Pleuroneumonía bovina contagiosa
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CAPÍTULO 2.1.6. PLEURONEUMONÍA BOVINA CONTAGIOSA RESUMEN La pleuroneumonía contagiosa bovina (PBC) es una enfermedad del ganado bovino causada por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (biotipo bovino) (MmmSC; SC= colonias pequeñas). Se manifiesta con anorexia, fiebre y síntomas respiratorios como disnea, poliapnea, tos y descargas nasales. El diagnóstico depende del aislamiento del agente etiológico. Los principales problemas para el control o la erradicación son la presencia frecuente de infecciones subagudas o asintomáticas y la persistencia de portadores crónicos después de la fase clínica. Identificación del agente: Las muestras que hay que tomar de animales vivos incluyen frotis nasales y/o lavados broncoalveolares, o líquido pleural obtenido por punción. Las muestras a tomar en las necropsias incluyen material de las lesiones pulmonares, nódulos linfoides, líquido pleural y líquido sinovial de los animales con artritis. Es posible realizar el examen directo de los exudados o frotis, pero ello requiere gran destreza. Para el cultivo del agente patógeno, se homogenizan los tejidos en medios con antibióticos y se inoculan en medios de cultivo que contienen inhibidores para evitar el crecimiento de las bacterias contaminantes. El crecimiento de MmmSC tarda varios días. En medio líquido, el crecimiento se observa en 3-10 días como una turbidez homogénea que forma remolinos cuando se agita; en medio sólido, aparecen pequeñas colonias, de 1 mm de diámetro, con la clásica morfología de "huevo frito". Las características bioquímicas de MmmSC son: sensibilidad a la digitonina, reducción de sales de tetrazolio, utilización de glucosa, ausencia de arginina hidrolasa, de fosfatasa y de actividades proteolíticas. Se han descrito medios especiales que se recomiendan para estas pruebas. El diagnóstico se confirma con pruebas inmunológicas, como la prueba de inhibición del crecimiento y la prueba de inmunofluorescencia (ambas utilizan sueros hiperinmunes). La reacción en cadena de la polimerasa se utiliza actualmente como una prueba rápida, específica, sensible y fácil de usar. Pruebas serológicas: La prueba de fijación de complemento de Campbell & Turner modificada, continúa siendo la prueba de diagnóstico prescrita para el comercio internacional. Sin embargo, presenta limitaciones importantes respecto a sensibilidad y especificidad. Se ha considerado al enzimoinmunoensayo como una prueba alternativa por el Comité Internacional de la OIE en Mayo de 2000, y como una prueba prescrita ordenada por la OIE para el comercio internacional en el 2004. Se ruega consultar la página web de la OIE para la versión más reciente de este capítulo. Se ha evaluado una prueba de inmunotransferencia y se ha descrito que es muy específica y sensible. Requisitos para las vacunas: Para la producción de las vacunas se recomienda la cepa atenuada T1/44. El título mínimo recomendado es 107 micoplasmas viables por dosis de vacuna. A. INTRODUCCIÓN La pleuroneumonía bovina contagiosa (PBC) es una enfermedad contagiosa del ganado bovino causada por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (biotipo bovino) (MmmSC; SC=colonias pequeñas). Se sabe que la PBC se presenta en Europa desde el siglo XVI pero alcanzó una distribución mundial durante la segunda mitad del siglo XIX debido al aumento en el mercado internacional de ganado vivo. A comienzos del siglo XX se erradicó de muchos países mediante políticas de extirpación. Sin embargo, la enfermedad persiste aún en muchas partes de África y del sur de Europa; en Asia, la situación es confusa. En Europa no se han descrito brotes desde 1999. En condiciones naturales, MmmSC sólo afecta a rumiantes del género Bos, es decir 178 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa principalmente ganado bovino y cebúes. En Italia se ha aislado MmmSC (biotipo bovino) de búfalos (Bubalus bubalus) (25), y en África y más recientemente en Portugal, de ovejas y cabras. Entre los animales salvajes se ha descrito un único caso en búfalos americanos (bison) y ninguno en búfalos africanos (Syncerus caffer) u otros rumiantes salvajes. Los animales salvajes no representan ningún papel en la epidemiología de la enfermedad. La PBC se manifiesta por anorexia, fiebre y síntomas respiratorios, como disnea, poliapnea, tos y descargas nasales. En el caso de brotes agudos en condiciones experimentales, la tasa de mortalidad puede alcanzar el 50% sin tratamiento con antibióticos. Esta mortalidad puede ser mucho menor en el campo; sin embargo, cuando en un área se presenta por primera vez un brote, la mortalidad puede ser mayor. Los síntomas clínicos no son siempre evidentes. Con frecuencia se presentan formas subagudas o asintomáticas cuando los animales se recuperan parcialmente. En este caso, sus pulmones muestran lesiones encapsuladas típicas denominadas "secuestros". Estos animales pueden ser responsables de la persistencia desapercibida de la infección en una población o una región y desempeñar un papel importante en la epidemiología de la enfermedad. La transmisión tiene lugar por contacto directo entre un animal infectado y otro sano. No existe evidencia de transmisión a través de fomites ya que MmmSC no persiste en el ambiente. Las estrategias de control en la mayoría de los continentes se basan en la detección inicial de los brotes, el control de los movimientos de los animales y una política de extirpación. En África, el control de la enfermedad se basa en campañas de vacunación utilizando cepas atenuadas de MmmSC como la T1/44 o T1sr. Aunque teóricamente el uso de antibióticos está prohibido, se aplican ampliamente en condiciones de campo. Todavía no se han evaluado las consecuencias de estos tratamientos antibióticos en términos de eficacia clínica, emergencia de cepas resistentes, persistencia de portadores crónicos e impacto sobre la salud humana. El grupo de M. mycoides comprende seis especies de micoplasmas o grupos de cepas de origen bovino y caprino (9, 21, 28). Este grupo se puede subdividir en dos grupos, capricolum y mycoides, que incluyen especies estrechamente relacionadas. Estas seis especies de micoplasmas comparten características serológicas y genéticas, y esto plantea problemas taxonómicos y de diagnóstico (9) con las técnicas convencionales. La identificación específica de MmmSC se puede llevar a cabo en la actualidad mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante la utilización de anticuerpos monoclonales (MAbs). Aunque se ha considerado que MmmSC es un biotipo muy homogéneo, algunas técnicas moleculares recientes, como la digestión enzimática del ADN completo o la transferencia tipo southern utilizando como sonda un elemento de inserción, han identificado diferencias entre las cepas. Una técnica descrita recientemente, que supone un modo más fácil de realizar epidemiología molecular de la PBC, consiste en un análisis de la secuencia de locus múltiples (o tipado). Esta técnica permite diferenciar tres líneas principales que se correlacionan con los orígenes geográficos (Europa, Sudáfrica y resto de África) (17). Las cepas de origen europeo se pueden diferenciar claramente de las africanas (8, 32). Las cepas europeas recientes se caracterizan por la delección de un gran fragmento de ADN y son incapaces de oxidar el glicerol, lo que puede explicar una patogenicidad aparente inferior (33). Sin embargo, las cepas europeas aisladas en 1967 no mostraban esa delección. Las cepas africanas parecen ser más diversas. No hay duda de que un mayor desarrollo técnico permitirá una caracterización más fina de las cepas. B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1. Identificación del agente El microorganismo causante se puede aislar de muestras de animales vivos o de material procedente de una necropsia. Las muestras de animales vivos son frotis o descargas nasales, lavados broncoalveolares o transtraqueales y líquido pleural tomado asépticamente por punción en la parte baja de la cavidad torácica entre la séptima y octava costilla. También se puede cultivar la sangre (14). Las muestras de una necropsia son los pulmones con lesiones, el líquido pleural ("linfa"), los nódulos linfáticos del tracto broncopulmonar y el líquido sinovial de los animales con artritis. Las muestras deben tomarse de la interfase de las lesiones entre el tejido enfermo y el normal. El agente etiológico se puede detectar por cultivo, por métodos de estudio de ácidos nucleicos y por mediante pruebas inmunológicas, que se describen más adelante. El estudio del agente es complejo y se puede llevar a cabo por pruebas bioquímicas, métodos de detección de ácidos nucleicos y métodos inmunológicos. Estos métodos se describen aquí en sus aspectos generales; sin embargo, se recomienda que la identificación definitiva sea realizada por un laboratorio de referencia de la OIE. La presencia de los patógenos varía mucho en función del estado de desarrollo de las lesiones, y un resultado negativo no es definitivo, en particular después de un tratamiento con antibióticos. Cuando se envían muestras al laboratorio, se aconseja utilizar un medio para el transporte que proteja los micoplasmas y evite la multiplicación de otras bacterias (caldo de infusión de corazón sin peptona y glucosa, 10% de extracto de levadura, 20% de suero, 0,3% de agar, 500 Unidades Internacionales [IU]/ml de penicilina, acetato de talio, 0,2 g/litro). Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 179 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa Las muestras se mantienen frías a 4ºC si se mantienen unos días, o se congelan a -20ºC o menos por más tiempo. Para traslados entre laboratorios, los fragmentos de pulmón o el líquido pleural también pueden congelarse. Si no se pueden procesar el mismo día de su recogida las muestras se deberían congelar. a) Cultivo MmmSC necesita medios apropiados para crecer (24). Para el aislamiento se pueden requerir 2-3 pases. Muchos intentos de aislamiento fracasan porque el microorganismo es lábil, se presenta a menudo en pequeñas cantidades, y es exigente en sus requerimientos nutritivos. Los medios deben contener un medio básico (como infusión de corazón o peptona), extracto de levadura (preferiblemente fresco) y suero de caballo (10%). Se pueden añadir otros componentes, como glucosa, glicerol, ADN y ácidos grasos, pero los efectos varían según las cepas. Son necesarios inhibidores, como penicilina, colistina o acetato de talio, para evitar el crecimiento de otras bacterias. El medio se puede utilizar líquido o solidificado con 1.0-1.2% de agar. Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y deben permitir el crecimiento de Mycoplasma spp. a partir de inóculos pequeños. La cepa de referencia se debe de cultivar en paralelo con las muestras sospechosas para asegurar que las pruebas funcionan correctamente. Las muestras de pulmón se homogenizan en caldo con antibióticos, se diluyen diez veces para reducir la contaminación bacteriana y se inoculan en cinco tubos de caldo y en medio sólido. El líquido pleural se puede inocular directamente sin dilución previa. Se recomienda el uso de cierres herméticos en las placas Petri o de incubadores con humedad controlada para evitar la desecación. Para asegurar las mejores condiciones de crecimiento de los micoplasmas debe utilizarse un incubador de CO2 o una jarra de anaerobios. Los tubos y las placas de Petri se inspeccionan diariamente durante 10 días. En medio líquido, por lo general aparece en 2-4 días una turbidez homogénea, con frecuencia con un filamento frágil y sedoso llamado "cometa", que es característico de MmmSC (o de M. capricolum subsp. capripneumoniae, la causa de la pleuroneumonía caprina contagiosa). Durante los siguientes días se desarrolla una opacidad uniforme con remolinos cuando se agita. En medio sólido, las colonias son pequeñas (1 mm de diámetro) y presentan la forma clásica de "huevo frito" con un centro denso. En esta fase se puede realizar la prueba de la inmunofluorescencia indirecta (IFI). b) Pruebas bioquímicas Las pruebas bioquímicas se consideran pruebas confirmativas, para realizarse en laboratorios de referencia. Para el uso rutinario, las pruebas inmunológicas son suficientes, pero cuando éstas dan resultados dudosos y en todos los casos de primeros aislamientos, las pruebas bioquímicas deben confirmarse en un laboratorio de referencia. A este fin, después de uno o dos pases, se deben eliminar del medio los antibióticos para comprobar si el aislado es un micoplasma o una forma-L de una bacteria que recuperará su forma original en el medio sin inhibidores. Una vez hecho esto, y después de clonar (deben seleccionarse al menos tres colonias), se puede identificar el microorganismo utilizando pruebas bioquímicas (2, 12) MmmSC es sensible a la digitonina (como todos los miembros del orden Mycoplasmatales), no produce "velo y manchas", fermenta la glucosa, reduce las sales de tetrazolio (aeróbica o anaeróbicamente), no hidroliza la arginina, carece de actividad fosfatasa y no tiene propiedades proteolíticas o éstas son muy débiles. Se han desarrollado medios especiales para estas pruebas que contienen los mismos ingredientes básicos (caldo de infusión de corazón o caldo Bacto PPLO [organismos semejantes a los de la pleuroneumonía], suero de caballo, 25% de solución de extracto de levadura, 0,2% de solución de ADN), a los que se añade 1% de una solución de glucosa al 50% para ver la utilización de glucosa, 4% de una solución de argininaHCl al 38% para ver la hidrólisis de arginina, y 1% de una solución de cloruro de dimetil tetrazolio para la reducción del tetrazolio, más un indicador de pH (por ejemplo, rojo fenol). Para la demostración de proteolisis, se realiza el crecimiento sobre agar caseína y/o agar con suero coagulado. Una vez realizada la caracterización bioquímica, se debe realizar una de las siguientes pruebas inmunológicas para confirmar la identificación: prueba de inhibición del crecimiento en disco (DGIT), inmunofluorescencia (FAT) y prueba de inmunounión en punto sobre un filtro de membrana (MF-dot). El aislamiento e identificación del agente de la PBC puede ser difícil y consumir mucho tiempo, y depende del manejo cuidadoso de los procedimientos y medios adecuados. Cuando resulte posible, los laboratorios bacteriológicos clásicos deberían montar una sección especial para trabajar solo con micoplasmas. c) Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos Se han desarrollado sondas radioactivas o enzimáticas, pero su uso es restringido principalmente por razones de seguridad. 180 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa Por otra parte, la PCR es sensible, muy específica, rápida y fácil de realizar. Se han descrito cebadores específicos para el grupo M. mycoides (26) y para MmmSC (10, 20, 31) y se han desarrollado pruebas PCR (5, 10, 20) que incluyen una nueva técnica que permite la identificación específica de las cepas T1 vacunales (18). La PCR se puede aplicar directamente después de desnaturalizar en agua hirviendo muestras tales como exudados de pulmón, sin extracción de ADN. No obstante, la ebullición de las muestras es menos sensible que la extracción de ADN y no debe utilizarse de modo rutinario. Incluso puede aplicarse a muestras secas sobre papel de filtro. Los fragmentos de pulmón se tienen primero que homogenizar y centrifugar a baja velocidad antes de la desnaturalización y la PCR. También puede realizarse la PCR con orina o con sangre. La principal ventaja de la técnica de la PCR es que se puede aplicar a muestras mal conservadas (contaminadas o sin micoplasmas viables, como puede ocurrir después de un tratamiento con antibiótico. Si falla la detección directa del ADN en el órgano estudiado, las muestras deben enriquecerse cultivándolas durante 24-48 horas en un medio apropiado, e intentar después la detección del ADN en el cultivo. La PCR se ha convertido en el instrumento más importante para la caracterización y diferenciación entre los miembros del grupo M. mycoides y MmmSC. d) Pruebas inmunológicas Se puede poner de manifiesto el agente etiológico o sus antígenos mediante pruebas inmunoquímicas en tejidos infectados, líquidos tisulares y/o cultivo del microorganismo. Sin embargo, como algunas de estas pruebas dependen de que esté presente en la muestra un número mínimo de microorganismos, solo se tienen en cuenta los resultados positivos. i) Prueba de inmunofluorescencia indirecta La prueba IFI se puede realizar sobre frotis de materiales clínicos utilizando suero de conejo hiperinmune contra MmmSC y anti-IgG marcada, de origen bovino. Se ha utilizado suero hiperinmune bovino, pero puede tener anticuerpos con reacción cruzada. La prueba es satisfactoria cuando se aplica a frotis de líquido pleural, pero lo es menos con frotis de pulmón, debido a una considerable fluorescencia inespecífica. Sin embargo, se pueden obtener buenos resultados utilizando frotis de pulmón con negro Ericromo como tinción de contraste. ii) Prueba del anticuerpos fluorescentes Por lo general, esta prueba (FAT) se realiza sobre cultivos líquidos y sólidos. Es un poco menos específica que la prueba IFI. Cultivo líquido: Colocar dos gotas en un porta. Fijar 15 minutos con alcohol metílico y en una cámara húmeda dejar en contacto durante 30 minutos a 37ºC con el suero hiperinmune marcado. Lavar tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) y examinar en un microscopio de epifluorescencia (x80). Colonias en medio sólido: Tomar un trozo de agar con varias colonias jóvenes y colocarlo en un porta con las colonias hacia arriba. Depositar una o dos gotas del suero hiperinmune marcado sobre el trozo y dejarlo en una cámara húmeda durante 30 minutos. Colocar el trozo en un tubo y lavar dos veces durante 10 minutos con PBS. Colocar el trozo en un porta con las colonias hacia arriba y examinar como antes. Cultivo en placa de Petri: El gel no debe ser muy grueso (menos de 3 mm) y debe contener el menor suero de caballo posible. Lavar el gel tres veces con PBS, extender por la superficie 1 ml del suero marcado e incubar 30 minutos en una cámara húmeda. Lavar cuatro veces con PBS y examinar directamente en un microscopio. La FAT en una placa de Petri se utiliza fundamentalmente después del aislamiento y antes de clonar, ya que es muy útil en el caso de infecciones mixtas con varias especies de micoplasmas. Interpretación de la FAT: En medio líquido, los micoplasmas aparecen de color verde brillante sobre fondo oscuro. Sin embargo, con la FAT realizada sobre colonias en agar, se requiere experiencia porque el fondo aparece como verde oscuro. iii) Prueba de inhibición del crecimiento en disco La DGIT se basa en la inhibición directa del crecimiento del agente en medio sólido por un suero inmune específico (12). Sin embargo, con frecuencia se presentan reacciones cruzadas con el grupo mycoides y se debe tener mucho cuidado en diferenciar MmmSC (biotipo bovino) de MmmLC (biotipo caprino; LC: colonias grandes). Es una prueba sencilla de realizar pero la interpretación de algunos resultados requiere experiencia: pequeñas zonas de inhibición (de anchura menor de 2 mm), inhibición parcial con "colonias invasoras", reacciones negativas y positivas falsas (muy raras). En esta prueba, la calidad del suero hiperinmune utilizado resulta crítica para obtener buenos resultados. iv) Prueba de inmunodifusión en medio sólido La prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) permite detectar el antígeno específico que está presente en la superficie del MmmSC y el galactano circulante que invade el sistema hemolinfático de los animales enfermos (13). Se puede probar líquido pleural o fragmentos homogenizados de pulmón Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 181 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa frente a un suero hiperinmune en dos pocillos practicados sobre el gel y separados entre sí 5 mm. El gel se compone de agar Noble (12 g) y acetato de talio (0,2 g/litro) en PBS, pH 7,2 (1.000 ml). Se considera que la prueba carece de sensibilidad y se sabe poco sobre su especificidad, pero ha servido como prueba de análisis y solo se deben tener en cuenta los resultados positivos. Los resultados son mejores cuando la placa se incuba a 37ºC y puede leerse en 24 horas. Se ha desarrollado una prueba de campo, sencilla, que utiliza discos de papel impregnados, en vez de pocillos (23). v) Inmunotransferencia de punto en membrana de filtración La prueba MF-dot se puede utilizar como prueba de rutina en el laboratorio. Esta técnica se puede realizar con antisueros policlonales adoptando un procedimiento cuantitativo (22), aunque pueden presentarse reacciones cruzadas dentro del grupo mycoides. Se han empleado MAbs específicos que pueden evitar este problema (7). vi) Inmunohistoquímica En lesiones pulmonares se pueden detectar sitios inmunoreactivos para MmmSC utilizando el método peroxidasa-antiperoxidasa en secciones de muestras incluidas en parafina (11). En el diagnóstico de la PBC esta prueba es solo suplementaria, pues en casos crónicos o después de tratamiento con antimicrobianos no siempre se obtiene el aislamiento del agente (6); un resultado negativo no es concluyente. 2. Pruebas serológicas Las pruebas serológicas para la PBC solo son válidas a nivel de poblaciones. Las pruebas individuales con animales pueden resultar equívocas porque el animal se encuentre en las primeras fases de la enfermedad, antes de que se produzcan los anticuerpos específicos, o porque pueda estar en la fase crónica de la enfermedad, cuando muy pocos animales son seropositivos. a) Fijación de complemento (una prueba adecuada para determinar la ausencia de la enfermedad y la prueba prescrita para el comercio internacional) La prueba de fijación de complemento (FC) de Campbell & Turner continúa siendo el procedimiento recomendado con carácter general (aunque el método actual difiere ligeramente del original), y es muy utilizado en todos los países donde se presenta la infección (24). La prueba FC, como micrométodo, se ha homologado en la Unión Europea (19). A efectos de titulación de antígeno y de armonización, se prepararon sueros positivos como estándares internacionales (840 y 845, PS1 y PS2, respectivamente) y están disponibles en el Laboratorio Nacional de Investigación Veterinaria, en Lisboa, Portugal (19). Sin embargo, la prueba FC todavía resulta de difícil realización y requiere personal bien entrenado y con experiencia. 182 • Reactivos i) Tampón Veronal (VB) pH 7,3. Se utiliza una solución base concentrada que se diluye al 1/5 en agua estéril bidestilada. ii) Las muestras de suero, sin eritrocitos, deben inactivarse a 56ºC durante 30 minutos y diluirse al 1/10 en VB. iii) El antígeno consiste en una suspensión de MmmSC previamente titulada y se utiliza a la dosis de 2 unidades fijadoras de complemento (unidades FC). Se debe mantener a 4ºC sin congelar. Se produce, prueba y distribuye por laboratorios reconocidos internacionalmente. iv) El complemento (C´) se obtiene a partir de suero normal de cobaya. Se liofiliza y se reconstituye en agua bidestilada. Después de la reconstitución se debe mantener a -20ºC. Se titula practicando una serie de diluciones en VB con una cantidad apropiada de antígeno que se utiliza en la prueba. Después de incubar a 37ºC durante 2 horas, a cada dilución se añade una cantidad apropiada de eritrocitos de oveja sensibilizados (SRBC). El resultado de la titulación se lee después de incubar otra hora. La dilución mas alta que provoca hemolisis completa de los SRBC es igual a 1 unidad de C´, de donde se calcula la dilución requerida para 2,5 unidades en 25 µl. v) La hemolisina es un suero hiperinmune de conejo contra SRBC. La cantidad utilizada es de 6 dosis hemolíticas leídas a punto final del 50% (HD50 [dosis hemolítica del 50%]). vi) Los SRBC se obtienen por punción aséptica de la vena yugular. Se pueden conservar en solución de Alsever o con citrato sódico. Se utilizan como suspensión al 6%. vii) El sistema hemolítico (HS) se prepara diluyendo hemolisina en VB hasta una dosis de 12 HD50. Se añade un volumen igual de suspensión de SRBC al 6% y el sistema se lleva a un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos con agitación periódica. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa viii) Los dos sueros positivos estándar, PS1 y PS2, son sueros bovinos de animales infectados naturalmente con un título bajo y alto, respectivamente, para armonización y control de la prueba FC, y para titulación de antígeno (PS2). Son negativos para anticuerpos frente a Brucella, Mycobacterium paratuberculosis, Chlamydia, Coxiella burnetii, Leptospira, rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa, Mycoplasma bovis y virus de la leucosis bovina. ix) El suero de control negativo (NS) es un suero de bovino sano, negativo para los microorganismos señalados. • Procedimiento de la prueba (utilizando microplacas) i) Colocar 25 µl de las muestras de los sueros de ensayo (ya diluidas a 1/10). Añadir 25 µl de antígeno a una dosis de 2 unidades FC. ii) Añadir 25 µl de C´a una dosis de 2,5 unidades. Agitar vigorosamente e incubar a 37ºC durante 30 minutos con agitación periódica. iii) Añadir 25 µl de HS, agitar vigorosamente e incubar a 37ºC durante 30 minutos con agitación periódica. Es necesario disponer de los siguientes controles: Complemento: 0,5, 1 y 2,5 unidades. Sistema hemolítico: 75 µl de VB + 25 µl de HS. Antígeno: 25 µl de 2 unidades FC de antígeno + 25 µl de C´con 2,5 unidades + 25 µl de HS. Nota: las microplacas deben agitarse vigorosamente dos veces durante el período de incubación. Se utilizan siempre los controles indicados arriba, el PS y el NS, en cada microplaca o en una serie de microplacas en que se utilizan los mismos lotes de reactivos. iv) Lectura e interpretación de los resultados: Después de centrifugar las microplacas a 125 g durante 2 minutos, la lectura se basa en el porcentaje observado de fijación de complemento. Resultado positivo: 100% de hemolisis a 1/10; Resultados dudosos: 25, 50 o 75% de hemolisis a 1/10. Se recomienda que cualquier fijación de complemento, incluso parcial (25, 50 ó 75%), a una dilución 1/10 de suero se continúe con investigaciones adicionales. Las limitaciones de la prueba FC resultan bien conocidas. Con una sensibilidad de >99,5%, la prueba FC puede detectar casi todos los animales enfermos con lesiones agudas, pero sólo una pequeña proporción de animales en las primeras fases de la enfermedad o con lesiones crónicas. Además, las intervenciones terapéuticas o las operaciones profilácticas ejecutadas de modo incorrecto (sacrificio parcial de la población) pueden aumentar el número de reacciones negativas falsas. Sin embargo, para grupos de animales (una manada o unidad epidemiológica) la FC es capaz de detectar prácticamente el 100% de los grupos infectados. La naturaleza de la patogénesis de la enfermedad es tal que el período de incubación, durante el cual los anticuerpos resultan indetectables por la prueba FC, puede prolongarse varios meses. Pese a la alta sensibilidad de la prueba FC, pueden producirse resultados positivos falsos. Una causa importante de ello es la existencia de reacciones serológicas cruzadas con otros micoplasmas, en particular con otros miembros del grupo M. mycoides. La validez de los resultados debe confirmarse mediante examen post-mortem y bacteriológico, y mediante pruebas serológicas con sangre tomada en el momento del sacrificio. b) Enzimoinmunoensayo competitivo (prueba prescrita para el comercio internacional) Se ha sometido a evaluación (3) un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) desarrollado por el Centro de Colaboración de la OIE para el diagnóstico y Control de Enfermedades Animales en Países Tropicales (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) (16). En la actualidad, la IAEA está evaluando un ELISA indirecto basado en una lipoproteína (1). En mayo de 2000 se designó a la C-ELISA como una "prueba alternativa" por el Comité Internacional de la OIE y en mayo 2004 como una prueba prescrita. Comparada con la prueba FC, la prueba C-ELISA tiene una sensibilidad similar pero una especificidad mayor. La C-ELISA es una prueba para poblaciones de animales más fácil de realizar que la FC, pero sus características no han Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 183 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa sido determinadas por completo, todavía (16). Los reactivos para C-ELISA se pueden obtener como preparaciones comercializadas 1 . Las pruebas de validación llevadas a cabo en varios países europeos y africanos (3, 16) indican i) que la verdadera especificidad de C-ELISA es de al menos 99,9%; ii) que la sensibilidad es similar a la de la prueba FC; y iii) que mediante C-ELISA los anticuerpos se detectan muy poco tiempo después de que se pueden detectar por la prueba FC y que los anticuerpos detectados por C-ELISA persisten mediante más tiempo. Esta prueba C-ELISA se suministra ahora como una preparación comercial lista para ser utilizada, que contiene todos los reactivos necesarios incluyendo placas recubiertas, que se mantienen selladas por papel de aluminio. La preparación se ha diseñado especialmente para ser resistente y ofrecer una buena reproducibilidad. Los sueros se analizan en pocillos únicos. El substrato se ha modificado y en la actualidad es TMB (tetrametil benzidina) en tampón líquido y la lectura se realiza a 450 nm. El color del substrato cambia de verde pálido a azul en una primera fase y es amarillo después de añadir la solución de parada. Los controles de MAbs muestran un color más oscuro mientras que los controles de suero muy positivo son muy claros. El punto de corte se ha tomado al 50% y debería ser válido en cualquier país. En una población afectada muchos animales mostrarán resultados positivos. c) • Reactivos i) El antígeno base se prepara lavando una suspensión concentrada de micoplasmas (2 mg/ml) y lisando con dodecil sulfato sódico al 0,1%. El antígeno base se mantiene a -20ºC hasta su uso. ii) Los MAbs se pueden conseguir del Centro de Colaboración de la OIE para el Diagnóstico y Control de Enfermedades Animales en Regiones Tropicales (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). iii) El conjugado es DAKO P260 diluido 1/1500 en PBS con 0,5% de suero de caballo y 0,05% de Tween 20. iv) El substrato es 1 mM ABTS (2, 2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]) y H2O2 en tampón citrato. • Procedimiento de la prueba i) Las placas para ELISA se recubren con una solución pH 7,4 (100 µl/pocillo) y se incuban toda la noche a 4ºC. ii) Se lavan las placas una vez en PBS diluido 1/5 con 0,05% de Tween 20. iii) Sueros no inactivados por el calor (diluidos 1/10) y MAb diluidos en PBS con 0-5% de suero de caballo y 0,05% de Tween 20 se dejan en contacto con el antígeno durante 1 hora a 37ºC con agitación moderada, en una cámara húmeda. El suero inactivado por calor no proporciona buenos resultados. iv) Se lavan las placas dos veces y se añade el conjugado a todos los pocillos (100 µl); luego se incuba durante 1 hora a 37ºC. v) Se lavan las placas tres veces y se añade el substrato a todos los pocillos (100 µl). vi) Se realiza la lectura a 405 nm cuando la absorbancia alcanza 0,8-1,6 en el control de MAb. de antígeno lisado en PBS, Prueba de inmunotransferencia Se ha desarrollado una prueba inmunoenzimática denominada prueba de inmunotransferencia (prueba IB) que se considera con valor diagnóstico. Una estimación en condiciones de campo indicó una sensibilidad y especificidad más altas que la prueba de FC. Se considera inmunodominante un perfil básico de bandas antigénicas, que se presentan en animales infectados tanto experimental como naturalmente. La visión ajustada del estado inmune del animal que proporciona esta prueba se debe a la posibilidad de un análisis más preciso de la respuesta inmune del hospedador en relación con el perfil electroforético de los antígenos de MmmSC; por tanto, esta prueba supera problemas relacionados con unión inespecífica. Debería utilizarse fundamentalmente como una prueba confirmativa, después de otras pruebas, y en todos los casos en los que la prueba FC ha dado un resultado falso sospechoso. Particularmente, posee valor donde se están implantando políticas de control o erradicación de la enfermedad. 1 184 International Atomic Energy Agency, Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Viena, Austria, o CIRAD/EMVY, Santé Animale, Campus International de Baillarguet, TA30/G, 34398 Montpellier cedex 5, Francia. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa • Preparación de tiras de antígeno i) El antígeno se prepara lavando una suspensión de células de micoplasmas obtenida de un cultivo de 48 horas. ii) Se prepara una SDS/PAGE (dodecil sulfato sódico/electroforesis en gel de poliacrilamida) con gel de concentración al 4% y gel de resolución en gradiente del 5-15% y se utiliza para electroforesis de la muestra con marcadores apropiados de peso molecular. iii) Las proteínas separadas se transfieren a membranas de 0,45 µm de nitrocelulosa (14 x14 cm) a un voltaje constante de 70 V en tampón de transferencia (20% de metanol en 193 mM de glicina, 25 mM de Tris/HCl, pH 8,3). iv) Se seca la membrana y se marca el lado sobre el que se encuentran las proteínas. Se incuba la membrana de nitrocelulosa en tampón de bloqueo (PBS que contiene 5% de leche desnatada, 1 M de glicina y 1% de ovolabúmina) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 15 minutos en PBS con 0,1% (v/v) de Tween 20, la membrana se lava de nuevo con PBS solo. Se seca la membrana y se corta una tira del borde, que se ensaya. Se identifican las bandas específicas de 110, 98, 95, 62/60 y 48 kDa. v) La hoja de la membrana de nitrocelulosa se corta en tiras de 0.4 cm de anchura y se marca cada tira. Estas tiras son el antígeno usado en la transferencia. • Procedimiento de la prueba NB: Las tiras deben disponerse con el antígeno hacia arriba durante el procedimiento. d) i) Las muestras del suero de prueba se diluyen al 1/3 y se preparan sueros control positivo y negativo utilizando tampón de dilución (PBS con 0,1% de leche desnatada y 0,1% de ovoalbúmina). ii) Se coloca una tira de antígeno en cada muestra de estudio (y en los controles) y se incuba a 37ºC durante 2 horas con agitación continua. Después se lavan las tiras, como antes. iii) Las tiras se incuban con una dilución adecuada de Ig anti-bovina (cadenas H +L) conjugada con peroxidasa, en tampón de dilución, durante 1 hora a temperatura ambiente y con agitación continua. Después, lavar como antes. iv) El substrato se prepara añadiendo 30 mg de 4-cloro-1-naftol, disuelto en 10 ml de metanol, a 50 ml de PBS y 30 µl de H2O2. Se añade substrato a las tiras, que se dejan en la oscuridad con agitación continua y se examinan periódicamente hasta que las bandas de proteínas aparecen oscuras. La reacción se detiene con agua destilada. v) Lectura de los resultados: Las tiras se secan y se examinan respecto a la presencia del perfil básico de inmunotransferencia de IgG para cinco bandas antigénicas específicas de 110, 98, 95, 62/60 y 48 kDa. Los sueros que dan un perfil inmunológico similar se consideran positivos. Otras pruebas Para detectar aglutininas específicas se ha desarrollado una prueba rápida de campo de aglutinación en porta (SAT) con sangre entera o con suero (30): el antígeno es una suspensión densa de micoplasmas coloreados que se mezcla con una gota de suero o sangre. Debido a una sensibilidad escasa, la prueba sólo detecta animales en los estados iniciales de la enfermedad (es decir, la fase aguda). Debe usarse solo a nivel poblacional. Se ha desarrollado una prueba de aglutinación con látex que es más fácil de interpretar que la SAT (4). Para la PBC, las pruebas FC y ELISA se pueden utilizar en programas de análisis y erradicación, y la prueba IB altamente específica debería usarse como confirmativa. Sin embargo, la prueba IB no satisface el análisis masivo y puede ser difícil de estandarizar en países con servicios de laboratorio marginales. C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Desde principios del siglo XX se han descrito muchas vacunas contra la PBC (vacunas muertas y vacunas heterólogas), pero ninguna ha sido realmente satisfactoria. En la actualidad, las únicas vacunas utilizadas se producen con cepas atenuadas de MmmSC. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 185 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa 1. Control del inóculo a) Características del inóculo Para preparar vacunas contra la PBC se utilizan dos cepas: la cepa T1/44, una cepa atenuada naturalmente y aislada en 1951 por Sheriff & Piercy en Tanzania, y la cepa T1sr (34, 35). El pase número 44 por huevo es lo suficientemente atenuado para proteger al ganado sin producir reacciones postvacunales importantes. Después de la vacunación pueden presentarse reacciones locales en el punto de la vacunación. Las razas de ganado deben caracterizarse en cuanto a sensibilidad antes de proceder a vacunar en masa. Debe advertirse que cuando la vacuna se suministra por intubación puede producir PBC; sin embargo, si se inyecta subcutáneamente no debe crear un problema serio de enfermedad (15). La identidad de la cepa se puede comprobar con la inserción del perfil de la secuencia o por ensayo específico con PCR (18). La cepa de inóculo original se mantiene en forma liofilizada a -20ºC. b) Método de cultivo Para la producción de vacunas se utiliza un sistema de lotes de inóculos liofilizados que se obtienen de cultivos del inóculo primario. Estos lotes de inóculo se mantienen a -20ºC. Los medios utilizados para los cultivos de siembra son el medio de Gourlay o el medio F66: ambos contienen los mismos ingredientes básicos, pero el F66 es más complejo (24). Los medios se esterilizan por filtración, poseen un pH de 7,8-8,0, y deben utilizarse en pocos días después de su preparación. El medio se debe distribuir en tubos incubados a 37ºC durante 48 horas para comprobar su esterilidad antes del uso. Para cultivos en masa de la cepa de vacuna se debe inocular directamente el contenido completo de un vial de inóculo de siembra a 100 ml de medio, para evitar el riesgo de clonar sin pretenderlo el inóculo de la vacuna. 2. Método de producción Los medios para producir vacunas, de Gourlay o F66, se describen en la Sección C.1.b. Deben distribuirse en matraces de 1 litro (500 ml por matraz) y de 10 litros (5 litros por matraz) e incubarse a 37ºC durante 48 horas para comprobar la esterilidad antes de su utilización. Para obtener un recuento bacteriano alto, se deben recoger los cultivos justo antes del final de la fase logarítmica de crecimiento, antes del punto máximo, pues el número de micoplasmas viables se reduce después rápidamente. Por consiguiente se debe realizar una cinética de la curva de crecimiento en cada laboratorio de producción. El contenido de un vial de inóculo de trabajo se usa en tubos en diluciones seriadas. Si no se produce contaminación después de la incubación, se utiliza el segundo tubo, cuando el cultivo aún está en fase exponencial, para inocular matraces de 1 litro. Los matraces de 10 litros se inoculan con el cultivo de 48 horas de un matraz de 1 litro (10 ml/ litro de medio) y se incuban a 37ºC. Después de 24 horas de incubación, se recomienda que la agitación magnética sea lenta. Justo antes de que se alcance el máximo (entre 60 y 70 horas de incubación), se prepara el cultivo para liofilización. Los siguientes pasos deben hacerse en hielo: • Adición del medio protector de liofilización: leche en polvo desnatada (al 4,5%, es decir 225 g por cada 5 litros). • Distribución en viales (el volumen depende del número de dosis necesarias por vial y de los pasos de la liofilización). Para liofilizar se recomiendan liofilizadores con estantes para controlar y observar los diferentes pasos. Los viales deben cerrase en la máquina del liofilizador para evitar roturas. 3. Control interno En cada paso deben realizarse exámenes microscópicos de preparaciones teñidas con la tinción de Gram del caldo, o de cultivos del caldo en medio sólido con sangre, para comprobar la ausencia de contaminación bacteriana. 186 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa También debe realizarse un examen rápido para comprobar la presencia de MmmSC en el medio recogido, por microscopía de contraste de fases y mediante FAT con un suero hiperinmune marcado. Se inoculan muestras liofilizadas de las vacunas en agar micoplasma o en caldo para llevar a cabo pruebas de inhibición del crecimiento (11). 4. Control de lotes a) Esterilidad Se inoculan caldos bacteriológicos, así como agar sangre, y se incuba a 37ºC. Todos los medios deben permanecer estériles (24). Las pruebas para esterilidad pueden encontrarse en el Capítulo I.1.5. b) Titulación El título mínimo es de 107 micoplasmas por dosis de vacuna, pero se recomiendan títulos más altos, de al menos 108. La titulación se lleva a cabo después de reconstituir la vacuna liofilizada en el diluyente recomendado para la vacunación. Las titulaciones se deben realizar en al menos cinco viales de cada lote. Técnica clásica: Se realizan diluciones decimales en medio de Gourlay. Para homogenizar la suspensión en cada tubo resulta útil emplear un agitador de tipo vórtex. Primero, 5 ml de los tubos con diluciones de 10-6 a 10-12 se inoculan en cinco tubos de medio (1 ml por tubo, cinco tubos por dilución). Todos los tubos se incuban luego 4 días a 37ºC y se detecta el crecimiento por el cambio de color en el indicador. El título se obtiene utilizando la tabla del "Número Más Probable" de MacCrady o por modificación del método de Reed & Muench. Esta técnica es simple y fácil de realizar pero carece de precisión (+ 0,5 log). Se ha descrito un método de microtitulación que es más exacto (27) y que debería utilizarse cuando sea posible. Existen procedimientos alternativos de titulación que incluyen el uso de diluciones decimales preliminares, como en la técnica clásica, pero la siembra de 20 alícuotas de 100 µl, por cada dilución, en una microplaca que ya contiene el "medio con glucosa" y un indicador de pH. Se pueden probar cuatro diluciones en una microplaca, dejando dos columnas para el control del medio. El título se calcula por una modificación del método de Reed y Müench que consiste en restar 0,25 log del título final para obtener un "número de organismos viables" y no una dosis infectiva del 50%. La precisión final debe ser del orden de 0,2-0,25 log. Se pueden obtener titulaciones comparativas sembrando alícuotas de 20 µl de cada una de las diluciones primarias en un medio sólido conveniente. Los títulos se obtienen luego como CFU (unidades formadoras de colonias) y no debería diferir mucho de los títulos obtenidos en medio líquido. La titulación en medio sólido requiere más destreza que en medio líquido. c) Inocuidad Después de la reconstitución en tampón frío, la vacuna se inocula subcutáneamente en dos ratones, e intraperitonealmente en otros dos ratones y en dos cobayas machos. Ninguno de los animales debe morir en el mes siguiente y los cobayas no deben mostrar signos de orquitis. Las pruebas de inocuidad se deben realizar por lo menos en dos cabezas de ganado bovino o de cebúes. Cada una se inocula con diez dosis de vacuna y se observan para efectos adversos durante 4 semanas. d) Potencia Se inyectan subcutáneamente por lo menos diez cabezas de ganado bovino en el sitio recomendado, indicado en el prospecto. Se mantienen como controles no vacunados otros tantos animales. Después de por lo menos 2 meses, todos los animales se ponen en contacto con ganado infectado experimentalmente, en un espacio cerrado, utilizando al menos un donante de la infección por cada tres cabezas sometidas a prueba. El ganado se mantiene en contacto durante 3 meses. Después, se sacrifican todos los animales y se realizan exámenes post-mortem. Los animales vacunados no deberían mostrar más que síntomas clínicos ligeros de la enfermedad, ni presentar lesiones post-mortem de pleuroneumonía. Al menos el 80% de los animales control deben mostrar las típicas lesiones post-mortem. Esta prueba de potencia solo se necesita realizar una vez; los lotes siguientes no se tienen que volver a probar, siempre que se produzcan con arreglo a un protocolo estándar (34, 35). Cualquier modificación de tal protocolo estándar, como incrementar el número de pases in vitro, debe estar estrictamente prohibido. Otras modificaciones, como la producción en fermentadores con ajuste continuo de pH o adición de reactivos, debe acompañarse siempre de una prueba de potencia para asegurar que la protección inducida no se ha visto alterada. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 187 Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa e) Duración de la inmunidad La cepa T1/44 confiere una protección aproximada de 1 año (14), pero la lograda con la cepa T1sr puede durar sólo 6 meses. En algunos animales se produce seroconversión (prueba FC). Los anticuerpos desaparecen a los tres meses de la vacunación. f) Estabilidad La titulación periódica de la vacuna almacenada permite calcular la caducidad. Las vacunas liofilizadas deben conservarse a -20ºC. A esta temperatura su período de conservación es de por lo menos 1 año (24), y la viabilidad se puede conservar por muchos años sin pérdida de titulación, lo que permite la constitución de stocks de emergencia. Naturalmente, los títulos de estos depósitos necesitan un control regular. g) Conservantes Para liofilizar se añade leche desnatada en polvo: 45 g/litro de medio de cultivo. Para la reconstitución de una vacuna liofilizada se utiliza solución salina normal. Alternativamente, se utiliza a temperatura ambiente una solución molar de sulfato magnésico (248 g por litro). Esta solución molar protege a los micoplasmas de la inactivación por el calor (24). Es importante la pureza de las sales que se emplean. h) Precauciones (riesgos) Los procedimientos para uso en condiciones de campo y la reconstitución de las vacunas liofilizadas se han descrito por Provost et al. (24). Cuando se vacunan animales infectados, pueden aparecer reacciones intensas, como las que tuvieron lugar recientemente después de las campañas de vacunación de emergencia en el este de África. Por lo general, estas reacciones se presentan en 2-3 días. También pueden aparecer reacciones locales en el sitio de la inyección después de 2-3 semanas con la cepa T1/44. Estas reacciones se conocen como "reacción de Willems" y comprenden un edema invasivo que lleva a la muerte si no se administra tratamiento antibiótico con tetraciclina o tilosina. La cepa T1sr carece por completo de patogenicidad residual, lo que supone una alternativa de elección a la T1/44, aunque la duración de la inmunidad es más corta. Hubo sospechas de ineficacia de la T1sr para controlar brotes en África del sur, lo que llevó a su suspensión (29). La sensibilidad general de una población bovina determinada debe probarse primero vacunando grupos de muestra (24). 5. Pruebas sobre el producto final Estas pruebas se deben realizar después de la reconstitución de un conjunto de al menos cinco viales de la vacuna liofilizada con el diluyente recomendado. a) Inocuidad Las pruebas de inocuidad deben realizarse en ganado bovino o cebúes, de acuerdo con lo expuesto en la Sección C.4.c. b) Potencia Esta prueba se realiza siguiendo el protocolo descrito en la sección C.4.d. Debido a que la PBC no se puede reproducir experimentalmente con facilidad, y por su coste, solo se necesita realizar una prueba de potencia en cada lote de inóculo, con tal de que el título sea satisfactorio y que no cambien los parámetros de producción. REFERENCIAS 1. ABDO E.-M., NICLOLET J. & FREY J. (2000). Antigenic and genetic characterization of lipoprotein LppQ from Mycoplasma mycoides subs. mycoides SC. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7, 588–595. 2. AL-AUBAIDI J.M. & FABRICANT J. (1971). Characterization and classification of bovine mycoplasma. Cornell Vet., 61, 490–518. 3. 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