Paloma SuarezPRRSMexicoDEF

Desarrollo de nuevas líneas
celulares permisivas a PRRSV, y
sus implicaciones próximas
Paloma Suárez, DVM, Ph.D
New Products Marketing
Madison, NJ
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Introducción
•  Primera descripción de la enfermedad a finales de los 80
(USA) y principios de los 90 (Europa) – “Enfermedad
misteriosa del cerdo”. Posteriormente se descubrió su
etiología vírica y se denominó Síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (PRRS)
•  Probablemente una de las enfermedades más devastadoras
del sector porcino. En un estudio reciente realizado en los
EE.UU los costes asociados a PRRS en ese país, se han
estimado en 530,6 millones de dólares*, o lo que es lo
mismo, entre 5,6 y 7,6 dólares por cada cerdo que se envía
al rastro
* Johnson, C et al. 2012. The impact of PRRS on the cost of Pig production. National Pork Board.
http://www.porknetwork.com/e-newsletters/pork-daily/The-impact-of-PRRS-on-the-cost-of-pig-production-169164786.html
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Introducción
•  Virus por primera vez aislado en 1991 (Europa – Lelystad
Virus) y 1992 (USA – VR-2332)
•  El aislamiento se realizó, inicialmente, en Macrófagos
Alveolares Porcinos (MAPs), ya que no era posible crecerlo
en líneas celulares establecidas
–  Necesidad de sacrificar lechones (los macrófagos no se
multiplican)
–  No uniformidad en el número de células obtenidas;
diferencias en títulos víricos
–  Contaminaciones frecuentes (flora del cerdo)
– Animales libres de la enfermedad
–  Uso en la producción comercial de vacunas limitado
(caro y difícil). Sólo vacunas muertas.
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Macrófagos Alveolares Porcinos
Fuente; Cinta Prieto, Universidad de Madrid
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En 1992, aparece la primera línea celular
que permitía crecer el virus
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MARC-145
Fuente; Cinta Prieto, Universidad de Madrid
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Características
•  Obtenida a partir de un clon susceptible de la línea MA-104,
una línea celular de riñón de mono verde africano.
Posteriormente se produjeron nuevos clones a partir de
misma línea celular dando origen a la línea MARC-145
•  En la actualidad, el crecimiento del virus PRRS en células de
simio, está protegido por patente en algunos países.
–  Permitido para uso en investigación
–  Use restringido para la producción de vacunas
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¿Por qué Pfizer investiga en PRRS?
•  Pfizer es una compañía líder en CRP
•  PRRS es una enfermedad muy interesante para nuestro
departamento de investigación y desarrollo
•  Distribución mundial de la enfermedad (aunque dos
tipos muy diferenciados)
•  Múltiples retos; enorme variabilidad genética y
antigénica
•  Con incremento en virulencia en varias regiones
•  Elevado impacto económico
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¿Por qué Pfizer investiga en PRRS?
•  Grupo de investigación en PRRS con más de 20 años
de experiencia propia y/o con colaboraciones
•  Avances generados en el conocimiento genético del
virus y de sus proteínas estructurales
•  Primer clon infeccioso de ADN complementario de
un virus PRRSV tipo 2
•  Primer uso del virus PRRSV como vector
•  Descubrimiento del receptor CD163 de PRRS
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PRRSV y Pfizer
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¿Qué es el receptor CD163?
•  El CD163 es una glicoproteína de membrana específica
que se expresa en la superficie de los macrófagos
•  CD163 está involucrado en el reconocimiento de varios
ligandos y patógenos como el virus de la Fiebre Porcina
Africana.
•  En el año 2007 nuestros científicos descubrieron que un
receptor, denominado CD163, estaba involucrado en la
penetración del PRRSV en las células
–  Anticuerpos monoclonales frente al CD163 bloqueaban la
entrada del virus
–  Transfección de células con el cDNA del receptor, conferían
susceptibilidad
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El CD163 hace que las células sean permisivas
•  Se realizaron librerías de cADN a partir de Macrófagos
Alveolares que se seleccionaron por su habilidad de hacer
que células no de simio fueran susceptibles al PRRSV.
•  Se identificó el CD163 como el receptor primario frente
al virus. La transfección transitoria del cDNA fue
necesaria y suficiente para hacer que diferentes líneas
celulares fueran permisivas a PRRSV.
•  Posteriormente hemos creado líneas celulares que de
modo continuo expresan el receptor CD163 en su
superficie, permitiendo la replicación del virus.
•  Dichas líneas proceden de diferentes especies, BHK21
(riñón de hamster), PK0809 (riñón porcino), y NLFK (riñón
felino).
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Implicaciones Futuras
Evidentemente, la más cercana es la generación de
nuevas vacunas
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Vacunación frente a PRRSV hoy
•  Existen tanto vacunas vivas como muertas
•  Ampliamente usadas, junto con otras estrategias
–  Vacunación en primerizas
–  Vacunación en cerdas
–  Vacunación en lechones
•  Han sido útiles, pero todavía no han controlado totalmente el
problema*
*Yoo, D. 2008. Development of stable cell lines permissive for PRRSV replication and production. National Pork Board. Research
Report. NPB 06-145. http://www.pork.org/ResearchDetail/603/Developmentofstablec.aspx
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Desafíos presentes en PRRSV
•  Alta tasa de mutación y variación genética
La inmunidad natural es limitada frente a cepas heterólogas
•  Mecanismos de evasión del sistema inmune
- El virus induce la producción temprana de Interleukina 10 – una
citoquina antiinflamatoria muy potente
- La producción de Interferón-α está suprimida en algunas cepas del
virus
- Producción tardía de interferón-γ
- Producción tardía de anticuerpos neutralizantes
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Diferente línea celular: diferentes propiedades
•  La atenuación es un proceso evolutivo
•  El virus acumula mutaciones que le permiten crecer de forma eficiente
en la línea celular
•  Al mismo tiempo pierde propiedades que son útiles para su
multiplicación en el cerdo
•  Las presiones selectivas son diferentes dependiendo de la
línea celular utilizada y, por ello, los virus vivos atenuados en
diferentes líneas celulares tienen propiedades diferentes
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Desarrollo actual
•  Estas líneas celulares permitirán el desarrollo de nuevas vacunas,
tanto muertas como vivas modificadas frente a PRRS y potencialmente
con nuevas propiedades
•  De hecho, ya hemos obtenido el virus tipo 2 Master para el desarrollo
de una vacuna (ya disponible en US) mediante el pase en células no
de simio como de riñón porcino, CD163+ PK y células de riñón de
hamster, CD163+ BHK que expresan el receptor CD163
Clonaje molecular
(clon de ADN complementario infectivo)
MAPs Células
PK-CD163
Células
PK-CD163
Células BHK-CD163
Virus
Master
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Desarrollo actual
A pesar de su paso en células BHK el virus de la vacuna de
Pfizer replica bien in vitro en MAPs y sus predecesores
perdieron genes que inhiben la liberación de ciertos
interferones por las células del hospedador
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Nuevas oportunidades en el futuro
El tener un clon infectivo de ADN complementario y una línea
susceptible permitirá en un futuro el alterar el genoma del
PRRSV y por lo tanto:
–  Identificar factores de virulencia y construir virus genéticamente
atenuados
–  El desarrollo de Vacunas DIVA
–  Utilizar el virus del PRRS como vector adicionando genes que
confieran protección frente a otras enfermedades del cerdo
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Muchas gracias por su atención
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