estudio de la fosforilación de la cadena ligera de las toxinas

estudio de la fosforilación de la
cadena ligera de las toxinas
botulínicas como estrategia para
el desarrollo de nuevas especies
para su uso en clínica y cosmética
tesis doctoral
cristina ibáñez rodríguez
Instituto de Biología Celular y Molecular
Universidad Miguel Hernández de Elche
+
Lipotec. S.A. Barcelona
Jose Manuel González Ros, Director del Instituto de Biología Molecular y
Celular de la Universidad Miguel Hernández de Elche,
da su conformidad a la lectura de la tesis doctoral titulada: “Estudio
de la fosforilación de la cadena ligera de las toxinas botulínicas
como estrategia para el desarrollo de nuevas especies para su uso
en clínica y cosmética”, presentada por Cristina Ibáñez Rodríguez.
Para que conste y surta los efectos oportunos, firma el presente certificado en
Elche, a 21 Noviembre de 2004
Fdo. Jose Manuel González Ros
En esta página quiero mostrar mi agradecimiento a todas las personas que
de una forma u otra han contribuido a la realización de este trabajo.
En primer lugar a los doctores Antonio Ferrer Montiel y Jose Mª García Antón
por darme la oportunidad de realizar mi tesis doctoral bajo su dirección.
También quiero agradecer a todo el personal del IBMC su ayuda y
amabilidad en los momentos que la he necesitado. Especialmente a Fran, por sus
buenos consejos sobre dicroismo circular y a May por su eterna sonrisa y
disponibilidad.
A todos mis compañeros del laboratorio, con los que he compartido un
montón de ratos buenísimos, especialmente a Reme, Carolina, Ana, Cloti, Beta y
Laura, por ser más que compañeras. A Clara además, por la enorme colaboración
prestada en la realización de algunos experimentos, a Rosa por sus consejos de
Biología Molecular y a Gregorio por su ayuda en la realización de los modelos
proteicos.
No quiero olvidar a mis compañeros del departamento de Bioquímica y
Biología Molecular de la Facultad de Farmacia, con los que me inicié como
investigadora y compartí tan buenos momentos dentro y fuera del laboratorio.
A mis queridísimos padres y hermana, que siempre me han apoyado en todas
mis decisiones laborales, que siempre están ahí para hacerme la vida más fácil y
que me lo dan todo sin esperar nada a cambio.
Y por último a la persona que más ha sufrido mis agobios, “estreses” e
inseguridades día a día, Enrique.
A mis padres
Capítulo 1. Introducción……………………………………………..….………………...1
La exocitosis y el ciclo vesicular……………………………………………………..….2
Mecanismo molecular de la exocitosis…………………………….…...…….3
Hipótesis SNARE…………….……………………………………………………….3
Otras proteínas implicadas en el ciclo vesicular………….…………………5
Patologías que cursan con hiperexocitosis neuronal………..…………………......6
Distonias…………………………………………………………….…………...…..7
Espasticidad…………………….………………………………….…………...….7
Estrabismo……………………..………………………………………………...….7
Hiperhidrosis…………..………………………………………………………….....7
Tratamiento
de
patologías
que
cursan
con
hiperexocitosis
neuronal:
toxinas botulínicas………....……………………………..……………………...……..….8
Las toxinas botulínicas…………………………..……………………………..….8
Estructura………………………………………………………………………....….8
Mecanismo de acción……………………………………………………….….10
Dianas de las toxinas botulínicas…………..………………………………….11
El botulismo…………………….……………………………………….……….....12
Usos terapéuticos de las toxinas botulínicas………………….……………..13
Problemas del uso de las toxinas botulínicas………………..…………..15
Diferencias entre los diferentes serotipos de toxinas botulínicas…….16
Alternativas al uso de las toxinas botulínicas……………………………16
Capítulo 2. Objetivos…………………………...…………………….…………………….18
Capítulo 3. Resultados………………………………………...…………………….…….20
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes….....21
Expresión y purificación de las CLs-BoNTs recombinantes……...………..21
Las CLs-BoNTs recombinantes son activas “in-vitro”………..……………..23
Las CLs-BoNTs recombinantes son sustratos de tirosín-quinasas..……….25
Efectos de la fosforilación en la actividad enzimática de las CLs-BoNTs
recombinantes………………………………………………….……………..….27
I
Cambios estructurales inducidos por la fosforilación…….………………29
La fosforilación aumenta la temperatura de desnaturalización de la
Cl-BoNTE………………………………………………………………………….....31
Localización del sitio de fosforilación de la CL-BoNTS……….……………32
Mutación de los sitios de forforilación…..……………………………..……..34
1. Mutantes constitutivamente no fosforilados…..………………35
2. Mutantes constittutivamente fosforilados……...…….…………..37
Modelos proteicos.………………………………………………..……………...41
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CL-BoNTs
recombinantes……………………………………………………………….…………….46
Dominios de transducción de proteínas…………………………..…………46
Caracterización de la proteína TAT-BoNTA………………………..………..49
1. Diseño y clonaje……………………..……………...……………..….49
2. Expresión y purificación de TAT-BoNTA……………………………50
3. Internalización de TAT-BoNTA en células……………....……….51
3.1. En el hibridoma F11……………..………………..………..51
3.2. En PC12….……….………..…………………………………52
La actividad de CL-BoNTA en células PC12 es modulada por tirosínquinasas……………………………………………………………………………………..56
Capítulo 3. Discusión……………………………………………………………………….57
Capítulo 4. Conclusiones………………………………………………………………...66
Capítulo 5. Materiales y métodos…………………………………...………………68
Materiales…………………………………………………………………………..69
Métodos…………………………………………………………………………….69
Obtención de cDNAs……………………………………………..……………..70
Mutagénesis dirigida……………………………………………………..………70
Transformación bacteriana……………………………………………..……...71
Expresión y purificación de CL-BoNTE…………………………………...……72
Expresión y purificación de CL-BoNTA……………………………….……….73
Expresión y purificación de SNAP-25……………..…………………..……….74
Expresión y purificación de TAT-BoNTA……………………………...…….….75
Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida…………..……….76
II
Western blot………………………………………………………………..……...76
Actividad proteolítica de CL-BoNTS………………………………..…………76
Fosforilación CL-BoNTs…………………………………………………..……….77
Visualización y modelado estructural………………………………..……….77
Medidas de dicroismo circular………………………………………..……….78
Mantenimiento de lineas celulares…………………………………..……….79
F11………..…………………………………………………….…………...79
PC12…………………………………………..……………………………79
Incubación con TAT-BoNTA…………………………..………………………...79
Inmunocitoquímica…………………………….……….………………………..80
Microscopía confocal……………………………..…………………………….80
Capítulo 6. Apéndices…………………………………………………………………….81
Abreviaturas……………………………………………………….……………………….82
Preparación de reactivos……………………………………………………………….84
Soluciones y tampones……………………………………..…………………...84
Medios para cultivos bacterianos…………………………..………………...87
Cepas bacterianas utilizadas……………..…………………….……………..88
Índice de figuras…………………………………………………………………………...89
Índice de tablas……………………………………………………………………………92
Capítulo 7. Bibliografía…………………………………………………………………….93
III
1
introducción
La exocitosis y el ciclo vesicular
L
a exocitosis es el proceso mediante el cual se secretan
diferentes tipos de moléculas contenidas en una vesícula
de una célula al espacio extracelular. Este proceso ocurre en
todas las células eucariotas. Sin embargo, la exocitosis se ha
especializado en células secretoras y neuronas, donde es
altamente regulable, dependiente de calcio y se denomina
exocitosis regulada. Ésta se diferencia de la exocitosis
constitutiva, la cual, está controlada únicamente por la
Figura 1.1. La exocitosis.
homeostasis celular. La exocitosis regulada es un proceso
extremadamente rápido, que dura unos milisegundos (Almers
et al., 1991) y forma parte de un proceso más complejo,
conocido como el ciclo vesicular.
El ciclo vesicular empieza en el citoplasma celular, con la
síntesis de las vesículas sinápticas a partir de endosomas
tempranos, a continuación las vesículas lipídicas vacías se
cargan con neurotransmisores (fig. 1.2.). Una vez cargadas, se
fijan al citoesqueleto mediante proteínas específicas de la
membrana vesicular. De este compartimiento de reserva, las
vesículas van a ser dirigidas y ancladas específicamente por
la interacción de ciertas proteínas a las zonas activas de la
membrana presináptica, dando lugar a una población de
vesículas preparadas para ser liberadas ante la llegada del
estímulo secretor. Una vez ancladas las vesículas serán
activadas mediante ATP. A continuación la vesícula se fusiona
a la membrana en respuesta a un aumento de Ca2+
intracelular, originando la exocitosis que conduce a la
liberación del contenido vesicular al espacio extracelular.
La exocitosis es seguida por la endocitosis, esto es, la
internalización de las vesículas vacías desde la membrana
celular, la cual, además de servir para recuperar de forma
selectiva y eficiente las estructuras especializadas de la
membrana, sirve para regular el tamaño celular. Las vesículas
vacías son transportadas al interior celular donde son
cargadas con neurotransmisor o fusionadas con el endosoma
para empezar nuevamente el ciclo.
2
Figura 1.2. El ciclo vesicular.
Mecanismo molecular de la exocitosis
L
as proteínas implicadas en la fusión vesicular fueron
descubiertas
inicialmente
en
el
laboratorio
del
Dr.
La hipótesis SNARE
Rothman por análisis bioquímico de sistemas de transporte
vesicular reconstituidos en un sistema libre de células (Sollner
et al., 1993). El análisis de las proteínas implicadas en estos
sistemas permitió al Dr. Rothman y sus colegas proponer un
modelo llamado la hipótesis SNARE (soluble N-ethylmaleimidesensitive (NSF) factor attachment protein receptor) en el cual
la fusión es mediada por interacciones entre proteínas
llamadas SNARE, una proteína SNARE que se encuentra en la
vesícula presináptica (v-SNARE) y otras proteínas (t-SNARE)
que se encuentran en la membrana plasmática. Las v-SNARE
y t-SNARE se reconocen, y se acoplan y forman un complejo
bioquímicamente estable que permite el acercamiento y
acoplamiento de la vesícula a la membrana plasmática.
Se han identificado más de 100 proteínas implicadas en el
ciclo vesicular, las cuales se han podido asignar en su gran
mayoría a tres familias de proteínas: Sintaxinas, VAMPs y la
familia de SNAP-25. Estas proteínas en el caso de la sinapsis
nerviosa son SNAP-25, sintaxina 1A y VAMP 2 (Sollner et al.,
1993).
Figura 1.3. Hipótesis SNARE.
La exocitosis y el ciclo vesicular. Hipótesis SNARE
3
Todas las proteínas SNARE comparten dos características
comunes:
• Un dominio de homología (el motivo SNARE) que
funcionalmente
permite
la
es
muy
formación
importante
de
la
porque
estructura
superenrollada del complejo SNARE (Weimbs et
al, 1997).
• Secuencias que permiten la interacción con
membranas. Sintaxina y VAMP se anclan a la
membrana mediante segmentos transmembrana
y SNAP-25 se asocia a ella a través de la
palmitoilación de residuos de cisteína (Jahn y
Sudhof, 1999).
La estructura del núcleo del complejo SNARE resuelta por el
grupo de Sutton (Sutton et al., 1998), supuso un gran avance
en el conocimiento de la biología estructural de la fusión
vesicular. Consiste en una estructura superenrollada formada
por 4 hélices paralelas, las cuales son aportadas una por
syntaxina-1A, dos por SNAP-25 y la cuarta por VAMP-2 (fig 1.4.).
El
enrrollamiento
helicoidal
está
fundamentalmente
estabilizado mediante interacciones hidrofóbicas.
Figura 1.4. Estructura del
complejo SNARE. De: “Crystal
structure of a SNARE complex
involved in synaptic exocytosis at
2.4 A resolution. Sutton,R.B.,
Fasshauer,D., Jahn,R., y Brunger,A.T.
(1998). Nature 395, 347-353.”
En el centro del núcleo hidrofóbico, se encuentra un motivo
polar, la capa cero, que consiste en 3 residuos de glutamina
(uno de la hélice de sintaxina y 2 por cada hélice de SNAP-25)
y un residuo de arginina (de la hélice de VAMP), que parece
tener un papel fundamental como modulador de la
estabilidad del complejo SNARE (fig. 1.5.) (Scales et al., 2001).
Esta estructura superenrollada confiere gran estabilidad al
complejo
SNARE,
siendo
éste
resistente
a
detergentes
caotrópicos como el SDS, temperaturas de hasta 70 ºC y a las
toxinas botulínicas (Chen y Scheller, 2001).
La exocitosis y el ciclo vesicular. Hipótesis SNARE
Figura 1.5. Estructura de la
capa cero del complejo
SNARE.
4
Otras proteínas implicadas en el ciclo vesicular
A
demás de las proteínas SNARE, la fusión vesícular
requiere una gran cantidad de proteínas (tabla 1.1.).
Esta complejidad molecular es esencial para asegurar la
localización, eficacia y fidelidad del proceso de exocitosis
regulada.
1. Proteínas de la membrana vesicular
Bomba de protones Es una ATPasa que al generar un gradiente
vacuolar
electroquímico de protones proporciora la energía para
la captura de los neurotransmisores o sus precursores.
Transportadores de Se encargan de la recaptura del NT a nivel del la terminal
neurotransmisores neuromuscular. Existen al menos 5 tipos de
transportadores específicos para glutamato, acetilcolina,
catecolaminas, glicina/GABA y ATP. El tipo de
transportador contribuye a determinar la especificidad
del transmisor de una sinapsis.
Sinapsinas
Existen varias isoformas, se consideran fundamentales
para la unión de las vesículas a proteínas del
citoesqueleto como la actina. Mantiene a las vesículas en
un almacén de reserva, listas para la liberación, cerca de
la zona activa de la sinapsis. Posee sitios de regulación por
fosforilación para una quinasa de la Ca-calmodulina.
Proteínas Rab
Son proteínas muy conservadas en la escala evolutiva
desde las levaduras hasta los mamíferos. Es una GTPasa
de bajo peso molecular regulada por GTP. Modulan el
anclaje y posible activación de las vesículas a las zonas
activas y la regulación de las proteínas SNARE
Sinaptotagminas Fundamentales para el anclaje y posiblemente para la
fusión de las vesículas a zonas activas de la membrana
plasmática, por su unión con proteínas específicas de la
membrana como la sintaxina y neurexinas. Presenta 2
dominios de unión para Ca2+ con una afinidad de 10 µM,
se postula que funcionan como sensores de calcio.
Sinaptofisinas
Posibles componentes del poro de fusión. Se une a
sinaptobrevina. Se regula por fosforilación por PKII
dependiente de Ca-calmodulina.
2.Proteínas asociadas a la membrana plasmática
Factor sensible a Es una ATPasa fundamental para direccionar el trafico de
N-etilmaleimide membranas en todas las células eucariotas a diferentes
(NSF)
niveles. Funcionan como chaperonas en el reciclaje de
las proteínas SNARE.
Munc18
Proteínas fundamentales en el proceso de anclaje de las
vesículas. Se unen a las sintaxinas
α/β/φ-SNAPs
Proteínas requeridas para reclutar el NSF a las membranas
de manera ATP-dependiente
3. Proteínas de la membrana plasmática
Neurexinas
Existen más de 1000 isoformas de esta familia. Se
encuentran a nivel de la terminal nerviosa y tienen
funciones de reconocimiento celular y de tráfico de
membranas
Canales de Ca2+ Se ha demostrado la presencia de canales de calcio a
sensibles
a nivel de las zonas activas de una sinapsis, median el influjo
voltaje
de Ca2+ para la liberación del neurotransmisor.
La exocitosis y el ciclo vesicular. Otras proteínas implicadas en el ciclo vesicular.
Tabla 1.1. Proteínas implicadas
en el ciclo vesicular.
5
Patologías que cursan con
hiperexocitosis neuronal
E
xiste un gran número de patologías que cursan con un
aumento de la actividad de la exocitosis en la unión
neuromuscular o en las terminales nerviosas que inervan las
glándulas
sudoríparas,
provocando,
una
contracción
muscular o sudoración excesiva, respectivamente.
L
as distonias son trastornos de movimiento en las cuales
Distonias
contracciones sostenidas del músculo causan torceduras y
movimientos repetitivos o posturas anormales. Cuando la
distonia se localiza en una parte específica del cuerpo se
conocen como distonias focales.
Tipos de distonias focales son:
• El blefarospasmo, es el cierre involuntario y
forzado de los párpados. Los primeros síntomas
pueden incluir un parpadeo incontrolable, los
espasmos pueden hacer que los párpados
permanezcan
cerrados
constantemente,
causando ceguera funcional aunque los ojos y
la visión sean normales.
• La tortícolis espasmódica, en la que los
Figura 1.6. Calambre del
escritor con flexión de
dígitos 2-5 y extensión de
pulgar.
músculos del cuello que controlan la posición
de la cabeza se ven afectados, haciendo que
la cabeza se doble hacia un lado.
• Calambre del escritor, es una distonia que
afecta a los músculos de la mano y a veces
del antebrazo y ocurre solamente durante la
escritura.
• Espasmo
hemifacial,
es
un
movimiento
anormal del párpado, se caracteriza por
contracciones de la musculatura inervada por
el nervio facial, en forma involuntaria, que se
6
sucede con breves intervalos, rápidos, con
carácter
de
espasmo
y
que
afectan
predominantemente el lado izquierdo de la
cara.
L
a espasticidad es un trastorno del tono muscular que se
Espasticidad
produce por una lesión cerebral o medular, reduciendo el
movimiento
de
la
parte
afectada,
generalmente
las
extremidades.
Esta asociada a lesiones o enfermedades que afectan al
sistema nervioso central. Las más frecuentes son las lesiones
vasculares-cerebrales,
otra
patología
frecuente
son
los
traumatismos craneales y finalmente las enfermedades
degenerativas como la esclerosis múltiple.
E
s la pérdida del paralelismo de los ojos. Los dos ojos no
Estrabismo
miran al mismo sitio, uno de ellos dirige la mirada al objeto
que fija, mientras que el otro se desvía en otra dirección.
La desviación puede ser grande y entonces constituye un
defecto estético llamativo, pero puede haber casos donde la
desviación es muy pequeña, no apreciándose estéticamente,
puede
pasar
desapercibido,
pero
creará
los
mismos
problemas de visión que las grandes desviaciones.
L
a
hiperhidrosis
primaria
es
la
sudoración
excesiva
Hiperhidrosis
principalmente de las palmas de las manos, axilas, cara, y
planta de los pies; es un síndrome que condiciona una intensa
alteración del estado psíquico del enfermo que dificulta sus
relaciones sociales así como su trabajo profesional.
Su causa no es conocida pero está relacionada con una
hiperactividad de las fibras simpáticas y un aumento de la
respuesta periférica sudomotora.
Enfermedades que cursan con hiperexocitosis neuronal.
7
Tratamiento de patologías que cursan con
hiperexocitosis neuronal: Toxinas
botulínicas
Las toxinas botulínicas
L
as toxinas botulínicas son las toxinas más potentes
conocidas, pero, paradójicamente se usan para combatir
un amplio número de enfermedades. La experimentación
clínica con BoNTA empezó en 1970 (Scott et al., 1973) como
alternativa a la cirugía para el tratamiento del estrabismo,
desde entonces cada vez son más los usos terapéuticos de las
toxinas botulínicas aprobados, entre los que se incluyen
desórdenes oftalmológicos, neurológicos y gastrointestinales.
L
as toxinas botulínicas se sintetizan en el citosol bacteriano
Estructura
y son liberadas al medio de cultivo, después de una lisis
bacteriana, como una cadena polipeptídica e inactiva de
150 KDa. La activación llega con un corte proteolítico
específico en un lazo expuesto. La cadena ligera (CL, 50 KDa)
y la cadena pesada (CP, 100 KDa) permanecen unidas por
un puente di-sulfuro, que es necesario para su neurotoxicidad
(Mahant et al., 2000; Rossetto et al., 2001).
Figura 1.7. Representación
esquemática de las toxinas
botulínicas.
8
Se
han
identificado
7
serotipos
diferentes
de
toxinas
botulínicas, producidas por diferentes cepas de Cl. botulinum,
que se nombran de la A a la G. Los serotipos son
antigénicamente
diferentes,
pero
funcional
y
estructuralmente muy semejantes, sin embargo las diferencias
en los sitios de unión a las neuronas, sus sustratos enzimáticos y
sensibilidades, sugieren que cada serotipo se comporta como
una entidad farmacológica.
En 1998 se determinó la estructura cristalográfica de la BoNTA
(Lacy et al, 1998), consta de 3 dominios estructurales, con una
disposición lineal, sin que haya contacto entre el dominio
catalítico y el de unión al receptor. Esto datos coincidieron
con el modelo estructuro-funcional que se había construido
con los datos bioquímicos.
Figura 1.8. Estructura
cristalográfica de la BoNTA.
De: “Sequence Homology and
Structural Analysis of the Clostridial
Neurotoxins. Lacy, D.B., Tepp, W.,
Cohen,A.C., DasGupta, B.R., y
Stevens, R.C. (1998).J. Mol. Biol. 291,
1091-1104.
De estos tres dominios, el primero (1-437), comprende la
cadena ligera (CL), que es donde reside la actividad
catalítica (endoproteasa dependiente de zinc) y dos se
encuentran
en
la
cadena
pesada
(CP):
la
porción
aminoterminal de la cadena pesada (448-872, PN) está
relacionada con la translocación de la cadena ligera L en el
citoplasma, a través de la membrana celular la porción
carboxiterminal (873-1295, PC), que es la principal responsable
de la unión a la superficie de las neurona.
Toxinas botulínicas. Estructura.
9
El dominio CP está formado por 2 subdominios de tamaño
semejante compuestos, principalmente por láminas β, unidas
por α hélice. Este dominio se ladea desde el dominio PN, de
forma que es accesible para la unión. El dominio PN contiene
2 largas hélices anfipáticas y un gran lazo conocido como
cinturón de translocación que envuelve a la cadena ligera.
La cadena ligera contiene el motivo HExxH característico de
las proteasas dependientes de zinc (fig. 1.9.) y se encuentra
situado en una hendidura de la superficie proteica. La
cadena de traslocación del dominio PN ocluye el centro
activo.
Figura 1.9. Centro activo de
las toxinas botulínicas.
Existen 2 puentes disulfuro, uno, que une la cadena ligera con
la cadena pesada, y otro en la en la porción c-terminal del
dominio de unión.
S
e ha propuesto un mecanismo de acción para las BoNTS
que consta de 4 fases:
1. La toxina se une a la membrana presináptica de la
terminales colinérgicas a través de se dominio PC.
Mecanismo
acción
de
1
Aunque este mecanismo no se conoce con exactitud,
se sabe que están implicados los gangliósidos de la
membrana
plasmática
de
las
células
diana.
Sin
embargo, los gangliósidos no son la única molécula que
facilita la unión de la BoNT y se postula que, además,
2
debe existir un receptor proteico (Rossetto et al., 2001;
Kitamura et al., 1999; Montecucco et al., 2004).
2. Internalización en vesículas endocíticas, cuyo lumen es
ácido por la actividad de la bomba de protones ATPasa.
3
3. Traslocación al citosol. El pH ácido conduce un cambio
conformacional en las toxinas botulínicas, que se
caracteriza por la exposición de regiones hidrofóbicas
en las superficie, que permiten, que la cadena pesada
4
forme un canal en la bicapa lipídica, por el que pasa la
cadena ligera para llegar al citosol celular (Koriazova y
Montal, 2003).
proteínas SNARE.
Figura 1.10. Mecanismo de
acción de las toxinas
botulínicas.
Toxinas botulínicas. Estructura.
10
4. La cadena ligera cataliza la proteolisis de una de las tres
L
a eficacia de las toxinas botulínicas reside especialmente,
en su enorme selectividad del sustrato.
Dianas de las
toxinas botulínicas
Los 7 serotipos de toxinas botulínicas cortan específicamente
una de las 3 proteínas del complejo SNARE necesario para la
neurosecrección: así BoNT-B, -D y –G cortan VAMP cada una
en un sitio diferente, BoNT-A y –E truncan el C-terminal de
SNAP-25 y BoNT-C proteoliza tanto a sintaxina como a SNAP25 (figura 1.11., tabla 1.2.). El corte de las proteínas SNARE por
las toxinas botulínicas inhibe la liberación de acetilcolina en la
unión neuromuscular, bloqueando la neurotransmisión.
Figura 1.11. Dianas de las
toxinas botulínicas.
tipo toxina diana intracelular secuencia aminoacídica cortada (P4-P3-P2-P1–P’1-P’2-P’3-P’4)
BoNT/A SNAP-25
Glu-Ala-Asn-Gln–Arg-Ala-Thr-Lys (Blasi et al, 1993a, Schiavo, et al., 1993b)
BoNT/B VAMP
Gly-Ala-Ser-Gln–Phe-Glu-Thr-Ser (Schiavo et al., 1992)
BoNT/C sintaxina
Asp-Thr-Lys-Lys–Ala-Val-Lys-Phe (Blasi et al, 1993b, Schiavo et al, 1995)
BoNT/C SNAP-25
Ala-Asn-Gln-Arg–Ala-Thr-Lys-Met (Foran et al., 1996)
BoNT/D VAMP
Arg-Asp-Gln-Lys–Leu-Ser-Glu-Leu (Schiavo et al., 1993a)
BoNT/E
SNAP-25
Gln-Ile-Asp-Arg–Ile-Met-Glu-Lys (Blasi et al, 1993a, Schiavo et al., 1993)
BoNT/F
VAMP
Glu-Arg-Asp-Gln–Lys-Leu-Ser-Glu (Yamasaki,S. et al., 1994)
BoNT/G VAMP
Glu-Thr-Ser-Ala–Ala-Lys-Leu-Lys (Schiavo et al., 1994)
Toxinas botulínicas. Estructura.
Tabla 1.2. Dianas de las
toxinas botulínicas.
11
El Botulismo
E
n la actualidad el botulismo es una enfermedad rara pero
grave, causada por la toxina producida por la bacteria
Clostridium botulinum, la cual puede entrar al organismo a
través de heridas o puede vivir en alimentos mal enlatados o
mal
conservados,
o
por
la
inhalación
de
esporas,
especialmente en el botulismo infantil.
El Clostridium botulinum es un microorganismo anaerobio se
encuentra en los suelos y las aguas de todo el mundo. El
Clostridium produce unas esporas resistentes que sobreviven
en el medio, así como en los alimentos mal conservados o
mal enlatados. Allí producen una toxina que al ingerirla, aun
en cantidades mínimas, puede provocar intoxicaciones
severas.
El botulismo se caracteriza por una parálisis flácida del
músculo liso del sistema respiratorio como consecuencia de la
Figura 1.12.
botulinum.
Clostridium
intoxicación con BoNTs de las neuronas de la unión
neuromuscular.
Los síntomas son:
• Debilidad progresiva con parálisis
• Náuseas, vómitos
• Cólicos abdominales
• Boca seca
• Visión doble
• Dificultad respiratoria que puede terminar
en una insuficiencia respiratoria
• Respiración temporalmente ausente
• Usualmente no se presenta fiebre
• Dificultad al deglutir y al hablar.
La base del tratamiento consiste en la asistencia respiratoria
con un pulmón artificial.
Toxinas botulínicas. El botulismo.
12
Usos terapéuticos
E
l descubrimiento de la especificidad y eficacia del
bloqueo de la unión neuromuscular originado por las
toxinas botulínicas ha promovido su uso creciente como
fármacos en el tratamiento de patologías caracterizadas por
hiperactividad de la unión neuromuscular (figura 1.13).
Figura 1.13. Tratamiento con
Toxina botulínica a una
paciente con blefarospasmo.
En la izquierda, antes de la
inyección con Botox no
puede abrir los ojos debido
a las contracciones
anormales del músculo. En el
centro, utiliza sus dedos para
mantener los ojos abiertos.
En la derecha, después de
la inyección.
La toxina botulínica se introdujo en la práctica clínica a
comienzos de los 80 para el tratamiento del estrabismo y se
ha convertido en un tratamiento útil en la distonia focal, y en
otros numerosos trastornos caracterizados por una excesiva o
inapropiada contracción muscular.
La lista de indicaciones terapéuticas se ha ido ampliando con
el paso de los años, incluyendo numerosos trastornos como
blefarospasmo, distonia cervical, distonia oromandibular,
distona laringea, espasmo hemifacial, trastornos autonómicos
(hiperhidrosis),
contracción
apropiada
de
esfínteres
corporales (acalasia, espasmo anal, vaginismo) temblor y tics.
El primer uso descrito de la toxina botulínica para su uso
cosmético fue en 1992 por una oftalmóloga y su esposo
dermatólogo
(Carruthers
y
Carruthers,
1992),
cuando
describieron los efectos positivos de la toxina en el aspecto de
las arrugas profundas en 41 pacientes tratados en la región
periorbital para el blefarospasmo esencial benigno. Esto llevó
a otras investigaciones, las cuáles confirmaron la efectividad y
seguridad de la toxina botulina mejorando las arrugas
ocasionadas por el constante uso de los músculos de la cara.
Toxinas botulínicas. Usos terapéuticos.
13
En la actualidad, en España, se encuentran disponibles dos
serotipos diferentes y 3 productos diferentes de toxinas
botulínicas para su utilización en terapéutica: toxina botulínica
tipo A: Botox® y Dysport® y toxina botulínica tipo B:
NeuroBloc® y su uso está legalmente restringido al ámbito
hospitalario y al tratamiento de contadas patologías.
Los usos terapéuticos autorizados de la inyección de toxina
botulínica son:
• Estrabismo,
que
fue
la
primera
indicación
aprobada para la BoNTA. Los resultados de los
estudios realizados han sido variables, pero en
general, parece que su utilización puede reducir
la desviación ocular de un 50-80 %, y su acción
suele durar de 2 a 3 meses.
• Espasmo hemifacial: se produce una mejoría de
hasta el 90 %, siendo esta aplicación la que
posee una mayor duración de acción (4-5
meses).
• Distonías: en la tortícolis espasmódica mejora la
discapacidad en un 50-90 %, siendo la duración
de
acción
de
unas
11
semanas;
en
el
blefarospasmo se produce una mejoría del 80100 % de los pacientes tratados con una
duración de 12,5 semanas.
• Espasticidad: ha mostrado una buena eficacia
combinada con fisioterapia y la duración de
acción es de alrededor de 3 a 4 meses.
• Hiperhidrosis, se utiliza cuando es resistente al
tratamiento tópico. En estos casos la duración de
acción es de 3 a 9 meses.
Recientemente la agencia española del medicamento, ha
autorizado la comercialización Vistabel® (Toxina botulínica de
tipo A con indicación estética) “para la mejoría temporal en
la apariencia de las líneas verticales de intensidad moderada
a grave, entre las cejas al fruncir el entrecejo, en adultos de
menos de 65 años de edad, cuando la gravedad de estas
líneas tenga un impacto importante para el paciente”.
Toxinas botulínicas. Usos terapéuticos.
14
U
n efecto secundario raro y temporal, es la difusión de las
toxinas botulínicas desde el sitio de inyección, lo que
provoca el debilitamiento involuntario de los músculos
cercanos.
Problemas del uso
de las toxina
botulínicas
Uno de los principales inconvenientes del uso de la toxina
botulínica (además del coste económico) es el desarrollo de
resistencias, sobre todo cuando se utilizan dosis altas (Mahant
et al., 2000). La toxinas botulínicas se administran junto con
otras proteínas que son copurificadas con ellas, que son varias
hemaglutininas de 14 a
48 KDa
y una proteína no
hemaglutinina de 130 KDa, formando un complejo que tiene
un peso molecular de 900 KDa, estas proteínas parecen que
la protegen de la acidez y de las proteasas del estómago
(Sharma y Singh, 1998), y que tienen una función importante
en el proceso del envenenamiento a través de la comida. El
resultado es un complejo proteico grande que puede ser
detectado
por
el
sistema
inmune.
La
formación
de
anticuerpos no producen reacciones de hipersensibilidad, la
única consecuencia es que ya no es efectivo el tratamiento
con toxina botulínica. Estudios de ELISA realizados sobre la
holotoxina y sobre la hemaglutinina mayoritaria en la
holotoxina (Hn-33), han mostrado que esta proteína es la
principal responsable de la inmunogenicidad del complejo
BoNTA (Sharma y Singh, 2000).
Un inconveniente adicional del uso terapéutico y cosmético
de las toxinas botulínicas es su acción temporal, ya que,
aunque el bloqueo de la liberación de la acetilcolina en la
unión neuromuscular es irrevesible, a los 3 ó 6 meses se
recupera la función muscular con la regeneración de nuevas
uniones neuromusculares (figura 1.14.), esta acción temporal,
requiere dosis sucesivas de toxinas botulínicas, por lo que se
agravan los problemas de resistencia.
Aunque se ha intentado utilizar diferentes serotipos de toxinas
botulínicas para evitar los problemas de resistencia, el efecto
ha sido moderado porque en muchos casos la respuesta
inmunológica
se
desencadena
(Sharma y Singh, 2000).
Toxinas botulínicas. Usos terapéuticos.
por
las
hemaglutininas
Figura 1.14. Aparición de
nuevas
uniones
neuromusculares después de
la inyección de toxina
botulínica.
15
BoNTB requiere dosis mayores que de BoNTA y además
presenta una duración de acción menor.
BoNTC se ha estudiado en pacientes resistentes a la BoNTA y
parece tener un perfil temporal similar a la BoNTA y aunque se
Diferencias entre
los
diferentes
serotipos
de
toxinas botulínicas
ha descrito que en cultivos celulares a altas dosis provoca
muerte celular, en estudios realizados en músculo estriado de
voluntarios se ha encontrado un margen de seguridad similar
al de la BoNTA (Eleopra, 2002).
BoNTE posee una menor duración de acción que la BoNTA.
BoNTF ha mostrado tener eficacia en el tratamiento de
distonías en pacientes resistentes a la BoNTA, sin embargo, las
altas dosis necesarias y la corta duración de acción no la
hace apropiada para el tratamiento de elección de las
distonías (Manhant et al., 2000).
L
a identificación de pequeños péptidos que inhiben la
formación de complejo SNARE, y por tanto la exocitosis
regulada (Blanes-Mira et al., 2003; Blanes-Mira et al., 2004;
Gutierrez et al., 1997), ofrece alternativas al uso de las toxinas
botulínicas,
más
económicas
y
previsiblemente
Alternativas al uso
de las toxinas
botulínicas
menos
inmunológicas.
En la actualidad se está utilizando con fines cosméticos el
peptido argirelina Ac-EEMQRR-NH2, que ha demostrado tener
eficacia antiarrugas (Blanes-Mira et al., 2002).
C
omo consecuencia del gran auge que tiene el uso de
las toxinas botulínicas en clínica y cosmética y el gran
número de nuevas aplicaciones que van apareciendo en la
bibliografía (Cordivari et al., 2004), y los problemas de
antigenicidad
derivados,
fundamentalmente,
de
la
necesidad de repetir la inyección de las toxinas botulínicas
para mantener su acción, hace necesario mejorar su
estabilidad y actividad.
Toxinas botulínicas. Usos terapéuticos.
16
El descubrimiento de que la fosforilación en tirosinas aumenta
la actividad y estabilidad de las toxinas botulínicas (FerrerMontiel et al., 1998), proporciona una estrategia para la
modificación racional de las BoNTs con el objeto de mejorar
sus propiedades para su uso clínico y cosmético.
Toxinas botulínicas. Usos terapéuticos.
17
2
o b j e t i v o s
E
l objetivo general de este trabajo es conocer el efecto de
la fosforilación en la regulación de las toxinas botulínicas,
como estrategia para desarrollar nuevas especies de toxinas
botulínicas, más activas, más estables y más pequeñas para
su uso farmacológico y cosmético. Este estudio se centrará en
la cadena ligera (que es donde reside la actividad proteasa
dependiente de zinc). Así mismo, el estudio pretende dotar los
dominios
catalíticos
de
las
BoNTs
de
capacidad
de
translocación a través de la membrana celular.
Los objetivos específicos son:
1. Obtención de las cadenas ligeras recombinantes de
las BoNTA y BoNTE.
2. Estudio de los efectos de la fosforilación en las CLs
recombinantes.
3. Localización del sitio de fosforilación.
4. Desarrollo de una cadena ligera de toxina botulínica
más activa y estable que la toxina silvestre.
5. Desarrollo de una estrategia de internalización celular
para las cadenas ligeras obtenidas.
19
3
r e s u l t a d o s
Caracterización funcional y
estructural de las CLs-BoNTs
Expresión y
recombinantes
P
purificación
de
las
CLs-BoNTs
ara poder caracterizar funcional y estructuralmente los
dominios catalíticos de las toxinas botulínicas A y E, se
eligió
la
producción
de
estas
proteínas
de
forma
recombinante en un sistema de Escherichia coli, ya que, la
expresión recombinante permite la producción y purificación
de especies mutantes requeridas para estudios de estructurafunción.
La
construcción
CL-BoNTA-His6
conteniendo
el
dominio
catalítico del serotipo A fusionado a 6 histidinas fue cedido
por el profesor Joan Blasí. Esta construcción nos permitió la
purificación del dominio catalítico de la toxina botulínica A
(CL-BoNTA) fusionado a un epítopo de His6, mediante una
resina de Ni2+. Esta proteína de fusión se expresó en E. coli de
forma soluble aunque una fracción de la proteína se
encontró en cuerpos de inclusión (fig. 3.1.). La purificación se
realizó de la fracción soluble.
1
2
3
4
5
Figura 3.1. SDS-PAGE de la
purificación de las CL-BoNTA
recombinante. Calle 1.
Marcador de pesos
moleculares. Calle 2. Cultivo
bacteriano inducido con IPTG
1 mM. Calle 3. Fracción
soluble de la lisis bacteriana.
Calle 4. Fracción no retenida
por la resina NTA-Ni . Calle 5.
Fracción eluida con 100 mM
de imidazol.
63.8 KDa →
49.5 KDa →
2+
Como se muestra en la figura 3.1., la incubación del extracto
soluble
de
E.
coli
con
la
resina
NTA-Ni2+
secuestró
completamente a la CL-BoNTA. La elución de la proteína
inmovilizada se realizó con 100 mM de imidazol, como indica
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
21
la banda de alrededor de 58 KDa que eluyó de la resina. El
análisis por western inmunoblot utilizando anticuerpo anti-His4
confirmó la identidad de la enzima (fig. 3.2).
Figura 3.2. Western
inmunoblot de la proteína
recombinante CL-BoNTA. Se
utilizó como anticuerpo
primario un anti-His y como
secundario un anti-ratón
conjugado con HRP
(peroxidasa de rábano).
Para el revelado se siguió la
estrategia de ECL (Amersham
Phrmacia Biotech).
4
←58 KDa
En estas condiciones la proteína se obtuvo con una pureza
del 90% y un rendimiento de 7-10 mg/Lcultivo.
A diferencia de la CL-BoNTA, la proteína de fusión CL-BoNTEHis6 produjo una enzima que se almacenaba principalmente
en cuerpos de inclusión, impidiendo seriamente la obtención
de una enzima activa. Por ello, se subclonó el cDNA de la CLBoNTE-His6 en el vector de expresión pGEX, de forma que se
introducía la proteína GST en el extremo N-terminal de la
enzima separados por una secuencia de reconocimiento de
la proteasa trombina, que permitiera el aislamiento de la
proteína.
La enzima, por tanto, se purificó mediante cromatografía de
afinidad utilizando una resina agarosa-GST. Como puede
observarse (fig. 3.3.), de la cromatografía de afinidad se
obtuvo un proteína sensible a la proteasa trombina. El
tratamiento con esta enzima proteolítica rindió 2 bandas de
peso molecular de unos 55 y 23 KDa.
1
2
3
4
63.8 KDa→
49.5 KDa→
25.0 KDa→
19.0 KDa→
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
Figura 3.3. SDS-PAGE de la
purificación de las CL-BoNTE
recombinante. Calle 1.
Marcador de pesos
moleculares. Calle 2. Fracción
soluble de la lisis bacteriana.
Calle 3. Corte con trombina.
Calle 4. Fracción eluída.
22
La banda de 55 KDa correspondió a la CL-BoNTE como reveló
un inmunoblot utilizando un anticuerpo anti-his4 (fig. 3.4.).
Figura 3.4. Western
inmunoblot de la proteína
recombinante CL-BoNTE. Se
utilizó como anticuerpo
primario un anti-His y como
secundario un anti-ratón
conjugado con HRP
(peroxidasa de rábano).
Para el revelado se siguió la
estrategia de ECl (Amersham
Phrmacia Biotech).
4
←55 KDa
Con esta estrategia se obtuvo la CL-BoNTE soluble, con una
pureza del 95 % y un rendimiento de 2 mg/Lcultivo (figura 3.3).
Las CLs-BoNTs recombinantes son activas “in-vitro”
P
ara comprobar la actividad funcional de las proteínas
recombinantes
obtenidas,
se
estudió
la
actividad
enzimática de las CL-BoNTs frente a su sustrato natural, SNAP25, obtenido de forma recombinante, como proteína de
fusión a GST.
En estos ensayos se incubó 6 µM de SNAP-25, con
concentraciones crecientes de CL-BoNTA o de CL-BoNTE a
30 ºC y a continuación la actividad catalítica se analizó
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.
En este ensayo, SNAP-25 íntegro aparece como una banda
de alrededor de 25 KDa. La truncación de SNAP-25 por la CLBoNTA rinde una proteína de 23.5 KDa, mientras que la
proteolisis con CL-BoNTE produce una proteína de 21.4 KDa.
Con el fin de aumentar la separación de SNAP-25 completo y
del fragmento de 23.5 KDa, el análisis de la actividad de la
CL-BoNTA se realizó con geles nativos (fig. 3.5.A.), en cambio,
la funcionalidad de la CL-BoNTE se monitorizó en geles
desnaturalizantes (fig. 3.5.B.).
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
23
A
120
% SNAP-25 cortado
100
80
60
40
20
0
0.1
[CL-BoNTA] nM
1
5
10 20
Snap-25
→
Snap-25 truncado →
0
0
5
10
15
20
25
[CL-BoNTA] (nM)
B
120
% SNAP-25 cortado
100
80
60
40
0
20
[CL-BoNTE] nM
0.01 0.05
0.1
1
10
Snap-25
→
Snap-25 truncado →
0
0
2
4
6
8
10
12
[CL-BoNTE] (nm)
Figura 3.5. Actividad de las
CL-BoNTS recombinantes. 6
µM de SNAP-25 se incubaron
con la
CL-BoNT
correspondiente durante 1
hora a 30 ºC. A. CL-BoNTA. B.
CL-BoNTE.
En la figura 3.5., se observa, como a medida que aumenta la
concentración
de
CL-BoNTs,
desaparece
la
banda
correspondiente a SNAP-25 y va apareciendo una banda
correspondiente a SNAP-25 truncado.
La digitalización y cuantificación de los geles permitió obtener
las curvas dosis-respuesta de la fracción de SNAP-25 truncado
frente a la concentración de enzima utilizada. El ajuste de
estas relaciones a una isoterma tipo Michaelis-Menten rindió
un valor de EC50 (concentración de enzima necesaria para
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
24
procesar la mitad de la población de SNAP-25) de 1.75 nM
para la CL-BoNTA y de 0.31 nM para CL-BoNTE.
Por tanto, estos experimentos demuestran que las CL-BoNTs
obtenidas de forma recombinante son enzimas activas,
siendo la CL-BoNTE unas 6 veces más eficaz que la CL-BoNTA,
como indica la menor concentración de proteína necesaria
para cortar el 50 % de SNAP-25.
La CL-BoNTs recombinantes son sustratos de la tirosínquinasa Src
L
as holoenzimas BoNTA y BoNTE son sustratos de la tirosín
quinasa Src (Ferrer-Montiel et al., 1998). La fosforilación de
la holoenzima provoca un incremento en la actividad
catalítica y la termoestabilidad de la proteína que se
correlaciona con cambios estructurales, principalmente en un
incremento del porcentaje de hélice-α en la proteína (Encinar
et al., 1998).
Estos resultados sugieren que la fosforilación del dominio
catalítico es el responsable de los efectos funcionales
observados. No obstante dada la presencia de la cadena
pesada, no se puede descartar un papel de ésta en las
alteraciones producidas por la modificación covalente de la
holoenzima. Por ello, para dilucidar los efectos funcionales y
estructurales de las CL-BoNTA y CL-BoNTE, en primer lugar se
procedió a determinar si las proteínas recombinantes eran
sustratos de la quinasa Src (fig. 3.6.).
Como se aprecia en la figura 3.6., la incubación de la CLBoNTA
y
CL-BoNTE
con
Src
recombinante
originó
la
incorporación de fosfatos en residuos de tirosina en función
del tiempo, como revelan los inmunoblots utilizando un
anticuerpo anti-fosfotirosina. La cinética de fosforilación es
similar para ambos enzimas, obteniéndose la saturación a los
60 minutos, con un t1/2 de 12 minutos para la CL-BoNTA y de 11
minutos para CL-BoNTE .
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
25
A
120
% fosforilación
100
80
60
40
0
t (minutos)
15 30 60
20
0
0
10
20
30
40
50
60
t (minutos)
B
120
% fosforilación
100
80
60
40
0
t (minutos)
15
30
60
5
20
0
0
10
20
30
40
50
60
t (minutos)
Figura 3.6. Fosforilación de
las CL-BoNTs recombinantes.
La fosforilación se llevó a
cabo como se describe en la
sección de materiales y
métodos. La detección se
detectó mediante western
blot con un anticuerpo
monoclonal anti-fosfotirosina.
A. CL-BoNTA. B. CL-BoNTE.
Consecuentemente, los centros catalíticos recombinantes de
ambos serotipos son sustratos de la quinasa de tirosinas Src.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
26
Efectos de la fosforilación en la actividad enzimática
de las CLs-BoNTs recombinantes
E
n la holotoxina la fosforilación en tirosinas provoca un
aumento en la actividad enzimática y en la estabilidad
térmica, por lo que se evaluó si estos mismos efectos se
lograban
con
la
fosforilación
de
las
CL-BoNTA
y
E
recombinantes, con el objeto de determinar si la fosforilación
regula la actividad y estabilidad de los dominios catalíticos.
Para estos experimentos, las CL-BoNTs se fosforilaron con
quinasa Src durante 60 minutos para conseguir la máxima
modificación de la proteína (muestra fosforilada), como
control
estas
CL-BoNTs
se
incubaron
en
las
mismas
condiciones pero en ausencia de Src (muestra no fosforilada).
El primer grupo de experimentos estuvo dirigido a evaluar el
efecto de la fosforilación sobre la estabilidad térmica y
actividad de la CL-BoNTA.
Para valorar el efecto sobre la estabilidad térmica; la CLBoNTA se fosforiló durante 60 minutos a 30 ºC y posteriormente
se incubó a temperaturas creciente durante 60 minutos
adicionales en ausencia de sustrato. Al final de este periodo
se evaluó la actividad catalítica monitorizando la eficacia
truncando SNAP-25.
CL-BoNTA
30
40
50
f-CL-BoNTA
30
40
50 ºC
←Snap-25
←Snap-25 truncado
Figura 3.7. Efecto de la
fosforilación en la
estabilidad térmica de la CLBoNTA. La fosforilación se
realizó como se describe en
la sección de materiales y
métodos. Para cuantificar la
actividad de las muestras se
incubaron concentraciones
crecientes de CL-BoNTA o
f-CL-BoNTA con SNAP-25 6 µM
a 30 ºC durante 1 hora.
La figura 3.7., muestra que tanto la CL-BoNTA no fosforilada
como la fosforilada fueron
inactivas tras aplicar este
protocolo, indicando que la incubación de 3 horas a 30 ºC
inactiva a la enzima.
El efecto de la fosforilación sobre la actividad, se estudió
incubando
concentraciones
crecientes
de
muestras
fosforiladas y no fosforiladas con SNAP-25 durante 60 minutos.
La actividad enzimática se analizó mediante PAGE.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
27
120
no fosforilada
fosforilada
% SNAP-25 cortado
100
80
60
40
c-
20
c+
no fosforilada
2
10
25
2
fosforilada
10
25 nM
←Snap-25
←Snap-25 truncado
0
0
5
10
15
20
25
30
[CL-BoNTA] (nM)
Figura 3.8. Efecto de la fosforilación en la actividad de la
CL-BoNTA. La fosforilación se
realizó como se describe en
la sección de materiales y
métodos. Para cuantificar la
actividad de las muestras se
incubaron concentraciones
crecientes de CL-BoNTA o fCL-BoNTA con SNAP-25 6 µM
a 30 ºC durante 1 hora. c–
representa SNAP-25 sin CLBoNTA. c+ representa SNAP25 cortado con 10 nM de CLBoNTA.
Como ilustra la figura 3.8. la forma no fosforilada no mostró
actividad en el intervalo se 2 a 25 nM. Por el contrario, la CLBoNTA fosforilada muestra actividad catalítica destacable, a
la menor concentración ensayada, 2 nM.
Del ajuste de los datos se obtuvo para la forma fosforilada de
EC50 = 1.35 nM.
El aumento de actividad debido a la fosforilación observado
en la figura 3.8., no se puede atribuir única y exclusivamente a
un aumento de actividad catalítica de la enzima, ya que las
EC50 de la CL-BoNTA fosforilada y de la que no ha sufrido
ningún tratamiento son las mismas, por lo que se le debe
otorgar a la fosforilación un efecto termoestabilizador.
Se estudió también el efecto de la fosforilación en la CLBoNTE, en este serotipo, la fosforilación no produjo aumento
en la actividad enzimática de la proteína. Como se observa
en la figura 3.B., las formas fosforiladas y no fosforiladas
truncan a SNAP-25 a la concentración de 0.5 nM (fig. 3.9.).
CL-BoNTE
0.5
1
10
f-CL-BoNTE
0.5
1
10
nM
←Snap-25
←Snap-25 truncado
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
Figura 3.9. Efecto de la
fosforilación en la actividad
La
de la CL-BoNTE.
fosforilación se realizó como
se describe en la sección de
materiales y métodos. Para
cuantificar la actividad de las
muestras, se incubaron
concentraciones crecientes
de CL-BoNTE o f-CL-BoNTE
con SNAP-25 6 µM a 30 ºC
durante 1 hora.
28
Sin embargo, la fosforilación en la CL-BoNTE tuvo un claro
efecto en la estabilidad térmica de la misma: en la figura
3.10., se observa que la CL-BoNTE se inactiva tras la
incubación de una hora a 46 ºC, mientras que la CL-BoNTE
fosforilada es capaz de cortar el 50% de SNAP-25. Lo que
sugiere un efecto termoestabilizador provocado por la
fosforilación por Src.
CL-BoNTE
42
44
46
f-CL-BoNTE
48
42
44
46
48 ºC
←Snap-25
←Snap-25 truncado
Figura 3.10. Efecto de la
fosforilación en la
termoestabilidad de la CLBoNTE. La fosforilación se
realizó como se describe en
la sección de materiales y
métodos. Para cuantificar la
actividad de las muestras se
incubó 10 nM de CL-BoNTE o
f-CL-BoNTE.
Obsérvese además, que en la CL-BoNTE, la incubación de 2
horas a 30ºC más una hora de incubación a temperaturas
superiores a 40 ºC, mantuvo la actividad de la toxina, lo que
indica, claramente, que la CL-BoNTE, es una proteína más
estable térmicamente que la CL-BoNTA.
Cambios estructurales inducidos por la fosforilación
C
on el fin de correlacionar los cambios funcionales y/o
de
estabilidad
térmica,
con
alteraciones
en
la
estructura proteica, se determinó el contenido en elementos
de estructura secundaria mediante dicroismo circular.
En primer lugar se obtuvieron los espectros para las CL-BoNTA
y E a una concentración de 4.5 µM (fig. 3.11.).
Figura 3.11. Espectros de CD
de CL-BoNTA y CL-BoNTE
recombinantes. Los espectros
fueron tomados a una
concentración de 4.5 µM en
una cubeta de 1 mm de paso
óptico y a una temperatura
de 25 ºC.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
29
Como se muestra en la figura 3.11, ambos proteínas
mostraron un espectro similar, caracterizado un máximo a 190
nm y por 2 mínimos a 207 y 220 nm. Este tipo de espectro es
característico de proteínas que contienen una estructura
secundaria de hélice-. En este sentido, la cuantificación del
contenido de elementos de estructura secundaria, dio unos
valores de hélice- alrededor del 15 % para ambas proteínas
(tabla 3.1.). Adviértase que los porcentajes de los distintos
componentes de estructura secundaria son virtualmente
idénticos para ambos serotipos.
-hélice
CL-BoNTA 14.7
CL-BoNTE
15.1
β-antiparalela β-paralela
giro β
no ordenada
25.1
23.4
18.7
19.9
34.4
34.8
5.7
5.5
Tabla 3.1. Predicción de
estructura secundaria de las
CL-BoNTA y E recombinantes
calculada mediante CDnn.
La fosforilación de muestras concentradas de CL-BoNTA (por
encima de 4 µM) rindió muestras muy inestables con elevada
tendencia a agregar y precipitar en la disolución. Este
inconveniente impidió el análisis por dicroismo circular de la
forma fosforilada de la CL-BoNTA. En cambio, la modificación
covalente de muestras concentradas de CL-BoNTE dio lugar a
una proteína soluble apropiada para estudios estructurales
(fig 3.12.).
Figura 3.12. Espectros de CD
de CL-BoNTE y CL-BoNTE
fosforilada. Los espectros
fueron tomados a una concentración de 4.5 µM en una
cubeta de 1 mm de paso
óptico y a una temperatura
de 25 º C.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
30
El espectro de dicroismo circular de la forma fosforilada
presentó
las
mismas
características
que
la
forma
no
fosforilada, es decir, un máximo a 190 nm y 2 mínimos a 207 y
222 nm. La intensidad de los mínimos fue mayor en la forma
fosforilada que en la toxina no modificada.
Este incremento de intensidad del mínimo se correspondió
con un incremento de alrededor del 45 % en el contenido de
–hélice, a costa de la disminución de láminas β-antiparalelas
(tabla 3.2.).
α-hélice
β-antiparalela β-paralela
giro β
no ordenada
15.1
23.4
5.5
19.9
34.8
f-CL-BoNTE 21.9
19.1
5.7
18.1
34.2
CL-BoNTE
La fosforilación aumenta la
desnaturalización de la CL-BoNTE
E
temperatura
Tabla 3.2. Predicción de
estructura secundaria de las
CL-BoNTE y f-CL-BoNTE
recombinantes calculada
mediante CDnn.
de
l análisis de los espectros de CD, además de aportar
información sobre la estructura secundaria de la proteína,
proporciona información acerca de la estabilidad térmica del
la proteína, cuando se realizan a temperaturas crecientes a
una longitud de onda determinada, que suele ser 222 nm, por
ello se realizaron estas medidas, para evaluar la magnitud de
la estabilidad térmica producida por la fosforilación.
Se tomaron los espectros de las formas fosforilada y no
fosforilada en el intervalo de temperaturas de 20 hasta 80 º C.
Finalmente, los valores de elipticidad se normalizaron para
obtener el porcentaje de desplegamiento según la ecuación:
% desplegamiento
− θ deg
⎛θ
= ⎜⎜ máx
⎝ θ max − θ min
⎞
⎟⎟ x 100
⎠
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
31
Figura 3.13. Curvas de
desnaturalización térmica
mediante CD de CL-BoNTE y
CL-BoNTE fosforilada.
Del ajuste de los datos obtenidos a una ecuación de dos
estados, se obtuvo el valor de la temperatura media de
desnaturalización (Tm) de las proteínas. Este parámetro
aporta información de la estabilidad térmica de las proteínas.
Los valores de Tm resultantes fueron:
Tm CL-BoNTE = 47.1 ºC
Tm f-CL-BoNTE = 51.0 ºC
Por tanto, la fosforilación produjo un incremento de 4 ºC en el
valor de Tm calculada por dicroismo circular, coincidentes
con los resultados obtenidos mediante el análisis de la
actividad de la CL-BoNTE y la f-CL-BoNTE preincubadas a las
diferentes temperaturas.
Localización del sitio de fosforilación de las CL-BoNTs
L
a localización del sitio de fosforilación de las CL-BoNT A y E
se abordó basándose, por un lado en la observación de
que la fosforilación es una modificación general de todos los
serotipos de CL-BoNTs, así como de la enzima relacionada
toxina tetánica, sugiriendo que el residuo de tirosina aceptor
del grupo fosfato está altamente conservado. Para facilitar su
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
32
localización se usaron herramientas bioinformáticas que
permiten la localización de motivos de fosforilación consenso.
Una vez alineadas las secuencias de los 7 serotipos de toxinas
botulínicas, se encontraron 8 tirosinas conservadas en las 7
secuencias; de estas tirosinas, 2 estaban localizadas en
motivos de fosforilación. Éstas eran en la BoNTE la Y67 y la
Y306, y en la BoNTA la Y71 y la Y319 (figura 3.14).
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
A
B
C
D
E
F
G
···1
···
···
···
···
···
···
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIA 20
MPVTINNFNYNDPIDNNNII
MPITINNFNYSDPVDNKNIL
MTWPVKDFNYSDPVNDNDIL
MP-KINSFNYNDPVNDRTIL
MPVAINSFNYNDPVNDDTIL
MPVNIKXFNYNDPINNDDII
.
: ***.**::. *
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
BoNT
A
B
C
D
E
F
G
··· 319 QYMKNVFKEKYLLSEDTSGKF 330
···
NIYKNKFKDKYKFVEDSEGKY
···
GEYKQKLIRKYRFVVESSGEV
···
DKYKKIFSEKYNFDKDNTGNF
···
NPYKDVFEAKYGLDKDASGIY
···
NEYKDYFQWKYGLDKNADGSY
···
SLYKQIYKNKYDFVEDPNGKY
*.
** :
:
61 PPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNY 86
SGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIF
RVTSPKSG--YYDPNYLSTDSDKDTF
RPTSKYQS--YYDPSYLSTDEQKDTF
TSLKNGDS-SYYDPNYLQSDEEKDRF
ASLKNGSS-AYYDPNYLTTDAEKDRY
TGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKF
***. ** :: .*: :
*
221 HELIHAGHRLYGIAINPNR-V 241
HELIHVLHGLYGIK-VDDLPI
HELNHAMHNLYGIAIPNDQTI
HELTHSLHQLYGINIPSDKRI
HELIHSLHGLYGAKGITTKYT
HELIHALHGLYGARGVTYEET
HELIHVLHGLYGIK-ISNLPI
*** * * ***
356 KFFKVLNRKTYLNFDKAVFKIN-IVPKVNYTIYDGFNLRN 394
ENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISD
KIYNVQNRKIYLSNVYTPVTAN-ILDDNVYDIQNGFNIPK
SQYNVKNRTHYFSRHYLPVFAN-ILDDNIYTIRDGFNLTN
TKFQVKCRQTYIGQYKY-FKLSNLLNDSIYNISEGYNIN
NKFKVKCRNTYFIKYEF-LKVPNLLDDDIYTVSEGFNIG
GEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIAS
: :
*
*:
.
:: .
*
:*:*:
Figura 3.14. Localización de
las tirosinas conservadas en
las cadenas ligeras de los 7
serotipos de BoNTs.
Para examinar, cual de estas tirosinas era la aceptora del
grupo fosfato, estos residuos se mutaron a fenilalanina
mediante mutagénesis dirigida. Las proteínas resultantes se
expresaron, se purificaron y se sometieron a fosforilación con
la quinasa Src en las mismas condiciones descritas para la CLBoNTE silvestre. La presencia o ausencia de fosforilación en
tirosinas se detectó mediante western inmunoblot con un
anticuerpo anti-fosfotirosina (fig. 3.15).
wt
Y67F
Y306F
Src
CL-BoNTE
Figura 3.15. Localización del
sitio de fosforilación de CLBoNTE. Las muestras fueron
fosforiladas según el
protocolo descrito en la
sección de materiales y
métodos.
El inmunoblot reveló que la mutación Y67 rindió una CL-BoNTE
que no se modificaba covalentemente por la quinasa Src. Por
el contrario, la mutación Y306F no alteró la incorporación de
fosfato en la toxina.
Para la localización de la tirosina responsable de la
fosforilación de la CL-BoNTA recombinante por la quinasa Src,
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
33
se mutó a fenilalanina la tirosina Y71 que es la equivalente a
la Y67 en la CL-BoNTE. Este nuevo mutante se expresó, se
purificó
y
se
fosforiló
“in
vitro”
con
la
quinasa
Src.
Posteriormente las muestras se analizaron mediante western
inmunoblot con anticuerpos antifosfotirosina que detectaron
aquellas proteínas fosforiladas (fig 3.16).
wt
Figura 3.16. Localización del
sitio de fosforilación de CLBoNTA. Las muestras fueron
fosforiladas según el
protocolo descritop en la
sección de materiales y
métodos.
Y71F
Al igual que con la CL-BoNTE, el inmunoblot desveló que la
Y71 de la CL-BoNTA es el centro aceptor del fosfato de Src,
porque el mutante CL-BoNTAY1F, no es fosforilable por Src.
El hallazgo de que los sitios de fosforilación en la CL-BoNTA y
CL-BoNTE están conservadas, apoya la hipótesis de que la
fosforilación en tirosinas por quinasas de la familia Src es una
estrategia común de todas las toxinas botulínicas.
Mutación de los sitios de fosforilación
L
a fosforilación en tirosinas es un proceso reversible debido
a la existencia de fosfatasas. Por ello, con el fin de evaluar
si los efectos funcionales y estructurales de la fosfoforilación
pueden ser reproducidos de forma más estable mediante la
incorporación
fosforilado,
se
de
aminoácidos
diseñó
una
que
forma
emulen
el
estado
constitutivamente
no
fosforilada, que incorpora una fenilalanina en el sitio de
fosforilación y una forma constitutivamente fosforilada, que
introducía un glutámico en el sitio aceptor del fosfato. De esta
forma, los mutantes que se generaron fueron: CL-BoNTA Y71F,
CL-BoNTAY71E, CL-BoNTEY67F y CL-BoNTEY67E.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
34
1. Mutantes constitutivamente no fosforilados
E
stos mutantes se obtuvieron mediante mutagénesis
dirigida y se expresaron y purificaron, tal y como se
describe en la sección de materiales y métodos para las
correspondientes proteínas silvestres.
La expresión recombinante de los mutantes CL-BoNTAY71F y
CL-BoNTE Y67F, dio lugar a proteínas con una pureza superior
al 90 %, y con el mismo rendimiento que sus respectivas
proteínas silvestres (fig 3.17).
A
1 2
3
4
5
63.8 KDa
49.5 KDa
B
1 2
3
4
63.8 KDa
49.5 KDa
Figura 3.17. SDS-PAGE de la
purificación de los mutantes
constitutivamente no
fosforilados. A. CL-BoNTAY71F.
Calle 1. Marcador de pesos
moleculares. Calle 2. Cultivo
bacteriano inducido con IPTG
1 mM. Calle 3. Fracción
soluble de la lisis bacteriana.
Calle 4. Fracción no retenida
por la resina NTA-Ni . Calle 5.
Fracción eluida con 100 mM
de imidazol. B. CLBoNTEY67F. Calle 1. Marcador
de pesos moleculares. Calle
2. Fracción soluble de la lisis
bacteriana. Calle 3. Corte con
trombina. Calle 4. Fracción
eluída.
2+
La caracterización de la actividad enzimática de estas
proteínas mutantes (fig. 3.18.), reveló valores de EC50 para la
CL-BoNTAY71F de 1.85 nM y para la CL-BoNTEY67F de 0.3 nM,
que son virtualmente idénticos a los mostrados por las
especies no fosforiladas (fig 3.5.).
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
35
A
120
% SNAP-25 cortado
100
80
60
40
0
20
[CL-BoNTA] (nM)
0.1
1
5
10
20
←Snap-25
←Snap-25 truncado
0
0
5
10
15
20
25
[CL-BoNTA(Y71F)] (nM)
B
% SNAP-25 cortado
120
100
80
60
40
[CL-BoNTE] (nM)
0
20
0.01 0.1
0.5
1
10
20
←Snap-25
←Snap-25 truncado
0
0
5
10
15
20
[CL-BoNTE(Y67F)] (nM)
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
25
Figura 3.18. Actividad de los
mutantes constitutivamente
no fosforilados. A. CLBoNTAY71F. B. CL-BoNTEY67F.
36
2. Mutantes constitutivamente fosforilados
Para emular a las BoNTS fosforiladas, se diseñaron los mutantes
CL-BoNTAY71E y CL-BoNTEY67E.
Sorprendentemente la mutación del sitio de fosforilación de
ambos serotipos dio lugar a proteínas mutantes CL-BoNTAY71E
y CL-BoNTEY67E que se acumularon en cuerpos de inclusión,
cuando se expresaron en E. coli (figura 3.19.), este resultado
sugiere que la introducción de un residuo alifático cargado
negativamente
produce
proteínas
inestables
y/o
aberrantemente plegadas que resultan tóxicas para la célula
y, por ello, las almacena desnaturalizadas en los cuerpos de
inclusión. Su renaturalización funcional no tuvo éxito.
1
2
3
Figura 3.19. SDS-PAGE de la
expresión del mutante
constitutivamente
fosforilados. CL-BoNTAY71E.
Calle 1. Marcador de pesos
moleculares. Calle 2.
Fracción soluble de la lisis
bacteriana. Calle 3. Fracción
no soluble de la lisis
bacteriana.
63.8 KDa →
49.5 KDa →
Con
el
fin
de
inconveniente,
superar,
con
la
al
menos
ayuda
de
parcialmente,
las
este
herramientas
bioinformáticas: PERLA y FOLD-X, que nos permitieron sustituir
la posición CL-BoNTAY71 por todos los aminoácidos, minimizar
su energía y evaluar los mutantes resultantes, se eligió la
mutación CL-BoNTAY71W. La razón de diseñar este mutante
fue, que la deslocalización de electrones característica de los
grupos aromáticos del residuo triptófano, podría asemejarse a
una forma “fosforilada”.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
37
La expresión del mutante en E. coli CL-BoNTAY71W resultó una
proteína que se encontraba en la fracción soluble, que se
purificó fácilmente mediante cromatografía de afinidad
utilizando una resina Ni2+-NTA. El grado de pureza alcanzado
fue superior al 95 % con un rendimiento de la purificación de
6-8 mg/Lcultivo como se muestra en la figura 3.20.
1 2
3
4
5
Figura 3.20. SDS-PAGE de la
purificación del mutante CLBoNTAY71W. Calle 1.
Marcador de pesos
moleculares. Calle 2. Cultivo
bacteriano inducido con IPTG
1 mM. Calle 3. Fracción
soluble de la lisis bacteriana.
Calle 4. Fracción no retenida
por la resina NTA-Ni . Calle 5.
Fracción eluida con 100 mM
de imidazol.
63.8 KDa
49.5 KDa
2+
El estudio de la actividad enzimática del mutante del
mutante CL-BoNTAY71W reveló una eficacia de 1.65 nM (fig
3.21.) muy similar al dominio catalítico silvestre (fig 3.5.),
indicando que el cambio de tirosina por triptófano no altera
la funcionalidad de la proteína.
120
% SNAP-25 cortado
100
80
60
40
0
[CL-BoNTAY71W] (nM)
0.1
1
5
10
20
20
←Snap-25
←Snap-25 truncado
0
0
5
10
15
20
25
[CL-BoNTAY71W] (nM)
Figura 3.21. Actividad del
mutante CL-BoNTAY71W.
Del mismo modo, el análisis de la estructura secundaria
mediante
CD
(fig.
3.22.),
mostró
unas
características
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
38
espectrales de la proteína mutante muy parecidas a la
proteína silvestre, esto es, un máximo a 190 nM, y 2 mínimos a
207 y 220 nM, las ligeras diferencias del mutante Y71W, se
pueden atribuir a la absorción del triptófano en la región del
ultravioleta.
Figura 3.22. Espectros de CD
de CL-BoNTA silvestre y los
mutantes CL-BoNTAY71F y CLBoNTAY71W.
La estimación del porcentaje de elementos de estructura
secundaria fue 15.1 % de α-hélice y 24.6 % de hoja β, valores
muy próximos a la proteína silvestre (tabla 3. 3.).
α-hélice
β-antiparalela β-paralela
giro β
no ordenada
silvestre
14.7
25.1
5.7
18.7
34.4
Y71F
15.1
24.6
5.7
18.8
34.3
Y71W
14.5
23.5
5.6
19.7
34.7
Tabla 3.3. Predicción de
estructura secundaria de las
CL-BoNTA silvestre y los
mutantes CL-BoNTAY71F y CLBoNTAY71W calcu lada
mediante CDnn.
Por último, también se caracterizó la estabilidad térmica de la
proteína mutante, mediante la variación de los espectros de
CD
a
temperaturas
crecientes.
En
la
figura
3.23.
se
representan las curvas de desnaturalización inducida por la
temperatura para la proteína silvestre y los mutantes Y71F e
Y71W.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
39
Figura 3.23. Curvas de
desnaturalización térmica
mediante CD de CL-BoNTA,
CL-BoNTAY71F y CLBoNTAY71W.
Nótese
que
el
mutante
CL-BoNTAY71W,
mostró
una
desnaturalización a temperaturas más bajas que la proteína
silvestre y el mutante CL-BoNTAY71F.
Los valores de Tm resultantes de ajustar las curvas de
desnaturalización a una ecuación de 2 estados fueron:
Tm (CL-BoNTAWT) = 47.3 ºC
Tm(CL-BoNTAY71F) = 47.6 ºC
Tm(CL-BoNTAY71W) = 43.6 ºC
Por tanto, la introducción del aminoácido W, en el sitio de
fosforilación de Src en la CL-BoNTA, produce una enzima con
la misma actividad que la proteína silvestre, pero con una
termoestabilidad
disminuida.
Consecuentemente,
la
introducción de un triptófano, no produce proteínas con
propiedades similares a la enzima fosforilada.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
40
Modelos proteicos
L
a publicación reciente (Segelke et al., 2004 ) por el grupo
del Dr. Rupp de la estructura tridimensional del dominio
catalítico de la toxina botulínica A, obtenida mediante el
análisis de sus cristales por rayos X, permite la recreación de
las mutaciones y modificaciones post-traduccionales, tales
como la fosforilación, mediante el uso de herramientas
bioinformáticas tales como Fold-X (Guerois et al., 2002), SwissPDBviewer (Guex y Peitsch, 1997) y Pymol (DeLano, 2002).De
esta manera se pueden realizar modelos tridimensionales de
los diferentes mutantes y comprobar si las modificaciones
introducidas alteran la estabilidad energética de la estructura
con respecto a la CL-BoNTA silvestre.
En la figura 3.24. se muestra la estructura cristalográfica de la
CL-BoNTA, donde se ha descrito con detalle la localización
del centro activo formado por H222, H226 y E261, en
coordinación con el átomo de Zn2+. Sin embargo no se ha
descrito la relevancia/importancia de los sitios de fosforilación
en términos estructurales, ni su supuesta relación con la
modulación de la actividad.
A
B
R374
D73
C
R374
D73
F191
F191
I159
Y71
I160
L415
I159
f-Y71
I160
L415
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
Figura 3.24. A. Estructura
cristalográfica de la CLBoNTA recombinante. B.
Detalle de la zona de
fosforilación por Src. C.
Aparición de nuevos puentes
de hidrógeno con la
fosforilación por Src.
41
La ampliación de la zona fosforilable por la quinasa Src (Y71)
(fig. 3.24.B) muestra que la Y71 se encuentra localizada en
una región no ordenada, donde el anillo aromático de la Y71
se encuentra ocupando un pequeño hueco hidrofóbico
formado por I169, I160, F191 y L415, mientras que el grupo
hidroxilo se encuentra expuesto al solvente.
En la figura 3.24.C. se muestra que la fosforilación del residuo
Y71 favorece la estabilización de la estructura gracias a la
aparición de tres nuevos puentes de hidrógeno (líneas
punteadas en la figura) entre el grupo fosfato y las cadenas
laterales de los residuos R374 y entre el grupo carbonilo de la
L415. Es incluso posible que se forme un puente de agua entre
el grupo fosfato y el D73, aunque esta última interacción no
ha sido comprobada. Así pues, la inserción del grupo fosfato,
provoca una aumento en la compactación de la proteína
que se traduce en un aumento de la termoestabilidad.
En la figura 3.25. se muestra la estructura hipotética de los
mutantes de la CL-BoNTA que hemos estudiado.
A
R374
D73
B
R374
D73
F191
F191
F71
I159
I159
L415
L415
E71
I160
I160
C
R374
D73
F191
W71
I159
L415
I160
Figura 3.25. Modelos de los
mutantes obtenidos de la CLBoNTA. A. Y71F. B. Y71E. C.
Y71W.
La mutación Y71F imposibilita la fosforilación y la consiguiente
aparición de los puentes de hidrógeno que estabilizan la
estructura, pero conserva la hidrofobicidad del entorno por lo
que la estructura no se ve desestabilizada, por lo que se
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
42
comporta como la CL-BoNTA silvestre. Sin embargo, la
mutación Y71E, que intenta insertar una carga negativa
imitando la del grupo fosfato, desestabiliza la estructura, ya
que la disposición de la cadena lateral acídica del E,
introduce una carga negativa en un entorno altamente
hidrofóbico, por lo que la estructura se ve energéticamente
desfavorecida.
La mutación Y71W tampoco permite la formación de los
puentes de hidrógeno ni rellena adecuadamente el bolsillo
hidrofóbico. Debido al gran volumen del triptófano, el anillo
aromático hexagonal se ve forzado a orientarse hacia fuera,
con lo que el pequeño hueco hidrofóbico se ve parcialmente
relleno por el anillo pentagonal. Probablemente por este
motivo este mutante no contribuye a la estabilización
adicional, pero tampoco a una desestabilización importante
de la molécula.
La superposición de la estructura de la CL-BoNTA con la
también recientemente publicada de la CL-BoNTE (Agarwal
et al, 2004a), muestra una gran semejanza estructural (Fig.
3.26.), a excepción de algunos lazos.
Figura 3.26. Superposición
de las estructuras de CLBoNTA y CL-BoNTE. Se
muestra en verde CL-BoNTA y
en rojo CL-BoNTB.
La ampliación de los residuos fosforilables por la quinasa Src
(Fig. 3.27.), muestra, la misma posición dentro de la estructura
de las dos proteínas, estando orientados los grupos hidroxilo
hacia el exterior de forma accesible a la quinasa Src.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
43
Figura 3.27. Ampliación de la
zona fosforilable por Src de
la superposición de CLBoNTA y CL-BoNTE. Se
muestra en verde CL-BoNTA y
en rojo CL-BoNTB.
En la figura 3.28, se muestra, la ampliación de la zona de los
centros
activos
en
coordinación
con
el
Zn2+ de
la
superposición de Cl-BoNTA y CL-BoNTE, y se observa que la
posición
de éstos en las dos proteínas es prácticamente
idéntica.
Figura 3.28. Ampliación del
centro activo de la
superposición de CL-BoNTA y
CL-BoNTE.
La gran homología estructural que también existe con la
toxina CL-BoNTB, que ha sido cristalizada con su sustrato,
VAMP, permite realizar un modelo de CL-BoNTE unido a SNAP25, ya que de momento, no se ha obtenido la estructura de
CL-BoNTE unida a su ligando mediante rayos X (fig. 3.29.).
Figura 3.29. Modelo de CLBoNTE unido a su sustrato
SNAP-25. Se muestra ClBoNTE como mapa de
superficie y SNAP-25 en
amarillo.
Caracterización funcional y estructural de las CLs-BoNTs recombinantes
44
Este modelo, puede permitir, en un futuro, el estudio de la
especificidad de la unión de las toxinas botulínicas a sus
sustratos, y el diseño de toxinas dirigidas contra un ligando
específico de nuestro interés, y que se unan con alta afinidad
y especificidad.
45
Desarrollo de un estrategia de
internalización celular para las
CL-BoNTs recombinantes
Dominios de transdución de proteínas
C
on el fin de poder estudiar el papel de la fosforilación en
tirosinas de la CL-BoNTA en células, es necesario dotar a
la proteína de la capacidad de traslocar al interior celular. En
la holotoxina, esta propiedad la confiere la cadena pesada
que dispone de un mecanismo de translocación celular
(Koriazova y Montal, 2003).
En general, la membrana plasmática de las células eucariotas
es impermeable a la mayoría de péptidos y de proteínas; sin
embargo, este dogma se ha demostrado ser falso con la
identificación
de
varios
dominios
del
transducción
de
proteínas (DTPs) que son capaces de introducir proteínas a
través de la membrana plasmática, permitiendo que éstas se
acumulen dentro de la célula.
En 1988, Green y Frankel (Green y Loewenstein, 1988.; Frankel
y Pabo, 1988) descubrieron de forma independiente que la
proteína del VIH, Tat, puede atravesar las membranas
plasmáticas celulares. Posteriormente, se demostró que la
unión química de un dominio del Tat de tan sólo 11
aminoácidos, con un elevado contenido en aminoácidos
básicos, a proteínas heterólogas (Fawell et al., 1994) o, la
producción de las proteínas recombinantes que contienen el
dominio del transducción de la proteína de TAT (Schwarze et
al., 1999), proporcionaba a éstas la capacidad de atravesar
la membrana plasmática. Además de la secuencia Tat, se
han identificado otros dominios del transducción procedentes
de la proteína de antennapedia de Drosophila (penetratina)
y del virus del herpes (VP22). También se ha observado que
secuencias ricas en poli-argininas, y poli-argininas con
triptófanos, tienen la capacidad de traslocación celular (las
secuencias de estos péptidos se encuentran detalladas en la
tabla 3.4.).
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
46
DTP
Secuencia aminoacídica
TAT
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
VP22
Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-ThrGlu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Pro-Arg-ArgPro-Val-Glu
Penetratina
Arg-Gln-Iso-Lys-Iso-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys
R7
Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg
R2W2
Arg-Arg-Trp-Trp
Tabla 3.4. Secuencias de los
DTPs más utilizados.
Con el fin de establecer las exigencias estructurales óptimas
para
este
proceso
de
transdución,
el
Dr.
Wender
y
colaboradores (Wender et al., 2000) desarrollaron una serie de
los
análogos
de
Tat
y
determinaron
su
capacidad
traslocadora mediante citometría de flujo. Todos los análogos
truncados y las sustituciones por alanina disminuyeron la
respuesta celular, sugiriendo que los residuos catiónicos de Tat
juegan un papel principal en su respuesta. La carga sola, sin
embargo, es insuficiente para el transporte puesto que los
oligómeros de varios aminoácidos catiónicos (histidina, lisina, y
ornitina) son menos eficaces que Tat. Al contrario un péptido
de 9 residuos de L-arginina tiene 20 veces más capacidad de
internalizar proteínas que el Tat y el isómero D tiene incluso
más capacidad (100 veces). Conjuntamente estos resultados
indicaron que los grupos guanidinio juegan un mayor papel
en la facilitación de la transporte celular que el esqueleto
central o que la carga.
Aunque el mecanismo de transducción a través de la
membrana plasmática mediado por DTPs a través de la
membrana
celular,
es
actualmente
desconocido
(y
controvertido), el proceso se ha dividido en 3 pasos (Wadia y
Dowdy, 2002):
•
El primer paso (1) aparece implicar una
atracción electrostática del DTP básico
con dominios cargados negativamente de
la membrana plasmática.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
47
•
El segundo paso, la internalización (2) sigue
siendo desconocido, aunque parece ser
independiente
de
transportadores,
de
receptores y de endocitosis.
•
Una vez dentro de la célula (3), una serie
de acontecimientos complejos pueden
llevarse a cabo en la carga
modificaciones
(como
post-traduccionales,
transporte intracelular, unión a la diana).
Figura 3.30. Representación
esquemática del proceso de
internalización celular a
través de los DTPs.
El péptido Tat es la secuencia que más se ha utilizado y
estudiado
como
estrategia
para
internalizar
diferentes
estructuras moleculares en células eucariotas. Se ha usado
unida a péptidos, proteínas (Caron et al., 2001; Fawell et al.,
1994; Fujiwara et al., 2001; Yoon et al., 2002), oligonucleótidos
antisentido (Astriab-Fisher et al., 2002), liposomas (Levchenko
et al., 2003), nanopartículas (Lewin et al., 2000) y fagos (Eguchi
et al., 2001). Además se ha demostrado su capacidad de
internalización “in vivo” (Schwarze et al., 1999). Por ello se
decidió fusionar la secuencia Tat al extremo N-terminal de la
CL-BoNTA.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
48
Caracterización de la proteína TAT-BoNTA
1. Diseño y clonaje
En el laboratorio disponíamos del vector pTAT-HA, que fue un
regalo del Dr. Dowdy, cuyo esquema se representa en la
figura 3.31.
Figura 3.31. Esquema del
vector pTAT-HA.
Este plásmido codifica 6 residuos de histidina, a continuación
una secuencia de 11 aminoácidos de la proteína TAT del VIH,
un epítopo de hemaglutinina y a continuación el sitio múltiple
de clonaje, para introducir la proteína a transportar.
En la figura 3.32. se muestra de forma esquematizada la
estrategia de clonación.
Figura 3.32. Esquema de la
estrategia del clonaje de la
CL-BoNTA en pTAT-HA.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
49
2. Expresión y purificación de TAT-CL-BoNTA
Las condiciones de purificación descritas para la purificación
de la CL-BoNTA (fig 3.1.), no resultaron óptimas para la TATBoNTA, por lo que hubo que modificar ligeramente las
condiciones de extracción y purificación. Básicamente, lo
que se hizo fue añadir glicerol y aumentar la cantidad de
imidazol de los tampones usados a lo largo del proceso, ya
que esta proteína era más retenida por la resina de Ni2+-NTA
que la CL-BoNTA-His6.
En la figura 3.33., se muestra un SDS-PAGE del proceso de
extracción y purificación de la TAT-BoNTA según el protocolo
descrito en la sección de materiales y métodos. El grado de
pureza obtenido fue mayor del 95 %, con un rendimiento de 2
mg/Lcultivo.
1 2 3 4 5
63.8 KDa →
49.5 KDa →
Figura 3.33. SDS-PAGE de la
purificación de la proteína
TAT--BoNTA. Calle 1. Marcador
de pesos moleculares. Calle
2. Fracción soluble de la lisis
bacteriana. Calle 3. Fracción
no retenida por la resina
NTA-Ni . Calle 4. Lavado con
100 mM de imidazol. Calle 5.
Fracción eluida con 500 mM
de imidazol.
2+
Mediante un inmuno-blot con un anticuerpo anti-his4, se
comprobó la identidad de la proteína purificada (fig. 3.34.).
63.8 KDa →
Figura 3.34. Western
inmunoblot de la proteína
TAT-BoNTA.
En primer lugar, se comprobó que la proteína TAT-BoNTA,
mantenía la actividad enzimática de la CL-BoNTA. Para ello se
comparó su actividad proteolítica frente a SNAP-25 con la
presentada por la proteína CL-BoNTA.
La figura 3.35 muestra que la incubación de SNAP-25 con 50
nM de TAT-BoNTA, resultó en el corte del 100 % del sustrato al
igual que la CL-BoNTA. Por tanto la fusión del péptido Tat en el
N-terminal de la CL-BoNTA no afecta la actividad catalítica.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
50
1
2
3
Figura 3.35. Actividad
enzimática de la proteína
TAT--BoNTA. Calle 1. SNAP-25
intacto. Calle 2. Tat-BoNTA.
Calle 3. CL-BoNTA
Snap-25
→
Snap-25 truncado→
3. Internalización de TAT-BoNTA en células
3.1 En el hibrídoma F11
Para ver si la secuencia TAT dotaba a la CL-BoNTA de la
capacidad de entrar en células eucariotas, se ha utilizado
como primera aproximación el modelo de cultivo neuronal,
las células F11, que es un hibridoma de neuroblastoma y
neuronas de ganglio raquídeo (Francel et al., 1987; Platika et
al., 1985).
Una
de
las
formas
más
determinantes
de
seguir
la
traslocación de la CL-BoNTA en las células, es evaluando su
actividad enzimática frente a su sustrato natural SNAP-25, a
través de un inmunoblot, con un anticuerpo anti-SNAP-25. En
primer lugar, se comprobó que se detectaba SNAP-25 en los
extractos de los cultivos de F11. Además, se confirmó que se
podía resolver en los geles de acrilamida y observar en un
inmunoblot las bandas de SNAP-25 (25 KDa) y SNAP-25
truncado (23.5 KDa). Para ello se sembraron 2 frascos de 25
cm2 de F11, y cuando las células estaban subconfluentes
(alrededor de 1x106 células/mL), se hizo un extracto de cada
uno de los frascos cultivados. A continuación, uno de ellos, se
incubó con 300 nM de CL-BoNTA, este extracto se utilizó como
control de SNAP-25 truncado, y el otro extracto como control
de SNAP-25 íntegro.
Snap-25
→
Snap-25 truncado→
Figura 3.36. Western
inmunoblot de la
sepración electroforética
de SNAP-25 intacto y
truncado por CL-BoNTA en
extractos del hibridoma
F11.
La separación electroforética de las dos formas SNAP-25 se
consiguió con geles SDS-PAGE del 14 %. Como puede
observarse en la figura 3. 36., en el inmunoblot se detectan 2
bandas correspondientes al SNAP-25 íntegro y la forma
truncada.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
51
A continuación, se
realizaron
experimentos en
células
intactas, donde se comparó si la incubación con TAT-BoNTA y
CL-BoNTA producía el procesamiento proteolítico del SNAP-25
celular. La figura 3.37., ilustra que la incubación de células F11
con 100 nM de TAT-BoNTA resultó en la truncación de SNAP25, en cambio, la adición de la CL-BoNTA al cultivo celular no
produjo la proteólisis del sustrato intracelular. Estos resultados
indican que la TAT-BoNTA traslocó al citosol celular, además la
enzima citosólica fue activa.
C-
C+
TAT
100
BoNTA
100 nM
SNAP-25
SNAP-25 truncado
Figura 3.37. Entrada de TATBoNTA en cultivo de F11.
Células F11 subconfluentes se
incubaron a 37ºC durante 4
horas con una concentración
de 100 nM de TAT-BoNTA o
CL-BoNTA. A continuación las
muestras se procesaron
según el protocolo descrito
en la sección de materiales y
métodos.
Un incremento de la concentración de TAT-BoNTA, resultó en
un aumento de la traslocación de la enzima al citosol, como
se muestra en la figura 3.38., donde se aprecia un aumento
de la cantidad SNAP-25 truncado al incrementar la cantidad
de TAT-BoNTA en el medio extracelular.
C-
C+
TAT
100
TAT
200
nM
SNAP-25
SNAP-25 truncado
Figura 3.38. Entrada de TATBoNTA en cultivo de F11.
Células F11 subconfluentes se
incubaron a 37ºC durante 2
horas con una concentración
de 100 y 200 nM de TATBoNTA. A continuación las
muestras se procesaron
según el protocolo descrito
en la sección de materiales y
métodos.
3.2. En células PC12
Para confirmar la traslocación de la toxina, se utilizó como
segundo modelo un cultivo de células PC12. Este cultivo fue
generado por Greene y Tischler en 1976 (Greene y Tischler,
1976) a partir de un feocromocitoma de rata y es una línea
que responde al factor de crecimiento neuronal (NGF),
diferenciándose en neuronas.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
52
Al igual que en el caso del cultivo de F11, se comprobó que
se podía detectar SNAP-25 en los extractos de los cultivos de
PC12 (fig 3.39.).
Figura 3.39. Detección de
SNAP-25 en un extracto de
PC12.
←25 KDa
A continuación se evaluó la capacidad traslocadora de la
proteína
TAT-BoNTA.
subconfluentes
(1x106
Para
ello,
cultivos
de
PC12
células/mL) se incubaron con CL-BoNTA
o TAT-BoNTA. Las incubaciones con CL-BoNTA y TAT-BoNTA se
hicieron en medio con y sin suero, con el fin de evaluar, si el
suero podía influir en la eficacia de traslocación de las
proteínas.
SNAP-25
TAT-BoNTA
+ SBF
CL-BoNTA
TAT-BoNTA
CL-BoNTA
c+
c-
- SBF
→
SNAP-25 truncado →
Figura 3.40. Entrada de TATBoNTA en cultivo de PC12. Se
incubaron las células con 300
nM de Cl-BoNTA o TAT-BoNTA
durante 3 horas a 37 ºC en
presencia (+) o ausencia de
suero (-), posteriormente se
hicieron los extractos
celulares para el western
blot. Se utilizó como
anticuerpo primario antiSNAP-25 y como secundario
un anti-ratón conjugado a
HRP.
Como puede apreciarse en la figura 3.40. únicamente la
proteína TAT-BoNTA, truncó el SNAP-25 citosólico, indicando la
entrada de la proteína en el citoplasma celular. El suero del
medio tuvo efecto en la actividad traslocadora indicando
que la TAT-BoNTA interacciona significativamente con los
componentes del suero. Por tanto los próximos experimentos
se realizaron en ausencia de suero en el medio extracelular.
En esta línea celular, se obtuvo una dosis-respuesta para TATBoNTA. La figura 3.41. muestra la actividad, en el intervalo de
50 a 500 nM de TAT-BoNTA en células PC12.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
53
A
0
% SNAP-25 cortado
B
[TAT-BoNTA] (nM)
50
100
250
500
60
50
40
30
Figura 3.41. Entrada de TATBoNTA en cultivo de PC12. Las
células se incubaron en
ausencia de suero. A.
Westenrblot. Se utilizó como
anticuerpo primario antiSNAP-25 y como secundario
un anti-ratón conjugado a
HRP. B. Cuantificación de A.
20
10
0
0
100
200
300
400
500
600
[TAT-BoNTA] (nM)
Apréciese, que el porcentaje de truncación citosólico
aumentó con la concentración de TAT-BoNTA hasta un valor
máximo del 50 % de la proteína. Este valor es similar al descrito
para la holotoxina y refleja el procesamiento total de SNAP-25
no complejado con sintaxina y Vamp (Ferrer-Montiel et al.,
1996).
Para confirmar que la TAT-BoNTA estaba entrando en las
células, y estudiar su localización intracelular se diseñaron
unos experimentos de inmunocitoquímica. Para ello se
aprovechó que tanto la CL-BoNTA como la TAT-BoNTA poseen
un epítopo de 6 histidinas, que permitía su inmunodetección.
Para
la
realización
de
los
experimentos
de
inmumocitoquímica se cultivaron las células PC12 sobre
cubreobjetos de 24 mm de diámetro tapizados con poli-lisina.
Cuando las células estaban subconfluentes se incubaron en
ausencia de suero con 300 nM de TAT-BoNTA o CL-BoNTA a
37ºC durante 3 horas.
En la figura 3.42., se observa que la toxina TAT-BoNTA entró en
las células, y se localizó fundamentalmente en el núcleo. La
tinción con yoduro de propidio, coincidió con la señal de la
TAT-BoNTA. La capacidad de traslocar al interior de las células
se debe al dominio TAT, ya que la CL-BoNTA no es capaz de
atravesar la membrana plasmática.
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
54
visible + 488 nm
A
488 nm + 520 nm
B
TAT-BoNTA
C
D
CL-BoNTA
Figura 3.42. Entrada de TATBoNTA en cultivo de PC12
visualizada por microscopía
confoca.La inmunocitoquímica
se realizó según el protocolo
descrito en la sección de
materiales y métodos.
La localización preferente en el núcleo se debe a la
presencia de secuencias de localización nuclear en el
péptido TAT (Vives et al., 1997).
Desarrollo de una estrategia de internalización celular para las CLs-BoNTs recombinantes
55
La actividad de la CL-BoNTA
en células PC12 es modulado
por tirosín quinasas
E
xperimentos realizados en células PC12 revelaron que la
BoNTA internalizada era fosforilada en residuos de tirosina,
sugiriendo un posible papel de esta modificación covalente
en la función catalítica de la CL-BoNTA (Ferrer-Montiel et al.,
1998). Consecuentemente, se investigó si la fosforilación
mediante Src afectaba la actividad enzimática de TATBoNTA. Para ello, se determinó el porcentaje de corte de
SNAP-25 en células intoxicadas con TAT-BoNTA, en ausencia y
presencia del inhibidor de tirosín quinasas PP2 (Hanke et al.,
1996) (fig. 3.43.).
A
c-
[PP2] (µM)
0
10
Snap-25
→
Snap-25 truncado→
B
En este experimento se observa como al añadir al medio de
Figura 3.43. La fosforilación
de CL-BoNTA aumenta su
actividad en cultivo de PC12.
A. Western inmunoblot. Se
utilizó como anticuerpo
primario un anti-SNAP-25. y
como secundario un antiratón conjugado a HRP.
B. Representación gráfica de
la cuantificación de A.
incubación el inhibidor de tirosín quinasas de la familia Src, la
cantidad de SNAP-25 truncado es significativamente menor
comparado con la muestra a la que no se le ha añadido el
PP2. Este resultado junto con los resultados obtenidos con la
fosforilación en tirosinas de la CL-BoNTA “in vitro”, indican que
la fosforilación es una estrategia de regulación de la
actividad enzimática de las toxinas botulínicas.
La actividad de de la CL-BoNTA en células PC12 es modulado por tirosín quinasas
56
4
d i s c u s i ó n
E
n este trabajo, se planteó como objetivo, profundizar en
el conocimiento de la actividad y la regulación de las
toxinas botulínicas como estrategia para desarrollar nuevas
especies de toxinas botulínicas más activas y estables y más
pequeñas; a través del desarrollo de especies de cadenas
ligeras más activas y estables, y del desarrollo de una
estrategia de internalización intracelular para estas cadenas
ligeras.
Los efectos paralíticos duraderos ejercidos por las toxinas
botulínicas en botulismo o en su uso terapéutico sugieren que
estas proteínas son altamente estables en las neuronas a
37ªC. Esta estabilidad contrasta con la termolabilidad in vitro
de
las
toxinas
botulínicas,
lo
que
implica
diferencias
estructurales entre las formas “in vivo” e “in vitro”. El
descubrimiento de que la fosforilación en tirosinas de las
toxinas botulínicas aumenta su actividad catalítica y la
estabilidad térmica, aporta nuevas estrategias para la
modificación racional de la toxinas botulínicas.
Para lograr estos objetivos, se ha expresado de forma
recombinante las cadenas ligeras de dos serotipos de toxinas
botulínicas, por un lado la CL-BoNTA, que fue el primer
serotipo que se introdujo en la práctica clínica, y por otro la
CL-BoNTE, que todavía no se ha utilizado en clínica, pero es el
serotipo que más se parece en el mecanismo de acción (las
dos cortan específicamente SNAP-25), aunque en ratones se
ha demostrado que tiene una vida media de unas 40 veces
menor que la BoNTA.
Las dos CLs se expresaron en E. coli, y se purificaron en
condiciones nativas mediante cromatografía de afinidad con
protocolos sencillos y sin que se requiriera purificaciones
posteriores.
En la CL-BoNTE, la adición del epítopo GST, permitió su
purificación
en
mayores
concentraciones
que
otras
58
purificaciones descritas en la bibliografía (Agarwal et al.,
2004b)
Las CLs-BoNTs obtenidas mantenían la actividad proteolítica
frente a su sustrato natural, SNAP-25 obtenido de forma
recombinante, lo que sugiere el correcto plegamiento de la
proteína, que permitía hacer estudios de estructura-función.
Las cadenas ligeras de los serotipos A y E, fueron fosforilados
por la quinasa Src, de igual forma que ocurre en las
holotoxinas correspondientes, lográndose en los dos serotipos
el mimo efecto; aumentar la termoestabilidad.
Los experimentos de mutagénesis dirigida nos han permitido
la localización de la única tirosina fosforilada por la quinasa
Src, en las dos cadenas ligeras de los serotipos A y E. Estudios
realizados sobre la holotoxina A y E (Encinar et al., 1998; FerrerMontiel et al., 1998) han mostrado, que la fosforilación en
tirosinas, aumenta la actividad y la estabilidad de las mismas,
sugiriendo que la fosforilación es un mecanismo de regulación
para las toxinas botulínicas. La conservación del sitio de
fosforilación en los dos serotipos estudiados, apoya la hipótesis
de que la fosforilación es un mecanismo de regulación de las
toxinas botulínicas.
En la CL-BoNTA, la estructura cristalográfica recientemente
publicada (Segelke et al., 2004 ) muestra que la localización
espacial de la Y71 es compatible con el efecto de su
modificación covalente en las características funcionales de
la enzima. De hecho, la fosforilación de la Y71 provoca la
aparición de 3 puentes de hidrógeno con la R374 y el
esqueleto del lazo vecino. La aparición de estos nuevos
enlaces
de
hidrógeno
provocan
un
aumento
de
la
compactación de la proteína, consistente con el aumento de
la termoestabilidad de la CL-BoNTA fosforilada.
Además los cambios conformacionales provocados por la
fosforilación
podrían
contribuir
al
replegamiento
o
la
estabilización de la proteína plegada después de su
traslocación a través de la cadena pesada.
Para reproducir los efectos conseguidos con la fosforilación
59
de tirosinas, se diseñaron mutantes que imitaban la forma
constitutivamente fosforilada y a la constitutivamente no
fosforilada. La forma no fosforilada se consiguió sustituyendo
la tirosina por fenilalanina, y para la emulación de la carga
negativa del grupo fosfato se introdujo un ácido glutámico.
Tal y como se esperaba, la sustitución de la tirosina por
fenilalanina, dio lugar, en los dos serotipos estudiados, a
proteínas funcionales, de características (rendimiento de la
purificación y EC50) similares.
Sin embargo, el reemplazo de la tirosina por glutámico, dio
lugar a proteínas altamente inestables, que se purificaroncon
un rendimiento muy bajo (CL-BoNTE) o que no se consiguieron
purificar (CL-BoNTA) con los protocolos utilizados para las
correspondientes proteínas silvestres. La explicación de este
resultado la podemos obtener del estudio de la estructura de
la CL-BoNTA, la sustitución de la fosfotirosina por glutámico
(residuo mucho más pequeño), sitúa la carga negativa
dentro de un bolsillo hidrofóbico, que es, en términos de
energía, muy desfavorable. Probablemente, este cambio
desestabiliza
la
estructura
proteica
y
como
resultado
proporciona una proteína altamente inestable.
Una alternativa a colocar una carga negativa en la posición
Y71, fue proporcionada mediante el uso de algoritmos de
diseño de proteínas (PERLA y FOLD-X), Estos programas
permiten sustituir la posición Y71 por todos los aminoácidos, y
evaluar las estructuras resultantes en términos de energía. El
aminoácido seleccionado de esta forma fue el triptófano.
El nuevo mutante, CL-BoNTAY71W, se purificó con un
rendimiento alto (6-8 mg /Lcultivo), y con una EC50 semejante a
la
proteína
silvestre
(1.65
nM),
pero
mostró
una
termoestabilidad (medida en términos de Tm) menor que la
proteína silvestre. En la estructura cristalográfica, se observa,
que el residuo W, no rellena perfectamente el hueco dejado
por la Y, lo que puede explicar el efecto desestabilizador de
esta mutación.
De hecho, la variación de la energía libre del estado plegado
estimada respecto a la proteína silvestre (∆∆G) son 2.2 Kcal/mol
60
y 3.1 Kcal/mol para los mutantes Y71W y Y71E (calculada con
Fold-X). Aunque estas interpretaciones parecen razonables, la
modulación estructural exacta ejercida por la fosforilación
tendrá que ser determinada con la estructura de la enzima
fosforilada.
mutagénesis
Estos
no
resultados
hemos
revelan
conseguido
que
emular
mediante
el
efecto
conseguido con la fosforilación en tirosinas. Por lo que habrá
que utilizar otras tecnologías, como la evolución dirigida bien
a través de mutagénesis al azar o por recombinación de
genes (“family shuffling”), en el futuro, para lograr este
objetivo.
El otro gran objetivo de este estudio fue desarrollar una
estrategia de internalización celular para las cadenas ligeras
de las BoNTs, eliminando la necesidad de la cadena pesada
(100 KDa) para internalizar la cadena ligera en la célula.
Como
resultado
el
tamaño
de
la
toxina
quedaría
notablemente reducido.
En las toxinas botulínicas, la cadena pesada (100 KDa),
permite la entrada de la cadena ligera en las células diana
para realizar su acción endoproteasa dependiente de zinc. El
desarrollo de estrategias de entrada celular, conduciría al
diseño de nuevas especies de toxinas, mucho más pequeñas
y previsiblemente menos inmunogénicas. Para estos estudios
se seleccionó la CL-BoNTA, que es el serotipo ampliamente
utilizado en clínica y cosmética.
El desarrollo de fármacos de péptidos y proteínas es limitado
por la pobre permeabilidad y la selectividad de la membrana
de la célula, por lo que existe un gran esfuerzo en evitar estos
problemas diseñando estrategias para introducir proteínas en
diversos tipos celulares.
Se ha utilizado la estrategia de los dominios de transducción
de proteínas (DTPs), estos son secuencias de 9 a 35
aminoácidos
fundamentalmente
básicos,
que,
por
un
mecanismo todavía por esclarecer, permiten la entrada en
células eucariotas de péptidos, proteínas, liposomas y
nanopartículas.
Dentro de estos DTPs, el más utilizado y descrito en la
61
bibliografía es el Tat (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-ArgArg),
que
procede
de
la
proteína
Tat
del
virus
de
inmunodefiencia humana (VIH), y ha sido la secuencia que
hemos utilizado para este estudio.
Partiendo del vector de expresión en procariotas pTAT-HA, se
obtuvo una proteína recombinante, His6-TAT-HA-CL-BoNTA,
esta construcción permitía la purificación de la proteína
mediante cromatografía de afinidad así como la localización
de la misma de mediante la detección inmunológica de los
epítopos hemaglutinina (HA) y His6. La proteína se expresó en
E. coli y se purificó en condiciones nativas con una resina de
Ni2+, la proteína así obtenida fue activa “in vitro”.
Para evaluar la capacidad de entrar en las células
seleccionamos dos lineas celulares: la F11, que es un
hibridoma de neuroblastoma y ganglio raquídeo y PC12,
procedente de feocromocitoma de rata.
La internalización se ha seguido de dos formas :
1.
Mediante
la
detección
de
la
actividad
endoproteasa frente a SNAP-25.
2.
Con la localización intracelular de la proteína
mediante inmunocitoquímica.
En las dos líneas estudiadas, la TAT-BoNTA, fue capaz de
atravesar la membrana plasmática, y de forma dosisdependiente, como ya se ha descrito en la bibliografía
(Schwarze et al., 1999). La CL-BoNTA, sin el dominio TAT, no fue
capaz de atravesar la membrana celular, lo que nos indica,
que el dominio TAT es el responsable de la internalización de
la proteína TAT-BoNTA.
Además, mediante experimentos de inmunocitoquímica se
ha detectado la proteína en el interior de las células
estudiadas (PC12), y se ha localizado en el núcleo de las
mismas, tal y como cabía esperar, ya que la secuencia TAT es
una señal de localización nuclear. Nuevamente, la CL-BoNTA
no se detectó en el interior de las célula.
62
En este estudio se ha trabajado con la proteína obtenida en
condiciones nativas, lo que difiere de la mayoría de trabajos
publicados, en los que utilizan la proteína desnaturalizada,
según la hipótesis de que las proteínas desnaturalizadas
tienen mayor potencial de transducción por que poseen
mayor energía (∆G) que sus correspondientes proteínas
plegadas y que luego, en el interior de la células las
chaperonas son las responsables del plegamiento (BeckerHapak et al., 2001). Nuestros resultados parecen contradecir
esta
hipótesis
ya
que
nosotros
hemos
conseguido
la
transducción de la proteína no previamente desnaturalizada.
Finalmente los estudios realizados con el inhibidor de quinasas
de la familia Src, PP2, que es permeable a la membrana
plasmática, apoyan la hipótesis de que la fosforilación en
tirosinas por las quinasas de la familia Src, es un mecanismo
de regulación de la actividad de las toxinas botulínicas, ya
que, tal y como ocurría “in vitro”, la fosforilación en tirosinas
aumenta la actividad de la CL-BoNTA en cultivos celulares.
Es significativo que neuronas y células neuroendocrinas
tengan niveles relativamente altos de tirosín quinasas, que se
cree que tienen un papel importante en la diferenciación
neuronal. El aumento de la estabilidad térmica provocado
por la fosforilación en tirosinas de las cadenas ligeras
recombinantes de las toxinas botulínicas A y E, y sugiere que
la forma fosforilada de las toxinas botulínicas puede ser la
forma predominante y activa dentro de las células.
D
esde que, en 1970 Alan scout explorara la posibilidad de
inyectar pequeñas dosis de toxina botulínica dentro de
los músculos hiperactivos, para reducir la intensidad de la
Contribución a la
terapéutica
contracción muscular en monos, hasta la actualidad, se han
hecho grandes avances en la aplicación de las toxinas
botulínicas en terapéutica y cosmética (Pellizzari et al., 1999;
Mahant et al., 2000; Klein, 2004; Thant y Tan, 2003)
A pesar del increíble auge que ha tenido el uso de las toxinas
63
botulínicas en las últimas décadas, todavía existe un
inconveniente del uso de las mismas que no ha sido
solucionado: el desarrollo de resistencias a la terapia con
toxinas botulínicas, caracterizada por la ausencia de sus
efectos beneficiosos, provocada por la generación de
anticuerpos (Borodic et al., 1996; Brin, 1997). La aparición de
resistencias, se ha relacionado con la altas dosis y la
repetición del tratamiento en un corto periodo de tiempo
(Atassi, 2004), necesario, ya que como se ha explicado en la
introducción, con el tiempo, la aparición de nuevas uniones
neuromusculares la hace ineficaz.
El desarrollo de especies más activas sería beneficioso para
los pacientes porque reduciría la inmunogenicidad, ya que el
paciente estaría expuesto a menos alergeno. Si además se la
disminución del tamaño del complejo proteico inyectado,
que en la actualidad es, para BOTOX®, de 900 KDa, también
debería disminuir la antigenicidad del complejo.
Con el fin de disminuir la inmunogenicidad, provocada por las
toxinas botulínicas, en la actualidad se intenta desarrollar
péptidos que inhiban la exocitosis. Se han descrito péptidos
que inhiben la formación del complejo SNARE, derivados de
los extremos amino y carboxilo de SNAP-25 (Blanes-Mira et al.,
2004, Gutierrez et al., 1997) así como elegidos a través de una
quimioteca de péptidos con estructura de α-hélice (BlanesMira et al., 2003). De entre estos péptidos descritos, el péptido
argirelina (Ac-EEMQRR-NH2), ha demostrado tanto en estudios
“in vitro” (Blanes-Mira et al., 2003) como “in vivo” (Blanes-Mira
et al., 2002; Alcalde, 2004) tener eficacia antiarrugas. Sin
embargo, una limitación de los péptidos pequeños es su
limitada eficacia cuando se les compara con la CL-BoNTA
(Blanes-Mira et al., 2003). Por ello, una alternativa es el
desarrollo
de
especies
botulínicas
más
pequeñas
que
reduzcan significativamente el riesgo de una respuesta
inmine. En este contexto, el desarrollo de la TAT-BoNTA,
representa un primer paso para el logro de versiones
estructuralmente más simples de las BoNTs. El resultado más
notable ha sido la producción de una forma pura de la TATBoNTA que muestra actividad “in vivo”. Claramente esta
proteína podría constituir una nueva generación de toxinas
con uso clínico. Sin embargo, estudios adicionales de
64
estabilidad de estas nuevas formas serán necesarias para su
expltación como agentes terapéuticos y cosmeticos.
65
5
conclusiones
•
Las
proteínas
recombinantes
CL-BoNTA-His6
y
CL-BoNTE--His6
se
obtienen de forma pura y alto rendimiento.
•
Las CL-BoNTs obtenidas son activas frente su sustrato natural obtenido
de forma recombinante.
•
La fosforilación aumenta la estabilidad térmica de las CL-BoNTs, sin
afectar su eficacia catalítica.
•
En la CL-BoNTE la fosforilación aumenta el contenido en α–hélice y
disminuye el contenido en hojas-β .
•
La fosforilación por la quinasa Src ocurre en la CL-BoNTA y E en un
único residuo de tirosina, que está conservado en todas los serotipos
de toxinas botulínicas y en la toxina tetánica, estructuralmente
relacionada con éstas.
•
La sustitución a fenilalanina de las tirosinas fosforilabes por Src, originó
en ambas CLs una especie con características similares a las proteínas
silvestres, mientras que las sustitución por glutámico rindió especies muy
inestables.
•
El dominio de transducción de proteínas TAT, permite la internalización
de la CL-BoNTA en células en cultivo, consiguiendo por tanto la
disminución del tamaño de la proteína en un 65 %.
•
La CL-BoNTA internalizada es una proteasa activa que proteoliza SNAP25 celular.
•
La TAT-BoNTA aporta una estrategia para la traslocación eficaz de la
CL-BoNTA al interior celular.
67
6
materiales y métodos
Materiales
T
odos los reactivos, a menos que se especifique lo contrario,
son
de
Sigma-Aldrich.
Los
oligonucleótidos
fueron
adquiridos de Invitrogen, las enzimas de restricción de
Boehringer, los kits de purificación de ADN de Qiagen y los
medios de cultivo celullares de Life-technology.
La composición de las soluciones, tampones y medios de
cultivo se detallan en el apartado de apéndices.
69
Métodos
L
as construcciones de SNAP-25 (pGEX-SNAP25) y CL-BoNTA
(pQE-BoNTA) fueron cedidas por H. Niemann y J. Blasí.
Obtención
cDNAs
de
El cDNA que codifica la cadena ligera de la BoNT E fue
subclonado en el vector pGEX-KG. Para ello se amplificó un
fragmento de la LC-BONTE mediante PCR usando como
primers,
5’
GATATCATTGGACTGAGCACTAG
3’
y
5’
GAGGAGAAATTAATCATGAGAGGATCC 3’. Este fragmento se
digirió con las enzimas de restrición BspHI y EcoRI, por otro
lado se digirió el cDNA de la LC-BoNTE con EcoRI y HindIII y el
vector pGEX-KG con NcoI y HindIII, así se obtuvo unos
fragmentos de 0.8, 0.5 y 5 Kb que, una vez purificados, se
ligaron en presencia de T4 ligasa. Se transformaron en E. Coli
XL-1 blue, de donde se purificó el ADN plasmídico y se
secuenció por secuenciación automática.
Para la obtención de la construcción TAT-BoNTA, se amplificó
mediante PCR el cDNA de la CL-BoNTA con los
oligonucleótidos 5’GCATCCATGGCATTTGTTAATAAACAATT 3’ Y
5’CGTCTCGAGTTACTTATTGTATCCTTTATCTAATGATTAG 3’, el
fragmento de ∼1400 pares de bases resultante se subclonó en
el vector pTAT-HA donado por S. Dowdy usando los sitios NcoI y
XhoI. El subclonaje se confirmó por secuenciación automática.
L
a mutagénesis dirigida se hizo mediante PCR utilizando
pares de oligonucleóti dos complementarios que
M u t a gé n e s i s
dirigida
acarreaban las mutaciones especificadas para amplificar el
plásmido entero; la digestión posterior con DpnI (que digiere
DNA metilado o hemimetilado) permitió la eliminación del
plásmido parental, y el ADN mutado se transformó en E. Coli XL
-1 blue, se seleccionó un clon, y se purificó el ADN plasmídico.
La presencia de la mutación, se verificó por secuenciación
automática.
Métodos
70
En la tabla 4.1 se detallan los oligonucleótidos utilizados para
cada mutación.
mutación
secuencia 5´→ 3´
orientación
CL-BoNTEY67F
GGAGATAGTAGTTTTTATGACCCTAATTATTTTAC
sentido
GTAAATAATTAGGGTCATAAAAACTACTATCTCC
antisentido
GGAGATAGTAGTGAGTATGCCCTAATTATTTTAC
sentido
GTAAATAATTAGGGCATACTCACTACTATATCTCC
antisentido
CL-BoNTEY67E
CL-BoNTEY306F GAAGCAAAGTTTGGATTAGATAAAG
CL-BoNTAY71F
CL-BoNTAY71E
CTTTATCTAATCCAAACTTTGCTTC
antisentido
CCAGTTTCATTTTATGATTCAAC
sentido
GTTGAATCATAAAATGAAACTGG
antisentido
CCAGTTTCAGAGTATGATTCAAC
sentido
GTTGAATCATACTCTGAAACTGG
antisentido
CL-BoNTAY71W CCAGTTTCATGGTATGATTCAAC
GTTGAATCATACCATGAAACTGG
E
sentido
sentido
antisentido
l método utilizado para la preparación de células de E.
Coli competentes ha sido el del CaCl2. Para esto se han
seguido estrictamente los pasos descritos en el libro de
Tabla 4.1. Oligonucleótidos
utilizados para la
obtención de los mutantes
de CL-BoNTE y CL-BoNTA.
Tr a n s f o r m a c i ó n
bacteriana
protocolos Sambrook et al, 1989. Las células una vez
competentes se mantenían a –80 °C hasta su utilización. Las
cepas bacterianas utilizadas se encuentran detalladas en el
apéndice.
Para la transformación de las células competentes se ha
utilizado el método del choque térmico. 100 µL de células
competentes se incubaron con 25 mM de β-mercaptoetanol
durante 10 minutos en hielo. A continuación se añadieron unos
200 ng del plásmido y se incubó 30 minutos más con hielo. Se
sometieron a un choque térmico de 42 ºC durante 45
segundos y 2 minutos en hielo. Se añadió 1 mL de LB y se
incubó una hora a 37 ºC, y se sembraron en placas de LB-agar
con los antibióticos adecuados. Las placas se incubaron a
37ªC durante 14-16 horas.
Métodos
71
L
a proteína CL-BoNTE se expresó en E. coli M15prep4. Las
bacterias transformadas se crecieron en medio 2xYT a
37ªC. El crecimiento fue monitorizado por la absorbancia
medida a 600 nm (A600), y cuando la A600 era 0.6-0.8, la
Expresión
y
purificación de la
CL-BoNTE
expresión fue inducida con IPTG 1 mM. Las células fueron
crecidas en la misma agitación a 30 ºC durante 5 horas.
El cultivo bacteriano se centrifugó durante 15’ a 6000g,
(Beckman, L8-70) para recoger las bacterias, las cuales se
resuspendieron en el tampón PBS conteniendo 1mM PMSF, 2
mM de iodoacetamida, 5 mM EDTA, y se digirió con lisozima
0.1 mg/mL durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación se sometió a 3 ciclos de sonicación. Se
agregaron de nuevo los inhibidores de proteasas y después
de ultracentrifugar 30’ 40000 g, (Beckman Coulter, Optima XL100k) se recogió el sobrenadante y se unió con una resina de
agarosa-GSH (1 mL/L cultivo, Amersham Pharmacia Biotech)
toda la noche a 4ª C. La resina se empaquetó en una
columna, se lavó con 50 mL del tampón de purificación de
CL-BoNTE. CL-BoNTE se desplazó de la unión con GST de la
resina incubando con 25 U.I. de trombina (Amersham
Pharmacia Biotech).
La proteína purificada, se dializó frente su tampón de diálisis,
comprobó la pureza mediante SDS-PAGE y se cuantificó
mediante la reacción con el ácido bicincónico (BCA, Pierce).
Métodos
72
E
l cDNA de la CL-BoNTA se encontraba en el vector de
expresión pQE-3, de forma que permitía su obtención
como proteína de fusión con una cola de histidinas en el
Expresión
y
purificación de la
CL-BoNTA
extremo carboxilo terminal, que posteriormente se podía
purificar por cromatografía de afinidad.
La CL-BoNTA se expresó en E. coli M15prep4. Las bacterias
transformadas se crecieron en medio 2xYT suplementado con
ampicilina 100 µg, kanamicina 50 µg y 0.4% glucosa a 37ªC y
200 rpm. El crecimiento fue monitorizado por la absorbancia
medida a 600 nm (A600 ), y cuando la A600 era 0.6-0.8, la
expresión fue inducida con IPTG 1 mM. Las células fueron
crecidas en la misma agitación a 30ºC durante 5 horas.
El cultivo bacteriano se centrifugó durante 15’ a 6000 g
(Beckman, L8-70), para recoger las bacterias, las cuales se
sonicaron en PBS 10 mM imidazol conteniendo 1 mM PMSF y 2
mM de iodoacetamida. Después de ultracentrifugar 30’ a
40000 g, (Beckman Coulter, Optima XL-100k) el sobrenadante
se incubó toda la noche a 4ªC con una resina Ni2+ (1 mL/L
cultivo) equilibrada con PBS 10 mM imidazol. La resina se
empaquetó en una columna y se lavó con 50 mL de PBS 10
mM de imidazol y 5 mL 25 mM de imidazol. Finalmente la
proteína se eluyó con 5 mL de 100mM de imidazol y 3 mL de
imidazol 500 mM. Se dializó frente su tampón de diálisis, se
comprobó la pureza mediante SDS-PAGE y se cuantificó
mediante BCA.
Métodos
73
E
l cDNA que codifica para SNAP-25 se encontraba en el
plásmido de expresión pGEX-KG, lo que permitía la
expresión de SNAP-25 como proteína de fusión de GST y su
posterior purificación por cromatografía de afinidad.
Expresión
purificación
SNAP-25
y
de
La proteína SNAP-25 se expresó en E. coli BL21. Las bacterias
transformadas se crecieron en medio 2xYT a 37ªC. El
crecimiento fue monitorizado por la absorbancia medida a
600 nm (A600), y cuando la A600 era 0.6-0.8, la expresión fue
inducida con IPTG 1 mM. Las células fueron crecidas a 30 ºC
durante 5 horas.
El cultivo bacteriano se centrifugó durante 15’ a 6000 g
(Beckman L8-70), para obtener el precipitado bacteriano, el
cual fue sonicado en PBS conteniendo 1 mM PMSF, 2 mM de
iodoacetamida y 2 mM EDTA. Después de ultracentrifugar 30’
a 40000 g (Beckman Coulter, Optima XL-100k), se recogió el
sobrenadante y se unió con una resina de agarosa-GSH (1 mL/
L cultivo, Amersham Pharmacia Biotech) o/n a 4ª C. La resina
se empaquetó en una columna, se lavó con 50 mL del tampón
de purificación de SNAP-25. SNAP-25 se desplazó de la unión
con GST de la resina incubando con 25 U.I. de trombina
(Amersham Pharmacia Biotech). Se dializó frente al tampón de
diálisis de SNAP-25, se comprobó la pureza mediante SDSPAGE y se cuantificó mediante BCA.
Métodos
74
E
l cDNA de la TAT-BoNTA se encontraba en el vector de
expresión pQE de forma que nos permitía su obtención
como proteína de fusión con una cola de histidinas en el
extremo carboxilo terminal, que posteriormente se podía
Expresión
y
purificación de la
TAT-BoNTA
purificar por cromatografía de afinidad.
La TAT-BoNTA se expresó en E. coli BL21plys. Las bacterias
transformadas se crecieron en medio 2xYT suplementado con
ampicilina 100 µg, cloranfenicol 35 µg y glucosa 0.4% a 37ªC.
El crecimiento fue monitorizado por la absorbancia medida a
600 nm (A600), y cuando la A600 era 0.6-0.8, la expresión fue
inducida con IPTG 1 mM. Las células fueron crecidas a 30 ºC
durante 5 horas.
La células bacterianas se recogieron mediante centrifugación
durante 15’ a 6000 g (Beckman, L8-70), y fueron sonicadas en
tampón PBS 25 mM imidazol conteniendo PMSF 1 mM y
iodoacetamida 2 mM. Después de ultracentrifugar 30’ a 4000
g (Beckman Coulter, Optima XL-100k), el sobrenadante se
incubó toda la noche a 4ªC con una resina Ni2+ (1 mL/L
cultivo) equilibrada con tampón de purificación. La resina se
empaquetó en una columna y se lavó con 50 mL de PBS-10%
glicerol 25 mM de imidazol, 2 mL 100 mM de imidazol y
finalmente se eluyó con 3 mL de PBS-10% glicerol 500 mM
imidazol.
Se comprobó la pureza mediante SDS-PAGE y se cuantificó
densitometrando frente un patrón de albúmina bovina en
SDS-PAGE al 10 %.
Métodos
75
L
a electroforesis en geles poliacrilamida (PAGE) se realizó
en el sistema Miniprotean II (Bio-Rad) con espaciadores de
1,5 mm. La concentración de acrilamida del gel separador
osciló entre el 10%-14%. El voltaje utilizado en la electroforesis
Electroforesis de
proteínas en geles
de poliacrilamida
ha sido: 100-140 V.
Una vez que había terminado de correr el gel, se tiñó con azul
comassie o se siguió con el protocolo de western blot.
D
espués de correr el PAGE del porcentaje adecuado, las
Western blot
bandas de las proteínas fueron electrotransferidas a una
membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia. El
bloqueo de los sitios inespecíficos se llevó a cabo con
seroalbúmina bovina al 3%. El primer anticuerpo se diluyó 1000
veces. El segundo, un anti-mouse conjugado con peroxidasa
se diluyó 4000 veces. Para el revelado se utilizó la estrategia
del ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Las incubaciones y
los lavados entre incubaciones se realizaron con el tampón
de western blot.
P
ara estudiar la actividad de las CLs-BoNTs se ha
cuantificado la actividad frente su sustrato natural, SNAP-
25, obtenido de forma recombinante.
A c t i v i d a d
proteolítica CLBoNTs
Para ello se incubaron las CL-BoNTs en el tampón de
proteólisis y una concentración de 6 µM de SNAP-25 a 30 ºC.
La concentración de Cl-BoNT y el tiempo de incubación se
especifica para cada experimento.
La reacción se detuvo con tampón de carga de proteínas. En
el caso de la CL-BoNTE las muestras se corrieron en
condiciones desnaturalizantes y en el caso de la CL-BoNTA en
condiciones nativas, lo que nos permitió la separación de
SNAP-25 truncado y no truncado.
Métodos
76
L
a fosforilación de las BoNTs se hizo en el tampón de
fosforilación, en presencia de ATP y la quinasa c-Src
humana recombinante (p60c-src, Upstate biotechnology). Se
Fosforilación
BoNTs
CL-
incubó 1 µg de cadena ligera de toxina botulínica durante 60
minutos con agitación suave. Se detuvo la reacción con
tampón de carga de proteínas. La fosforilación se determinó
mediante western blot, usando como anticuerpo primario
anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (clon 4G10, Upstate
biotechnology).
L
a visualización y la superposición de la estructura se
hicieron usando el “Swiss PDB viewer v3.7” (Guex y Peitsch,
1997) y “Pymol” (DeLano, 2002).
Visualización y
m o d e l a d o
estructural
Con el algoritmo del diseño de proteínas PERLA (Reina et al.,
2002), se sustituyeron las posiciones seleccionadas para la
mutagénesis por todo el repertorio del aminoácidos y fueron
evaluadas por FOLD-X, (Guerois, et al., 2002).
Métodos
77
L
os espectros de dicroísmo circular fueron tomados en un
espectropolarímetro Jasco modelo J-810, equipado de
control computerizado de la temperatura de la muestra
Medidas
de
dicroísmo circular
Neslab RTE-111. El instrumento fue periódicamente calibrado
con ácido 10-canforsulfónico.
Los cambios en estructura secundaria fueron registrados en el
ultravioleta lejano en el intervalo de 200 a 260 nm de longitud
de onda, se utilizaron cubetas de sílice fundido de 1 mm de
paso óptico. El ancho de banda utilizado para todas las
determinaciones fue 2 nm con una constante de tiempo de 2
s y una velocidad de 50 nm/min. Cada espectro tomado
representa el promedio de 5 barridos realizados por el
instrumento. Durante las mediciones la temperatura se
mantuvo constante a 20 °C. Las contribuciones originadas por
el solvente fueron sustraídas en cada una de las mediciones.
Las señales de CD en mdgrees (θdeg) se convirtieron a
elipticidad molar (θmolar) mediante la relación:
θ molar =
θ deg
10.c.l.
donde c representa la concentración molar de
proteína, y l el paso óptico de la cubeta.
Los porcentajes de estructura secundaria se calcularon con el
programa CDnn (Bohm et al., 1992).
Para el cálculo de la temperatura de desnaturalización (Tm)
se registró el valor de elipticidad a 222 nm y la temperatura
varió de 20 a 80 ºC a una velocidad de 1 ºC/min y con un
tiempo de respuesta de 2 s. Se utilizaron cubetas de sílice de
paso óptico 1 mm y la muestra se cubrió con aceite mineral
para evitar la evaporación de la misma.
Métodos
78
F11
La linea celular F11 se mantuvo con medio HAM F-12 con
Mantenimiento de
líneas celulares
glutamax suplementado con 20% de suero bovino fetal (FBS),
0.5 % suplemento HAT (hipoxantina-timidina-aminopterina) y
100 U.I./mL de penicilina y estreptomicina a 37 ºC en un
incubador humidificado con un 5% de CO2.
PC12
La linea celular PC12 se mantuvo con medio DMEM con
glutamax suplementado con 10% de suero de caballo (HS),
5% FBS y 100 U.I./mL de penicilina y estreptomicina a 37 ºC en
un incubador humidificado con un 5% de CO2. Se sembraron
en placas tapizadas con colágeno para que crecieran de
forma adherente. Para la diferenciación se les añadió factor
de crecimiento neuronal (NGF) 100 ng/mL durante 7-10 días.
L
as células se sembraron en pocillos de 35 mm, y una vez
que estaban confluentes se incubaron con la CL-BoNTA o
TAT-BoNTA en medio incompleto durante el tiempo que se
Incubación
TAT-BoNTA
con
describe para cada experimento. Después las células se
lavaron 3 veces con PBS, se recogieron por tripsinización o
rascado y se lisaron con tampón de lisis, DTT 2 mM, EDTA 50
mM, inhibidores de proteasas, 30 minutos a 4ºC y se recogió la
fracción soluble por centrifugación durante 15’ a 16000 g a
4ºC.
Métodos
79
L
as células cultivadas sobre el cubreobjetos tapizado con
Inmunocitoquímica
poli-lisina, después de la incubación pertinente, eran
lavadas con PBS, fijadas con paraformaldehido al 4% durante
15 minutos, y lavadas nuevamente con PBS. Estos cubres
fueron bloqueados en 3% de suero de cabra, 2% de BSA y 0.1
% de NP40 durante 30 minutos a temperatura ambiente. A
continuación se incubó toda la noche con el anticuerpo
primario anti-His4 (qiagen) en 2% de BSA y 0.1 % de NP40 a 4ºC.
Se lavó primero 2 veces con PBS con NaCl 500 mM, y 2 veces
con PBS. Se bloqueó nuevamente en 3 % de suero de cabra,
2% de BSA y 0.1 % de NP40 durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Después se incubó con el anticuerpo secundario
anti-mouse conjugado con Alexa 488 (Molecular probes).
A continuación, para la tinción de los núcleos con yoduro de
propidio se incubaron las células con 10 µg/mL de yoduro de
propidio
durante
5
minutos
a
temperatura
ambiente.
Finalmente los cubres era lavados con PBS, secados al aire y
montados en un portaobjetos con medio de montaje para
fluorescencia (Vector).
L
a adquisición de las imágenes se realizó con un
microscopio confocal (Leica TCS-SL) equipado con una
mezcla de argón y criptón con picos de excitación de 488
Microscopía
confocal
(Alexa 488) y 520 nm (Yoduro de propidio). Se usaron canales
independientes para cada fluoróforo.
Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de inmersión
en aceite 20x, con un zoom electrónico de alrededor de 3x.
Métodos
80
7
a p é n d i c e s
Abreviaturas
ADN
Ácido desoxiribonucleico
ATP
Adenosina 5´-trifosfato
BoNT
Toxina botulínica
BCA
Ácido bicincónico
BoNTA
Toxina botulínica serotipo A
BoNTE
Toxina botulínica serotipo E
CL
Cadena ligera
CP
Cadena Pesada
CD
Dicroismo circular
C-Terminal
Carboxi-terminal
DTP
Dominios de transacción de proteínas
EC50
Concentración
de
enzima
necesaria
para
cortar el 50 % de sustrato
ELISA
(Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay)
f-CL-BoNTA
CL-BoNTA fosforilada
f-CL-BoNTE
CL-BoNTA fosforilada
HA
Hemaglutinina
HAT
hipoxantina-timidina-aminopterina
LB, medio
Luria-Bertani
KDa
Kilodalton
NGF
Factor de crecimiento nervioso
NSF
Factor
sensible
a
N-etilmaleimida
(N-
ethylmaleimide-sensitive factor)
NT
Neurotransmisor
N-Terminal
Amino-terminal
PAGE
Electroforesis de poliacrilamida (PolyAcrylamide
Gel Electrophoresis)
PDB
Banco de datos de proteína (Protein data Bank)
PBS
Tampón salino fosfato
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PC
Dominio C-Terminal de la cadena pesada
82
PN
Dominio N-Terminal de la cadena pesada
PMSF
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (phenyl methyl
sulfonyl fluoride)
RMSD
Raíz de la desviación cuadrática media de las
posiciones de pares de átomos de dos proteínas
a comparar (root mean square desviation)
SBF
Suero bovino fetal
SDS
Dodecil sulfato sódico (Sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE
Electroforesis de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes
SNAP
Proteínas solubles de unión a NSF (soluble NSF
attachment proteins)
SNAP-25
Proteína de 25 KDa asociada a sinaptosomas
(Synaptosomal-asociated protein)
SNARE
Receptores de SNAP (SNAP Receptors)
Src
Tirosín quinasa src de 60 KDa (pp60 c-src)
t-SNARE
SNARE de la membrana presináptica
V-SNARE
SNARE de la vesícula
TAT-BoNTA
Proteína TAT-His6-HA-CL-BoNTA
Tm
Temperatura media de desnaturalización
VAMP
Proteína de membrana asociada a vesículas
(Vesicle–Associated Membrana Protein)
v
voltios
WT
Silvestre (Wild Type)
Y306F
Mutación Y306 por F306
Y67E
Mutación Y67 por E67
Y67F
Mutación Y67 por F67
Y71E
Mutación Y71 por E71
Y71F
Mutación Y71 por F71
Y71W
Mutación Y71 por W71
83
Preparación de reactivos
Soluciones
Tampones
PBS
137 mM NaCl
y
2.7 mM KCl
4.3 mM Na2PO4
1.4 mM KH2PO4
Tampón de diálisis de CL-BoNTA
100 mM NaCl
20 mM tris pH 7
Tampón de purificación de TAT-BoNTA
25 mM imidazol
10% glicerol
PBS
Tampón de purificación de SNAP-25
20 mM hepes
100 mM NaCl
5 mM DTT
0.05% octil-glucósido
Tampón de diálisis de SNAP-25
20 mM hepes
80 mM KCl
20 mM NaCl,
0.01% octil-glucósido
Tampón de proteolísis
20 mM hepes
2 mM DTT
10 µM acetato de Zinc
Tampón de fosforilación
20 mM MgCl2
20 mM hepes
pH 7.4
84
Tampón de electroforesis desnaturalizante 5x
72 g glicina
5 g SDS
15 g tris
pH 8.3
Tampón de electroforesis 5x
72 g glicina
15 g tris
pH 8.3
Tampón de carga de proteínas 2x
125 mM Tris.HCl pH 6,8
20 % glicerol,
0.04 % azul de bromofenol
Tampón de carga de proteínas desnaturalizante 2x
125 mM Tris HCl pH 6,8
4% SDS,
20 % glicerol,
0.04 % azul de bromofenol
Solución de tinción de coomassie
1% coomassie
20% metanol
20% ácido acético glacial
59% H2O
Solución de destinción
20% metanol
20% ácido acético glacial
60% H2O
Tampón de transferencia
Trizma base
glicina
20% metanol
Tampón de western-blot
0.05 % tween-20
PBS
85
Tampón de lisis celular
20 mM hepes
200 mM NaCl
1% tritón x-100
0.25 % desoxicolato
1 mM EGTA
pH 7.4
86
LB
10 g/l bacto triptona,
Medios
para
cultivo bacterianos
5 g/l de extracto de levadura,
5 g/l NaCl
pH 7
LB-Amp
Medio LB suplementado con ampicilina (50-100 µg/L)
LB-Kan
Medio LB suplementado con kanamicina (25 µg/L)
2xYT
16 g/l bacto triptona,
10 g/l de extracto de levadura,
5 g/l NaCl
pH 7
2xYT-Amp
Medio 2xYT suplementado con ampicilina (50-100 µg/L)
2xYT-Kan
Medio 2xYT suplementado con kanamicina (25 µg/L)
LB-agar
10 g/l bacto triptona,
5 g/l de extracto de levadura,
5 g/l NaCl
15 g/L agar
pH 7
87
Cepas bacterianas utilizadas
cepa
referencia
E. coli XL-1 blue
stratagene
E. coli M15prep4
stratagene
E. coli BL21(DE3)
stratagene
E. coli BL21(DE3)plys
stratagene
uso
Propagación de ADN plasmiídico y
purificación
Sobreexpresión de proteínas
(CL-BoNTs y mutantes)
Sobreexpresión de proteínas
(SNAP-25)
Sobreexpresión de proteínas
88
Indice de figuras
Figura 1.1. La exocitosis.
Figura 1.2. El ciclo vesicular
Figura 1.3. Hipótesis SNARE.
Figura 1.4. Estructura del complejo SNARE.
Figura 1.5. Estructura de la capa cero del complejo SNARE.
Figura 1.6. Calambre del escritor con flexión de dígitos 2-5 y extensión de pulgar.
Figura 1.7. Representación esquemática de las toxinas botulínicas.
Figura 1.8. Estructura cristalográfica de la BoNTA.
Figura 1.9. Centro activo de las toxinas botulínicas.
Figura 1.10. Mecanismo de acción de las toxinas botulínicas.
Figura 1.11. Dianas de las toxinas botulínicas.
Figura 1.12. Clostridium botulinum.
Figura 1.13. Tratamiento con toxina botulínica a una paciente con blefarospasmo.
Figura 1.14. Aparición de nuevas uniones neuromusculares después de la
inyección de toxina botulínica.
Figura 3.1. SDS-PAGE de la purificación de las CL-BoNTA recombinante.
Figura 3.2. Western inmunoblot de la proteína recombinante CL-BoNTA.
Figura 3.3. SDS-PAGE de la purificación de las CL-BoNTE recombinante.
Figura 3.4. Western inmunoblot de la proteína recombinante CL-BoNTE.
Figura 3.5. Actividad de las CL-BoNTs recombinantes.
Figura 3.6. Fosforilación de las CL-BoNTs recombinantes.
Figura 3.7. Efecto de la fosforilación en la estabilidad térmica de la CL-BoNTA.
89
Figura 3.8. Efecto de la fosforilación en la actividad de la CL-BoNTA.
Figura 3.9. Efecto de la fosforilación en la actividad de la CL-BoNTE.
Figura 3.10. Efecto de la fosforilación en la termoestabilidad de la CL-BoNTA.
Figura 3.11. Espectros de CD de CL-BoNTA y CL-BONTE recombinantes.
Figura 3.12. Espectros de CD de CL-BoNTE y CL-BoNTE fosforilada.
Figura 3.13. Curvas de desnaturalización térmica mediante CD de CL-BoNTE y CLBoNTE fosforilada.
Figura 3.14. Localización de las tirosinas conservadas en las cadenas ligeras de
los 7 serotipos de BoNTs.
Figura 3.15. Localización del sitio de fosforilación de CL-BoNTE.
Figura 3.16. Localización del sitio de fosforilación de CL-BoNTA.
Figura 3.17. SDS-PAGE de la purificación de los mutantes constitutivamente no
fosforilados. A. CL-BoNTAY71F. B. CL-BoNTEY67F.
Figura 3.18. Actividad de los mutantes constitutivamente no fosforilados. A. CLBoNTAY71F. B. CL-BoNTEY67F.
Figura 3.19. SDS-PAGE de la purificación del mutante constitutivamente fosforilado
CL-BoNTAY71E..
Figura 3.20. SDS-PAGE de la purificación del mutante CL-BoNTAY71W.
Figura 3.21. Actividad del mutante CL-BoNTAY71W.
Figura 3.22. Espectros de CD de CL-BoNTA silvestre y los mutantes CL-BoNTAY71F y
CL-BoNTAY71W.
Figura 3.23. Curvas de desnaturalización térmica mediante CD de CL-BoNTA,
CL-BoNTAY71F y CL-BoNTAY71W.
Figura 3.24. A. Estructura cristalográfica de la CL-BoNTA recombinante. B. Detalle
de la zona de fosforilación por Src. C. Aparición de nuevos puentes de hidrógeno
con la fosforilación por Src.
Figura 3.25. Modelos de los mutantes obtenidos de la CL-BoNTA. A. Y71F. B. Y71E.
C. Y71W.
Figura 3.26. Superposición de las estructuras de CL-BoNTA y CL-BoNTE.
90
Figura 3.27. Ampliación de la zona fosforilable por Src de la superposición de CLBoNTA y CL-BoNTE.
Figura 3.28. Ampliación del centro activo de la superposición de CL-BoNTA y
CL-BoNTE.
Figura 3.29. Modelo de CL-BoNTE unido a su sustrato SNAP-25.
Figura 3.30. Representación esquemática del proceso de internalización celular a
través de los DTPs.
Figura 3.31. Esquema del vector pTAT-HA.
Figura 3.32. Esquema del la estrategia del clonaje.
Figura 3.33. SDS-PAGE de la purificación de la proteína TAT-CL-BoNTA.
Figura 3.34. Western inmunoblot de la proteína TAT-BoNTA.
Figura 3.35. Actividad enzimática de la proteína TAT-BoNTA.
Figura 3.36. Western inmunoblot de la sepración electroforética de SNAP-25
intacto y truncado por CL-BoNTA en extractos del hibridoma F11.
Figura 3.37. Entrada de TAT-BoNTA en cultivo de F11.
Figura 3.38. Entrada de TAT-BoNTA en cultivo de F11.
Figura 3.39. Detección de SNAP-25 en un extracto de PC12.
Figura 3.40. Entrada de TAT-BoNTA en cultivo de PC12.
Figura 3.41. Entrada de TAT-BoNTA en cultivo de PC12.
Figura 3.42. Entrada de TAT-BoNTA en cultivo de PC12 visualizada por microscopía
confocal.
Figura 3.43. La fosforilación de CL-BoNTA aumenta su actividad en cultivo de PC12.
91
Indice de tablas
Tabla 1.1. Proteínas implicadas en el ciclo vesicular.
Tabla 1.2. Dianas de las toxinas botulínicas.
Tabla 3.1. Predicción de estructura secundaria de las CL-BoNTA y E recombinantes
calculada mediante CDnn.
Tabla 3.2. Predicción de estructura secundaria de las CL-BoNTE y f-CL-BoNTE
recombinantes calculada mediante CDnn.
Tabla 3.3. Predicción de estructura secundaria de las CL-BoNTA silvestre y los
mutantes CL-BoNTAY71F y CL-BoNTAY71W calculada mediante CDnn.
92
8
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