expansina

DOCTORADO EN
CIENCIAS MENCIÓ
MENCIÓN
INGENIERÍ
INGENIERÍA GENÉ
GENÉTICA
VEGETAL
AISLAMIENTO DE UN cDNA DE PAPAYA
CHILENA QUE MUESTRA UNA ALTA
HOMOLOGÍA CON EXPANSINAS
Carlos Gaete-Eastman, Cristian Balbontín,
Raúl Herrera & M. Alejandra Moya-León
Calidad de los frutos
• Buen color
• Buena textura
• Sin daños
• Sin infecciones
• Buen aroma
• Buen sabor
Durante la maduración de los frutos se produce
un descenso de la firmeza
Intenso y/o rápido ablandamiento
corta vida de almacenaje
productos elaborados
de calidad deficiente
El factor mas importante que contribuye al ablandamiento
lo constituyen las modificaciones en la estructura de la
pared celular (Gray et al, 1992)
¿ Cómo es la pared celular de un fruto?
La pared celular está compuesta por dos redes
co-extensivas de polisacáridos
(Buchanan et al, 2000)
El factor mas importante que contribuye al ablandamiento
lo constituyen las modificaciones en la estructura de la
pared celular (Gray et al, 1992)
¿Cuáles cambios?
• Solubilización y depolimerización de pectinas
• Depolimerización de hemicelulosas
• Pérdida de azúcares neutras
¿Cuáles enzimas?
• poligalacturonasa
• pectina metilesterasa
• pectato liasa
• endo (1-4) β-D-glucanasa
• xiloglucano endo-transglicosidasa
• expansina
(Giovannoni, 2001)
Expansinas
•Son proteínas de entre 25-28 kD
•Induce relajación de la pared celular no hidrolíticamente,
permitiendo su extensibilidad y una expansión celular.
(Cosgrove, 2000)
• Existen 2 familias de expansinas (α y β), con una
limitada homología de secuencia.
• Se han identificado un grupo de expansinas
asociadas a la maduración de diferentes frutos.
frutos
La papaya cultivada en Chile (Vasconcellea pubescens)
con centro de origen en Colombia y Ecuador
• 2n =18
• Antitusivo y cicatrizante
• Agradable sabor y aroma
• Alto contenido de vitaminas (A, B y C)
• Antioxidantes
• Gran cantidad de proteasas
Determinación del descenso de firmeza de la papaya
6,5
6,0
Penetrómetro
Firmeza (Kg)
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
0
2
4
6
8
Tiempo (Días)
10
12
14
Determinación del descenso de firmeza de la papaya
6,5
6,0
Penetrómetro
Metodología destructiva
Firmeza (Kg)
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
Alta dispersión de los datos
3,0
0
Colaboración Dr Per Bro
2
4
6
8
Tiempo (Días)
10
12
14
Preguntas
¿Existen expansinas en Vasconcellea pubescens
asociadas al proceso de maduración?
Si es así, ¿son homólogas a las expansinas aisladas en
otras especies?
Métodos
• Se colectaron las muestras de papaya
durante Marzo del 2004, en huertos
comerciales en la localidad de Lipimávida
(VII Región).
• Las muestras fueron almacenadas en una
cámara a 20 °C.
• A partir de frutas maduras, se extrajo RNA total según Chang et al., 1993
• Luego se sintetizó cDNA de doble cadena utilizando el kit SMART (BD Bioscience)
• Se aisló la expansina de papaya mediante PCR, utilizando los siguientes partidores:
EXPP–F
EXPP-R
5’-ATG-GGI-GGI-GCN-TGY-GGN-TAY-G-3’
5’-YTG-CCA-RTT-YTG-NCC-CCA-RTT-3’
• El fragmento amplificado fue aislado y purificado utilizando el sistema Gel Extraction
Kit (Omega Bio-Tek), clonado mediante el sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen)
y finalmente secuenciado en un secuenciador ALFexpress II (Amersham).
RNA
Isolation
Papaya sample
Total RNA
cDNA
cDNA
Synthesis
Synthesis
RTRT-PCR
Sequenciation
PCR product amplified using
primers EXPPEXPP-F y R
Resultados
Como resultado de la secuenciación, obtuvimos un fragmento de 496 pb
ATGGGGGGGGCCTGTGGTTACGGAAATCTGTACAGCCAAG
GTTATGGGACAAACACTGCTGCACTAAGCACTGCTCTATTC
AATAATGGGCTTGCTTGTGGAGCCTGTTTTGAAATTAAATG
TGTGAATGATGGTAGGTGGTGTCTACCAGGATCTATCATGG
TCACAGCAACAAATTTCTGCCCTCCAAACAATGCTCTTGCAA
GCAATGCAGGAGGATGGTGTAACCCTCCTCTGCGTCATCTC
GATCTCTCTCAGCCTGTTTTCCAGCACATAGCTCACTACAAA
GCAGGAATCGTACCTGTCCAATACAGAAGGGTTAGTTGCAG
GAAGAGTGCTGGGATTAGGTTCACCATAAACGGACACTCAT
ACTTCAATCTKGTGCBAATAAGCAATGTTGGAGGAGCTGGC
GATGTTGTGTCYGTATCCATCAAAGGTTYTAGGACTGGCTG
GCAAGCCATGTYYCATAACTGGGGGTCAGAACTGGCAG
Análisis BLASTn
gi|29421117|dbj|AB104442.1| Vitis labrusca x Vitis vinifera exp 1
gi|14718274|gb|AF226701.1| Fragaria x ananassa exp 4
gi|16923360|gb|AF319473.1| Cucumis sativus exp 7
gi|16305104|gb|AF367459.1| Prunus persica exp 1
%
E
Ident. Value
84
9e-24
83
7e-17
83
3e-16
83
2e-14
Análisis BLASTx
gi|29421118|dbj|BAC66694.1| Vitis labrusca x Vitis vinifera exp 1
gi|14718275|gb|AAK72875.1| Fragaria x ananassa exp 4
gi|17484121|gb|AAL40354.1| Prunus cerasus exp 5
gi|10180019|gb|AAG13983.1| Prunus avium exp 2
83
83
83
83
1e-80
1e-79
1e-79
1e-79
El resultado de la traducción de la secuencia
obtenida arroja un ORF de 174 aas.
ORF 1
A L Met G G A C G Y G N L Y S Q G Y G T N T A A L S T A L F N N G L A
C G A C F E I K C V N D G R W C L P G S I Met V T A T N F C P P N N A
LASNAGGWCNPPLRHLDLSQPVFQHIAHYKAGIVP
VQYRRVSCRKSAGIRFTINGHSYFNXVXISNVGGA
G D V V X V S I K G X R T G W Q A Met X H N W G S E L A E G X X P A
HWG
Resultado del análisis de motivos estructurales por MotifScan:
prf: EXPANSIN_EG45
pos. 4 - 116
E-value = 2,1e-23
pfam: POLLEN_ALLERG_1
pos. 117 - 174
E-value= 2,8e-12
Se observa un alto grado
de homología entre la
secuencia de papaya y
las presentes en otras
especies.
Se pueden identificar
algunos de los residuos
críticos para la función
biológica propuesta.
Se observan los dos
dominios estructurales
descritos para las
expansinas.
Se observa un alto grado
de homología entre la
secuencia de papaya y
las presentes en otras
especies.
Se pueden identificar
algunos de los residuos
críticos para la función
biológica propuesta.
Se observan los dos
dominios estructurales
descritos para las
expansinas.
Análisis filogenético de genes
de expansinas
79
C
55
100
A partir del alineamiento de las
secuencias aminoacídicas
deducidas de 39 secuencias
de expansinas.
93
100
70
72
B
85
93
77
51
70
74
D
67
65
Mediante Clustal V y PAUP
v4.0, utilizando MP y análisis
bootstrap (1000 rep.)
100
80
96
A
100
Conclusiones
• Se aisló un fragmento de un cDNA con alta homología con
expansinas.
• El fragmento posee los dos dominios propuestos para las
expansinas, con sus residuos aminoacídicos característicos.
• El análisis filogenético sitúa a la expansina de papaya
como miembro del subgrupo C, junto a otras α-expansinas
asociadas a maduración .
Perspectivas
• Aislar y secuenciar el extremo 3’ de la expansina de papaya.
• Analizar el patrón de expresión de la expansina de papaya.
• Correlacionar dicho patrón con cambios en la composición
de hemicelulosas durante el ablandamiento de la papaya.
• Construir el modelo de la estructura tridimensional de la
expansina de papaya (Colaboración Dr Danilo González)
Dominio1
Dominio 2
¿Parecidos?
Bolsillo catalítico
Residuos
aromáticos
Puentes disulfuro
Hendidura
Del CBD
Agradecimientos
Financiamiento:
• Proyecto Fundación Andes C-13855/12.
• Proyecto Mecesup TAL-105.
• Centro Regional en Biotecnología
Colaboradores:
• Dr. Claudio Ramírez
• Lic. Mario Moya
• Lic. Carlos Figueroa
• Lic. Rubén Almada
Análisis fisiológico del proceso de maduración de la papaya
Control
Medición etileno
1-MCP
Medición firmeza