ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DEL SEMEN Y SU IMPLICACIÓN EN LA ESTERILIDAD CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA 2011-2012 ACTUALIZACIONES EN EL LABORATORIO CLÍNICO Nº 7 I.S.S.N.- 1988-7477 Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: mayo de 2012 Estudio microbiológico del semen y su implicación en la esterilidad. Mª Teresa Gil Ruiz (1), Mª Sagrario Díaz Merino (2), Alicia Beteta López (1), Lorena Vega Prado (1), J. Ismael Linde Rubí (1).- (1) Facultativos Especialistas de Área. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital General Ntra. Sra. del Prado de Talavera de la Reina. Toledo.(2) Facultativo Especialista de Área. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Nacional de Parapléjicos. Toledo. 1.- INTRODUCCIÓN. Las glándulas anexas del aparato genital masculino engloban un grupo de estructuras con función exocrina y capacidad reservoria, que están unidas al aparato urinario por vías comunes que desembocan en la uretra. En ellas se producen y secretan, entre otras, sustancias de gran valor energético, lo que explica la apetencia de los microorganismos por dichas estructuras. Por tanto, las glándulas anexas masculinas son estructuras favorables para la colonización y asentamiento bacterianos. Por ello, disponen de mecanismos de defensa generales (macrófagos, anticuerpos) y específicos (fosfato de espermina, iones, zinc) que tratan de impedir la invasión. Por otra parte, las células prostáticas poseen receptores reconocidos por las adhesinas específicas de ciertas bacterias. Estas adhesinas tienen la capacidad de unirse al epitelio del huésped, constituyendo el primer paso de la colonización. Posteriormente se produce el fenómeno citotóxico, que explica su acción inflamatoria. 772 De este modo, la infección se inicia en un punto concreto, para extenderse posteriormente. Dependiendo de la virulencia del agente invasor y del tiempo transcurrido desde el inicio de su acción, se encontrarán signos y síntomas clínicos más o menos concretos. El diagnóstico microbiológico de la patología infecciosa de la vía seminal es complejo y su influencia sobre la esterilidad es todavía hoy motivo de debate. La exacta relación que existe entre infección de la vía seminal y la esterilidad no está del todo clara, pero se ha llegado a estimar por diversos autores que entre el 15 y el 30% de las parejas estériles pueden tener esta etiología (1). La presencia de gérmenes en la próstata, vesículas seminales, conductos deferentes, epidídimo y testículo, puede originar procesos inflamatorios de tipo obstructivo, disfunciones secretoras glandulares y alteraciones de la funcionalidad espermática por adherencia de los microorganismos al espermatozoide o por el desarrollo de anticuerpos antiespermatozoide (2). No obstante, esto no sucede siempre, pues se ha demostrado la normalidad de los parámetros seminales de individuos afectos de infecciones del aparato genital. No obstante, algunos autores han sugerido que el hecho de no encontrar alteración de éstos, no indica que la capacidad funcional de los espermatozoides no se encuentre comprometida, ya que tanto las bacterias como sus productos y el incremento de la peroxidación durante la infección, podrían ocasionar cambios bioquímicos y moleculares en la membrana espermática, que afectan la reacción acrosómica y su capacidad de fusión con el ovocito, así como daños en el ADN espermático (3) (4). 773 La infección de la vía seminal puede afectar: La propia vía seminal El espermatozoide El plasma seminal El aparato genital femenino pudiendo producir alteraciones en la concentración espermática (azoospermia, oligozoospermia), en la calidad espermática (astenozoospermia, teratozoospermia, alteraciones en la licuefacción del semen, disminución de los parámetros bioquímicos del eyaculado, alteraciones del pH y presencia de anticuerpos antiespermatozoide (AAE))y en el volumen del eyaculado (hipospermia), así como la detección de sémenes leucocitospérmicos (5) o con hematíes (hemospermia). La complejidad diagnóstica de las infecciones de la vía seminal se debe a la propia estructura anatómica, que dificulta el acceso directo a los órganos y por tanto a la extracción de una muestra para analizar. El cultivo de semen es el punto de partida para iniciar estudios microbiológicos complementarios y poder localizar el órgano afectado. En muchas ocasiones el diagnóstico microbiológico precisa de la comparación de los hallazgos en orina, semen, secreción prostática y frotis uretral, como más adelante veremos. 2.- INDICACIONES PARA LA REALIZACIÓN DE UN SEMINOCULTIVO Al ser una prueba opcional, según OMS (1999) (6), se indicará el cultivo del semen en las siguientes situaciones: 774 1) Hipospermia y/o pH < 7.0 2) Hemospermia 3) Alteraciones en la licuefacción 4) Presencia de leucocitospermia (> 106 leucocitos/mL) o aumento de elastasa granulocitaria en líquido seminal 5) Presencia de aglutinaciones espontáneas de los espermatozoides en el eyaculado, que pueden estar en relación con la existencia de AAE en el semen 6) Marcada astenozoospermia 7) Marcada oligozoospermia 8) Teratozoospermia 9) Descenso de los marcadores prostáticos (fosfatasa ácida, ácido cítrico), de vesículas seminales (fructosa) o epididimarios (carnitina). En ocasiones una infección puede causar una disminución considerable de la función secretora, pero a pesar de esto la cantidad total del marcador o los marcadores presentes todavía pueden estar dentro del amplio rango de normalidad. La infección también puede producir un daño irreversible del epitelio secretor, de modo que incluso después del tratamiento, la capacidad secretora aún será baja. 10) Antecedente de infecciones urogenitales o de las glándulas accesorias con datos actuales de posible infección de la vía seminal 11) Inclusión en programas de Reproducción Asistida 775 3.- TÉCNICA DE RECOGIDA DE LA MUESTRA El cultivo del semen puede contribuir a establecer el diagnóstico de infección de las glándulas accesorias masculinas, tanto por gérmenes aerobios como anaerobios. Las muestras de semen que se han de cultivar han de recogerse con precauciones específicas para que no se contaminen. El paciente deberá mantener de 5 a 7 días de abstinencia sexual (6). Según expone la OMS en su reciente y quinta edición sobre el examen y procesamiento del semen humano (2010) (7), antes de obtener la muestra, el paciente debe orinar. Inmediatamente después, deberá lavarse las manos y el pene con jabón. A continuación deberá secarse con una toalla limpia. Se obtendrá la muestra de semen mediante masturbación y se recogerá en un frasco estéril de tapón de rosca. El tiempo entre la recogida de la muestra y el procesamiento microbiológico nunca excederá las tres horas (8). 4.- METODOLOGÍA: GÉRMENES Y MEDIOS DE CULTIVO. 4.1.- Procesamiento del semen: El cultivo del semen ha de realizarse antes de cualquier otra petición para evitar contaminaciones de la muestra. Las muestras de semen han de sembrarse en medios de cultivo con asas calibradas estériles dentro de las tres primeras horas desde la recogida de la muestra (6) (7). El recuento de UFC/mL viene dado por el calibre del asa utilizada en la siembra de los medios de cultivo. 776 En manuales anteriores de la OMS (8) (9), el sembrado del eyaculado era también posible mediante dilución de la muestra con tampón fosfato o agua destilada en proporción 1:1, sembrando 0,05 mL en cada uno de los diferentes medios. El número de colonias observadas se multiplica por 40, obteniéndose el número de UFC/mL. La limitación de esto último, viene dada por la necesidad de utilizar la muestra de semen para otros fines como seminograma, técnica de recogida de espermatozoides móviles, o inclusión en programas de inseminación intrauterina. 4.2.- Microorganismos: Según el manual de procedimientos de la Sociedad Americana de Microbiología (10), los microorganismos asociados más frecuentemente a las infecciones del tracto genital masculino son: SÍNDROME Epididimitis Orquititis Abscesos prostáticos Prostatitis GERMENES Chlamydia trachomatis Enterobacteriaceaea Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas sppa Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Staphylococcus aureus Anaerobios Escherichia coli Enterobacter spp. Enterococcus spp. Klebsiella spp. Neisseria gonorrhoeae Proteus spp. Pseudomonas spp. Serratia spp. Anaerobios Uretritis Chlamydia trachomatis Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Neisseria gonorrhoeae Mycoplasma genitales Nota: Cuando se asocia una historia de absceso o se tiene una muestra de aspirado del absceso es aconsejable la búsqueda de microorganismos anaerobios (Bacteroides spp.). a Asociados frecuentemente a varones de más de 35 años de edad. 777 4.3.- Medios utilizados: Los microorganismos que deben buscarse en un examen microbiológico de semen incluyen, por tanto: bacterias aerobias, anaerobias, levaduras, micoplasmas, clamidias y protozoos (Trichomonas), porque además de tener en cuenta los cuadros más frecuentes en el hombre, hay que considerar que muchas veces la presencia de bacteriospermia se detecta en varones asintomáticos y que el semen puede ser el vehículo de transmisión de ciertas infecciones al aparato genital femenino. 4.3.1.- Bacterias: 4.3.1.1.- Agar sangre: incubación a 37ºC y en atmósfera de CO2. Medio no selectivo que permite el crecimiento de cualquier tipo de microorganismo como estafilococos, estreptococos, enterobacterias, Pseudomonas spp. 4.3.1.2.- Agar chocolate: incubación a 37ºC y en atmósfera de CO2. Búsqueda de microorganismos del tipo de Haemophilus spp. 4.3.1.3.- Agar McConckey: incubación a 37ºC al aire. Crecimiento de bacilos Gram negativos. Este medio contiene sales biliares y cristal violeta para inhibir el crecimiento de los Gram positivos y el rojo fenol para diferenciar los bacilos Gram negativos fermentadores de la lactosa (BGNF) que aparecen con colonias rojo-rosas, de los no fermentadores (BGNNF), que dan lugar a colonias transparentes en el medio. 4.3.1.4.- Medio de Thayer-Martin: incubación a 37ºC y en atmósfera de CO2. Se utiliza para la búsqueda de Neisseria gonorrhoeae. Este medio es una variedad de agar chocolate suplementado con antibióticos del tipo de vancomicina, colistina, trimetropim/sulfametoxazol (TMP/SMX) para inhibir las bacterias Gram (+) y (-) y nistatina para inhibir el crecimiento de hongos. A veces, requieren la incubación durante 778 48 horas. Las colonias del gonococo son redondas, pequeñas grisáceas y brillantes y al realizarles una tinción de Gram se observan cocos Gram negativos. 4.3.1.5.- Agar V: incubación a 37ºC y en atmósfera de CO2, 48-72 horas. Investigación de Gardnerella vaginalis. Aunque no está clara la relevancia clínica de su presencia en el tracto genital masculino y en el semen, debido a la producción de vaginosis en la mujer por contagio sexual, el cultivo de semen en placas de agar V es rutinario en los laboratorios. Las colonias en el agar V son opacas, grises y rodeadas de un halo de beta-hemólisis, pues Gardnerella tiene la propiedad de degradar la sangre humana que contiene este medio de cultivo. Se desarrollan bien en el agar CNA sangre, que es medio con agar columbia, sangre animal suplementado con ácido nalidíxico y colistina, aunque en este medio Gardnerella se desarrolla de forma menos visible y sin producir beta-hemólisis. 4.3.1.6.- Agar Schaedler: incubación a 37ºC en atmósfera de anaerobiosis. Aislamiento de posibles anaerobios (Bacteroides spp.). 4.3.1.7.- Medio sólido A7B y medio líquido U9B para aislamiento e identificación de micoplasmas: incubación a 37ºC. El medio sólido en anaerobiosis. El medio líquido es un caldo de urea-arginina y un indicador (rojo fenol), que permite visualizar un cambio de color del caldo debido al aumento de pH. La lectura de las colonias se realiza por observación microscópica buscando la morfología característica de estos microorganismos (en huevo frito). El caldo contiene sustratos del tipo arginina que van a ser utilizados por M. hominis, lo que originará un aumento del pH del medio y un cambio de color por la acción del rojo fenol. Esto nos indicará la presencia de M. 779 hominis en la muestra. Igualmente el caldo contiene urea como sustrato, por lo que si existe U. Urealyticum en la muestra, el sustrato va a ser degradado y se producirá un cambio de pH y de color. Actualmente existen sistemas de identificación de estos micoplasmas comercializados, de manera que se combinan los caldos con una galería de identificación y de estudio de sensibilidades para ambos microorganismos. 4.3.1.8.- Identificación de Chlamydia trachomatis: Las muestras de semen, orina o secreción prostática no parecen ser las ideales para el estudio de esta bacteria intracelular. Debe utilizarse el frotis uretral, debiendo realizarse éste, incluso después de una eyaculación, sobre todo en los casos de varones asintomáticos estériles. De esta manera parece que aumentan las posibilidades de recuperación, ya que en estos casos la infección no sería uretral sino seminal y podría localizarse en el epidídimo, como sugieren algunas de las alteraciones observadas en la motilidad del espermatozoide que son típicas de afectación epididimaria (11). Actualmente, las técnicas de detección de ADN por biología molecular directamente en el semen, empiezan a ser de gran interés, pero no constituyen una práctica rutinaria en los laboratorios de microbiología. El raspado uretral ha de realizarse con el objetivo de arrastrar el mayor número de células epiteliales, en cuyo interior se halla el microorganismo. El diagnóstico puede realizarse por métodos inmunológicos del tipo de inmunofluorescencia directa, inmunocromatografía (IFD), ELISA, o biología molecular mediante la hibridación y/o amplificación con sondas de ADN quimioluminiscentes (ADN-ARN), o mediante el cultivo en medio de células de McCoy, tecnología esta última que no está al alcance de la mayoría de los laboratorios. 780 4.3.2.- Levaduras: utilización de agar Sabouraud, con incubación al aire a 30ºC para la detección de Candida spp. Este medio suele ir suplementado con antibióticos del tipo gentamicina y cloranfenicol para inhibir el crecimiento bacteriano. Incluso hay medios con sustratos cromogénicos para que el crecimiento de C. albicans pueda ser identificado directamente por el color que adquieren las colonias. Además se pueden utilizar galerías de identificación de levaduras para la identificación del tipo Candida, bien de forma manual o de forma semiautomatizada. 4.3.3.- Protozoos: Búsqueda de Trichomonas vaginalis. Se puede realizar por observación microscópica directa o bien con el medio de cultivo específico de Roiron a 37ºC durante 2-5 días. 5.- PROTOCOLO DE TRABAJO. TIPO DE MUESTRA Frotis uretral Semen Semen Semen AGENTE CAUSAL Chlamydia trachomatis DIAGNÓSTICO IFD ELISA Sonda DNA-RNA PCR Cultivo celular McCoy Bacterias Neisseria gonorrhoeae Haemophilus spp. Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Gardnerella vaginalis Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Mycoplasma-Ureaplasma Anaerobios Levaduras Candida spp. Parásitos Trichomonas vaginalis Thayer-Martin Agar chocolate (X, V) Agar McConckey Agar V Agar sangre U9 (caldo)/A7 (agar) Agar Schaedler Sabouraud Microscopio óptico Medio de Roiron 781 6.- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. La detección de bacterias en una muestra de semen humano no necesariamente significa infección, ya que la bacteriospermia puede aparecer igualmente en situaciones de contaminación o colonización de la muestra. El establecimiento de un punto de corte que nos diferencie la normalidad de lo patológico en el estudio microbiológico del semen es hoy un tema objeto de debate. Algunos autores han demostrado la alta frecuencia en que se aísla algún tipo de bacteria en muestras de semen humano y que la mayoría de las veces los microorganismos aislados constituyen flora contaminante. Este hecho ha sugerido que si la presencia de bacterias en semen está implicada en procesos como la esterilidad, sería probable que sólo ciertos microorganismos de los que se aíslan o un recuento alto de todos ellos estuvieran involucrados en el desarrollo de manifestaciones como la esterilidad. Por otra parte, la detección de leucocitospermia parece ser uno de los signos indicativos de infección de la vía seminal, aunque existen opiniones discrepantes. Wolf y Anderson hallaron en 1988(12) una asociación entre semen leucocitospérmico y esterilidad por la inclusión en su estudio de pacientes con posibles infecciones genitales, lo que concuerda con investigaciones más recientes (13). Sin embargo, otros autores (14) han demostrado que la presencia de leucocitos en semen es un pobre marcador de infección, observando que el 45% de los pacientes que presentaban seminocultivos positivos poseían ≤ de 500.000 leucocitos por mL; cifras, que por otra parte concuerdan con las nuestras (15) en las que detectamos concentraciones de leucocitos no diferentes y análogas a esta cantidad comparando sémenes fértiles, sémenes estériles sin AAE y 782 sémenes estériles con AAE. Algunos autores (2) han encontrado una asociación entre sémenes leucocitospérmicos y un recuento superior a 103 UFC bacterianas/mL. De acuerdo con este último hallazgo, la OMS (9) establece que si la concentración de bacterias en un seminocultivo es ≥ 103 UFC/mL, el cultivo se ha de considerar positivo y la bacteria ha de ser estudiada. Si en la placa de cultivo aparece más de un tipo de colonia, el cultivo de semen ha de ser informado como “muestra contaminada” y ha de recogerse una segunda muestra de semen, instruyendo correctamente al paciente. Si el recuento de colonias es ≤ a 103 UFC/mL, el cultivo debe ser informado como negativo para el caso de las bacterias aerobias habituales. Si en el cultivo del semen se aíslan colonias de gérmenes patógenos específicos, o asociados a ETS (gonococo, Gardnerella vaginalis, micoplasmas, anaerobios, clamidias), igualmente se deben informar y procesar para su identificación y si es posible para estudio de sensibilidades. Estas normas han sido validadas y publicadas por sociedades como la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR) (16) y la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC) (17), e introducidas en sus procedimientos normalizados de trabajo. 7.- FISIOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN DE LA VÍA SEMINAL. La importancia de la colonización microbiana genital en la interacción semen-moco y el beneficio de la terapia antimicrobiana en parejas estériles asintomáticas han sido y siguen siendo un tema controvertido. No obstante, es cada vez mayor el número de estudios que demuestran que la presencia de determinados microorganismos, incluso de 783 forma asintomática, en el cérvix y en el semen, puede ocasionar alteraciones en la interacción semen-moco, en la vitalidad, motilidad, morfología y recuento espermáticos; alteraciones que desaparecen en muchos casos cuando estos microorganismos son erradicados. 7.1- Micoplasmas: Opiniones discrepantes existen en relación al tema de que si la colonización del moco cervical o del semen por los micoplasmas genitales puede influir de manera significativa en la interacción semen-moco cervical y producir esterilidad transitoria (18) (19). Los estudios en contra se basan en el alto porcentaje de colonización genital que existe tanto en hombres como mujeres estériles como no estériles, sin diferencias significativas al comparar las tasas. Las principales especies dentro de los géneros Mycoplasma y Ureaplasma responsables de infecciones en el semen, asociadas a infecciones del tracto reproductor masculino y afectación de la reproducción son: Ureaplasma urealitycum (es el más frecuentemente aislado) y Mycoplasma hominis, y en menor grado Mycoplasma genitalium, Mycoplasma espermatophilum y Ureaplasma parvum. Los efectos que producen y que han sido señalados como causa de la esterilidad, sobre todo aplicados al U. urealyticum, son: Alteraciones en la morfología (teratozoospermia): sobre todo en la cola como colas enrolladas, cabezas afiladas, y restos citoplasmáticos. Disminución de la vitalidad espermática. 784 Astenozoospermia, por su unión al espermatozoide produciendo un descenso de la capacidad de ascenso de los espermatozoides por el cérvix, útero y trompas de Falopio. Disminución de la capacidad de penetración del ovocito (efecto masking): lo que ha sido demostrado mediante el test de penetración del ovocito de hámster tras la exposición de las muestras de semen a M. hominis y al U. urealyticum (sobre todo el serotipo 4). Interferencia en el reconocimiento del espermatozoide-receptor del ovocito (efecto masking). Producción de anticuerpos antiespermatozoide. Alteraciones cromosómicas: Se han detectado que el U.urealyticum es capaz de inducir pérdidas o deleciones en cultivos de linfocitos. Ello sugiere la posibilidad de que este mecanismo afecte a los gametos humanos, produciendo esterilidad. Destrucción tisular: Resultante de la colonización de estos gérmenes, se pueden ocasionar lesiones de esterilidad. En este hecho se basa la producción de las salpingitis, junto a la disminución del movimiento ciliar en las trompas de mujeres que se encuentran infectadas por estos microorganismos. En el hombre este puede ser el mecanismo de producción de uretritis y por vía ascendente de prostatitis y epididimitis. Mejoría en los parámetros seminales y aumento en la tasa de embarazos con la terapia antibiótica. 785 Estos microorganismos poseen una resistencia natural por su carencia de pared celular a antibióticos como los betalactámicos, por lo que desde este punto de vista es muy importante evitar el uso indiscriminado de antibióticos. Recientemente se ha publicado un estudio sobre sensibilidad y resistencia de aislamientos de micoplasmas genitales, analizando su evolución en el tiempo, del que se concluye que disponer de información microbiológica previa mediante un cultivo de semen es de vital importancia para recomendar la terapia más adecuada. Los tratamientos inadecuados, además de aumentar las resistencias de los microorganismos, pueden disminuir los síntomas sin curar la infección, con una alta probabilidad de transmitir la enfermedad y de que ocurran complicaciones secundarias y esterilidad (20). 7.2- Enterobacterias: Algunos autores han detectado BGN en semen en alrededor del 50% de los casos de las muestras de semen con cultivos positivos, siendo el más frecuente E. coli (26%) (21). Algunos grupos de investigadores han estudiado las características de la E. coli que infecta el tracto genital masculino y el semen, repercutiendo en las características seminales (leucocitospermia). Tales características son la posesión de los antígenos O (76,4%): O1 (5,7%), O2 (7,5%), O4 (17,0%) y O6 (46,2%); y el antígeno K (12%) de las subclases: K1 y K5. El fenotipo de fimbria es el T1F/P-, mientras que sólo el 16% presentaron el fenotipo T1F/P+. Además se ha detectado una alta proporción de E. coli adherida a espermatozoides de mamíferos. Alrededor de un 40% es resistente a la doxiciclina y una alta proporción a la ampicilina también. Por lo tanto, parece que existe una subpoblación de E.coli que posee ciertas 786 propiedades de virulencia para adherirse a los espermatozoides y colonizar el tracto genital masculino. 7.3- Chlamydia trachomatis: Más dudosa es la asociación de alteraciones en los parámetros seminales y la presencia de Chlamydia trachomatis en el semen. No obstante, lo que sí parece estar claro es el papel de reservorio de este germen que las glándulas anejas del aparato genital masculino poseen, incrementando la probabilidad de infección en la mujer y las posibles consecuencias en ésta como la obstrucción tubárica y la enfermedad inflamatoria pélvica (EIP). Sin embargo, recientes investigaciones, han puesto de manifiesto que la infección de las vías seminales por esta bacteria produce alteración de la concentración, movilidad y morfología espermáticas, así como aumento de la fragmentación del ADN espermático y de los fallos de las técnicas de reproducción asistida (22) (23). 7.4- N. gonorrhoeae: Igualmente ha sido señalado como agente inductor de alteraciones seminales y leucocitospermia. 7.5- Otros: Trichomonas vaginalis: La presencia de este parásito en el semen se correlaciona con alteraciones seminales del tipo de oligo, asteno y teratozoospermia; alteraciones que desaparecen en el 50% de los casos después del tratamiento con metronidazol. Candida albicans: La infección genital por levaduras, siendo C. albicans una de las más frecuentes se puede transmitir vía sexual, aunque es más frecuente que provenga de otras zonas como la flora intestinal. No está del todo claro su 787 papel en la esterilidad, sin embargo, se han descrito casos de pérdida de fertilización por este microorganismo, incremento en la fragmentación del DNA espermático y disminución de la movilidad de los espematozoides (24). Gardnerella vaginalis: Se ha señalado como productora de alteraciones seminales como la leucocitospermia. Aunque realmente la infección de la vía seminal es casi siempre asintomática, epidemiológicamente se comprueba el aumento de la prevalencia de algunas patologías ginecológicas del tipo de EIP, displasias cervicales, cervicitis mucopurulenta, endometritis,..., por lo que el despistaje de esta infección es importante, por la repercusión que puede tener en la fertilidad de la pareja. Saprófitos oportunistas: S. epidermidis, enterococos, Streptococcus viridans, Corynebacterium, etc. en los que aún no se conoce la relevancia clínica de su presencia en el tracto genital masculino y en el semen. 8.- DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN DE LA VÍA SEMINAL Se basa en los siguientes signos o hallazgos: 8.1.- Clínica: Antecedentes infecciosos Signos y síntomas de: orquiepididimitis, prostatitis, vesiculitis y uretritis Anomalías a la palpación y exploración Muchas veces asintomáticos 788 8.2.-Datos de laboratorio: Leucocitospermia (> 1 millón de leucocitos/mL) o aumento de la elastasa granulocitaria. Oligozoospermia/azoospermia; teratozoospermia; astenozoospermia Disminución de la vitalidad espermática. Aglutinaciones espontáneas y/o AAE. Alteraciones del líquido seminal: hipospermia, hemospermia, pH<7 y disminución de los marcadores bioquímicos. 8.3.- Diagnóstico por el laboratorio de la prostatitis Debido a lo frecuente de esta patología y a la importancia del laboratorio en el diagnóstico de ésta, vamos a exponer brevemente algunos de sus aspectos más relevantes en lo que al papel del laboratorio clínico se refiere. Dentro de las prostatitis podemos diferenciar las siguientes entidades: 8.3.1.- Prostatitis agudas: Conjunto de síntomas entre los que destacan el dolor perineoescrotal, fiebre alta, escalofríos, síndrome miccional, con disuria y polaquiuria. La glándula está repleta de secreciones purulentas que fluyen espontáneamente a la uretra posterior. Por ello está contraindicado en estos pacientes el masaje prostático por el riesgo de septicemias que tienen estos pacientes. El cultivo que se indica en este caso es el de semen y orina, ya que la recogida de estas muestras provocará el arrastre de las secreciones purulentas vertidas en la uretra prostática y permitirá la identificación del microorganismos causal. 789 8.3.2.- Otras: en donde se encuandran las prostatitis crónicas bacterianas, las prostatitis crónicas no bacterianas o prostatosis y la prostatodinia. Para el diagnóstico de estas tres entidades nos basaremos en la recogida y valoración de las siguientes muestras: Primer chorro miccional de la mañana: La muestra nos proporciona una muestra de barrido uretral que, cultivada, al arrastrar las secreciones existentes en la uretra, nos proporciona información sobre el tipo de flora bacteriana uretral. Chorro miccional medio: Este nos proporciona información sobre la flora vesical. Líquido prostático u orina posmasaje prostático (técnica de Stamey): Su cultivo nos da información sobre la flora bacteriana prostática. De cada muestra se realiza cultivo en sus correspondientes medios, añadiendo en el caso de secreciones prostáticas la investigación de micoplasmas y clamidias; y estudio citológico, observando la presencia de leucocitos en las diferentes muestras, en especial la del fluido prostático, con el objeto de diferenciar si estamos ante un líquido prostático purulento (>15 leucocitos/campo) o no, hecho que tiene significación diagnóstica, como ahora vamos a ver. 8.3.2.1.- Diagnóstico de las prostatitis crónica bacteriana: siempre que se de alguna de las siguientes tres situaciones: Los cultivos del fluido prostático y/o la orina posmasaje prostático serán positivos, en concomitancia con cultivos negativos de orina inicial y de orina de chorro medio. 790 El número de colonias en las muestras de fluido prostático y/o la orina posmasaje prostático sea superior al menos en una potencia de 10 al recuento de colonias en las orinas inicial y del chorro medio. Se demuestran gérmenes patógenos en el cultivo de la orina inicial, será negativo el cultivo de orina de chorro medio (orina de representación vesical) y será positivo pero marcadamente mayor (x10) el recuento de colonias en el fluido prostático y/o la orina posmasaje prostático. 8.3.2.2.- Diagnóstico de la prostatosis o prostatitis crónica no bacteriana: Cuando junto a los cultivos bacteriológicos negativos se asocia un número de leucocitos mayor en el fluido prostático que en las otras muestras (>15 leucocitos/campo al microscopio óptico con 40x aumentos). 8.3.2.3.- Diagnóstico de la prostatodinia: Otorgaremos este diagnóstico a aquellos pacientes que presentando una clínica de prostatitis no se evidencia infección, ni signos de inflamación en los cultivos de localización, ni en las citologías exfoliativas (cultivos negativos y <15 leucocitos/campo en el líquido prostático) 9.- INVESTIGACIÓN MICROBIOLÓGICA EN SEMEN Cuando uno se plantea la investigación sistemática determinada como norma general es inevitable plantearse la utilidad de esta investigación desde el punto de vista relación costo-beneficio. Y esta relación en el caso del análisis bacteriológico depende de la fiabilidad y dificultad del método utilizado y de la prevalencia de dicha infección en la población a estudiar. 791 Micoplasmas: son microorganismos que aunque precisan de medios de cultivo específicos no requieren técnicas especiales y su investigación es asequible, puesto que además el porcentaje de colonización en nuestro medio oscila entre un 20-40%. Como además las parejas tratadas con tratamiento antibiótico, en muchos casos, consiguen embarazos, su estudio parece estar justificado de rutina. N. gonorrhoeae: Suele dar síntomas, pero hay casos en los que el individuo es un reservorio del germen y permanece asintomático. Siendo un germen cuya investigación es fácil y de bajo costo, el beneficio de su investigación es grande. Además de los medios para micoplasmas y N. gonorrhoeae, en la mayoría de los laboratorios se introduce en el protocolo de rutina del seminocultivo, una placa de agar McConckey, otra de agar V y otra para anaerobios (investigación fácil y de bajo costo). No sucede lo mismo con la C. trachomatis. Si en nuestro medio la investigación sistemática de este microorganismo en parejas estériles sin sintomatología ni signos de infección es útil o rentable es todavía un tema no aclarado debido a los escasos datos existentes. En España hay pocos estudios sobre la prevalencia en mujeres y hombres asintomáticos estériles, pero los existentes no dan cifras que justifiquen en la actualidad su búsqueda indiscriminada (0,6-1% en población general) (1) (ó 0,98% en población de alto riesgo) (25). Recientes estudios (26) sugieren más bien la importancia de realizar la serología a C. trachomatis en el 792 estudio de parejas estériles porque es un buen indicador de parejas con posible infecciones por este germen y de daño tubárico en la mujer, e incluso algunos autores proponen (27) el screening de anticuerpos IgG anti-hsp60- Chlamydia (“heat shock protein” de 60kDa) en suero y el de anticuerpos tipo IgA anti- Chlamydia en cérvix de mujeres de parejas que van a ser sometidas a tratamientos de esterilidad. Esta última opción parece que daría cobertura a la búsqueda del principal patógeno que causa obstrucción tubárica en la mujer, y por otro lado, permitiría no hacer de forma indiscriminada estudios frente a este germen en todas las muestras genitales, puesto que como se ha apuntado antes, no parecen ser coste-efectivos en nuestro país, y evitaría tratamientos antibióticos profilácticos a todas estas parejas, recibiéndolo sólo aquellas con el screening positivo. 10.- ANTIBIOTERAPIA Lo más importante es el tratamiento de LA PAREJA (efecto ping-pong de la infección por contagio sexual). Realizar tratamiento antibiótico sistemáticamente en todos los individuos en los que se aísla algún germen es un tema controvertido. En el caso de infecciones que producen clínica tanto en el varón como en la mujer o sólo en alguno de los dos, como en el caso de los microorganismos involucrados en las ETS, habría que prescribir el tratamiento antibiótico específico descrito para cada una de ellas. En el resto de los casos dependerá de las repercusiones clínicas que pudiera estar ocasionando, como por ejemplo la esterilidad de la pareja o de las alteraciones seminales achacables a la infección. 793 De todas formas, existen opiniones discrepantes, ya que hay trabajos que confirman el aumento de las tasas de embarazos en grupos de parejas a las que se le ha sometido a tratamiento antibiótico, frente a otros estudios en los que no se ha detectado este efecto e incluso desaconsejan el tratamiento de los individuos asintomáticos de parejas con sémenes bacteriospérmicos, ya que el tratamiento puede seleccionar una población de bacilos Gram negativos resistentes en la vagina de la mujer que contamine en programas de Fecundación In Vitro-Transferencia Embrionaria (FIV-TE) el medio en el que se realiza la fecundación de los ovocitos que se extraen por punción folicular a través de la vagina. Si se decide pautar tratamiento, hay que hacerlo sabiendo la etiología más frecuente asociada a la clínica que presenta el paciente, o si se ha aislado el germen e incluso si se dispone del informe de sensibilidades, elegir el antibiótico más adecuado. El tratamiento antibiótico en las infecciones de la vía seminal suma además una dificultad anatómica-histológica. Las glándulas masculinas pertenecen al grupo denominado farmacológicamente de “tejido profundo”, lo que significa que la llegada de los antibióticos al lugar de la infección está condicionada a una serie de características físico-químicas (membrana basal, potencial óxido-reducción, grado de ionización del antibiótico, ...) que regulan la capacidad de difusión o penetración del antibiótico. La interrelación de las características locales y de las propiedades de la molécula antibiótica va a influir de forma importante en la eficacia de la antibioterapia. Así, el tratamiento antibiótico específico (28) para algunas de estas infecciones es el siguiente: 794 N. gonorrhoeae: Ceftriaxona 250 mg IM; o cefixima 400 mg oral en dosis única. Como alternativa, ciprofloxacino 500 mg o levofloxacino 400 mg oral 0 azitromicina 2 g oral en dosis única. Chlamydia trachomatis: Doxiciclina 100 mg/12 h durante 7 días o azitromicina 1g en dosis única. Mycoplasma hominis: Doxiciclina 100 mg/12 h, 7-15 días. Alternativa: azitromicina, clindamicina, quinolonas. Ureaplasma urealyticum: Macrólido 7-15 días. Alternativa: Doxiciclina, levpfloxacino. Gardnerella vaginalis: Metronidazol o clindamicina en aplicación tópica. Candida spp.: clotrimazol,miconazol o terconazol 5 g de crema o tabletas de 100 mg/día, 7 días o fluconazol oral un solo comprimido de 150 mg o 3 comprimidos en 72 horas en infecciones recurrentes. Trichomonas vaginalis: Tinidazol o metronidazol, 2 g dosis única o 500 mg/12h, 7 días. 10.1- Tratamiento del semen “infectado” en reproducción asistida En recientes investigaciones (2) se ha observado la alta prevalencia de muestras de sémenes en las que algún tipo de bacteria era aislado. Esto es debido a una incorrecta recogida de la muestra, que ocasiona la contaminación de la muestra habitualmente. Por otro lado, los tratamientos de reproducción asistida aumentan el riesgo de infección viral, por lo que ha sido importante demostrar que el lavado y swim-up de los eyaculados con medios de cultivo en los que se ha añadido antibiótico, elimina el 95% 795 de los microorganismos presentes en las muestras de semen. Este hecho apoya la utilización de medios en las técnicas de reproducción asistida que contienen agentes antibióticos como el Ham F10, RPMI, B2 Menezzo, etc. Una de las formulaciones más habitual es la de añadir Penicilina a 100U/mLy Estreptomicina a 50 g/mL de medio. Estos medios son utilizados tanto en la realización de swim-up como de gradientes de densidad en programas de inseminación intrauterina. 11.- CONCLUSIONES El cultivo de semen debe realizarse en los casos en los que exista alguna alteración en los parámetros seminales, leucocitospermia, síntomas de infección o inclusión en programas de reproducción asistida. La muestra de semen no es la más adecuada para el aislamiento de algunos microorganismos, siendo el cultivo de semen lo primero que hay que realizar en el caso de que a la muestra le sean solicitadas más determinaciones. Es fundamental la recogida adecuada de la muestra para evitar futuras contaminaciones de flora habitual. Los resultados del cultivo de semen deben interpretarse con cautela y compararlos con los del examen bacteriológico de otras muestras como la orina, fluido prostático y exudado uretral. Un cultivo de semen es positivo cuando se aíslan más de 1000 UFC de una sola bacteria/mL en la placa de cultivo. Si crecen dos o más, se informará como muestra contaminada y se aconsejará la recogida correcta de una nueva muestra. 796 Un cultivo de semen positivo puede ser el punto de partida para estudios complementarios orientados a localizar el órgano afectado y para iniciar el tratamiento en casos de esterilidad. 797 12.- BIBLIOGRAFÍA 1.- Miranda C. Microbiología en el estudio de la esterilidad humana. En: Herruzo AJ, Vergara F, Editores. Propedéutica en esterilidad humana. Editorial Proyecto Sur; 1994. p. 101-6. 2.- De Francesco MA, Negrini R, Ravizzola G, Galli P, Manca N. Bacterial species present in the lower male genital tract: a five-year retrospective study. Eur J Contracpt Reprod Helth Care 2011; 16(1): 47-53. 3.- Martínez E, Camejo M. Prevalencia de infecciones en plasma seminal humano. Medicina 2007; 67(1); 1-128. 4.- Hugerhuber E, Stef CG, Sielbels M. Urogenital infections in the male and their implications on fertility. 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