Tinción de Gram

PRACTICA i: TINCIÓN DE GRAM
1. OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEORICOS
En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la microbiología, es fundamental la observación de los
microorganismos. Esta observación se hace necesaria para su clasificación e identificación.
Para ello se usa el microscopio tanto óptico como electrónico, y en sus diversas variantes (microscopio de
rayos UV, electrónico de barrido, de contraste de fase, de campo oscuro). Nosotros abordaremos únicamente
el microscopio óptico compuesto de dos lentes (condensador y objetivo).
Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiología se usa preferentemente el objetivo de
inmersión, aunque para visualizar una preparación siempre se recomienda empezar por el objetivo de x10 y
una vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de aumentos.
Al microscopio óptico hay dos formas de ver las preparaciones:
• Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de que las preparaciones son muy
difíciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea.
• Preparaciones fijadas y teñidas con el objetivo de inmersión. Se matan las bacterias, pero son más visibles y
su contraste es superior y de mayor calidad.
Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un método de tinción que se usa universalmente para
distinguir a las bacterias en dos grandes grupos: se trata de la Tinción de Gram. Es una tinción diferencial que
basa su distinción en la estructura diferente de la pared bacteriana de las bacteria Gram + (pared más gruesa, y
una sola capa de peptidoglucano ) y de las Gram− ( pared más delgada y dividida en dos partes). El
procedimiento y sustancias usadas son:
• Colorante básico Cristal Violeta o Violeta de Genciana. Es el primer colorante que se echa sobre el frotis
previamente preparado. Es un colorante selectivo que tiñe a todos los microorganismos. Se deja actuar
durante un minuto y se lava con agua a continuación.
• Lugol. Producto compuesto de yodo y yoduro potásico. Es un mordiente, que intensifica al Cristal Violeta
haciendo que precipite. Se deja actuar un minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se
arrastre el colorante del todo.
• Alcohol 96º. El alcohol retira el colorante de las gram− debido a su diferente estructura de la pared celular
(tamaño de los poros).
• Safranina. Colorante básico diferenciador. Tiñe a las bacterias gram−. Se deja actuar treinta segundos y se
lava con agua.
Como puede verse una vez finalizada la tinción las bacterias gram− estarán teñidas de un color rosáceo, y las
gram+ de un color violeta. Esto sirve para
diferenciarlas claramente al microscopio óptico.
2.DESARROLLO PRÁCTICO.
En primer lugar encendemos el mechero, ya que para realizar cualquier estudio de una muestra bacteriana,
debemos usar la técnica aséptica para evitar la contaminación de la muestra.
Usamos un asa de siembra, aparato fundamental en la preparación de frotis y cultivos. La calentamos al rojo
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en el mechero y a continuación cogemos una gota de agua el asa y la depositamos en el portaobjetos que
previamente habremos preparado. Volvemos a esterilizar el asa y con otra mano abrimos un tubo de ensayo
tapado con un algodón donde se encuentra el inoculo a sembrar. Con cuidado introducimos el asa, evitando
que el asa mate por excesivo calor a los microorganismos, dando unos golpecitos dentro del tubo y mojando el
asa en el tubo un poco.
Cerramos el tubo y colocamos el inóculo en el portaobjetos, haciendo un frotis con él. Fijamos a la llama
cuidadosamente con ligeros pases con el mechero y dejamos secar.
A continuación hacemos la tinción de Gram de la forma antes explicada, usando un barreño para evitar el
desparramamiento de los colorantes y el agua por el laboratorio. Hay que tener cuidado en la cantidad de
colorantes a usar, con una gota suele ser suficiente. Una vez hecha la tinción dejamos secar de nuevo.
Ahora nos dirigimos al microscopio. Preparamos el objetivo de inmersión echando un poco de aceite de cedro
al cubre. Esta gota de aceite crea una fina película entre objetivo y muestra , que disminuye el índice de
refracción de la luz, mejorando la visión de la muestra.
En la practica observamos estreptobacilos, en forma de bastoncillos, algunos de ellos representados con
manchas blancas en su interior que se identificaban con esporas y tétradas de cocos, bacteria de forma
redondeada.
Observamos también a las bacteria lácticas de una muestra de yogur.
Todas las bacterias observadas eran gram+.
MATERIAL USADO
ðUn vaso lavador
ðUn asa de siembra
ðUna gradilla con tubos de ensayo con el microorganismo en medio sólido (Agar como coloide.)
ðUna placa de Petri
ðBarreño para los restos de los colorantes por los lavados
ðPortaobjetos
ðMicroscopio
PRACTICA II: SIEMBRA, RECUENTO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
• OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEORICOS
Esta práctica se caracteriza por ser uno de los procedimientos más usados en un laboratorio de microbiología.
Se trata de la siembra de un inóculo y el posterior recuento y aislamiento de unos microorganismos.
Refiriéndonos a la siembra de un inoculo y su proliferación creando un cultivo hay diversos métodos y
formas. Nosotros nos ceñiremos a cultivos semisintéticos generales. Según el medio físico podemos ver
cultivos:
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• Sólidos: En ellos el coloide se echa en forma de gel que se solidifica más tarde. El agente solidificante suele
ser el agar. El cultivo sólido puede ser en placas de Petri o en tubos de ensayo.
• Líquidos o caldos: Son soluciones acuosas de nutrientes diversos para que proliferen las bacterias.
Como puede deducirse los métodos de siembra para formar colonias solo pueden hacerse en medio sólido, ya
que en medio líquido las bacterias están dispersadas.
Entre los métodos más destacados encontramos:
• Siembra por agotamiento en estrías oblicuas: Con el asa de siembra se coge el material y se hacen estrías en
el agar. A continuación se esteriliza por flameado y se vuelven a hacer estrías cruzadas, con el objetivo de
poner en estas estrías el excedente de las primeras estrías.
• Siembra por agotamiento en zigzag: Con el asa de siembra sembramos el inóculo en zigzag de manera que
conforme avancemos en la placa o el tubo de ensayo habrá menos inóculo y será más fácil luego distinguir
y aislar las colonias.
• Siembra en masa: Es un tipo especial de siembra indicada para el recuento de microorganismos. Se usa una
mezcla de medio de cultivo y agar fundido a 45ºC, donde se echa también una solución de
microorganismos, que deben estar diluidos varias veces anteriormente, ya que luego para contar las
colonias, el número debe estar entre 30 y 300.
Para conocer el factor de dilución exacto que debemos usar en una siembra en masa se hacen varias
diluciones, que se explicaran más tarde en los procedimientos prácticos.
2.DESARROLLO PRÁCTICO.
Para realizar nuestro cultivo partimos de una muestra biológica, concretamente pimentón en polvo. Cogemos
0,1 gramos a un tubo y echamos 9,9ml de agua. Este será el tubo A. Agitamos con el vortex la muestra y
posteriormente ( todo esto en las consabidas condiciones asépticas) cogemos 0,1ml del tubo A con una pipeta.
Lo echamos a un tubo B con otros 9ml de agua. Repetimos la operación echando 0,1ml del tubo B a un tubo C
con 9ml de agua. Repetimos la operación en un tubo D.
En nuestro caso vamos a usar la dilución del tubo C. Como puede verse hemos diluido la muestra en un factor
1/100 en la dilución al tubo A, y un factor 1/10 en las sucesivas diluciones. Para la dilución C el factor de
dilución es igual a 1/10000.
Una vez hecho esto sembramos en masa, como se ha explicado anteriormente, vertiendo el contenido del tubo
C en la placa de Petri, junto con el agar líquido.
Esperamos a que solidifique, y aquí ya podemos contar el número de bacterias refiriéndonos a unidades
formadoras de colonias (UCF). Debemos esperar dos días, incubando la placa a 28ºC.
Obtuvimos 217 UCF, Por lo que multiplicamos por 10.000 ya que es el factor de dilución. Luego
multiplicamos por 10, para obtener las colonias que hay en un gramo, y también multiplicamos por 100 ya
que había 0,1 gramos de pimentón en
10ml. En total nos da 217x105 UCF.
Los resultados de otros grupos fueron:
217 millones; 127 millones; 253 millones; 212 millones; 136 millones;
88 millones; 186 millones.
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Total: 1219
Media: 174,14
Ahora podemos proceder a aislar diversas colonias, para hacerles pruebas bioquímicas, con el fin de descubrir
la especie de la colonia a aislar.
MATERIAL USADO
ðAsa de siembra
ðplaca de Petri
ðUn mechero
ðProbeta con el inóculo
ðProbetas diferentes para hacer las diluciones
ðPimentón
ðAgar fundido como coloide
práctica iii. Pruebas bioquímicas
1.OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEÓRICOS.
Las pruebas bioquímicas son un útil instrumento para el investigador, ya que mediante diferentes
procedimientos de detección de metabolitos o productos de excreción bacteriana, podemos descubrir la
especie bacteriana que estamos observando. Las más utilizadas en el campo de la microbiología son:
1.HIDROLISIS DEL ALMIDÓN.
Esta prueba nos indica si un germen es capaz de hidrolizar o no el almidón.
Esto se debe a la presencia o no de una enzima amilasa. Podremos distinguir entre las bacteria que hidrolizan
almidón y las que no:
ð Si el microorganismo asimila e hidroliza el almidón se verá en la placa de Petri y alrededor de las colonias
un halo negro, violeta o azul (zonas donde no ha llegado la amilasa).
ð Si el microorganismo no hidroliza el almidón, toda la placa de Petri se verá negra violeta o azul, (debido a la
ausencia de amilasas).
Para que se tiña el almidón que queda en la placa se echa lugol que forma un complejo de color negro, violeta
o azul.
El agar en el que se inocula el germen es un agar nutritivo compuesto de:
−Pectona como fuente de nitrógeno.
−ClNa como fuentes de sales.
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−Extracto de carne como fuente de carbono (levadura)
−Agar
−Agua
Junto con un Agar almidón compuesto de (En 100ml):
−2 gr. agar
−0,2 gr. de almidón
−97,8 ml. De agua.
• USO DE LA GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO:
Esta prueba se basa en los productos que surgen como resultado del metabolismo de la glucosa. Se usa un
caldo nutritivo, con glucosa como fuente de carbono, y también pectonas. A la glucosa se le añade el púrpura
de bronocresol que le da diferentes colores al cultivo según sea el pH, es decir, si como resultado del
metabolismo no se crean ácidos, baja el pH y el color que se ve es púrpura. A pH neutro el color es violeta y a
pH alcalino es color es amarillo ( no hay secreción de ácidos)
Además, en el cultivo en probeta, añadimos una campana de Durhan para saber si la fermentación de Durham
produce gas. Si produce gas, en la campana habrá una burbuja, si no produce gas no habrá burbuja.
• TEST DE VOGES−PROSTKAUER:
Esta prueba se basa en dos rutas del metabolismo de la glucosa que usan diferentes tipos de bacterias. Las
rutas son la fermentación ácido−mixta con un intermediario que es la acetoína, y la fermentación 2´, 3´
butanoldioica, que no produce acetoína como producto intermediario.
ð Si la bacteria sigue la ruta de fermentación ácido−mixta, el pH final será ácido ya que formará diversos
ácidos orgánicos como láctico, succínico y acético, con lo que la concentración de hidrógeno se igualará a la
del dióxido de carbono.
Al echar una solución A (ððnaftol) al tubo de cultivo y más tarde una solución B (KOH al 40%), el líquido de
la probeta formará un precipitado y se volverá de color rojo ladrillo. Este precipitado se forma al reaccionar la
acetoína con los reactivos de las soluciones, que dan diacetilo, que se une a la guanilina de la pectona que
llevaba el cultivo, dando el consabido color rojo ladrillo.
ð Si la bacteria sigue la otra ruta, el cultivo permanecerá del mismo color que tenía, ya que al no poseer
acetoína, no reacciona con los reactivos usados.
Su pH será neutro y la concentración de dióxido de carbono será mayor que la de hidrógeno.
2.DESARROLLO PRÁCTICO.
Antes de todo, habremos aislado una colonia, sembrandola en zigzag en una placa de Petri con agar nutritivo
(12ml) y agar almidón por encima (8−10ml), incubándolo durante 48 horas a 24 ºC, para la prueba del
almidón. Para las otras pruebas bioquímicas, se verá en cada apartado por separado.
1.HIDROLISIS DEL ALMIDÓN:
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En la placa de Petri que habíamos preparado añadimos el lugol para ver si la bacteria es amilasa+. En nuestro
caso se veían halos negros alrededor de las colonias, por lo tanto nuestra especie es amilasa+.
2. USO DE LA GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO:
Al caldo nutritivo que habíamos formado se le añade un inóculo de la probeta donde teníamos el cultivo
bacteriano (siempre con la técnica aséptica).
El caldo inoculado se incuba durante 24 horas. En nuestro experimento se produjo ácido y el color viró a
púrpura, por tanto nuestra bacteria es ácido+.
Además en la campana no se veía burbuja de gas y por tanto la especie era gas−.
• TEST DE VOGES−PROSTKAUER:
En un tubo de hemolisis y en un medio de Voges−Prostkauer con glucosa como fuente de carbono y como
indicador, rojo de metilo.
Ahora inoculamos, con la consabida técnica aséptica, en el tubo e incubamos a 28ºC durante 72 horas. Una
vez pasado el tiempo, se le aplica al tubo el reactivo A, se mezcla por inversión, y después se añade el reactivo
B.
En nuestro caso obtuvimos un precipitado de color rojo ladrillo, por tanto esta bacteria sigue la ruta de
fermentación ácido−mixta.
Viendo el resultado de las pruebas bioquímicas y sus características físicas del cultivo, que habíamos
observado en el microscopio, previa tinción de Gram.
La bacteria era elipsoidal, con la espora central, que no deformaba a la bacteria.
Las especies posibles son Bacillus cereus, Bacillus subtitulus y Bacillus lidieniferuns.
MATERIAL USADO.
ðProbeta con el cultivo
• Placa de Petri con Agar almidón y Agar nutritivo
• Medio nutritivo con glucosa en un tubo
ðCampana de Durham
ðTubo con medio Voger−Prostkauer
ðReactivo A (ð−naftol)
ðReactivo B (KOH al 40%)
ðAsa de siembra
ðMechero
ðIncubadora
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práctica iv. Antiobiograma
1.OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Los antibiogramas nos sirven para conocer la diferente sensibilidad que tiene un microorganismo a diversos
antibióticos. El antibiograma se hace en una placa de Petri con un medio Müeller−Hinton, donde los
antibióticos se propagan de forma homogenea por toda la placa con una concentración decreciente conforme
se va propagando el antibióticos.
Los antibioticos estan embebidos en discos de papel. El modelo, para conocer cada antibiótico es:
Ej: TOB 10. TOB representa las siglas del antibiótico, en este caso es Tobramicina y el número 10 representa
los microgramos de antibiotico que hay en ese disco. Para saber si una bacteria es sensible o no a un
antibiótico debemos conocer el diametro mínimo de la calva que produce en el cultivo bacteriano. Si este
diametro es mayor del indicado para cada antibiotico la bacteria es sensible a éste.
Los antibióticos pueden ser bacteristáticos (inhibe el crecimiento bacteriano) o bactericída (destruye al
microorganismo).
Para sembrar el cultivo en la placa de Petri usaremos un asa de Drigalsky, de forma especial, que reparte
uniformemente el cultivo por toda la placa.
2.DESARROLLO PRÁCTICO
Un cultivo puro de bacterias patógenos que ha sido incubado durante 18−24 horas a 37ºC se inocula en una
Placa de Petri en un medio Müeller−Hinton, siempre con técnica aséptica. Vamos a poner cinco discos de
antibioticos diferentes, colocadas de forma equidistante en la placa. En nuestros casos los antibioticos son:
1. CRO 30. Ceftriazone. Halo de sensibilidad >18mm
• ATM 30. Aztreonam. Halo de sensibilidad >18mm
• MA 30. Cefamandol. Halo de sensibilidad >18mm
• C 30. Clorafenicol. Halo de sensibilidad >18mm
• CAZ 30. Celtazidime. Halo de sensibilidad >18
Hay que recordar que si el halo o calva producido es menor del 10% de la distancia de cada antibiótico el
microorganismo es resistente.
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