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Aspectos morfológicos del desarrollo embrionario en Quercus sspp. : embriogénesis
cigótica versus embriogénesis somática.
GONZÁLEZ CABRERO N, RUIZ M, HERNÁNDEZ I, CARNEROS E, CELESTINO C,
TORIBIO M, ALONSO BLÁZQUEZ N, ALEGRE J.
IMIDRA. Finca El Encín. Apdo. 127 28800 Alcalá de Henares (Madrid) E-mail: [email protected]
Resumen
El embrión cigótico y el embrión somático se asemejan hasta el punto de que los estudios
realizados en uno de ellos se utilizan como modelo para entender el desarrollo del otro. De
hecho, la embriogénesis somática es la herramienta habitual en estudios básicos de
embriogénesis porque en sus estados iniciales de desarrollo, el embrión cigótico resulta muy
poco accesible en el interior del ovario, lo que impide realizar análisis moleculares y
bioquímicos. De igual forma, es importante que los embriones somáticos, cultivados in vitro,
se asemejen al embrión cigótico, siendo la morfología de éste un modelo clásico para evaluar
su calidad. Como el gameto femenino está incluido en un saco embrionario, a su vez
embebido en el óvulo, sólo de forma relativamente reciente ha sido posible realizar otros
estudios detallados del desarrollo del embrión cigótico que se han basado, generalmente, en
cortes histológicos.
En este trabajo, presentamos los resultados de un seguimiento del desarrollo morfológico del
embrión cigótico de Quercus suber (alcornoque) y Quercus ilex (encina) realizado mediante
disección y observación directa en microscopio invertido con luz natural y en contraste de
fases. Las imágenes obtenidas son de gran utilidad para el seguimiento y evaluación de
cultivos embriogénicos en medio líquido. Al comparar la morfología de ambos tipos de
embriones: cigótico versus somático, se confirma el paralelismo en las fases de desarrollo
globular, corazón y cotiledonar. Se aprecia una mayor variabilidad en el tamaño del embrión
somático, en su número de cotiledones y la formación de embriones agregados, debido a las
condiciones de cultivo.
Palabras clave: Biotecnología forestal, cultivo in vitro, embriogénesis cigótica,
embriogénesis somática, Quercus, calidad del embrión.
1. Introducción
El desarrollo embrionario de las plantas con semillas tiene dos fases: la morfogénesis
(desarrollo embrionario sensu stricto) y la maduración (Dodeman et al., 1997; Braybrook &
Harada, 2008). Durante la morfogénesis, dominan los procesos de división celular y se
establece la estructura básica del vegetal: polaridad raíz-tallo, ápices radical y caulinar,
vascularización, órganos y tejidos. Durante la maduración, domina el crecimiento celular y se
detiene la morfogénesis, se sintetizan y acumulan sustancias de reserva, se adquiere la
tolerancia a la deshidratación, se inhibe la germinación precoz y finalmente, en algunas
especies, aparece la latencia vinculada a la desecación.
En Quercus sspp. el desarrollo embrionario sigue las fases anteriores. Como en el resto
de angiospermas, la semilla se forma por el desarrollo conjunto del embrión y el endospermo
tras ser generados simultáneamente en un proceso de doble fecundación. La célula huevo o
gameto femenino forma parte de un saco embrionario, el gametofito, que está embebido en
los tejidos del óvulo. La estructura del saco embrionario se asemeja a la de otras muchas
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especies: en uno de sus extremos y cerca de su apertura (el micropilo) se sitúa una célula
huevo con marcada polaridad, flanqueada por otras dos células (las sinérgidas), en su zona
central hay una célula con dos núcleos polares (la célula central) y en el extremo opuesto del
saco, se encuentran tres células más (las antípodas). En cuanto a sus funciones, las sinérgidas
son responsables de la atracción del tubo polínico hasta la célula huevo, la célula central tras
la fecundación da lugar a la aparición de un tejido nutritivo triploide (el endospermo) y las
antípodas cumplen también con una función nutritiva.
La observación del proceso de fecundación y de las fases iniciales del desarrollo
embrionario, en el embrión cigótico, es difícil porque tienen lugar “ocultas” en el interior de
los tejidos maternos. Por ello, los estudios detallados de las primeras fases de desarrollo del
embrión cigótico se basan, generalmente, en cortes de tejidos fijados y teñidos. La morfología
del embrión en sus diferentes estados de desarrollo puede cambiar de unas especies vegetales
a otras, aunque la primera división del cigoto siempre es asimétrica, genera una célula apical
pequeña que produce el embrión y una célula basal grande que genera el suspensor. Las
relaciones de asimetría-simetría y la existencia de polaridad son fundamentales en el proceso
embriogénico. Las divisiones celulares que se producen en el embrión se ajustan además a
unos patrones fijos que definen su desarrollo y su morfología (Souter & Lindsey, 2000). En
relación con la embriogénesis sensu stricto, Dodeman et al. (1997) distinguen los estados de
desarrollo globular, oblongo, corazón, torpedo y cotiledonar, en una de las especies modelo
por excelencia, Arabidopsis thaliana. En el estado globular el embrión es esférico y está
unido por medio del suspensor a los tejidos maternos. Cuando aparecen los cotiledones, el
embrión observado lateralmente toma forma de corazón y posteriormente la expansión
longitudinal de los cotiledones y del hipocótilo, generan la forma de torpedo. La transición al
estado cotiledonar coincide con la iniciación del ápice radical que es seguida por la aparición
del primordio apical. En este momento se establece el patrón de crecimiento característico de
la planta y se forman los tejidos meristemáticos responsables del desarrollo posterior, lo que
marca el final de la morfogénesis. Los estados de desarrollo globular, corazón, torpedo y
cotiledonar, son los empleados habitualmente para describir la embriogénesis en
angiospermas (Mordhorst et al., 1998; Braybrook & Harada, 2008).
Los embriones somáticos son estructuras bipolares semejantes a los embriones
cigóticos, pero que desarrollan a partir de células somáticas que adquieren la capacidad de
expresar un programa embriogénico. Pueden generarse de forma directa, a partir de las células
de un tejido vegetal, o de forma indirecta con un estadío intermedio en el que hay formación
de callo (Von Arnold et al., 2002). En cualquier caso, a diferencia de lo que sucede en la
embriogénesis cigótica, en la embriogénesis somática el proceso no se desencadena por la
fusión de gametos. Pese a las diferencias que existen en su origen, existen similitudes
importantes en la progresión de ambos tipos de embriogénesis. Los embriones somáticos se
desarrollan en fases cuya morfología es semejante a la de los embriones cigóticos (Yeung et
al. 1996, Dodeman et al., 1997; Schmidt et al. 2006), lo que se considera reflejo de procesos
también semejantes a nivel fisiológico y molecular (Zimmerman, 1993; Ikeda et al., 2006).
Se han publicado diversos estudios sobre la anatomía y el desarrollo de la flor y el fruto
en Quercus sspp. Mogensen (1965) describió la evolución de las flores pistiladas de Q. alba y
Q. velutina desde la antesis hasta la maduración del fruto, Boavida et al. (1999) publicaron un
estudio detallado del proceso de polinización y fertilización en Q. suber y más recientemente,
Borgardt & Nixon (2003) realizaron un estudio sobre el desarrollo floral y la fructificación de
Q. acutissima. También existen varias publicaciones que incluyen aspectos morfológicos del
desarrollo embrionario en Quercus (Palada-Nicolau & Hausman, 2001; Prewein et al., 2006;
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López Vela et al., 2008) pero la información gráfica contenida en ellas es parcial e incompleta
y no conocemos ningún estudio detallado de la morfología del proceso embriogénico en
especies forestales de tanta importancia como son las del género Quercus.
2. Objetivos
La producción clonal de plantas en especies del género Quercus mediante
embriogénesis somática, puede mejorarse con el establecimiento de protocolos de cultivo en
los que el estado de desarrollo del embrión somático se asemeje lo más posible a los del
embrión cigótico. El objetivo de este trabajo fue obtener información gráfica, lo más completa
posible, del desarrollo de los embriones cigóticos en Q. suber y Q. ilex, empleando las
técnicas de microscopía que se utilizan habitualmente para el seguimiento de los cultivos
embriogénicos en medio líquido. La finalidad última es que estas imágenes puedan emplearse
como herramienta de evaluación rápida y no agresiva, en los cultivos embriogénicos de estas
especies forestales o en otras afines.
3. Metodología
Para el seguimiento del desarrollo del embrión cigótico, se hizo una recolección
secuencial de flores pistiladas y bellotas inmaduras. Existe una gran heterogeneidad entre
individuos y dentro de cada individuo, en las fechas de floración, polinización y fecundación
(Kanazashi & Kanazashi, 2003; López Vela et al., 2008), por eso en cada fecha, el criterio de
muestreo fue la toma de flores y bellotas inmaduras representativas de diferentes estados de
desarrollo. El material de encina se recogió en la localidad de Los Santos de la Humosa
(Madrid), entre el 27 de junio y el 5 de agosto de 2008; y el de alcornoque, en Torrelaguna
(Madrid), entre el 8 de julio y el 12 de agosto del mismo año. Este material se conservó en
frío a 4ºC hasta el momento de su disección. El seguimiento del desarrollo del ovario y el
embrión se realizó con un microscopio invertido marca NIKON ECLIPSE TS100 conectado a
la Aplicación NIS Elements F2,3 y una cámara digital OLYMPUS C-5050ZOOM, empleando
luz natural y en contraste de fases.
Las imágenes de los embriones somáticos se obtuvieron usando el mismo equipo
descrito en el apartado anterior. El material embriogénico procedía de cultivos en medio
líquido, proliferando en medio nutritivo SH en Erlenmeyer de 250 ml a 110 rpm (Jiménez et
al., 2007), y de cultivos en medio semisólido proliferando en placas Petri con el mismo
medio nutritivo SH pero solidificado con agar (Hernández et al., 2003 a y b). Los cultivos se
mantuvieron a 25ºC y fotoperiodo de 16 h de luz.
Se buscaron posibles diferencias entre el embrión cigótico de encina y de alcornoque.
Además, se compararon las fases de desarrollo de la embriogénesis cigótica frente a la
embriogénesis somática, y se determinaron aspectos morfológicos del embrión en sucesivos
estados del desarrollo: forma, tamaño medio, color, transparencia y número de cotiledones.
4. Resultados
En la figura 1, se muestra el desarrollo del fruto y del embrión cigótico en Quercus
suber y Quercus ilex. El desarrollo inicial del ovario en una flor pistilada de alcornoque y
encina es muy semejante. En el momento de la polinización, el ovario aún está inmaduro y no
se han desarrollado los óvulos. En la imagen 1a se muestra un detalle de la sección transversal
de una flor de encina, ya polinizada, de unos 5 mm de diámetro. Se observan dos de los tres
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carpelos biloculados en estado incipiente de desarrollo. La imagen 1b corresponde también a
una flor de encina ya fecundada, de unos 5 mm de diámetro. Se observan 5 óvulos abortados
y un saco embrionario mucho más desarrollado que corresponde al óvulo fecundado. La
imagen 1c representa la sección longitudinal de una flor de unos 7 mm de diámetro, donde se
aprecian 2 óvulos abortados (B) y un saco embrionario desarrollado que en su zona apical
(A), contiene un embrión de unas 500 μm de longitud en estado torpedo. La imagen 1d es una
ampliación de (A), en la que se muestra con mayor detalle el embrión.
Las imágenes 1e-h representan los diferentes estados de desarrollo del embrión cigótico
en alcornoque. La imagen 1e, obtenida con luz natural, es un embrión globular de unas 120
μm de diámetro rodeado de un endospermo viscoso. La imagen 1f, obtenida en contraste de
fases, corresponde a un embrión en estado corazón de unas 250 μm. La imagen 1g, obtenida
en contraste de fases, muestra un embrión en estado torpedo de 1mm de longitud donde se
observa el primordio radical, y la imagen 1h, obtenida con luz natural, un embrión cotiledonar
de 2mm.
d
b
a
c
e
h
f
g
Figura 1: Detalles del desarrollo del fruto y del embrión en Quercus suber y en Quercus ilex. a: detalle de la sección
transversal de una flor de encina, b: seción transversa de una flor de encina con un saco embrionario más desarrollado, c:
sección longitudinal de una de flor de alcornoque con 2 óvulos abortados (B) y un saco embrionario desarrollado con un
embrión en su zona apical (A), d: detalle del embrión cigótico mostrado en la imagen anterior (en el círculo), e: embrión
cigótico de alcornoque en estado globular, f: embrión cigótico de alcornoque en estado corazón, g: embrión cigótico de
alcornoque en estado torpedo, h: embrión cigótico de alcornoque en estado cotiledonar.
La figura 2, refleja el desarrollo de embriones somáticos de Quercus suber
procedentes de cultivos en medio líquido y en medio gelificado.
Las fotos 2a-d corresponden a medio líquido. La foto 2a, obtenida en contraste de
fases, muestra lo que probablemente es el inicio de un embrión de origen unicelular. Las
imágenes 2b y 2c, obtenidas con luz natural, representan la morfología de un embrión
globular y corazón respectivamente. La imagen 2d muestra un embrión somático cotiledonar
de unos 7 mm de longitud, bien desarrollado.
Las imágenes 2e-h, obtenidas con luz natural, muestran algunos aspectos de un cultivo
de alcornoque en medio semisólido: 2e es un detalle del crecimiento de un agregado de
embriones somáticos, 2f embriones somáticos en diferente estado de desarrollo, 2g representa
embriones cotiledonares con 3 cotiledones y 2h un embrión somático cotiledonar obtenido
en medio semisólido.
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a
d
b
c
g
e
f
h
Figura 2. Detalles del desarrollo de embriones somáticos de Quercus suber cultivados en medio líquido y en medio
semisólido; a: inicio de un embrión de origen unicelular, b: embrión somático de alcornoque en estado globular en medio
líquido, c: embrión somático de alcornoque en estado corazón en medio líquido, d: embrión cotiledonar en medio líquido, e:
detalle del crecimiento en medio semisólido de un agregado de embriones, f: embriones en diferentes estados de desarrollo
en medio semisólido, g: embriones cotiledonares con 3 cotiledones en medio semisólido, h: embrión somático de alcornoque
en estado cotiledonar.
Desde el punto de vista morfológico, el embrión somático se asemeja al cigótico. Se
identifica la fase globular por que se forman estructuras más densas, esféricas y rodeadas de
una protodermis. El estado corazón se inicia con un alargamiento de la zona radical y dos
abultamientos en la zona del futuro ápice. La fase torpedo sería difícil de identificar sólo por
la morfología y la fase cotiledonar es evidente por la aparición de uno o más cotiledones,
apreciándose un mayor tamaño del cuerpo del embrión en los embriones somáticos que en los
cigóticos.
5. Discusión
El desarrollo inicial del ovario en la flor de Quercus ilex y de Quercus suber es muy
semejante. Ambas especies tienen tres carpelos biloculados con un óvulo en cada lóculo. Una
vez fecundada la flor, sólo uno desarrolla y el resto se atrofian. Este mismo proceso se ha
descrito en otras especies el género Quercus (Mogensen, 1965; Borgart & Nixon, 2003).
El desarrollo del embrión cigótico en la encina y el alcornoque es muy semejante. En
sus primeras fases de desarrollo (globular, corazón, torpedo) los embriones cigóticos de estos
Quercus, también muestran una morfología muy similar a la descrita en las especies modelo
como Arabidopsis thaliana (Dodeman et al. 1997).
Es característico de la embriogénesis somática la existencia de una gran heterogeneidad
y asincronía, fenómeno que se observa también en los cultivos de alcornoque. En medio
sólido y en menor proporción en medio líquido, los cultivos de alcornoque generan embriones
a partir de masas proliferativas por un proceso multicelular que se asemeja a la gemación
(Puijderrajols et al. 1996 y 2000), lo que hace prácticamente imposible la observación de las
fases iniciales del proceso embriogénico, si no es mediante procedimientos histológicos. En
medio líquido sí fue posible obtener imágenes de embriones aislados en todos los estados de
desarrollo posibles. Los embriones aislados con morfologías semejantes a la de los embriones
cigóticos se produjeron con baja frecuencia y coexistieron con embriones de un solo cotiledón
(sobre todo en medio líquido), o con más de dos cotiledones y otras formas aberrantes.
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Aunque son relativamente frecuentes los trabajos que comparan parámetros
bioquímicos del embrión somático con los del embrión cigótico, existen pocas comparaciones
del desarrollo a nivel morfológico, especialmente para especies forestales.El uso de medios
líquidos ha permitido observar la similitud en el desarrollo del embrión somático y el embrión
cigótico en Quercus. Las diferencias que habitualmente se aprecian, parecen guardar más
relación con las condiciones de cultivo, en especial con el tipo de medio, que con el proceso
embriogénico propiamente dicho. Cabe plantearse la mejora de los protocolos de cultivo
modificando las condiciones para lograr una alta frecuencia de embriones aislados con
morfologías semejantes a las del embrión cigótico.
6. Conclusiones
Existe un gran parecido con las especies modelo. La mayor heterogeneidad en el
embrión somático podría considerarse un efecto de las condiciones de cultivo. Por tanto, en
cada fase se puede utilizar la semejanza morfológica del embrión somático con el embrión
cigótico como parámetro de calidad del cultivo.
7. Agradecimientos
Nuestro agradecimiento para Alfredo Cuevas y Noelia Ramírez por su asistencia
técnica. Este trabajo se ha financiado con fondos del Plan Nacional I+D+I (2004-2007) del
MEC a través del Proyecto AGL 2007- 66345-CO2-01.
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