Tema VI. Conservación a nivel genético
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Tema VI. Conservación a nivel genético (continúa…) Consecuencias genéticas en poblaciones pequeñas y especies amenazadas Deriva génica Entrecruzamiento Fragmentación y flujo genético Tamaño poblacional efectivo (Ne) Manejo genético de poblaciones en cautiverio y en jardines botánicos Jerarquía y procesos en los diferentes niveles de los sistemas ecológicos 1 2 1 Origen de la variación • La variación en cualquier sistema de caracteres, refleja una combinación de factores ecológicos, genéticos e históricos 2 INDIVIDUAL Ontogenética Clases de edades o sexos Cambios en el ambiente Constitución genética Diferencias en el hábitat Diferencias sociales POBLACIONAL Transformaciones climáticas temporales Cambio de la densidad o estructura demográfica Constitución genética Para entender las consecuencias genéticas en poblaciones pequeñas y especies amenazadas La diversidad genética es uno de los atributos más importantes de las poblaciones. Conocerla tiene aplicaciones importantes en la conservación de las especies. La reducción de la diversidad genética causa un aumento en la homocigosidad y la expresión de alelos deletéreos recesivos Consecuentemente, aumenta la depresión por endogamia y reduce la viabilidad de los individuos y de la población a adaptarse conduciendo a la extinción 3 ¿Qué es la diversidad genética? ¿Cuál es su origen? ¿Cómo la detectamos? ¿Cómo se mide? Amos, W. & A. Balmford. 2001. When does conservation genetics matter? Heredity 87: 257-265. Frankham, R., J. D. Ballou, D. A. Briscoe. 2004. A primer of Conservation Genetics. Cambridge University Press. Frankham, R. 2005. Genetics and extinction. Biological Conservation 126: 131-140 Frankham, R. 2005. 2008. Genetic adaptation to captivity in species conservation programs. Molecular Ecology 17: 325-333 Freeland, J. R. 2005. Molecular Ecology. John Wiley and Sons, Ltd. Gillespie, J. H. 1998. Population Genetics: a concise guide. The Johns Hopkins University Press. González, D. 1998. Marcadores moleculares para los estudios comparativos de la variación en ecología y sistemática. Revista Mexicana de Micología 14: 1-21. Sunnucks, P. 2000. Efficient genetic markers for population biology. TREE 15: 199-203 Qué es? Diversidad génetica 4 Cheetah (Acinonyx jubatus) Ejemplo de la importancia de la variación genética en la sobrevivencia a largo y corto plazo Diversidad genética problemas fisiológicos 5 La incorporación de la genética en la conservación surgió por el efecto adverso de la endogamia en la reproducción y sobrevivencia de las especies en poblaciones pequeñas y fragmentadas 3 No. total animales considerados Padres no relacionados 4 21 22 7 Ejemplos del grado de variación genética en especies raras o en peligro 6 Qué es la conservación a nivel genético? Es la disciplina que hacer uso de la teoría y técnicas de la genética para reducir el riesgo de extinción de especies amenazadas, y a largo plazo….. conservarlas como entidades dinámicas capaces de mantenerse a través de cambios ambientales. Se enfoca en poblaciones pequeñas o que están disminuyendo en número. Su objetivo es conocer aspectos genéticos de las especies que sean relevantes para su manejo Por ejemplo: 1. Los efectos de la endogamia en la reproducción y sobrevivencia 2. Las incertidumbres taxonómicas 3. La definición de las unidades de manejo dentro de las especies 7 ……… 5. La pérdida de la diversidad genética y la habilidad de adaptarse en respuesta a cambios ambientales 6. La acumulación de mutaciones deletéreas 7. El efecto de la adaptación al cautiverio sobre el éxito de la reintroducción a habitats naturales 8. La identificación de las huellas genéticas de las especies para la ciencia forense (litigios) Por qué es importante conservar la diversidad a nivel genético? Necesaria para adaptarse a cambios ambientales inducidos por el hombre o por desastres naturales 8 Qué es? Diversidad génetica Se describe en términos de frecuencias alelicas, número de alelos y heterocigosidad Cuál es su origen? 9 POLIMORFISMO Alteraciones en el ADN Variación genética A nivel de nucleótidos indel His Thr Phe Gly Lys Gln Gly ? ? Leu Trp Tyr ? (a) CAC ACA TTT GGA AAA CAG GGT C -- TGT GGT ATA (b) CAC ACA TTC GGA AAA CAG GTT CTT TGT GGA ATA His Thr Phe Gly Transición sinónima Lys Gln Val Leu Cys Stop Ile Transversión Transversión No-sinónima No-sinónima (con sentido) (sin sentido) 10 Otras fuentes: Variación genética A nivel de segmentos de ADN Inversión Translocación Duplicación Deleción Variación genética A nivel de cromosomas Cadenas homólogas Entrecruzamiento Recombinación Cromosomas homólogos 11 Variación genética A nivel de cromosomas Euploidía Aneuploidía Un juego entero de cromosomas se duplica una o varias veces Uno o más cromosomas de un juego normal se pierden o están presentes en más de su número normal de copias. Monoploidía Trisomía Pérdida de un juego Poliploidía Monosomía Enzimas de reparación Endonucleasas Exonucleasas Polimerasas ligasas Reparación incorrecta MUTACION 12 Cuál es la base de la variación genética en la población? La frecuencia y fijación de las mutaciones Mutación * Selección y deriva genética * Genoma o gen muestreado Mutaciones en el linaje (fuente de variación dentro y entre especies) Las mutaciones que observamos: Dependen del organismo * * Algunas ADN polimerasas son más eficientes en corregir errores Hay diferencias en la reparación de genes Algunos organismos tienen tasas de mutación extremadamente altas. Dependen de la posición en el genoma Regiones con nucleótidos repetidos más susceptible a errores durante la replicación (“slippage”) Dependen del ambiente Presencia de mutágenos 13 * * En forma natural, la tasa de mutación es baja Pero, otros factores como pocos individuos en poblaciones pequeñas promueve la fijación de mutaciones perjudiciales para la población Cómo lo detectamos? 14 Cómo se descubren los procesos que están afectando a la población? Explorando la constitución genética de los individuos de la población GCGGCCCA GCGGCCCA GCGTTCCA GCGTCCCA GCGGCGCA TCAGGTAGTT TCAGGTAGTT TCAGCTGGTT TCAGCTAGTT TTAGCTAGTT GGTGGCCCGT GGTGG---GT GGTGGCCCCT GGTGGCCCGT GGTGA---GT Propiedades de los marcadores moleculares Polimórfico Codominante Frecuente Distribuido ampliamente en el genoma Reproducible De ensayo rápido y sencillo De fácil acceso 15 Técnicas para detectar la variación genética Actualmente es fácil conocer la variación genética usando datos moleculares de muchos loci para muchos individuos y para muchas poblaciones! Características: Clases de marcadores: ADN o proteínas Información de la secuencia de ADN: necesaria o no Origen del marcador: Producto de extracto celular (ADN, ARN, enzima) Producto de amplificación de ADN Secuencia de ADN Variación genética: por longitud o por nucleótidos Cobertura genómica, número de loci que detecta: Un solo locus loci múltiples Fenotipo del marcador: dominante o codominante 16 PROTEÍNAS 28% monómeras 47% dímeras 4% trímeras 24% tetrámeras 1% octámeras substrato enzima producto Complejo enzina-substrato enzima glicólisis ATP Glucosa-6-fosfato ADP Fructuosa-6-fosfato 17 ELECTROFORESIS DE ISOENZIMAS ZIMOGRAMA PARA UNA ENZIMA CON UN LOCUS Y DOS ALELOS heterocigotos genotipo AA AB AB a AB aa AB aaaa aab aaab ab b bb BB aaa aabb abb abbb bbb bbbb subunidades polipeptídicas producidas por alelos A ó B monomérica dimérica trimérica tetramérica (intensidad 1:4:6:4:1 si A y B producen concentración similar) 18 Extracción y purificación de ADN PCR PCR-RFLPs RFLPs RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) ENZIMAS DE RESTRICCION 5' 3' G AA T T C 3' 5' C T TA A G Eco RI C C GG 3' GGCC Hpa II CAA T T G Hpa I m 5' G TT AA C m 3' 5' C C GG G GCC Msp I isosquizómero de Hpa II 19 Población de líneas diploides derivados de F1 Población de individuos F2 Loci RFLP en poblaciones segregantes. A) población de líneas diploides derivadas de F1 en Brassica napus. Cada línea es característicamente homocigota para uno u otro alelo en el locus RFLP. B) Locus RFLP estudiado en una población segregante F2. Además de los genotipos homocigotos para uno u otro alelo, se identifican también los heterocigotos. P = línea parental homocigota RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Rubus nessensis (asexual) vs. R. idaeus (sexual) 20 T A X A m X YZ XY Z X Y Z enzima 1 enzima 2 enzima 3 A) gel B) taxa 1 enzima 1 2 3 4 5 6 7 enzima 2 8 9 10 11 enzima 3 12 13 14 15 X 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 Y 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 Z 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 AFLPs Eco RI 5' 3' Mse I G AAT T C T TAA C T TA A G AAT T 3' 5' El ADN se digiere con dos enzimas de restricción diferentes 21 AFLPs iniciador + 1 base 5' A Primera amplificación selectiva AAT T C N A B C A B C NT TA adaptador adaptador N AAT T TAA G N C 5' iniciador + 1 base iniciador + 3 bases AAC 5' Segunda amplificación selectiva AAT T C A GTTA T TAA G T C AAT AAC 5' iniciador + 3 bases Eco RI (un corte cada 4096 pb) MseI MseI MseI MseI MseI MseI Mse I (un corte cada 256 pb) MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI MseI EcoRI MseI MseI EcoRI EcoRI EcoRI MseI MseI MseI EcoRI MseI MseI MseI MseI MseI MseI EcoRI MseI MseI MseI EcoRI EcoRI MseI Solo un subjuego específico de productos de digestión se amplificarán, usando combinaciones selectivas de primers 22 AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) * polimórficos Black Robin Individuos casi idénticos! Bush Robin 23 SSR- microsatélites Son secuencia específicas de mono, di, tri, o tetra nucleótidos repetidos en tandem Por ejemplo: AAAAAAAAAAA se refiere como (A)11 GTGTGTGTGTGT se refiere como (GT)6 CTGCTGCTGCTG se refiere como (CTG)4 ACTCACTCACTCACTC se refiere como (ACTC)4 También se conocen como, short tandem repeats (STR) o short sequence tandem repeats (SSTR) SSR- microsatélites Individuo 1 (solo una cadena de cada GTACTAGGCTCTCTCTCTGGATCC cromosoma)CT5 Individuo 2 GTACTAGGCTCTCTCTCTCTGGATCC CT6 Individuo 3 GTACTAGGCTCTCTCTCTCTCTGGATCC CT7 Son altamente polimórficos. En una población pueden existir muchos alelos en un solo locus de microsatélite (hasta 20 en humanos) 24 Dónde se encuentran? La mayoría se localizan en cualquier parte del genoma en regiones no codificadoras locus microsatélite alelos homocigoto …CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC… …CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC… Cromosomas homólogos alelos heterocigoto …CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC… …CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC… 25 MICROSATELITES (Short Tandem Repeats) (Short Single Repeats) ACC TGCT 26 Secuencia de tres genotipos: A 1A 1 A 1A 2 A2A 2 CACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGT CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT (CA)7 (CA)9 27 • La secuenciación mejoró cuando: – Se incorporaron ddNTPs fluorescentes – Se introdujo la secuenciación de capilar • Capilares vs geles – Capilares más rápidos – Más automatizado 28 ALINEAMIENTO ¿ Cómo se mide el grado de diversidad genética dentro de las especies ? 29 Descriptores básicos para cuantificar los patrones de variación genética dentro y entre las poblaciones Identificar genotipos Identificar alelos Determinar la frecuencia alelica en cada locus (frecuencia génica) Análizar estadísticamente los datos; determinar la asociación de alelos (dentro y entre loci) Inferencias de la diversidad genética como la estructura de la población y los procesos evolutivos que la afectan (deriva genética, endogamia, flujo genético, cuello de botella etc.) Por qué nos interesa medir la variación genética? Conservación, manejo, uso eficaz de los recursos genéticos, evolución • La población ha experimentado cuello de botella en el pasado? • Hay flujo génico entre poblaciones? • Hay endogamia en la población; qué impacto tiene? • Las poblaciones aisladas geográficamente están relacionadas genéticamente? • Cuáles son los progenitores de ciertos individuos? etc.. 30 ... Genética de poblaciones Estudiar las fuerzas evolutivas que resultan en cambios genéticos en las especies a través del tiempo Conocer y caracterizar el grado de variación genética dentro de las especies NO es posible conocer la estructura genética de las poblaciones! t1 = x t2 = y 31 Cómo se investiga? Se ignora la complejidad de las poblaciones reales y se enfoca únicamente en la variación de uno o pocos loci en un tiempo específico y en una población que se asume en equilibrio Modelo: población ideal en equilibrio Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4 Tiempo t ... t+1 ... t+2 ... .. . , apareamiento al azar, no migración, mutación o selección poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg 32 El modelo de la población ideal es irreal. Las desviaciones significativas en las frecuencias alélicas son una indicación de la violación de una o más de las suposiciones de este modelo. Por lo tanto, intuimos que están actuando procesos naturales o inducidos que afectan la población. Procesos evolutivos Mutación Recombinación Flujo genético Deriva génica Selección Cambios al azar en el ADN Rearreglo de los alelos asociado con meiosis y/o mitosis Movimiento de nuevos alelos en las poblaciones Cambios en la frecuencia alélica debidos al azar Cambios en las frecuencias alélicas debido a diferencia en la reproducción y sobrevivencia 33 Cómo se detecta el efecto de esos procesos? – A través de marcadores cuya presencia común sea indicadora de conexión ontogenética, genética o histórica Cómo afectan los procesos evolutivos a las poblaciones? Reproducción sexual Mutación + Flujo génico Diversidad genética - Diversidad genética Endogamia Deriva génica Tamaño pequeño de la población Ne Pérdida inmediata de alelos Deriva génica Cuello de botella Ne Variación en el éxito reproductivo, radio desigual de sexos 34 Dos niveles de análisis a. Una población i. Programas de investigación muchas veces interesados en una población (conservación, prevención de enfermedades, etc.) ii. Es importante caracterizar primero la población antes de hacer comparaciones entre varias poblaciones b. Varias poblaciones Parámetros genéticos estándar para un análisis de diversidad genética poblacional Diversidad alélica (A) Proporción de loci polimórficos (P) Frecuencia génica Heterocigosidad observada (H0) Heterocigosidad esperada (HE) Número efectivo de alelos [AE = 1/(1-HE)] Indice de fijación (FIS) Diversidad génica dentro de la población (HI) Diversidad media dentro de la población (Hs) Diversidad total (HT) 35 Parámetros genéticos estándar para un análisis de diversidad genética entre poblaciones Basada en el número de variantes • Polimorfismo o tasa de polimorfismo (Pj) • Proporción de loci polimórficos • Número de alelos y riqueza alélica Basada en la frecuencia de los variantes • Promedio esperado de heterocigosidad (He; Nei’s genetic diversity, etc.) Wright’s F statistics (Wright) Diferenciación entre poblaciones para un locus Diferenciación entre poblaciones para varios loci (gST) (GST) Contribución genética total Análisis de la población a la diversidad de varianza molecular (AMOVA) 36 Eider ducks glucose phosphate isomerase F S …67 genotipos FF observados 37 1) Frecuencias genotípicas 0.552 (proporción ej. 37/67=0.552) para.. Frecuencia alélica FS SS Total 24 0.358 6 0.090 67 1.00 2 alelos pyq diploides Cada homocigoto porta 2 copias del mismo alelo p(A) = [2(AA) + (Aa)]/2n Cada individuo porta 2 alelos por locus 37 genotipos observados 2) Frecuencia alélica P= (2 x FF) + FS 2 x total FF FS SS Total 37 24 6 67 2 alelos P= pyq diploides (2 x 37) + 24 = 0.73 2 x 67 q=1-p q = 0.27 3) Diversidad alélica (A) = promedio del número de alelos por locus A = (2 + 3 + 2 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 +1) = 1.4 10 Es la suma de todos los alelos detectados en todos los loci, divididos por el número total de loci 38 alozimas genotipos observados FF FS SS Total 37 24 6 67 4) Heterocigosidad observada (Ho): 24/67 = 0.36 Entre poblaciones: 5) Hererocigosidad promedio (H) Ej: H= (0.36 + 0.2 + 0.1 + 0.0 + 0.1 + 0.0 + 0.08) = 0.12 7 Para saber si la población esta en equilibrio… Frecuencias genotípicas esperadas , apareamiento al azar, no migración, mutación o selección + A1 p A2 q A1 p A2 q p2 pq A1 A1 A1 A2 pq q2 A2 A1 A2 A2 poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg A1 A1 2A1 A2 A2 A2 p2 + 2pq + q2 = (p + q)2 = 1 Si la frecuencia de los alelos A1 y A2 es 0.9 y 0.1 Las frecuencia genotípicas esperadas en equilibrio Hardy-Weinberg son: 0.92 + 2 x 0.9 x 0.1 + 0.12 = 1.0 39 Las frecuencias observadas se comparan con las esperadas bajo EHW genotipos FF Observados 37 p2 Frecuencias esperadas 0.732 0.5329 0.552 observadas Genotipos esperados 35.7 (Frecuencias esperadas X 67) FS SS Total 24 2pq 2x0.73x0.27 0.3942 0.356 6 q2 0.272 0.0729 0.090 67 1.00 1.00 1.00 26.4 4.9 67 Esta en equilibrio! SSRs de maiz Locus 1 Locus 2 Locus 3 tamaño (pb) Intensidad (unidades ABI) 2 alelos 2 alelos 3 alelos 40 Cuando hay más de dos alelos (microsatélites Tarr et al, 1998): primer A1 ...GATAGCTTGAGAGAGAGAGAGACTATTG... ...CTATCGAACTCTCTCTCTCTCTGATAAC... A2 ...GATAGCTTGAGAGAGAGAGACTATTG... ...CTATCGAACTCTCTCTCTCTGATAAC... A3 ...GATAGCTTGAGAGAGAGAGACTATTG... ...CTATCGAACTCTCTCTCTCTGATAAC... Cuando hay más de dos alelos (microsatélites Tarr et al, 1998): Heterocigosidad esperada He=1- pi2 pi es la frecuencia del alelo ith Tres alelos en un locus He=1-[(p1)2+(p2)2+(p3)2] He=1-[(0.364)2+(0.352)2+(0.284)2] He=0.663 41 El grado de desviación al EHW indica que hay factores externos que afectan a la población La desviación se determina con indicadores de bondad de ajuste (goodness-of-fit, X2, G -test), para comparar los resultados observados contra los esperados, lo que indicará si las diferencias se deben al azar o no Las desviaciones a las frecuencias genotípicas esperadas bajo el HWE, nos permiten detectar procesos evolutivos que afectan a la población (ej. endogamia, fragmentación de las poblaciones, migración, selección, etc.) 42 Análisis básico de la diversidad genética 1. Descripción de la variación dentro y entre poblaciones 2. Cálculo de relaciones genéticas entre individuos o poblaciones Individuos M a t r i z 01 1 0 1 1 0 1 d e 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 d a t o s 1 0 0 0 1 1 02 03 04 01 0 02 0.56 0 03 0.33 0.33 0 0.47 0.26 0.50 0 05 0 0 1 1 0 0 04 1 1 1 0 0 0 05 0.32 0.43 0.37 0.28 0 1 0 1 0 1 1 06 0.33 0.56 0.56 0.37 0.46 06 0 Ind5 3. Expresión de las relaciones Ind3 Ind6 Ind4 Ind2 Ind1 AMOVA (Excoffier et al, 1992) Análisis jerárquico de varianza. Separa y prueba niveles de diversidad genética •Diversidad entre grupos de poblaciones •Diversidad entre las poblaciones dentro de grupos •Diversidad entre los individuos dentro de una población 43 Los niveles jerárquicos de la diversidad génica en un AMOVA pueden incluir: 1. Continentes 2. Regiones geográficas dentro de un continente 3. Areas dentro de una región 4. Poblaciones dentro de un área de una región 5. Individuos dentro de una población en un área de una región algunos programas para análisis 44 Ejercicio 1… 45
