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EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS
EN CULTIVOS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
CARLOS GUILLERMO HERNÁNDEZ PLATA
LYDA KARINA PANTOJA AVILA
SANDRA CATALINA TURRIAGO MOJICA
Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero de Producción Agroindustrial
Director
DRA. BERNADETTE KLOTZ
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
2002
RESUMEN
Para caracterizar el crecimiento de cultivos mixtos y puros de bacterias ácido lácticas
(BAL) en medio MRS se evaluaron diferentes parámetros cinéticos como: pH,
porcentaje de acidez en función de ácido láctico, sólidos solubles totales, contenido de
nitrógeno, conteo de bacterias por métodos indirectos (Densidad óptica) y métodos
directos (conteo total y Número más Probable).
El antagonismo de las BAL tanto del cultivo mixto como de las cepas puras, se llevó a
cabo empleando el método de césped utilizando cuatro indicadores Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853. Se descartó la inhibición por producción de ácido, neutralizando el
sobrenadante centrifugado. La inhibición por peróxido de hidrógeno se descartó
utilizando un medio catalásico.
Después de realizar diferentes tratamientos a los sobrenadantes obtenidos de cultivo
mixto y puros y de evaluar su actividad antimicrobiana se estableció que el efecto
inhibitorio de los sobrenadantes analizados se debe a productos diferentes del ácido
láctico y de los peróxidos de hidrógeno. La inhibición observada puede deberse a
sustancias inhibitorias similares a las bacteriocinas llamadas BLIS utilizando la sigla en
ingles (Llórente 1998).
ABSTRACT
To characterize the growth of pure and mix acid lactic bacterias (BAL) cultures were evaluated different
cinetic parameters such as pH, acidity, total soluble solids, nitrogen content, optical density, viable cell
count and direct cell count.
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 were utilized as indicator bacteria in the agar diffusion method. The antimicrobial activity of
the supernatant of mix and pure culture using unmodified supernatant neutralized, concentrated and
neutralized-concentrated supernatant was evaluated. The inhibition was produced for different subproducts than lactic acid and hydrogen peroxides. The bactericins could be the inhibition agent.
CONTENIDO
Pag
INTRODUCCIÓN
i
OBJETIVOS
3
CAPÍTULO 1
4
MARCO TEÓRICO
4
1. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL)
5
1.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES
5
1.2. GÉNERO STREPTOCOCCUS
7
1.3. GÉNERO LACTOBACILLUS
9
1.3.1 Lactobacillus acidophillus
9
1.3.2. Lactobacillus delbrueckii
10
1.4. GÉNERO BIFIDOBACTERIUM
11
2. FASES DEL CRECIMIENTO
11
2.1. Fase de latencia
11
2.2. Fase logarítmica
12
2.3. Fase estacionaria
12
2.4. Fase de muerte
12
3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS BAL
13
3.1. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS
14
3.2. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Y
METABOLITOS DEL OXÍGENO
OTROS
14
3.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE OTROS COMPUESTOS ORGÁNICOS
15
3.3.1. Dióxido de carbono
15
3.3.2. Diacetilo
15
3.3.3. Acetaldehido
15
3.4. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LAS BACTERIOCINAS
16
3.4.1. Clasificación y estructura de las bacteriocinas
16
3.4.2. Modo de acción de las bacteriocinas
17
3.4.3. Aplicaciones en la industria alimentaria
19
3.4.4. Formas de aplicación de las bacteriocinas en la conservación de alimentos
23
3.4.5. Factores que afectan la eficiencia de las bacteriocinas en los alimentos
23
3.4.6. Tendencias actuales y futuras
24
4. MICROORGANISMOS INDICADORES
25
4.1 Pseudomonas aeruginosa
25
4.2 Bacillus subtilis
26
4.3 Escherichia coli
27
4.4 Staphylococcus aureus
28
CAPÍTULO 2
29
MATERIALES Y MÉTODOS
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
30
1. PRUEBAS PRELIMINARES
34
2. EXPERIMENTACIÓN
35
2.1. ACTIVACIÓN DEL CULTIVO MIXTO DE BAL
35
2.2. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL
36
2.3. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS.
36
2.3.1. Conteo cámara de Neubauer.
36
2.3.2. Número Más Probable.
38
2.3.3. Técnicas turbidométricas
39
2.4. DETERMINACIÓN DEL PH.
41
2.5. DETERMINACIÓN DE LOS SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES.
42
2.6. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE ACIDEZ.
43
2.7. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO TOTAL NITRÓGENO.
45
2.8. CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL
49
2.8.1. Titulación
49
2.8.2. Destilación y titulación
50
2.8.3. Digestión, destilación y titulación
51
2.9. OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
52
2.10. TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DEL PERFIL BIOQUÍMICO DE LAS BAL
54
2.11. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS PUROS
57
2.12. TÉCNICA DE CÉSPED
57
3. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS INDICADORES.
60
4. SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS UTILIZADOS
61
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
1. PRUEBAS PRELIMINARES
63
1.1. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL COMO CULTIVO MIXTO
63
1.2. ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DEL CÉSPED
64
2. CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL
65
2.1. TITULACIÓN
66
2.2. DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
66
2.3. DIGESTIÓN, DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
68
3. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN CULTIVO MIXTO
70
3.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS EN FUNCIÓN DEL
TIEMPO
71
3.2. DETERMINACIÓN DE OTROS PARÁMETROS DE CRECIMIENTO
72
4. OBTENCIÓN Y DETERMINACIÓN DEL PERFIL BIOQUÍMICO DE CULTIVOS PUROS
75
5. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS PUROS
75
5.1. MEDICIÓN DE LA DENSIDAD ÓPTICA A TRAVÉS DEL TIEMPO PARA LOS CULTIVOS
PUROS
75
5.2. MEDICIÓN DE pH y PORCENTAJE DE ACIDEZ EN FUNCIÓN DEL TIEMPO PARA LOS
CULTIVOS PUROS
77
5.3. MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES A TRAVÉS DEL
TIEMPO PARA LOS CULTIVOS PUROS
78
6. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS
78
6.1. SOBRENADANTE OBTENIDO DIRECTAMENTE DE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO
MIXTO
79
6.2. CONCENTRACIÓN DEL SOBRENADANTE
79
6.3. EFECTO INHIBITORIO DE SOLUCIONES DE ÁCIDO LÁCTICO
79
6.4. INFLUENCIA DEL pH EN LA ESTABILIDAD DEL EFECTO INHIBITORIO
80
6.4.1. Sobrenadante con pH final de 4.0, 4.5, 5.0 y 7.0
80
6.4.2. Sobrenadantes neutralizados obtenidos de fermentaciones con pH
controlado
80
6.4.3. Sobrenadantes neutralizados obtenidos de fermentaciones en ausencia
de oxígeno
80
6.4.4. Sobrenadante a diferentes tiempos de fermentación
81
6.5. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA ESTABILIDAD DEL EFECTO
INHIBITORIO
81
CAPÍTULO 4
ANÁLISIS DE RESULTADOS
1. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN CULTIVO MIXTO
83
1.1. CURVA DECRECIMIENTO
83
1.2. DENSIDAD ÓPTICA (ABSORBANCIA) CON LONGITUD DE ONDA DE 600 nm
83
1.3. COMPORTAMIENTO DEL pH Y PORCENTAJE DE ACIDEZ
83
1.4. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES
83
1.5. CONTENIDO TOTAL DE NITRÓGENO
84
2. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN CULTIVOS PUROS.
85
2.1. CURVA DE CRECIMIENTO
85
2.2. COMPORTAMIENTO DEL pH Y PORCENTAJE DE ACIDEZ
89
2.3. PORCENTAJE DE SÓLIDOS TOTALES
90
3. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS
90
CONCLUSIONES
93
RECOMENDACIONES
95
BIBLIOGRAFÍA
98
LISTA DE TABLAS
6
1.
Diferenciación de los principales géneros de bacterias ácido lácticas.
2.
Resultados de la fermentación del cultivo mixto utilizando diferentes
cantidades de inóculo.
63
3.
Resultados preliminares obtenidos durante la fermentación del cultivo
mixto de BAL en caldo MRS a 41°C.
Concentración de microorganismos indicadores cultivados durante 24
horas en caldo Mueller Hinton a 37°C.
64
5.
Volumen de 10 gotas de ácido clorhídrico 0.1004 N en una bureta de 25 ml.
66
6.
Porcentajes de error de exactitud para la curva de calibración de la destilación en el
método de Kjeldahl.
67
7.
Porcentajes de error de exactitud para la curva de calibración de la Digestión, Destilación
y Titulación en el método Kjeldahl.
69
8.
Conteo de microorganismos cultivo mixto.
71
9.
Parámetros de crecimiento del cultivo mixto en función del tiempo.
73
10.
Porcentaje de nitrógeno en función del tiempo cultivo mixto.
74
11.
Resultados del perfil bioquímico realizado a los aislamientos del cultivo mixto BIOFLORA
ABY 424.
75
12.
Densidad óptica de las cepas aisladas.
76
13.
pH y porcentaje de acidez para cepas aisladas.
77
14.
Halos de inhibición obtenidos con sobrenadante SCm48AScoSc y pH 4.0
Halos de inhibición obtenidos con sobrenadantes concentrados de los
cultivos aislados y mixto.
79
Halos de inhibición obtenidos con soluciones de ácido láctico.
Halos de inhibición obtenidos con sobrenadante SCm48AScoSc y pH de
4.00, 4.50, 5.00 y 7.00.
Resultados con sobrenadantes obtenidos de fermentaciones con pH
controlado y sin controlar.
Resultados con sobrenadantes obtenidos de la fermentación en ausencia
de oxígeno.
Resultados con sobrenadantes a diferentes tiempos de fermentación.
79
21.
Tabla de análisis de varianza para la densidad óptica de las cepas
aisladas.
86
22.
Comparativo en el análisis de varianza para la densidad óptica de las
cepas aisladas.
87
23.
Sumatoria de las densidades ópticas de las cepas aisladas necesarias
para el análisis de varianza
87
4.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
65
79
80
80
81
81
24.
Tabla de análisis de varianza para el pH de las cepas aisladas
89
25.
Comparativo en el análisis de varianza para el pH de las cepas aisladas
89
LISTA DE FIGURAS
1.
Fermentación de la glucosa en bacterias ácido lácticas homofermentativas
y heterofermentativas.
5
2.
Micrografía de contraste y electrónica de Streptococcus.
8
3.
Micrografía de contraste y electrónica de Lactobacillus acidophillus.
10
4.
Micrografía de contraste de fases y electrónica de Lactobacillus delbrueckii
10
5.
Micrografía de contraste de fases y electrónica de Bifidobacterium
11
6.
Curva de crecimiento en un cultivo bacteriano.
12
7.
Mecanismo general de acción de las bacteriocinas de las bacterias lácticas en las células
Gram-positivas sensibles.
18
8.
Ejemplo de la interacción de bacteriocinas en un sistema de barreras destinado a mejorar
la calidad microbiológica de los alimentos.
20
9.
Micrografía de contraste y electrónica de Pseudomonas aeruginosa.
25
10.
Micrografía de contraste y electrónica de Bacillus subtilis.
27
11.
Micrografía de contraste y electrónica de Escherichia coli.
28
12.
Micrografía de contraste y electrónica de Staphylococcus aureus.
29
13.
Espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible
40
14.
Potenciómetro Metrohm.
41
15.
Equipo de digestión de Kjeldahl (Derecha) y Scruber (Izquierda).
47
16.
Equipo de destilación de Kjeldahl.
47
17.
Ejemplo de la galería API 50CH
53
18.
Ejemplo de la técnica de difusión en agar (césped).
57
19.
Espectrofotómetro Spectronic 20 D
61
ANEXOS
A. FICHA TÉCNICA DEL CULTIVO BIOFLORA ABY 424
99
B. COMPOSICIÓN CALDO MRS
100
C. COMPOSICIÓN AGAR MRS
101
D. COMPOSICIÓN CALDO MUELLER HINTON
102
E. COMPOSICIÓN AGAR MUELLER HINTON
103
F. COMPOSICIÓN DEL MEDIO CHL
104
G. COMPOSICIÓN DE LA GALERIA API 50 CH
105
H.
RESULTADOS
DESTILACIÓN
OBTENIDOS
CON
LA
CURVA
DE
CALIBRACIÓN
I. RESULTADOS OBTENIDOS CON LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE LA
DESTILACIÓN TITULACIÓN
DE
LA
DIGESTIÓN
J. RESULTADOS PERFIL BIOQUÍMICO OBTENIDO CON EL API
K. CÓDIGOS EMPLEADOS PARA IDENTIFICAR LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS QUE
SE REALIZARON A LOS SOBRENADANTES
106
107
108
109
L. CONTEO DE BACTERIAS CULTIVO MIXTO UTILIZANDO LA TÉCNICA DEL NMP
110
M. CONTEO EN CÁMARA DE NEUBAUER CULTIVO MIXTO
111
N. DENSIDAD ÓPTICA CULTIVO MIXTO λ = 600nm
112
Ñ. pH DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO
113
O. PORCENTAJE DE ACIDEZ DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO
114
P. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL
CULTIVO MIXTO
115
Q. VARIACIÓN DEL PORCENTAJE DE NITRÓGENO DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL
CULTIVO MIXTO
116
R.
PARÁMETROS DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO MIXTO Y VARIACIÓN DEL pH,
PORCENTAJE DE ACIDEZ Y PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES DURANTE LA
FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO.
117
S. VARIACIÓN DEL pH PARA LAS CEPAS AISLADAS
118
T. VARIACIÓN DE PORCENTAJES DE ACIDEZ PARA LAS CEPAS AISLADAS
119
U. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES CEPAS AISLADAS
120
V. CORRECCIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE SACAROSA.
121
W. GRÁFICA DE COMPARACIÓN ENTRE DENSIDAD ÓPTICA Y CURVA DE
CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO
122
X. PORCENTAJE DE ACIDEZ CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES
123
Y. pH CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES
124
W. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES
125
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades gastrointestinales (salmonelosis, tifoidea, cólera, listeriosis,
shiguelosis, tuberculosis, yersiniosis, difteria y hepatitis infecciosa) están asociadas al
consumo de alimentos contaminados con microorganismos patógenos o sus toxinas,
que al ser ingeridos por el ser humano subsisten en el tracto intestinal y pueden iniciar
un proceso infeccioso (Doyle 1997).
Los microorganismos patógenos más comunes en alimentos son: Listeria monocytogenes, Clostridium
botulinum, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Clostridium sporogenes, Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Shigella sonnei, Bacillus
cereus y Vibrio cholerae (Carminati et al. 1989).
Para prevenir el crecimiento de microorganismos patógenos en alimentos se requiere del uso de métodos
de conservación tales como: tratamiento térmico, refrigeración, congelación y conservadores químicos. El
tratamiento térmico y la congelación alteran las características fisicoquímicas del alimento. La
refrigeración por sí sola garantiza una corta vida de anaquel, además que microorganismos como Listeria
monocytogenes que son psicrótrofos pueden crecer a temperaturas de refrigeración comercial (4°C). La
alternativa ha sido por mucho tiempo el uso de conservadores químicos como: dióxido de sulfuro, sulfitos,
parabenos, ácido acético, ácido láctico, ácido propiónico, ácido benzóico, ácido sórbico, nitritos y nitratos
(Stiles 1996).
En la actualidad el mercado demanda productos libres de conservadores químicos y mínimamente
tratados, de manera que no se modifiquen las características fisicoquímicas del alimento. Una alternativa
para la solución de este problema es el uso de bacteriocinas (Stiles 1996). Las bacteriocinas son un
grupo de sustancias antimicrobianas de origen bacteriano caracterizadas por poseer un componente
proteico biológicamente activo y por ejercer una acción bactericida (Tagg et al. 1976). Hasta el momento,
la única bacteriocina permitida para uso en más de 45 países es la nisina (Stiles 1996) por lo que la
búsqueda de nuevas bacteriocinas ha constituido un campo extenso de investigación en los últimos años.
Con este proyecto se pretende evaluar la presencia de bacteriocinas en cultivos puros y mixtos de
bacterias ácido lácticas y estandarizar la metodología a emplear en el proyecto macro "Caracterización
fisicoquímica y microbiológica del Suero Costeño y evaluación de la presencia de bacteriocinas”. El Suero
Costeño es un producto lácteo fermentado, elaborado con leche de vaca y obtenido por la separación
mecánica del lacto suero. La zona típica de producción está localizada en la región de la costa Atlántica
en la mayoría de los municipios de los departamentos del Magdalena, Cesar,
evaluación de la presencia de bacteriocinas”.
Para caracterizar el crecimiento de cultivos mixtos y puros de bacterias ácido lácticas
(BAL) en medio MRS se evaluaron diferentes parámetros cinéticos como: pH, % de
acidez en función de ácido láctico, sólidos solubles totales, contenido de nitrógeno,
conteo de bacterias por métodos indirectos (Densidad óptica) y métodos directos
(conteo de totales y Número más Probable ).
El antagonismo de las BAL tanto del cultivo mixto como de las cepas puras, se llevara a
cabo empleando el método de césped utilizando cuatro indicadores Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853. La inhibición por producción de ácido, se evitará neutralizando el
sobrenadante centrifugado. La inhibición por peróxido de hidrógeno se descartará
utilizando un medio catalásico.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la presencia de bacteriocinas en cultivos puros y mixtos de bacterias ácido lácticas de paquetes
comerciales.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar el crecimiento de las bacterias ácido lácticas en cultivos mixtos y puros comerciales.
Evaluar la presencia de bacteriocinas en el sobrenadante de cultivos mixtos y puros comerciales.
Establecer las condiciones de pH y temperatura óptimas de estabilidad de las bacteriocinas .
CAPÍTULO 1
MARCO TEÓRICO
1. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
1.1
CARACTERÍSTICAS GENERALES
Son un grupo de bacterias Gram-positivas, muy heterogéneo desde un punto de vista filogenético. A los
cuatro géneros tradicionales: Streptococcus (actualmente subdividido en Streptococcus, Lactococcus,
Vagococcus y Enterococcus), Lactobacillus, Pediococcus y Leuconostoc, se han añadido otros como
Weissella, Oenococcus, Atopobium, Alloicoccus, Aerococcus, Tetragenococcus y Carnobacterium
(Schleifer et al., 1995).
Estas bacterias no esporuladas, comúnmente no móviles producen ácido láctico como un producto
principal o único del metabolismo fermentativo. Los miembros de este grupo carecen de porfirinas y
citocromos, no realizan fosforilación por transporte de electrones y de ahí que reciban su energía sólo por
fosforilación a nivel sustrato. Todas las bacterias ácido lácticas crecen de manera anaeróbica. Sin
embargo, a diferencia de muchos, la mayor parte de ellas no son sensibles a O2 y pueden crecer en su
presencia o ausencia; por tanto, son anaerobios aerotolerantes. Algunas cepas son capaces de tomar O2
por medio de sistemas de flavoproteína oxidasa, produciendo H2 O2 aunque la mayoría de las cepas
carecen de catalasa y muchas disponen de H2O2 por medio de enzimas alternativas llamadas
peroxidasas. No se forma ATP en la reacción flavoproteínas oxidasa, pero el sistema oxidasa puede
emplearse para reoxidación de NADH. La mayor parte de las bacterias ácido lácticas pueden obtener
energía solo de la fermentación de los carbohidratos y compuestos relacionados y de ahí que estén
restringidos a habitats en que existen azúcares. Por lo general, tienen una capacidad biosintética limitada
y sus requerimientos nutricionales complejos incluyen necesidades de aminoácidos, vitaminas, purinas y
pirimidinas. Una diferencia importante entre los subgrupos de las bacterias ácido lácticas se basa en la
naturaleza de los productos que se forman en la fermentación de los azúcares. Un grupo denominado
homofermentativo, produce un único producto de fermentación, el ácido láctico, mientras que el otro
grupo denominado heterofermentativo produce otros productos, en
particular etanol y CO2.(Figura 1)
Figura 1. Fermentación de la glucosa en bacterias ácido lácticas homofermentativas y
heterofermentativas.
Fuente : Microbiología de Brock T, Smith D. y Madigan M. 1987.
Las diferencias observadas en los productos de fermentación son determinados por la
presencia o ausencia de la enzima aldolasa, una de las enzimas claves en la glucólisis.
Los heterofermentadores carentes de aldolasa no pueden descomponer el difosfato
hexosa a fosfato triosa. En lugar de ello, oxidan glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconato y
entonces descarboxilan esto a pentosa fosfato que se transforma en triosa fosfato y
acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa. La triosa fosfato se convierte por
último en ácido láctico con la producción de 1 mol de ATP, mientras el acetilfostato
entonces descarboxilan este a pentosa fosfato que se transforma en triosa fosfato y
acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa. La triosa fosfato se convierte por
último en ácido láctico con la producción de 1 mol de ATP, mientras el acetilfostato
acepta electrones a partir de NADH generado durante la producción de pentosa fosfato
y así se convierte en etanol sin producción de ATP. Debido a esto, los
heterofermentadores producen solo 1 mol de ATP a partir de glucosa en lugar de 2
moles, como los homofermentadores. Esta diferencia en el producto de ATP a partir de
glucosa refleja el hecho de que los homofermentadores producen el doble de masa que
los heterofermentadores de la misma cantidad de glucosa. Dado que los
heterofermentadores descarboxilan 6-fosfogluconato, producen CO2 como un producto
fermentativo, mientras que los homofermentadores producen poco o nada de CO2; por
tanto, una forma simple de detectar un heterofermentador es observar la producción de
CO2 en cultivos de laboratorio. A nivel de enzima, los heterofermentadores se
caracterizan por la falta de aldolasa y la presencia de fosfocetolasa. Muchas cepas de
heterofermentadores pueden utilizar oxígeno como aceptor de electrones con una
flavoproteina que sirve como donador de electrones. En esta reacción, la mitad de
NADH generada por la oxidación de la glucosa a ribosa es transferida a una flavina y en
O2. El acetil fosfato puede entonces convertirse en acetato en lugar de ser reducido a
etanol y se sintetiza un ATP adicional.
Los diversos géneros de bacterias ácido lácticas han sido definidos en base a la
morfología y al tipo de metabolismo fermentativo como aparece en la siguiente tabla.
Tabla 1. Diferenciación de los principales géneros de bacterias ácido lácticas.
DNA (mol % G + C)*
Género
Forma de célula y
organización
Fermentación
Streptococcus
Cocos en cadenas
Homofermentativa
33 - 40
Leuconostoc
Cocos en cadenas
Heterofermentativa
38 – 41
Pediococcus
Cocos en tétradas
Homofermentativa
38
1 Bacilos
generalmente en
cadena
Homofermentativa
2. Bacilos
generalmente en
cadena
Heterofermentativa
Lactobacillus
34 -50
36 -56
Fuente : Microbiología de Brock T, Smith D. y Madigan M 1987. * (Guanina, Citosina)
Los miembros de los géneros Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus tienen
composiciones de relación de bases de DNA bastante similares. Además existe una
pequeña variación de cepa a cepa. El género Lactobacillus por el contrario, tiene
miembros con composiciones de DNA diversas y de aquí que no constituya un grupo
homogéneo.
Las bacterias ácido lácticas tienen una gran importancia económica ya que las
actividades metabólicas que desarrollan en los alimentos y fundamentalmente la
producción de ácido láctico con el consiguiente descenso del pH, inducen cambios en la
textura, aroma, sabor, color, digestibilidad y palatabilidad de las materias primas,
originando unos productos finales con unas características organolépticas diferentes y
deseables. (Martinez Mago, Martinez J.Ma, Herranz C., Suarez A.M. y Rodriguiez J.M.,
2000). Además de su función tecnológica las bacterias lácticas secretan metabolitos
que inhiben el crecimiento de microorganismos alterantes y patógenos potencialmente
presentes en los alimentos que incluyen entre otros, bacterias de los géneros
Pseudomonas, Salmonella, Clostridium, Staphylococcus y Listeria, lo que las convierte
en la flora predominante de una gran variedad de productos fermentados, de carnes y
pescados conservados en refrigeración, envasados al vacío y en atmósferas
modificadas.
Por otra parte la seguridad e inocuidad de las bacterias ácido lácticas (BAL) asociadas
a los alimentos se ha aceptado durante mucho tiempo y en la actualidad se consideran
microorganismos GRAS (Generally Recognized as safe ), lo que sugiere su utilización
como agentes antimicrobianos (bioconservantes) para incrementar la calidad higiénica y
extender la vida útil de los alimentos. Los principales mecanismos de antagonismo
microbiano de las BAL son la competencia por los nutrientes del sustrato y la formación
de ácidos orgánicos (ácido láctico y ácido acético), principalmente con el consiguiente
descenso del pH. No obstante las bacterias ácido lácticas también producen otras
sustancias antimicrobianas como: diacetilo, acetaldehído, peróxido de hidrógeno y otros
metabolitos del oxígeno y otros compuestos no proteicos de pequeño tamaño
molecular. Por último las BAL también producen sustancias antimicrobianas proteicas
de síntesis ribosomal denominadas bacteriocinas.
1.2
GÉNERO STREPTOCOCCUS
Los cocos de éste género, perteneciente a las BAL, se disponen característicamente en
pares o cadenas largas o cortas, dependiendo de las especies y condiciones de
crecimiento, pero nunca en paquetes o en masas. Todos son homofermentativos. Los
estreptococos se pueden clasificar serológicamente mediante una reacción de
precipitinas en grupos llamados de Lancefield, que se designan con letras mayúsculas
(A,B,C,D, etc.), pero generalmente los que son importantes en los alimentos se dividen
en cuatro grupos: piógenos, viridans, lácticos y enterococos.
Los del grupo viridans incluyen el Streptococcus. Thermophilus (Figura 2), importante
en los quesos y leches fermentadas como el yogur. Estas especies crecen a 45°C pero
no a 10°C.
El grupo láctico comprende las bacterias de la leche Streptococcus lactis y
Streptococcus cremoris, que crecen a 10°C pero no a 45°C.
El género Streptococcus contiene una alta variedad de especies con habitats muy
diferentes cuyas actividades son de importancia práctica para el hombre. Algunos
miembros son patógenos para las personas y los animales. Como productores de ácido
láctico, ciertos Streptococcus, desempeñan papeles importantes en la producción de
leche agria, de ensilados y otros productos fermentados. Para distinguir los
Streptococcus generalmente no patógenos de las especies patógenas para el hombre,
se realizó una reclasificación. El género Lactococcus contiene Streptococcus
significativos en la industria de lácteos, mientras que el género Enterococcus se ha
creado para agrupar los estreptococos, en primer lugar de origen fecal.
Algunas cepas de Streptococcus, producen un color rojizo al crecer en agar o forman
un pigmento amarillo o naranja al crecer en caldo que contenga almidón. El crecimiento
en medios artificiales es escaso. Las colonias crecidas en agar son pequeñas. La
superficie de las colonias es traslúcida. La mayoría de las especies son aerotolerantes y
unas pocas cepas son anaerobias estrictas. Otras cepas atacan las proteínas con la
producción de gas y olor fétido. Algunas cepas son homofermentativas y en su
fermentación producen principalmente ácido láctico. No transforman el nitrato en nitrito.
No son solubles en bilis. Se encuentran principalmente en la boca y el intestino del
hombre y otros animales, en productos lácteos, y en fermentos.
Figura 2. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Streptococcus
Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods. C. www.anaka.livstek.lth.se (Mayo de 2002)
1.2.1 Streptococcus salivarius
Son células Gram-positivas, esféricas o elipsoidales de 0.6 a 0.8 micrones de diámetro
y usualmente forman pequeñas cadenas. Las células son relativamente largas en
medio líquido, especialmente en leche.
En un medio sólido común las colonias son blancas, pequeñas y no crecen más de 0.5
mm de diámetro.
En un medio sólido que contenga 5% de sucrosa o rafinosa, las colonias son largas,
suaves, mucosas y el diámetro de la colonia es como el producido por las bacterias
coliformes y las levaduras. Esto es distintivo de esta especie, ya que ningún otro
Streptococcus produce colonias de este tipo en agar que contenga sucrosa o rafinosa.
En agar sangre no se ha demostrado la producción de toxinas solubles ni la hemólisis
en este medio.
En caldo el crecimiento es variable, en algunas ocasiones los microorganismos floculan
y el sobrenadante es fluido y se forman cadenas largas, o hay turbidez uniforme o
granular en el sobrenadante con poca decantación del flóculo y pequeñas cadenas.
Tolerancia química: Toleran un 2% de sal, pero no alcanzan a tolerar 4 %. El pH final
en caldo glucosado se encuentra entre 4.4 y 4.0. No crecen a un pH de 9.6. Toleran el
azul de metileno en 0.01% pero no lo hacen en 0.1 %. Son inhibidos en agar sangre
que contenga un 30% de bilis. No producen catalasa.
Relaciones de temperatura: El crecimiento óptimo se encuentra entre 37°C y 43°C. La
máxima temperatura de crecimiento es 45°C, pero a 47°C y a 10°C no hay crecimiento.
No sobreviven 30 minutos a 60°C. Son anaerobias facultativas.
Se pueden encontrar en la saliva y esputo, en varias infecciones pulmonares, abscesos
dentales, en caries de los dientes y en el tracto intestinal. Su hábitat se encuentra en la
boca humana, garganta y nasofaringe.
1.3
GÉNERO LACTOBACILLUS
Son bacilos, generalmente largos y delgados, que en la mayoría de las especies forman
cadena. Son aerotolerantes, aunque existen algunos anaerobios estrictos; catalasanegativos y Gram-positivos. Los lactobacilos homofermentativos presentan
temperaturas óptimas de 37°C o incluso superiores y comprenden especies como L.
bulgaricus, L. helveticus, L. lactis, L. acidophillus, L. thermofilus y L. delbrueckii. Todas
las especies citadas, excepto L. delbrueckii son fermentadoras de la lactosa con
producción de ácido láctico y, en consecuencia, de interés en la industria láctea.
En los lactobacillos es característica la forma de bastoncillo que varía de largos y
delgados a Lactobacillus acidophillus curvos. La mayor parte de las especies son
homofermentativos, pero algunos son heterofermentativos. La formación de pigmentos
es escasa, pero cuando se presenta es de color amarillo, naranja o color ladrillo. El
crecimiento en superficie es pobre (excepto el género Microbacterium), porque esta
bacteria es generalmente anaeróbica. Los carbohidratos y polisacáridos son
transformados por la homofermentación en ácido láctico o por heterofermentación en
ácido láctico, propiónico o butírico, en alcohol y dióxido de carbono. El crecimiento en
papa es pobre. No licua la gelatina, los nitratos no los reduce a nitritos (excepto el
género Microbacterium). Varias especies crecen a temperaturas relativamente altas.
Pueden producir o no, catalasa.
El género se ha dividido en dos subgrupos principales:
o Homofermentativos: su producto principal es el ácido láctico, no forma gas a
partir de glucosa. Existen dos sub-grupos: 1. Crecen a 45°C pero no a 15°C y
son Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus Lactis. 2.
Crecen a 15°C, desarrollo variable a 45°C y son Lactobacillus acidophillus y
corineformes, ácidos teitóicos del glicerol y del ribitol (Lactobacillus caseii,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus).
o Heterofermentativos: produce alrededor de 50% de ácido láctico a partir de
glucosa; produce CO2 y etanol; fosfocetolasa presente; Lactobacillus
acidophillus, ácido teicoico del glicerol y son Lactobacillus fermentum,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri y Lactobacillus kefir.
1.3.1 Lactobacillus acidophillus
Tienen un tamaño de 0.6 a 0.9 por 1.5 a 6.0 micrones. Se encuentran solos, en parejas
y en cadenas pequeñas que se redondean al final (Figura 3). No tienen movimiento, sus
dimensiones son variables y son Gram-positivas. En agar Wort o agar de tomate se
forman vellosidades delicadas y torcidas en la superficie y la periferia de las colonias.
En el centro se forma una masa que parece filtro la cual es gruesa y oscura. Las
colonias son gruesas y de forma irregular.
En leche el crecimiento es lento con poco inóculo y coagula del fondo a la superficie.
Forma ácido o gas de la glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, galactosa, manosa,
maltosa. Algunas cepas fermentan la rafinosa y la trealosa y actúan levemente sobre la
dextrina.
Temperatura óptima de crecimiento: 37°C. No crecen entre 20 a 22°C. La temperatura
máxima de crecimiento 43°C a 48°C. Son microaerófilos.
Figura 3. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Lactobacillus acidophillus.
Fuente: Microbiología de Brock T, Smith D. y Madigan M 1987
1.3.2 Lactobacillus delbrueckii
Tienen un tamaño de 0.5 a 0.8 por 2.0 a 9.0 micrones (Figura 4 ).
Figura 4. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Lactobacillus delbrueckii.
Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods.C. www.anaka.livstek.lth.se (Mayo de 2002)
Pueden encontrarse solos y en pequeñas cadenas, no son móviles y Gram-positivos.
Las colonias sembradas en gelatina son pequeñas, grises, y circulares no licuadas.
Colonias sembradas en agar: Pequeñas y planas.
Las colonias sembradas en eslant: son angostas, traslúcidas y con líneas grisáceas.
No trasforman los nitratos en nitritos, el ácido lo obtienen de la fermentación de la
maltosa, sucrosa, glucosa, fructosa galactosa y dextrina. Es el organismo que tolera la
más alta temperatura durante la fermentación. La temperatura óptima de crecimiento es
de 45°C y son microaerófilos.
1.4
GÉNERO BIFIDOBACTERIUM
Son células Gram-positivas, no móviles, catalasa negativos presentes generalmente en
microcolonias lisas y no poseen filamentos al final de la célula, presentan bifurcación
(sencilla o doble) y son anaeróbicos. Este género es uno de los cuatro géneros de las
bacterias ácido lácticas con forma de bastón (Figura 5) y producen ácido láctico
dextrorrotatorio.
Figura 5. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Bifidobacterium
Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods.C. www.anaka.livstek.lth.se (Mayo de 2002)
2.
FASES DE CRECIMIENTO
Después de la inoculación de una solución nutritiva estéril con microorganismos y su
cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases típicas de crecimiento: fase
de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte (Figura 6).
2.1
FASE DE LATENCIA
Cuando las células se transfieren de un medio a otro no existe inicialmente aumento en
el número de células, aunque la masa celular puede cambiar. Durante la fase de
latencia, los microorganismos se adaptan a su nuevo ambiente. Debido a este cambio
de ambiente, es probable que las células inoculadas produzcan cambios en varios
parámetros: cambios en el valor de pH, aumento en el suministro de nutrientes,
descenso en los inhibidores del crecimiento. En las células deben ser inducidos nuevos
sistemas de transporte. Fuera de la célula pueden difundir cofactores esenciales y las
enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a las nuevas condiciones. Además,
sistemas de transporte. Fuera de la célula pueden difundir cofactores esenciales y las
enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a las nuevas condiciones. Además,
la condición fisiológica del inóculo es crucial respecto de la longitud de la fase de
latencia. Si el cultivo que se va utilizar como inóculo se encuentra todavía en la fase
logarítmica, puede no existir periodo de latencia y el crecimiento puede comenzar
inmediatamente. Sin embargo, el inóculo que se toma de un cultivo en el que se ha
detenido el crecimiento debido a una limitación de un substrato necesita más tiempo
para adaptarse a la nueva solución de nutrientes. La concentración del inóculo tiene
también influencia en la fase de latencia.
Figura 6. Curva de crecimiento de un cultivo bacteriano.
Fuente: Manual de Microbiología Industrial 1987
2.2
FASE LOGARÍTMICA
Al final de la fase de latencia las células se han adaptado a las nuevas condiciones de
crecimiento. El crecimiento de la masa celular puede ahora ser descrito
cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de
tiempo (levaduras y bacterias) o por la duplicación de la biomasa por unidad de tiempo
(organismos filamentosos como estreptomicetos y hongos). Representando el número
de células o la biomasa frente al tiempo en una relación lineal.
Aunque las células alteran el medio debido a la toma de substratos y la secreción de
productos metabólicos, la velocidad de crecimiento permanece constante durante la
fase logarítmica. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentración de
substrato en tanto que exista exceso de substrato.
2.3
FASE ESTACIONARIA
Tan pronto como el substrato es metabolizado o se han formado sustancias tóxicas, el
crecimiento desciende o se detiene completamente. La biomasa aumenta solo
gradualmente o permanece constante durante esta fase, aunque la composición de la
células puede cambiar. Debido a la lisis se liberan nuevos substratos (carbohidratos,
proteínas) que pueden servir como fuente de energía para el crecimiento de los
supervivientes. Los distintos metabolitos formados en la fase estacionaria son
frecuentemente de gran interés biotecnológico.
2.4 FASE DE MUERTE
En esta fase la reservas de energía de las células se agotan. Cuando se representan
en forma semilogarítmica los supervivientes en función del tiempo, puede ser obtenida
una línea recta, lo que indica que las células mueren a una velocidad exponencial.
La longitud de tiempo entre la fase estacionaria y la de muerte dependen del organismo
y del proceso utilizado. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se
interrumpe al final de la fase logarítmica o antes de que comience la fase de muerte.
Estas fermentaciones discontinuas (en “batch”) pueden ser consideradas como
sistemas cerrados. A tiempo cero T = 0, la solución esterilizada de nutrientes se inocula
con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones
óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto
oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el
pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la
concentración de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado
del metabolismo de las células.
3.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS BAL
Las BAL además de su función tecnológica, contribuyen a la conservación de los
alimentos fermentados debido a su capacidad de inhibir el desarrollo de
microorganismos alterantes y patógenos, que incluyen, entre otros, bacterias de los
géneros Pseudomonas, Salmonella, Clostridium, Staphylococcus y Listeria. El efecto
antimicrobiano primario de las BAL se debe a la competencia por los nutrientes y a la
producción de ácidos orgánicos, con el consiguiente descenso del pH. No obstante,
también producen otras sustancias antimicrobianas como el etanol, el dióxido de
carbono, el diacetilo, acetaldehído, el peróxido de hidrógeno y las bacteriocinas. A
continuación se describen las principales características bioquímicas, modo de acción y
espectro antimicrobiano de los ácidos orgánicos, metabolitos del oxígeno y productos
finales del catabolismo.
3.1
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS
Las BAL producen ácido láctico por la fermentación de la glucosa y otras hexosas, así
como también pueden producir ácido fórmico, ácido acético y etanol por la fermentación
de otros sustratos. Estos ácidos una vez sintetizados se liberan al medio extracelular,
donde además de contribuir a las características organolépticas , inhiben o retardan el
desarrollo de un gran número de microorganismos alterantes y patógenos, entre los que
se encuentran Escherichia coli, Pseudomonas spp, Salmonella spp. y Clostridium spp.
También se ha determinado que los ácidos orgánicos inhiben la germinación de las
esporas de Bacillus cereus, de Clostridium tyrobutyricum, así como el desarrollo de
algunos hongos y levaduras. La eficacia antimicrobiana de los ácidos orgánicos débiles
esta relacionada principalmente con la concentración de las formas moleculares
(fracción no disociada), por lo tanto a valores bajos de pH aumenta la eficacia
antimicrobiana de estas sustancias.
3.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
Y OTROS METABOLITOS DEL OXÍGENO
Los metabolitos producidos en el desarrollo en aerobiosis de la mayoría de las BAL
conlleva la formación de metabolitos del oxígeno, principalmente peróxido de hidrógeno
(H2O2 ), aniones superóxido (O2-) y radicales hidroxilo (-OH), los cuales poseen una gran
toxicidad debido a su elevado poder oxidante. Estos metabolitos poseen un efecto
bacteriostático o bactericida sobre un gran número de microorganismos debido
principalmente a la inactivación de enzimas, como gliceraldehido- 3P -deshidrogenasa,
lactato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa o determinadas coenzimas como la
coenzima A, por la oxidación de sus grupos sulfidrilo. No obstante, esta actividad
antimicrobiana también puede deberse al aumento de la permeabilidad de las
membranas debido a la peroxidación de los lípidos y a los daños del material genético,
como la rotura de enlaces inter e intra catenarios del ADN, la alteración de bases
nitrogenadas, la liberación de nucleótidos y la inhibición de la replicación cromosómica.
3.3
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
ORGÁNICOS
DE
OTROS
COMPUESTOS
Además de los ácidos orgánicos y de los metabolitos del oxígeno existen diferentes
compuestos que se presentan en menor proporción.
3.3.1 Dióxido de carbono
Las BAL producen CO2 como consecuencia de un metabolismo heterofermentativo de
los hidratos de carbono. El efecto antimicrobiano del CO2 se conoce desde hace tiempo
y parece deberse a: 1. La creación de condiciones anaeróbicas que inhiben el
crecimiento de microorganismo aerobios obligados; 2. Un descenso del pH por la
formación de ácido carbónico; 3. Una acción antimicrobiana específica de la propia
molécula.
3.3.2 Diacetilo
Es un compuesto volátil producido en la vía de degradación del piruvato, por algunas
especies y cepas de los géneros Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus,
Pediococcus y Lactobacillus. En la mayoría de los casos debido al efecto represor del
metabolismo fermentativo de las hexosas la producción de diacetilo se limita a la fase
estacionaria, ya que durante esta disminuyen los requerimientos en ATP por lo que el
piruvato que comienza a acumularse se transforma en diacetilo. Una vez sintetizado ,
se libera al medio extracelular donde además de contribuir al desarrollo de la aroma de
productos fermentados como la mantequilla y algunos tipos de quesos, ejerce una
fuerte acción antimicrobiana frente a un gran número de bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas, hongos y levaduras.
Aunque aun no se conocen con exactitud los mecanismos por los que el diacetilo ejerce
esa actividad antimicrobiana parece ser que en los microorganismos sensibles inactiva
enzimas, como la alcohol deshidrogenasa, la adenilato ciclasa y la glutamato
deshidrogenasa. La concentración de diacetilo en los alimentos es tan pequeña que no
es suficiente por si sola para ejercer una acción antimicrobiana, aunque su actividad se
incrementa a valores bajos de pH, generalmente inferiores a 5.
3.3.3 Acetaldehído
Es el principal componente aromático de algunos productos lácteos fermentados, como
el yogur, contiene una aldolasa que metaboliza la treonina en acetaldehído y glicina.
Estos microorganismos no degradan el acetaldehído, por lo que éste se acumula en el
medio a una concentración aproximada de 25 ppm. Se ha demostrado que
concentraciones de acetaldehído entre 10 – 100 ppm inhiben el crecimiento de
microorganismos alterantes y patógenos de la leche, como St. aureus, S. typhimurium y
E. coli.
3.4
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LAS BACTERIOCINAS
Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos que se sintetizan a nivel ribosómico y que,
posteriormente, pueden sufrir modificaciones postraduccionales. Anteriormente se pensaba que sólo eran
activas frente a bacterias que guardaban una estrecha relación taxonómica con la especie productora,
hoy en día se sabe que existen algunas bacteriocinas que son activas frente a microorganismos
taxonómicamente distantes de la especie bacteriocinogénica. Por esta razón Koninsky realizó una
definición más general sobre las bacteriocinas: son agentes antimicrobianos de naturaleza peptídica cuya
síntesis no es letal para la célula productora. Klaenhammer las definió como un grupo heterogéneo de
compuestos antibacterianos de naturaleza peptídica que varían en su espectro de actividad, modo de
acción, peso molecular, determinantes genéticos y características bioquímicas.
Las bacteriocinas poseen una parte proteica necesaria para su actividad, son bactericidas, para actuar, la
bacteriocina se fija sobre un receptor específico localizado sobre la célula diana; la célula productora de
bacteriocina sintetiza igualmente una molécula que la inmuniza contra su propia bacteriocina; el soporte
genético de las dos moléculas bacteriocinas y moléculas de inmunidad es un plásmido.
Para poner en evidencia el efecto inhibidor de las bacterias lácticas por la acción de una
bacteriocina es preciso trabajar en condiciones experimentales eliminando la influencia
del ácido láctico, o del peróxido de hidrógeno. La capacidad bacteriocinogénica de las
bacterias lácticas se suele evaluar mediante pruebas de difusión en agar, utilizando la
técnica de Césped en placas réplicas y empleando diversos microorganismos
indicadores. En este sentido, la acción de los ácidos orgánicos se puede evitar
neutralizando el pH de los cultivos o sobrenadantes evaluados y la del peróxido de
hidrógeno añadiendo catalasa al medio o empleando medios de cultivo que posean una
marcada actividad catalásica como el MRS. Los sobrenadantes de los cultivos de las
cepas presuntamente bacteriocinogénicas se suelen someter a diversos tratamientos
enzimáticos y térmicos con el fin de determinar su naturaleza química y su
termoresistencia. A continuación se suele proceder a la purificación de la(s)
bacteriocina(s) producidas. Tras la purificación a homogeneidad de una bacteriocina, se
suele proceder a la determinación de su peso molecular por espectrometría de masas y
de su composición y secuencia aminoacídica.
3.4.1
§
Clasificación y estructura de las bacteriocinas
Clase I (lantibióticos): péptidos pequeños (<5 kDa), termoestables y con aminoácidos modificados de
los que los más comunes son la deshiroalanina (DHA) y la deshidrobutirina (DHB), originados por
deshidratación postraduccional de la serina y la treonina, respectivamente.
Se divide en:
§
§
•
Lantibióticos Tipo A: Son péptidos formadores de poros, catiónicos y elongados que en algunos
casos, como el de la lacticina 3147, constan de dos componentes. La nisina, es la bacteriocina
perteneciente a este tipo y ha sido la más estudiada hasta el momento.
•
Lantibióticos Tipo B: son péptidos globulares inmunológicamente activos que actúan como
inhibidores enzimáticos.
Clase II: son péptidos pequeños (<10 kDa), termoestables y sin aminoácidos modificados en su
estructura primaria. A su vez, se pueden clasificar en cuatro subclases:
§
Subclase IIa: Se caracterizan por ser particularmente activas frente a los microorganismos del
género Listeria. Esta subclase también se conoce como "familia Pediocina", en alusión a la
bacteriocina más estudiada de este grupo, la pediocina PA-1.
•
Subclase IIb: Contiene bacteriocinas cuya actividad depende de la acción complementaria de dos
péptidos, como la lactococina G.
•
Subclase IIc: Incluye a las bacteriocinas de la clase II que se transportan utilizando un sistema
sec-dependiente, a pesar de que algunas, como la enterocina P, muestran ciertas características
propias de las bacteriocinas de la subclase IIa.
•
Subclase IId: Engloba a las bacteriocinas de la clase II que, como sucede con la alctococina A,
no se pueden clasificar en ninguno de los subgrupos anteriores.
Clase III: Proteínas de más de 30 kDa, termolábiles y sin aminoácidos modificados en su estructura
primaria. Estas bacteriocinas son las que poseen un menor interés industrial en la actualidad.
3.4.2
Modo de acción de las bacteriocinas
Las bacteriocinas actúan sobre la membrana celular de las células sensibles a través de un proceso que
consta de tres etapas básicas:
1.
Unión a la membrana.
2.
Inserción en la misma.
3.
Formación de poros.
La unión inicial de las bacteriocinas a las membranas esta gobernada por interacciones
electrostáticas entre los residuos cargados positivamente de los péptidos y los grupos
negativos de los fosfolípidos de las membranas. Las regiones de las bacteriocinas que
determinan la especificidad deben reconocer e interaccionar de una forma específica
con entidades localizadas en las membranas de las células diana. No obstante, en el
caso de las bacteriocinas de amplio espectro, parece más probable que sea un
componente determinado de la membrana y no un receptor como tal el que reaccione
con la región de la bacteriocina que determina la especificidad. La interacción no sería
quiral ya que la especificidad de cepa que muestran las bacteriocinas no depende de
interacciones estereoespecíficas. Actualmente existen dos grandes modelos que
explican el mecanismo por el que la bacteriocinas generan poros en las membranas
plasmáticas: el modelo de cuña, aplicable a la nisina y otros lantibióticos y el modelo de
duela de barril, aplicable a diversas bacteriocinas de la Clase II (Moll et al,1999). En
cualquier caso, la formación del complejo de poración de las membranas provoca la
disipación de la fuerza protón motriz (PMF) y en última instancia la muerte celular (Jack
et al, 1995). La PMF es un gradiente electroquímico necesario para que se efectúen
gran parte de los procesos metabólicos dependientes de energía que tienen lugar en
las células; consta de dos componentes: un potencial de membrana y un gradiente de
pH. En los últimos años, el desarrollo de técnicas para estudiar por separado ambos
componentes y de sistemas de membranas artificiales a permitido evaluar el efecto de
diversas bacteriocinas sobre la PMF, un parámetro clave para comprender su
mecanismo de acción.
En general, el colapso de la PMF conduce a una reducción significativa del contenido
de ATP intracelular, inhabilita el transporte activo de nutrientes e impide el
mantenimiento de concentraciones adecuadas de ciertos iones como los K+ y Mg++ . En
este sentido , los resultados obtenidos con diversas bacteriocinas, como la nisina
(Bruno et al., 1992., Gao et al., 1991., Kordel et al., 1989., Okerere y Montville, 1992.,
Ruh y Sahl, 1985) la pediocina PA1, la Lactococina A y Lactococina B, condujeron a la
conclusión de que las bacteriocinas de las BAL compartían un mecanismo de acción
común: La disipación de la PMF en las células sensibles. ( Figura 7).
Figura 7. Mecanismo general de acción de las bacteriocinas de las bacterias lácticas en las
células Gram-positivas sensibles.
Fuente: Revista Alimentaria Julio-Agosto 2000
Recientemente, se ha sugerido que la constitución global de las membranas, y no solo
su composición lipídica podría ejercer una marcada influencia en la actividad formadora
de poros de una bacteriocina ya que las proteínas de membrana podrían intervenir
decisivamente en el ordenamiento lipídico de esta estructura. En este sentido aunque
las bacterias naturalmente resistentes a una bacteriocina no puedan evitar la inserción
de monómeros de una bacteriocina la composición global de sus membranas impediría
que se formaran poros de suficiente duración y diámetro como para causar la muerte
celular.
Una vez que las moléculas de bacteriocina han formado un complejo de poración la muerte de las células
sensibles puede ir acompañada o no de un proceso de lisis celular. La muerte celular puede activar
sistemas autolíticos que ha su vez serían responsables de la lisis en algunas cepas. Se ha observado
que los lantibióticos nisina Pep5 son capaces de liberar y activar las enzimas autolíticas normalmente
unidas a los ácidos teicoicos, lipoteitoicos, y teicurónicos de la pared celular de Staphylococcus simulans
22. A pesar que muchas bacteriocinas de las bacterias lácticas poseen estructuras similares, su espectro
antimicrobiano varía mucho más de lo que se podría esperar de una mera interacción entre un péptido
catiónico y los lípidos de la membrana celular. Este hecho sugiere que diferencias muy sutiles en la
estructura de los péptidos pueden provocar diferencias notables en su especificidad. El análisis de las
relaciones entre la estructura primaria y la especificidad celular podría permitir la identificación de
interacciones péptido-célula claves para determinar si una célula es sensible o no a un péptido
antimicrobiano. Por este motivo, el establecimiento de las relaciones estructura-función constituye
actualmente uno de los grandes retos en el campo de las bacteriocinas.
3.4.3
Aplicaciones en la industria alimentaria
La aplicación industrial de la bacteriocina se debe a lo siguiente:
1.
Son sustancias producidas por microorganismos que gozan de estatus GRAS (Generally Recognized
As Safe).
2.
Debido a su naturaleza peptídica son degradables e inactivadas enzimáticamente en el tracto
digestivo, por lo que no originan disbiosis intestinales ni trastornos de tipo alérgico.
3.
La mayor parte de las bacteriocinas de interés industrial tienen un amplio espectro antimicrobiano y
actúan sinérgicamente con otros sistemas de conservación como temperatura, atmósferas
modificadas, NaCl, nitratos, entre otros.
Frecuentemente, se ha observado que la aplicación de bacteriocinas en sistemas alimentarios provoca
reducciones típicas de entre 1 y 4 ciclos logarítmicos en las poblaciones de los microorganismos
sensibles (Muriana,1996;Stiles 1996.). Aunque estos niveles de inhibición pueden considerarse
inaceptables como método de conservación único primario, resultarían muy útiles como factor de
seguridad adicional un sistema en barreras. La acción sinérgica de las bacteriocinas con otras barreras
(temperatura, atmósferas modificadas, NaCl, nitratos, etc) podría contribuir tanto a la obtención de
alimentos con una calidad higiénica óptima, como a una reducción en las concentraciones de ciertos
aditivos químicos en la intensidad de algunos tratamientos tecnológicos, (Figura 8). La adopción de un
sistema de barreras es especialmente recomendable para evitar la presencia en los alimentos de
microorganismos que, como Listeria monocytogenes son recalcitrantes a sistemas de conservación
clásicos como la acidificación o la refrigeración. Por otra parte dado que las bacterias lácticas
bacteriocinogénicas y / o sus bacteriocinas no solo se encuentran en forma natural en muchos alimentos
sino que son percibidos positivamente por los consumidores, podrían ser útiles como agentes que
confieran cierta protección a aquellos alimentos que son particularmente susceptibles al crecimiento
microbiano, como los mínimamente procesados.
Figura 8. Ejemplo de la integración de las bacteriocinas en un sistema de barreras destinado a
mejorar la calidad microbiológica de los alimentos.
Fuente: Revista Alimentaria Julio-Agosto 2000
La bacteriocina más empleada hasta el momento en la industria alimentaria es la nisina, que es un
péptido de 3500 daltons de peso molecular y la produce Streptococcus lactis. La concentración mínima
inhibitoria es inferior a 128 U.I./ml para las células vegetativas de Bacillus, Clostridium, algunas cepas de
Neisseria, Pneumococcus, Staphylococcus aureus, los estreptococos de los grupos A. B y N.
Mycobacterium tuberculosis es también sensible a concentraciones que según las cepas varían de 100 a
500 U.I./ml. (C.M. Burgeois, J.P. Larpent 1988).
La nisina se utiliza como agente de conservación en la industria alimentaria y su uso como aditivo ha sido
aceptado por el Comité de expertos de la FAO/WHO. Se utiliza para la conservación de quesos fundidos,
de quesos de pasta cocida y prensada y de leches esterilizadas. (Lipinska, 1997; Hurst, 1977). Las
condiciones de aplicación de la nisina están ligadas a sus propiedades y a su espectro de acción. El pH
debe ser inferior a 7, el efecto explotable concierne a las bacterias Gram-positivas, más especialmente a
las Bacillaceae y Clostridium.
En la práctica las aplicaciones de la nisina son limitadas; en Francia no está autorizada más que en los
quesos fundidos.
Las razones que pueden permitir la utilización de la nisina como aditivo alimentario son las siguientes:
§
Está producida por un organismo normalmente utilizado en las fermentaciones alimentarias.
§
La nisina residual en los alimentos es digerida, efectivamente es sensible a la α-quimotripsina.
§
Los análisis efectuados en Gran Bretaña y en RUSIA han demostrado la ausencia de toxicidad.
§
Los estudios sobre las posibilidades de adquisición de la resistencia a la nisina por algunos
microorganismos son escasos, resistencia que no ha podido evidenciarse en los microorganismos de
la flora bucal de los animales o de los humanos cuyos alimentos contenían una elevada tasa de
nisina. (Carlson y Bauer, 1975).
La aplicación de esta propiedad de S. lactis de producir nisina ha sido al principio considerada para inhibir
a Clostridium tyrobutiricum en los quesos y distintos trabajos realizados hace ya tiempo, han confirmado
esta posibilidad. Pero la sensibilidad de las cepas nisinógenas a los fagos junto con la sensibilidad de los
fermentos a la nisina hace problemática la utilización del procedimiento. Sin embargo Lipinska (1997),
utilizando cepas productoras de nisina en combinación con fermentos resistentes a la nisina, obtuvo un
90% de los quesos de muy buena calidad, mientras que en el lote testigo, el 59% presentaron
alteraciones butíricas.
La nisina se utiliza también en los quesos fundidos. Recientemente Somers y Taylors (1987) han
demostrado que la nisina es eficaz en la prevención de la formación de toxina de C. botilinum en quesos
fundidos con una humedad superior al 55%.
Son numerosos los estudios sobre la utilización de la nisina como alternativa a los nitritos en los
productos cárnicos, para inhibir el crecimiento de C. botulinum y la producción de su toxina. Se ha
demostrado que la nisina tiene una escasa capacidad de inhibir la producción de la toxina. También se ha
estudiado la nisina como aditivo eventualmente utilizable en mezclas con otros conservantes: nitritos,
sorbato, etc.
Javis y Burke (1976) han utilizado nisina en cantidades de 1.600 U.I./g sola o en combinación con 1000
p.p.m. de ácido ascórbico y 2.5% de polifosfato en salchichas frescas inglesas; utilizando esta mezcla
han observado una mejor conservación a 5°C, que en el caso de utilización de cada uno de los
componentes por separado. Estos autores han detectado un aumento de la fase de latencia de los
principales grupos de microorganismos presentes. Se ha demostrado que 200 U.I./g de nisina en
combinación con 75 a 100 p.p.m. de nitrato sódico retrasan la germinación de esporas de Clostridium
perfingens inoculados a la carne. Los retrasos son de 38.33 y 20 días para las carnes conservadas a 3.5
y 20°C respectivamente.
Se ha mostrado que la nisina, en una dosis de 3000 a 4000 unidades/g mezcladas con 40 ppm de nitrito,
permite prevenir la germinación de las esporas de C. sporogenes P.A. 3679 en la carne, pero que la
nisina utilizada en cantidades de 118 ppm con 60 ppm de nitrito son incapaces de evitar la germinación
de C. botulinum en la carne.
Se ha señalado que 50 ppm de nisina, incorporada a las salchichas de Frankfurt, aumentan la duración
de la vida de este producto impidiendo su enverdecimiento por la acción de los lactobacilos.
La segunda bacteriocina más estudiada es la pediocina PA-1, la cual es activa frente a un amplio
espectro de bacterias Gram-positivas, que incluye microorganismos patógenos como Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens o botulinum. Las bacterias Gramnegativas también pueden ser sensibles si se someten a tratamientos subletales que alteren la
permeabilidad de sus cubiertas externas.
Se ha empleado la pediocina PA-1 en carne de vacuno a una concentración de 1400 UA inoculada con
cepas alterantes de Clostridium aramiae, Lactobacillus spp. y Leuconostoc spp. envasada a vacío y
almacenada en refrigeración. La población de estas bacterias fue significativamente inferior en las
muestras con bacteriocina que en sus respectivos controles; las muestras tratadas no se alteraron tras 12
semanas de almacenamiento.
Se ha empleado la cepa comercial P. acidilactici JDI-23, productora de pediocina PA-1, como cultivo
iniciador para la elaboración de productos cárnicos a partir de una masa inoculada con L. monocytogenes
6
-1
(10 ufc g ). En los productos finales, la población de Listeria era 2 unidades logarítmicas menor que en
los productos elaborados con un cultivo iniciador no productor de pediocina PA-1.
6
En extractos de carne y productos cárnicos inoculados con dos cepas de L. monocytogenes (2.5 x 10 ufc
-1
ml ), se observó una reducción de 1.2 - 1.8 ciclos logarítmicos en la población de las dos cepas, tan solo
-1
1.5 min. después de tratarlos con pediocina PA-1 (30000 UA ml ). La actividad de la bacteriocina fue
significativamente mayor cuando se añadía encapsulada en liposomas de fosfatidil colina o cuando los
extractos contenían el emulsionante Tween 80.
Se ha demostrado que la aplicación de bacteriocinas a las películas empleadas habitualmente para
envasar los alimentos puede ser un medio muy eficaz para inhibir el desarrollo de L. monocytogenes en
carnes frescas y procesadas. Para esto se envasaron carnes inoculadas con L. monocytogenes en
-2
-1
películas de celulosa tapizadas con 7.75 mg cm de una preparación de pediocina (640000 UA g ) y se
observó que el crecimiento de dicho microorganismo se inhibía completamente tras un almacenamietno a
4°C durante 12 semanas.
-1
También se ha investigado el efecto de la pediocina PA-1 (10-1000 UA ml ) en diversos productos
2
4
lácteos inoculados con L. monocytogens (10 - 10 UFC/ml) y almacenados a 4°C. Durante todo el
2
período de almacenamiento, la población se mantuvo inferior a 10 UFC/ml en los productos con pH 5.1.
En aquellos con pH 6.0 - 6.6 las Listerias se empezaron a multiplicar a los 7 días; sin embargo, al cabo
de 2 semanas, la población del patógeno era entre 2 y 4 ciclos logarítmicos inferior a la de las muestras
control.
La pediocina PA-1 también inhibía o retrasaba el crecimiento de Listeria spp. en leche y productos
lácteos. El nivel de sensibilidad dependía de la cepa de Listeria y era proporcional a la dosis de
bacteriocina.
3.4.4
Formas de aplicación de las bacteriocinas en la conservación de alimentos
Existen tres estrategias principales para la aplicación de las bacteriocinas en la conservación de los
alimentos:
1.
Inoculación de la bacteria láctica productora de la bacteriocina en el alimento. La aplicación se realiza
in situ.
2.
Empleo de un medio previamente fermentado con una cepa bacteriocinogénica como ingrediente
alimentario.
3.
Adición de la bacteriocina purificada o semipurificada.
Prácticamente cualquier bacteria láctica bacteriocinogénica y /o bacteriocina se puede
emplear en la industria alimentaria bajo las dos primeras formas de aplicación. De
hecho las bacterias lácticas bacteriocinogénicas se han utilizado de forma empírica o
inadvertidamente durante siglos en las fermentaciones alimentarias. En la tercera forma
de aplicación la acción esta más controlada ya que la cantidad de bacteriocina aplicada
es conocida; sin embargo, tiene el inconveniente de estar sujeta a la regulación de la
lista positiva de aditivos alimentarios. Hasta la fecha la nisina es la única bacteriocina
autorizada como conservante alimentario. Actualmente, su empleo esta aceptado en
más de cincuenta países, existiendo notables diferencias en cuanto a qué alimentos y a
qué concentraciones se puede añadir. La unión Europea otorgó a esta bacteriocina el
número de aditivo alimentario E234. Recientemente, se ha aprobado en Estados
Unidos el uso como ingrediente alimentario de un fermentado (ALTA 2341) que
contiene Pediocina PA1. A pesar de que la presencia de la bacteriocina es el hecho
más remarcado publicitariamente, el producto no esta sujeto a las restricciones de los
aditivos alimentarios al comercializarse y en forma de fermentado. Actualmente existen
algunas patentes europeas y estadounidenses que cubren el empleo de la Pediocina
PA1 en productos lácteos y cárnicos.
3.4.5 Factores que afectan la eficacia de las bacteriocinas en los alimentos
A pesar del innegable potencial práctico de las bacteriocinas, no es conveniente extraer
conclusiones directas de resultados obtenidos in vitro para predecir la eficacia de las
bacteriocinas en sistemas in vivo. Ello se debe a que existe una serie de factores que
pueden comprometer la eficacia de las bacteriocinas y/o de las cepas productoras en
aplicaciones industriales. Entre los factores que afectan las BAL bactericinogénicas se
destacan los siguientes:
1.
La existencia de un ambiente inadecuado (pH, temperatura, nutrientes etc.).
2.
La pérdida espontánea de la bacteriocinogenicidad, lo cual puede suceder por ejemplo, cuando los
determinantes genéticos para la biosíntesis de las bacteriocinas se encuentran localizados en
plásmidos inestables.
3.
La existencia de fagos que destruyen o impiden el crecimiento normal de las cepas
bacteriocinogénicas.
4.
Los fenómenos de antagonismos con otros microorganismos presentes en el alimento.
Por lo que respectan a los factores que pueden influir negativamente en la acción de las
bacteriocinas, los principales son:
1.
La aparición de microorganismos resistentes. Se trata de un problema particularmente preocupante,
ya que las células que adquieren resistencia frente una bacteriocina suelen mostrar resistencia
cruzada frente a otras bacteriocinas de la misma clase.
2.
La existencia en el alimento de condiciones (por ejemplo: pH, proteasas, procesos oxidativos, aditivos
alimentarios) que alteren la estructura o función de las bacteriocinas.
3.
La posible unión de las bacteriocinas a ciertos componentes alimentarios como grasas o proteínas.
4.
La dificultad para lograr que la bacteriocina se solubilice o se distribuya uniformemente en la matriz
alimentaria, especialmente en alimentos que se elaboran con materia primas sólidas o semisólidas.
3.4.6 Tendencias actuales y futuras
Gran parte de las investigaciones actuales en el campo de las bacteriocinas se dirigen a
eliminar o reducir al máximo los problemas que plantean los factores anteriormente
expuestos y que suponen una seria limitación para la generalización del empleo de
éstos péptidos antimicrobianos como agentes bioconservantes. A continuación, se
exponen algunas de las estrategias seguidas para tal fin, junto con otras que persiguen
la obtención de herramientas que permitan la cuantificación de éstos péptidos
antimicrobianos:
§
Combinación de bacteriocinas
La actividad y espectro antimicrobiano de una bacteriocina se puede aumentar si se combina con otras
bacteriocinas. Se ha observado que una combinación de Sakacina A y Nicina A inhibe el crecimiento de
Listeria monocitogenes, de una forma más acusada que cualquiera de las dos bacteriocinas por
separado.
La emergencia de microorganismos resistentes a las bacteriocinas, particularmente a las de la clase II,
parece un hecho bastante común. En este sentido la combinación de bacteriocinas pertenecientes a
clases distintas puede tener consecuencias prácticas muy positivas. Se ha observado que los mutantes
de Listeria monocytogenes, que habían adquirido resistencia cruzada frente a diversas bacteriocinas de
la clase II mantenían su sensibilidad intacta frente a los lantibióticos.
§
Ingeniería protéica y síntesis química
Los espectaculares avances en la genética de las bacterias lácticas, han conducido al
desarrollo de estrategias de ingeniería proteica que permiten introducir un gran número
de modificaciones en las moléculas de las bacteriocinas. Este enfoque ha abierto la
posibilidad de introducir variantes de bacteriocinas con propiedades ventajosas, como
una mayor actividad biológica, un mayor espectro de inhibición o una mejor estabilidad
y/o solubilidad, alternativamente, y dado que la mayoría de las bacterias lácticas son
péptidos de pequeño tamaño, también se pueden obtener variantes de bacteriocinas
de composición conocida mediante los procedimientos de síntesis química de péptidos.
§
Producción heteróloga
En ocasiones, sería interesante disponer de cultivos iniciadores lácticos que produjeran
in situ una bacteriocina con actividad frente a microorganismos indeseables e los
alimentos en los que habitualmente se aplican los cultivos. Sin embargo, muchas
bacteriocinas son producidas de forma natural por especies adaptadas a unos sustratos
alimenticios pero incapaces de crecer en otros. Por este motivo, en los últimos años se
está prestando mucha atención a la producción heteróloga de bacteriocinas de interés
por parte de bacterias lácticas no bacteriocinogénicas, pero bien adaptadas al alimento
en el que se desea aplicar y/o con propiedades tecnológicas relevantes.
4.
MICROORGANISMOS INDICADORES
4.1
PSEUDOMONAS
Todos los géneros de este grupo son bacilos rectos o curvos con flagelos polares, pero
no vibroides; tamaño 0.5-1.0µm por 1.5-4.0 µm; sin esporas (Figura 9). Las
pseudomonas son un grupo importante de bacilos Gram-negativos; flagelo polar único o
múltiples, sin vainas, apéndices o yemas, metabolismo respiratorio nunca fermentativo,
aunque puede producir pequeñas cantidades de ácido a partir de glucosa
aeróbicamente. Utilizan compuestos orgánicos, no polímeros, algunos son litotróficos,
usando H2 o CO como único donador de electrones; algunos pueden utilizar nitrato
como receptor de electrones en forma anaeróbica, algunos pueden utilizar arginina
como fuente de energía en forma anaeróbica. Las características de identificación clave
Figura 9. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Pseudomonas aeruginosa
Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods. C. www.anaka.livstek.lth.se (Mayo de 2002)
son la ausencia de formación de gas a partir de glucosa y la prueba oxidasa positiva;
ambas ayudan a distinguir las pseudomonas de las bacterias entéricas. Los
representantes de este género tienen en la mayor parte de los casos, requerimientos de
nutrición muy sencillos y se desarrollan organotróficamente a valores neutros de pH y a
temperaturas entre los límites de las mesófilas. Una de las propiedades más
sorprendentes de las pseudomonas es la capacidad para utilizar una amplia variedad
de compuestos orgánicos como fuentes de carbono y como donadores de electrones
para la generación de energía.
El desarrollo de las pseudomonas se detiene a aw de (0,97-0,98), son fácilmente
destruidas por el calor, crecen mal si disponen de poco oxígeno, son poco resistentes a
la deshidratación y su crecimiento es pobre o nulo por encima de 43°C.
En comparación con las Pseudomonas encontradas en la carne, las aisladas de la
leche han sido objeto de numerosos trabajos de carácter taxonómico. Sin embargo, el
número de estudios realizados para precisar la heterogeneidad real de las poblaciones
de estas bacterias ha sido bastante limitado. RICHARD (1981) demostró que el 60% de
las poblaciones totales de Pseudomonas está constituido por Pseudomonas
fluorescens. También se ha señalado de forma general la existencia en proporción no
desechable de Pseudomona aeruginosa y Pseudomona putida. Se ha señalado la
existencia de Pseudomona fragi en algunos productos lácteos (mantequilla, crema
fresca) y muy raramente en la leche refrigerada. Es un patógeno oportunista que puede
infectar casi cualquier lugar del organismo humano, causa infecciones en la piel y
puede producir neumonía además de infecciones en el tracto urinario. Está diseminado
en áreas húmedas y las personas pueden ser infectadas por contacto directo o
indirecto.
La actividad de las proteasas extracelulares que producen las Pseudomonas produce
principalmente características organolépticas no deseadas como la gelificación y el
agriado de la leche o pérdidas en el rendimiento quesero.
4.2
BACILLUS
Los representantes del género Bacillus son bacilos Gram-positivos, aerobios
esporógenos aunque, a veces, muestran una reacción Gram-negativa o variable. Se
divide en tres grupos basados en la morfología del esporangio (célula portadora de la
espora) y de la espora. Para subdividir los grupos morfológicos en especies se utilizan
pruebas bioquímicas.
Bacillus cereus es anaerobio facultativo con células vegetativas de gran tamaño,
típicamente de 1,0 µm por 3,0 - 5,0 µm, que forman cadenas. Crece dentro de una
escala de temperaturas desde 8 a 55°C, óptimamente en torno a 28-35°C, y no tiene
una tolerancia acusada ni del pH (mín. 5,0-6,0, dependiendo del acidulante) ni de la
escasa actividad de agua (min. 0,95). Como esporógeno, Bacillus cereus está muy
difundido en el ambiente por lo que se puede aislar en el suelo, en el agua y en la
vegetación.
La capacidad para producir esporas resistentes a factores tales como la desecación y el
calor significa que los bacilos responsables de intoxicaciones alimentarias son
propagados con mucha frecuencia en los alimentos. La facultad de las esporas para
resistir la desecación permite su supervivencia en productos tales como los cereales y
las harinas. El síndrome emético esta especialmente asociado con productos amiláceos
tales como el arroz y los platos de pasta. En la mayoría de los casos sin embargo, sólo
constituyen una parte insignificante de la flora total y no se hallan presentes en cantidad
suficiente para causar enfermedad. Producen intoxicaciones y están relacionadas
generalmente con el arroz recalentado y legumbres puede producir en algunas
ocasiones bacteriemia.
Las endosporas de este género aerobio o facultativo no determinan coloraciones
anormales superficiales en las carnes y toman parte en él especies mesófilas,
termófilas, pueden o no formar gas, unas son lipolíticas y otras carecen de esta
propiedad. En general, las esporas de los géneros mesófilos, como Bacillus subtilis
(Figura 10), son menos termorresistentes que los de los géneros termófilos.
Figura 10. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Bacillus subtilis
Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods. C. www.anaka.livstek.lth.se (Mayo de 2002)
Los bacilos en general crecen bien en medios sintéticos que contienen azúcares,ácidos
orgánicos alcoholes etc, como las únicas fuentes de carbono y el amonio como única
fuente de nitrógeno; algunos microorganismos aislados tienen necesidad de vitaminas.
Muchos bacilos producen enzimas hidrofílicas extracelulares que descomponen
polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos, permitiendo que el organismo emplee estos
productos como fuentes de carbono y donadores de electrones. Muchos bacilos
producen antibióticos como la bacitracina y la polimixina.
4.3
ESCHERICHIA COLI
Es un procariote, una eubacteria, un habitante común del intestino humano. Es un
bacilo catalasa-positivo, oxidasa-negativo, fermentador, corto, Gram-negativo, no
esporógeno. Escherichia coli puede ser diferenciado de otros representantes de la
familia Enterobacteriaceae en base al número de azúcares que fermenta y mediante
otras pruebas bioquímicas. Es un organismo mesófilo típico que crece a temperaturas
desde 7-10°C hasta 50°C, con una temperatura óptima en torno a 37°C. La bacteria es
bien conocida por que es fácil trabajar con ella en el laboratorio. Aun quienes tienen
dificultad con las técnicas estériles y otros procedimientos bacteriológicos generalmente
pueden trabajar con Escherichia coli sin ninguna dificultad. Crece rápidamente y tienen
requerimientos de nutrición sencillos.
La contaminación fecal de las redes de abastecimiento de agua y los manipuladores de
alimentos contaminados, han sido implicados muy frecuentemente en brotes de
enfermedades causadas por Escherichia coli. Han sido implicados varios alimentos,
entre los que se incluyen un sustitutivo del café en Rumanía, las hortalizas, la ensalada
de papa y el sushi. En los estados Unidos, en 1971, los quesos blandos madurados por
mohos han sido responsables de brotes relacionados con Escherichia coli enteroinvasor
en los que resultaron afectadas más de 387 personas y en 1983 fueron causadas por
Escherichia coli enterotoxigénico. No sería de esperar que Escherichia coli sobreviviese
favorablemente en un producto lácteo fermentado con un pH inferior a 5 pero, en
aquellos casos en los que la contaminación está asociada con la maduración por
mohos, el aumento local del pH como consecuencia de la utilización del lactato y de la
producción de aminas por el moho permitiría el crecimiento del organismo.
Los brotes causados por el serotipo O157:H7 de Escherichia coli enterohemorrágico
han implicado principalmente a carne picada insuficientemente cocida y
accidentalmente a leche fresca.
Son capaces de provocar diarrea varios serotipos pero el serotipo O157:H7 es el que
con mayor frecuencia se aísla en las personas (Figura 11). Ha llamado la atención no
solo porque la transmisión de la enfermedad alimentaria es más corriente que en el
caso de otras cepas de Escherichia coli productoras de diarrea, sino también porque es
capaz de causar enfermedades que amenazan la vida como son la colitis hemorrágica,
el síndrome urémico hemolítico y la púrpura trombótica trombocitopénica.
Figura 11. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Escherichia coli
Fuente: Yazawa k., Fujumori M. y www.nature.com (Mayo de 2002)
4.4
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Es un coco Gram-positivo, catalasa-positivo ,oxidasa-negativo, anaerobios facultativos,
osmotolerante y soporta una actividad acuosa baja y presenta tolerancia a la sal. Es un
mesófilo típico con un intervalo de tamperatura de crecimiento entre 7 y 48°C y una
temperatura óptima de 35-40°C; el crecimiento transcurre óptimamente a valores de pH
de 6-7, con límites mínimo y máximo de 4,0 y 9,8-10 respectivamente. Produce una
enterotoxina que ha sido implicada como causante del síndrome de choque tóxico y
envenenamiento de alimentos. Esta enterotoxina no es destruida a 100°C por 30
minutos. La diseminación de Staphylococcus aureus en los alimentos se lleva a cabo
por humanos, por contacto directo o indirectamente a través de la respiración. El hábitat
principal de los estafilococos es la piel, sus glándulas anejas y las mucosas de los
animales de sangre caliente. Varias especies de estafilococos están relacionada con
hospedadores concretos, por ejemplo Staphylococcus hyicus con los cerdos y
Staphylococcus gallinarum con las gallinas.
Aunque normalmente es un parásito inofensivo de la superficie externa del cuerpo
humano en la que desempeña una función útil metabolizando los productos de la piel y
posiblemente evitando la colonización de la piel por organismos patógenos,
Staphylococcus aureus (Figura 12)es capaz de causar abscesos cutáneos de poca
importancia, por ejemplo forúnculos y, más gravemente, actúa como patógeno
oportunista cuando la barrera cutánea es quebrantada o cuando la resistencia del
hospedador es escasa.
La producción de la toxina se propicia por refrigeración inadecuada, escasa higiene del
personal, calentamiento inadecuado o un uso prolongado de bajo calentamiento y se
puede encontrar en carnes, utensilios almacenados, leche contaminada y productos
diversos que han sido manipulados por el hombre (Doyle et al 1997).
Figura 12. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Staphylococcus aureus
Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods. C. www.anaka.livstek.lth.se (Mayo de 2002)
CAPÍTULO 2
MATERIALES Y MÉTODOS
DISEÑO EXPERIMENTAL
1.
PRUEBAS PRELIMINARES
Determinación cantidad de
inóculo
Caracterización del crecimiento
del cultivo de BAL
Estandarización de la técnica de
césped
*
Caracterizar el crecimiento
midiendo los siguientes parámetros :
pH, porcentaje de acidez expresado en
porcentaje de ácido láctico y
porcentaje de sólidos solubles las
mediciones se hicieron por duplicado.
* Utilizarar como medio de difusión agar
Mueller Hinton
y seleccionar la
concentración óptima de agar entre capa
doble y capa sencilla . Cinco repeticiones
de cada prueba.
* Determinar la concentración de
microorganismos por mililitro al las 24
horas.
* Realizar controles positivos con caldo
MRS y negativos con solución de ácido
láctico a pH 1.
Cultivar en 250ml de caldo MRS (Anexo B) 7.5, 15, 60 y 120 mg de inóculo (cultivo
BIOFLORA ABY liofilizado) siendo 7.5mg la cantidad indicada por el proveedor en la
ficha técnica (Anexo A), aumentándola hasta encontrar la cantidad óptima para obtener
un descenso en el pH de aproximadamente una unidad al cabo de 5 horas de
fermentación. Se realizará cada fermentación por duplicado midiendo el pH cada 30
min.
-
Inocular la cantidad de cultivo mixto establecida y realizar la fermentación en caldo
MRS a 41°C durante 12 horas, tomando muestras de los diferentes parámetros cada
hora (durante los periodos de latencia y estacionario) y cada 30 minutos durante las
interfases. Se realizarán mediciones de pH, acidez como porcentaje de ácido láctico
y sólidos solubles totales para caracterizar el crecimiento de los cultivos. Cada
parámetro se medirá por duplicado utilizando la metodología que se presentan en los
numerales 2.4, 2.5 y 2.6 de éste capítulo.
Según Cintas L., Rodríguez J., Fernández M., Sletten K., Nes I., Hernández P. y Holo
H.1995, una de las técnica más aplicadas para evaluar el efecto inhibitorio de las
bacteriocinas y cualquier otro agente antimicrobiano, es la de difusión en agar llamada
técnica de césped. Los microorganismos indicadores a utilizar son: Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeuroginosa y Bacillus subtilis.
-
Para realizar la técnica de césped se utiliza como medio de difusión agar Mueller
Hinton (Anexo E) ya que es un medio que favorece el crecimiento de los
microorganismos indicadores seleccionados. Para determinar la concentración de
agar óptima requerida para observar con claridad la inhibición producida se hacen
cinco repeticiones de cada una de las siguientes pruebas.
o
Técnica del césped capa doble:
Mezclar 2.1µl del microorganismo indicador con 10 ml de agar Mueller Hinton al
1.6% y distribuir homogéneamente sobre una caja de petri con agar Mueller
Hinton al 3.2% (gelificado). Continuar con la metodología que se enuncia en el
numeral 2.12 de éste capítulo.
o
Técnica del césped capa sencilla:
Preparar cajas de Petri con agar Mueller Hinton al 3.2 % gelificado y distribuir
homogéneamente sobre ella 100µl del microorganismo indicador. Continuar con
la metodología que se enuncia en el numeral 2.12 de éste capítulo.
-
Estandarizar el inóculo de los microorganismos indicadores (Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa y Bacillus subtilis) haciendo conteo en
cámara de Neubauer y determinando el NMP para luego medir la densidad óptica a
las 24 horas de incubación cuando la concentración es de aproximadamente 108
microorganismos/ml. Para todas las evaluaciones de la actividad inhibitoria del
sobrenadante (Técnica del césped), se utilizan cultivos de los microorganismos
indicadores en caldo Mueller Hinton (Anexo D) con crecimiento medido por las
lecturas a 24 horas de las densidades ópticas observadas.
-
Hacer controles negativos de la técnica del césped inoculando en los pozos caldo
MRS y controles positivos utilizando una solución de ácido láctico a pH 1 para
verificar el buen funcionamiento de la técnica de césped.
2.
PRUEBAS EXPERIMENTALES
Activación del cultivo de BAL
Caracterización del crecimiento
de las BAL.
Obtención de cultivos puros que
conforman el cultivo mixto.
Determinación del perfil
Bioquímico de las cepas
aisladas.
Caracterización de las cepas
aisladas.
Técnica de césped
Sobrenadante
original
Sobrenadante
concentrado
Césped con
solución de ácido
láctico
Incubar 120mg cultivo
en 250 ml de caldo
MRS a 41°C.
* Caracterizar el cultivo mixto midiendo :
pH, % sólidos , concentración de
microorganismos/ml , por duplicado;
porcentaje de acidez y de nitrógeno por
triplicado.
* Tomar muestras de cultivo mixto de 7 y
40 horas realizar siembras en agar MRS.
* Realizar un agotamiento por estrías.
* Observar al microscopio (40 x) los
cultivos puros.
* Utilizar el sistema API 50 CHL .
* Elaborar la curva de crecimiento
midiendo densidad óptica, caracterizar las
cepas midiendo pH , porcentaje de sólidos
solubles por duplicado y porcentaje de
acidez por triplicado. Realizar un análisis
de varianza con un 5% de confiabilidad
para determinar si existen diferencias
significativas entre los anteriores
parámetros de cada una de las colonias
aisladas.
Determinación
pH estabilidad
Las técnicas descritas en la metodología experimental se utilizarán con el fin de
caracterizar el crecimiento del cultivo mixto y puro de las BAL , determinado pH y
porcentaje de acidez para verificar la capacidad de las BAL de producir ácido láctico,
concentración de microorganismos por ml utilizando las técnicas de NMP , cámara de
Neubauer y densidad óptica , porcentaje de nitrógeno y sólidos solubles para observar
su variación a través de la fermentación.
Inocular caldo MRS estéril con el cultivo mixto de BAL liofilizado BIOFLORA ABY
424
- Incubar a 41°C y dejar fermentar entre 4 y 48 horas, de acuerdo a la fase de
crecimiento que se desee analizar.
-
Caracterizar el crecimiento de las BAL determinando los siguientes parámetros:
Concentración de microorganismos mediante conteo directo de totales con
cámara de Neubauer y Número Mas Probable, pH empleando el potenciómetro
(por duplicado), acidez como porcentaje de ácido láctico titulando con NaOH
0.1N (por triplicado), contenido de nitrógeno total por el método de Kjeldahl (por
triplicado), sólidos solubles por refractometría (por duplicado), densidad óptica
con el espectofotómetro Cary 100 conc Varian.
- La frecuencia de toma de muestras se determina en las pruebas preliminares,
tomando muestras cada hora durante las fases de crecimiento y cada 30 minutos
durante las interfases.
-
-
Activar un cultivo en caldo MRS por 24 horas a 41°C.
Sembrar 1 ml del cultivo en agar MRS durante 24 h a 41°C
Realizar un agotamiento por estrías hasta obtener colonias aisladas.
-
La determinación del perfil bioquímico se realizará utilizando el sistema API 50
CHL.
-
Cultivar las BAL aisladas en caldo a 41°C por 24 horas.
Elaborar las curvas de crecimiento midiendo densidad óptica utilizando el
espectofotómetro Cary 100 conc Varian.
Medir pH empleando potenciómetro y trabajar por duplicado.
Medir acidez como porcentaje de ácido láctico mediante titulación con KOH 1 N y
trabajar por triplicado.
Hacer un análisis de varianza de los resultados anteriores para determinar si
existen diferencias significativas entre el crecimiento, el pH y la acidez de las
diferentes colonias aisladas.
-
-
Centrifugar en equipo Hermlez 320 a 4800 rpm durante 20min y en Hettich
Zentrifuguen Universal 32 R a 9000 rpm durante 5 min a 4°C.
Filtrar el sobrenadante separado de las bacterias en filtro de papel de nitrato de
celulosa con diámetro de poro 0.45 µm.
Incubar durante 24 horas a 37°C, 10ml de caldo Mueller Hinton en 4 tubos de
ensayo inoculado en ellos los microorganismos indicadores (Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa y Bacillus subtilis) previamente
caracterizados.
-
Mezclar el cultivo con vortex .
Distribuir homogéneamente 100µl del cultivo en una placa de agar Mueller Hinton.
Abrir pozos de 6mm de diámetro sobre el agar utilizando pipetas Pasteur como
sacabocas estériles.
Adicionar en cada pozo 35 µl de los sobrenadantes tratados de los cultivos puros y
mixto trabajando por duplicado.
Incubar las cajas a 37°C durante 24 horas.
Medir los halos de inhibición.
Se realizaron diferentes tratamientos a los sobrenadantes obtenidos de 7,12,40 y 48
horas de fermentación de los diferentes cultivos y se realizó la técnica del césped por
duplicado para cada una de las siguientes pruebas.
-
Sobrenadante obtenido directamente de la fermentación: Realizar la técnica del
césped adicionando en los pozos sobrenadante de cultivo fermentado en
aerobiosis, sin neutralizar y sin concentrar.
-
Concentrar el sobrenadante: Realizar la técnica del césped adicionando en los
pozos sobrenadante de cultivo fermentado en aerobiosis, sin neutralizar y
concentrado utilizando una bomba de vacío conectada a un desecador con sílica
gel (Ver procedimiento completo en el numeral 2.10).
-
Efecto inhibitorio de soluciones de ácido láctico a diferentes valores de pH: Realizar
la técnica del césped adicionando en los pozos soluciones de ácido láctico en agua
destilada a los mismos valores de pH presentados por los sobrenadantes. Se
trabajará adicionando soluciones a pH 1, 3, 3.5, 4 y 4.5..
-
Evaluación del pH de estabilidad para el sobrenadante:
o Neutralizar el sobrenadante con KOH al 80% hasta llegar a pH 4.5, 5 y 7.
Realizar la técnica del césped con estos sobrenadantes.
o Realizar una fermentación discontinua, manteniendo el pH cercano a 7,
neutralizando con KOH al 80%. Concentrar los sobrenadantes y realizar la
técnica del césped.
o Realizar la fermentación del cultivo en anaerobiosis: Realizar la técnica del
césped adicionando en los pozos sobrenadante de cultivo fermentado en
anaerobiosis, neutralizando con KOH al 80%. y concentrado
o
Evaluar sobrenadantes de distintas horas de fermentación: Realizar la
técnica del césped adicionando en los pozos sobrenadante de cultivo fermentado en
aerobiosis, neutralizando con KOH al 80%. y concentrado.
2.
EXPERIMENTACIÓN
2.1
ACTIVACIÓN DEL CULTIVO MIXTO DE BAL
2.1.1 Equipos y materiales
Cámara de Flujo Laminar CIAL Modelo CAE 30x36x6 pulgadas
Balanza Analítica AB24 (±0.0001g).
Espátula
Mechero
Algodón
Papel aluminio
Erlenmeyer de 250 ml
Pipeta 10 ml (± 0,075 ml)
Macropipeta
Incubadora
2.1.2 Medios, reactivos y cultivos
Caldo MRS (Anexo B)
Cultivo de Bacterias Acido Lácticas BIOFLORA ABY (Anexo A)
Etanol 70%
2.1.3 Metodología
•
Precalentar 250 ml de caldo MRS a 41°C.
•
Pesar 120mg de cultivo sobre papel aluminio en la Balanza Analítica AB24
(±0.0001g).
•
Inocular el cultivo en la Cámara de Flujo Laminar.
•
Lavar con caldo MRS empleando una pipeta esterilizada el cultivo que quede
adherido al papel aluminio.
•
Incubar el cultivo a 41°C, y dejarlo fermentar entre 12 y 48 horas dependiendo la
fase de crecimiento que se desee analizar.
2.2
CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL
Para realizar la caracterización del crecimiento del cultivo mixto de BAL BIOFLORA
ABY, se midieron las variables: crecimiento, pH, porcentaje de sólidos solubles totales,
acidez como porcentaje de ácido láctico y contenido total de nitrógeno.
2.3
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS
Se utilizaron dos métodos para determinar la concentración de microorganismos por
mililitro durante el proceso de fermentación: métodos directos como recuento en cámara
de conteo de Neubauer y técnica del Número Más Probable y densidad óptica como
método indirecto.
2.3.1
Conteo en Cámara de Neubauer
Es un método directo, en el cual se determina bajo el microscopio el número de
microorganismos totales (vivos y muertos). Se recomienda utilizar este método en
muestras con concentraciones de microorganismos mayores o iguales a 106
bacterias/ml y que no contengan partículas que impidan determinar el número de los
microorganismos. Si la población de microorganismos en la suspensión es muy alta se
debe diluir.
2.3.1.1 Equipos y materiales
La cámara de Neubauer esta formada por un cuadro central dividido en 25 cuadros grandes con aristas
de 0.2 mm, cada cuadro grande esta dividido por 16 cuadros pequeños con aristas de 0.05mm y la
profundidad de la cámara es de 0.1mm.
Microscopio de luz
Cubre objetos
Porta objetos
Gotero
Tubos de ensayo
Pipetas de 0.1ml (± 0,001 ml), 1ml (± 0,01 ml) y 5ml (± 0,045 ml)
2.3.1.2 Medios, reactivos y cultivos
Cultivo de BAL
Caldo MRS
2.3.1.3 Metodología
•
Extraer 1 ml de la muestra en un tubo de ensayo.
•
Realizar la dilución seriada de la muestra hasta obtener aproximadamente 10 microorganismos por
mililitro.
•
Colocar una gota de la muestra en la cámara de Neubauer y observar al microscopio. Aumento 40 X.
•
Contar el número de microorganismos/ ml. Si la muestra obtenida para el conteo no es totalmente
homogénea, es necesario contar los microorganismos observados en 10 cuadros grandes, si la
muestra es homogénea contar los microorganismos contenidos en 5 cuadros grandes y calcular el
promedio de microorganismos en cada cuadro. Para conocer el número de microorganismos por
mililitro (NMO / ml), se realiza la siguiente operación:
6
XX
NMO = ----------
(dX * VN )
Donde:
XX = Promedio del número de microorganismos contados en los cuadros
pequeños de la cámara Neubauer.
dX = Factor de dilución de la muestra.
VN = Volumen de un cuadro pequeño de la cámara Neubauer en mililitros.
•
•
Calcular la desviación estándar y elaborar la curva de crecimiento (concentración de
microorganismos por mililitro en función del tiempo) utilizando como rango una vez la desviación para
obtener confiabilidad del 95%.
Calcular tasas de crecimiento y tiempos de generación para las fases analizadas.
2.3.2
Número Más Probable
Es un método directo, en el cual se efectúan determinaciones de conteo de viabilidad
empleando sólo cultivos o muestras líquidas. En ésta técnica, la muestra que va a ser
cuantificada se diluye hasta que la densidad celular sea menor 1 microorganismo /ml.
En éstas condiciones ya no es apropiado hablar de concentración de células, sino más
bien de la probabilidad de encontrar una célula.
Esta probabilidad puede convertirse nuevamente a concentración celular en la muestra
no diluida, considerando el número de diluciones y el empleo de la tabla del NMP. Esta
tabla es una derivación estadística del número esperado o más probable de células que
producirá el patrón de crecimiento observado. Para que llegue a ser útil el
procedimiento de NMP, la muestra debe diluirse lo suficiente; si no se hace esto, todas
las muestras contendrán células viables y todos los tubos inoculados mostrarán
crecimiento.
Se han hecho tablas estadísticas para ser empleadas con inoculaciones de 3, 5 y 10 réplicas de tubos de
crecimiento. Cuanto mayor sea la cantidad de tubos empleados, mayor será la precisión obtenida. Para
realizar la curva de crecimiento de las BAL con esta técnica, se emplearon 3 réplicas.
2.3.2.1
Equipos y materiales
Tubos de ensayo
Caldo MRS
Pipetas de 1 ml (± 0,01 ml)
Gradillas
Incubadora
Mechero
Cámara de flujo laminar
2.3.2.2 Medios, reactivos y cultivos
Cultivo de BAL BIOFLORA ABY
Caldo MRS
2.3.2.3
Metodología
• Para conocer la concentración en la cual no hay crecimiento de las BAL, se
realizaron diluciones seriadas por triplicado para el cultivo fermentado durante 40h.
Para la primera dilución (10-1) se tomaron 0.5 ml del cultivo y se diluyeron en un tubo
de ensayo con 4.5 ml de caldo MRS, a partir de esta dilución se realizaron diluciones
seriadas con las mismas cantidades hasta 10-12. Se incubaron a 41°C durante 24
horas y se observó que no hay crecimiento cuando la dilución llega a 10-9. Una vez
conocida esta concentración mínima se realiza el siguiente procedimiento.
•
Tomar 0.5 ml del cultivo de BAL e inocular en un tubo que contiene 4.5 ml de caldo MRS, donde la
-1
dilución es 10 .
•
Tomar del primer tubo 0.5 ml e inocular en el siguiente tubo que contiene 4.5 ml de caldo MRS y así
-9
sucesivamente hasta llegar a una dilución de 10 .
•
Inocular 1 ml de cada dilución en tres tubos que contengan 5 ml de caldo MRS.
•
Incubar durante 24 horas a 41 °C.
•
Determinar la concentración de microorganismos por mililitro empleando la tabla para determinar el
número más probable diluciones 1:10, para 3 tubos en paralelo.
•
Realizar la curva de crecimiento.
•
Calcular tasas de crecimiento y tiempos de generación para las fases analizadas.
2.3.3 Técnicas turbidimétricas
Las técnicas turbidimétricas son métodos indirectos que se utilizan para determinar la concentración de
microorganismos por unidad de volumen o densidad, en los cuales los cultivos de microorganismos
actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La
turbidometría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión. La nefelometría mide la luz
difractada. Por medio de éstos procedimientos se puede estimar el número de microorganismos en el
cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión microbiana es
directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. La relación entre luz transmitida y
difractada depende de la concentración, tamaño, forma e índice de difracción de partículas de la longitud
de onda y recorrido de la luz. Las partículas interiores también influyen en ésta medida. Dependiendo del
tamaño y características ópticas de los microorganismos existe una concentración mínima. El
espectrofotómetro, es el aparato que se utiliza para medir la luz transmitida. Este aparato proporciona luz
monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. La
cantidad de luz transmitida por una suspensión microbiana es medida por una celda fotoeléctrica e
inversamente proporcional a la cantidad de microbios. Normalmente el crecimiento microbiano no se
expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida
(densidad óptica), ya que ésta última es directamente proporcional al número de microorganismos
presentes en la suspensión. La relación entre la transmitancia y la densidad óptica se expresa
matemáticamente de la siguiente manera:
Densidad óptica = 2 - log % de transmitancia.
La lectura se realiza de la densidad óptica cada hora durante toda la fermentación y se elabora la gráfica
de densidad óptica en función del tiempo.
2.3.3.1 Equipos y materiales
1 Espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible (Figura 13)
2 Cubetas porta muestras
18
5
1
1
Pipetas de 10 ml (± 0,075 ml)
Pipetas de 1 ml (± 0,01 ml)
Gradilla
Frasco lavador
2.3.3.2
Medios y reactivos
Agua de peptona
Caldo MRS
Agua destilada
2.3.3.3
Metodología
§
Conectar el espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible.
§
Con las cubetas del espectofotómetro deben tenerse en cuenta las siguientes
precauciones:
- Limpiar y secar las celdas antes de introducirlas en el instrumento.
- Coger las celdas por la parte superior y lavarlas con agua destilada en abundancia.
•
Realizar el espectro de absorción del caldo MRS entre 200 y 900 nm, para
determinar la longitud de onda en la cual los valores obtenidos correspondan
únicamente al crecimiento de las BAL.
•
Introducir en una celda el blanco (agua destilada) y en la otra la muestra.
•
Realizar la lectura cada hora.
Figura 13. Espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible.
•
Elaborar la gráfica de densidad óptica en función del tiempo.
2.4
DETERMINACIÓN DEL pH
2.4.1 Equipos y materiales
1 Potenciómetro Metrohm (Figura 14).
1 Vaso de precipitado
1 Frasco lavador
Toallas de papel
2.4.2 Medios y reactivos
Cultivo de BAL inoculado en caldo MRS
Agua destilada
Soluciones buffer
4.2.3 Metodología
•
Conectar el Metrohm
•
Calibrar el Metrohm con soluciones buffer de pH 4 y 7.
•
Lavar y secar los electrodos con agua destilada.
•
Introducir los electrodos en la muestra (10 ml) y observar la medida del pH.
•
Realizar la gráfica de pH en función del tiempo sabiendo que el equipo posee una precisión de ± 0.01
Figura 14. Potenciómetro Metrohm.
2.5
DETERMINACIÓN DE LOS SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES
2.5.1 Equipos y materiales
Refractómetro
Etanol 70%
Algodón
2.5.2
Medios y reactivos
Agua destilada
Cultivo de BAL inoculado en caldo MRS.
2.5.3 Metodología
•
Colocar el refractómetro de manera que el rayo de luz se refleje a través del prisma
hasta el ocular.
•
Abrir los prismas. Dejar el prisma inferior en posición nivelada.
•
Colocar dos gotas de la muestra a medir (cultivo de BAL), sin tocar el prisma con el gotero, se cierran
los prismas y se abre la ventanilla.
•
Mover el prisma hasta que el borde del campo brillante caiga en el cruce de las diagonales,
empleando el tornillo grande a la izquierda del ocular.
•
Enfocar girando el tornillo derecho hasta que la línea quede definida y acromática. Si no se obtiene
línea definida puede deberse a muestra insuficiente.
•
Hacer la lectura.
•
Limpiar después de cada lectura, los prismas con alcohol embebido en algodón y dejarlos secar.
•
Realizar la corrección de la lectura de porcentaje de sólidos a 20°C, utilizando la Tabla presentada en
el anexo V (correcciones para la determinación del porcentaje de sacarosa), utilizando el
refractómetro de inmersión ABBÉ cuando las lecturas se llevan acabo a temperaturas distintas a
20°C.
•
Elaborar la gráfica de porcentaje de sólidos totales en función del tiempo.
2.6
DETERMINACIÓN DE LA ACIDEZ
Para determinar la cantidad de ácidos orgánicos existentes en el medio de cultivo,
producidos por las BAL se halla el porcentaje de acidez como porcentaje de ácido
láctico.
2.6.1
Equipos y materiales
1 Soporte Universal
1 Pipeta de 10 ml (± 0,075ml)
1 Bureta de 10 ml BRAND (± 0,05ml)
3 Erlenmeyer de 100 ml
1 Agitador Magnético
1 Balanza Analítica (± 0.0001g)
2.6.2 Medios y reactivos
Hidróxido de Sodio (NaOH) 0,1N o KOH 1N
Fenolftaleina
2.6.3
Metodología
§
Realizar el ensayo por triplicado.
§
Rotular los tres erlenmeyer de 100ml limpios y secos.
§
Pesar los tres erlenmeyer.
§
Homogeneizar y tomar una muestra de 10 ml por erlenmeyer.
§
Pesar cada erlenmeyer y determinar el peso de cada muestra.
2.6.3.1
Titulación de la muestra
§
Colocar la muestra de sobrenadante sobre el agitador, debajo de la bureta que
contenga NaOH 0.1 N.
§
Titular la muestra de sobrenadante con la solución valorada de NaOH 0,1N, hasta
que el cambio de color de la fenolftaleina sea de transparente a rosa pálido y se
mantenga por 30seg.
§
Medir el volumen de NaOH empleado.
2.6.3.2 Cálculo del porcentaje de acidez de la muestra
%Acidez =
V B ∗ N B * PM A L
* 100
m
La relación de equivalentes en la neutralización es 1:1.
Donde:
VB
: Volumen de NaOH utilizado para la valoración (Litros)
NB
: Concentración de NaOH (Equivalentes / Litro)
PMAL
: Peso Molecular del Ácido Láctico (90.08 g / eq)
m
: Peso de la muestra en gramos
Se calcula para cada muestra el porcentaje de acidez y se promedia.
§
Graficar el porcentaje de acidez en función del tiempo, utilizando el error del
procedimiento el cual se calcula sumando y restando 0,5ml al volumen de NaOH
utilizado en la fórmula anterior.
2.6.4 Valoración de la solución de NaOH 0,1N
2.6.4.1
Equipos y materiales
Soporte Universal
Bureta de 10 ml BRAND (± 0,05ml)
Vasos de precipitado de 150 ml
Probeta de 100ml (±0.5ml)
Agitador Magnético
Pinzas
2.6.4.2.
Medios y reactivos
Ftalato ácido de potasio analítico
Solución de hidróxido de sodio a valorar
Fenolftaleina
2.6.4.3. Metodología
§
Secar una cantidad de ftalato ácido de potasio aproximadamente dos horas a
105°C.
§
Enfríar en un desecador.
§
Pesar una muestra de 0.4gramos.
§
Disolver en un vaso de precipitado con 100ml de agua destilada.
§
Adicionar dos gotas de fenolftaleina.
§
Titular con la solución de hidróxido de sodio a valorar.
§
Calcular la normalidad de la solución de hidróxido de sodio de la siguiente manera:
NNaOH
0.4g
204.23 g
eq ⋅ Ftalato
=
VNaOH
La relación de equivalentes en la neutralización es 1:1.
Donde
NNaOH : Normalidad del NaOH (Equivalentes por litro)
VNaOH
: Volumen de NaOH requerido en la titulación (litros)
Esta valoración se debe hacer por triplicado.
2.7
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO TOTAL NITRÓGENO
La muestra de sobrenadante se digiere en ácido sulfúrico caliente, el cual convierte el carbono y el
hidrógeno de la muestra en CO2 y H2O y el nitrógeno de aminas en sulfato de amonio. Después de
enfriar, se neutraliza el ácido sulfúrico por adición de un exceso de hidróxido de sodio concentrado. El
amoniaco liberado por este tratamiento se destila entonces a una cantidad medida en exceso de una
solución de ácido bórico. Después de que la destilación es completa, se realiza la titulación con ácido
clorhídrico.
Reacciones
Sobrenadante +
(NH 4 ) 2 SO 4
Sulfato de amonio
2NH 3
Amoniaco
+
H 2SO 4
Acido Sulfúrico
+
→
(NH 4 )2 SO 4
Sulfato de amonio
→
2NaOH
Hidróxido de Sodio
2H3 BO 3
→
Ac ido Bórico
2H2 BO 3
Ion dihidrógen o borato
+
+
−
+
Ion dihidrógen o borato
2HCl
Acido Clorhídric o
+
2NH 3
Amoniaco
2H 2BO 3
→
+ H 2O
CO 2
Dióxido de Carbono
Na2 SO 4
Sulfato de Sodio
2NH4
+ 2H2o
+
ion amonio
2H3BO 3
Acido Bórico
+
2Cl-
2.7.1 Equipos y materiales
Centrífuga Hermlez 320
Papel de nitrato de celulosa con diámetro de poro de 0.45µm
Aparato de digestión de Kjeldahl. (Figura 15)
Aparato de destilación de Kjeldahl. (Figura 16)
Aparato de succión y recolección de gases.12 Tubos de Kjeldahl.
Agitador magnético.
Bureta de 25 ml (±0,075 )
Erlenmeyer de 250ml
Balanza Analítica AB24 (±0.0001g).
Pinzas
Gafas de protección
2.7.2 Medios y reactivos
Acido sulfúrico concentrado 97% analítico.
Pastillas para Kjeldahl exentas de mercurio y selenio (catalizador).
Solución de hidróxido de sodio al 32%p/v (NaOH comercial).
Agua destilada.
Solución de ácido bórico al 2%p/v.
Solución valorada de ácido clorhídrico 0,1N.
Indicador Taschiro.
2.7.3 Metodología
4.5.3.1
Preparación de las muestras
Para muestras líquidas (sobrenadante del cultivo bacteriano) :
§
Centrifugar el sobrenadante del cultivo de BAL a 4800 rpm por 20 minutos.
§
Filtrar el sobrenadante con papel de nitrato de celulosa con diámetro de poro de
0.45µm para obtener el sobrenadante libre de bacterias.
§
Tomar 5ml con una pipeta volumétrica, para muestras líquidas.
§
Pesar la muestra.
§
Colocar la muestra en un tubo de Kjeldahl, evitando que queden residuos en las
paredes del tubo.
Para muestras sólidas:
§
Poner la muestra a analizar sobre papel de arroz y pesar en la balanza analítica.
Para medir el porcentaje de nitrógeno del cultivo liofilizado se pesan 5 g (cantidad
suficiente si la mezcla es homogénea para las condiciones del equipo utilizado) y
para la biomasa se pesan 3 gramos de las muestras.
§
Colocar la muestra en un tubo de Kjeldahl.
2.7.3.2
Digestión
§
Agregar 20ml de ácido sulfúrico concentrado y una pastilla de catalizador al tubo de
Kjeldahl.
§
Colocar el tubo de Kjeldahl en el aparato de digestión, verificando que el aparto de
evacuación de gases (Scrubber) este encendido. Calentar cuidadosamente hasta
ebullición. Si la espuma formada es excesiva, se debe controlar el calentamiento
para evitar que ésta llegue a la boca del tubo de Kjeldahl.
§
Detener el calentamiento cuando la muestra adquiere un color verde brillante.
§
Retirar el tubo del aparato de digestión y dejar enfriar a temperatura ambiente.
2.7.3.3
§
Destilación
Colocar en el aparato de destilación de Kjeldahl el tubo y un erlenmeyer de 250ml
con dos gotas de indicador Taschiro.
Automáticamente después de dar la orden de inicio al destilador, el equipo agrega al
tubo de Kjeldahl 80ml de NaOH al 32% y 50ml de agua destilada y al erlenmeyer
agrega 75ml de ácido bórico al 2%. La destilación se realiza durante 5 minutos.
2.7.3.4
§
Titulación
Titular el contenido del erlenmeyer obtenido en la destilación con una solución
valorada de HCl 0,1N hasta que cambio de color de verde a violeta sea permanente.
Calcular el contenido de nitrógeno de la muestra de la siguiente manera:
Según la estequiometría de las reacciones:
De donde
Nm =
VH C l ⋅ N H C l
71.43
Donde
Nm
= contenido de nitrógeno de muestra (g).
VHCl
= volumen de HCl utilizado en la titulación (ml).
NHCl
= normalidad del HCl (equivalentes por litro).
71.43
= constante obtenida a partir de la estequiometría de la reacción.
Para hallar el porcentaje de nitrógeno de la muestra se realiza la siguiente operación:
% de nitrógeno =
Nm
x 100
Pm
Donde,
Nm
= contenido de nitrógeno de la muestra (g)
Pm
= Peso de la muestra (g)
Figura 15. Equipo de digestión de Kjeldahl (Derecha) y Scruber (Izquierda).
Figura 16. Equipo de destilación de Kjeldahl.
2.7.4
2.7.4.1
Valoración de la solución de HCL 0,1N
Equipos y materiales
Soporte universal
Bureta de 10 ml BRAND
Vasos de precipitado de 150 ml
Probeta de 100ml (±0.5ml)
Agitador magnético
Pinzas
2.7.5.2
Medios y reactivos
Hidroximetil Aminometano (TRIS)
Solución de Acido Clorhídrico a valorar.
Rojo de Metilo
2.7.6.3 Metodología
§
Secar una cantidad de TRIS aproximadamente dos horas a 105°C
§
Dejar enfriar en un desecador.
§
Pesar una muestra de 0.2g
§
Disolver en un vaso de precipitado con 100ml de agua destilada.
§
Adicionar dos gotas de rojo de metilo
§
Titular con la solución de ácido clorhídrico a valorar.
Calcular la normalidad de la solución de ácido clorhídrico de la siguiente manera:
NHCl
0.2g
121.14 g
eq ⋅ TRIS
=
VHCl
La relación de equivalentes en la neutralización es 1:1.
Donde
NHCl
: Normalidad del HCl (Equivalentes por litro)
VHCl
: Volumen de HCl requerido en la titulación (litros)
Esta valoración se debe hacer por triplicado.
2.8 CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE
NITRÓGENO TOTAL
Para esta metodología se calculó el porcentaje de error de exactitud para la titulación,
para la destilación incluyendo titulación y para la digestión incluyendo destilación y
titulación.
2.8.1 Titulación
Para determinar el error en la titulación, se midió el volumen de una gota de ácido
clorhídrico (HCl) 0.1 N de la siguiente manera:
§
Llenar una bureta de 25 ml. y abrir la llave para dejar caer 10 gotas en un vaso de precipitado,
estableciendo así la variación del volumen del ácido en la bureta. Realizar esta operación por
triplicado. Promediar los volúmenes obtenidos y dividir entre 10 para conocer el volumen de una
gota.
Volumen de una gota =
Volumen de 10 gotas (ml )
10gotas
Determinar el peso de nitrógeno que se titularía con éste volumen de HCl:
Nm =
VHCl * NHCl
71. 43
2.8.2 Destilación y titulación
El error calculado para ésta parte del método incluye el error de la titulación.
§
Pesar 2 gramos de sulfato de amonio y secar en estufa a 105°C durante una hora.
§
Pesar 0.4242 g de sulfato seco para preparar 200 ml de solución, de esta manera
cada mililitro contendrá 0.0021g de nitrógeno.
§
Tomar de ésta solución volúmenes de 0, 4, 8, 12, 16 y 20 ml, los cuales tendrán
respectivamente 0, 8.5, 17.0, 25.5, 33.90 y 42.4 mg de nitrógeno.
§
Destilar éstos volúmenes de la siguiente manera:
Medir cada volumen y depositar en un tubo de destilación. El equipo adiciona 50 ml
de H2O destilada, 80 ml NaOH al 32% frío y se comienza la destilación, recogiendo
el amoniaco desprendido en 75 ml de solución de ácido bórico al 2% y utilizando
como indicador dos gotas de Tashiro. Luego se realiza la titulación con HCl valorado
hasta cambio de color de verde a morado. Este procedimiento se realiza por
triplicado para cada volumen y se calcula el promedio del mismo.
A continuación se muestra la manera como se realizan los cálculos.
2.8.2.1 Nitrógeno recuperado
NR =
VE * N HcL
Donde:
71.43
NR : Nitrógeno recuperado en gramos.
VE : Volumen experimental de ácido clorhídrico requerido en la titulación
2.8.2.2 Porcentaje de recuperación del nitrógeno:
%N R =
NR
* 100
VSA * C N
Donde :
% NR : Porcentaje de recuperación de nitrógeno
NR : Nitrógeno recuperado (g)
VSA: Volumen de solución de sulfato de amonio (ml)
CN :
Concentración de nitrógeno en la solución de sulfato de amonio
(0.0021g de nitrógeno / ml).
2.8.2.3 Error de exactitud
Los porcentajes de error obtenidos para cada punto de la curva se muestran en la siguiente tabla y se
obtuvieron de la siguiente manera:
% EE = [( NR Teórico – NR Experimental) / N
R
Teórico ] * 100
Donde:
%EE :
Porcentaje de error de exactitud
NR :
Nitrógeno recuperado
De esta forma se determinarán los errores de exactitud para los otros volúmenes.
2.8.3
Digestión, destilación y titulación
Se tomaron muestras de urea que tuvieran un contenido de nitrógeno entre 0 y 0.2g de nitrógeno debido
a que en estos valores se encuentran la mayoría de las sustancias orgánicas conocidas.
2.8.3.1 Nitrógeno recuperado:
NR =
v E * NHCl
71.43
Donde:
NR : Nitrógeno recuperado (g).
VE : Volumen experimental de HCl requerido en la titulación (ml).
N : Normalidad del HCl para la titulación (equivalentes por litro).
2.8.3.2 Porcentaje de recuperación de nitrógeno
El porcentaje de recuperación de nitrógeno se calcula de la siguiente manera:
%N R =
NR
* 100
PU * 0.46623
Donde:
% NR
: Porcentaje de nitrógeno recuperado
NR
: Nitrógeno recuperado (g) .
PU
: Peso medido de urea (g).
0.46623
: Fracción de nitrógeno contenido en la urea.
*
2.8.3.3 Error de exactitud
Los porcentajes de error obtenidos para cada punto de la curva se obtienen de la siguiente forma:
*
% EE = [( NR Teórico – NR Experimental ) / N
R
Teórico ] * 100
Donde:
%EE :
Porcentaje de error de exactitud
NR :
Nitrógeno recuperado
Para 0.0712 g de nitrógeno recuperados:
% EE = [(0.07197g – 0.0712g) / 0.07197 ] * 100 = 0.96%
De esta forma se determinarán los errores de exactitud para las otras muestras.
2.9
OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
La condición para el estudio cualitativo y cuantitativo de las propiedades de los
microorganismos es la obtención de cultivos puros, los cuales naturalmente se
encuentran como cultivos mixtos. Un cultivo puro contiene una sola clase (provenientes
de una célula) de microorganismos y para obtenerlo se recurre a las técnicas de
aislamiento por agotamiento de estrías. Como un estudio exploratorio se realiza el
aislamiento de dichas bacterias, por lo que se harán diferentes agotamientos. Se utiliza
el sistema API cuando se esté totalmente seguro de la pureza de las colonias debido al
elevado costo del análisis. El aislamiento se realizará en principio de la siguiente forma:
Tomar muestras de cultivo mixto de 7 y 40
horas de fermentación.
Se toman muestras del inicio de la fase logarítmica y a las 40 horas debido a que en
cultivos mixtos los estreptococos son los primeros microorganismos en desarrollarse
(7h), seguidos por los lactobacilos (40h).
Hacer 5 siembras de cada muestra en cajas de
petri con agar MRS (Anexo C).
Tomar dos colonias de cada caja y realizar un
agotamiento de estrías con cada una.
Realizar un doble agotamiento de estrías tomando una colonia de
cada uno de los anteriores agotamientos.
Observar al microscopio los 10 cultivos puros de cada hora de
fermentación, buscando diferencias morfológicas.
Escoger una bacteria con morfología de coco y tres con
morfología de bacilos (las cuales tengan características diferentes
entre sí) para determinar su perfil bioquímico con el sistema API.
2.9.1 Aislamiento por agotamiento de estrías
Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo
sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener a partir de
un elevado número de bacterias un número reducido de colonias aisladas, distribuidas
individualmente sobre la superficie de la placa. Durante la incubación cada una de las
bacterias dará origen a una colonia.
2.9.1.1 Equipos y materiales
Placas de Petri
Asa de siembra
Mechero
Cámara de Flujo Laminar CIAL Modelo CAE 30x36x6 pulgadas
2.9.1.2 Medios, reactivos y cultivos
Cultivo de BAL BIOFLORA ABY 424
Agar MRS
2.9.1.3 Metodología
w
Encender la cámara de flujo laminar.
w
Colocar la placa de Petri, donde se encuentran activados los microorganismos, de forma invertida
sobre la mesa de trabajo.
w
Tomar la parte que contiene el medio de cultivo, levantar hasta la altura de la llama del mechero, allí
con ella en posición casi vertical, realizar las sucesivas tandas de estrías.
w
Esterilizar el asa flameándola en el mechero hasta conseguir un rojo incandescente.
w
Enfriar el asa en la proximidad de la llama y tomar una porción de la muestra mediante la técnica
descrita anteriormente.
w
Transferir el inóculo a un área pequeña de la superficie de la placa con agar MRS (Anexo C) próxima
al borde.
w
Extender el inóculo, formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción pequeña de la
placa.
w
Flamear el asa de nuevo y se enfría.
w
Rozar una vez con el asa de siembra la última estría sembrada la primera vez y realizar sobre una
porción virgen de la placa una segunda tanda de estrías que no toquen la primera.
w
Flamear y enfriar el asa.
w
Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda
tanda de estrías. Las nuevas tandas de estrías no deben tocar ninguna de las series anteriores.
w
Flamear el asa y tapar la placa de Petri.
w
Incubar a 41°C en posición invertida.
2.10 TÉCNICAS PARA LA
BIOQUÍMICO DE LAS BAL
DETERMINACIÓN
DEL
PERFIL
Para facilitar la identificación de las BAL se empleó la galería del API 50 CHL, de
BioMeriux. La galería API 50 CHL permite realizar el estudio del metabolismo de
hidratos de carbono de los microorganismos. Está compuesto por 50 microtubos. Cada
uno de ellos tiene una zona de anaerobiosis (el tubo), para los estudios de fermentación
y una zona de aerobiosis (la cúpula), para los estudios de oxidación y de asimilación
(Figura 17).
Figura 17. Ejemplo de la galería API 50CHL (BioMeriux) incubada a 37°C,24 horas con BAL1
El primero tubo, sin principio activo, sirve como control negativo. Los tubos siguientes
contienen cada uno una cantidad definida de sustrato deshidratado perteneciente a la
familia de los hidratos de carbono y derivados (heterosidos, polialcoholes, y ácidos
urónicos).
Estos substratos pueden ser metabolizados por diferentes vías:
§
Asimilación: Se traduce en un crecimiento del microorganismo en la cúpula cuando
el substrato es utilizado como única fuente de carbono presente.
§
Oxidación: Se traduce en un cambio de color en la cúpula, debido a una producción
de ácido en aerobiosis, revelada por el indicador de pH del medio elegido.
§
Fermentación: Se traduce por un cambio de color en el tubo, debido a una
producción de ácido en anaerobiosis revelado por el indicador de pH del medio
elegido.
La galería API 50 CH puede ser utilizada para estudiar una de éstas tres vías. El medio
empleado para la inoculación de éstas galerías debe ser elegido en función del
metabolismo a estudiar, y de las exigencias del grupo microbiano correspondiente.
De acuerdo a las bacterias que conforman el cultivo mixto BIOFLORA ABY según ficha
técnica del producto (Anexo A), se utilizará el medio de inoculación CHL para la
determinación de los perfiles bioquímicos.
El medio CHL está diseñado para determinación del perfil bioquímico y subsiguiente
identificación del género Lactobacillus y microorganismos próximos; se encuentra listo
para el empleo y permite realizar el estudio de fermentación de los 49 azúcares de la
galería API 50 CHL.
El microorganismo por estudiar se pone en suspensión en el medio y después se
inocula en cada tubo de la galería. Durante la incubación, el catabolismo de los glúcidos
produce ácidos orgánicos que hacen virar el indicador del pH. Los resultados obtenidos
constituyen el perfil bioquímico de la cepa y sirven para su identificación o su biotipaje.
La lectura de estas reacciones se lleva a cabo utilizando la tabla de lectura y la
determinación del perfil bioquímico se alcanza con la ayuda del catálogo analítico o un
programa de identificación. Después de realizar el aislamiento de las cuatro cepas del
cultivo BIOFLORA ABY, se empleó el API 50 CHL para determinar el perfil bioquímico
de las colonias aisladas.
2.10.1
Equipos y materiales
Estufa (30 o 37 °C)
Nevera (2 a 8 °C)
Mechero
Vortex
Sistema de anaerobiosis
Gradillas para ampollas
Programa de identificación APILAB
2.10.2
Medios y reactivos
Contenido de los 10 Tests:
10 Ampollas de API 50 CHL médium (Anexo F)
1 Ficha técnica
Galería de API 50 CH
10
10
10
1
Galerías API 50 CHL
Cámaras de incubación
Hojas de resultados
Ficha técnica
Aceite de parafina
McFarland Estándar, punto 2
Suspensión médium 2 ml. y 5 ml.
Caldo MRS
2.10.3
Metodología
1. Activación de las colonias
Cultivar la colonia en medio MRS durante 24 horas a 30 a 37°C en anaerobiosis.
2. Preparación de la galería API 50 CHL
Cada galería (Anexo G) está constituida por 5 filas conteniendo cada una 10 tubos numerados.
w
Preparar una cámara de incubación (fondo y tapa).
w
Anotar la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara.
w
Repartir aproximadamente 10 ml. de agua destilada o desmineralizada en los alvéolos del fondo con
el fin de crear una atmósfera húmeda.
w
Sacar las bandas de su envase, y organizarlas en orden desde 0 hasta 49.
3. Preparación del inóculo
w
Abrir una ampolla de suspensión medio (2 ml.) o utilizar un tubo con agua destilada estéril sin aditivo.
w
Tomar todas las bacterias del cultivo, con la ayuda de un asa de siembra y realizar una suspensión
densa en la ampolla.
w
Abrir una ampolla de suspensión médium (50 ml.) y realizar una suspensión densa (S) de turbidez
igual a 2 de McFarland transfiriendo un cierto número de gotas de la suspensión (S ). Anotar este
número de gotas (n).
w
Abrir una ampolla de API 50 CHL e inocular con 2 veces el número de gotas encontradas (2 n).
w
Homogeneizar.
4. Inoculación de la galería
w
Repartir el medio API 50 CHL así inoculado en los tubos con pipeta estéril y se recubren los tests con
aceite de parafina.
w
Incubar a 30 o 37 °C en anaerobiosis durante 4 horas.
5. Lectura de la galería
Para la lectura de las reacciones observadas hay que tener en cuenta dos parámetros:
w
o
La intensidad (crecimiento o acidificación).
o
La velocidad de aparición del ácido láctico.
La lectura de las galerías se realiza:
o
En un tiempo de incubación definido (24 horas o 48 horas), dependiendo del microorganismo.
o
En cada tubo del medio CHL se estudia la acidificación producida, que se traduce por que vira
al amarillo el púrpura de bromocresol contenido en el medio. En el test esculina (tubo # 25) se
observa un viraje del púrpura al negro.
o
Los tubos en los que se observe el cambio de color del púrpura a amarillo (con excepción del
tubo 25 que cambia a negro) se considerarán como resultado positivo y los que conserven el
color púrpura serán negativos.
o
Los resultados se anotan en las hojas de resultados y se envían a BioMerieux donde realizan la
determinación del perfil bioquímico utilizando un programa de computadora (APILAB).
6. Eliminación del material utilizado
Después de su utilización, ampollas, pipetas y galerías deben ser incinerados o
descontaminados por esterilización en autoclave o inmersión en un desinfectante antes
de ser retirados.
2.11 CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS PUROS
Se caracterizará el crecimiento de tres cultivos, los cuales deben pertenecer a géneros
de BAL diferentes (Streptococcus, Bifidobacterium y Lactobacillus).
Después de aislar y determinar el perfil bioquímico de las cepas aisladas de BAL se
procede a caracterizar estos cultivos aislados siguiendo los procedimientos utilizados
para el cultivo mixto.
2.12 TÉCNICA DE CÉSPED
La técnica de césped se emplea para determinar la sensibilidad bacteriana a distintos
antibióticos o agentes antibacterianos. Por el método de la difusión en agar, se enfrenta
la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar a los agentes
antibacterianos (Figura 18), que en este caso son los sobrenadantes de los cultivos
Figura 18. Ejemplo de la técnica de difusión en agar (césped). A la izquierda se observan los
halos de inhibición causados por una solución de ácido láctico con pH de 1 y a la derecha con
una solución con pH de 4.5. El microorganismo indicador es Escherichia coli.
estudiados, los cuales se colocan dentro de pozos abiertos en el agar. La aparición de
una zona en forma de halo de inhibición alrededor de los pozos y la medida del anillo
formado indican la sensibilidad del microorganismo patógeno frente a un producto
determinado. El medio de cultivo generalmente empleado es el de Mueller-Hinton, que
permite el crecimiento de los microorganismos patógenos que se utilizaron.
Para hacer una aproximación al tipo de agente antimicrobiano presente en el
sobrenadante, se realizarán diferentes pruebas al sobrenadante obtenido de la
fermentación del cultivo BIOFLORA ABY 424 utilizando la metodología que se
mencionará a continuación. Los estudios de Barrefoot S., Chen I,Hunghes T y Bodine
A. en 1994 proveen evidencia del incremento que causa en la producción de
bacteriocinas la presencia de otras bacterias ácido lácticas, por esta razón, una vez
aisladas las diferentes bacterias que componen el cultivo mixto, se evaluará de igual
forma la presencia de bacteriocinas con sobrenadantes obtenidos de la fermentación de
una bacteria con morfología de coco y otra con morfología de bacilo aisladas del cultivo
anterior. La fermentación de las BAL produce diversos metabolitos primarios como
ácido láctico, peróxido de hidrógeno y metabolitos secundarios como las bacteriocinas.
Estos metabolitos presentan una conocida actividad antimicrobiana estudiada hace más
de setenta años. Para comprobar si el efecto inhibitorio producido sobre los
microorganismos patógenos utilizados en la técnica de césped, es causado por las
bacteriocinas u otros metabolitos y no por la presencia de ácido láctico, peróxido de
hidrógeno o la influencia de oxígeno, se utilizará KOH para neutralizar (como lo hizo
Quillaza 1994 cuando caracterizó una bacteriocina producida por Lactobacillus
plantarum), un medio de cultivo catalásico (Caldo MRS) para evitar la formación de
peróxidos y se trabajará en anaerobiosis para evaluar la influencia del oxigeno (Brock
T., Smith D. y Madigan M. 1987). De acuerdo con los estudios de Ralph W., Tagg J. y
Bibek R., la mayor producción de bacteriocinas se presenta durante la fase exponencial
y al inicio de la fase estacionaria, por lo tanto se realizaron pruebas con sobrenadantes
a diferentes horas de fermentación, para evaluar en que fase se presenta la mayor
producción de bacteriocinas. Sabiendo que las bacteriocinas son metabolitos
secundarios que se presentan en concentraciones bajas se decidió concentrar como lo
hicieron Cintas L., Rodríguez J., Fernández M., Sletten K., Nes I., Hernández P. y Holo
H. en 1995 caracterizando la producción de Pediocina L50. De acuerdo a los estudios
realizados por Quillama en 1992, para determinar el efecto inhibitorio del sobrenadante
descartando la presencia del ácido láctico, se debe neutralizar. Para esto se utilizará
una solución de KOH al 80% v/v. Cuando Quillaza caracterizó una bacteriocina
producida por Lactobacillus plantarum, ésta se comportaba estable a diferentes valores
de pH. Para conocer a que valores de pH presentan efecto inhibitorio las bacteriocinas
en el sobrenadante analizado, se decidió evaluarlo cuando su pH es 4.00, 4.50, 5.00 y
7.00.
Cuando Barrefoot S., Chen I,Hughes T y Bodine A en 1994 identificaban la producción
de Lactacina B encontraron que la bacteriocina es detectada únicamente en cultivos
cuyo pH se mantiene neutralizado. Para verificar si la presencia del ácido láctico
durante la fermentación influye en la presencia de bacteriocinas, se realizarán
fermentaciones continuas con el cultivo mixto y los cultivos aislados BAL1 y
Lactobacillus acidophilus agregando desde el inicio de la fase logarítmica KOH al 80%
v/v cada 30 minutos.
2.12.1 Equipos y materiales
Cámara de flujo Laminar CIAL Modelo CAE 30x36x6 pulgadas
Desecador de sílica gel
Bomba de vacío
Centrífuga Hettich Universal 32 R
Centrífuga Hermlez 32
Balanza analítica AB24 (±0.0001g)
Crisoles de porcelana
Cajas de Petri
Pipetas Pasteur estériles
Micropipeta
Mechero
2.12.2 Medios, reactivos y cultivos
Sobrenadante obtenido del cultivo de BAL
Cultivos de microorganismos indicadores.
Agar Mueller Hinton (Anexo E)
Caldo Mueller Hinton (Anexo D)
2.12.3 Metodología
§
Obtención del sobrenadante a utilizar:
Centrifugar el cultivo en uno de los siguiente equipos:
§
§
w
Centrífuga Hermlez 320. La muestra se centrifuga a 4800 rpm durante 20 minutos.
§
Centrífuga Hettich Zentrifugue Universal 32R. La muestra se centrifuga a 9000 rpm
durante 5 minutos.
Filtrar el sobrenadante separado de las bacterias en filtro de papel de nitrato de celulosa con
diámetro de poro 0.45 µm.
Preparar agar Mueller Hinton en cajas de Petri y distribuir homogéneamente sobre éste, 100µl del
microorganismo indicador.
Los microorganismos indicadores empleados para detectar las bacteriocinas son:
Bacillus subtilis, Pseudomonas aeuroginosa, Staphylococcus aureus y
Escherichia coli , los cuales se activan en caldo Mueller Hinton durante 24 h a
37°C.
•
Abrir pozos de 6 mm de diámetro.
•
Sembrar en dos pozos diferentes (duplicado), 35 µl de cada uno de los sobrenadantes previamente
separados de las bacterias.
•
Inocular las cajas a 37°C durante 24 horas.
•
Medir los halos de inhibición.
En algunas de las pruebas se requiere neutralizar y concentrar el sobrenadante antes
de sembrarlo en los pozos. Para esto se hizo lo siguiente:
•
Pesar una muestra de 5 gramos de sobrenadante en un crisol.
•
•
•
Colocar el crisol en el desecador y conectar a éste la bomba de vacío.
Concentrar entre 24 y 48 horas pesando periódicamente dependiendo de la
concentración que se desee. La máxima concentración a la que se llegó con los
sobrenadantes empleados para este proyecto manteniendo un estado líquido el
cual se podía manipular con micropipetas fue de 13 veces del peso inicial, para
lo cual se requieren aproximadamente 48 horas en el desacador.
Calcular la concentración obtenida
Concentrac ión =
Peso inicial
Peso final
Todo el material sembrado se debe esterilizar antes de ser desechado.
3
CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO
MICROORGANISMOS INDICADORES
3.1
EQUIPOS Y MATERIALES
DE
LOS
Tubos de ensayo con 10 ml de caldo Mueller Hinton
Tubos de ensayo con 9.8 ml de caldo Mueller Hinton
Tubos con 4.5 ml de caldo Mueller Hinton.
Tubos con 5 ml de caldo Mueller Hinton
Gradillas
Incubadora
Pipetas estériles de 0.1 ml (± 0,001 ml)
Pipetas estériles de 1 ml (± 0,01 ml)
Cámara de Flujo Laminar
Espectofotómetro Spectronic 20 D (Figura 19)
Microscopio
Cámara de conteo de Neubauer
Gotero
Algodón
3.2
MEDIOS, REACTIVOS Y CULTIVOS
Cultivos indicadores (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa y Bacillus
subtilis)
Etanol
3.3
METODOLOGÍA
El siguiente procedimiento se realizó por triplicado para cada uno de los microorganismos:
•
Incubar los microorganismos indicadores en 10 ml de caldo Mueller Hinton durante 24 horas a 37 °C
•
Medir la densidad óptica en el espectofotómetro Spectronic 20 D.
•
Sin introducir ningún tubo ajustar el 0 de transmitancia.
•
Utilizar como blanco agua destilada para ajustar el 100% de transmitancia o cero de
absorbancia, mediante el mando correspondiente.
•
Determinar la longitud de onda a la cual se tiene la mínima absorbancia del caldo Mueller Hinton.
•
Medir la densidad óptica de los microorganismos indicadores a esta longitud de onda.
•
Realizar el conteo en cámara de Neubauer.
•
Realizar el N.M.P. para cada uno de los microorganismos, empleando la tabla para determinar el
Número Más Probable diluciones 1:10, utilizando 3 tubos en paralelo.
Figura 19. Espectrofotómetro Spectronic 20 D
4.
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS UTILIZADOS
4.1
BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
Para detectar la presencia de bacteriocinas se empleó el cultivo de BAL BIOFLORA
ABY 424 C – 859 de la empresa Vivolac Cultures Corporation. Este es un cultivo
liofilizado para la inoculación directa de leche o base para yogurt, diseñado
especialmente para la producción de yogurt espeso de alta viscosidad. El cultivo está
compuesto por los siguientes géneros y especies: Lactobacillus acidophillus,
Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subs Bulgaricus
y Bifidobacterium.
Se decidió utilizar este cultivo basado en los estudios de Klerk y Coetzee sobre la
producción de bacteriocinas por el género Lactobacillus en los años sesenta, cuando
analizaron 189 cepas de lactobacillus homo y heterofermentativos y observaron que, el
6% producían sustancias bactericidas frente a otros miembros de la familia
Lactobacillaceae. Desde entonces se han identificado más de 40 bacteriocinas
producidas por especies homofermentativas obligadas (L. acidophillus, L. johnsonii, L.
amylovorus y L. helveticus), muchas de ellas aisladas de producto cárnicos, encurtidos
y bebidas. La Lactacina B, la acidocina B, la acidocina A y la acidocina J 1132 están
producidas por diversas cepas de Lb. acidophillus; la lactacina F por Lactobacillus
johnsonii; la lactobina A por Lb. amylovorus; la helveticina J y la lactocina 27 por Lb.
helveticus.
La única especie de interés alimentario del género Streptococcus es S. salivarius
subsp. thermophilus que se emplea como cultivo iniciador en gran variedad de quesos y
conjuntamente con Lactobacillus bulgaricus, en la elaboración del yogurt. Villani et al.
aislaron del yogurt comercial la cepa S. thermophilus 347, productora de termofilina
347, una bacteriocina con una potente actividad anti-Listeria.
4.2
MICROORGANISMOS INDICADORES
Los microorganismos indicadores utilizados Bacillos subtilis, Pseudomona aeuroginosa,
Staphylococcus aureus y Escherichia coli han sido ampliamente estudiados como
microorganismos alterantes de la calidad en alimentos como carnes, leches, cereales,
hortalizas y frutas. Por esta razón se decidió evaluar el efecto antimicrobiano de las
bacteriocinas producida frente a estos microorganismos potencialmente patógenos.
Estos microorganismos fueron donados por la facultad de medicina de la Universidad
de la Sabana.
Se seleccionaron dos microorganismos Gram-negativos, Pseudomona aeuroginosa y
Escherichia coli, y dos microorganismos Gram-positivos Bacillos subtilis, y
Staphylococcus aureus, tal como lo hicieron Floriano B., Ruiz J. y Diaz R. en 1998
cuando evaluaron la actividad inhibitoria de la Enterocina I frente a Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeuroginosa, y Escherichia coli.
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
1.
PRUEBAS PRELIMINARES
1.1
ESTANDARIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN
CULTIVO MIXTO
Las pruebas preliminares se realizaron con el fin de estandarizar la cantidad de inóculo
a emplear para que el pH descienda en 4 horas y así prevenir la contaminación durante
la fermentación. Se realizaron mediciones de pH, acidez y porcentaje de sólidos
solubles totales para conocer los diferentes parámetros del cultivo mixto de BAL
utilizando como medio de cultivo caldo MRS con pH inicial de 5.77. Con estas pruebas
se determinó la duración de las fases de crecimiento y se estableció la frecuencia de
toma de datos en el cultivo mixto.
Se determinó la cantidad de inóculo necesaria para obtener una disminución sustancial
en el pH a las cuatro horas de fermentación activando el cultivo mixto y utilizando
diferentes cantidades de inóculo. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 2. Resultados de la fermentación del cultivo mixto utilizando diferentes
cantidades de inóculo
Cantidad de inóculo
(mg)/250ml de caldo
MRS
pH a las 6 horas
de fermentación.
7.50
5.77
15.0
5.77
60.0
5.77
120.0
5.03
Como se observa en la Tabla 2, la cantidad de inóculo especificada por el proveedor (7.5 mg de cultivo BIOFLORA
ABY 424 en 250 ml) esta formulada para leche entera. Al utilizar caldo MRS se utilizarán 120 mg de inóculo para
que el descenso en el pH sea a las seis horas de fermentación y de esta forma garantizar la calidad microbiológica del
cultivo evitando su contaminación observar el lfhsdafhdsfhdaksjlhfdsfdasfdescenso en
el pH a las seis horas de fermentación y de esta forma garantizar la calidad
microbiológica del cultivo evitando su contaminación las seis horas de fermentación y
de esta forma garantizar la calidad microbiológica del cultivo evitando su contaminación.
Durante la fase de latencia (4 primeras horas) se tomaron las muestras cada hora ya
que el cultivo se estaba adaptando a las nuevas condiciones del medio y los cambios
observados eran mínimos. A partir de las 4 horas empieza la fase de crecimiento por lo
tanto la frecuencia de toma de datos se realizó cada media hora hasta las 12.5 horas.
En el momento en que los cambios se hacen menos notorios las lecturas se toman
nuevamente cada hora.
Tabla 3. Resultados preliminares obtenidos durante la fermentación del cultivo mixto de
BAL en caldo MRS a 41°C. (Ver Anexos X, Y, Z).
Tiempo
(h)
pH
° BRIX
%
Acidez
%
0,0
2,0
4,0
5,0
6,0
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,5
12,0
12,5
26,0
6.64
6.53
6.35
5.53
5.46
5.27
5.10
4.92
4.76
4.65
4.56
4.48
4.35
4.12
4.09
4.02
3.78
6,94
6,87
6,77
6,51
6,41
6,40
6,53
6,42
6,26
6,66
6,64
6,70
6,53
6,95
6,42
6,42
6,10
0,2925
0,3263
0,3600
0,5738
0,5738
0,6075
0,6863
0,8100
0,8663
0,9225
1,1250
1,1800
1,2038
1,4400
1,5075
1,6230
1,9238
De acuerdo a lo observado en la fermentación del cultivo mixto, la fase de latencia tiene
una duración de 4 horas, tiempo en el cual se inicia la producción significativa de ácido
láctico evidenciado en el descenso de pH y el aumento de la acidez. La fase logarítmica
inicia a las 4 horas . El descenso total del pH fue de 2.86 unidades y el aumento total
de la acidez fue de 1.6313%.
1.2
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DEL CÉSPED
Para determinar la concentración de agar óptima requerida para observar con claridad
la inhibición producida se hicieron las siguientes pruebas.
1.2.1 Preparación del agar adecuado para realizar la técnica del césped
Para realizar la técnica de césped se utilizó como medio de difusión agar Mueller Hinton
(Anexo E) ya que es un medio que favorece el crecimiento de los microorganismos
indicadores seleccionados.
♦
Técnica del césped capa doble:
Se presentaron dificultades para abrir los pozos debido a la poca gelificación de la capa superior.
Además los halos obtenidos no fueron regulares en sus bordes, debido a la difusión no homogénea del
sobrenadante en el agar, por lo que se decidió realizar una segunda prueba.
♦
Técnica del césped capa sencilla:
Después de realizar cinco repeticiones de la técnica con cada preparación, se decidió emplear el agar de
capa sencilla. Se observó mejor difusión de la solución que contiene los microorganismos indicadores en
el agar, los halos se observaron con mayor claridad y el trabajo se facilitó al utilizar un medio
suficientemente endurecido.
1.2.2 Concentración microorganismos indicadores
Tabla 4. Concentración de microorganismos indicadores cultivados durante 24 horas en
caldo Mueller Hinton a 37°C.
Microorganismo indicador
Conteo (NMO/ml)
Pseudomonas aeruginosa
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Densidad óptica
*
600 nm
1.74
(3,0 – 7,5) x10
8
1.50
1.64
1.74
2. CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE
NITRÓGENO TOTAL
Para esta metodología se calculó el porcentaje de error de exactitud para la titulación,
para la destilación incluyendo titulación y para la digestión incluyendo destilación y
titulación.
2.1
TITULACIÓN
Para determinar el error en la titulación, se midió el volumen de una gota de ácido
clorhídrico (HCl) 0.1 N de la siguiente manera:
Tabla 5. Volumen de 10 gotas de ácido clorhídrico 0.1004 N en una bureta de 25 ml.
Muestra
1
2
3
PROMEDIO
Volumen de 10 gotas de HCl
0,1N (ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
Para las titulaciones realizadas el error fue de más o menos una gota.
Volumen de una gota =
0.5ml
= 0.05 ml gota
10gotas
Se determinó el peso de nitrógeno que se titularía con éste volumen de HCl:
Nm =
VHCl * N HCl 0.05 * 0.1
=
= 6.99 ×10 − 5 g de nitrógeno
71.43
71.43
Por lo tanto en cada titulación se pudo determinar el contenido de nitrógeno presente en la muestra más
-5
o menos 6.99 x 10 g.
2.2
DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
El error calculado para ésta parte del método incluye el error de la titulación. A continuación se muestra la
manera como se realizaron los cálculos.
2.2.1
Nitrógeno recuperado
Para un volumen medido de sulfato de amonio de 4 ml,
NR =
6ml * 0.1012N
= 0.0085 g nitrógeno
71.43
NR : Nitrógeno recuperado en gramos.
Al valorar el HCl la concentración exacta fue 0.1012N
De esta forma se determinó el nitrógeno recuperado para los otros volúmenes (Anexo H).
2.2.2
Porcentaje de recuperación del nitrógeno
Para 0.0251 g. N recuperado:
% NR =
0.0251gN
*100 = 98.57%
12 ml * 0.0021gN / ml
Donde :
% NR : Porcentaje de recuperación de nitrógeno
De esta forma se determinó el porcentaje de recuperación para los otros volúmenes. (Anexo H).
2.2.3
Error de exactitud
Los porcentajes de error obtenidos para cada punto de la curva se muestran en la siguiente tabla y se
obtuvieron de la siguiente manera:
% EE = [( NR Teórico – NR Experimental) / N
R
Teórico ] * 100
Donde:
%EE :
Porcentaje de error de exactitud
NR :
Nitrógeno recuperado
De esta forma se determinaron los errores de exactitud para los otros volúmenes.
Tabla 6. Porcentajes de error de exactitud para la curva de calibración de la destilación en el método de
Kjeldahl.
Sulfato de Amonio (g)
Cont. Teórico de
nitrógeno (g)
Cont. Experimental de
nitrógeno (g)
% Error exactitud
0.04
0.00848
0.00850
0.24%
0.00
0.01696
0.01700
0.24%
0.12
0.02544
0.02508
1.43%
0.16
0.03392
0.03333
1.74%
0.20
0.04240
0.04179
1.43%
GRÁFICA 1.
Curva de calibración para la destilación en el método Kjeldahl
0.045
Contenido de Nitrógeno (g)
0.04
0.035
0.03
0.025
CN = 0.2082 PS + 0.0001
0.02
R
2
= 0.9999
0.015
0.01
0.005
0
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
Peso de Sulfato de Amonio (g)
Teórico
Experimental
Gráfica 1. Curva de calibración para la destilación en el método de Kjeldahl para la
determinación del contenido de nitrógeno.
2.3
DIGESTIÓN, DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
Se tomaron muestras de urea que tuvieran un contenido de nitrógeno entre 0 y 0.2g de nitrógeno debido
a que en estos valores se encuentran la mayoría de las sustancias orgánicas conocidas.
2.3.1
Nitrógeno recuperado:
Para un peso medido de urea de 0.15415g:
NR =
52.35ml * 0.1024N
= 0.0712 g nitrógeno
71.43
Donde:
NR : Nitrógeno recuperado (g).
De esta forma se determinó el nitrógeno recuperado para los otros volúmenes (Anexo
I.)
2.3.2
Porcentaje de recuperación de nitrógeno
El porcentaje de recuperación de nitrógeno se calcula de la siguiente manera:
Para 0.0712 g de nitrógeno recuperados:
%N R =
0.0712g
* 100 = 99.04%
0.15415 * 0.46623
Donde:
% NR
: Porcentaje de nitrógeno recuperado
0.46623
: Fracción de nitrógeno contenido en la urea.
De esta forma se determinó el porcentaje de recuperación de nitrógeno para todas las muestras. (Anexo
I)
2.3.3
Error de exactitud
Los porcentajes de error obtenidos para cada punto de la curva se muestran en la Tabla 7 y se
obtuvieron de la siguiente forma:
Para 0.0712 g de nitrógeno recuperados:
% EE = [(0.07197g – 0.0712g) / 0.07197 ] * 100 = 0.96%
Donde:
%EE :
Porcentaje de error de exactitud
De esta forma se determinaron los errores de exactitud para las otras muestras.
Tabla 7.
Porcentajes de error de exactitud para la curva de calibración de la Digestión, Destilación
y Titulación en el método Kjeldahl.
Peso Urea
(g)
Cont. Teórico de
nitrógeno (g)
Cont. Experimental
de nitrógeno (g)
Error exactitud
%
0.0000
0.0000
0.0039
-
0.0419
0.0195
0.0200
2.71
0.1223
0.0570
0.0573
0.45
0.1542
0.0719
0.0712
0.96
0.1985
0.0926
0.0904
2.31
0.2374
0.1107
0.1091
1.40
0.2732
0.1274
0.1268
0.43
0.4360
0.2033
0.2023
0.44
En todos los casos se restó el peso de nitrógeno del papel de arroz sin muestra de urea, el cual fue de
0.0038 g. La curva de calibración obtenida se presenta en la gráfica 2.
0.25
Contenido de Nitrógeno (gr.)
0.2
0.15
0.1
Cont. N = 0.4574 * PU + 0.0015
2
R = 0.9995
0.05
0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
Peso de Urea (gr.)
Contenido teórico de nitrógeno (gr)
Lineal (Contenido experimental de Nitrógeno(gr.))
Gráfica 2. Curva de calibración para el método Kjeldahl (Digestión, Destilación y titulación.
3.
CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL
EN CULTIVO MIXTO
3.1
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS EN
FUNCIÓN DEL TIEMPO
Se emplearon las técnicas de Número Más Probable y conteo total de microorganismos
en cámara de Neubauer. Los resultados se presentan en la Tabla 8. Se elaboró
además la curva de crecimiento de las BAL a través del tiempo (Gráfica 3 ).
Tabla 8. Conteo de microorganismos cultivo mixto
Tiempo (h)
Conteo NMO / ml
2.0
4.50 x 10
4.0
9.50 x 10
6.0
8.52 x 10
7.0
5.04 x 10
7.5
6.32 x 10
8.0
7.60 x 10
8.5
8.40 x 10
9.0
9.45 x 10
9.5
1.05 x 10
10.0
1.15 x 10
10.5
1.24 x 10
11.0
1.35 x 10
12.0
1.85 x 10
13.0
2.10 x 10
26.0
1.96 x 10
4
4
5
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
Los valores obtenidos con la cámara de Neubauer para las cuatro primeras horas en las que las
6
concentraciones fueron menores a 10 bacterias/ml no se presentan en la tabla 8 (Anexo M). Para el resto
de datos en los que las concentraciones son mayores a la mencionada, se tomaron los datos obtenidos
por el conteo en cámara de Neubauer los cuales fueron confirmados con la técnica del NMP.
Gráfica 3. Curva de crecimiento del cultivo mixto de BAL fermentado a 41°C en caldo MRS.
2.50E+07
2.00E+07
N.M.O. / ml.
1.50E+07
1.00E+07
5.05E+06
4.50E+04
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
TIEMPO (h)
TASA DE CRECIMIENTO DURANTE TODA LA FERMENTACION
Log Nf - Log No Log 1.96x10 7- Log 4.50x10 4
TC =
=
= 0.365
Log 2 *(tf − to )
Log2* (26- 2)
du p l i c a c i o n e s
h
TIEMPO DE GENERACIÓN MEDIO
G=
1
1
=
= 2.737 h
TC 0.365
3.2
DETERMINACIÓN DE OTROS PARÁMETROS DE CRECIMIENTO
3.2.1
Determinación de densidad óptica, pH, porcentaje de acidez y sólidos solubles totales.
Se determinó por medio del espectro de absorción del caldo MRS que la menor
densidad óptica se presenta cuando la longitud de onda es 600nm
Se midió la densidad óptica de las BAL a través del tiempo (Tabla 9) y se elaboró la
gráfica de densidad óptica en función del tiempo (Gráfica 4 ).
Se midió además el pH cuyos datos se presentan en la tabla 9 y la gráfica 5, la cual se realizó
conociendo la precisión del potenciómetro (± 0.01). La curva de acidez de la gráfica 5 se realizó sabiendo
que el error de experimentación es de más o menos una gota al final de la titulación. Los rangos
utilizados para estas gráficas se presentan en los anexos Ñ y O. Los sólidos solubles durante toda la
fermentación se mantuvieron cercanos a 6%, los resultados se presentan en el anexo P.
Tabla 9. Parámetros de crecimiento del cultivo mixto en función del tiempo
Tiempo (h)
Densidad óptica (600 nm)
pH
% Acidez
0.0
2.0
4.0
5.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.5
12.0
12.5
26.0
0.2045
0.3869
0.5741
0.6780
0.9601
1.0017
1.1058
1.2316
1.3254
1.4358
1.5635
1,6843
1,8450
2,0057
2,1086
2,2067
2,2067
5.77
5.73
5.59
5.44
5.03
4.88
4.77
4.61
4.50
4.49
4.40
4.25
4.20
4.18
4.14
4.08
3.72
0,54%
0,56%
0,61%
0,61%
0,84%
0,84%
0,89%
0,98%
1,06%
1,10%
1,18%
1,18%
1,18%
1,24%
1,37%
1,46%
2,05%
2.4000
2.0000
D.O.
1.6000
1.2000
0.8000
0.4000
0.0000
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
TIEMPO (h)
Gráfica 4. Densidad óptica en función del tiempo cultivo mixto de BAL fermentado a
41°C en caldo MRS y longitud de onda de 600nm.
6.5
2.25%
6
2.00%
5.5
4.5
1.50%
pH
4
1.25%
3.5
3
1.00%
2.5
Porcentaje de Acidez
1.75%
5
0.75%
2
1.5
0.50%
1
0.25%
0.5
0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
22.0
24.0
0.00%
26.0
Tiempo (h)
pH
Porcentaje Acidez
Gráfica 5. pH y porcentaje de acidez en función del tiempo para el cultivo mixto de BAL
fermentado a 41°C en caldo MRS.
3.2.2 Determinación de contenido total de nitrógeno
Se determinó el porcentaje de nitrógeno para el sobrenadante durante toda la
fermentación (Anexo Q).
Tabla 10. Porcentaje de nitrógeno del cultivo mixto
5.000
% Nitrógeno
*
BH
0.0645%
% Nitrógeno
**
BS
1.304%
0.249
2.0819%
2.124%
5.092
2.540
0.0635 %
0.4208%
1.285%
3.557%
Muestra
Peso (g)
CALDO MRS
BIOMASA INICIAL (Cultivo
Liofilizado)
SOBRENADANTE FINAL
BIOMASA FINAL
*
Base húmeda
**
Base seca
El porcentaje de nitrógeno, permaneció entre 0.0645 y 0.0635% durante toda la
fermentación.
4. OBTENCIÓN Y DETERMINACIÓN DEL PERFIL BIOQUÍMICO
DE CULTIVOS PUROS
Durante las primeras horas de fermentación del cultivo mixto se observó crecimiento de bacterias
identificadas morfológicamente como cocos. Después de realizar los agotamientos por estrías tomaron
dos colonias puras cuya morfología (por observación al microscopio) fue de coco, las cuales, se
cultivaron en cajas de Petri con agar MRS para la identificación con el sistema API.
Se tomaron además muestras de cultivo de 40 horas de fermentación. Después de realizar los
agotamientos de este cultivo, se aseguró la pureza de los 10 cultivos para determinar su perfil
bioquímico. Al no poder diferenciar morfológicamente el Bifidobacterium de los demás bacilos
observados, se pasó a la utilización del sistema API para la determinación del perfil bioquímico. Los
resultados detallados, en los que se indica que azúcares fermentaron las bacterias se presentan en al
anexo J.
La determinación del perfil bioquímico del Bifidobacterium se obtuvo a partir de las
reacciones observadas en el API 50 CHL comparándolas con los perfiles que presenta
el Bifidobacterium en el sistema de identificación API 20A. La bacteria identificada como
BAL 1 fue el único coco encontrado en el cultivo mixto. El único coco según el
proveedor del cultivo es un Streptococcus salivarius thermophilus.
Tabla 11. Resultados del perfil bioquímico realizado a los aislamientos del cultivo mixto BIOFLORA ABY
424 con el sistema API 50 CHL.
BAL
Bifidobacterium
L. delbrueckii
L. acidophillus
BAL 1
Tiempo de
Fermentación
(h)
40
40
40
8,14 y 40
Observación al
microscopio
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Coco
5.
CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS
PUROS
5.1
MEDICIÓN DE LA DENSIDAD ÓPTICA A TRAVÉS DEL TIEMPO
PARA LOS CULTIVOS PUROS.
A continuación se presentan los resultados de la densidad óptica presentada por las
cepas BAL 1, Bifidobacterium y Lactobacillus acidophillus, aisladas del cultivo mixto.
(Tabla 12 y Gráfica 6).
Tabla 12. Densidad óptica de las cepas aisladas
Tiempo
(h)
0
1
2
3
5
6
8
9
11
15
Densidad óptica λ = 600 nm
BAL 1 Bifidobacterium Lactobacillus
acidophilus
0.1452
0.2902
0.7324
1.3153
1.9940
2.2510
2.2671
2.2716
2.2801
2.2942
0.2429
0.5542
1.0256
1.4852
2.2050
2.2104
2.2149
2.2188
2.2190
2.2199
0.1037
0.1038
0.1048
0.2840
0.7047
0.9253
1.3065
1.4489
1.5856
1.7223
32
2.4572
2.3574
1.8945
2.7500
2.5000
2.2500
2.0000
D.O. (nm)
1.7500
1.5000
1.2500
1.0000
0.7500
0.5000
0.2500
0.0000
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
22.5
25
27.5
30
32.5
35
Tiempo (h)
BAL 1
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium
Gráfica 6. Densidad óptica en función del tiempo para cepas aisladas fermentadas a 41°C en
caldo MRS medida a 600nm.
5.2
MEDICIÓN DE pH y PORCENTAJE DE ACIDEZ EN FUNCIÓN DEL
TIEMPO PARA LOS CULTIVOS PUROS .
Tabla 13. pH y porcentaje de acidez para las cepas aisladas
Tiempo (h)
BAL 1
Bifidobacterium
Lactobacillus acidophillus
pH
Acidez
pH
Acidez
pH
Acidez
1
5.81
0.94%
5.81
0.84%
5.86
0.87%
2
5.78
0.94%
5.77
0.87%
5.83
0.88%
3
5.77
0.96%
5.74
0.93%
5.83
0.93%
4
5.63
0.99%
5.50
0.97%
5.74
0.94%
5
5.50
1.03%
5.28
1.03%
5.62
1.05%
6
5.19
1.09%
4.96
1.20%
5.39
1.12%
7
5.04
1.17%
4.87
1.36%
5.30
1.12%
9
4.75
1.64%
4.69
1.65%
5.01
1.48%
11
4.55
1.70%
4.60
1.77%
4.75
1.63%
15
4.36
2.31%
4.52
2.18%
4.51
1.85%
6.90
6.70
6.50
6.30
6.10
5.90
5.70
pH
5.50
5.30
5.10
4.90
4.70
4.50
4.30
4.10
3.90
3.70
3.50
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Tiempo (h)
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium
BAL 1
Gráfica 7. pH en función del tiempo para las cepas aisladas cultivadas a 41°C en caldo MRS.
2.50%
2.25%
2.00%
1.75%
% ACIDEZ
1.50%
1.25%
1.00%
0.75%
0.50%
0.25%
0.00%
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TIEMPO (HORAS)
Bifidobacterium
BAL 1
Lactobacullus acidophilus
Gráfica 8. Acidez en función del tiempo para cepas aisladas fermentadas a 41°C en caldo
MRS.
5.3
MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES
A TRAVÉS DEL TIEMPO PARA LOS CULTIVOS PUROS
Se midió el porcentaje de sólidos solubles totales (Anexo U) utilizando el procedimiento
descrito en el numeral 2.5 del capítulo 2 observándose que durante la fermentación de
las cepas aisladas BAL 1, Bifidobacterium y Lactobacillus acidophilus este valor
permanece en un rango de 6.4 a 7.3%.
6.
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS
En el anexo K se observa la codificación que se utilizó para los diferentes
sobrenadantes de acuerdo al tratamiento realizado. A continuación se presentan los
resultados obtenidos con los diferentes tratamientos. Para todas las pruebas siguientes
se utilizó la técnica del césped presentada en el numeral 2.9 del capítulo 2.
6.1
SOBRENADANTE
OBTENIDO
DIRECTAMENTE
FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO
DE
LA
El sobrenadante obtenido fue tomado a las 48 horas de fermentación cuando el pH del
cultivo era 4.0.
Tabla 14. Halos de inhibición obtenidos con sobrenadante SCm48ASNNcoSc y pH 40.
Halos de inhibición (mm)
6.2
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
aeruginosa
1.0
1.5
1.5
1.0
CONCENTRACIÓN DEL SOBRENADANTE
Para esta prueba se utilizaron sobrenadantes de 12 horas de fermentación
concentrados entre 8 y 13 veces y pH entre 4 y 4.5.
Tabla 15. Halos de inhibición obtenidos con sobrenadantes concentrados de los
cultivos aislados y mixto.
Halos de inhibición (mm)
Concentración
Código
pH
Staphylococcus Pseudomonas
(veces)
aureus
aeruginosa
SCm12ASNNcoC
SCpLd12sASNNcoC
ScpBAL1
12sASNNcoC
6.3
4.5
4.0
8
13
6
11
5
5
4.5
8
5
2
EFECTO INHIBITORIO DE SOLUCIONES DE ÁCIDO LÁCTICO
Para esta prueba se prepararon soluciones con ácido láctico en agua destilada a
diferentes valores de pH para compararlas con los halos de inhibición obtenidos
anteriormente.
Tabla 16. Halos de inhibición obtenidos con soluciones de ácido láctico.
Halos de inhibición (mm)
pH
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
1.0
18.0
14.0
3.0
1.0
0.5
3.5
0.5
0.5
4.0
0.5
0.5
4.5
0
0.5
6.4
INFLUENCIA DEL pH EN LA ESTABILIDAD DEL EFECTO
INHIBITORIO
6.4.1 Sobrenadante con pH final de 4.0, 4.5, 5.0 y 7.0
Este sobrenadante fue tratado con una solución de KOH al 80% v/v para llevarlo a los
diferentes valores de pH presentados en la siguiente tabla.
Tabla 17. Halos de inhibición obtenidos con sobrenadante SCm48ANcoSc y pH de
4.00, 4.50, 5.00 y 7.00.
pH
4.00
4.50
5.00
7.00
Bacillus subtilis
1.0
1.0
No hay halo
No hay halo
Halos de inhibición (mm)
Staphylococcus
Escherichia coli
aureus
1.5
1.0
No hay halo
No hay halo
1.5
1.5
No hay halo
No hay halo
Pseudomonas
aeruginosa
1.0
1.0
No hay halo
No hay halo
6.4.2 Sobrenadantes obtenidos de fermentaciones con pH controlado
Para esta prueba se utilizaron sobrenadantes tomados al inicio de la fase estacionaria y
concentrados 8 veces comparándose el efecto inhibitorio cuando el pH se controla o nó
durante la fermentación; los resultados se presentan en la siguiente tabla:
Tabla 18. Resultados con sobrenadantes obtenidos de fermentaciones con pH
controlado y sin controlar.
Código Sobrenadante
SCm12ANCoC
SCm12ANScoC
SCp BAL 1 14sANCoC
SCp BAL 1 14sANScoC
SCpLa14sANCoC
pH
final
pH sobrenadante
neutralizado
7.41
4.31
7.41
7.50
7.20
4.18
7.20
6.82
6.81
6.81
4.30
SCpLa14sANScoC
7.41
Al realizarla técnica del césped no se observaron halos de inhibición.
6.4.3 Sobrenadantes obtenidos de fermentaciones en ausencia de oxígeno
Para esta prueba se utilizaron sobrenadantes obtenidos de la fermentación del cultivo
mixto, BAL 1, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus acidophilus tomados al inicio de
la fase estacionaria, neutralizados con KOH al 80% v/v y concentrados de 9 a 12 veces.
Tabla 19. Resultados con sobrenadantes obtenidos de la fermentación en ausencia de
oxígeno.
Código sobrenadante
pH final
SCm12AnNScoC
SCp BAL1 12sAnNScoC
SCpLd14sAnNScoC
SCpLa12sAnNScoC
3.84
4.43
3.69
3.70
Al realizarla técnica del césped no se observaron halos de inhibición.
6.4.4 Sobrenadante a diferentes tiempos de fermentación
Para esta prueba se concentraron los sobrenadantes de 9 a 12 veces y se neutralizaron
entre pH de 6.90 a 7.20.
Tabla 20. Resultados con sobrenadantes a diferentes tiempos de fermentación.
Código
Tiempo de
fermentación (h)
pH final antes de
neutralizar
SCm8ANScoC
SCpBAL18sANScoC
SCpLd8sANScoC
SCm12sANScoC
SCpBAL112sANScoC
SCpLd12sANScoC
SCm30ANScoC
SCm40ANScoC
8
8
8
12
12
12
30
40
5.40
4.80
4.70
4.80
4.5
4.2
3.70
3.60
Al realizarla técnica del césped no se observaron halos de inhibición.
6.5
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA ESTABILIDAD DEL
EFECTO INHIBITORIO
Los sobrenadantes del cultivo mixto y los cultivos aislados son estables entre el rango
de temperatura entre 4 y 41°C. En las pruebas en las que se observó halo de inhibición
se utilizaron sobrenadantes tratados a 4°C durante 24 horas y se observó que el efecto
inhibitorio se conserva después de la temperatura de fermentación.
CAPÍTULO 4
ANÁLISIS DE RESULTADOS
1. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN
CULTIVO MIXTO
1.1
CURVA DE CRECIMIENTO
Según los resultados obtenidos se observa que durante las primeras 4 horas el número
de microorganismos por mililitro permanece en 104 bacterias/ml, lo cual corresponde al
crecimiento reportado por los proveedores de cultivos para la fase de latencia en las
bacterias ácido lácticas. A partir de las 4 horas inicia la fase de aceleración, la cual se
prolonga hasta las 6 horas presentando un aumento de 9.5x104 a 8.5x105 bacterias/ml.
La fase exponencial inicia a las 6 horas aproximadamente y la concentración de los
microorganismos es de 8.52 x 105 bacterias/ml. La tasa de crecimiento en esta fase es
de 0,660 duplicaciones/h y el tiempo de generación es de 1.51 horas, es decir, que en
la fase exponencial las bacterias se duplicarn cada 1.51h. De las 13 a las 26 horas el
número de bacterias por mililitro se mantiene alrededor de 2.1 x 107 , en esta fase el
substrato es metabolizado y se han formado sustancias tóxicas, por lo tanto el
crecimiento desciende o se detiene completamente influenciado por la alta
concentración de ácido láctico.
Estos datos son confirmados por la curva de crecimiento de Lactobacillus salivarius
subs. salivarius (Pescue Aida y Nader M., 1999), en donde la fase de latencia termina a
las seis horas. Comparando la fase logarítmica del cultivo mixto con la fase logarítmica
del Lactobacillus salivarius subs.salivarius, en el primero se observa una fase de mayor
tiempo, debido a la interacción entre las cuatro bacterias que conforman el cultivo mixto.
Según la tasa de crecimiento calculada para toda la fermentación se generan 0.36
duplicaciones por hora y el tiempo de generación es de 2.73h. En el Anexo W se
presenta la comparación entre la curva de crecimiento y la densidad óptica del cultivo
mixto.
1.2 DENSIDAD ÓPTICA (ABSORBANCIA) CON LONGITUD DE ONDA
DE 600 nm.
Durante las primeras 4 horas, se observó un aumento promedio de 0.100 por hora en la
densidad óptica (Tabla 9 y Gráfica 4), y en la fase exponencial el aumento promedio es
a razón de 0.4772 cada hora. Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos en la
curva de crecimiento, en la cual se observa el inicio de la fase logarítmica o exponencial
entre las 4 horas de fermentación . Lo anterior corresponde a lo esperado de acuerdo a
las especificaciones del proveedor, el cual afirma que el crecimiento se inicia máximo a
las 6 horas de iniciada la fermentación, cuando el substrato es leche.
Al igual que la técnica de conteo en cámara de Neubauer, la densidad óptica no es
confiable a concentraciones menores de 106 bacterias/ml, esta es la razón de las
diferencias encontradas durante las primeras horas con respecto al conteo.
1.3
COMPORTAMIENTO DEL pH Y PORCENTAJE DE ACIDEZ
La capacidad de las BAL de producir grandes cantidades de ácido láctico por
fermentación de los carbohidratos presentes en el medio de cultivo lleva al consecuente
descenso de pH. (Martinez Mago, Martinez J.Ma , Herranz C., Suarez A.M. y Rodriguiez
J.M., 2000).
En el cultivo mixto BIOFLORA ABY 424, se observa un descenso del pH en el
sobrenadante desde 5.77 hasta 3.72 (Gráfica 5 y Tabla 9). Durante la fase de latencia,
la cual tiene una duración de 4 horas, la variación del pH es menor a la registrada
durante la fase logarítmica. La mayor producción de ácido láctico se obtiene al inicio de
la fase logarítmica, la cual ocurre a entre las 4 y 12 horas de fermentación. En la fase
estacionaria el pH llega a 3.72.
El porcentaje de acidez del cultivo aumentó de 0.54% al 2.00% en 26 horas. Durante la
fase de latencia el porcentaje de acidez llego a 0.61%.
1.4
PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES
El caldo MRS tiene un contenido inicial de sólidos solubles de 6.4°Brix, el consumo de
estos sólidos por parte de las bacterias ácido lácticas se ve compensado por la
producción de bacteriocinas y metabolitos secundarios de las BAL. Como se observa
en el anexo P los sólidos solubles permanecen alrededor del 6°Brix para el cultivo
mixto, observándose tendencia a la disminución ya que comienzan en 6.4 y terminan en
6.25°Brix.
1.5
CONTENIDO TOTAL DE NITRÓGENO
El último parámetro medido para caracterizar el crecimiento de las BAL fue la variación
del contenido total de nitrógeno a través del tiempo (Anexo Q).
Como se observa, el descenso en el contenido de nitrógeno que contiene inicialmente
el caldo MRS utilizado como alimento de las BAL se transforma en biomasa, por esta
razón, el porcentaje de nitrógeno permanece durante toda la fermentación en valores
cercanos a 0.06%.
Para verificar el comportamiento del nitrógeno durante toda la fermentación se midieron
los valores de: porcentaje de nitrógeno en el caldo MRS, cultivo liofilizado, biomasa final
y sobrenadante final y se realizó el siguiente balance de materia en el que se comprobó
que el nitrógeno perdido por el caldo de cultivo es ganado por las bacterias en
crecimiento.
El nitrógeno perdido por el medio de cultivo debe ser igual al nitrógeno ganado por la
biomasa.
NpcMRS
=
NGB
Donde,
NpcMRS
NGB
= Nitrógeno perdido por el caldo MRS
= Nitrógeno ganado por la biomasa.
El nitrógeno ganado por la biomasa es igual al nitrógeno de la biomasa final menos el
nitrógeno del cultivo liofilizado.
NGB
=
NB – NLF
Donde,
NB
= Nitrógeno de la biomasa final
NLF
= Nitrógeno cultivo liofilizado
NB = P B * Np = 2.54 gr * 3.6%N + (%EE) = 0.0939gN
NLF = P L * Np = (0.12 gr) * 2.124%N - (%EE) = 0.0024gN
Donde,
PB = Peso de la biomasa
PL = Peso del cultivo liofilizado
Np
= Porcentaje de nitrógeno en base seca.
%EE
= Porcentaje de eror de exactitud calculado para el método de Kjeldahl
Remplazando,
NGB = N B -NLF = 0.092gN
El nitrógeno perdido por el medio de cultivo es igual al nitrógeno del caldo menos el
nitrógeno del sobrenadante final.
NpcMRS
=
NMRS – NSF
Donde,
NMRS
NSF
= Nitrógeno caldo MRS
= Nitrógeno del sobrenadante final
NMRS = V * D * Np = 250ml * 1.036
NSF = V * D * Np = 250ml * 1.036
V
D
Np
gr
* 1.304%N + (%EE) = 3.420gN
ml
gr
* 1.285%N = 3.328gN Donde,
ml
= Volumen del caldo ó sobrenadante
= Densidad caldo MRS ó sobrenadante
= Porcentaje de nitrógeno en base seca.
Remplazando,
NpcMRS = 0.092gN
2.
CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL
EN CULTIVOS PUROS
2.1. CURVA DE CRECIMIENTO
La curva de crecimiento para las bacterias aisladas del cultivo mixto (Gráfica 6 y Tabla
12) se realizó midiendo la densidad óptica a lo largo de la fermentación.
En el caso de las bacterias aisladas, la fase de latencia es de dos horas en el caso del
Lactobacillus acidophilus y de cero para Bifidobacterium y BAL 1 debido a que a
diferencia del cultivo mixto liofilizado, estas ya se encuentran activadas previamente.
Para el cultivo de cocos aislado BAL 1 y el cultivo Bifidobacterium el crecimiento inicia
desde las cero hasta las dos horas con una fase de aceleración en la que la densidad
óptica aumenta desde 0,1452 hasta 0,3813 para BAL 1 y desde 0,2429 hasta 0,6482
para Bifidobacterium.
La fase logarítmica inicia desde las dos horas , observándose un crecimiento de 13.73
veces para BAL 1 y para Bifidobacterium 9.07 veces; mientras que el crecimiento del
Lactobacillus acidophillus se desarrolla con una fase de latencia de 2 horas, tiempo en
el cual se inicia la fase logarítmica la cual aumenta 4.88 veces. De acuerdo con estos
resultados los cultivos de BAL 1 y Bifidobacterium se adaptan con mayor facilidad al
medio mientras que el Lactobacillus acidophillus tarda 2 horas para iniciar su
crecimiento el cual se desarrolla a menor velocidad que las anteriores. Lo anterior es
confirmado por el análisis de varianza, el cual indica que no existen diferencias
significativas en el crecimiento de BAL1 y Bifidobacterium mientras que sí las hay, entre
el Lactobacillus acidophilus y las dos anteriores.
Para determinar si existen diferencias significativas en el crecimiento de las tres cepas
analizadas se realizó el siguiente análisis de varianza:
Tabla 21. Sumatoria de las densidades ópticas de las cepas aisladas necesarias para
el análisis de varianza.
Σ TOTAL
N
BAL 1
Bifidobacterium
11
18.2983
18.9533
Lactobacillus
acidophilus
10.1841
Gran
Total
47.4357
Con estos valores se calculan los siguientes factores y grados de libertad:
Factor de corrección: Es el cuadrado del gran total dividido el número total de
lecturas.
FC = (47.4357)2 / (3 x 11) = 68.1862
Suma de cuadrados: Se calcula sumando el cuadrado del total de las lecturas de cada
hora, dividido por el número de lecturas para cada cepa menos el factor de corrección.
SCm = [(18.29832 + 18.95332 + 10.18412) / 11] -68.1862 = 4.3384
Grados de libertad: Se calcula restando uno del número de cepas analizadas.
gl = 3 - 1 = 2
Suma de cuadrados, total: Se calcula sumando el cuadrado de cada dato y restando
el factor de corrección.
SCt = (0.14522 + 0.24292 + 0.10372 + 0.29022 + 0.73242 + ... + 1.72232 + 2.45722 +
2.35742 + 1.89452) - 68.1862 = 22.9801
Grados de libertad total: Se calcula restando uno del número total de datos
glt = 33 - 1 = 32
Suma de cuadrados del error: Se calcula restando la suma de cuadrados de las
lecturas (fuente de la variación) de la suma de cuadrados total.
Sce = 22.9801 - 4.3384 = 18.6416
Grados de libertad del error: Se calcula restando los grados de libertad de la fuente
de variación de los grados de libertad total.
gle = 32 - 2 = 30
Cuadrados medios: Se calculan para la fuente de variación y para el error, dividiendo
respectivamente la suma de cuadrados por su grado de libertad.
CM muestras
= 4.3384 / 2
= 2.1692
CM error
= 18.6416 / 30 = 0.6214
Relación de variación: Se calcula dividiendo el cuadrado medio de las muestras por el
cuadrado medio del error.
Fm = 2.1692 / 0.6214 = 3.4909
Con los datos anteriormente calculados se estructura la siguiente tabla:
Tabla 22. Tabla de análisis de varianza para la densidad óptica de las cepas aisladas
Fuente de variación
Muestras
Error
Total
gl
2
30
32
SC
4.3384
18.6416
22.9801
CM
2.1692
0.6214
F
3.4909
El valor F calculado se compara con el valor de la tabla Puntos críticos para F (con 2 gl
para el numerador y 30 gl para el denominador). Si los valores calculados son mayores
que los de la tabla, se establecerá que existe diferencia significativa al 5%. En este
caso se ubican los valores en la tabla conociendo los grados de libertad de las
muestras (2) y los del error (30). Con esto se efectúa el siguiente comparativo.
Tabla 23. Comparativo en el análisis de varianza para la densidad óptica de las cepas
aisladas
Nivel de significancia
0.05
*
*
Tabla F
3.32
Comparativo Valor F calculado
<
Valores tomados de Wonnacott 1997 pag. 751.
3.49
Diferencia significativa
Sí
Una vez que se ha determinado que existe diferencia es necesario evaluar entre sí
cuales son diferentes. Aplicando la prueba de diferencia mínima significativa de Fisher
(DMS) se calcula un factor equivalente a la distancia mínima permisible que una
muestra (en nuestro caso un acepa) puede alejarse de la otra.
La distancia entre una cepa y otra se calcula restando el valor de la media de dos
cepas. Si esta diferencia es menor que el valor calculado de DMS entonces sí hay
diferencia significativa entre ambas cepas, con un nivel de significancia equivalente al
utilizado en el cálculo de DMS.
La fórmula de la diferencia mínima significativa es la siguiente:
DMS = t
2 * CMe
2 * 0. 6214
= 2.04
= 0.2067
n
11
donde:
t = valor t de Student 5% para dos colas, a los grados de libertad del error (tomado de
Wonnacott 1997 pag. 750.
t (tablas al 5%, con gl 30) = 2.04
Cme = Cuadrado medio del error.
n = total de lecturas efectuadas por cepa
El valor de la diferencia entre las medias de dos muestras, igual o mayor 0.2067, indica
que entre esas dos muestras hay diferencia significativa al 5%.
Para el cálculo de las muestras diferentes es necesario, primero, arreglar por orden
decreciente los valores de sus medias:
(A) Bifidobacterium
1.7230
(B) BAL 1
1.6635
(C) Lactobacillus acidophillus
0.9258
Determinando el rango de diferencia se obtiene:
A - C = 1.7230 - 0.9258 = 0.7972
>
0.2067
A - B = 1.7230 - 1.6635 = 0.0595
<
0.2067
B - C = 1.6635 - 0.9258 = 0.7377
>
0.2067
Las cepas de Bifidobacterium y BAL 1 presentan mayor crecimiento de manera
significativa frente al Lactobacillus acidophillus. Mientras que no hay diferencia
significativa entre el crecimiento del Bifidobacterium y BAL 1.
Para determinar si existen diferencias significativas en el pH de las tres cepas
analizadas se realizó un análisis de varianza siguiendo los pasos utilizados con los
resultados de la densidad óptica obteniéndose, los siguientes valores:
Factor de corrección:
831.7121
Suma de cuadrados:
0.2317
Grados de libertad:
3 -1 = 2
Suma de cuadrados, total:
7.3287
Grados de libertad total:
29
Suma de cuadrados del error: 7.0970
Grados de libertad del error:
29 - 2 = 27
Cuadrados medios:
CM muestras
= 0.1159
CM error
= 0.2629
Relación de variación: Se calcula dividiendo el cuadrado medio de las muestras por el
cuadrado medio del error.
Fm = 0.4408
Con los datos anteriormente calculados se estructura la siguiente tabla:
Tabla 24. Tabla de análisis de varianza para el pH de las cepas aisladas
Fuente de variación
Muestras
Error
Total
gl
2
27
29
SC
0.2317
7.0970
7.3287
CM
0.1159
0.2629
F
0.4408
Tabla 25. Comparativo en el análisis de varianza para el pH de las cepas aisladas
Nivel de
Tabla F * Comparativo
significancia
0.05
3.37
>
*
Valor F
calculado
0.4408
Diferencia
significativa
No
Valores tomados de Wonnacott 1997 pag. 751.
Como se observa, no hay diferencia significativa entre los valores de pH de las cepas
Bifidobacterium, BAL 1 y Lactobacillus acidophillus.
De igual forma se realizó un análisis de varianza para determinar si existen diferencias
significativas entre los valores obtenidos de acidez para cada cepa. El análisis presentó
un valor F de 0.1568 el cual es mucho menor a los valores presentados en las tablas de
F. Por lo tanto, no hay diferencias significativas al 5% entre los valores de acidez de las
cepas Bifidobacterium, BAL 1 y Lactobacillus acidophillus.
2.2
COMPORTAMIENTO DEL pH Y PORCENTAJE DE ACIDEZ
El comportamiento en el descenso del pH del cultivo de las cepas aisladas Lactobacillus
acidophillus, BAL 1 y Bifidobacterium es similar al presentado por el cultivo mixto
BIOFLORA ABY, a las 15 horas disminuye hasta 4.3 (Tabla 13 y Gráfica 7).
Tanto el pH como la acidez de las cepas aisladas se mantienen constantes durante las
tres primeras horas de crecimiento lo cual indica que durante estas horas no hay
producción notoria de ácido láctico a pesar de registrar crecimiento.
La mayor variación de pH se registra después de las 4 horas, ya que se observa un
descenso del pH a razón de 0.29/h para BAL 1, 0.32/h para el Bifidobacterium y 0.23/h
para Lactobacillus acidophillus .
El porcentaje de acidez del cultivo de BAL 1 aumentó de 0.94% a 2.31% en 15 horas,
en el cultivo de Bifidobacterium aumentó de 0.80% a 2.16% y en los Lactobacillus
acidophillus el cambio fue de 0.87% a 1.88%.
La mayor variación en el porcentaje de acidez (Anexo T) se registra ente las 8 y las 9
horas luego de haber inoculado los cultivos, ya que se observa un descenso en el
porcentaje de acidez a razón de 0.46/h para BAL 1, 0.29/h para Bifidobacterium y
0.34/h para Lactobacillus acidophillus.
Como se observa en las gráficas 7 y 8 las bacterias responsables en forma mayoritaria
sobre la producción de ácido láctico son BAL1 y Bifidobacterium, mientras que el cultivo
de Lactobacillus acidophillus lo hace en menor proporción. La cepa Bifidobactterium es
la mayor productora de ácido láctico, seguida por la cepa BAL 1 y por último la cepa de
Lactobacillus acidophillus.
2.3 PORCENTAJE DE SÓLIDOS TOTALES
El caldo MRS tiene un contenido inicial de sólidos solubles de 6.4 %, el consumo de
estos sólidos por parte de las bacterias ácido lácticas no se ve disminuido debido a la
producción de las diferentes sustancias producto del metabolismo de las BAL, como se
observa en el anexo U, los sólidos solubles permanecen al rededor del 6% y 6.7%. En
las tres cepas aisladas se observa la misma tendencia del cultivo mixto, al disminuir
desde 6.7% hasta 6.25%
3.
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS
Los metabolitos producidos en el desarrollo en aerobiosis de la mayoría de las BAL
conllevan a la formación de metabolitos del oxígeno, principalmente peróxido de
hidrógeno (H2O2), los cuales pueden tener un efecto antagónico contra otras bacterias.
Para descartar que los halos de inhibición formados fueran causados por estos
metabolitos, se decidió emplear como medio de cultivo el caldo MRS, el cual posee una
marcada actividad catalásica que evita la formación de los peróxidos.
Después de realizar las primeras evaluaciones de la presencia de bacteriocinas
utilizando la técnica de césped con sobrenadante de cultivo mixto obtenido a las 48
horas, se obtuvieron halos de inhibición de 1 y 1.5 mm, utilizando sobrenadante con pH
de 4 los cuales se presentan en la tabla 14. Estos resultados confirman los estudios de
Lopez G. y Chacón Z. en 1998 en donde analizaron la actividad antimicrobiana del
Lactobacillus acidophilus frente a Bacillus subtilis ATCC 60519, Pseudomonas
aeruginosa y Escherichia coli encontrando disminución en la tasa de crecimiento sobre
todas las cepas analizadas. Según los autores este efecto es causado por compuestos
tipo de bacteriocinas sin descartar que la actividad inhibitoria este asociada a ácidos
orgánicos.
Las bacteriocinas son metabolitos secundarios de la fermentación de bacteria ácido
lácticas presentes en concentraciones entre 60 y 740 ng/ml y se producen en mayor
proporción al final de la fase exponencial como se observa en las investigaciones de
Cintas L., Rodríguez J., Fernández M., Sletten K., Nes I., Hernández P. y Holo H. en
1995 al caracterizar la producción de Pediocina L50. Al evaluar el efecto inhibitorio de
los sobrenadantes obtenidos al las 12 y 14 horas y concentrados entre 8 y 13 veces, se
observa mayor inhibición a la encontrada en el sobrenadante sin concentrar y obtenido
al final de la fase estacionaria (Ver tablas 14 y 15). Estos resultados confirman que
cuando se concentra el sobrenadante 8 veces, el halo de inhibición aumenta entre
400% y si se logra concentrar hasta 13 veces se obtendrá un efecto inhibitorio de hasta
500% mayor al obtenido sin concentrar.
En la siguiente prueba se realizó la técnica del césped utilizando en los pozos
soluciones de ácido láctico en agua con pH entre 1 y 4.5. Como se observa en la tabla
16 el ácido láctico a los pH en los que se encuentran los sobrenadantes analizados en
la tabla 14, no es causante de inhibición ya que se observaron halos de máximo 0.5mm.
Esto confirma que los halos obtenidos con sobrenadantes obtenidos del final de la fase
logarítmica concentrados y sin neutralizar causan un efecto inhibitorio que no es
ocasionado por efecto del ácido láctico.
Para determinar el pH de estabilidad del sobrenadante con sustancias inhibitorias se
realizaron las cuatro pruebas siguientes. Como se observa en las tablas 17, 18, 19 y 20
el pH en el que se observan halos de inhibición esta entre 4 y 4.5. Cuando el
sobrenadante se neutraliza se pierde el efecto inhibitorio sin importar que el se realice
la fermentación a pH controlado (Barrefoot S., Chen I,Hughes T y Bodine A. 1994), en
ausencia de oxígeno (Gonzalez B. Arca P.,Mayo B. y Suarez J.,) o que el sobrenadante
utilizado sea obtenido de diferentes fases del crecimiento. Debido a este pH de
estabilidad, los sobrenadantes estudiados podrían ser utilizados como bioconservantes
en productoscuyo pH oscile entre 4 y 5 como vegetales y algunos productos de origen
animal.
Los sobrenadantes del cultivo mixto y los cultivos aislados son estables entre el rango
de temperatura entre 4 y 41°C. En las pruebas en las que se observó halo de inhibición
se utilizaron sobrenadantes tratados a 4°C durante 24 horas y se observó que el efecto
inhibitorio se conserva a la temperatura de fermentación (41°C). Siendo estable el
sobrenadante a temperaturas de 4°C se puede pensar en su utilización como
bioconservante en productos refrigerados e incluso en productos que puedan ser
conservados a temperatura ambiente.
Los anteriores resultados permiten afirmar que los sobrenadantes obtenidos de la
fermentación del cultivo mixto BIOFLORA ABY 424 y sus cultivos aislados, causan
inhibición sobre los microorganismos patógenos utilizados con la técnica de difusión en
agar. Este efecto es producido por sustancias llamadas BLIS (Sustancias similares a las
bacteriocinas) y no por el ácido láctico o peróxidos de hidrógeno.
CONCLUSIONES
•
Se evaluó la presencia de sustancias inhibitorias similares a las bacteriocinas
llamadas BLIS utilizando los sobrenadantes obtenidos de la fermentación del cultivo
mixto BIOFLORA ABY 424 y sus cultivos aislados, los cuales causaron inhibición
sobre los microorganismos patógenos utilizados con la técnica de difusión en agar.
•
Los halos de inhibición obtenidos con sobrenadantes de 12 horas de fermentación
concentrados y sin neutralizar causan un efecto inhibitorio que no es ocasionado por
el ácido láctico y que podría ser producido por sustancias inhibitorias similares a las
bacteriocinas llamadas BLIS en su sigla en inglés.
•
Se caracterizó el crecimiento del cultivo mixto determinando la curva de crecimiento,
el comportamiento del pH, porcentaje de acidez expresado como porcentaje de
ácido láctico, porcentaje de sólidos solubles y contenido de nitrógeno durante toda la
fermentación.
•
El cultivo mixto BIOFLORA ABY demostró un crecimiento acorde al presentado por
bacterias ácido lácticas en leche, tal como lo reporta el proveedor. El cultivo
presentó una fase de latencia de 4 horas, una interfase de 2 horas y el nicio de la
fase logarítmica después de las 4 horas.
•
Las técnicas de aislamiento e identificación sirvieron para observar el crecimiento de
las cepas de Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus delbrueckii, Bifidobacterium y
BAL 1 que conforman el cultivo mixto.
•
Se caracterizó el crecimiento de las cepas aisladas determinando el comportamiento
en el porcentaje de acidez expresado como porcentaje de ácido láctico, pH,
porcentaje de sólidos solubles y densidad óptica.
•
El crecimiento de las cepas aisladas Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus
delbrueckii, BAL 1 y Bifidobacterium, demostró que las bacterias responsables en
forma mayoritaria sobre la producción de ácido láctico son BAL1 y Bifidobacterium,
mientras que el cultivo de Lactobacillus acidophillus lo hace en menor proporción. La
cepa Bifidobactterium es la mayor productora de ácido láctico, seguida por la cepa
BAL 1 y por último la cepa de Lactobacillus acidophillus.
•
Al concentrar los sobrenadantes aumenta proporcionalmente el tamaño del halo de
inhibición lo que podría explicarse por una mayor concentración del agente
inhibitorio.
•
Cuando el sobrenadante se neutraliza, se pierde el efecto inhibitorio sin importar que
se realice la fermentación a pH controlado, en ausencia de oxígeno o que el
sobrenadante utilizado sea obtenido de diferentes fases del crecimiento, lo que
podría indicar que la utilidad del agente inhibitorio se encuentra relacionada con
productos cuyo pH se encuentre cercano a 4.
•
El efecto inhibitorio de los sobrenadantes analizados se mantiene a temperaturas
entre 4 y 41°C.
RECOMENDACIONES
•
Se recomienda para estudios posteriores buscar otros métodos de concentración
más efectivos como liofilización o ultra-centrifugación y evaluar sobrenadantes a pH
diferente de 7.
•
Evaluar el efecto inhibitorio de las BAL utilizando como microorganismos indicadores
bacterias con estructura molecular parecida a las bacterias ácido lácticas, ya que se
ha demostrado que su efecto inhibitorio es mayor.
•
Realizar resiembras de los microorganismos utilizados cada cinco días para evitar el
fenómeno de pleomorfismo y estrés que se da en cultivos viejos. Si se requiere
conservar por tiempos prolongados es conveniente adicionar al medio glicerol al
20% y mantener a temperaturas de -20°C.
•
Se recomienda buscar otra técnicas de conservación de las cepas de bacteria ácido
lácticas utilizando bajas temperaturas mediante la utilización de nitrógeno líquido
adicionando glicerol para evitar la formación de cristales.
•
Se recomienda hacer pruebas adicionales a las utilizadas por el sistema API 50 CHL
para lograr la identificación confiable del coco presente en el cultivo mixto
BIOFLORA ABY 424, el cual, según el proveedor es un Streptococcus salivarius
subsp. thermophilus.
•
Se recomienda para futuros estudios la purificación y análisis químico del agente de
inhibición utilizando técnicas electoforéticas para determinar su peso molecular por
espectrometría de masas
y la evaluación de su potencial como agente
bioconservante.
BIBLIOGRAFÍA
ADAMS M.y MOSS M. Microbiología de los Alimentos. Ed.Acribia S.A. Zaragoza
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Guía de Laboratorio de microbiología de la Universidad de la Sabana "Obtención y
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Guía de Laboratorio de microbiología de la Universidad de la Sabana "Esterilización,
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INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN.
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WONNACOTT T. y R., Introducción a la estadística.,5° Edición., Ed. LIMUSA S.A.,
México 1997. Pag 367
ANEXOS
A continuación se presentan los anexos nombrados a lo largo del texto.
ANEXO A.
FICHA TÉCNICA DEL CULTIVO MIXTO BIOFLORA ABY 424
Technical
Information
VIVOLAC CULTURES CORPORATION
3862 E. WASHINGTON ST., INDIANAPOLIS, IN 46201
PHONE (317) 359-9528 FAX (317) 356-8450
DRI⇒
⇒ SET
BIOFLORA
SERIE ABY 424
PREMIUM FREEZE-DRIED
LACTIC CULTURE
DESCRIPCIÓN
BIOFLORA ABY 424 C-859
PRESENTACIÓN
Cultivo liofilizado para la inoculación directa de leche o base para yogurt.
COMPOSICIÓN
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus
Lactobacillus acidophillus
Bifidobacterium
UNIDADES DISPONIBLES Se encuentran disponibles envases de 20LU, 100LU, 200LU, 500 y LU.
ENVASE
Sobres de aluminio trilaminado sellado térmicamente
CARACTERISTICAS DE CULTIVO
El cultivo BIOFLORA ABY 424 ha sido específicamente diseñado para la producción de yogurt espeso de
alta viscosidad, con acidez y sabor moderados con la adición de probióticos. Este cultivo permite una
post-acidificación mínima.
MODO DE EMPLEO:
1. Sacuda el sobre para juntar el cultivo en el fondo
2. Antes de abrir el sobre, desinfecte la parte superior con etanol al 70%
3. Abrir el sobre y adicionar asépticamente el cultivo a la leche o base de yogurt
4. Agitar la leche por al menos 25 minutos para asegurar que el cultivo se disuelve completamente en la
leche
CONDICIONES GENERALES DE FERMENTACIÓN
Temperatura
41°C
Rango de inoculación
Un sobre de 500LU en 500 litros de leche desgrasada reconstituida al 9% de
extracto seco, precalentada a 90-95°C por 30 minutos.
Tiempo
6 horas
pH final
4.5 ± 0.15
Nota: Estos valores corresponden a resultados obtenidos en pruebas estándar de laboratorio, que pueden cambiar
dependiendo de las condiciones específicas de cada caso. Tales como materias primas y tecnología empleada.
ANEXO B.
COMPOSICIÓN CALDO MRS
COMPOSICIÓN (g/l) Caldo MRS de
MERCK
PEPTONA DE CASEINA
10.00
EXTRACTO DE CARNE
8.00
EXTRACTO DE LEVADURA
4.00
D (+)GLUCOSA
20.00
HIDROGENOFOSFATO DIPOTÁSICO
2.00
TWEEN 80
1.00
HIDROGENOCITRATO DE AMÓNICO
2.00
ACETATO SÓDICO
5.00
SULFATO DE MAGNESIO
0.20
SULFATO DE MANGANESO
0.04
Preparación del caldo MRS:
Diluir 52g en un 1litro de agua destilada, agitar constantemente para solubilizar el
caldo en el agua, posteriormente se esteriliza el caldo en el autoclave durante 15
min a 121°C.
El pH final del caldo es 5.7
+
-
2.
ANEXO C.
COMPOSICIÓN AGAR MRS
COMPOSICIÓN (g/l) Agar MRS de
MERCK
PEPTONA DE CASEINA
10.00
EXTRACTO DE CARNE
8.00
EXTRACTO DE LEVADURA
4.00
D (+)GLUCOSA
20.00
HIDROGENOFOSFATO DIPOÁSICO
2.00
TWEEN 80
1.00
HIDROGENOCITRATO DE AMÓNICO
2.00
ACETATO SÓDICO
5.00
SULFATO DE MAGNESIO
0.20
SULFATO DE MANGANESO
.040
AGAR AGAR
14.00
Preparación del Agar MRS:
Diluir 66.2g en un 1litro de agua destilada, agitar constantemente para solubilizar el agar en el agua,
posteriormente se esteriliza la solución en autoclave durante 15 min a 121°C.
+
El pH final del agar es 7.3 - 0.1
ANEXO D.
COMPOSICIÓN CALDO MUELLER HINTON
COMPOSICIÓN (g/l) Caldo Mueller
Hinton de MERCK
EXTRACTO DE CARNE
3.00
HIDROLISADO ACIDO DE CASEINA
17.50
ALMIDON
1.50
Preparación del caldo Mueller Hinton:
Diluir 22g en un 1litro de agua destilada, agitar constantemente para solubilizar el caldo en el agua,
posteriormente se esteriliza la solución en autoclave durante 15 min a 121°C.
El pH final del caldo es 7.3
+
-
0.1
ANEXO E.
COMPOSICIÓN AGAR MUELLER HINTON
COMPOSICIÓN (g/l) Agar Mueller
Hinton de MERCK
EXTRACTO DE CARNE
2.00
HIDROLISADO ACIDO DE CASEINA
17.50
ALMIDON
1.50
AGAR AGAR
13.00
Preparación del Agar Mueller Hinton:
Diluir 34g en un 1litro de agua destilada, agitar constantemente para solubilizar el AGAR en el agua,
posteriormente se esteriliza la solución en autoclave durante 15 min a 121°C.
El pH final del agar es 7.4 +/- 0.2.
ANEXO F.
COMPOSICIÓN DEL MEDIO CHL
SUSPENSIÓN MÉDIUM (2 y 5 ml)
API 50 CHL MÉDIUM (10ml)
Agua desmineralizada
Polipeptona
10.00 g
Extracto de Levadura
5.00 g
Tween 80
1.00 ml
Fosfato Dipotasico
2.00 g
Acetato de Sodio 3 H2 O
5.00 g
Citrato Amónico
2.00 g
Sulfato de Magnesio 7H2O
0.20 g
Sulfato de Manganeso 4H2O
0.50 g
Púrpura de Bromocresol
0.17 g
Agua desmineralizada
1000 ml
ANEXO G.
COMPOSICIÓN DE LA G ALERÍA API 50CH
BANDA 0-9
Tubo/ Substrato
BANDA 10-19
Tubo/ Substrato
0 Control
10 Galactosa
1 Glicerol
11 Glucosa
2 Heritritol
12 Fructosa
3 D arabinosa
4 L arabinosa
5 Ribosa
6 D xilosa
7 L Xilosa
13 Mannosa
14 Sorbosa
15 RHA Mnosa
16 Dulcitol
17 Inocitol
BANDA 20-29
Tubo/ Substrato
20 α -Metil-DMannosido
21α- Metil D
Glucosido
22 N-Acetil
glucosamina
23 Amigdalina
24 Arbutina
25 Esculina
26 Salicina
27Celobiosa
BANDA 30-39
Tubo/ Substrato
8 Adonitol
18 Mannitol
28 Maltosa
38 Xilitol
9 βMetil – Dxilosido
19 sorbitol
29Lactosa
39 Gentiobiosa
BANDA40-49
Tubo/ Substrato
30 Melibiosa
40 D Turanosa
31 Saccarosa
41 D Lixosa
32 Trehalosa
42 D Tagatosa
33 Inulina
34 Melezitosa
35 Rafinosa
36 Almidon
37 Glicogeno
43 D Fucosa
44 L Fucosa
45 D Arabitol
46 L Arabitol
47 Gluconato
48 2-KetoGluconato
49 5-KetoGluconato
ANEXO H.
RESULTADOS OBTENIDOS CON LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE LA DESTILACIÓN
DEL SOBRENADANTE DEL CULTIVO MIXTO
Volumen
SolucionSulfato
deAmonio
Sulfato de
Amonio (gr)
0
4
8
12
16
20
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
VolHCl0,1012N
Contenido
Teorico N
0,00000
0,00848
0,01696
0,02544
0,03392
0,04240
1
0,00
6,00
12,00
17,50
24,45
29,50
2
0,00
6,25
12,00
17,75
23,50
29,60
3
0,00
6,00
11,95
17,65
23,55
29,50
VolPromHCL
Nitrogeno
Recuperado
%Recuperación
0,00
6,00
12,00
17,70
23,53
29,50
0,00000
0,00850
0,01700
0,02508
0,03333
0,04179
0,00%
100,24%
100,24%
98,57%
98,26%
98,57%
ANEXO I.
RESULTADOS OBTENIDOS CON LA CURVA DE CALIBRACION DIGESTIONDESTILACION-TITULACION DEL SOBRENADANTE DEL CULTIVO MIXTO
Contenido
Peso Urea1 (g) Experimental de
Nitrogeno 1(g)
0.0000
0.0413
0.1242
0.1543
0.1983
0.2387
0.2733
0.4365
0.00384
0.01932
0.05895
0.07114
0.09049
0.11234
0.12676
0.20288
Volumen1 HCL
(ml)
2.71
16.35
43.80
52.30
65.80
82.00
91.10
144.20
Contenido
Experimental de Peso Urea 2 (g)
Nitrogeno 2(g)
0.00390
0.02076
0.05560
0.07122
0.09029
0.10588
0.12685
0.20182
0.0000
0.0424
0.1204
0.1540
0.1986
0.2360
0.2730
0.4354
Volumen2
HCL (ml)
Peso
Promedio
Urea
Contenido
Teorico de
Nitrogeno (g)
Volumen
Promedio
HCL
2.75
17.40
41.50
52.40
65.70
78.10
91.20
143.50
0.0000
0.0419
0.1223
0.1542
0.1985
0.2374
0.2732
0.4360
0.00000
0.01952
0.05705
0.07190
0.09257
0.11071
0.12741
0.20335
2.73
16.88
42.65
52.35
65.75
80.05
91.15
143.85
ANEXO J.
RESULTADOS DETERMINACION DEL PERFIL BOQUIMICO DE LAS BACTERIAS
AISLADAS DEL CULTIVO MIXTO REALIZADO CON EL API
4 5
6
7
8
9
LARA RIB DXYLLXYL ADOMDX
4 0
0
0
0
0
1 0
0
0
0
0
1 0
0
0
0
0
0 0
0
0
0
0
0 33
0
0
0
0
75
60
80
90
10 11
GAL GLU
75 100
99 100
71 100
25 98
5 100
99
99
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
FRU MNE SBE RHA DUL INO MAN SOR MDM MDG NAG AMY ARB ESC SAL CELI MAL LAC MEL SAC TRE INU MLZ RAF AMD
100 96
0
0
0
0
4
0
0
0 79 67 67 99 85 96 83 73
4 100 77
1 0 25 21
100 99
0
0
0
0 40
0
0
0 99 20
1 99 40 80 99 99
1 100
1 20 0 80 80
100 64
0
0
0
0
1
0
0
0 75
1
1 36 29 71 75 64
1 100 43
1 0 21
9
98 25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 98
0
0
2
0 0
0
0
50 16
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 100
0 100 16
0 0
0
0
70
0
30 25
40 70 40 99 99
99 35
20 91
99
50
99 75
75 99 99 99 99
99 99
85 100
+
+ +
+
+
dentificación
89.2
98.7
Tipificidad
1
0.83
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ANEXO K.
CÓDIGOS EMPLEADOS PARA IDENTIFICAR LOS
DIFERENTES TRATAMIENTOS QUE SE REALIZARON A LOS
SOBRENADANTES DE LOS CULTIVOS MIXTOS Y PUROS.
PARÁMETROS
CODIGO
SOBRENADANTE
S
Cm
TIPO DE CULTIVO
TIEMPO DE FERMENTACIÓN
*CANTIDAD DE INOCULO
PRESENCIA O AUSENCIA DE
OXIGENO DURANTE LA
FERMENTACIÓN
pH FINAL SOBRENADANTE
pH DURANTE LA FERMENTACIÓN
CONCENTRACIÓN
SIGNIFICADO
Sobrenadante
Cultivo mixto BIOFLORA ABY
CpLa
Cepa pura Lactobacillus acidophillus
CpLd
Cepa pura Lactobacillus delbrueckii
Cp BAL 1
Cepa pura Bacterias Acidolácticas No. 1
Cp BAL 2
Cepa pura Bacterias Acidolácticas No. 2
7,8,12,14,
30,40,48
s
d
t
Número de horas de fermentación
Cantidad de inoculo sencillo (1 asa)
Cantidad de inoculo doble (2 asas)
Cantidad de inoculo triple (3 asas)
An
Anaerobiosis
A
N
SN
Co
Nco
C
Sc
Aerobiosis
Neutralizado
Sobrenadante sin neutralizar
pH controlado
pH sin controlar
Concentrado
Sin concentrar
*Sólo se emplea para indicar la cantidad de inóculo empleado en cepas puras y es una medida
cualitativa. Ejemplo: un sobrenadante obtenido de la fermentación del cultivo mixto BIOFLORA ABY
utilizado para realizar el césped, con un tiempo de fermentación de 12 horas, en aerobiosis, con pH
neutralizado al final de la fermentación, con pH sin controlar durante la fermentación y sin concentrar,
tendría como código: scm12anncosc.
ANEXO L.
CONTEO DE BACTERIAS CULTIVO MIXTO UTILIZANDO LA
TECNICA DEL NMP
DILUCIÓN
HORA
2
4
6
7
9
11
10
3
3
3
3
3
3
1
10
3
3
3
3
3
3
2
10
1
3
3
3
3
3
3
10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9
0
3
3
3
3
3
0
2
3
3
3
3
0
0
3
3
3
3
0
0
2
2
3
3
0
0
1
2
0
0
0
0
NMP
45,000.00
95,000.00
9,500,000.00
9,500,000.00
11,000,000.00
95,000,000.00
ANEXO M.
CONTEO EN CAMARA DE NEUBAUER CULTIVO MIXTO
Tiempo
(horas)
0.0
2.0
4.0
6.0
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
12.0
12.5
26.0
Dilución
0
0
0
0
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Promedio
conteo
0.160
0.188
0.200
0.213
0.126
0.158
0.190
0.210
0.236
0.263
0.288
0.310
0.338
0.463
0.525
0.490
N.M.O. / ml
6.40E+05
7.52E+05
8.00E+05
8.52E+05
5.04E+06
6.32E+06
7.60E+06
8.40E+06
9.45E+06
1.05E+07
1.15E+07
1.24E+07
1.35E+07
1.85E+07
2.10E+07
1.96E+07
ANEXO N.
ABSORBANCIA CULTIVO MIXTO λ = 600nm
TIEMPO
(horas)
0.0
2.0
4.0
5.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.6
11.5
12.0
12.5
26.0
Densidad
Óptica
0.2045
0.3869
0.5741
0.6780
0.9601
1.0017
1.1058
1.2316
1.3254
1.4358
1.5635
1.6843
1.8450
2.0057
2.1086
2.2067
2.2100
ANEXO Ñ.
pH DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO
Tiempo (h)
0.0
2.0
4.0
5.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.5
12.0
12.5
26.0
*
pH
5.77
5.73
5.59
5.44
5.03
4.88
4.77
4.61
4.50
4.49
4.40
4.25
4.20
4.18
4.14
4.08
3.72
pH - 0.01* pH + 0.01*
5.76
5.78
5.72
5.74
5.58
5.6
5.43
5.45
5.02
5.04
4.87
4.89
4.76
4.78
4.6
4.62
4.49
4.51
4.48
4.5
4.39
4.41
4.24
4.26
4.19
4.21
4.17
4.19
4.13
4.15
4.07
4.09
3.71
3.73
Es la precisión del potenciómetro Metrónh.
ANEXO O.
PORCENTAJE DE ACIDEZ DURANTE LA FERMENTACIÓN
CULTIVO MIXTO
Tiempo (h) % Acidez
0.0
2.0
4.0
5.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.5
12.0
12.5
26.0
0,54%
0,56%
0,61%
0,61%
0,84%
0,84%
0,89%
0,98%
1,06%
1,10%
1,18%
1,18%
1,18%
1,24%
1,37%
1,46%
2,05%
% Acidez - 1
gota*
0,50%
0,51%
0,56%
0,56%
0,79%
0,79%
0,84%
0,93%
1,01%
1,06%
1,13%
1,13%
1,13%
1,20%
1,32%
1,41%
2,00%
% Acidez + 1
gota*
0,59%
0,61%
0,65%
0,65%
0,89%
0,89%
0,93%
1,03%
1,10%
1,15%
1,23%
1,23%
1,23%
1,29%
1,41%
1,51%
2,10%
El error de experimentación durante la titulación es de más ó menos una gota, por esta razón se presenta
el rango de acidez.
ANEXO P.
PORCENTAJE DE SOLIDOS SOLUBLES TOTALES DURANTE
LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO
TIEMPO
TEMPERATURA
BRIX1
BRIX2
BRIX
BRIX 1 BRIX 2
(horas)
°C
CORREGIDOS CORREGIDOS Prom
0.0
6.70
6.70
15.00
6.40
6.40
6.40
2.0
6.70
6.65
18.00
6.57
6.52
6.55
4.0
6.65
6.60
20.00
6.65
6.60
6.63
6.0
6.60
6.75
22.00
6.73
6.88
6.81
6.5
6.50
6.50
22.00
6.63
6.63
6.63
7.0
6.40
6.60
22.00
6.53
6.73
6.63
7.5
6.40
6.60
22.00
6.53
6.73
6.63
8.0
6.40
6.50
22.00
6.53
6.63
6.58
8.5
6.40
6.40
21.00
6.47
6.47
6.47
9.0
6.50
6.50
21.00
6.57
6.57
6.57
9.5
6.50
6.50
20.05
6.57
6.55
6.56
10.0
6.60
6.60
20.00
6.60
6.60
6.60
11.0
6.60
6.75
19.00
6.54
6.69
6.61
11.5
6.40
6.50
20.00
6.40
6.50
6.45
12.0
6.40
6.30
21.00
6.47
6.37
6.42
12.5
6.60
6.40
21.00
6.67
6.47
6.57
27.5
6.40
6.30
19.00
6.46
6.24
6.35
29.5
6.20
6.25
20.05
6.27
6.25
6.26
31.0
6.25
6.25
20.00
6.25
6.25
6.25
ANEXO Q.
VARIACIÓN DEL PORCENTAJE DE NITRÓGENO DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL
CULTIVO MIXTO DE BAL
ml. de Peso de ml. de Peso de ml. de
HCl
muestra
HCl
muestra
HCl
HORA
0,0996 N
(g)
0,0996 N
(g)
0,0996 N
1
2
3
0.0
2.90
5.1848
1.30
5.1329
2.20
5.0
2.70
5.1694
2.20
5.1896
2.65
6.0
3.00
5.1279
2.70
5.2000
1.65
7.0
2.10
5.1616
2.15
5.0391
2.75
8.0
2.05
5.1572
2.15
5.1204
2.45
10.0
2.75
5.1625
2.00
5.0577
2.75
11.0
2.35
5.1095
2.00
5.1169
2.30
24.5
2.45
5.1224
2.55
5.1186
2.35
25.5
2.50
5.0565
2.45
5.1372
2.00
26.5
2.45
5.0255
2.30
5.1367
2.20
Peso de
% de
muestra
Nitrógeno
(g)
1
5.1000
0.0780%
5.1500
0.0728%
5.0873
0.0816%
5.1772
0.0567%
5.1657
0.0554%
5.1547
0.0743%
5.1090
0.0641%
5.1206
0.0667%
5.0364
0.0689%
5.1131
0.0680%
% de
Nitrógen
o
2
0.0353%
0.0591%
0.0724%
0.0595%
0.0585%
0.0551%
0.0545%
0.0695%
0.0665%
0.0624%
% de
Nitrógen
o
3
0.0601%
0.0717%
0.0452%
0.0741%
0.0661%
0.0744%
0.0628%
0.0640%
0.0554%
0.0600%
Promedi
o%
Nitrógen
o
0.0645%
0.0679%
0.0664%
0.0634%
0.0600%
0.0679%
0.0605%
0.0667%
0.0636%
0.0635%
+%EE
0.0628%
0.0661%
0.0646%
0.0617%
0.0584%
0.0661%
0.0588%
0.0649%
0.0619%
0.0617%
.- %EE
0.0662%
0.0697%
0.0682%
0.0651%
0.0617%
0.0698%
0.0621%
0.0685%
0.0653%
0.0652%
ANEXO R.
PARÁMETROS DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO MIXTO Y
VARIACIÓN DEL PH Y % DE ACIDEZ
Tiempo
(h)
pH
Delta pH
0.0
2.0
4.0
5.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.5
12.0
12.5
26.0
5,77
5,73
5,59
5,44
5,03
4,88
4,77
4,61
4,50
4,49
4,40
4,25
4,20
4,18
4,14
4,08
3,72
0,00
0,04
0,14
0,15
0,41
0,15
0,11
0,16
0,11
0,01
0,09
0,15
0,05
0,21
0,04
0,06
0,36
Densidad
óptica
600 nm
0.2045
0.3869
0.5741
0.6780
0.8207
1.2979
1.3703
1.4427
1.4933
1.5438
1.6141
1,6843
1,7245
2,0057
2,1086
2,2067
2,2067
% Acidez
0,54%
0,56%
0,61%
0,61%
0,84%
0,84%
0,89%
0,98%
1,06%
1,10%
1,18%
1,18%
1,18%
1,24%
1,37%
1,46%
2,05%
Delta % % Sólidos
Acidez Solubles
0,00%
0,02%
0,05%
0,00%
0,23%
0,00%
0,05%
0,09%
0,08%
0,04%
0,08%
0,00%
0,00%
0,06%
0,13%
0,09%
0,59%
6.40
6.55
6.63
6.63
6.63
6.63
6.63
6.51
6.47
6.57
6.56
6.60
6.60
6.35
6.42
6.57
6.35
ANEXO S.
DELTAS DE pH PARA LAS CEPAS AISLADAS
HORA
1
2
3
4
5
6
7
9
11
15
BAL1
pH
5.81
5.78
5.77
5.63
5.50
5.19
5.04
4.75
4.55
4.36
Delta de pH
0.03
0.01
0.14
0.13
0.31
0.15
0.29
0.20
0.19
Bifidobacterium
pH
5.81
5.77
5.74
5.50
5.28
4.96
4.87
4.69
4.60
4.52
Delta de pH
LACTOBACILLUS
ACIDOPHILUS
Delta de pH
0.04
0.03
0.24
0.22
0.32
0.09
0.18
0.09
0.08
pH
5.86
5.83
5.83
5.74
5.62
5.39
5.30
5.01
4.75
4.51
0.03
0.00
0.09
0.12
0.23
0.09
0.29
0.26
0.24
ANEXO T.
DELTAS DE PORCENTAJES DE ACIDEZ PARA LAS CEPAS AISLADAS
% ACIDEZ PROMEDIO
TIEMPO
(HORAS)
BAL1
0
1
2
3
5
6
7
8
9
11
15
0.94%
0.94%
0.95%
0.96%
0.99%
1.03%
1.11%
1.18%
1.64%
1.72%
2.31%
Delta de %
Acidez
0.0020%
0.0065%
0.0172%
0.0300%
0.0360%
0.0751%
0.0760%
0.4626%
0.0734%
0.5902%
LACTOBACILLUS
Bifidobacterium
LACTIS
0.80%
0.84%
0.87%
0.91%
0.97%
1.03%
1.20%
1.34%
1.64%
1.77%
2.16%
Delta de%
Acidez
0.041%
0.022%
0.044%
0.057%
0.061%
0.167%
0.149%
0.293%
0.133%
0.393%
LACTOBACILLUS
ACIDOPHILLUS
0.87%
0.90%
0.91%
0.94%
0.95%
1.05%
1.12%
1.12%
1.45%
1.65%
1.88%
Delta de%
Acidez
0.023%
0.014%
0.029%
0.014%
0.094%
0.074%
-0.005%
0.335%
0.196%
0.234%
ANEXO U.
PORCENTAJES DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES PARA LAS CEPAS AISLADAS
TIEMPO
(horas)
1
2
3
5
6
7
8
9
11
15
TEMPERATURA
°C
° BRIX
BAL 1
Bifidobacterium
6.70
6.70
6.45
6.75
6.70
6.60
6.30
6.45
6.40
6.40
6.70
6.70
6.70
6.70
6.75
6.50
6.20
6.30
6.40
6.50
Lactobacillus
acidophilus
6.80
7.00
6.60
6.80
6.90
6.70
6.60
6.70
6.70
6.25
15
18
20
22
22
26
29
28
27
27
° BRIX CORREGIDOS
BAL 1
Bifidobacterium
6.40
6.60
6.45
6.90
6.80
7.00
6.90
7.00
6.90
6.90
6.40
6.40
6.70
6.40
6.90
6.90
6.90
6.90
6.90
7.20
Lactobacillus
acidophilus
6.50
7.10
6.60
6.90
7.00
7.10
7.30
7.30
7.20
6.80
ANEXO V.
CORRECCIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DEL
PORCENTAJE DE SACAROSA
Tabla internacional de corrección por temperatura, 1936
T (°C)
0
5
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
0.50
0.46
0.42
0.37
0.33
0.27
0.22
0.17
0.12
0.06
0.54
0.49
0.45
0.40
0.35
0.29
0.24
0.18
0.13
0.06
21
22
23
24
25
0.06
0.13
0.19
0.26
0.33
0.07
0.13
0.20
0.27
0.35
PORCENTAJE DE SACAROSA
10
15
20
25
30
40
Restar del % de sacarosa determinado
0.58
0.61
0.64
0.66
0.68
0.72
0.53
0.55
0.58
.060
0.62
0.65
0.48
0.50
0.52
0.54
0.56
0.58
0.42
0.44
0.46
0.48
0.49
0.51
0.37
0.39
0.40
0.41
0.42
0.44
0.31
0.33
0.34
0.34
0.35
0.37
0.25
0.26
0.27
0.28
0.28
0.30
0.19
0.20
0.21
0.21
0.21
0.22
0.13
0.14
0.14
0.14
0.14
0.15
0.07
0.07
0.07
0.07
0.07
0.08
Sumar al % de sacarosa determinado
0.07
0.07
0.07
0.08
0.08
0.08
0.14
0.14
0.15
0.15
0.15
0.15
0.21
0.22
0.22
0.23
0.23
0.23
0.28
0.29
0.30
0.31
0.31
0.31
0.36
0.37
0.38
0.38
0.39
0.40
Fuente: Intern. Sugar J (1937).
50
60
70
0.74
0.67
0.60
0.53
0.45
0.38
0.30
0.23
0.15
0.08
0.76
0.69
0.61
0.54
0.46
0.39
0.31
0.23
0.16
0.08
0.79
0.71
0.63
0.55
0.48
0.40
0.32
0.24
0.16
0.08
0.08
0.16
0.24
0.31
0.40
0.08
0.16
0.24
0.32
0.40
0.08
0.16
0.24
0.32
0.40
ANEXO W.
GRÁFICA DE COMPARACIÓN ENTRE DENSIDAD ÓPTICA Y CURVA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO
MIXTO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO
2.25.E+07
2.5000
2.00.E+07
2.2500
2.0000
1.75.E+07
1.7500
1.5000
1.25.E+07
1.2500
1.00.E+07
1.0000
7.50.E+06
0.7500
5.00.E+06
0.5000
2.50.E+06
0.2500
0.00.E+00
0.0000
27.5
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
Tiempo (h)
Bacterias /ml
DO
17.5
20
22.5
25
DO
Bacterias/ml
1.50.E+07
ANEXO X.
PORCENTAJE DE ACIDEZ PARA EL CULTIVO MIXTO
PRUEBAS PRELIMINARES
Tiempo
(h)
Vol. 1
NAOH
Vol, 2
NAOH
Vol.
prom
NAOH
Acidez
%
0,0
2,0
4,0
5,0
6,0
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,5
12,0
12,5
26,0
0,65
0,70
0,80
1,30
1,30
1,35
1,50
1,80
1,90
2,00
2,50
2,40
2,65
3,20
3,40
3,60
4,35
0,65
0,75
0,80
1,25
1,25
1,35
1,55
1,80
1,95
2,10
2,50
2,40
2,70
3,20
3,30
3,50
4,20
0,65
0,73
0,80
1,28
1,28
1,35
1,53
1,80
1,93
2,05
2,50
2,40
2,68
3,20
3,35
3,55
4,28
0,2925
0,3263
0,3600
0,5738
0,5738
0,6075
0,6863
0,8100
0,8663
0,9225
1,1250
1,1800
1,2038
1,4400
1,5075
1,6230
1,9238
ANEXO Y.
pH CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES
Tiempo
(h)
0,0
2,0
4,0
5,0
6,0
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,5
12,0
12,5
26,0
pH1
6,64
6,53
6,35
5,53
5,46
5,27
5,10
4,92
4,76
4,65
4,56
4,48
4,35
4,12
4,09
4,02
3,78
pH2
6,63
6,53
6,35
5,52
5,46
5,26
5,10
4,91
4,75
4,64
4,55
4,48
4,35
4,11
4,09
4,02
3,77
pH prom
6,64
6,53
6,35
5,53
5,46
5,27
5,10
4,92
4,76
4,65
4,56
4,48
4,35
4,12
4,09
4,02
3,78
ANEXO Z.
PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES CULTIVO MIXTO
PRUEBAS PRELIMINARES
Tiempo
(h)
0,0
2,0
4,0
5,0
6,0
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,5
12,0
12,5
26,0
BRIX. 1
6,93
6,86
6,77
6,50
6,41
6,52
6,41
6,26
6,66
6,63
4,56
6,70
6,52
6,94
6,42
6,42
6,09
BRIX. 2
6,94
6,87
6,77
6,51
6,40
6,53
6,42
6,26
6,65
6,64
4,55
6,69
6,53
6,95
6,41
6,42
6,10
BRIX. PROM
6,94
6,87
6,77
6,51
6,41
6,53
6,42
6,26
6,66
6,64
4,56
6,70
6,53
6,95
6,42
6,42
6,10