia incluye tanto el descenso de la respuesta como de la función inmune. Recientes estudios realizados en nuestro laboratorio han incluido a las células «invariantes NKT» (iNKT) dentro de las poblaciones afectadas por el proceso de inmunosenescencia. Las células iNKT en humanos se caracterizan por la co-expresión del receptor NK CD161 y por la expresión de un receptor T (TCR) formado por una cadena Vα24JαQ y una cadena V‚11 que reconoce antígenos glucolopídicos presentados por un MHC-I no clásico denominado CD1d. El glucolípido α-Galactosil Cerámida (α-GalCer) esta identificado como un potente inductor de la activación de las células iNKT vía TCR. De acuerdo con la expresión de los marcadores CD4 y CD8 las células iNKT se pueden dividir en tres subpoblaciones: iNKTCD8+, iNKT-CD4+ y iNKT-Dobles Negativas. Tras la activación de su TCR, las células iNKT proliferan liberando citoquinas tipo Th1 y Th2. Las células iNKT actúan durante la respuesta innata del sistema inmune y está demostrada su implicación en la eliminación de tumores y en enfermedades autoinmunes en diferentes modelos experimentales. Objetivos. Estudio ex vivo del fenotipo y función, secreción de citoquinas y proliferación de células iNKT en sangre periférica procedente de donantes jóvenes y ancianos sanos. Metodología. Se obtuvieron las PBMCs de donantes jóvenes (1835 años) y ancianos (70-95 años) sanos. La identificación de las iNKT se realizó mediante fluorescencia multiparamétrica. Se utilizaron AcMo anti-Vα24, anti-Vβ11, CD8, CD4, y otros marcadores de diferenciación, así como anticuerpos anti-IFN-γ e IL-4. Para analizar la secreción de citoquinas las PBMCs se incubaron con PMA, Ionomicina y Brefeldina durante 6 horas La capacidad proliferativa se determinó mediante el marcaje con CFSE. Las células marcadas con CFSE se sembraron en medio de cultivo durante 5 días con IL-2 y α-GalCer. Resultados y conclusiones. Transcurridos 5 días de cultivo in vitro de las células iNKT-CFSE observamos una mayor proliferación en donantes jóvenes con respecto a los ancianos. Cuando observamos las diferentes subpoblaciones de iNKT vimos como las células iNKTCD4 son las que principalmente proliferan mientras que las células iNKT-CD8 quedan retrasadas en el crecimiento tanto en jóvenes como en ancianos. El análisis de la producción de citoquinas dio como resultado un incremento en la producción de IL-4 y IFN-γ en células iNKT de ancianos cuando se compara con los jóvenes. Con respecto a la caracterización fenotípica de las iNKT no encontramos grandes diferencias entre jóvenes y ancianos. En ambas poblaciones las células iNKT tienen un fenotipo: CD28+CD27+CD45RACD45RO+ CCR7-. El descenso de la capacidad proliferativa de las células iNKT de ancianos y el aumento de producción de IFN-γ y IL-4 indican que las células iNKT se encuentran entre las poblaciones linfocitarias afectadas por la inmunosenescencia. 115. PROMOTOR MÍNIMO REQUERIDO PARA LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DEL GEN BLIMP1 HUMANO. PedreñoHorrillo N, Mora-López F, Brieva JA, Campos-Caro A. Unidad de Investigación. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz. Los linfocitos B maduros tras entrar en contacto con el antígeno sufren un proceso de diferenciación a células plasmáticas (CP), cuya función es la secreción de Ig. En este proceso diferenciativo, como en otros, la regulación transcripcional juega un papel esencial, interviniendo en él diversos factores de transcripción. Entre ellos, destaca el Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 105 INMUNOLOGÍA represor transcripcional BLIMP-1 (B lymphocyte-Induced Maturation Protein 1) codificado por el gen PRDM1, que es considerado el regulador maestro en la diferenciación del linfocito B en CP, ya que su presencia es suficiente y necesaria para la diferenciación y el mantenimiento del fenotipo de la CP. Se sabe que BLIMP-1 reprime la expresión de genes como los del INF-β, MYC, PAX5, CIITA. Sin embargo, poco se conoce sobre la regulación transcripcional de su gen, PRDM1. Cómo tiene lugar esta regulación viene siendo nuestro objetivo en los últimos años. Mediante experimentos con genes reporteros hemos delimitado la región promotora mínima del gen, en la que localizamos varios elementos «cis» capaces de regular la expresión de BLIMP-1. Para estudiar factores de implicados en esta regulación se han utilizado técnicas de retardo en gel (EMSA) mediante experimentos de competencia y supershift. Se ha identificado un elemento «cis» clave para la expresión del gen: una GC-box a la cual se une el factor de transcripción Sp1 y diferentes isoformas del factor Sp3. La mutación o la deleción de esta secuencia impide la actividad del promotor del gen. Solapada con esta GC-box existe un sitio de unión para el factor Egr-1. El tratamiento de las células con PMA + Ionomicina aumenta la unión del factor Egr-1 al promotor y aumenta la actividad del gen reportero, sugiriendo que este factor puede regular positivamente la expresión de BLIMP-1. La unión de estos factores se ha comprobado tanto en ensayos in vitro como in vivo, mediante inmunoprecipitación de cromatina. 116. CO-EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES CD94/NKG2A Y CD94/NKG2C EN LA SUPERFICIE DE UNA SUBPOBLACIÓN DE CÉLULAS NK. Sáez-Borderías A, Romo N, López-Botet M. Universidad Pompeu Fabra. Los heterodímeros tipo lectina CD94/NKG2A y CD94/NKG2C son receptores con función inhibidora y activadora respectivamente que interaccionan con HLA-E y se expresan en subpoblaciones de células NK y de linfocitos T. NKG2A presenta ITIM (immunoreceptor tyrosinebased inhibition motifs) citoplásmicos y se asocia a la tirosina fosfatasa SHP-1, mediante la cual inhibe la señalización de otros receptores. Por el contrario NKG2C se ensambla con el adaptador DAP12 activando vías dependientes de tirosina quinasas. La función de estas moléculas se ha estudiado en células NK que expresan una u otra selectivamente, sin embargo hay indicios de que ambas pueden transcribirse simultáneamente en algunos clones. Por medio de anticuerpos monoclonales (AcM) específicos analizamos su distribución y posible coexpresión en la superficie. Los estudios fenotípicos realizados con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos (n=159), presentaron una proporción variable de células NK (CD3-CD56+) NKG2A+ (rango= 6,1-69,8%, media ± SD = 34,2 ±13,2), y de NKs NKG2C+ (rango= 0,2-84,2%, media ± SD= 15,4±14,7), y demostraron la existencia de una subpoblación de células NK que presentan ambos receptores en la superficie (rango = 0,5-18,2%, media ± SD = 3,2 ± 2,5%). Por otra parte, el análisis de un panel de clones NKG2C+ indicó que la expresión de NKG2A en la superficie puede inducirse de forma transitoria tras la estimulación con PBMC irradiadas e IL-2; se obtuvieron resultados similares incubando las células con IL-12 (20ng/ml durante 5 días). Los ensayos de lisis redirigida utilizando AcM específicos demostraron que ambos receptores pueden desempeñar sus funciones contrapuestas en el mismo clon. Se requieren mas estudios para valorar las implicaciones fisiológicas que puede tener la expresión en la misma célula de receptores inhibidores y activadores específicos para HLA-E. POSTERS 117. REGULACIÓN POR LAS CÉLULAS NK DE LA RESPUESTA ESPECÍFICA DE LOS LINFOCITOS T CD4+ AL CITOMEGALOVIRUS HUMANO. Romo N, Gumà M, López-Botet M. Universidad Pompeu Fabra. Las células NK participan en la respuesta inmunitaria innata frente al citomegalovirus (CMV), secretando citocinas proinflamatorias y destruyendo las células infectadas. Por otra parte, se ha propuesto que las células NK podrían regular el desarrollo de la respuesta específica. La incubación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos seropositivos (CMV+) en presencia del virus promueve una expansión oligoclonal de linfocitos T citotóxicos CD4+ específicos. En estas condiciones experimentales hemos observado que el tratamiento con un anticuerpo F(ab')2 anti CD94 soluble inhibe dicha expansión sugiriendo que las células NK podrían estar implicadas en el proceso. Para analizar el hipotético papel regulador de las células NK en la respuesta adaptativa de los linfocitos T CD4+ al CMV realizamos experimentos de fraccionamiento celular, estimulando diferentes poblaciones leucocitarias con el virus y analizando su respuesta (secreción de IFNγ y/o proliferación). La estimulación de linfocitos T CD4+ purificados en presencia del CMV y de células dendríticas mieloides (mDC) autólogas, generadas cultivando monocitos con IL4 + GM-CSF, y maduradas posteriormente tras la estimulación con LPS, promovió una respuesta específica (secreción de IFNγ) frente al virus. La adición en este ensayo de poblaciones de células NK, CD94/NKG2A+ o CD94/NKG2C+ purificadas, potenció la secreción de IFNg de los linfocitos T CD4+ en respuesta a concentraciones subóptimas de CMV. En conjunto los resultados indican que las células NK pueden contribuir a estimular la respuesta adaptativa al virus. Se requieren mas estudios para analizar el papel de las NK en la expansión de las células T CD4+ en este sistema. 118. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DEL COMPARTIMENTO NKT DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE Y OSTEOARTRITIS. IMPLICACIONES BIOLÓGICAS DEL TRATAMIENTO. Villarroel M1, Sánchez MA1, Sánchez-Atrio A2, Zaldivar G1, García JDD3, Pérez-Gómez A2, Cuende E2, Lopez A2, Albarran F2, Monserrat J1, Mallo AB1, Reyes E1, Álvarez-Mon M1-2. 1Laboratorio de Enfermedades del Sistema Inmune y Oncología. Unidad I+D Asociada CNB-CSIC. Dpto. Medicina. UAH. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune y Oncología. HUPA. 3Servicio de Medicina Interna. HUPA. Alcalá de Henares. Introducción. La intensidad del tratamiento en pacientes con artritis reumatoide (AR) esta directamente relacionada con la acción biológica de los fármacos empleados. Las diferentes estrategias terapéuticas van desde el uso de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), glucocorticoides (GC), fármacos modificadores de la enfermedad -FAME- sintéticos (FAME S), FAME biológicos (FAME B) o terapia combinada entre estos grupos (FAME B-S). Las células NKT han sido implicadas en la regulación de la respuesta inflamatoria, entre otros mecanismos, por la eliminación de linfocitos autorreactivos. Objetivo. Analizar el compartimento NKT en sangre periférica (distribución porcentual y número absoluto de células por uL) en pacientes con AR, considerando la estrategia terapéutica empleada, en un estudio observacional transversal. Se incluyen pacientes diagnosticados de osteoartritis (OA) como control de enfermedad. 105 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 106 POSTERS VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 Métodos. 33 pacientes diagnosticados de AR, 24 con OA y 28 controles sanos (CS) incluidos en este estudio. Los pacientes con AR fueron estratificados según la estrategia terapéutica en 5 grupos: a) pacientes sin tratamiento (N=3); b) tratados con FAME S - AINEs- (N=9); c) terapia combinada con FAME S - GC- (N=9); d) terapia con FAME B y GC (N=2) y e) FAME B-S (N=10). El estudio de la distribución de las células NKT y de su estado de activación se determinó mediante citometría de flujo de 4 colores y el uso de anticuerpos monoclonales (CD56, CD3, CD8, CD57, CD16). El grado de significación fue establecido para valores P< 0,05. Resultados. el número de células NKT (Mediana) en pacientes con AR tratados con FAME B-S (153 cels/uL) fue significativamente superior que el encontrado en pacientes con AR sin tratamiento, tratados con FAME S-AINEs, pacientes con OA y CS (44, 89 y 111 cels/uL respectivamente). En esta población el número absoluto de células NKT CD8+CD57+ fue superior en el grupo tratado con FAME B-S (60 cels/uL) respecto al grupo sin tratamiento (22 cels/uL). El porcentaje de células NKT CD16+ se encuentra incrementado en pacientes tratados con FAME B-GC (63,7%) respecto a aquellos tratados con FAME S-AINEs, OA y CS (44,0%, 40,0%, 38,2% respectivamente). Conclusión. En terapias con FAME B en las que se establece una mayor respuesta biológica existe una normalización (Combinada con GC) o un incremento (Combinada con FAME S) en las cifras absolutas de células NKT. Sin embargo las terapias basadas en FAME S y AINEs o GC se asocian a una disminución en el número absoluto de estas células. Por lo tanto las diferentes estrategias terapéuticas en pacientes con AR se asocian con una redistribución en sangre periférica de células NKT. SESIÓN 9: TRASPLANTES Moderadores: Jaume Martorell Pons (Madrid), Luis Larrad Mur (Cádiz) 119. ESTUDIO DESCRIPTIVO DE ACTIVIDAD DEL BANCO Y REGISTRO DE DONANTES DE MÉDULA ÓSEA DE LA REGIÓN DE MURCIA (SURESTE DE ESPAÑA)(1994-2005). Rojas G, López-Bermejo A, Botella C, Moya-Quiles MR, Campillo JA, Alemany JM, López M, Sanchis MJ, Álvarez-López MR, Muro M. Fundación Española para la Lucha contra la Leucemia & Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia. The international collaboration of 75 blood stem cell registries in 42 different countries around the world over the course of 16 years is an unprecedented example of global altruism directed to helping patients irrespective of their national ethnic origin. In this sense, Spanish bone marrow donor registry (REDMO) is member from the WMDA (World Marrow Donor Association), contacting with all donor registries worldwide (BMDW-Bone Marrow Donors Worldwide). The REDMO is placed in sixth position of Europe and USA ranking. The Bone Marrow Donor Registry from Murcia Region is included on REDMO and is reference centre of Autonomous Government of Murcia. Our objective was to perform a descriptive study of the activity of the Marrow Donors Registry from Murcia Region. All donors in the Bank of bone marrow from 1994 until 2005 were included. This study analysed the number of donors, their origin, resolution level and performed donor searches activity. Donors were typed by serological and molecular PCR-SSO and -SSP techniques. The Bank of bone marrow approximately contains 106 4000 voluntary donors typed in low- and high-resolution. A total of 721 donor searches have been performed. Donor's origin according to several Areas of Health in which the Autonomous Community of Murcia and other provinces will be discussed. Briefly, the procedence of donors respect to the Health Areas was: Area I (28%), Area II (18%), Area III (23%), Area IV (6%), Area VI (10%) and other provinces (12%). In conclusion, an increase is observed in the number of annual donors as well as a very marked increase of donor searches that are performed every year, especially from 2004. However, donors of all ethnic groups other than Western European origin are still underrepresented in all database of blood stem cell donors. 120.PREVALENCIA AUMENTADA DE INFECCIONES GRAVES EN PACIENTES CON TRASPLANTE HEPÁTICO POR INFECCIÓN POR VHC: IMPLICACIÓN DE FACTORES INMUNOLÓGICOS. Micheloud D, Resino S, Salcedo M, Bañares R, Rincón D, Rodríguez-M JJ, Fernández-Cruz E, Carbone J. Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón. Madrid. Introducción. Uno de los factores que influyen en la morbi-mortalidad en el transplante hepático ortotópico (THO) es la infección, que suele presentarse en los primeros 90 días post-THO. El 75% de los pacientes que reciben un THO tienen alguna complicación infecciosa en el primer año. La cirrosis vírica, secundaria al Virus de la Hepatitis C (VHC), es la etiología más frecuente de THO en Europa. Objetivo. Estudiar la prevalencia de complicación infecciosa y factores inmunológicos asociados en el THO por VHC. Material y métodos. Estudio prospectivo (Noviembre 2004-Junio 2006) de 46 pacientes sometidos a THO. Criterios de inclusión: a) pacientes con cirrosis por VHC que requerían THO (grupo-VHC = 20 pacientes); b) pacientes con cirrosis enólica y THO (grupo no-VHC, control = 14 pacientes). Se excluyeron pacientes con cirrosis por VHC asociada a otras etiologías como hepatocarcinoma; fallo hepático fulminante y hemocromatosis. Se incluyeron en el estudio 34 pacientes. Todos los pacientes recibieron tacrolimus más glucocorticoides a bajas dosis. Se agregó mofetil micofenolato cuando se observó efectos colaterales del tacrolimus. Evento Infeccioso: Infección grave según criterios CDC. Estudios inmunológicos: Pre-THO, 7, 30 y 90 días post-THO. Parámetros: IgG, IgA, IgM, C3, C4, FB, PCR (nefelometría); subpoblaciones CD3, CD4, CD8, CD56, CD19 (citometría de flujo de 4 colores). Resultados. 16 pacientes presentaron infecciones graves en el grupo-VHC (tiempo medio post-THO: 50 días) en comparación con 6 pacientes en el grupo control (tiempo medio post-THO: 16 días, RR 2,99, p<0,05). La infección bacteriana fue predominante en ambos grupos incluyendo neumonía y bacteriemia. Alteraciones inmunológicas: En comparación con el grupo control, en el grupo-VHC se observó: En el estudio pre-THO: porcentajes menores de linfocitos T-CD4+, niveles más bajos de IgA sérica y cifras más altas de C3, FB y PCR; A los 7 días post-THO: porcentajes menores de células T-CD8 y de IgA sérica y niveles más bajos de IgA. En el grupo-VHC se observó una expansión transitoria del número de células B CD19+ a los 7 días post-THO, con disminución posterior a los 30 y 90 días (en posible relación con el rebrote de carga viral VHC descrito en estos pacientes tras el THO). Los pacientes de ambos grupos presentaron niveles significativamente más bajos de IgG, IgA e IgM a los 7 días post-THO en comparación con sus niveles basales. Conclusión. En pacientes VHC sometidos a THO se observa una mayor prevalencia de complicación infecciosa. Alteraciones inmunológicas sugestivas de un estado de inmunodeficiencia celular y humo- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 107 INMUNOLOGÍA ral podrían predisponer a los pacientes a esta mayor tendencia a padecer infecciones. 121.NUEVA HERRAMIENTA INFORMATICA PARA EL MANEJO DE LABORATORIOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD. Cano J, Recio R, Gallardo JJ, García L, García A, Lavado R, Romero MJ, Miranda JM, Fernández N, Caballero A, Alonso A. Servicio de Inmunología. Hospital Regional Carlos Haya. El laboratorio de histocompatibilidad recibe un gran numero de muestras a las que hay que aplicar distintos procedimientos analíticos según la finalidad del estudio. Además, en algunos casos ha de realizar procedimientos de urgencia si participa en trasplante de órganos. Presentamos un programa informático que permite tener un laboratorio «sin papel». Entre las características de este programa, llamado «HLA» (Histocompatibility Laboratory Assistant) destacan: • Manejo de muestras aisladas y muestras vinculadas en familias. • Búsquedas automatizadas del receptor idóneo atendiendo a varios criterios seleccionables. • Manejo de sueros para citotóxicos y otro cualquier tipo de anticuerpos, incluidos los detectables por tecnología luminex. • Selección de antígenos HLA de listas desplegables y modificables por el usuario. Almacenamiento completo del resultado, incluyendo las imágenes de geles. • Acepta resultados de baja y alta resolución. • Impresión de resultados en papel o envío a lugares remotos en pdf. • Manejo de muestras de rutina, controles de calidad y proyectos de investigación en histocompatibilidad. • Alarmas: a) mismatches donante-receptor, b) mismatches repetidos en trasplantes sucesivos y c) presencia de anticuerpos en sueros contra antígenos del donante. • Trabajo en red. 122.ALOANTICUERPOS HLA CLASE I Y CLASE II POST-TRASPLANTE Y EVOLUCIÓN DEL IMPLANTE RENAL: EXPERIENCIA DE UN CENTRO. Lucas D1, Llorente S2, Botella C, González-Soriano MJ2, Salgado G1, López M1, Sanchis MJ1, Alemany JM1, Minguela A1, Gimeno L2, Álvarez-López MR1, Muro M1. 1Servicios de Inmunología y 2Nefrologia, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia. Despite the progress in renal transplantation (Tx), acute rejection and graft failure still occur and chronic rejection continues to be the main problem in long-term allograft survival. Post-Tx monitoring of DSA HLA IgG antibodies has been suggested to be an important tool for graft outcome. However, not all patients with failed kidney Tx have anti-HLA antibodies, indicating that other loci may be involved (ECA, MICA, etc). Collaborative studies are needed for dilucidate the role of HLA antibodies in chronic rejection. Our objective was to investigate the experience in our center with those patients included in the study of 14th International Histocompatibility Workshop submitted to this Component. Screening of pre- and post-transplant sera from 209 renal allograft recipients for IgG anti-HLA class I and class II antibodies were performed (LabScreen, OL, CA). These patients was included to have survived more than 6 months post-Tx. Data of donor-recipient HLA matching, previous Tx, % pre-Tx PRA and immunosuppressor regimen POSTERS were compared. One year later follow-up clinical data were evaluated with respect to allograft status. The percentage of patients with IgG antibodies class I was 15.8%, 4.3% with class II and 23.9% class I+II. Thus, 44% of patients had HLA IgG antibodies. However, among patients whose transplant failed, 60% (40% class I+II, 20% class I and 0% class II) had DSA anti-HLA IgG antibodies compared with 43.1% (23% class I+II, 15% class I and 4% class II) of those with functioning kidney. Comparing only HLA class I antibodies this difference is even higher (60% vs 38.7%). Indeed, all graft failures were suffered for patients with CsA, MMF and prednisone treatment. In conclusion, these data indicate that, a correlation exists between post-transplant HLA IgG antibodies apparition and kidney transplant outcome. 123.ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE UN CASO DE RECHAZO HUMORAL ACELERADO: VALORACIÓN DE LAS ESPECIFICIDADES ANTI-HLA Y DE LOS EPÍTOPOS IMPLICADOS EN LA RESPUESTA. Marín-Crespo N, Rubio-García M, CamposEsteban J, Andres-Martin A, Castañer-Alabau JL. Hospital Ramón y Cajal. Madrid. Mujer de 43 años con IR secundaria a poliquistosis hepatorrenal en hemodiálisis desde 11/2004, HTA, hiperPTH secundario y nefrectomía derecha en 07/2005. No transfusiones previas, tres hijos vivos, no abortos, no trasplantes previos. Tipaje HLA: A11 A23 B27 B44 Bw4 DR1 DR7 .Presenta sensibilización previa frente a los antígenos HLAA29+31+32+33+68 y frente a HLA-II, con valores de PRA del 37 al 54%. Recibe un primer injerto renal en 06/2006 con las incompatibilidades A2 A24 B51 B39 Bw6 DR8 DR14 y prueba cruzada negativa con suero actual y previos. Terapia inmunosupresora inicial con Prednisona, Tracolimus y Everolimus. Presenta síntomas y signos de rechazo renal a partir del 5º día post-Tx, biopsia en día 7 en la que se observa necrosis fibrinoide segmentaria, lesión intersticial severa con intenso infiltrado inflamatorio (PMNs, eosinófilos y linfocitos) y vasculitis. Se plantea la valoración inmunológica para el diagnóstico del rechazo humoral mediante el estudio de las especificidades de los anticuerpos anti-HLA mediante fluorocitometría sobre partículas de látex. Se sospecha rechazo agudo mediado por anticuerpos, por lo que se sustituye Everolimus por MMF y se aplica tratamiento de rescate con Timoglobulina y Plasmaféresis. No mejora la función renal, 2ª biopsia el día 22 post-Tx en la que se aprecia necrosis cortical. En 07/2006 trasplantectomía sin incidencias. Resultados. La respuesta de anticuerpos post-Tx (previa a la administración de timoglobulina) mantiene un patrón de especificidades similar al pre-Tx, al que se le añaden especificidades propias del injerto . Con la administración de timoglobulina y plasmaféresis se observa la negativización de los anticuerpos anti-HLA-II; sin embargo, aumenta la reactividad frente a las especificidades pre-Tx y a las incompatibilidades del injerto. La reactividad anti-HLA se analizó posteriormente con el programa Matchmaker v1.1, identificándose dos posibles epítopos (62RN y 76ES) que explican las reactividades encontradas en la evolución del rechazo. Estos resultados sugieren que el rechazo humoral se produce por reacción específica frente a epítopos compartidos entre sensibilización pre-Tx y la incompatibilidad HLA-B (B51+39) del injerto. Este dato junto al tiempo de aparición de los signos de rechazo sugieren una respuesta de memoria y su expresión como rechazo acelerado. Además, el tratamiento con timoglobulina y plamaféresis no presenta efecto inmunosupresor sobre esta respuesta de memoria, resultando ineficaz en el rescate de esta forma de presentación del rechazo humoral. 107 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 108 POSTERS 124.RESPUESTA PROLIFERATIVA DE LA MOLÉCULA HLADQB1*0302 ASOCIADA CON RECHAZO AGUDO EN TRASPLANTE HEPÁTICO Y DEPLECIÓN DE MOLÉCULAS DE SHLA CLASE I. Muro M1, Marín L1, Botella C1, Moya-Quiles MR1, Salgado G1, Minguela A1, Campillo JA1, Lucas D1, Villar M2, García-Alonso AM1, Álvarez-López MR1. 1Servicio de Inmunologia, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia, y 2Servicio de Inmunología, Hospital Ramon y Cajal. Madrid. Estudios previos incluyendo los de nuestro grupo han demostrado que los niveles sericos pre-transplante de HLA clase I soluble (sHLAI) y la presencia del alelo HLA-DQB1*0302 en receptores hepáticos son diferentes factores implicados en el desarrollo de rechazo agudo. Además, este alelo HLAse relaciona con varias enfermedades autoinmunes y podría estar implicado en un mayor estado de aloreactividad en determinados individuos. Nuestro objetivo era investigar la respuesta proliferativa (RP) de diferentes moléculas HLA-DQB1 con y sin depleción de sHLA sérico alogénico. Examinamos la RP primaria (MLR-I) y la secundaria (MLR-II) de individuos con distintas combinaciones de compatibilidad HLA-DQ en situaciones de depleción de moléculas sHLA en cultivos celulares. La depleción de las moléculas sHLA clase I de suero se realizo por binding del anticuerpo HLA clase I (isotipo IgG2a, clon w6.32) a gel Sepharosa 4B y tratamiento de las muestras de séricas, como publicado. Los cultivos celulares se realizaron por unidireccional MLR-I primaria (5 dias) y MLR-II secundaria (re-estimulada a 5 dias) utilizando células respondedoras alogenicas y autologas, y estimuladoras irradiadas (lineas linfoblastoides-EBV) en combinaciones alogenicas y autologas HLA-DQB1 específicas (presencia o ausencia de HLA-DQB1*0302). La respuesta relativa (RR) de los linfocitos HLA-DQB1*0302+ en MLR-I primaria, cuando la células estimuladoras eran semialogenicas o incompatibles, no mostró una proliferación aumentada, en situaciones de ausencia o presencia de moléculas sHLA-I. Sin embargo, en la MLR-II secundaria (respondedora primada frente a estimuladora), detectamos una RR aumentada en situaciones de ausencia de sHLA alogénico y usando células semialogenicas HLADQB1*0302+. Este resultado no se obtuvo cuando se utilizaron células HLA-DQB1*0302-. En conclusión, estos datos indican que, en una respuesta primaria las diferentes combinaciones testadas muestran una manera similar de responder, pero en la respuesta secundaria, cuando las células respondedoras ha sido primadas y sensibilizadas, las moléculas sHLA juegan diferente papel en molecules plays a different role in RP dependiendo de la constitución de las moléculas HLA-DQ específicas. 125.ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE ALOTIPOS HLA-C EN EL DESENLACE DEL TRASPLANTE HEPÁTICO A CORTO PLAZO. HLA-CW*07 COMO FACTOR PREDICTIVO DE LA BUENA ACEPTACIÓN DE ESTOS INJERTOS. Moya-Quiles MR1, Alvarez R, López-Álvarez MR, Miras M, Sánchez-Mozo MP, Blanco-García MR, Marín-Moreno I, Sánchez-Bueno F, Minguela A, Muro M, Alonso C, Álvarez-López MR. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. El efecto de la compatibilidad HLA en el injerto hepático es aún controvérsico. Sin embargo, a pesar del uso potentes drogas inmunosupresoras, la frecuencia de rechazo agudo en estos trasplantes es bastante alta. El objetivo del presente trabajo, fue valorar si con 108 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 independencia del carácter genético del donante, el status genético del receptor puede predeterminar la buena o mala aceptación del injerto a corto plazo. Este estudio es fruto de una colaboración dentro del ámbito RED-GIT y en el mismo se compararon las frecuencias de HLAC en 446 receptores de hígado con las de 473 individuos control. HLAAy -B fueron tipados mediante técnicas estándar de microlinfocitotoxicidad y PCR-SSO. En principio se observó una asociación entre el epitopo Asn80 y una mejor aceptación del injerto (P= 0,01), pero un análisis posterior considerando el efecto de HLA-Cw*07 frente al resto de alelos de su mismo grupo HLA-C (portando el epitopo Asn80) demostró que el efecto observado era mayoritariamente mediado por HLA-Cw*07, ya que este alelo se asociaba negativamente con la aparición de rechazo agudo (P=0.001, Pc=0.01). En conclusión, la presencia de HLA-Cw*07, puede ser considerada como un factor predictivo del buen desenlace del trasplante, ya que este alelo se asocia negativamente con el riesgo de rechazo agudo. El trabajo ha sido financiado por el proyecto FISS PI050944, la Red de grupos RED-GIT (G03/104). 126.NIVELES SERICOS DE TGF-B1 EN TRASPLANTE HEPATICO Y SU POSIBLE INFLUENCIA EN LA EXPRESION DE MOLECULAS B7 EN CÉLULAS B. Botella C1, Lopez-Alvarez MR1, RuizMerino G1, Marin L1, Gomez-Mateo J1, Salgado G1, Lucas D1, Blanco-Garcia RM1, Parrilla P2, Miras M3, Minguela A1, Muro M1, Alvarez-Lopez MR1. 1Servicio Inmunología. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia. 2Servicio Cirugía. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia. 3Servicio Medicina Digestiva. H.U.Virgen Arrixaca. Murcia. El trasplante hepático es mejor aceptado que otros órganos sólidos trasplantados. Otros estudios de nuestro grupo han demostrado que la expresión de moléculas B7 (CD80 y CD86) en células B está upregulada durante los episodios de rechazo agudo (RA). Por otra parte, en relación con el polimorfismo del TGF-B1 en el codón +25, se observó que el genotipo G/G predomina en los individuos con RA, y que el genotipo G/C predomina en los individuos NRA. Los objetivos de este estudio fueron: Analizar los niveles séricos de TGF-B1 en TOH en relación a la up-regulación de las moléculas B7 (Día 30 post-trasplante), estudiando dichos niveles para cada fenotipo secretor de TGF-B1, así como para cada genotipo. Además se plantea estudiar la posible influencia entre la concentración sérica de TGF-B1 y la expresión de moléculas B7. La determinación sérica de TGF-B1 se realizo mediante técnica ELISA, utilizando el kit comercial Quantikine Human TGF-B1 (R & D Systems), incluyendo en dicho estudio un total de 50 individuos sometidos a trasplante hepático (RA n=11 y NRA n=39). Como resultado del estudio se observó que, al comparar las medias de las concentraciones séricas de TGF-B1 de los individuos RA vs NRA, los valores fueron muy similares en los dos grupos, aunque ligeramente mayores en el grupo de RA. Cuando se compararon los valores de TGF-B1 en los genotipos para el codón +25 (G/G y G/C), se observó que en el genotipo G/G los niveles séricos de TGFB1 seguían el mismo patrón que la población global, y tenían valores muy similares en RA y NRA. Por el contrario, en el grupo de pacientes con genotipo G/C la concentración de TGF-B1 para los pacientes con RA alcanzó valores que duplicaban los de los pacientes sin rechazo (NRA). Además, estos cambios reflejaban un perfil similar al observado por los cambios en el número de células CD19+CD86+ en individuos con genotipo G/C. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 109 INMUNOLOGÍA En conclusión, aunque no se puede afirmar que la concentración de TGF-B1 en suero de individuos TOH condicione claramente la aparición de episodios de rechazo agudo, existe una tendencia al aumento de TGF- B1, acompañada de aumento del número de células CD19+CD86+ en individuos con genotipo G/C. 127.INFLUENCIA DE LOS GENOTIPOS DEL CODÓN +25 DE TGFB1 EN LA GENERACIÓN DE CÉLULAS CD19+CD86+ EN TRASPLANTE HEPÁTICO. Botella C1, Gomez-Mateo J1, Marin L1, Lopez-Alvarez MR1, Ruiz-Merino G1, Salgado G1, Lucas D1, Blanco-Garcia RM1, Parrilla P2, Miras M3, Minguela A1, Muro M1, Alvarez-Lopez MR1. 1Servicio Inmunología. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia.2Servicio Cirugía. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia. 3Servicio Medicina Digestiva. H.U.Virgen Arrixaca. Murcia. Durante varios años, nuestro grupo ha investigado factores que intervienen en la tolerancia y el rechazo del trasplante hepático. Las interacciones entre citoquinas regulan la respuesta inmune hacia el órgano trasplantado. Algunas citoquinas como el TNF-α, IL-6, o IFNγ, son proinflamatorias y promueven reacciones celulares. Otras citoquinas como IL-10 son antiinflamatorias y pueden favorecer la respuesta humoral; y algunas como TGF-B pueden tener ambos efectos. La producción de citoquinas puede estar influenciada por diversos polimorfismos identificados en el promotor o en la secuencia génica. Por otra parte, estudios previos de nuestro grupo demostraron que la expresión de las moléculas B7 (CD80 y CD86) en células B estaban upreguladas durante el periodo de rechazo agudo. El objetivo del presente estudio fue analizar el polimorfismo de TGF-B y testar la influencia de los diferentes genotipos en la expresión de CD86 células B de receptores hepáticos. El grupo de estudio estaba constituido por 234 pacientes receptores de trasplante hepático, 161 con rechazo agudo (RA) y 72 con ausencia de rechazo agudo (NRA). El estudio del polimorfismo de citoquinas se realizó mediante PCR-SSP (One Lambda). La expresión de moléculas B7 en células B , se realizó mediante citometría de flujo, utilizando como anticuerpos monoclonales: anti-CD80-FITC, anti -CD86- PE, antiCD19-PerCP, y anti-CD5- APC. El análisis de polimorfismos TGF-B en posición +10, demostró que este polimorfismo génico no estaba asociado con rechazo o con aceptación de injerto hepático. En cambio, los polimorfismos en posición +25 correlacionan con la aceptación del injerto con valores p cercanos a la significación. El genotipo G/G estaba aumentado en el grupo de RA (p<0.07) y el genotipo G/C prevalecía en el grupo de NRA. Cuando se analizaron los genotipos combinados para las posiciones +10 y +25 de TGF-B, se observo que el genotipo T/T G/C estaba significativamente asociado con la aceptación del injerto (p< 0,033). El porcentaje y el nº absoluto de linfocitos CD86+ resultó significativamente incrementado en el grupo de rechazo en el día 30 post-trasplante. Además, portadores de G en posición +25 (genotipos G/G y G/C) estaban up-regulados en el grupo de RA respecto al grupo de NRA, y también presentaron valores más altos de células CD19+CD86+. En resumen, el estudio combinado del polimorfismo de TGFB1 y las variaciones en las células CD19+CD86+, sugieren una dependencia entre el genotipo G/G o G/C y la expresión de CD86 en linfocitos B, la cuál puede ayudar a predecir el rechazo o la aceptación del injerto, así como ser utilizado en inmunoterapias individualizadas. POSTERS 128.EXPRESIÓN DE CD28 Y DE MOLÉCULAS HLA EN CÉLULAS DE SANGRE PERIFÉRICA, DE UTILIDAD EN LA MONITORIZACIÓN INMUNOLÓGICA EN TRASPLANTE CARDIACO. Blanco-García RM, López -Álvarez MR, Villar Permuy F, Marín-Moreno IM, Botella C, Salgado- Cecilia G, Muro M, García-Alonso AM, Pascual D, Álvarez -López MR, Minguela A. Servicio de Inmunología y Cardiología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Murcia. Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, HLA en humanos) se expresan en células de diversos tejidos, incluidos los leucocitos de sangre periférica (SP), y su expresión se ve afecta por procesos inflamatorios, entre ellos el rechazo agudo (RA) de aloinjertos. Por tanto su monitorización, puede ser de utilidad en la predicción temprana de la aparición del RA. Por otra parte, nuestro grupo ha puesto de manifiesto que CD28 juega un papel decisivo en la aceptación de injertos alogénicos de hígado, y es de utilidad en la predicción temprana de la aparición del rechazo agudo (RA) y en la discriminación del RA frente a las recidivas de hepatitis virales. Se monitorizaron por citometría de flujo la expresión de CD28 en linfocitos T CD4+ y CD8+ y la expresión de HLA de clase-I y de clase-II en linfocitos T y B, Monocitos y Neutrófilos. Se utilizaron muestras de SP (sangre periférica) de 42 receptores de trasplante cardiaco, tomadas en el pre-trasplante y 1, 2, 3, y 4 semanas, y 2, 3, 4 ,6 ,9 y 12 meses post-trasplante. Los pacientes se clasificaron en: con-RA (n=19) y sin-RA (n=23) en función del índice de rechazo agudo que se calculó como un promedio del grado de rechazo de todas las biopsias (sumatorio del grado rechazo/nº biopsias con rechazo), considerando los pacientes con-RA cuando el promedio fue >1. Nuestros datos reflejan que la mayor frecuencia de rechazo agudo tuvo lugar entre el 4º y 6º mes post-trasplante, en los que se contabilizaron el 64% del total de los rechazos, el resto se distribuyó homogéneamente entre los diferentes periodos de monitorización. Coincidiendo con el periodo de mayor rechazo agudo, se detectaron niveles de expresión de CD28 en linfocitos T CD4+ ; CD8+ y de HLA de clase-I y de claseII (tanto en linfocitos T y B, como en Monocitos y Neutrófilos), significativamente superiores en pacientes con-RA que en pacientes sin-RA. La ciclosporinemia fue comparable en ambos grupos, aunque ligeramente superiores en los pacientes con-RA. El estudio de la expresión de CD28, HLA clase I y HLA clase II en células de SP, podría ser de utilidad para monitorizar la respuesta alogénica en trasplante cardiaco, y ayudar en la predicción de la aceptación del injerto. 129. USO DE GAMMAGLOBULINA INTRAVENOSA INESPECIFICA PARA LA PROFILAXIS Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD CMV EN TRASPLANTE CARDIACO. Carbone J1, Sarmiento E1, Fernández-Yáñez J2, Palomo J2, Muñoz P3, Bouza E3, Lanio N1, Rodríguez-Molina JJ1, Rodríguez-Hernández C4, Ruiz M5, Fernández-Cruz E1. 1Servicios de Inmunología, 2Cardiología, 3Microbiología, 4Bioquímica, 5Cirugía Cardiaca, Hospital Gregorio Marañón. Madrid. Introducción. La presencia de hipogammaglobulinemia en el periodo post-trasplante cardiaco (TC) se asocia a un riesgo elevado de desarrollo de infecciones, entre ellas la infección o enfermedad por CMV (Sarmiento, Transpl. Infect. Dis. 2006). Recientemente, se ha sugerido que el uso de gammaglobulina intravenosa (GGIV) específica anti-CMV es útil para prevenir el desarrollo de infección por CMV en 109 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 110 POSTERS pacientes con TC que tienen hipogammaglobulinemia (Yamani, J Heart Lung Transplant, 2005). Objetivo. Analizar la utilidad de las GGIV-inespecíficas para la profilaxis y tratamiento de la enfermedad CMV en pacientes con TC que desarrollan hipogammaglobulinemia. Justificación. Con GGIV-inespecíficas es posible administrar la misma concentración total de anticuerpos anti-CMV que con GGIVespecíficas anti-CMV (Cytotect, 50 unidades Paul-Ehrlich/mL), si se conoce la concentración de anticuerpos anti-CMV de cada lote y si se ajustan las dosis a infundir de GGIV-inespecífica. Pacientes y métodos. Estudio retrospectivo. 18 pacientes sometidos a TC, que desarrollaron hipogammaglobulinemia (IgG <600 mg/dl), y que fueron tratados con GGIV-inespecífica para la profilaxis (terapia anticipada de pacientes con infección CMV sin haber desarrollado enfermedad CMV) o tratamiento de enfermedad CMV entre Junio 1996 y Febrero de 2006. Infección por CMV: antigenemia positiva. Enfermedad CMV: antigenemia positiva y signos o síntomas de enfermedad. Protocolo. GGIV-inespecífica (Flebogamma): Dosis: 200-400 mg/kg cada 3 semanas con la finalidad de obtener niveles normales de IgG (>750 mg/dl). Ritmo de infusión: 0,01 a 0,04 ml/kg/min. Se utilizó el mismo lote de GGIV (con las más altas concentraciones disponibles de anticuerpos anti-CMV, media 38 unidades Paul-Ehrlich/mL) o lotes con concentraciones similares. Resultados. En el periodo de estudio se realizaron 154 TC. Ocho pacientes fueron tratados con GGIV-inespecífica para profilaxis de enfermedad CMV y 10 pacientes para tratamiento de enfermedad CMV. Los 8 pacientes con infección CMV habían utilizado ganciclovir, y uno de ellos además GGIV-específica profiláctica por discordancia serológica CMV (D+/R-). Todos los pacientes con enfermedad CMV habían recibido tratamiento con ganciclovir y 6 además GGIV-específica anti-CMV. En el momento de iniciar GGIV-inespecífica había persistencia de antigenemia y síntomas de enfermedad. La terapia con GGIV-inespecífica para los pacientes con enfermedad CMV se hizo en combinación con ganciclovir. Media de IgG en los pacientes con infección CMV: 569 (DS 81 mg/dl) vs pacientes con enfermedad CMV: 402 (DS 93 mg/dl), p= 0,003. Ninguno de los pacientes tratados con GGIV-inespecífica por infección CMV desarrolló enfermedad CMV, y todos negativizaron la antigenemia CMV. Todos los pacientes tratados por enfermedad CMV evolucionaron favorablemente (negativización de antigenemia y mejoría de síntomas). La GGIV-inespecífica fue bien tolerada a las velocidades de infusión administradas. Conclusión. El uso de GGIV-inespecífica podría ser efectivo como terapia anticipada al desarrollo de enfermedad CMV y para el tratamiento de la enfermedad CMV en pacientes sometidos a TC con hipogammaglobulinemia. La confirmación de este resultado requiere la realización de un estudio randomizado. 130.MONITORIZACIÓN DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS EN PACIENTES SOMETIDOS A TRASPLANTE HEPÁTICO EN FUNCIÓN DE SU TRATAMIENTO INMUNOSUPRESOR. Romo EM, Muñoz-Robles JA, Castillo-Rama M, Meneu JC, Pérez-Saborido B, Castro MJ, Allende L, Morales P, Serrano A, Paz-Artal E. Hospital 12 de Octubre. Madrid. El trasplante ortotópico hepático es el tratamiento de elección para pacientes con cirrosis o necrosis hepáticas terminales. Los pacientes, una vez trasplantados, requerirán un tratamiento de inmunosupresión con el fin de evitar un rechazo del órgano. El objetivo de este estudio es la monitorización pre- y pos-trasplante de las principales poblaciones 110 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 linfocitarias en pacientes sometidos a trasplante hepático, compararlas entre sí y en función de su tratamiento inmunosupresor pos-trasplante. Se monitorizaron 68 pacientes sometidos a trasplante hepático, que habían llegado a la situación de fallo hepático desde diferentes enfermedades de base. Todos los pacientes estaban tratados con inhibidores de la calcineurina (tacrolimus o ciclosporina), y un 20%, además estaba tratado con Micofenolato Mofetil, como tratamiento inmunosupresor. Para este seguimiento se tomaron muestras de sangres previas al trasplante y posteriores a él, concretamente al 6º mes pos-trasplante y se marcaron con anticuerpos monoclonales característicos de las principales subpoblaciones linfocitarias y subpoblaciones V‚ del TCR; por último, se midieron por la técnica de citometría de flujo. Los resultados, fueron tratados estadísticamente con el programa SPSS para Windows. Tras el trasplante, se observaba un aumento porcentual muy significativos de las diferentes poblaciones linfocitarias, especialmente de los linfocitos T CD8+ y concretamente de los CD8+ activados (p = 0,00000114). Este resultado se reflejaba también si comparábamos los números absolutos, tódas las poblaciones mostraban una disminución clara (debido al tratamiento inmunosupresor), a excepción de los linfocitos T CD8+. Los individuos que tomaban la combinación de fármacos inmunosupresores (tacrolimus + micofenolato mofetil), presentaban una disminución porcentual y de números absolutos significativa de las células CD8 activadas (que podrian ser perjudiciales para el injerto). En el resto de familias estudiadas no se encontraron diferencias significativas entre individuos que tomaban exclusivamente inhibidores de la calcineurina y los que tomaban tacrolimus en combinación con micofelonato mofetil, entre las diferentes familias del TCR V‚ estudiadas, aunque la distribución de las subpoblaciones V‚ era diferente en los pacientes antes y despues del trasplante. 131.COMPLICACIONES INFECCIOSAS Y POLIMORFISMOS DE CITOCINAS EN EL TRASPLANTE RENAL. Guerrero MA, Sánchez-Velasco P, Ocejo-Viñals G, Valero R, Ausín F, Rodrigo E, Ruiz JC, Arias M, Leyva-Cobián F. Servicios de Inmunología y Nefrología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Introducción. Junto con las enfermedades cardiovasculares, las infecciones contribuyen a una elevación en la morbimortalidad de los trasplantados renales. El conocimiento de los factores de riesgo que favorecen la aparición de infecciones es fundamental para su prevención. Además del tratamiento inmunosupresor, los pacientes tienen una susceptibilidad individual al desarrollo de infecciones. Mientras que la influencia de los polimorfismos genéticos de las citocinas en la aparición de complicaciones inmunológicas ha sido analizado ampliamente en el trasplante renal, pocos estudios han evaluado el papel de estos polimorfismos en la aparición de complicaciones infecciosas. Materiales y métodos. Se incluyeron 256 pacientes receptores de primer trasplante renal, analizando la presencia o no de infecciones durante el primer año postrasplante. Se determinaron los polimorfismos genéticos de las siguientes citocinas mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos de secuencia (PCR-SSP): IL-1a, IL-1b, IL-1R, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-4Ra, IL-6, IL-10, IL-12, TNFα, TGF-β e IFN-γ. Resultados. La presencia de infecciones en el primer año postrasplante estaba asociado a polimorfismos en el gen de la IL-1b (-511: CC 65,2%, CT 77,7%, TT 51,6%, p= 0,008) y de la IL-12 (-1188: AA 43,4%, AC 50,0%, CC 78,9%, p= 0,012). Los pacientes con genotipo (-511) CC en el gen de Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 111 INMUNOLOGÍA la IL-1b presentaron mayor número de infecciones virales (0,1 ± 0,3 vs 0,03 ± 0,1, p= 0,009) y totales (0,9 ± 1,1 vs 0,5 ± 0,9, p= 0,037) respecto al genotipo TT en el primer año postrasplante. Los pacientes con genotipo (-1188) CC en el gen de la IL-12 presentaron un mayor número de infecciones bacterianas (1,7 ± 1,5 vs 0,5 ± 0,9, p= 0,003), urinarias (1,4 ± 1,5 vs 0,3 ± 0,8, p= 0,005) y totales (1,8 ± 1,5 vs 0,7 ± 1,0, p= 0,005) respecto al genotipo TT en el primer año postrasplante. No se encontraron diferencias significativas en el resto de polimorfismos analizados. Conclusión. Los polimorfismos en los genes de las citocinas IL1b (-511) CC e IL-12 (-1188) CC se asocian con un mayor riesgo de presentar infecciones tras el trasplante renal. La determinación de los polimorfismos genéticos de las citocinas puede ayudar a predecir el riesgo de presentar infecciones en pacientes trasplantados renales y a su prevención. 132.DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ATP INTRACELULAR EN LINFOCITOS CD4+ DE PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL Y SU CORRELACIÓN CON EL RIESGO DE INFECCIÓN. Benito MJ, Sánchez-Velasco P, Ocejo-Viñals G, Valero R, Ausín F, Rodrigo E, Ruiz JC, Arias M, Leyva-Cobián F. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Introducción. Uno de los principales objetivos en el trasplante renal es optimizar el tratamiento inmunosupresor, puesto que una dosis que ocasione un exceso de inmunosupresión se asocia con efectos secundarios graves mientras que una dosis que origine una inmunosupresión defectuosa se asocia con un riesgo elevado de rechazo del injerto. Recientemente, se ha desarrollado un ensayo para la determinar la concentración intracelular de trifosfato de adenosina (iATP) en linfocitos CD4+ tras estimulación con mitógenos o antígenos. Este método podría ayudar, por un lado, a monitorizar el estado inmunitario en pacientes inmunosuprimidos y, por otro lado, a predecir el riesgo de infección y rechazo en pacientes trasplantados renales. En este estudio se presenta nuestra experiencia con este procedimiento al aplicarlo a la monitorización de la evolución clínica de pacientes con transplantes renales. Materiales y métodos. Se ha determinado la concentración de iATP en linfocitos CD4+ de 89 pacientes trasplantados renales monitorizados durante 18 meses y los resultados se han comparado con la evolución clínica (infección o rechazo agudo) teniendo en cuenta las siguientes variables: edad, sexo, concentración sérica de sirolimus, tacrolimus y ciclosporina, y número de días postrasplante. La presencia de infección (n=81), se estableció tras la aparición de un cultivo positivo; se consideraron como rechazos agudos (n=10) los demostrados mediante biopsia y estudio histopatológico. De acuerdo con la concentración de iATP, las respuestas inmunitarias obtenidas tras la estimulación (expresadas en ng/ml de ATP) se clasificaron como fuertes (>525 ng/ml), moderadas (225-525 ng/ml) y bajas (<225 ng/ml). Resultados. Los valores en pacientes con infección fueron significativamente menores que los de aquellos pacientes que no presentaron infección (230 159 vs 314 202 ng/ml, p = 0,018). La frecuencia de infección fue del 50% in pacientes con respuesta inmunitaria baja, del 37,97% in aquellos pacientes con respuesta inmunitaria moderada y del 15,38% en aquellos pacientes con respuesta inmunitaria fuerte (p = 0,005). El valor del área bajo la curva (ABC) «Receiver operatingcharacteristic» (ROC)-plot para las concentraciones de iATP fue significativo (ABC = 0,622, p = 0,003). Sin embargo, no hubo relación con la aparición de rechazo agudo ni con otras variables estudiadas. POSTERS Conclusión. La determinación de iATP en linfocitos CD4+ durante la monitorización de los pacientes trasplantados renales podría indicar cuáles tendrían un mayor riesgo de infección y por tanto podría constituir un parámetro de utilidad en la individualización del tratamiento inmunosupresor. 133.IDENTIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE LA LA PRODUCCIÓN DE NOVO DE ANTICUERPOS ANTI-DONANTE TRAS EL TRASPLANTE CARDIACO. Domenech N, Crespo MG, Paniagua MJ, Moscoso I, Nemiña R, Naya C, Cursack G, Calviño R, Aldama G, Mosquera V, Cuenca J, Castro-Beiras A. CHU Juan Canalejo. Introducción. En el momento actual está por definir la utilidad de la monitorización de anticuerpos anti-donante (AAD) tras el trasplante cardiaco (TC). La determinación por citometria de flujo de los AAD, tanto anti-HLA de Clase I o Clase II como los anti-noHLA, podría ser un método no-invasivo y fácilmente repetible para incluir en el seguimiento post-TC. Objetivo: Conocer la factibilidad para monitorización y la frecuencia de aparición de AAD tras el TC. Métodos. En cada paciente con TC, se realizaron 5 extracciones de sangre para obtención de sueros de los distintos receptores, antes del TC y a los 1, 3, 6 y 12 meses post-TC. En dichos sueros se determinó por citometria de flujo: a) la producción de anticuerpos (Acs) anti-HLAI y/o HLA-II (sistema FlowPRA), y b) la presencia de Acs IgG o IgM anti-linfocitos del donante, utilizando las células obtenidas a partir de ganglios o bazo de cada donante correspondiente. Resultados. En el estudio se han incluido 48 pacientes correspondientes a los TC del CHU Juan Canalejo en los dos últimos años que han completado el año de seguimiento. Se realizó un estudio especifico de la presencia de Acs anti-HLA-I y HLA-II en un total de 210 muestras de sueros correspondientes a dichos pacientes. Se detectaron Acs antiHLA- I en el 14,5% de las muestas pre-TC y solo en el 12% de las muestras post-TC, respectivamente, y Acs anti-HLA-II en el 4% de las muestras pre-TC y solo en 2 (1,6%) de las muestras post-TC correspondientes a un mismo paciente. En la mayoria de los casos los valores fueron menores del 10%PRA. También se llevo a cabo la detección de Acs antilinfocitos del donante en el suero de 25 de estos pacientes siendo positivos los Acs de tipo IgG en solo dos de los pacientes (8%), no mostrando ninguno de estos dos pacientes el %PRA positivo. Conclusión. 1) En nuestro serie, la frecuencia de los pacientes en los que se ha detectado presencia de AAD tras el TC ha sido del 18,75% para los Ac anti-HLA-I, del 2% para los Acs anti-HLA-II y del 8% para los Acs IgG anti-linfocitos, 2) La relevancia de estos hallazgos requiere ulteriores análisis 134.ANÁLISIS DE LA CONCERTRACIÓN DE ADN EN ORINA COMO INDICADOR DEL PRONÓSTICO EN EL TRASPLANTE RENAL. Alonso A1, Rodríguez F2, Caballero A3, Alonso-Ortiz A3, López L3, Gallardo J3, Recio R3, Jiménez A3, Lavado R3, Bravo MJ3, Miranda JM3, Fernández-Arcás N3. 1Servicio de Nefrología. 2Servicio de Análisis Clínicos. 3Servicio de Inmunología. HRU. Carlos Haya, Málaga. Introducción. El postoperatorio inmediato del trasplante renal es un período crucial. En él pueden existir complicaciones isquémicas, 111 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 112 POSTERS inmunológicas, quirúrgicas e infecciosas que van a marcar la evolución del injerto y, por lo tanto, el éxito o fracaso del trasplante. La biopsia renal continúa siendo el gold-standard para el estudio de la evaluación post transplante pese a sus limitaciones inherentes. El objetivo de la creación de este estudio es la utilización de parámetros inmunológicos detectables en orina que permitan la monitorización de la función del injerto renal, lo que supondría una técnica no invasiva alternativa o complementaria a la histología para el diagnóstico diferencial de los distintos eventos susceptibles de deteriorar la función del trasplante. Material y métodos. Se determinó la concentración de DNA urinario en orina de 24 horas del primer día postrasplante a un total de 50 pacientes. Se desecharon 7 muestras por no cumplir los requisitos de pureza de ADN establecidos. De los 43 pacientes restantes, 13 (30,32%) presentaron una función retrasada del injerto (FRI, definida como necesidad de diálisis postoperatoria). En 30 (69,77%) casos la evolución fue buena, sin necesidad de diálisis. De cada muestra de 100 ml de orina se extrajo un volumen de 100 µl de ADN purificado mediante BioRobot© EZ1 de Qiagen La concentración de ADN se determinó midiendo la absorbancia de la muestra a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro (Eppendorf BioPhotometer©). Los datos clínicos y moleculares se recogieron en una base de datos informatizada, bajo el entorno SPSS®. Resultados. La mediana de concentración en el grupo con función retrasada fue de 65 con un rango intercuartílico de 83,5 mientras que en el grupo sin FRI esta mediana resultó de 31,75 con un rango intercuartílico de 21. Se compararon estos datos mediante tests no paramétricos (U de Mann-Whitney) encontrando diferencias significativas entre los dos grupos. (p =0.004). Se categorizó la variable cuantitativa «concentración de ADN» convirtiéndola en cualitativa dicotómica estableciendo para ello un punto de corte en 40 ng/ml. Este punto de corte resultó el valor mínimo posible (para aumentar la sensibilidad del test) que nos permitiese obtener significación estadística. Dentro del grupo con función retrasada del injerto, el porcentaje casos con DNA en orina por encima del punto de corte fue significativamente mayor que en el grupo con buena evolución inicial con una p= 0,007 (Test exacto de Fisher). Conclusiones. Aquellos pacientes cuya concentración de DNA urinario fue inferior a 40 μg/ml observamos una buena evolución a los 3 meses de la intervención. En aquellos con concentración superior a 40 μg/ml observamos una evolución tórpida del transplante. 135.ASOCIACIÓN ENTRE ANTICUERPOS ANTI-CITOESQUELETO DE CÉLULAS ENDOTELIALES (CS-AECA) Y LA APARICIÓN DE EPISODIOS DE RECHAZO EN EL TRASPLANTE CARDIACO. Álvarez-Márquez A1, Aguilera I1, Álvarez-López MR2, Pascual D2, Encarnación-Carrizosa M1, Hernandez A1, Blanco RM2, Wichmann I1, Núñez-Roldán A1. 1B. Servicio de Inmunología. H.H. U.U. Virgen del Rocío. Sevilla. 2Servicio de Inmunología. Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia. Introducción. Los anticuerpos anti-células endoteliales (AECA) constituyen una familia muy heterogénea de anticuerpos que reaccionan con una amplia variedad de determinantes antigénicos. Su presencia se ha descrito asociada a una gran variedad de enfermedades tanto autoinmunes como inflamatorias, así como en el trasplante cardiaco 112 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 en relación con la vasculopatía del injerto. Uno de los mecanismos que podría explicar su presencia en el trasplante cardiaco podría ser el daño provocado por la isquemia-reperfusión asociado con la cirugía del trasplante. Objetivo. Con objeto de explorar la historia natural de aparición de los AECA nos hemos planteado investigar la aparición secuencial de estos anticuerpos en pacientes trasplantados cardiacos y en pacientes sometidos a circulación extracorpórea por cirugía valvular o coronaria. Material y método. Hemos incluido 31 pacientes trasplantados cardiacos ( días: 0, 15, 30, 90 y 360) y 39 pacientes sometidos a CEC (dias 0, 15 y 30). Incluimos además un grupo de 87 controles sanos. El estudio de AECA se ha llevado a cabo mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) con células HUVEC. Resultados. 26,5% de los controles sanos fueron positivos para AECA. Observamos que, en el día 0, la frecuencia de AECA era significativamente mayor respecto a los controles, tanto en el grupo de trasplantados cardiacos (51,6%; p= 0,0195) como en el grupo de CEC (74,3%; p= 0,00001). No había diferencias en la frecuencia de AECA antes o después de la cirugía en el grupo de CEC. Pudimos identificar dos patrones de IFI claramente diferenciados: un patrón granular citoplasmático y otro patrón que reconocía estructuras del citoesqueleto celular. Cuando estratificamos los resultados por el patrón de IFI observamos un aumento gradual en la frecuencia del patrón citoesqueleto tras el trasplante cardiaco: día 15=13,3%, día 30=22,2%, día 90=53,8%, día 360=58%). En el patrón granular no observamos diferencias signicficativas a lo largo de la evolución. La aparición de episodios de rechazo durante el primer año postrasplante fue del 94.4% entre los pacientes que presentaban el patrón citoesqueleto, frente al 46.2% entre los que presentaban patrón granular (p= 0,009). Conclusión. Nuestros resultados indican una relación entre la aparición de anticuerpos anti-citoesqueleto durante el primer año postrasplante cardiaco y la aparición de episodios de rechazo. Los anticuerpos anti-citoesqueleto podrían ser una de las principales dianas en el rechazo del trasplante cardiaco. 136.RECHAZO CRONICO EN TRASPLANTE RENAL MEDIADO POR ANTICUERPOS ANTI-GSTT1. Aguilera I, Alvarez-Marquez A, Gentil MA, Wichmann I, Núñez-Roldán A. Servicio de Inmunología, H. U. Virgen del Rocío, Sevilla. El rechazo crónico (RC) es una forma progresiva de daño al injerto debido a distintos factores pero fundamentalmente a mecanismos de tipo aloinmune. Las características histológicas del rechazo humoral son muy variables, poco específicas y compatibles con distintas causas. Por este motivo el reciente descubrimiento de que los depósitos C4d en capilares peritubulares es un marcador del rechazo humoral en trasplante renal y cardiaco, se considera de gran utilidad para un diagnóstico correcto, con presencia de anticuerpos circulantes antidonante. En la mayoría de los casos los anticuerpos estan dirigidos frente a antígenos HLA específicos del donante aunque en un 10% de los casos C4d+ son indetectables. Se postula que otros antígenos no identificados de las células endoteliales del injerto pueden ser la diana en estos pacientes. El objetivo de este estudio fue ver si los anticuerpos frente a Glutation S-Transferase T1 (GSTT1) en trasplantados renales con rechazo crónico del injerto pueden ser incluidos en este grupo de casos inexplicados Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 113 INMUNOLOGÍA sin anticuerpos anti-HLA. Los anticuerpos anti-GSTT1 fueron descritos por nuestro grupo en 2001, son muy específicos frente al antígeno del donante y aparecen en pacientes que carecen del gen de la GSTT1 cuando reciben un injerto de un donante positivo. En este trabajo describimos tres pacientes que son negativos para anti-HLA Clase I y II del donante, cuyo diagnóstico de rechazo humoral ha sido confirmado por el patólogo y que actualmente solo podemos atribuir a los anticuerpos anti-GSTT1. Tras un largo seguimiento a estos pacientes (3 a 5 años) esta es la primera vez que detectamos evidencias morfológicas de la respuesta aloinmune en pacientes con anticuerpos anti-GSTT1 en trasplante renal. SESIÓN 10: INMUNOLOGÍA TUMORAL Moderadores: Melchor Álvarez de Mon Soto (Madrid), Augusto Silva González (Madrid) 137.LAS CÉLULAS TUMORALES DE LA LEUCEMIA DE CÉLULAS PLASMÁTICAS PIERDEN LA FORMA DE ALTA AFINIDAD DE LA INTEGRINA CD29 Y SON REFRACTARIOS AL ESTÍMULO DE SUS FACTORES REGULADORES. MartínezViñambres E, García-Trujillo JA, Rodríguez-Martin E, Villarrubia N, Coll J, Roldán E. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid. Introducción. El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad clonal de las células plasmáticas (CP) presentes en la médula ósea (MO). Aunque en la gran mayoría de las ocasiones las CP clonales permanecen acantonadas en el microambiente medular, en algunos casos la enfermedad progresa hacia su leucemización, detectándose entonces la población tumoral en la sangre periférica (SP). A esta fase de la enfermedad se la denomina leucemia de células plasmáticas (LCP). Nuestro grupo ha demostrado que las CP de MO normal y de la práctica totalidad de enfermos con MM expresan la forma activa de la integrina CD29, determinada mediante la expresión del epítopo HUTS-21, y caracterizada por su alta afinidad por sus ligandos. Objetivos. Estudiar la expresión del epítopo HUTS-21 y su regulación en las células tumorales de enfermos con LCP en comparación con las CP de enfermos con MM. Métodos. Aspirados de MO y muestras de SP de individuos sanos, diagnosticados con mieloma múltiple y con LCP. Cultivos de corta duración de CP con o sin cationes. Las poblaciones de CP así como el resto de antígenos estudiados se detectaron por citometría de flujo. Resultados. La mayoría de la población de CP de MO de individuos sanos expresaron el epítopo de activación HUTS-21 (85±12%), siendo similar al porcentaje obtenido en CP de enfermos con MM (87±9%). Por el contrario, el porcentaje de expresión de la forma activa de la integrina en enfermos con LCP estuvo francamente disminuido (menos de 1%). La expresión de la forma constitutiva de la integrina, determinada con el AcMo anti-CD29 clon MAR-4, fue equivalente en todos los casos. Estudios funcionales con cationes Mn2+ y plasmas autólogos y alogénicos demostraron que las células clonales de los enfermos de LCP respondieron de forma muy deficiente a los reguladores del epítopo HUTS-21, tanto en MO como en SP. POSTERS Conclusiones. La leucemización del MM está asociada a la pérdida de expresión de la forma de alta afinidad de la integrina CD29. Las CPs en estos enfermos son a su vez refractarias a los factores que regulan la expresión del epítopo HUTS-21, probablemente por defectos intrínsecos en esta molécula. 138.FASL ASOCIADO A EXOSOMAS COMO PRINCIPAL MECANISMO DE DEFENSA EN LÍNEAS HUMANAS DE CÁNCER DE COLON. Royo-Cañas M, Anel A, Lasierra P, Larrad L, Martínez-Lorenzo MJ. Instituto Aragones de Ciencias de la Salud y Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa-Zaragoza. La apoptosis o muerte celular programada juega un importante papel en la regulación de células normales. Diversos tumores malignos son resistentes a la apoptosis a través de receptores de muerte y expresión de ligandos como FasL y APO2L/TRAIL. En el caso de algunos tumores, la sobreexpresión de FasL parece correlacionarse con la agresividad del tumor y el mal pronóstico. Aunque algunos autores han descrito que las células de cáncer de colon son capaces de expresar FasL y atacar a las células linfoides que expresan Fas, otros han indicado que FasL no se expresa en la superficie de esos tumores. Esto indicaría que otros factores podrían estar implicados, tales como el balance entre forma unida a membrana y forma soluble o la secreción de ligandos de muerte en la superficie de exosomas. Algunos autores han descrito que las células de cáncer de colon son capaces de expresar FasL y atacar a las células linfoides que expresan Fas, sin embargo, otros resultados contradictorios indican que FasL no se expresa en la superficie de estos tumores. El objetivo del presente trabajo fue analizar la expresión de FasL en células de cáncer de colon y su funcionalidad. La expresión de Fas, FasL, se determinó por citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos. La muerte celular se cuantificó mediante análisis de la exposición de fosfatidilserina y por medida del potencial mitocondrial. Los estudios de sensibilidad a los diferentes inductores apoptóticos se llevaron a cabo por el método de Mossman (Test del MTT). Se analizó la expresión y posible secreción de Fas y FasL en los siguientes carcinomas de colon: HT-29, SW480, LoVo, HCT-116 y CaCo2. La expresión de Fas en membrana en la mayoría de las líneas celulares analizadas fue superior al 70%. Solamente la línea celular CaCo2 no expresó Fas ni en la membrana ni en el interior celular. En cuanto a la expresión de FasL, las líneas HT-29, HCT-116 y CaCo-2 expresaron niveles similares en la membrana y en el interior celular. En las líneas SW480 y LoVo, la expresión en membrana de FasL fue solo de un 40 y 30% respectivamente, aumentando hasta un 80% para la expresión intracelular. Sin embargo, a pesar de la expresión de Fas en membrana, ninguna de las líneas celulares analizadas fue sensible a anticuerpos anti-Fas (<10%). A continuación se comprobó que FasL expresado en la membrana de las células fue poco tóxico en los cocultivos utilizando células Jurkat que expresan Fas en membrana como diana. Finalmente, se observó la expresión de FasL asociado a una fracción ultracentrifugable que fue tóxica para células Jurkat. Los resultados preliminares obtenidos indican que el FasL que expresan las células de cáncer de colon en membrana no es funcional, sino el liberado en su forma soluble asociado a exosomas. Financiación: C03/02, PI020658. 113 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 114 POSTERS 139.CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS HLA DE CLASE I EN LÍNEAS CELULARES TUMORALES HUMANAS DESPUÉS DEL CRECIMIENTO EN RATONES INMUNODEFICIENTES. Casares C1, Linares I1, Romero I1, Berruguilla E1, Salaya G1, Paco L1, Collado A2, Algarra I3, Lopez-Nevot MA1, GarcíaLora A1, Garrido F1. 1Análisis Clínicos e Inmunología. 2Unidad de Investigación, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 3Departamento Ciencias de las Salud. Universidad de Jaén. Los ratones inmunodeficientes son ampliamente utilizados para estudios de crecimiento de líneas celulares tumorales humanas y para el análisis in vivo de terapias antitumorales. Normalmente las células tumorales inyectadas no son analizadas para su fenotipo antes y después del crecimiento en estos ratones. Resultados previos de nuestro grupo han mostrado que en el caso de la línea de melanoma Ando2, el fenotipo HLA de clase I cambiaba después de su crecimiento en ratones nude. Para poder determinar la amplitud y repetitividad de este fenómeno, hemos inyectado diferentes líneas de melanoma humanas, y hemos estudiado su fenotipo HLA antes y después del crecimiento en los ratones. Se han utilizado 3 líneas de melanoma, tres de ellas presentan LOH en el cromosoma 6, expresando un único haplotipo HLA en superficie. Se han inyectado subcutáneamente en ratones nude/nude, 5 ratones por grupo, 2x106 y 5x106 células. El crecimiento del tumor fue controlado mediante medición del diámetro mayor y cuando el tumor alcanzo un diámetro entre 5-8 mm el tumor fue extirpado y adaptado a cultivo celular. Las líneas celulares obtenidas fueron analizadas para la expresión de moléculas HLA de clase I mediante citometría de flujo, y dicha expresión fue comparada con las líneas celulares originales. En la mayoría de las líneas analizadas se producían alteraciones en el fenotipo HLA de clase I después del crecimiento en ratones. La línea celular Ando2 presenta la expresión de un haplotipo HLA de clase I, después del paso por ratones nude, todas las líneas obtenidas no muestran expresión en superficie de ninguna molécula HLA de clase I, perdiendo por tanto la expresión del otro haplotipo HLA. Hemos podido determinar que esta perdida total de expresión de moléculas HLA de clase I se debía a una baja regulación de la maquinaria de procesamiento antigénica. En el caso de otras dos líneas de melanoma, presentan después del crecimiento en ratones nude una perdida de expresión de locus B. Estos resultados fueron reproducibles en diferentes ensayos, ya que todas las líneas analizadas provenientes de una misma línea mostraron un fenotipo HLA de clase I muy similar, prácticamente idéntico. Estos resultados muestran que el fenotipo HLA de clase I de las células tumorales puede cambiar después del crecimiento en ratones nude, siendo un fenómeno reproducible. 140.IMPLICACIÓN IN VIVO DE LAS CÉLULAS NK EN EL CAMBIO DE FENOTIPO MHC DE CLASE I EN METÁSTASIS OBTENIDAS EN RATONES NUDE. Salaya G, Romero I, Linares I, Berruguilla E, Casares C, Garrido F, García-Lora A. Servicio de Análisis Clínicos e Inmunología. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. Estudios anteriores de nuestro grupo mostraron que metástasis generadas a partir de el clon B9, fibrosarcoma murino inducido por metilcolantreno, presentaban un distinto fenotipo MHC de clase I 114 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 dependiendo del sistema inmune del huésped en el que se produjeron: fenotipo MHC clase I negativo en ratones inmunocompetentes, y MHC clase I positivo en ratones inmunodeficientes nude/nude. Las metástasis MHC clase I positivas, cuando son inyectadas en ratones inmunocompetentes presentan un alta inmunogenicidad por lo que, aunque crecen en un principio, son finalmente rechazadas. Esta inmunogenicidad no se presenta en ratones nude en los que no son rechazadas. Las metástasis MHC clase I negativas, por el contrario, muestran una baja inmunogenicidad en ratones inmunocompetentes, no siendo los tumores rechazados. Los ratones nude/nude carecen de linfocitos T maduros pero tienen una elevada actividad NK que podría estar relacionada en este cambio de fenotipo MHC de clase I. Para estudiar la posible implicación de las células NK, se produjeron metástasis a partir del clon B9 en ausencia de células NK, por un lado en ratones nude/nude deplecionados de células NK mediante inyección peritoneal de Ac anti-asialo GM1 una vez por semana, y por otro lado en ratones SCID-Beige. Tras adaptarse a cultivo, se estudió la expresión en superficie de moléculas H-2 clase I de estas metástasis mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales. Los resultados obtenidos mostraron, que tanto las metástasis obtenidas en ratones nude depleccionados de células NK como las obtenidas en ratones SCID-Beige, no tenían expresión en superficie de moléculas H-2 de clase I clásicas. Por tanto presentaban idéntico fenotipo MHC de clase I clásico que el clon B) y que las metástasis obtenidas en ratones inmunocompetentes, y un fenotipo opuesto al de las metástasis obtenidas en ratones nude. En base a estos resultados podemos concluir que en este sistema tumoral murino las células NK parecen estar directamente implicadas in vivo en el cambio de fenotipo H-2 de clase I, de negativo a positivo, ocurrido en las metástasis obtenidas en ratones nude a partir del clon original B9. 141.CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE IMPLICADA EN EL RECHAZO EN RATONES INMUNOCOMPETENTES DE TUMORES GENERADOS EN RATONES NUDE: OBTENCIÓN DE CTLs ESPECÍFICOS. Salaya G, Berruguilla E, Linares I, Romero I, Casares C, Garrido F, García-Lora A. Servicio de Análisis Clínicos e Inmunología. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. En nuestro laboratorio hemos generado un sistema tumoral murino compuesto por metástasis espontáneas derivadas de el clon B9, fibrosarcoma murino inducido con metilcolantreno, que presentan un distinto fenotipo MHC de clase I dependiendo del sistema inmune del huésped en el que se produjeron: fenotipo MHC clase I negativo en ratones inmunocompetentes, y MHC clase I positivo en ratones inmunodeficientes nude/nude. Las metástasis MHC clase I positivas, cuando son inyectadas en ratones inmunocompetentes presentan un alta inmunogenicidad por lo que, aunque crecen en un principio, son finalmente rechazadas. Esta inmunogenicidad no se presenta en ratones nude en los que no son rechazadas. Las metástasis MHC clase I negativas, por el contrario, muestran una baja inmunogenicidad en ratones inmunocompetentes, no siendo los tumores rechazados. El análisis de las subpoblaciones linfocitarias realizado en sangre periférica y bazo de ratones inmunocompetentes previamente inmunizados con las metástasis H-2 clase I positivas, mostró un aumento de los porcentajes de linfocitos CD8+. Con el objeto de profundizar en la caracterización de esta respuesta inmune, se propuso la determina- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 115 INMUNOLOGÍA ción de precursores de CTLs y el aislamiento de estos en ratones previamente inmunizados. Para la realización de este ensayo se inmunizaron ratones inmunocompetentes mediante 4 inyecciones subcutáneas de la metástasis MN4.5, H-2 clase I positiva, que se realizaron cada 15 días. Después se les extrajo el bazo que se disgregó, y se aislaron los linfocitos CD8+ presentes mediante un proceso de selección negativa. Se co-cultivaron a diferentes ratios con células MN4.5 irradiadas. Tras varias reestimulaciones semanales se realizo un ensayo de lisis con 51Cr utilizando como diana el propio clon B9 y diferentes metástasis. Este test de lisis se repitió a las 2 semanas y se obtuvieron los pocillos en los que la lisis era específica para las células MN4.5, que fueron posteriormente clonados. Los resultados mostraron que la frecuencia de precursores de CTLs que reconocían específicamente y únicamente a las células tumorales MN4.5 era de 1/2703 (3,7 x 10-4). Este resultado muestra una fuerte respuesta antitumoral especifica frente a estas células tumorales por parte de linfocitos T citotóxicos. Varios pocillos positivos fueron seleccionados y clonados. Estos clonos obtenidos podrán dar lugar a la identificación de los antígenos tumorales reconocidos por los linfocitos CD8+ implicados en el rechazo tumoral de estas líneas celulares tumorales originadas en ratones nude. 142.GENES IMPLICADOS EN LA BAJA REGULACIÓN COORDINADA DE LOS COMPONENTES DEL APM Y DE LAS MOLÉCULAS DEL MHC DE CLASE I EN CÉLULAS TUMORALES. Romero Garcia I, Berruguilla Perez E, Salaya Algarín G, Martinez M, Linares I, Garrido F, Garcia Lora A. Servicio de Analisis Clinicos e Inmunología del Hospital Universitario Virgen de las Nieves. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo tumoral murino compuesto por metastasis espontaneas, derivadas de un clon tumoral (fibrasarcoma inducido con metilcolantreno), que presenta un diferente fenotipo MHC de clase I dependiendo del sistema inmune del huésped: MHC de clase I negativo en ratones inmunocompetentes, y MHC de clase I positivo en ratones nude. Estudios previos han mostrado que la falta de expresión en superficie de moléculas MHC clase I es consecuencia de una baja regulación coordinada a nivel transcripcional de varios componentes de la maquinaria de procesamiento antigénica (APM): TAP-1, TAP-2, LMP-2,LMP-7,LMP-10, Calnexina y Tapasina. Para determinar el mecanismo molecular implicado en la baja expresión coordinada de estos genes del APM, construimos bibliotecas de sustracción de cDNA comparando mRNAs derivados de las diferentes variantes metastásicas. Los diferentes fragmentos obtenidos fueron secuenciados y su secuencia fue comparada con las basas de datos. Se realizaron ensayos comparando líneas metastásicas MHC clase I positiva (MN4.5 y MN4.1) con dos líneas que carecen de expresión de moléculas de clase I ( MP5 y MP12). Al ser estas metástisis generadas desde el mismo clon B9 deben expresar un número diferencial de genes muy reducidos. Hemos encontrado 12 genes expresados diferencialmente, unos correspondientes a genes conocidos y otros a genes nuevos. Entre los genes encontrados debemos destacar los siguientes como posiblemente implicados: FHIT, Glis1, KPNA2, IL1r. Actualmente, se están realizando estudios con estos genes, a nivel de expresión cuantitativa, bloqueo de la expresión y transfección, para determinar su implicación directa con la expresión de los componentes del APM y en la expresión de moléculas MHC de clase I en la superficie celular. POSTERS 143.ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL ARNM DE CD3Z EN 13 PACIENTES CON ADENOCARCINOMA GÁSTRICO. Aguinaga Barrilero A, Pérez Blas M, Rodríguez Pérez N, Gutiérrez A, Martín J, Gómez R, Martín Villa JM. Facultad de Medicina (UCM). Introducción. Son numerosas las referencias a una disfunción de los linfocitos T en cáncer y otros procesos patológicos con inflamación crónica. Dicha disfunción está asociada en muchos casos a la pérdida de expresión de la cadena CD3Z en la membrana de la célula. La causa del defecto de la cadena CD3Z en los pacientes de cáncer no se conoce, aunque se ha venido atribuyendo a algún factor derivado del tumor. Sin embargo, resultados previos de nuestro grupo han mostrado que la baja expresión de CD3Z se mantiene en líneas estables de linfocitos T de pacientes con cáncer gástrico, por lo que suponemos que debe tratarse de una alteración inherente a las células, independiente de la presencia de factores tumorales. Con esta hipótesis como base, quisimos comprobar si el ARNm de CD3Z presentaba alguna alteración (mutación, splicing alternativo) en los pacientes con adenocarcinoma gástrico que explicara la reducción en membrana de la proteína y que, además, se mantendría en las líneas. Métodos. Se partió de muestras de sangre de 13 pacientes con adenocarcinoma gástrico y de 8 individuos sanos, de las cuales fueron aisladas las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante gradiente de densidad. Se obtuvo el ARN total de las CMSP en cada caso, el cual fue retrotranscrito a cDNA para su posterior amplificación y secuenciación directa, utilizando cebadores específicos del gen CD3Z. El análisis de las secuencias revela que el gen CD3Z de los pacientes no muestra ningún cambio diferencial con respecto al de los individuos sanos y al que está publicado en el GenBank. Hemos comprobado la existencia de 5 polimorfismos ya descritos y, además, hemos encontrado otros 3 polimorfismos nuevos. Ninguno de los polimorfismos se da con un patrón característico en los pacientes. Conclusión. La disminución de la expresión de la cadena CD3Z que presentan nuestros pacientes de cáncer gástrico no se debe a alteraciones de la secuencia del gen de dicha proteína, y ninguno de los polimorfismos detectados se asocia a la enfermedad. 144.IDENTIFICATION OF APOPTOSIS-RELATED GENES REGULATED BY THE PLZF PROTEIN. Bernardo MV1, Yelo E1, Gimeno L1, MajadoMJ2, Álvarez-López MR1, Parrado A1. 1Inmunology Service and 2Hematology Service. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. El Palmar. Murcia. The PLZF gene was identified in acute promyelocytic leukemia (APL, AML-M3). PLZF expression is downregulated in most chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients, suggesting that PLZF may play a tumor suppressor role. PLZF is a transcriptional repressor involved in the control of cell proliferation, differentiation and survival. Overexpression of PLZF induces cell cycle arrest and growth suppression, whereas alteration of its normal function due to the presence of the reciprocal fusion proteins, PLZF-RARA and RARA-PLZF, resulting from the t(11;17) traslocation, is associated to the development of APL. We have established stable inducible PLZF expressor clones from different hematopoietic cell lines, using the tet-off system. PLZF induced inhibition of cell growth in T lymphocytic Jurkat cells, but not in erythroid K562 cells, or B lymphocytic DG75 cells. Growth suppression in Jurkat cells was dependent on its levels of expression, since it was observed only in the highest PLZF expressor clones. 115 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 116 POSTERS Moreover, it was inversely proportional to the initial density of the cultures, suggesting a dependence on exogenous mitogens. Deletion of the BTB/POZ domain abrogated growth suppression. Cell cycle and apoptosis analysis suggest that cell death may be the primary and predominant mechanism responsible for growth suppression in Jurkat cells. Since PLZF may mediate its biological effects by transcriptional control, we conducted a search of potential transcriptional targets by microarray analysis (CodeLink, human whole genome, 55K). Biological duplicates of a high PLZF expressor Jurkat clone, cultured at low cell density (25.000 cells per ml) in the presence and absence of doxycycline, were analysed at 24, 48, 72, and 96 hours. As a result, we have identified around 70 genes, involved in diverse cellular functions, whose expression was significantly modulated by PLZF. Some of them, which have been implicated in cell death, were verified using real time RT-PCR: TERT, which has been described as anti-apoptotic, was repressed; conversely, TP53INP1, ID1 and ID3, which have been described as pro-apoptotic, were induced. The identification of these genes is consistent with the pro-apoptotic phenotype observed for PLZF, suggesting that they could be major mediators of PLZF function. Other genes confirmed by real time RTPCR included ZNF496 and IGLL1, significantly down-regulated, and MYCN, TBL1X, and TRB2, significantly up-regulated, respectively. None of these targets were significantly modulated when cultures were established at high cell density (250.000 cells per ml). At this cell density, PLZF expression did not induce growth suppression or apoptosis, suggesting that PLZF may integrate external signals before initiating specific genetic programmes that lead to growth arrest and cell death. These findings could contribute to elucidate the mechanism by which PLZF induces apoptosis, and to assess the relevance that structural alterations or abnormal expression of PLZF, respectively, may have in APL and CLL. 145.CÉLULAS T CD3+TCRGD+CD28- EN SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON MELANOMA CUTÁNEO MALIGNO. Campillo JA, Martínez-Escribano JA, Minguela A, López-Álvarez R, Marín LA, García-Alonso AM, Bensussan A, Álvarez-López MR. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Antecedentes. Previamente ha sido descrito un aumento de células T CD3+TCRgd+CD28- tras activación prolongada in vitro, o incluso durante procesos infecciosos virales. Objetivo. Investigar la expresión de la molécula co-estimuladora CD28 sobre linfocitos que expresan los receptores CD3/TCRgd en pacientes de melanoma cutáneo maligno. Metodología. Se analizaron las células T CD3+TCRgd+ en sangre periférica de 41 pacientes y 39 controles mediante citometría de flujo. Los pacientes fueron clasificados atendiendo al estadio clínico de acuerdo con los criterios establecidos por el American Joint Committee on Cancer. Resultados. El número de células T CD3+TCRgd+ circulantes estaba significativamente aumentado en pacientes en estadios clínicos I-II y III comparado con el grupo de individuos sanos. Este incremento fue mediado por una acumulación de células de la subclase T CD3+TCRgd+CD28-, la cual expresaba altas cantidades de perforina tanto en individuos sanos como en pacientes de melanoma. Conclusión. Este trabajo muestra, por primera vez, un aumento de células T CD3+TCRgd+CD28- con capacidad citotóxica en pacien- 116 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 tes de melanoma, las cuales pueden tener un papel importante en inmunovigilancia anti-tumoral. 146.PÉRDIDA DE EXPRESIÓN HLA DE CLASE I EN METÁSTASIS EN HÍGADO DE CÁNCER COLORRECTAL: MECANISMOS DE ESCAPE TUMORAL A LA INMUNOTERAPIA. Lara E1, Southgate TD2, Dangoor A2, Cabrera T1, Garrido F1, Stern PL2. 1Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Departamento de Bioquímica, Biología Molecular 3 e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada. 2Immunology Group. University of Manchester, Paterson Institute for Cancer Research, Manchester, Reino Unido Aunque se han estudiado numerosas estrategias inmunoterapéuticas en pacientes con cáncer, ha sido difícil correlacionar la inducción de una respuesta inmunológica con la producción de una respuesta clínica favorable. Las respuestas inmunológicas efectivas antitumorales pueden verse alteradas por los mecanismos de evasión inmune. Por ejemplo, la pérdida de moléculas HLA de clase I, necesarias para la susceptibilidad de los antígenos tumorales a las células T, es un evento muy frecuente en diversos tipos tumorales. Nosotros estamos caracterizando los fenotipos HLA de tumores de pacientes con metástasis en hígado de cáncer colorrectal. La inmunohistoquímica de los tumores y del tejido normal adyacente, usando AcMos locus y alelo-específicos contra antígenos HLA de clase I, ha dado como resultado algún tipo de alteración HLA en más del 50% de las muestras estudiadas. Dentro de este 50% de muestras se ha detectado pérdida de locus HLA de clase I en el 60%, mientras que el resto presentaba una pérdida específica de alguno de los alelos HLA. También se ha estudiado mediante PCR a tiempo real el nivel de transcripción de los locus HLA de clase I utilizando el RNA de las células tumorales microdisectadas con láser. Los resultados de la PCR a tiempo real demostraron una correlación entre la reducción del número de transcritos de los locus HLA de clase I y la pérdida de expresión a nivel superficial observada por inmunohistoquímica. Nuestros resultados sugieren que la combinación de distintos factores está implicada en el diferente comportamiento tumoral y en la tasa de éxito en los tratamientos inmunoterapéuticos. 147.REEXPRESIÓN DE HLA DE CLASE I EN LÍNEAS CELULARES DE MELANOMA DEFECTIVAS EN b2-m MEDIANTE EL VECTOR ADENOVIRAL b2-m (AdCMVb2m). Campo AB1, Aptsiauri N1, Mendez R1, Ruiz-Cabello F1, Gonzales G2, Melero I2, Garrido F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Dept. de Inmunología y Terapia Génica, Universidad de Navarra, Pamplona. Los linfocitos T citotóxicos juegan un papel fundamental en la eliminación de células infectadas por virus y células tumorales, requiriendo para ello de la expresión de moléculas HLA de clase I sobre estas células. Sin embargo, debido a la inestabilidad genética que caracteriza a los tumores, la expresión de HLA en la superficie de estas células se ve alterada; este hecho puede tener un efecto negativo en el reconocimiento inmune de las células tumorales. Uno de los principales mecanismos de la alteración de las moléculas HLA de clase I es el defec- Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 117 INMUNOLOGÍA to en el gen de la beta 2-microglobulina (b2-m) indispensable para su expresión en superficie. Hemos descrito previamente mutaciones de b2m en dos líneas celulares establecidas de melanoma procedentes de lesiones metastasicas de dos pacientes. Estas mutaciones estaban asociadas con la pérdida total de moléculas HLA de clase I, impidiendo su reconocimiento inmunológico por linfocitos T citotóxicos. La presentación antigénica pudo ser recuperada después de la transfección de las células de melanoma con el gen de b2-m in vitro. La infección de las líneas deficientes en b2-m con el vector adenoviral AdCMVb2-m recupera la expresión en superficie de las moléculas de HLA clase I incrementando la inmunogenicidad 148.EL POLIMORFISMO EN EL GEN NKG2D NO SE ASOCIA CON MAYOR RIESGO DE CÁNCER DE COLON O DE RIÑÓN EN POBLACIÓN DEL SUR DE ESPAÑA. Romero Noguera JM1, Saenz-López P1, Cózar JM2, Tallado M2, Vilchez JR1, Jiménez P1, Ferron A3, Garrido F1, Ruiz-Cabello F1. 1Servicio de Análisis Clínicos. 2Servicio de Urología, y 3Servicio de Cirugía General, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. NKG2D es un receptor activador que se expresa en la superficie de las células NK estimulando su citotoxicidad natural frente a ciertas dianas celulares como células neoplásicas o infectadas por virus, pudiendo participar en los procesos de inmunovigilancia tumoral. El gen NKG2D se encuentra ubicado, junto a otros locus, en una zona de 270 kb dentro del llamado complejo NK (NKC). Distintos polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en el gen del receptor NKG2D se han relacionado con el grado de actividad citotóxica NK. Los 5 polimorfismos estudiados fueron: NKC-3, NKC-4, NKC-7, NKC9 y NKC-11. Al estudiar estos polimorfismos quedó patente que NKC3 (G/C), NKC-7 (A/T) y NKC-11 (C/T) están en desequilibrio de unión, pues conociendo uno de ellos se deducen los otros dos, formando un haplotipo. El haplotipo CAT se ha relacionado con baja actividad NK, mientras que GTC se ha relacionado con alta actividad NK. De manera similar, NKC-4 (G/A) y NKC-9 (G/A) forman otro haplotipo, donde GG se ha relacionado con baja actividad NK y AA con alta actividad. Nosotros estudiamos 127 carcinomas renales, 96 carcinomas de colon y 176 controles. Para el primer haplotipo, clasificamos los casos como de baja actividad (CAT/CAT), actividad media (CAT/GTC) o alta actividad (GTC/GTC); para el otro haplotipo hicimos lo mismo. En el primer haplotipo, en carcinoma renal encontramos un 47,2% de casos de baja actividad NK, un 43,3% de actividad intermedia y un 9,4% de actividad alta; en carcinoma de colon obtuvimos un 38,6% de baja actividad, un 49,4% de actividad intermedia y un 11,9% de actividad alta. En los controles encontramos un 48,9% de actividad baja, 38% de actividad intermedia y un 13,1% de alta actividad. Al aplicar el test de chi cuadrado, no se encontró significación ni en carcinoma renal (p = 0,50) ni en carcinoma de colon (p = 0,09). En el segundo haplotipo encontramos en carcinoma renal un 63% de casos de baja actividad, 32,3% de actividad intermedia y 4,7% de actividad alta, mientras que en carcinoma de colon encontramos un 52,1% de baja actividad, un 42,7% de actividad intermedia y un 5,2% de actividad elevada. En controles un 61,4% fueron de alta actividad, un 31,8% de actividad intermedia y un 6,8% de actividad elevada. El análisis estadístico no resultó significativo para los casos de carcinoma renal (p = 0,75) ni para los casos de carcinoma de colon (p = 0,20). POSTERS 149.CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA DE MELANOMA CON PÉRDIDA TOTAL DE EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS HLA DE CLASE I. Rodríguez T1, Méndez R1, Aptsiauri N1, Campo AB1, Jiménez P1, Zinchenko S1, Gallego A1, Ruiz-Cabello F1, Gaudernak G2, Garrido F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Section for Immunotherapy, Department of Immunology, Cancer Research Institute, The Norwegian Radium Hospital, University of Oslo, Oslo, Noruega. Las células T citotóxicas (CTLs) juegan un papel central en la eliminación de células infectadas por virus y células tumorales, siendo necesario para ello la expresión de moléculas HLA de clase I. No obstante, la pérdida total de estas moléculas en la superficie celular es un mecanismo frecuente empleado por el tumor para evadir la inmunovigilancia. Tres mecanismos principales han sido descritos en células con pérdida total de clase I en células tumorales: mutaciones en b2-microglobulina (b2m), deficiencias en TAP, y baja afinidad en la unión de los elementos reguladores de esos genes. El objeto de esta comunicación es la descripción de otros mecanismos molecular responsables de la ausencia de expresión de moléculas HLA de clase I en una línea tumoral procedente de un paciente con melanoma. La línea celular denominada M010, es totalmente negativa para la expresión de HLA de clase I tanto en condiciones basales como tras el tratamiento de Interferón gamma. En cambio, en esta línea se detecta la presencia por inmunoflourescencia indirecta de una acumulación de b2m y de la cadena pesada intracitoplasmática. Los genes involucrados en la maquinaria de procesamiento antigénico (LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2) fueron estudiados mostrando un nivel de transcripción similar a la encontrada en líneas tumorales positivas para la expresión de moléculas HLA de clase I en superficie. Estos resultados sugieren un defecto en la formación del complejo de cadena pesada-b2m hasta el momento desconocido. 150.EL POLIMORFISMO DEL GEN CTLA-4 SE ASOCIA A UN MAYOR RIESGO DE DESARROLLO DE CÁNCER RENAL. Saenz-López P1, Romero Noguera JM1, Cózar JM2, Tallado M2, Vilchez JR1, Jiménez P1, Ferron A3, Garrido F1, Ruiz-Cabello F1. 1Servicio de Análisis Clínicos y 2Servicio de Urología Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. El polimorfismo de genes que codifican citoquinas y otras proteínas reguladoras de linfocitos puede influenciar en el control de procesos de respuesta inmune, tales como procesos inflamatorios, autoinmunes o antitumorales. En nuestro caso, hemos estudiado polimorfismos génicos de un solo nucleótido relacionados con distintos grados de actividad de la molécula producida. Hemos estudiado polimorfismos de CTLA-4, IL-4 e IL-10 en 117 pacientes con carcinoma renal, 96 pacientes con carcinoma de colon y en 196 controles sanos, todos procedentes del área de Granada (España), para comprobar si existen diferencias estadísticamente significativas en la distribución de frecuencias de los polimorfismos estudiados. Las frecuencias estudiadas no fueron estadísticamente significativas para los polimorfismos estudiados de IL4 e IL10, siendo los porcentajes obtenidos similares entre casos y controles. En el gen CTLA-4 se estudiaron dos polimorfismos, CTLA4/CT60 y CTLA4/A49G, que influyen en la cantidad producida y en la actividad biológica, respectivamente, de este factor inmunosupresor. En el polimorfismo CT60 encontramos una mayor frecuencia del genotipo AA en pacientes con cáncer renal que en controles (p= 0,005; OR= 2,12; IC 95%: 1,28-3,50) y en el polimorfismo A49G obtuvimos una mayor frecuen- 117 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 118 POSTERS cia del genotipo AA, también al comparar las frecuencias de los casos de carcinoma renal con la de los controles (p= 0,022; OR=1,76; IC 95%: 1,11-2,80). Los genotipos que aparecen con mayor frecuencia en pacientes con carcinoma renal se han relacionado con una mayor producción (CT60) y con una mayor actividad biológica (A49G) de este factor inmunosupresor. También encontramos correlación entre el polimorfismo CT60 y el grado tumoral en los casos de cáncer renal (p = 0,022). En los casos de carcinoma de colon se encontraron diferencias con los controles en ninguno de los polimorfismos estudiados. 151.DIFERENTES ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS HLA DE CLASE I ENCONTRADAS EN EL ESTUDIO DE CUATRO LÍNEAS CELULARES DE PRÓSTATA. Méndez R1, García Ruano A1, Campo AB1, Aptsiauri N1, Zinchenko S1, Cantón J1, Ward S2, Ruiz-Cabello F1, Garrido F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Onyvax Ltd, St George's Hospital Medical School, London, Reino Unido. El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte en la mayoría de los países desarrollados. El desarrollo de esta enfermedad puede estar probablemente influenciado por factores genéticos. Uno de esto factores que puede influenciar la progresión del cáncer prostático es la expresión de los antígenos HLA en estas células tumorales, dado que la pérdida de estas moléculas en la superficie celular es un mecanismo frecuente empleado por el tumor para evadir la inmunovigilancia. El objeto de esta comunicación es la caracterización de la expresión de los antígenos HLA de clase I en cuatro líneas celulares de próstata establecidas de metástasis procedentes del proyecto europeo ENACT, siendo cedidas a éste por Onyvax. De las cuatro líneas estudiadas, una de ellas (OPCN-3) fue totalmente negativa para la expresión en superficie de HLA de clase I, tanto en condiciones basales como tras el tratamiento con Interferón gamma. Al estudiar el gen de la b2-microglobulina en esta línea, observamos una deleción de aproximadamente 300 pb mediante RT-PCR. La secuenciación de este fragmento mostraba la ausencia del exón 2. No obstante este fragmento se encontraba presente en el DNA genómico. Se ha secuenciado el DNA genómico de las secuencias que flanquean el exón 2 y no se ha encontrado mutación en el sitio aceptor de «splicing». La línea celular OPCN-1 fue positiva para la expresión de W6/32 (HLA-ABC). No obstante, presentó una baja regulación del locus HLA-B inducible tras el tratamiento con Interferón gamma. Esta baja regulación fue también observada a nivel transcripcional, no encontrándose transcritos para el locus B en condiciones basales. El tipaje genómico de esta línea fue A*0101,2301/B*3701,4001/C*0304,0602. Tras el tratamiento con IFN-gamma sólo se pudo observar la recuperación del antígeno B*3701 con un anticuerpo anti Bw4, en cambio no se pudo observar la presencia de B*4001 . Las otras dos líneas celulares fueron positivas para la expresión de moléculas HLA de clase I en superficie. 152.DISTRIBUCIÓN DE FENOTIPOS HLA ALTERADOS EN 92 LÍNEAS CELULARES DE MELANOMA. Rodríguez T1, Méndez R1, Campo AB del1, Monge E1, Jiménez P1, Ruiz-Cabello F1, Gallego A1, Pawelec G2, Garrido F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Section for Transplantation Immunology and Immunohaematology, Zentrum für Medizinische Forschung, Tübingen, Alemania. Introducción y metodología. En este estudio, hemos aplicado una metodología para el análisis integral de los antígenos HLA de clase I 118 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 en líneas celulares de melanoma. Se ha estudiado la expresión de las moléculas HLA de clase I en 92 líneas celulares de melanoma procedentes del proyecto Europeo ESTDAB. La expresión de las moléculas HLA de clase I fue evaluada mediante la intensidad media del canal del fluorescencia (MFI) mediante citometria de flujo y el estudio de expresión génica para varios genes (cadena pesada HLA de clase I, b2m, LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2) mediante PCR cuantitativa a tiempo real, siendo realizado a las mismas el tipaje genómico. Resultados. 11% de las líneas estudiadas han sido incluidas en el Fenotipo I. De esas líneas un 2% presentan una ausencia total de moléculas HLA de clase I (Fenotipo Ia) debido a defectos en el gen de la b2-m, las 8 líneas restantes, con Fenotipo Ib (9%), se caracterizan por una baja regulación de las moléculas HLA de clase I (HLA-ABC, MFI<100). A su vez, estas líneas poseen baja expresión de las moléculas LMP-7 y TAP-2. En un 15% de las líneas se observa la pérdida de haplotipo (Fenotipo II) mediante tipaje genómico. El 21 % de las líneas celulares de melanoma presentaron una baja regulación del locus HLA-B (Fenotipo III) (HLA-B, MFI< 50). Seis líneas (7% de los casos) presentaron la combinación de dos o mas fenotipos (Fenotipo compuesto o Fenotipo V). Solamente 2 líneas celulares no mostraron respuesta al IFN-γ, aunque presentaban respuesta al tratamiento con IFNα. En las 39 líneas celulares (42%) restantes, ninguna alteración HLA de clase I pudo ser identificada. Conclusión. La pérdida de expresión de los antígenos HLA de clase I es un fenómeno frecuente y heterogéneo en tumores y en algunos casos es el resultado de cambios genéticos irreversibles en cromosoma 6 y el 15 los cuales pueden afectar la inmunidad antitumoral e interferir con protocolos de inmunoterapia. 153.REGULACIÓN Y FUNCIÓN DEL LIGANDO DE MUERTE TRAIL EN CÉLULAS T. Ruiz-Magaña MJ, Morales JC, Ruiz-Ruiz C. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada. TRAIL es un ligando de muerte que pertenece a la superfamilia TNF. La importancia de este ligando se basa en su capacidad para inducir apoptosis en células tumorales y no en células normales, aunque existen algunas células tumorales que son resistentes a la acción de TRAIL. En estudios preclínicos se ha comprobado que puede inhibir el crecimiento de tumores de mama y de colon y el desarrollo de metástasis, sin presentar toxicidad como le ocurre a CD95L. Al igual que en otros tipos celulares del sistema inmunológico, TRAIL se expresa en células T en respuesta al tratamiento con interferones o a la activación del TCR, pudiendo mediar la actividad antitumoral de dichas células. El objetivo de este trabajo es conocer la implicación del factor de transcripción NFAT en la regulación de la expresión de TRAIL en células T activadas. Para ello hemos llevado a cabo ensayos de actividad luciferasa utilizando diferentes fragmentos del promotor de TRAIL y analizando la activación de los mismos en respuesta al tratamiento con ésteres de forbol y/o iónoforos de calcio. Se ha analizado también la expresión del ARNm de TRAIL en células T activadas y en respuesta al tratamiento con ciclosporina A. Finalmente, se han realizado experimentos de cocultivo de distintas líneas tumorales, sensibles o no a TRAIL, con linfocitos T activados y en reposo. Los resultados obtenidos de este estudio demuestran que linfocitos T activados pueden inducir apoptosis en células tumorales sensibles a TRAIL y que el factor de trascripción NFAT participa en la regulación de la expresión de TRAIL a nivel de ARNm en dichas células Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 119 INMUNOLOGÍA T activadas, debiendo existir algún sitio de unión y regulación por dicho factor en una región de 165 pb en dirección 5' desde el sitio de inicio de trascripción. 154.RECEPTORES KIR2D SOBRE CÉLULAS TCD8 Y NK EN SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON MELANOMA. IMPORTANCIA DEL FENOTIPO HLA-C. Campillo JA, Martínez-Escribano JA, Moya-Quiles MR, Marín L, Muro M, Guerra N, Parrado A, Campos M, Frías JF, Minguela A, García-Alonso AM, Álvarez-López MR. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Introducción. Las células TCD8 y NK están implicadas en la respuesta inmune contra el melanoma. Su actividad citotóxica está regulada por el balance entre señales de inhibición y de activación mediadas por receptores killer pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas (KIR). Dado que los receptores KIR y sus correspondientes ligandos en el locus HLA-C han sido recientemente asociados con diferentes patologías, incluyendo enfermedades tumorales, estuvimos interesados en el siguiente objetivo. Objetivo. Investigar cambios tempranos en el número de células TCD8 y NK que expresan receptores KIR2D en diferentes grupos de dimorfismo HLA-C de pacientes con melanoma. Metodología. Se analizaron las células TCD8 y NK CD56 en sangre periférica de 38 pacientes y 37 controles mediante citometría de flujo. El dimorfismo HLA-C en posición 80 se realizó mediante PCRSSP y/o PCR-SSO. Resultados. En 32 de un total de 38 pacientes no se detectó metástasis en el ganglio centinela. Las células T CD8+CD28-CD158a+ y NK CD56+CD158a+ estaban significativamente aumentadas en pacientes no metastáticos y homocigotos para HLA-CLys80, mientras que en heterocigotos solo se encontró aumentada la población de células NK CD56+CD158a+. También se observó un aumento de la expresión del receptor CD158a sobre células NK, pero no en células T, de pacientes en estadio avanzado. Conclusión. El presente trabajo describe, por primera vez, un aumento de las células TCD8 y NK CD56 que expresan el receptor CD158a en pacientes que portan el correspondiente ligando HLA-C, lo cual puede ser de interés en el planteamiento de terapias inmunes individualizadas. 155.EXPRESIÓN DEL EPÍTOPO A-10 EN LÍNEAS CELULARES DE TUMOR DE PULMÓN HUMANAS Y SU REACTIVIDAD CON ANTICUERPOS NATURALES DE CLASE IGM. Cillero L, Moltó L, López-Asenjo JA, Trancho H, Subiza-Lestache JL. Hospital Clínico San Carlos. Madrid. Introducción. El Ac-A-10 es un anticuerpo monoclonal originalmente seleccionado por su reactividad frente a células de tumor murino de Ehrlich. Identifica un epítopo de carbohidrato dentro de la mucina MUC-1 presente en adenocarcinoma de colon humano. La expresión de este epítopo tiene valor de factor pronóstico en cáncer de colon y se correlaciona con la reactividad de IgM natural con este tipo de tumores. Objetivo. Valorar la expresión del epítopo A-10 en Cáncer de pulmón humano y su relación con la reactividad de IgM natural en el suero de individuos sanos. Material y métodos. La reactividad de IgM natural se ha ensayado tanto por Inmunofluorescencia de superficie como por células per- POSTERS meabilizadas por citospin frente a diferentes líneas de tumor de pulmón humanas tales como H-1355, Calu-3, H-1299, A-549 cedidas por ATTC. La muestra ascendió a n=115. Analisis estadístico. Las variables cuantitativas se resumen en Mediana y Rango Intercuartílico (P25 y P75). La correlación se evaluó mediante el Coeficiente de Correlación de Spearman. La comparación de medianas se realizó mediante el Test de U de Mann- Whitney y Kruskal Wallis. El paquete informático utilizado fue SPSS 12. Resultados. Diferentes Líneas de tumor de pulmón humanas tienen diferente expresión del epítopo A-10. H-1355 y Calu-3 son altamente positivas mientras que A-549 y H-1299 son negativas. Existe una muy buena correlación entre la expresión del epítopo A-10 y la reactividad de IgM natural de los sueros de los individuos testados con las líneas H-1355 y Calu-3 (p< 0,001, r = 0,82) frente a la encontrada con las líneas A-549 y H-1299 (p< 0,001, r = 0,50). Datos que se corroboran con el análisis descriptivo de un subgrupo (n=26) por Inmunofluorescencia por Citospinas, el 78% de los sueros que fueron positivos para H-1355 lo son para Calu-3 por otra parte las líneas A-549 y H-1299 fueron negativas para los sueros analizados. Conclusión. Los anticuerpos naturales de tipo IgM y el anticuerpo monoclonal A-10 reaccionan con un epítopo de carbohidrato presentes en células de tumor de pulmón humanas. 156.ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA EXPRESIÓN DE ZAP-70 EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA (LLC) POR CITOMETRÍA DE FLUJO (CF). Olivares N, Alonso M, Emparanza J, Trassorras M, Cuadrado E, Echániz P. Laboratorio de Inmunología. Hospital Donostia. El curso clínico de los pacientes con LLC es heterogéneo y algunos requieren terapia temprana, mientras que otros no la necesitan durante años. La presencia o ausencia de mutaciones somáticas en los genes Ig VH es un factor pronóstico considerado como «gold-standar», pero esta técnica es cara y laboriosa. la expresión de la proteína ZAP70 se ha propuesto como alternativa del estatus mutacional somático. La interpretación de los resultados de expresión de ZAP-70 por C.F. es compleja y varía según el método de análisis. Material y métodos. Hemos analizado la expresión de ZAP-70 en 65 casos de LLC utilizando dos métodos alternativos :1) Teniendo en cuenta la expresión de ZAP-70 en linfocitos T, y 2) Teniendo en cuenta la ratio de intensidad media de fluorescencia (IMF) entre LLC-B/L-T. Comparamos los resultados por tres métodos de análisis estadistico: 1) Valoración continuada, 2) Valoración categorizada, 3) Valoración de indeterminados. Resultados. Analizando el grado de concordancia o acuerdo entre 2 determinaciones a escala cuantitativa continua mediante análisis gráfico de Bland y Altman, se aprecia una diferente coincidencia de la determinación en diferentes regiones de «rango de proteína» r: 0,645 p< 0,001, por lo que concluimos que los dos métodos no tienen un acuerdo estadístico suficiente. Hemos categorizado las determinaciones y determinado la kappa de Cohen k:0.521 p< 0,001 lo que puede considerarse como un acuerdo moderado en la escala de Landis. El porcentaje de indeterminados (20-30% de expresión de ZAP-70) es mayor en el método de IMF (33%) que en el método que tiene en cuenta la expresión de ZAP-70 en L-T (16%). Conclusiones. Los resultados entre ambos métodos tienen un acuerdo moderado y no son superponibles. 119 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 120 POSTERS El porcentaje de incertidumbre es mayor cuando se tiene en cuenta el método de la IMF. La significación de ambos tipos de análisis en relación con los datos clínicos esta siendo evaluada en estos momentos. 157. VALORACION CLINICA, IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE PROTEINAS INMUNES EN GAMMAPATIAS MONOCLONALES. TALLERES DE INMUNOQUIMICA. 20042005. Sequí Navarro J1*, Rodríguez Molina JJ2*, Villar Guimerans LM3*, Juárez Rubio C4* y el Grupo de Trabajo de Inmunoquímica5 (M. Alsina Donadeu; E.M. Martínez Cáceres; M.J. Amengual Guedaní; M.J. Rodrigo Anoro; C. Cámara Hijón. L. Fernández Pereira; P. Sanchez Mozo; I. Alarcón Torres; P. González Porqué; P. Varela Peña; L. Allende Martínez; M.J. Sentchordi Izquierdo; M.J. Sanchez Alonso; C. Jiménez Garófano; C. Muñoz Calleja; M. López Trascasa; N. Fernández Arcas; R. Álvarez López; J. Ferrer Balaguer; M. López Hoyos; L. Larrad Mur; R. Garcia Delgado y J. Yagüe Ribes). Servicios de Inmunología: 1Hospital Carlos III, Madrid; 2Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid; 3Hospital Ramón y Cajal, Madrid; 4Hospital de Sant Pau. Barcelona; 5Grupo de Trabajo de Inmunoquímica (Hospital Mutua de Terrassa. Terrasa. Barcelona; Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona; UDIAT-CD. Corporació Sanitaria Parc Taulí. Sabadell.Barcelona; Hospital Vall d'Hebron. Barcelona; Hospital de Cruces. Baracaldo. Bilbao; Hospital San Pedro de Alcántara. Cáceres; Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo. La Coruña; Hospital de Gran Canaria«Dr. Negrín». Las Palmas Gran Canaria; Hospital 12 de Octubre. Madrid; Hospital Central de la Defensa. Madrid; Hospital de la Princesa. Madrid; Hospital Universitario «La Paz». Madrid; Hospital «Carlos Haya». Málaga; Hospital Virgen Arrixaca. Murcia; Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. Baleares; Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander; Hospital Clínico Unive rsitario. Zaragoza; Fundación Jiménez Díaz . Madrid y Hospital Clinic. Barcelona).*Coordinadores. Taller SEI 2004 y 2005. Los Talleres de Inmunoquímica (IQ) de la Sociedad Española de Inmunología son herramientas de estandarización basados en ejercicios colaborativos de íntercomparación para validar los métodos analíticos. Sus resultados se expresan unidades homologadas por Organizaciones Internacionales (Internacional Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.IFCC) Las gammapatias monoclonales (GM) se definen por la presencia de uno o mas Componentes Monoclonales (CM). La prevalencía de los CM en la población sana < 60 años es un 0,2% y en los individuos > 80 años se eleva a un 10%. El estudio del Perfil de Proteínas Inmunes del CM, según las recomendaciones de los Grupo Internacional de Mieloma y de las GM de Significado Incierto incluye las determinaciones en: 1. Suero: análisis de la concentración de proteínas totales, electroforesis de la muestra y concentración de la proteína monoclonal. 2. Orina: determinación de la concentración de proteínas en el volumen de 24 horas, electroforesis y concentración de la proteína monoclonal. 3. En suero y en orina: definición de la clase y el tipo de proteína monoclonal. 4. En suero: determinación de la concentración de Inmunoglobulinas (Igs) y relación de cadenas ligeras libres (CLL) (kappa y lambda CLL). El objetivo primordial del estudio es confirmar la presencia del o los CM en muestras biológicas, con criterios homogéneos, en todos los laboratorios de Inmunología participantes. 120 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 En los Talleres de IQ (2004 y 2005) se remitieron a los responsables de los laboratorios (2004, n=21), (2005, n=22) un total de 9 muestras para valorar el CM. En ellas se estudio el Perfil de Proteínas Inmunes, para ello se identifico el CM y se determino la concentración de las Igs: IgG, IgA, IgM, cadenas ligeras totales (CLT) kappa y lambda, con las técnicas habituales empleadas en la practica clínica en cada uno de los laboratorios participantes. En el Taller de IQ-2004 se analizaron 4 CM (IgG lambda, IgD lambda, IgM kappa e IgG kappa), y en el Taller IQ-2005 se analizaron 5 muestras (cadenas pesadas mu, IgG kappa, IgG policlonal, IgA lambda e IgG lambda).Se evaluaron los valores medios de las cuantificaciones de las Igs monoclonales y el coeficiente de variación (%CV) de resultados obtenidos por los laboratorios participantes. En cuatro de las muestras el isotipo monoclonal mostró un %CV > 10 , en otras 4 muestras el %CV < 10 y la muestra de la proteína IgD del CM IgD lambda no se cuantifico: Se observo que estas diferencias dependen del método y equipo empleado ( nefelometría y turbidimetría). La relación del estudio de las CLT kappa/ lambda ( rango 1,292,61) muestra predominio de cadenas kappa en los tres CM asociados a la CL kappa, y en la muestra remitida de hipergammaglobulinemia policlonal. En la vertiente de las CL lambda se observa aumento en dos CM lambda, y se encuentra dentro del rango en otros dos CM lambda y en la muestra de cadena pesada mu, por lo que la relación CLT kappa/ lambda requiere su valoración dentro del Perfil de Proteínas Inmunes y establecer su significado clínico. Finalmente concluimos que en el control de calidad en las GM es aconsejable emitir un informe del Perfil de Proteínas Inmunes de los CM, con la descripción de los métodos, y equipos, para el diagnostico y seguimiento de las distintos procesos clínicos en las neoplasias linfoides y hematológicas 158.ACTIVIDAD ANTITUMORAL DEL ESCUALENO, COMPONENTE MINORITARIO DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA, EN DOS LÍNEAS TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA (MDA-MB-231 Y MCF7). Ruiz-Mora J, Warleta F, Serrano MJ, Campos M, Algarra I, Gaforio JJ. Área de Inmunología. Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad de Jaén. Introducción. Las propiedades saludables del Aceite de Oliva Virgen Extra (AOVE) son cada vez más reconocidas. Diversos estudios epidemiológicos describen la correlación inversa entre el consumo habitual de AOVE y la aparición de determinados tipos de tumores. El Escualeno, componente con propiedades antioxidantes, se encuentra en grandes cantidades en la fracción insaponificable del AOVE, su rango oscila ente 136 y 708 mg/100 g. Nuestro grupo, esta interesado en estudiar la actividad antitumoral del Escualeno sobre células tumorales de cáncer de mama. Como modelo experimental utilizamos las líneas tumorales MDA-MB-231 (receptor estrogénica negativa) y, MCF7 (receptor estrogénica positiva). Realizamos in vitro ensayos de citotoxicidad, proliferación celular, ciclo celular y de apoptosis. Metodología. Las líneas tumorales utilizadas son MDA-MB-231 y MCF7. Utilizamos diferentes concentraciones de Escualeno para tratar las líneas tumorales. Para realizar los estudios de citotoxicidad y proliferación celular, utilizamos ensayos colorimétricos en placa de 96 pocillos mediante la técnica de XTT; los estudios de apoptosis se realizan con Citometría de Flujo y mediante marcaje con Anexina V-FITC/IP; los estudios de ciclo celular se realizan mediante Citometría de Flujo Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 121 INMUNOLOGÍA y marcaje con Ioduro de Propídio, y completados con estudios de microscopia confocal de fluorescencia. El tratamiento estadístico de los datos se realiza mediante cálculo de promedios y errores. Resultados: • Citotoxicidad MDA-MB-231 (Expresada en % ± SD) – Control 100,00 ± 0,03 – ESC 1 µM 101,80 ± 0,09 – ESC 10 µM 107,18 ± 0,05 – ESC 100 µM 108,93 ± 0,06 – ESC 1000 µM 107,50 ± 0,07 • Citotoxicidad MCF7 (Expresada en % ± SD) – Control 100,00 ± 0,05 – ESC 1 µM 107,97±0,12 – ESC 10 µM 111,04±0,10 – ESC 100 µM 100,99±0,11 – ESC 1000 µM 97,14±0,09 • Proliferación MDA-MB-231 (Expresada en % ± SD) – Control 100,00 ± 0,08 – ESC 1 µM 94,71 ± 0,05 – ESC 10 µM 98,64 ± 0,04 – ESC 100 µM 103,55 ± 0,06 – ESC 1000 µM 102,67 ± 0,09 • Proliferación MCF7(Expresada en % ± SD) – Control 100,00±0,03 – ESC 1 µM 100,07±0,04 – ESC 10 µM 97,35±0,03 – ESC 100 µM 97,85±0,06 – ESC 1000 µM 100,89±0,06 • Apoptosis mda-MB-231(Valores expresados en %) Apoptosis Necrosis – Control 20,30 5,17 – ESC 50 µM 17,14 5,16 – ESC 200 µM 13,16 5,13 • Apoptosis MCF7 (Valores expresados en %) Apoptosis Necrosis – Control 57,62 4,48 – ESC 50 µM 54,07 3,83 – ESC 200 µM 58,73 3,04 • Ciclo celular MDA-MB-231(Valores expresados en %) G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M – Control 61,70 18,52 15,92 – ESC 50 µM 63,37 18,43 13,88 – ESC 200 µM 65,64 17,61 12,12 • Ciclo celular MCF7(Valores epresados en %) G0/G1 S G2/M – Control 64,62 16,29 15,61 – ESC 50 µM 67,07 14,76 14,77 – ESC 200 µM 65,86 16,06 14,97 Conclusión. Son numerosas las propiedades saludables que se atribuyen al Aceite de Oliva, entre ellas una posible actividad antitumoral, correlacionandose las características antioxidantes de aquel con esta actividad. Nuestros resultados in vitro con las líneas tumorales MDA-MB-231 y MCF7, aún siendo preliminares, muestran que el Escualeno, y a las concentraciones manejadas, no tiene efectos significativos sobre la proliferación celular, ciclo celular, capacidad de inducir apoptosis ni posee actividad citotóxica. Ello sugiere que la capacidad antioxidante es independiente de la actividad antitumoral en este componente del AOVE. POSTERS 159.DIFERENCIACIÓN IN VITRO DE CÉLULAS T CD8 MART-1 ESPECÍFICAS NAÏVE: CORRELACIÓN DE LA FUNCIÓN EFECTORA CON FENOTIPO Y PROLIFERACIÓN. Casado JG, DelaRosa O, Durán E, Peralbo E, Barahona F, Solana R, Tarazona R. Universidad de Extremadura, Departmento de Fisiología, Área de Inmunología, Facultad de Veterinaria, Cáceres. Universidad de Córdoba, Departmento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Córdoba. Universidad de Extremadura, Unidad de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Veterinaria, Cáceres. Universidad Autónoma, Centro de Biología Molecular, Madrid. En este trabajo se han caracterizado los lifocitos T CD8 MART-1 específicos circulantes y expandidos in vitro de donantes sanos en relación con su estadio de diferenciación y su capacidad citotóxica. La frecuencia de linfocitos T CD8 MART-1 específicos se ha determinado mediante pentámeros MART-1 y la expansión in vitro de células T CD8 específicas se realizó mediante estimulación antóloga con la fracción CD8 negativa incubada con el péptido ELAGIGILTV. El fenotipo se analizó por fluorescencia multiparamétrica y la funcionalidad por ELISPOT y ensayos de citotoxicidad. Los resultados demostraron que los lifocitos T CD8 MART-1 específicos circulantes de donantes sanos exhiben un fenotipo naïve y que el protocolo utilizado para la expansión in vitro expande eficientemente un alto número de CTLs MART-1 específicos. En función de la capacidad de proliferación se obtuvieron CTLs MART-1 específicos efectores/memoria (CD45RA–CCR7–) y CTLs MART-1 específicos efectores (CD45RA+CCR7–) que fueron no citotóxicos y citotóxicos respectivamente. En conclusión, la estimulación in vitro de linfocitos T CD8 MART-1 específicos naïve produce CTLs MART-1 específicos con diferentes fenotipos activados en función de su historia replicativa. 160.LINFOMA T EN PACIENTE CON TRASPLANTE HEPÁTICO. Rodríguez-Martín E1, Martínez-Viñambres E1, Villarrubia N1, García-Trujillo JA1, Berlinches A2, Santón A2, Coll J1, Roldán E1. 1Servicio de Inmunología. 2Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Ramón y Cajal. Madrid. Los síndromes linfoproliferativos post-trasplante (PTLDs) se desarrollan como consecuencia de la inmunosupresión a la que es sometido el receptor de un órgano sólido o de médula ósea. Los PTLDs pueden ser de naturaleza policlonal, generalmente inducidos por EBV, o de naturaleza clonal, en la mayoría de los casos linfomas (EBV positivos o negativos), con un claro predominio de linfomas B con respecto a los linfomas T. El riesgo de padecer un linfoma varía en función del tipo de órgano trasplantado y del régimen de inmunosupresión. La incidencia de los PTLDs en los receptores de trasplante de órgano sólido es inferior al 2%, representando el trasplante hepático un riesgo intermedio respecto al mayor riesgo que presentan los receptores de pulmón y corazón (5%). El caso clínico que se presenta es el de una mujer de 35 años con dolor abdominal generalizado de 7 días de duración acompañado de naúseas y vómitos. La paciente refiere aumento de perímetro abdominal de forma progresiva, sin aumento de edemas en miembros inferiores. Asimismo, refiere astenia sin fiebre ni sensación distérmica. La paciente padece hepatitis crónica por VHB+D y recibió un trasplante hepático en 2004. Los resultados obtenidos mostraron múltiples adenopatías mediastínicas, mesentéricas y retroperitoneales, ascitis y hepatoesplenomegalia homogénea. En la analítica se observó leucopenia con plaque- 121 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 122 POSTERS topenia. Se realizaron estudios de citometría de flujo en muestras de sangre periférica, aspirado de médula ósea, PAAF, líquido ascítico y líquido pleural. En todas las muestras, salvo en el líquido pleural, se detectó la presencia de una población tumoral de linfocitos T, con fenotipo: CD4+, CD3+ (intensidad inferior a la habitual), CD56-, CD2+, CD5+, CD7+, TCR alfa beta+. La población linfomatosa aparecía leucemizada en un pequeño porcentaje (1% de los leucocitos totales en sangre periférica y 1,2% de la celularidad total medular). Mediante técnica de PCR se detectó un reordenamiento clonal de la región variable del gen TCR gamma en la muestra de líquido ascítico. Estos datos muestran, de nuevo, como la citometría de flujo es capaz de detectar procesos clonales T, incluso con un muy bajo porcentaje de células tumorales y con una única aberración fenotípica (alteración en la intensidad media de fluorescencia del antígeno CD3). 161.EXPRESIÓN DE LIGANDOS DE RECEPTORES ACTIVADORES DE LA CITOTOXICIDAD NK EN MELANOMA: ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR. Marín J, Casado JG, Sánchez-Correa B, Delgado E, Durán E, Solana R, Tarazona R. Área de Inmunología, Departamento de Fisiología, Universidad de Extremadura, Cáceres. La activación de células NK depende de un complejo balance entre señales de activación e inhibición. Para moléculas de MHC clase I se han descrito receptores NK activadores e inhibidores de la citotoxicidad. Por otro lado, se han descrito receptores activadores y co-receptores que no son específicos para moléculas MHC clase I y que intervienen en el reconocimiento y la eliminación de células tumorales. En este trabajo se han estudiado líneas celulares de melanoma procedentes de los proyectos europeos OISTER y ESTDAB (http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/index.html) para analizar la expresión de ligandos del receptor activador NKG2D. Los resultados mostraron que la mayoría de las líneas de melanoma expresan MICA/B y con menor frecuencia ULBPs. El papel de la interacción NKG2DMICA/B en la lisis de células de melanoma ha sido evaluado utilizando una línea celular NK (NKL). Los resultados obtenidos demostraron que la interacción NKG2DMICA/B representa un mecanismo efector muy importante en el reconocimiento y eliminación de células de melanoma mediado por células NK. Sin embargo, aunque estos resultados apoyan el papel de NKG2D en la defensa contra el melanoma, la expresión de MICA/B en las células de melanoma no siempre se correlaciona con su susceptibilidad a la lisis mediada por las células NK. Así, en ausencia de señales inhibidoras mediadas por receptores inhibidores de la citotoxicidad, algunas líneas de melanoma MICA/B+ son resistentes a la lisis NK sugiriendo que otras interacciones receptor activador/ligando pueden ser requeridas. 162. INCREASED EX VIVO APOPTOSIS IN PERIPHERAL BLOOD NAÏVE/EFFECTOR/MEMORY T LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS OF B-CLL PATIENTS. Chara L, Diaz D, Chevarria J, Monserrat J, Prieto A, Mur S, Sanchez M, Barcenilla H, Acuña L, Villarroel M, Alvarez-Mon M. ÁCNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has been described in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) patients. 122 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 We have analyzed the apoptosis in specifically defined naïve/effector/memory T lymphocyte circulating subpopulations of B-CLL patients. OBJECTIVE: To quantify spontaneous and induced apoptosis in lymphocytes of B-CLL patients with regard to a control population of sex and age matched healthy individuals and with regard to the zap-70 expression. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 untreated BCLL patients diagnosed according to Binet criteria (Binet A stage, 4 zap-70+ and 3 zap-70-) and 6 healthy controls were purified and characterized using monoclonal antibodies and annexin V by eight color flow cytometry in a FACSAria sorter. The apoptotic index (AI) of lymphocyte subsets were determined after 24 hour culture under two conditions: spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinin induction. Results. A marked increase in spontaneous ex vivo apoptosis was found in peripheral blood T lymphocytes from B-CLL patients with respect to healthy controls. This increased apoptosis was impressive in the naïve subset (CD45RA+CD27+) from both CD4+ and CD8+ T lymphocyte subpopulations. The effector and memory CD4+ T subsets of zap-70+ B-CLL patients presented an increased apoptosis with regard to healthy controls. Apoptosis of CD4+ T cell subsets were higher in zap-70+ B-CLL patients than in zap-70patients. Similar differences in AI were found in mitogen-induced T cell apoptosis. Conclusions: Patients with B-CLL show an impressive increase in spontaneous and mitogen-induced apoptosis within naïve CD4+ and CD8+ T-cell subsets. This increased T lymphocyte apoptosis was specially marked in poor prognosis zap-70+ B-CLL patients. 163.LYMPHOCYTE APOPTOSIS IS MARKEDLY INCREASED ON PATIENTS WITH METASTATIC RENAL CELL CARCINOMA. Chara L1, Diaz D1, Chevarria J1, Navas V2, Carballido J3, Prieto A1, Monserrat J1, Barcenilla H1, Sánchez M1, Acuña L1, Villarroel M, Jimenez E, Olaverria M, Álvarez-Mon M1. 1CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Clinical Oncology Research Unit, University Central Hospital of Asturias, Oviedo. 3Department of Urology, University Hospital «Puerta de Hierro», Madrid. Background. There are no studies regarding the incidence of ex vivo apoptosis in specific lymphocyte subpopulations obtained from peripheral blood of patients with renal cell carcinoma. The currently used indicator, apoptotic index (AI), measures the presence of apoptosis in a phenotypically defined cell population quantified by flow cytometry. OBJECTIVES: To quantify spontaneous and mitogen-induced apoptosis in lymphocytes of renal carcinoma patients with regard to a control population from healthy individuals. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 patients with renal carcinoma and 6 healthy controls were purified and characterized in a FACSCalibur cytometer using fluorocromo-labeled monoclonal antibodies. The AI (or percentage of apoptotic cells, AI x 100) was calculated for T-cells expressing CD3, CD4, CD8, CD56, HLA-DR, CD25 and CD45RO/RA antigens and NK-cells (CD3-CD56+ or CD3-CD16+). These AI were determined after 24 hours of culture under two conditions: spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinin induction. Comparisons between patients and healthy controls were carried out using the non parametric Mann-Whitney test and considered significant when p<0.05. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 123 INMUNOLOGÍA Results. A significant increase (between 2.5 and 12 folds) in spontaneous ex vivo apoptosis was found in peripheral blood lymphocytes from renal carcinoma patients. This increase occurred in T-cells and NK-cells. We observed in the CD4+ subpopulation for the CD45RA+ and CD45RO+ subsets, as well as in the CD8+ subpopulation for the CD45RA+ and CD45RO+ subsets. An increase of apoptosis was also observed in CD3-CD56+ and CD3-CD16+ NK-cells. We also found an apoptosis increase in total T-cells, CD4+ T-cells and CD8+ T-cells expressing CD25 and CD3+HLA-DR+, CD3+CD8+HLA-DR+ cells. Similar increases in AI were found in mitogen induced apoptosis of lymphocyte subsets from mRCC patients. Conclusions. We have found impressive increases of spontaneous and mitogen induced apoptosis within several T-cell subsets of renal carcinoma patients. 164.GENERACIÓN DE AGENTES ANTIANGIOGÉNICOS MULTIVALENTES Y MULTIESPECÍFICOS CONSTITUIDOS POR ANTICUERPOS RECOMBINANTES Y OLIGÓMEROS DE COLÁGENO XVIII. Cuesta AM1, Sánchez-Arévalo Lobo VJ1, Sanz L1, Compte M1, García P2, Prieto J2, Blanco FJ2, ÁlvarezVallina L1. 1Unidad de Inmunología Molecular, Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid. 2Programa de Biología Estructural y Computacional, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas), Madrid. Este proyecto pretende el diseño, construcción y caracterización de una nueva generación de agentes antiangiogénicos multivalentes y multifuncionales, mediante la integración anticuerpos monoclonales (AcMos) en armazones proteicos derivados de la membrana basal (MB) que contienen inhibidores endógenos de angiogénesis (IEAs). Uno de los IEAs mejor caracterizados es la endostatina (ES) que deriva de uno de los principales componentes de la MB, el colágeno (XV y XVIII), de donde es liberada inicialmente en forma trimérica (dominio NC1) y posteriormente en forma monomérica, por la acción de proteinasas específicas. En el extremo N-terminal del dominio NC1, hay un dominio de trimerización de aproximadamente 60 residuos conectado con el módulo ES (180 aminoácidos) mediante una región bisagra flexible que contiene diversos sitios sensibles a proteinasa que liberan ES después de su procesamiento. Con este objetivo, hemos generado una proteína quimérica que comprende el fragmento variable de cadena única (scFv) del AcMo anti-laminina L36, y el dominio NC1 de colágeno XVIII. Los niveles de proteinasas están aumentados en el microambiente tumoral, por lo que dicha proteína de fusión liberará in situ tanto monómeros de ES como trímeros de scFv. La PF secretada por las células humanas genéticamente modificadas en forma funcionalmente activa. La forma intacta tiene una masa molecular de 210 kDa aproximadamente, lo que indica que, en condiciones fisiológicas, las subunidades individuales se asocian de manera no covalente para producir una estructura trimérica. Dicha PF trimérica inhibió de manera significativa la capacidad de células endoteliales de migrar en respuesta a factores de crecimiento y para formar estructuras capilariformes. Asimismo, dicha proteína de fusión es procesada in vitro por diferentes proteinasas. Los datos muestran que la catepsina L, la elastasa pancreática y diversas metaloproteinasas de la matriz POSTERS (MMP) generan tanto monómeros de ES como fragmentos scFv triméricos. En ensayos in vivo, la secreción in situ de PF originó una inhibición significativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha observado regresión tumoral. Estos resultados inician una nueva estrategia de base genética para el tratamiento del cáncer. 165.PAPEL DEL SISTEMA HLA DE CLASE I Y CLASE II EN MIELOMA MULTIPLE. Alcoceba M, Marín L, Balanzategui A, Martín-Jiménez P, Sarasquete ME, Chillón C, Corral R, García-Sanz R, González M. Departamento de Biología Molecular/Histocompatibilidad, Servicio de Hematología, Hospital Universitario de Salamanca. Introducción. El Mieloma Múltiple (MM) es una enfermedad caracterizada por un aumento clonal del número de células plasmáticas en medula ósea capaces de producir una paraproteína monoclonal. Aunque la etiología de esta enfermedad es desconocida, entre sus causas se considera que puedan existir factores genéticos. El papel del sistema HLA (Human Leukocyte Antigen) ha sido escasamente estudiado, no encontrándose una asociación consistente. Así, el antígeno HLA-B18 se ha asociado con la presencia de mieloma en la población negra sudafricana y el HLA-B5 en diferentes poblaciones. Objetivo. Analizar la influencia del sistema HLA en la aparición de MM en la población española, así como su relación con la supervivencia global (SG) y supervivencia libre de progresión (SLP) en este grupo de pacientes. Métodos. El tipaje de HLA clase I y clase II se realizó en muestras de sangre periférica de pacientes con mieloma múltiple (n= 130) y de controles (n= 1838). Las especificidades de HLA-clase I (-A, -B) se identificaron mediante microlinfocitotoxicidad. En caso de ambigüedades y para el tipaje de HLA-clase II (-DRB1), se llevó a cabo un tipaje HLA genérico mediante PCR-SSOr y/o PCR-SSP. Las frecuencias alélicas y haplotípicas se estimaron mediante el método de máxima verosimilitud utilizando el programa Arlequin 3.0. La comparación de las frecuencias alélicas y haplotípicas entre pacientes y controles se realizó mediante el test exacto de Fisher ó el test ci2. Para la estimación de la supervivencia se emplearon las curvas de Kaplan-Meier, utilizando el paquete estadístico SPSS 14.0. Valores de p< 0,05 fueron considerados como estadísticamente significativos. Resultados. El análisis de las frecuencias alélicas y haplotípicas de HLA-A, -B, y -DR no reveló la presencia de diferencias significativas entre el grupo de pacientes y el de controles. Así, los alelos que mostraban asociación con mieloma múltiple en publicaciones previas (HLA-B18 y HLA-B5) mostraron una frecuencia similar en el grupo de los pacientes y en el de los controles: HLA-B18 (6% en pacientes versus 9% en controles, p= 0,229), y HLA-B5 (9% vs 10% p= 0,958). Se encontró una mejor SG a 5 años en pacientes con -A1 (77% vs 63%) y -DR1, y peor con -B18 (50% vs 68%), aunque no alcanzaron valores estadísticamente significativos. La presencia de -B18 se asocia con peor SLP a 5 años (23% vs 59%, p= 0,016). Conclusiones. Este estudio sugiere que no hay asociaciones específicas entre el tipo de HLA y la aparición de mieloma múltiple. La presencia del alelo HLA-B18 podría influir en la progresión de la enfermedad. 123 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 124 POSTERS VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 SESIÓN 11: CÉLULAS T Moderadores: Rafael Bragado Herrero (Madrid), Jaime Sancho López (Granada) 166.REGULACIÓN DE LA RECOMBINACIONAL DURANTE EL DESARROLLO EN EL LOCUS DEL TCR ALFA/DELTA POR ENHANCERS. Blanco B del, Halmi P, Fernández-Ibáñez AM, Hernández-Munain C. Instituto de Parasitología y Biomedicina «LópezNeyra». Granada. El locus del receptor de linfocitos T (TCR) α/δ es un modelo muy interesante para el estudio de la regulación V(D)J durante el desarrollo ya que los dos genes que lo componen, el TCRα y el TCRδ, tienen diferentes programas de activación durante el desarrollo de los timocitos. El gen del TCRδ es funcionalmente activo en timocitos dobles negativos (DN), mientras que el gen del TCRα no es funcionalmente activo hasta los timocitos dobles positivos CD4+CD8+ (DP). Además, el gen del TCRδ es inactivado en la transición de timocitos DN a timocitos DP. Más aún, la organización de este locus, con el gen del TCRδ rodeado por los segmentos Vα y Jα del gen del TCRα, determina que el gen del TCRδ sea delecionado como consecuencia del reordenamiento del gen del TCRα. Estos programas de activación están controlados por la actividad de dos enhancers: el enhancer del TCRα (Eα) y el enhancer del TCRδ (Eδ). Eδ y Eα funcionan como enhancers específicos de estadío de diferenciación durante el desarrollo de los linfocitos T: Eδ está activado y Eα está desactivado en timocitos DN, mientras que Eδ está desactivado y Eα está activado en timocitos DP. La inactivación de Eδ durante la transición de timocitos DN a timocitos DP está asociada con una pérdida de la ocupación de este enhancer. Sin embargo, Eα está ya ocupado en timocitos DN. Actualmente, estamos estudiando los mecanismos moleculares para la regulación de la función de estos enhancers mediante la identificación de los complejos multiprotéicos que se ensamblan in vivo durante la diferenciación de los timocitos. 167.MARCADORES DE LINFOCITOS T COMO MARCADORES DE EVOLUCIÓN CLÍNICA EN PACIENTES CON INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA (IRC). Hernández A1, Sánchez MA1, Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Calvino M3, Arriba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH. 2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá de Henares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara. Introducción. En los pacientes con IRC el grado de afectación o daño renal se determina por estadios en base al cálculo estimado de la filtración glomerular. La clasificación de los pacientes en dichos estadios y la valoración de diferentes factores de riesgo como son los niveles de colesterol y LDL entre otros (asociados a complicaciones cardiovasculares) permite la detección de pacientes de riesgo en el desarrollo de la enfermedad y poder prevenir complicaciones estableciendo un adecuado manejo terapéutico. La relación de las alteraciones del sistema inmune en estos pacientes con la evolución de la enfermedad no ha sido suficientemente estudiada y su conocimiento podría contribuir a la prevención de complicaciones en estos pacientes. 124 Objetivo. Estudiar el estado del sistema inmune en los pacientes con IRC según el estado de evolución de la enfermedad. Materiales y métodos. Se realizó el estudio inmunofenotípico por citometría de flujo de 4 colores en 29 pacientes de insuficiencia renal crónica (IRC) de edades comprendidas entre 28-80 años, teniendo en cuenta los factores de riesgo asociados a esta enfermedad (criterios de inclusión: creatinina plasmática >5mg/dl y examinados en consulta externa). Como referencia se han usado 23 controles sanos de edad y sexo similar a los pacientes. Resultados. Según se deteriora la función renal en los pacientes con IRC se observa un incremento significativo del porcentaje de linfocitos CD4 y CD8 que expresan el marcador de activación CD57 y un incremento significativo del porcentaje de linfocitos CD4 que expresan el marcador CD40L, mientras que se produce un descenso significativo del porcentaje de linfocitos CD4 y CD8 que expresan el marcador CD28 así como una disminución significativa de los linfocitos CD4+CD71+, CD8+CD62L+ y CD8+CCR7+. Las variaciones en estas poblaciones linfocitarias están asociadas al grado de afectación de los pacientes y a diferentes factores de riesgo como son el nivel de colesterol, LDL y ferritina. Conclusiones. Los marcadores de linfocitos T CD57+, CD28+, CD62L+, CCR7+ y CD40L se asocian al empeoramiento de la IRC y podrían utilizarse como marcadores de la evolución clínica de la insuficiencia renal crónica. 168.LAS ALTERACIONES DE LAS SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS DIFIEREN EN FUNCIÓN DEL ORIGEN DE LA INSUFICIENCIA RENAL. Hernández A1, Sánchez MA1, Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Pérez J3, Arriba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH. 2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá de Henares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara. Introducción. Existen diferentes patologías que pueden desembocar en insuficiencia renal crónica y afectan de manera diferente al estado inmunológico del paciente. Objetivo. Estudiar el estado inmunológico de los pacientes según el origen de la insuficiencia renal crónica. Materiales y métodos. En el estudio se han incluido un total de 28 pacientes con insuficiencia renal crónica agrupados en 4 nefropatías de diferente origen: glomerulonefritis, nefropatía túbulo intersticial, nefropatía genética y nefropatía diabética. Las células mononucleares se obtuvieron de sangre periférica y el estudio inmunofenotípico se llevó a cabo por citometría de flujo de 4 colores. Resultados. Se detectaron alteraciones inmunofenotípicas comparando las células mononucleares sanguíneas de los pacientes con respecto a los controles. La linfopenia más acusada la presentan los pacientes con glomerulonefritis (disminución del 61% en linfocitos totales con respecto a los controles sanos y del 50% con respecto a las otras patologías). También encontramos una disminución significativa en el número de células que expresan el marcador de activación CD95 en glomerulonefritis y nefropatía túbulo intersticial, estando aumentadas en los pacientes de las otras dos nefropatías de origen. En las nefropatías genética y diabética encontramos aumentadas de forma significativa las cifras de linfocitos CD45RO+ tanto en las células T4 como en las T8, lo que hace que disminuya el ratio RA/RO, mientras que en glomerulonefritis y nefropatía Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 125 INMUNOLOGÍA túbulo intersticial este ratio se mantiene similar al de los controles pese a la linfopenia. Conclusiones. Las diferentes alteraciones del sistema inmune que se producen en los pacientes con insuficiencia renal crónica dependen del origen de dicha insuficiencia. Así mientras que la nefropatía genética y diabética afecta a la redistribución linfocitaria, la glomerulonefritis produce una linfopenia marcada que afecta fundamentalmente a los linfocitos CD4+. 169.EL PAPEL DE NUMB DURANTE LA PROLIFERACION DE TIMOCITOS. Aguado R, Cañelles M. Instituto de Parasitologia y Biomedicina Lopez-Neyra-CSIC. Durante el desarrollo de los linfocitos, éstos pasan en el timo por una serie de estadios de diferenciación: doble negativo (DN) doble positivo (DP)-simple positivo (SP). Para ello se necesita una correcta señalización tanto a través de pre-TCR como de TCR. Se ha demostrado que alteraciones en la señalización a través de estos dos receptores resultan en defectos en el desarrollo de los linfocitos T. Se sabe que otros receptores transmembranales también participan en la diferenciación temprana de linfocitos, estando entre ellos Notch. Nosotros estamos interesados en Numb, una proteína adaptadora implicada en la ruta Notch, de la cual se conocen tres funciones: a. Endocítica, participando en procesos de internalización de numerosos receptores. b. Moduladora negativa de Notch. c. Oncosupresora, ya que la pérdida de su expresión resulta en cancer mamario en humanos. d. También está implicada en proliferacion de precursores tempranos en el sistema nervioso de ratón, aunque en este caso su papel es distinto, pues la delección condicional de Numb y Numblike resulta en defectos proliferativos de los precursores y en graves alteraciones en el desarrollo del cerebro. En este contexto, nos proponemos determinar el papel de Numb durante la proliferación de precursores tempranos de linfocitos. Para ello poseemos ratones transgenicos en los cuales se ha inhibido funcionalmente Numb mediante un dominante negativo(dnNbTG). Estos ratones presentan una celularidad total del timo disminuida, reducción de la población DP, así como un bloqueo significativo en el estadio DN3. Hemos demostrado mediante co-cultivos de timocios fetales sobre la linea celular OP9 que la poblacion DN de ratones dnNbTG prolifera menos con respecto a los ratones wild-type. Sospechamos que los ratones transgenicos para dnNb pueden tener defectos en la señalización por pre-TCR, y como consecuencia se produciría un defecto proliferativo en el estadio DN. Estos estudios estan siendo realizados actualmente. 170.PAPEL DE LA PROTEINA NUMB EN LA MODULACIÓN DEL TCR. Martín-Blanco N, Cañelles M. Instituto de Parasitología y Biomedina «López Neyra» CSIC. La función mas estudiada de Numb es su función como modulador negativo del receptor Notch. Notch, a su vez, interviene en el desarrollo de linfocitos deciciendo la vía de diferenciación que debe seguir cada célula hija tras una división. Numb contiene en su extremo amino un dominio PTB, y en su extremo carboxilo motivos DPF y NPF. Se POSTERS ha visto como los dominios DPF y NPF son capaces de unirse a AP-2 y a Eps15 respectivamente, proteínas que intervienen en la internalización y degradación de diferentes receptores. Probablemente este es el mecanismo por el que modula la actividad de Notch. Además de la de señalización a través de Notch, para la correcta diferenciación de los linfocitos es necesario una correcta señalización a través del preTCR y del TCR. El TCR esta continuamente sufriendo procesos de endocitosis, degradación y recicleje. Cuando la célula es estimulada, tanto la endocitosis como la degradación se aceleran, lo que conduce a una disminución de la cantidad de TCR superficial expresado. Nuestro trabajo en el laboratorio se centra en el estudio del papel de Numb para esto disponemos de ratones trangénicos que expresan un dominante negativo para Numb (dnNb TG), el cual inhibe funcionalmente a Numb. En estos ratones hemos observado un fenotipo en el que el timo se encuentra reducido, y el desarrollo de los linfocitos aparece parcialmente detenido en DN3 (Doble Negativo 3). Además, a nivel periférico, se detecta una gran disminución de linfocitos B y T CD8+ en nódulos linfáticos. Puesto que Numb también ha sido descrito como una proteína implicada en la endocitosis de diversos eceptores, pensamos que su inhibición puede estar afectando a la modulación y señalización del TCR, y por tanto al desarrollo de linfocitos y a la función de linfocitos maduros. En este aspecto, hemos observado que en ratones transgénicos, tras la estimulación de linfocitos T periféricos, la modulación del TCR lleva una dinámica diferente que en ratones salvajes. Es por esto que pretendemos centrarnos en el estudio del papel de Numb en la modulación de la señalización a través del TCR. 171.LA ESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DE CD5 REVELA LA ELEVADA CONSERVACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS DOMINIOS TIPO A Y B DE LA SUPERFAMILIA DE RECEPTORES SRCR (SCAVENGER RECEPTOR CYSTEINE-RICH). Rodamilans B1, Muñoz IG1, Sarrias MR2, Padilla O2, Bragado-Nilssson E1, Suárez B2, Blanco FJ1, Montoya G1, Lozano F2. 1Grupo de Cristalografía Macromolecular y NMR, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid. 2Servicio de Inmunología, Hospital Clínico de Barcelona, Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona. Los dominios SRCR (Scavenger Receptor Cysteine-Rich) constituyen un antiguo y altamente conservado módulo proteico presente en receptores solubles y de membrana del sistema inmunitario, tanto innato como adaptativo. En función de su contenido en residuos cisteína y de su organización genómica, se han definido dos tipos de dominios SRCR (A y B) existiendo información estructural solo para uno de ellos. Se presenta aquí la resolución de la estructura cristalográfica a 2.2 Å del tercer dominio extracelular de la molécula humana CD5 (CD5-DIII), un receptor linfocitario implicado en la modulación de las señales de activación y diferenciación mediadas por el receptor antígeno específico de las células T y B. El dominio CD5-DIII consta de una hélice α central rodeada por dos hojas β antiparalelas y revela la existencia un elevado grado de conservación entre la estructura tridimensional de los dominios tipo A y B de la superfamilia SRCR (SF-SRCR). La resolución por vez primera de la estructura de un miembro del grupo B ha permitido asimismo la interpretación de datos preexistentes de mutagénesis dirigida sobre la interacción de la molécula de adhesión de la SF-Ig, ALCAM/CD166 125 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 126 POSTERS (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule), con su ligando CD6 otro receptor linfocitario perteneciente al grupo B de la SF-SRCR altamente relacionado con CD5. 172.REDISTRIBUCIÓN DE LAS POBLACIONES DE CÉLULAS T NOVATAS, MEMORIA Y EFECTORAS, Y ALTERACIONES EN SU PATRÓN DE SECRECIÓN DE CITOQUINAS EN PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B). Sánchez MA1, Villarroel M1, Hernández A1, Mur S1, Barcenilla H1, Díaz D1, Prieto A1, Reyes E1, Monserrat J1, Paz R de3, Alvarez-Mon M1, 2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto. Medicina. UAH. 2Ser. de enfermedades del sist. inmune y oncología.HUPA.Alcalá de Henares. 3Ser. de hematología del Hospital Universitario de La Paz, Madrid. Introducción. Los nuevos fenotípicos para la definición de células novatas, efectoras y memoria están basados en la combinación de la expresión de las isoformas del antígeno CD45 (CD45RA y CD45RO) y la de otros marcadores de diferenciación como son el CD27, CD62L y CCR7. Utilizando estos marcadores podemos definir 4 tipos de subpoblaciones: células T novatas, células T memoria central, células T memoria efectora no terminada y células T memoria efectora terminada. La LLC-B se asocia a alteraciones inmunes que incluyen alteraciones fenotípicas y funcionales de los linfocitos T. Objetivo. Estudiar la distribución de los linfocitos T en poblaciones novatas, efectoras y memoria y su patrón de secreción de citoquinas. Materiales y métodos. El estudio se realizo con células mononucleares de sangre periférica de 4 pacientes con LLC-B y 3 controles sanos. Las células mononucleares fueron cultivadas durante 6 horas en presencia de PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) y nomensina (2 μM). El estudio inmunofenotípico y de producción de citoquinas se realizo mediante citometría de flujo de 8 colores utilizando anticuerpos frente a los antígenos de superficie CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, CD27 y anticuerpos para el marcaje intracelular de las citoquinas INFγ, TNFα, IL-2, IL-4 e IL-10. Resultados. En los pacientes con LLC-B se observo una disminución del porcentaje de células novatas tanto en poblaciones CD4 como CD8 con respecto de los controles. Por otra parte se observo un incremento en los porcentajes de de células T memoria central, células T memoria efectora no terminada y células T memoria efectora terminada en poblaciones CD4 y CD8 de pacientes con LLC-B con respecto de los controles. También se observaron diferencias en el patrón de producción de citoquinas según el estado de activación de los linfocitos T en los pacientes con LLC-B con respecto de los controles sanos. Con aumento en la producción de INFγ, TNFα e IL-2 en poblaciones inmunofenotipicamente definidas como células novatas, memoria y efectoras. Conclusiones. Los pacientes con LLC-B muestran un patrón de activación aumentado en los linfocitos T de sangre periférica que afecta tanto a los linfocitos CD4 como CD8 y que se refleja en un aumento de células T memoria central, células T memoria efectora no terminada y terminada, y con una disminución concomitante de células T novatas. Se encuentra además alteraciones en la funcionalidad de estas poblaciones que se manifiestan con aumentos en la producción de las citocinas INFγ, TNFα e IL-2 en la mayoría de las subpoblaciones estudiadas. 126 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 173.CONFORMATIONAL DIFFERENCES IN THE SURFACE αβTCR/CD3 COMPLEX BETWEEN CD4+ AND CD8+ T LYMPHOCYTES ARE CONSERVED IN MAMMALS AND ASSOCIATED WITH DIFFERENTIAL GLYCOSYLATION. Rossi NE1, Meza NW2, Pineda M3, Pulgar M3, Martínez E4, Pérez L1, Ramírez C1, Swamy M5, Schamel WWA5, Risueño R3, Reiné J1, Neville D6, Karlsson A7, Bonay P3, Fernández-Malavé E3, Regueiro JR1. 1Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid. 2Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas, Madrid. 3Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, Cantoblanco, Madrid. 4Zoo-Aquarium Madrid. 5Department of Molecular Immunology, Max Planck-Institute for Immunobiology and Faculty of Biology, University of Freiburg, Freiburg, Germany. 6Laboratory of Molecular Biology, National Institute of Health, Bethesda, MD. USA. 7The Phagocyte Research Laboratory, Department of Rheumatology and Inflammation Research, Goteborg University, Sweden. We have previously shown that the surface αβ-T-cell antigen receptor (TCR)αCD3 complex borne by human CD4+ and CD8+ T lymphocytes can be distinguished conformationally using monoclonal antibodies. Using two unrelated sets of antibodies, we have now extended this finding to the surface αβ-TCRαCD3 of seven additional mammalian species (six non-human primates and the mouse). We have also produced data supporting that differential glycosylation of the TCRαCD3 in the two main T cell subsets may be involved in the observed conformational differences in humans. First, we show differential lectin binding to human CD4+ vs CD8+ T lymphocytes, particularly with Galectin 7. Second, we show that lectin binding can compete differentially with CD3 monoclonal antibody binding to human primary CD4+ and CD8+ T lymphocytes. In contrast, the multimerisation status of the TCRαCD3 complex from resting CD4+ vs CD8+ T lymphocytes was similar, excluding differential clustering as the cause for differential antibody accessibility. We conclude that the conformational differences between the surface αβ?TCRαCD3 complex of primary CD4+ and CD8+ T lymphocytes are phylogenetically conserved and associated to differential glycosylation. The differences may be exploited for therapeutic purposes, such as lineage-specific immunosuppression of graft rejection. 174.APOPTOTIC RATE SENSITIVITY IN THE QUANTIFICATION OF APOPTOSIS IN MURINE CELL CULTURES. Chara L, Chevarria J, Diaz D, Monserrat J, Prieto A, Ubeda M, Muñoz L, Lario M, Nieto M, Sanchez M, Barcenilla H, Acuña L, Villarroel M, Alvarez-Mon M. CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. Background. Currently the apoptosis in culture is quantified by the Apoptotic Index (AI), or the proportion of apoptotic cells. The apoptotic Rate (AR), a new flow cytometry-based ratiometric indicator extends the AI and provides a more accurately estimation of apoptotic cells from several lymphocyte subsets. Objectives. To compare the sensitivity of AR vs AI in the quantification of apoptosis in murine cell cultures. Methods. Highly purified spleen lymphocytes populations were obtained by positive fluorescence-activated cell sorting (FACSAria) from Wistar rats and C57BL/6 mice. The cells were cultured for 24 hours under four conditions: without exogenous apoptosis inducers and in the presence of phytohemagglutinin (PHA), staurosporin (ST) Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 127 INMUNOLOGÍA or polystyrene beads coated with CD3 and CD28 antibodies (T-cell expander). We used a flow cytometry-based ratiometric method that uses an internal reference estandar of microbeads to determine the AR, combined with antibodies and An nexin V-FITC binding and 7Aminoactinomycin D labeling to enumerate viable, necrotic and apoptotic cells. Differences were evaluated by the Wilcoxon test and were considered significant when p<0.05. Results. Significant differences were observed between AR and AI in CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD5+ and CD28+ mice lymphocyte populations in all culture conditions assayed, but in staurosporin that was only significant for the CD4+ and CD28+ populations. In Addition, the AR was always significantly more sensitive determining apoptotic cells than AI in these culture conditions. Similar data were obtained in rat lymphocytes. Conclusions. The AR was more sensitive apoptosis indicator than AI quantifying apoptosis in murine cell cultures. This reflects that the AR measures with more accuracy than the AI the real ocurrente of apoptosis, because AR takes into account both the late apoptotic cells that divide into apoptotic bodies and also the apoptotic cells that loss their lineage antig en expression. 175.EL CONSUMO CONTINUO DE CACAO INDUCE UN AMBIENTE ANTIOXIDANTE Y PROMUEVE LA DIFERENCIACIÓN LINFOCITARIA EN EL TIMO DE RATAS JÓVENES. Ramiro-Puig E, Pérez-Cano FJ, Castellote C, Permanyer J, Izquierdo-Pulido M, Franch A, Castell M. Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona. Introducción y objetivo. El cacao es un alimento rico en flavonoides con capacidad antioxidante. Estudios in vitro han demostrado este poder antioxidante, pero la influencia de su consumo en el organismo no ha sido investigada en profundidad. El objetivo de este estudio ha consistido en determinar la capacidad antioxidante de ratas jóvenes sanas que han consumido una dieta rica en cacao desde el destete y durante 3 semanas. Concretamente, la investigación se ha centrado en el análisis de la capacidad antioxidante total (TAC) y de los sistemas enzimáticos superóxido-dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) en plasma y en tejidos linfoides como bazo y timo. Dada, la elevada capacidad antioxidante detectada en el timo, se ha estudiado también en éste, el patrón fenotípico de maduración linfocitaria. Material y métodos. Dietas ricas en Cacao Natural Forastero (4% y 10%) fueron la base alimentaria de ratas Wistar desde las 3 a las 6 semanas de edad, momento en que se obtuvieron muestras de plasma y tejidos (bazo y timo). TAC fue determinada mediante el método ABTS. La actividad de los enzimas SOD y CAT se cuantificó mediante ensayos colorimétricos. Estudios posteriores se encaminaron a aislar linfocitos del timo y estudiar su fenotipo mediante triple marcaje y posterior análisis por citometría de flujo. Resultados. Una dieta rica en cacao, no modifica la TAC en plasma, pero incrementa de forma significativa la capacidad antioxidante total en los tejidos analizados (p<0,05), principalmente en el timo. Además, a diferencia del bazo, en el tejido tímico de los animales alimentados con 4% o 10% de cacao, aumenta la actividad CAT y SOD. Por otra parte, una dieta rica en cacao induce una disminución (p<0,05) de la proporción de linfocitos en estados intermedios de desarrollo (CD4+CD8+ y TCRlow), mientras que eleva el porcentaje de timocitos maduros CD4+CD8- y CD4-CD8+ con elevada expresión de TCRαβ, y la de precursores CD4-CD8-. POSTERS Conclusión. El consumo de cacao en rata durante la infancia potencia un ambiente antioxidante en el timo, influyendo en el proceso de maduración linfocitario que tiene lugar en éste. Así, una dieta rica en cacao puede desempeñar un papel importante en la prevención y mejora de determinadas enfermedades asociadas a una elevada producción de radicales libres. 176.ASSESSING THE REGULATION OF T CELL FUNCTION BY DISTINCT CYTOKINE COMBINATIONS ON THE GUAVA EASYCYTE™ PLUS PLATFORM. Cappione A, Snyder-Cappione J, Gillis K. Guava Technologies, Inc. Precise regulation of effector function is critical for mounting a potent, yet specific immune response to a given antigenic challenge. It has been hypothesized that the cytokine content of secondary lymphoid organs and at the actual site(s) of inflammation exert localized control over immune cell populations. Distinct cytokine combinations present within a given microenvironment can induce changes in the phenotype and effector functions of immune cells that differ dramatically from the effects exerted by each cytokine alone. Using a multiparametric analysis approach, we investigated the effects in culture of all possible combinations of as many as 6 cytokines (IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, TNF-α, and TGF-β) on the phenotype and functional capacity of CD4+ and CD8+ isolates derived from human peripheral blood. Following stimulation, cultures were assessed for changes in maturation/activation state (as measured by surface marker expression and phospho-protein analysis), as well as determining their individual proliferative capacity and viability (ViaCount®). Stimulated CD4+ and CD8+ cultures were also subject to cytokine production profiling through intracellular staining. The cytolytic capacity of CD8+ cultures was measured both indirectly, through intracellular Granzyme B staining, and directly through killing of autologous target B cells (CellToxicity™). All samples were acquired and analyzed using the Guava EasyCyte Plus platform, a microcapillarybased cell cytometry system. Briefly, we found that unique combinations of cytokines had profound and highly varied effects on lymphocyte fate and function in vitro. Demonstrations of synergy, antagonism, dominance, and substitution amongst multiple cytokines in our experimental system may reflect actual paradigms underlying such processes as the differentiation of T cell subsets into effector and resting memory phenotypes in vivo. 177.LA GLIADINA INDUCE LA PRODUCCIÓN DE IL-15 Y EXPRESIÓN DE CD30 EN POBLACIONES LINFOCITARIAS PROVENIENTES DE BIOPSIAS DE PACIENTES CELIACOS Y CONTROLES. Bernardo D1, Periolo N2, Garrote JA1,3, Riestra S4, Fernández-Salazar L5, Blanco A1, Cherñavsky AC2, Arranz E1. 1Laboratorio de Inmunología de las mucosas, Departamento de Pediatría e Inmunología, IBGM-Universidad de Valladolid. 2División de Inmunogenética, Hospital de Clínicas-Universidad de Medicina, Buenos Aires, Argentina. 3Unidad de Investigación, Hospital Clínico Universitario, Valladolid. 4Servicio de Digestivo, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo. 5Departamento de Gastroenterología, Hospital Clínico Universitario, Valladolid. Introducción. Actualmente se asume que la inmunidad innata juega un papel clave en el desarrollo de la enfermedad celiaca a tra- 127 Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 128 POSTERS vés de un mecanismo DQ2-independiente. Sin embargo, hasta el momento no se han descrito factores diferenciales entre pacientes celiacos y no celiacos actuando en la inmunidad innata, por lo que planteamos la hipótesis de que el gluten es capaz de inducir una respuesta innata en todos los pacientes, tanto celiacos como no celiacos, aunque la respuesta adaptativa secundaria es específica de los pacientes celiacos. Materiales y métodos. Biopsias procedentes de al menos 3 pacientes celiacos en dieta sin gluten (DSG) y 3 pacientes controles no celiacos fueron cultivadas por condición. Las biopsias se estimularon con gliadina, zeína o el péptido inmunodominante 33mer. La producción de IL-15 (Western-blot) y la inducción de mRNA de mediadores adaptativos, STAT1, STAT3, IFNγ, TNFα (qPCR), se determinó en el extracto completo de la biopsia. Los linfocitos intraepiteliales y de lámina propia fueron también evaluados para la expresión de marcadores de activación (CD30, CD45Ro, CD69) por citometría de flujo. 128 VOL. 26 SUPL. 1/ 2007 Resultados. Los péptidos de gliadina fueron capaces de inducir la producción de IL-15 y de activar las poblaciones linfocitarias intraepiteliaeles y de lámina propia (aumento de CD30) tanto en los pacientes celiacos como en los controles, aunque si la estimulación se realizaba sobre las poblaciones linfocitarias aisladas no se veía respuesta en ningún caso. Es interesante que ni en los cultivos basales ni en los estimulados con zeína se observó una respuesta. Finalmente, los niveles de mRNA de mediadores adaptativos (STAT1, STAT3 e IFNγ) se encontraban modificados sólo en los pacientes en DSG tras ser estimulados con los péptidos de gliadina. Conclusión. Los resultados obtenidos en este estudio parecen confirmar que el gluten es capaz de inducir una respuesta innata en el intestino de todos los individuos, aunque la activación de la inmunidad específica parece ser exclusiva de los celiacos. La existencia no sólo del HLA-DQ2 sino de un menor umbral de respuesta para disparar la inmunidad adaptativa en los pacientes celiacos podría ser clave en la patogénesis de la EC. Inmunol supl -136p 13/3/07 10:47 Página 129 Indice de autores A Abadia-Molina AC, 30 76, 85, 100 Abós B, 26 Abud-Mendoza C, 83 Aceves M, 45 Acosta-Iborra A, 76, 77 Acuña L, 56, 60, 90, 95, 122, 126 Aguado R, 125 Aguilar S, 90 Aguilar-García S, 90 Aguilar-Reina J, 73 Aguilera I, 112 Aguinaga Barrilero A, 18, 54, 115 Alarcón-Riquelme ME, 21 Alba A, 17 Albarran F, 61, 95, 105 Alcalá I, 16 Alcoceba M, 123 Aldama G, 111 Alecsandru D, 64, 71, 98 Alemany JM, 66, 106, 107 Alemany-Frances L, 91 Alés I, 74 Alfaro C, 48 Algarra I, 54, 55, 114, 120 Allende L, 36, 57, 110 Allende LM, 34, 35, 58 Almeida J, 54 Alonso A, 73, 74, 107, 111 Alonso C, 108 Alonso Franch M, 46 Alonso M, 63, 119 Alonso N, 97 Alonso Sardon M, 67 Alonso-Arias R, 29 Alonso-Camino V, 61 Alonso-Franch M, 46 Alonso-Ortiz A, 111 Alsina Donadeu M, 102 Alvarez A, 99 Álvarez AJ, 93 Álvarez de Mon M, 99, 103, 125 Alvarez del Riego O, 34 Alvarez Doforno R, 65 Álvarez Domínguez C, 29 Álvarez E, 81 Álvarez I, 16, 25 Álvarez -López MR, 53 Alvarez R, 108 Alvarez-Barrientos A, 82 Álvarez-Cermeño JC, 66, 96 Alvarez-Dominguez C, 29 Álvarez-Lafuente R, 23 Álvarez-López MR, 43, 49, 51, 53, 66, 91, 106, 107, 108, 109, 112, 115, 116, 119 Alvarez-Marquez A, 112 Alvarez-Mon M, 56, 60, 61, 79, 87, 90, 95, 100, 105, 122, 126 Alvarez-Santana MC, 34 Álvarez-Vallina L, 45, 56, 61, 123 Alves D, 101 Amengual Guedan MJ, 102 Ampudia R, 17 Anaya-Baz B, 90 Andrés A, 18 Andres-Martin A, 107 Anel A, 96, 113 Aptsiauri N, 116, 117, 118 Aragoneses-Fenoll L, 25, 78 Arenas JI, 63 Arias M, 110, 111 Arias M, 52 Arias-Díaz J, 85 Arina A, 48 Armengol MP, 18 Arnaiz-Villena A, 19, 23, 69, 70 Arostegui JI, 91 Arranz E, 127 Arranz-Sanz E, 46 Arriaga J, 83 Arriba G de, 99, 103, 125 Arribas F, 96 Arribillaga L, 27 Arrieta A, 78 Arroyo R, 23, 74 Asensi V, 29 Asín L, 80 Aspa J, 30 Astola A, 66 Astudillo A, 16 Atencia R, 78 Ausín F, 110, 111 Ausín F, 73 Azpilicueta A, 48 B Balanzategui A, 123 Balibrea J, 85 Ballestar E, 57 Ballester S, 28, 86 Ballesteros C, 31 Balomenos D, 37 Balsa A, 21, 22 Bañares R, 106 Barahona F, 121 Barcenilla H, 56, 60, 79, 90, 95, 99, 100, 103, 122, 125, 126 Barquinero J, 15 Barreiro A, 101 Barreiro E, 34, 36 Barroso N, 73 Barroso S, 93 Bartolomé M, 74 Bas J, 51 Beares I, 52 Bellas C, 26 Benavides M, 74 Bendandi M, 48 Benítez-Rondán A, 55 Benito JM, 31, 36, 111 Benito MJ, 52 Benito MS, 72 Benlloch T, 94 Bensussan A, 116 Berasain C, 48 Berlinches A, 121 Bernabeu R, 47 Bernad A, 56 Bernal M, 94 Bernal-Ramos A, 53, 91 Bernardo D, 127 Bernardo I, 34, 35, 68 Bernardo MV, 49, 115 Berruguilla E, 54, 114, 115 Bestard O, 51 Blanco A, 127 Blanco B, 56, 124 Blanco FJ, 123 , 125 Blanco J, 24, 36 Blanco O, 30, 76, 85, 100 Blanco RM, 112 Blanco-García MR, 53, 108, 109 Blanco-Gelaz MA, 19, 51 Blanco-Quirós A, 46 Blanquer J, 30 Blazquez R, 26 Bofia M, 24, 77 Bonay P, 126 Borràs FE, 17 , 25, 77 Borrás-Cuesta F, 27, 80 Boscá I, 59 Botella C, 53, 66, 91, 106, 107, 108, 109 Bousoño C, 94 Bouza E, 26, 109 Bowakin D, 75 Bragado R, 59 Bragado-Nilssson E, 125 Bravo B, 28, 86 Bravo MJ, 73, 74, 111 Brieva JA, 32, 37, 49, 50, 51, 66, 71, 94, 104 Briones J, 81 Briones M, 30 Buelta L, 37 Burgui I, 79 C Caballero A, 73, 74, 111 Cabezón A, 96 Cabrera T, 116 Cacho E, 52 Cacho JL, 74, 75 Cadahia A, 42 Calderón E, 88 Calderón EJ, 89 Calle H de la, 76 Calleja S, 68 Calleja-Antolín S, 36 Callejas JL, 39 Calvino M, 103, 125 Calviño R, 111 Calvo P, 26 Calzada JE, 72 Cámara Hijón C, 102 Camarero C, 18 Cambra A, 92 Camiña F, 63 Camino I, 26 Campillo JA, 53, 106, 108, 116, 119 Campillo-Marquina JA, 43 Campo AB, 116, 117, 118 Campos M, 55, 119, 120 Campos-Caro A, 49, 50, 51, 104 Campos-Esteban J, 107 Canals F, 16, 25 Cañelles M, 125 Cano J, 107 Cantó E, 81 Cantón J, 54, 118 Caparrós E, 77 Cappione A, 127 Caragol I, 91, 93, 94 Carballido J, 56, 122 Carbone J, 26, 31, 38, 52, 63, 91, 98, 106, 109 Cárdaba B, 43, 44 Cárdenes MA, 34 129
