Jelvys Bermúdez Acosta - DSpace@UCLV

UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS
FACULTAD DE QUÍMICA-FARMACIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos a partir del
uso de un consorcio bacteriano alóctono en la zona costera de Punta
Majagua. Cienfuegos, Cuba.
Tesis presentada para optar por el grado académico de Master en Ciencias Ténicas.
Mención Ingeniería en Saneamiento Ambiental.
Autor:
Lic. Jelvys Bermúdez Acosta
Tutores:
Dr. Roberto Nuñez Moreira
Dr. Remigio Cortés Rodríduez
Consultante:
Dra. Edudalys Ortíz Guilarte
Santa Clara
Febrero de 2012
Exergo
EXERGO
«Llegará una época en la que una investigación diligente y prolongada sacará a la luz
cosas que hoy están ocultas. La vida de una sola persona, aunque estuviera toda ella
dedicada al cielo, sería insuficiente para investigar una materia tan vasta [...]. Por lo tanto
este conocimiento sólo se podrá desarrollar a lo largo de sucesivas edades. Llegará una
época en la que nuestros descendientes se asombrarán de que ignoramos cosas que para
ellos son tan claras... Muchos son los descubrimientos reservados para las épocas futuras,
cuando se haya borrado el recuerdo de nosotros. Nuestro universo sería una cosa muy
limitada si no ofreciera a cada época algo que investigar... La naturaleza no revela sus
misterios de una vez para siempre.»
Séneca. Cuestiones naturales, libro 7, siglo I.
I
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
A mis tutores: Dr. Roberto Núñez Moreira y Dr. Remigio Cortés Rodríguez.
Por sus sabios consejos, y valiosos aportes en la realización de este trabajo.
A la Dra. Eudalys Ortiz Guilarte
Por sus siempre oportunas ideas y aportes en este encargo.
A mis Colegas: José R. Poma, Yoelvis Castro y David Castro.
Por su amistad y por siempre contribuir con sus ideas y críticas constructivas.
A Alejandro García
Por su dedicación y ayuda incondicional
A todos los profesores de la Maestría de Ingeniería en Saneamiento Ambiental
Por su profesionalidad y por transmitirnos sus experiencias y conocimientos
A todos
Gracias, de veras Gracias…
II
Dedicatoria
DEDICATORIA
No podría faltar tal espacio para dedicar este trabajo a quienes han sido la razón de ser en
mi empeño y esfuerzo. Lo dedico a mi hijo, Luca, quién no solo me inspira, sino que me da
fuerzas y esperanza para alcanzar todas las metas propuestas. Lo dedico a mi esposa,
Isany, quien no solo es mi soporte emocional y espiritual, sino mi amiga y confidente. Lo
dedico a mis padres; a Isady y Jimmy; amigos y familiares. Lo dedico a todos los que de
una forma u otra me han apoyado en la conclusión de trabajo.
III
Resumen
RESUMEN
El propósito de esta investigación fue realizar el saneamiento ambiental de una zona
costera contaminada con hidrocarburos, localizada en la porción centro-norte de la Bahía
de Cienfuegos, Cuba. El tratamiento de los residuos petrolizados se realizó mediante la
técnica de bioaumentación con el uso del consorcio bacteriano BIOIL-FC, aplicándose un
diseño aleatorizado por bloques completos con un factor categórico. Se diseñó un área de
biorremediación de 115m X 75m donde posteriormente se dispusieron 479m3 de residual
mezclado con tierra fértil en proporción 1/3. Se aplicaron 76 640L de BIOIL-FC, producidos
en un biorreactor de 12 000L utilizando para su producción industrial un cultivo
semicontinuo con adiciones y extracciones de 7 000L cada 4h, hasta lograr el volumen final
de producción.
Se monitorearon las variables
microbiológicas, físico-químicas y
ecotoxicológicas antes del tratamiento y a los 45, 90 y 120 días posteriores a la aplicación
del bioproducto. Las poblaciones de bacterias degradadoras se incrementaron durante el
proceso de biorremediación (106cel·mL-1), llegando a predominar en el total de las
poblaciones de heterótrofas totales. Niveles que disminuyeron significativamente al final del
proceso (105cel·mL-1), relacionado con una reducción significativa de las concentraciones
de Hidrocarburos Totales del Petróleo (HTP). Del cual se obtuvieron remociones
superiores al 90% con una velocidad media de degradación de 245,0±35,7mg⋅(kg⋅h)-1. Para
las fracciones fundamentales del petróleo (SARA) se obtuvieron remociones superiores al
70%, con una velocidad media de degradación entre 107,8±11,8 y 233,7±86,6mg⋅(kg⋅h) -1.
Se obtuvieron niveles de HTP y SARA inferiores a los límites máximos permisibles
establecidos por
la norma SEMARNAT, (2003). Los ensayos ecotoxicológicos de
germinación y crecimiento para frijol y maíz demostraron una recuperación de las
características del suelo a los 120 días de tratamiento. Del análisis costo-beneficio se
obtuvo un VAN=$37 674,61; una TIR=60% y un PRD=2,4meses. Indicadores que
demostraron la factibilidad económica de la investigación.
IV
Índice
ÍNDICE
EXERGO ...................................................................................................................................... I
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................. II
DEDICATORIA ........................................................................................................................... III
RESUMEN ................................................................................................................................. IV
ÍNDICE ........................................................................................................................................ V
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1
1.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................ 6
1.1.
Generalidades sobre el petróleo y sus derivados ............................................................ 6
1.1.1.
Origen del petróleo. Características generales .......................................................... 6
1.1.2.
Composición química del petróleo ............................................................................ 6
1.1.2.1.
Parafinas volátiles (n-alcanos e isoprenoides volátiles) .......................................... 6
1.1.2.2.
Parafinas no volátiles (n-alcanos e isoprenoides) .................................................. 6
1.1.2.3.
Naftenos (cicloalcanos) ........................................................................................ 7
1.1.2.4.
Olefinas (alquenos) .............................................................................................. 7
1.1.2.5.
Hidrocarburos aromáticos..................................................................................... 7
1.1.2.5.1.
Hidrocarburos monoaromáticos ......................................................................... 7
1.1.2.5.2.
Hidrocarburos poliaromáticos ............................................................................ 7
1.1.2.6.
Resinas y asfaltenos ............................................................................................ 8
1.1.3.
Clasificación químico-física del petróleo ................................................................... 8
1.1.4.
Generalidades sobre la refinación del petróleo. Derivados ........................................ 9
1.2.
La contaminación de los suelos por petróleo y sus derivados........................................ 10
1.2.1.
Antecedentes de la contaminación por petróleo y sus derivados.............................. 10
1.2.2. Generalidades sobre las propiedades físico-químicas, estructurales y microbiológicas
de los suelos ...................................................................................................................... 13
1.2.2.1.
Estructura y composición del suelo ..................................................................... 14
1.2.2.2.
Fracciones minerales ......................................................................................... 14
1.2.2.3.
Materia orgánica ................................................................................................ 16
1.2.2.4.
Gases en el suelo .............................................................................................. 16
1.2.2.5.
Humedad en el suelo ......................................................................................... 17
1.2.2.6.
Microflora autóctona del suelo ............................................................................ 18
1.2.3.
Procesos naturales que ocurren durante los derrames de hidrocarburos en el suelo 19
1.2.4.
Efectos de la contaminación por hidrocarburos sobre los suelos.............................. 21
1.3.
Metodologías y técnicas más empleadas en la remediación de suelos contaminados con
hidrocarburos ......................................................................................................................... 22
1.3.1.
Tecnologías de remediación. Clasificación ............................................................. 22
1.3.1.1.
1.3.1.1.1.
Estratégia de remediación .................................................................................. 23
Destrucción o modificación de los contaminantes............................................. 23
V
Índice
1.3.1.1.2.
Extracción o separación del contaminante ....................................................... 23
1.3.1.1.3.
Aislamiento o inmovilización del contaminante ................................................. 23
1.3.1.2.
Lugar de realización del proceso de remediación ................................................ 24
1.3.1.3.
Tipo de tratamiento ............................................................................................ 24
1.4.
La biorremediación como método de tratamiento de suelos contaminados por
hidrocarburos ......................................................................................................................... 24
1.4.1.
Generalidades ....................................................................................................... 24
1.4.2.
Clasificación .......................................................................................................... 25
1.4.2.1.
Bioestimulación.................................................................................................. 25
1.4.2.2.
Bioaumentación ................................................................................................. 25
1.4.3.
Fundamentos bioquímicos de la biorremediación .................................................... 26
1.4.4.
Consorcios Bacterianos degradadores de hidrocarburos ......................................... 28
1.4.5.
Factores que condicionan la biodegradación de los hidrocarburos ........................... 29
1.4.5.1.
Temperatura ...................................................................................................... 29
1.4.5.2.
pH ..................................................................................................................... 29
1.4.5.3.
Oxígeno ............................................................................................................. 30
1.4.5.4.
Nutrientes .......................................................................................................... 30
1.4.5.5.
Humedad ........................................................................................................... 30
1.4.5.6.
Estructura, composición y disponibilidad del contaminante .................................. 31
1.4.6.
Polémica actual sobre el empleo de las técnicas de biorremediación ....................... 31
Conclusiones parciales ........................................................................................................... 32
2.
MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................... 34
2.1.
Breve descripción de la zona de estudio ...................................................................... 34
2.2.
Tratamiento de los residuos petrolizados ..................................................................... 34
2.2.1.
Diseño y preparación del área de biorremediación .................................................. 34
2.2.2.
Microorganismos empleados.................................................................................. 34
2.2.3.
Medios de cultivo................................................................................................... 34
2.2.4.
Proceso de fermentación ....................................................................................... 35
2.3.
Monitoreo y control del proceso de biorremediación ..................................................... 36
2.3.1.
Muestreo ............................................................................................................... 36
2.3.2.
Determinaciones analíticas .................................................................................... 37
2.3.2.1.
Análisis microbiológico ....................................................................................... 37
2.3.2.1.1.
Determinación de Microorganismos Heterótrofos Totales ................................. 37
2.3.2.1.2.
Determinación de Microorganismos Degradadores de Petróleo ........................ 37
2.3.2.1.3.
Absorbancia ................................................................................................... 37
2.3.2.1.4.
Número total de células................................................................................... 37
2.3.2.1.5.
Velocidad específica de crecimiento ................................................................ 37
2.3.2.2.
Análisis físico-químico ........................................................................................ 37
VI
Índice
3.
2.3.2.2.1.
Determinación de Hidrocarburos Totales del Petróleo ...................................... 37
2.3.2.2.2.
Determinación de Saturados, Aromáticos, Resinas y Asfaltenos ....................... 38
2.3.2.2.3.
Velocidad de degradación de hidrocarburos..................................................... 38
2.3.2.3.
Determinación del porciento de remoción de hidrocarburos ................................. 38
2.3.2.4.
Análisis Ecotoxicológicos .................................................................................... 38
2.3.2.4.1.
Ensayos de fitotoxicidad sobre la germinación en plantas terrestres. ................ 38
2.3.2.4.2.
Ensayos de fitotoxicidad sobre el crecimiento en plantas terrestres. ................. 38
2.4.
Tratamiento estadístico de los resultados ..................................................................... 38
2.5.
Análisis costo-beneficio ............................................................................................... 39
RESULTADOS Y DISCUCIÓN ........................................................................................... 41
3.1.
Diseño del área de manejo .......................................................................................... 41
3.2.
Obtención industrial de BIOIL-FC................................................................................. 42
3.2.1.
Fermentación a escala industrial ............................................................................ 42
3.2.2.
Aplicación del BIOIL-FC......................................................................................... 44
3.3.
Análisis microbiológico ................................................................................................ 45
3.4.
Análisis físico-químico ................................................................................................. 47
3.4.1.
Análisis de la concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo ......................... 47
3.4.2. Análisis de la concentración de las fracciones saturadas, aromáticas, resinas y
asfalténicas ........................................................................................................................ 51
3.5.
Análisis ecotoxicológico............................................................................................... 54
3.5.1.
Determinación de la fitotoxicidad sobre la germinación de semillas en frijol y maíz .. 54
3.5.2.
Ensayos de fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento en plantas terrestres........... 55
3.5.2.1.
Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de frijol ............... 55
3.5.2.2.
Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de maíz.............. 57
3.6.
Análisis costo-beneficio ............................................................................................... 58
CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 62
RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 64
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 65
ANEXOS ................................................................................................................................... 74
VII
Introducción
INTRODUCCIÓN
Una de las problemáticas ambientales en la industria petrolera está relacionada con el
tratamiento y disposición de los residuos generados en los procesos de extracción y
refinación del petróleo, que comprenden la disposición de lodos y aguas no reutilizados en
los procesos de perforación/extracción y lodos acumulados
combustible. Desechos
que contienen
aguas
en los depósitos de
oleosas, lodos
petrolizados,
altas
concentraciones sales (NaCl y Na2 CO 3 ) agregadas como densificantes y contaminantes
peligrosos como metales pesados e hidrocarburos poli aromáticos de carácter carcinógeno
siendo un residual peligroso con características especiales de manejo.
Por su parte, los derrames de crudo y sus derivados son otra fuente de contaminación con
resultados nefastos para el medio ambiente en general, siendo los efectos biológicos de
dichos productos petrolíferos, aunque de difícil predicción muy graves, al actuar a todos los
niveles de organización biológica, desde los componentes subcelulares hasta los niveles
superiores del ecosistema (Alexander, 1994).
Muchos trabajos publicados (Luque et al., 1998; Ercoli, 1999; Martínez and López, 2001;
Mendoza et al., 2001) demuestran que la presencia de hidrocarburos en el suelo modifica
sus características. Sus propiedades físicas se afectan al aglutinarse las partículas del
suelo, generando estructuras más gruesas que cubren la superficie y el espacio poroso
afectando la aireación. Como la película que cubre las partículas es hidrófoba también
disminuye la retención de agua, generando alteraciones del sustrato original y modificando
sus propiedades químicas y biológicas, que a su vez impiden o dificultan la implantación de
las especies vegetales, dejando suelos inutilizables durante años (Ayelén, 2008).
Teniendo en cuenta la magnitud de la contaminación por hidrocarburos y los efectos
nocivos que ocasiona, se hace necesario el establecimiento de un equilibrio entre el
desarrollo productivo y la protección del medio ambiente. Lo que conlleva al desarrollo de
tecnologías eficientes para el tratamiento de estos desechos, debiendo incluir
la
recuperación del valor energético de estos residuales y su reintroducción en los procesos
productivos; proponiendo a su vez metodologías y procedimientos que logren la total
degradación de los contaminantes presentes, y garanticen su disposición en espacios
ambientales sin representar riesgo alguno para los ecosistemas o cuerpos receptores.
1
Introducción
Son disimiles las tecnologías de tratamiento usadas en la actualidad. Dependiendo de su
uso en particular, además de los factores específicos del sitio y de las propiedades
fisicoquímicas del contaminante, de su disponibilidad, fiabilidad demostrada o proyectada,
de su estado de desarrollo (laboratorio, escala piloto o gran escala) y de su costo (Sellers,
1999).
Dichas tecnologías pueden clasificarse sobre la base de tres criterios fundamentales:
primero, en función de la estrategia de remediación, las cuales incluyen la destrucción o
modificación del contaminante, la extracción o separación y el aislamiento o inmovilización;
segundo, en función del lugar en que se realiza el proceso de remediación, clasificándose
en tecnologías “ex-situ” e “in-situ”; tercero, de acuerdo al tipo de tratamiento, en métodos
biológicos, fisicoquímicos y térmicos.
Dentro de las principales ventajas de los métodos biológicos está su efectividad en cuanto
a costos, son más benéficos para el medio ambiente y generalmente son destruidos la
totalidad de los contaminantes requiriendo un mínimo de tratamiento posterior; sin
embargo requieren de mayores tiempos de tratamiento y generalmente es necesario
verificar la toxicidad de intermediarios y productos. Por su parte, los métodos
fisicoquímicos también son factibles en cuanto a costos, pueden ejecutarse en períodos
relativamente cortos y el equipamiento necesario es accesible, no requiriendo de mucha
energía ni ingeniería; por el contrario los residuos generados por esta técnica deben
tratarse o disponerse, deviniendo en un incremento de los costos y necesidades de
permisologías, a su vez los fluidos de extracción pueden aumentar la movilidad de los
contaminantes, necesitándose sistemas de recuperación. Finalmente los métodos de
tratamiento térmico poseen tiempos cortos de limpieza pero tienen un incremento
considerable de sus costos en función de su alto consumo de energía, equipamiento y
mano de obra.
Las investigaciones relacionadas con la biorremediación surgen como una alternativa
eficiente para la recuperación de los ecosistemas impactados. Esta técnica aprovecha la
capacidad que tienen los microorganismos de crecer a partir de sustancias nocivas al
medio ambiente, de manera que la degradan hasta dióxido de carbono y agua, además,
permite tratar grandes volúmenes de contaminantes con un impacto ambiental mínimo, a
diferencia de otros procedimientos de descontaminación (Núñez, 2003).Entre las técnicas
más utilizadas en la biorremediación se encuentra el uso de los dispersantes (primera
2
Introducción
generación, en los años ’60 del pasado siglo), la segunda generación llamada
bioestimulación y a partir de los años ’80 la denominada bioaumentación basada en el uso
de microorganismos exógenos para acelerar el proceso de descontaminación(Núñez,
2003).
A partir de la década del ’70 comenzó el desarrollo de técnicas de biorremediación con
productos para estimular la biodegradación natural. Estos se basaban en la utilización de
tensoactivos emulgentes que facilitaran la oxidación de los compuestos del petróleo, pero
lejos de obtener resultados alentadores se incrementaba la contaminación del entorno con
estos productos (Bergueiro and Domínguez, 1996). Teniendo en cuenta las bajas
concentraciones de nitrógeno y fósforo en el ambiente marino y la baja frecuencia de
aparición
de
microorganismos
degradadores
de
petróleo
(10-6
bacterias
hidrocarbonoclastas/ml) (Bartha, 1986), una nueva generación de productos se desarrolló
desde mediados de los años ’80, mediante la técnica de bioestimulación llamados
biofertilizantes (Atlas, 1995; Lee and Tremblay, 1995), permitiendo enriquecer en nutrientes
la zona afectada por el derrame. Los productos de esta generación presentan una gran
variedad de composición y fueron ampliamente comercializados (Head, 1998). Estos
productos se utilizaron con resultados no satisfactorios durante la limpieza del derrame
ocasionado por el Supertanquero “Exxon Valdez” en Alaska (Arrejuría, 1994).
En la actualidad se han desarrollado otros productos que se basan en la técnica de
bioaumentación, o sea, en el aislamiento y selección de microorganismos marinos
hidrocarbonoclastas, que son liofilizados con nutrientes y añadidos en la zona afectada
después de la recogida mecánica del crudo. Los productos de esta generación también se
comercializan actualmente y entre ellos se encuentran los productos rusos “Putidoil” y
“Biotemposkreem” (Núñez, 2003).
La experiencias en el campo de la biorremediación en nuestro país, han estado basadas
fundamentalmente en el empleo de métodos de bioestimulación a escala de laboratorio,
reportándose en la literatura solo algunos casos aislados de experiencias
a nivel de
campo con resultados discretos. Por su parte, el empleo de técnicas de bioaumentación,
ha tenido mayor uso con resultados alentadores tanto a escala de laboratorio como en
campo. El uso del BIOIL-FC (Cultivo mixto de cinco bacterias hidrocarbonoclastas
degradadoras de hidrocarburos y productoras de sustancias tensoactivas, aisladas de la
bahía de Cárdenas) obtenido por el Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR) ha sido
3
Introducción
utilizado en el tratamiento satisfactorio de varios derrames de hidrocarburos en Bahías y
Playas de Cuba (Fonseca et al., 1994; Núñez, 2003). Técnica que asumimos como soporte
de nuestra investigación a partir de las ventajas antes expuestas
que el método
proporciona en sí, además de la disponibilidad de uso del producto patentado BIOIL-FC.
La industria petrolera contribuye de manera importante al desarrollo económico de Cuba,
razón por la cual, las actividades de exploración, extracción, refinación, transporte y
consumo de productos derivados del petróleo se incrementan cada día. Así, el manejo
inadecuado y los accidentes durante la transportación de crudo y sus derivados, han
generado un incremento de la contaminación por hidrocarburos a lo largo del territorio
nacional tanto en ecosistemas marinos como terrestres. De manera particular, en la
provincia de Cienfuegos, con una amplia proyección de desarrollo del polo petroquímico
desde el 2007 con la reapertura de la refinería “Camilo Cienfuegos”, se ha incrementado el
riesgo de contaminación de las aguas y zonas terrestres contiguas a su Bahía.
Uno de estos escenarios lo constituye la zona costera de “Punta Majagua”, península
localizada en la porción centro-norte de la Bahía, perteneciente al consejo popular Reina;
la cual además de haber constituido uno de los pilares del desarrollo industrial en
Cienfuegos, constituye el asentamiento de una de las comunidades pesqueras de mayor
tradición en la provincia, que ocupa un área de 0,89km2 con un fondo poblacional de 1 719
habitantes y posee una población con una tendencia al envejecimiento, y una metrópoli
residente bastante estable con pocos movimientos migratorios, consecuencia de un fuerte
arraigo a la cultura del lugar.
La severa contaminación ambiental en “Punta Majagua”, tuvo su origen en la presencia de
479m3 de fueloil y lodos de deposición de alta viscosidad con altos contenidos de
sedimento y agua; acumulados en los restos de cuatro tanques de almacenamiento y
derramados en la zona tras el abandono de las instalaciones de la Unidad Distribuidora de
Combustibles de Cienfuegos en 1998. Su presencia representaba un peligro potencial para
los habitantes de la zona, y de contaminación de las aguas de la bahía y el suelo,
causando la pérdida de la biodiversidad en dicha franja costera. Las características físico químicas del residual y la limitada capacidad de autodepuración natural entre otras causas,
propició la persistencia de dichas condiciones ambientales por más de 12 años.
4
Introducción
Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto se plantea el siguiente problema de
investigación:
La biodegradación natural de residuos petrolizados en procesos de autodepuración de
zonas contaminadas con hidrocarburos, está limitada por la baja capacidad degradativa de
los microorganismos autóctonos sobre los compuestos orgánicos del petróleo.
Hipótesis del trabajo
El uso del potencial metabólico del consorcio bacteriano BIOIL-FC, pudiera ser efectivo en
la degradación de residuos petrolizados sometidos a años de intemperismo, los cuales son
cuantificables por técnicas analíticas y factibles de evaluar su potencial ecotóxico.
Objetivo general
Realizar el saneamiento ambiental de la zona costera de “Punta Majagua” mediante la
técnica de biorremediación con el uso del consorcio bacteriano BIOIL-FC.
Objetivos específicos
1. Diseñar el área de manejo de residuos petrolizados y aplicar el consorcio bacteriano
BIOIL-FC.
2. Evaluar
la
eficiencia
del
proceso
de
biorremediación
mediante
variables
microbiológicas, físico-químicas y ecotoxicológicas del suelo antes, durante y después
del tratamiento.
3. Realizar el análisis costo-beneficio del saneamiento de la zona contaminada.
5
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1. Generalidades sobre el petróleo y sus derivados
1.1.1. Origen del petróleo. Características generales
El petróleo es esencialmente una mezcla compleja de hidrocarburos, y elementos no
hidrocarbonados tales como oxígeno, azufre, nitrógeno, vanadio, níquel y cromo,
generalmente presentes como componentes de moléculas complejas. Se origina a partir de
la materia orgánica depositada con los sedimentos, la cual es convertida por procesos
bacterianos y químicos durante el soterramiento en un polímero complejo o kerógeno, el
que contiene pequeñas cantidades de nitrógeno y oxígeno. Este proceso es acompañado
por remoción del agua y compactación de los sedimentos. El kerógeno a su vez, es
convertido en hidrocarburos por crackeamiento térmico a mayores profundidades y
temperaturas relativamente elevadas ( Welte, 1965; citado en Quiroga and Rodrigo,
1990).La composición elemental de un crudo está condicionada por la predominancia de
los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de 0-8% de S, y de 0-4% de
O, N y metales como el níquel y el vanadio (Clark and Brown, 1997).
1.1.2. Composición química del petróleo
1.1.2.1. Parafinas volátiles (n-alcanos e isoprenoides volátiles)
Representan hasta un 30% del crudo de petróleo. Son n-alcanos e isoprenoides (alcanos
ramificados) de un tamaño C 1 -C 10 (de 1 a 10 átomos de carbono). Es la fracción más
volátil del crudo y por lo tanto la más susceptible de pérdidas abióticas por volatilización. La
fracción gas natural contiene, principalmente C 1 -C 5 . Los isoprenoides volátiles, están
representados principalmente por el isobutano e isopentano. Los homólogos de mayor
peso molecular disminuyen su presencia en el crudo con el incremento del peso molecular.
Los isoprenoides volátiles también pueden llegar hasta C 10 (2,6 dimetil octano) (HoweGrant, 1996) .
1.1.2.2. Parafinas no volátiles (n-alcanos e isoprenoides)
Se definen como aquellos n-alcanos y aquellos isoprenoides entre C 11 -C 40 . Los
componentes entre C 11 -C 15 son de volatilidad intermedia. Los n-alcanos oscilan entre C 11 C 40 , aunque se han descrito cadenas más largas y pueden constituir entre el 15-20% de
crudos no degradados. Los isoprenoides varían de C 12 -C 22 y constituyen entre 1-2% del
crudo, llegando a 15% en crudos degradados.
6
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
El pristano y fitano se han utilizado como marcadores internos del grado de biodegradación
de un crudo, La bibliografía especializada sobre los rangos de los índices de Pr/nC 17 y
Fi/nC 18 cita que se consideran valores umbrales de biodegradación relaciones de 0,5 y 0,3
respectivamente (Lee and Levy, 1989; Wang et al., 1998; Ortíz, 2004)
1.1.2.3. Naftenos (cicloalcanos)
Esta familia está compuesta por las cicloparafinas o cicloalcanos. Los compuestos más
abundantes de esta familia son los ciclopentanos alquilados (fundamentalmente
metilados), que pueden llegar a representar un 31% del crudo. Los compuestos mono y
dicíclicos corresponden al 50-55% de esta fracción, los tricíclicos al 20% y los tetracíclicos
al 25%. Esta familia engloba a los hopanos, antes mencionados.
1.1.2.4. Olefinas (alquenos)
Los alquenos están poco presentes en el crudo de petróleo, encontrándose en
concentraciones traza. Adquieren importancia en los productos resultantes del refinado, ya
que se generan durante el proceso de cracking, existiendo hasta un 30% en gasolinas y un
1% en fueles.
1.1.2.5. Hidrocarburos aromáticos
El crudo de petróleo contiene una mezcla muy compleja de hidrocarburos aromáticos.
Compuestos por moléculas que contienen uno o varios anillos bencénicos en su estructura.
Así encontramos hidrocarburos monoaromáticos (un anillo bencénico), diaromáticos (dos
anillos bencénicos) y poliaromáticos (HAPs, con más de dos anillos bencénicos).
1.1.2.5.1. Hidrocarburos monoaromáticos
Conformado por el benceno y sus alquilados (monoalquilados como el tolueno y
dialquilados como los xilenos), formando la familia de los BTEX (benceno, tolueno,
etilbenceno y xileno) de gran importancia ambiental debido a su volatilidad y toxicidad
(Torres and Zuluaga, 2009).
1.1.2.5.2. Hidrocarburos poliaromáticos
Entre los hidrocarburos diaromáticos, encontramos el naftaleno y sus alquilados (mono, di,
tri y tetrametilnaftalenos). Constituyen la familia mayoritaria de hidrocarburos aromáticos
presentes en un crudo. Entre los hidrocarburos poliaromáticos de tres anillos, encontramos
el fenantreno, antraceno, fluoreno, y sus derivados alquilados. El fenantreno y los
metilfenantrenos, representan los componentes mayoritarios de los triaromáticos. Entre los
hidrocarburos poliaromáticos de más de tres anillos, encontramos el fluorantreno (tres
7
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
anillos bencénicos y uno no bencénico), pireno y criseno (cuatro anillos aromáticos), pireno
y benzo(a) pireno (cinco anillos aromáticos).
1.1.2.6. Resinas y asfaltenos
Se trata de mezclas complejas, integradas por núcleos policíclicos o naftenoaromáticos.
Contienen cadenas hidrocarbonadas con heteroátomos de oxígeno, nitrógeno y azufre
(componentes
NOS
del
petróleo)
y
a
veces
están
asociadas
con
pequeñas
concentraciones de metales como el vanadio y el níquel. Constituyen entre un 10% en
crudos poco degradados o ligeros, hasta un 60% en crudos muy degradados. Es la
fracción que presenta una mayor recalcitrancia de un crudo de petróleo. Se trata de
agregados de piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfóxidos, amidas, HAP, sulfuros,
ácidos nafténicos, ácidos grasos, metaloporfirinas y fenoles polihidratados. (Howe-Grant,
1996).
1.1.3. Clasificación químico-física del petróleo
Una de las clasificaciones más utilizadas se basa fundamentalmente en la concentración
de los cuatro componentes funcionales del petróleo citados anteriormente: Saturados,
Aromáticos, Resinas y Asfaltenos, (tabla 1).
Parafínica
75%(+)
Nafténica
--
Aromática
Asfáltica
Parafínico-Nafténica
Parafínico-Nafténico-Aromática
Nafténico-Aromática
Nafténico-Aromático-Asfáltica
Aromático-Asfáltica
Asfaltenos
Resinas
Aromáticos
CLASES
Naftenos
COMPOSICIÓN (%)
Parafinas
Tabla 1. Clasificación química del petróleo según su composición, (Mello et al., 1984;
citado en Quiroga and Rodrigo, 1990: p. 352).
-70%(+)
--
-50%(+)
-60-70% 20% (-)
Aproximadamente igual %
-35%(+) 35%(+)
-25%(+) 25%(+)
--35%(+)
-60% (+)
--
---
--25%(+)
35%(+)
8
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
Otro de los criterios de clasificación usados en la industria petrolera, está en función de su
densidad API. Básicamente creada para clasificar líquidos menos densos que el agua en
una escala relacionada con la gravedad específica, y se calcula de acuerdo a la expresión:
La tabla 2 muestra los tipos de hidrocarburos de acuerdo a dicha clasificación:
Tabla 2. Clasificación del petróleo según su densidad, (API, 2008; citado en Melaine, 2009:
p.23)
Petróleo Crudo
Densidad (g/cm3)
Densidad. Grados API
Extra Pesado
>1
<10
Pesado
Mediano
Ligero
Súper Ligero
1-0,92
0,92-0,87
0,87-0,83
<0,83
10-22,3
22,3-31,1
31,1-39
>39
1.1.4. Generalidades sobre la refinación del petróleo. Derivados
El conocimiento de las características de los derivados del petróleo y las generalidades de
su obtención en los procesos de refinación del crudo, es importante para comprender la
naturaleza química de sus derivados que potencialmente pueden contaminar el medio
ambiente. En la refinación de un crudo la destilación tiene como finalidad eliminar el color
y olor, así como también, los compuestos del azufre. Se destila a temperaturas crecientes
obteniendo cuatro fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios
(querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vacío
obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras, parafinas y bitumes
asfálticos (alquitranes).
Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción asfalténica
(altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles,
querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables
que los coques o alquitranes residuales (Viñaz, 2005).
Así pues, la composición química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se
han obtenido como productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intervalos de
9
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
temperatura (tabla 3). La obtención de gasolina es menos directa que la de los fueles y
gasóleos, ya que en una primera fase se obtiene por destilación del crudo entre 20-180ºC.
Esto implica una composición de n-alcanos más ligera (C 6 -C 11 ) que los fueles y gasóleos
(C 10 -C 25 ). En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: n-butano,
isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetilhexanos,
trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y
dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).
Tabla 3. Fracciones obtenidas durante la destilación de un crudo de petróleo.
% de Salida
Rango de ebullición (ºC)
Átomos de Carbono
2
<30
1-5
15-20
5-20
10-40
30-200
200-300
300-400
5-12
12-15
15-25
Residuos
400 (+)
25(+)
Productos
Hidrocarburos
Ligeros
Gasolinas, Naftas
Queroseno
Gas-oíl
Lubricantes,
Alquitrán
Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fracción intermedia de destilación en el
proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullición entre 185-345ºC,
encontrando compuestos de 10 a 25 átomos de carbono, siendo los más abundantes los
C 15 -C 17 . Su composición es de un 30% en parafinas (n-alcanos e isoprenoides), 45% de
naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En concreto a nivel de compuestos
aromáticos encontramos alquibencenos, y más abundantemente, el naftaleno y sus
alquilados. También se ha encontrado, en cantidades menores, el fenantreno y el fluoreno.
No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de
ebullición son más elevados que el intervalo utilizado en la destilación de fracciones
intermedias (Viñaz, 2005).
1.2. La contaminación de los suelos por petróleo y sus derivados
1.2.1. Antecedentes de la contaminación por petróleo y sus derivados
El problema de la contaminación por petróleo y sus derivados en ambientes terrestres y
marinos, ha recibido gran atención en los últimos años y sobre todo en los aspectos del
destino y los efectos tóxicos del petróleo derramado. Los accidentes de contaminación
tanto en tierra como en cuerpos de agua resultan inevitables en la industria petrolera,
10
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
debido a los grandes volúmenes de hidrocarburos que se manejan. Siendo así, los
derrames pueden provenir de dos fuentes fundamentales: terrestres (ruptura de ductos y
depósitos de almacenamiento, transportación ferroviaria y por carreteras, manejo
inadecuado de lodos de acumulación y cortes de perforación entre otras causas), y
marítimas (operaciones de limpieza, carga, descarga, y colisiones de buques tanqueros y
supertanqueros así como la ruptura de ductos submarinos y malas operaciones en
plataformas de extracción mar adentro entre otras fuentes).
La mayoría de los grandes desastres o accidentes petroleros
que han ocasionado
derrames de impacto global, han sido ampliamente reportados y analizados en medios
internacionales, asimismo, algunos de los derrames de mayor connotación fueron los del
Torrey Canyon que vertió entre 586 000 y 872 000 barriles (80 000-119 000t) de petróleo
frente a las costas de Cornualles, Inglaterra, en 1967 y el Exxon Valdez, que vertió 240 000
barriles (30 000t) en Prince William Sound, Alaska, en marzo de 1989, produciendo en el
plazo de una semana, una marea negra de 6 700km2, que puso en peligro la vida silvestre
y las pesquerías de toda el área. Por su parte entre las mayores mareas negras
registradas hasta el momento estuvo la del petrolero Amoco Cádiz frente a las costas
francesas en 1978 con 1 635 000 barriles de crudo (223 000t); otro derrame de gran escala
fue el producido en el campo de Nowruz, Golfo Pérsico, en 1983 con 1 906 000 barriles
(260 000t) de crudo.
La zona marino-costera mexicana del Golfo de México es una de las mayores cuencas de
hidrocarburos con una producción superior a las 400 000t/d. Sujeta a un intenso tráfico de
buques petroleros que movilizan más de 5 000 000 de barriles diarios y donde se vierte al
mar cerca de 7 000 0000 de barriles al año por el lavado de sus tanques que ejerce una
presión ambiental en los principales ríos, lagunas costeras y estuarios de la zona (Botello
et al., 1997). Dentro de los accidentes reportados de mayor impacto ambiental en el área
está la producida por el pozo petrolífero Ixtoc I de Pemex en 1979, entre 3 328 000 y 3 518
000 barriles de crudo (454 000-480 000t ), (Núñez, 2003) y 32 años más tarde el 22 de
abril de 2010 el derrame producido por la explosión de la plataforma Deepwater Horizon,
de la empresa British Petroleum (BP), donde fueron vertidos al mar más de 4 900 000
barriles de petróleo crudo (Dávalos, 2010), considerado hoy como el mayor desastre
petrolero la historia
11
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
La región del Caribe por su parte, sufre un daño considerable debido a vertimientos
sistemáticos de hidrocarburos, según datos estimados, el 90% de las cargas
contaminantes por petróleo que ingresan en las aguas costeras de la región están
relacionadas con fuentes industriales, señalándose las refinerías
y las plantas
petroquímicas, pequeños derrames y especialmente la descarga de aguas de lavado de
tanques en los supertanqueros que son transportados por las corrientes oceánicas, para
terminar como agregados de alquitrán en playas y arrecifes coralinos. Uno de los
vertimientos mayor escala global totalizó unos 872 000 barriles (119 000t) debido a la
colisión de dos petroleros, el Aegean Captain y el Atlantic Empress, cerca de Trinidad y
Tobago en 1979 (Núñez, 2003).
Los anales de la industria del petróleo en Cuba por su parte,
registran ejemplos
fehacientes de la contaminación por petróleo y sus derivados. Por citar algunos ejemplos
en 1992 se reportó el vertimiento accidental de 100t de petróleo crudo en la Bahía de
Cienfuegos, tras la varadura de la nave inglesa B/T Aida ; en 1998 en la Bahía de
Matanzas se derramaron más de 500t de petróleo Varadero (11 API ), provocado por la
colisión de los buques Bravo y Sharadar ; en el mismo año el desmantelamiento de las
instalaciones de la base de combustibles de la Unidad Distribuidora de Cienfuegos, produjo
la acumulación de 479 m3 de lodos petrolizados, los que contaminaron 70 000 m2 de suelo
y parte del litoral costero. El recalo de 120t de diesel marino en playa Jibacóa, al norte de
la provincia La Habana, se produjo por la limpieza de sentinas de un barco desconocido en
el 2000, provocando la contaminación de 500m de costas y la acumulación de diesel en
300m de la playa antes mencionada. En el 2002 por su parte, producto de la avería de un
tramo del oleoducto Felton-Nicaro en la provincia de Holguín, se contaminaron con más de
300t de crudo cubano (11 API), 6km de costa, de las cuales 1km fue de costa rocosa,
1,5km de playa y el resto de mangle costero e interior. Uno de los derrames de mayor
envergadura en el territorio nacional ocurrió en septiembre de 2008 producto de la avería
de un sector del oleoducto Puerto Escondido-Supertanqueros en las cercanías del rio
Bacunayagua, localizado en los límites de la Provincia de La Habana y Matanzas, en el
cual fueron vertidos al medio más de 800 t de petróleo crudo que contaminó 172 700m2 de
estuario y ensenada del rio Bacunayagua, y 3,610 km de distancia, comprendidos entre
afluente, río, playa y franja costera (Núñez et al., 2008). A su vez el 24 de Marzo de 2010
en Arroyo la Bomba, provincia de Cienfuegos, tras el descarrilamiento de tres carros
12
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
cisternas en el tramo refinería Camilo Cienfuegos-Planta Fertilizantes, se derramaron
121m3 de fueloil y 46m3 de diesel, contaminando más de 20 000m2 de suelo, y lagunas
naturales, además de 5km de río hasta su desembocadura en la bahía (Bermúdez et al.,
2011).
Los derrames accidentales no son la única fuente de peligro de contaminación sino que la
acumulación de pasivos ambientales constituye también un problema ambiental latente en
la industria cubana del petróleo, asimismo, la refinería Camilo Cienfuegos de Cienfuegos
acumula más de 30 000m3 de lodos petrolizados en confinamiento temporal; por su parte
en la base de Supertanqueros de Matanzas se confinan hoy, sin alternativas de tratamiento
más de 5000m3 de lodos petrolizados producto de la limpieza de tanques (Castro and
Bermúdez, 2011), otras empresas como la refinería Ñico López en La Habana, Cabaiguan
en Santi Spíritus, la Empresa Puerto Moa en Holguín, la Empresa Comercializadora de
Combustibles de Villa Clara entre otras, reportan hoy volúmenes considerables de residuos
petrolizados confinados potencialmente contaminantes del medio ambiente.
1.2.2. Generalidades
sobre
las
propiedades
físico-químicas,
estructurales
y
microbiológicas de los suelos
El suelo se define como la parte superior de la corteza terrestre, y se trata de un sistema
formado por componentes minerales (meteorización de las rocas), componentes orgánicos
(humus y derivados, biomasa viva y muerta), gas (aire en el espacio existente en los
poros), y agua envolviendo partículas y el espacio capilar. Constituye la Interfaz entre la
tierra, el aire y el agua, lo que le confiere la capacidad de desempeñar tanto funciones
naturales como de uso antropogénico (Viñaz, 2005). Así, Los suelos proporcionan soporte
físico y nutrientes para el crecimiento de las plantas y los microorganismos. Existe una
gran variedad de microorganismos (bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoos)
que casi siempre están presentes en ellos, aunque las densidades de población de las
mismas varían ampliamente. La superficie de los suelos constituye el lugar donde se
producen la mayoría de las reacciones bioquímicas pertenecientes al ciclo de la materia
orgánica, el nitrógeno y otros minerales, a la meteorización de las rocas y a la toma de
nutrientes por parte de las plantas (Alexander, 1991; citado en Viña, 2005).
Las propiedades físico-químicas de los suelos influyen en gran manera sobre la aireación,
la disponibilidad de nutrientes, la retención de agua y por lo tanto, sobre la actividad
biológica. Las propiedades más importantes de las que engloban estos grupos son el
13
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
tamaño de partícula, la textura, la porosidad, la humedad, estado de aireación,
composición química, fracción de arcilla, capacidad de intercambio de cationes y fracción
orgánica. El tamaño de partícula afecta a la química de la superficie de los suelos y al
tamaño de los poros. La cantidad de poros depende de la textura, estructura y contenido
de materia orgánica del suelo.
1.2.2.1. Estructura y composición del suelo
Según las proporciones de arenas, limos, arcillas y materia orgánica, principalmente
humus y derivados, existe una gran variedad de tipos diferentes de suelos. Los
componentes minerales y la materia orgánica se distribuyen en el espacio generando una
estructura porosa. Los poros pueden contener agua o aire, de manera que existen tres
fases: sólida, líquida y gaseosa. El agua contenida en los poros del suelo contiene sales
minerales y nutrientes y es el medio en el cual se puede desarrollar la actividad metabólica
de los microorganismos que lo colonizan. El contenido en agua de un suelo puede oscilar
enormemente, afectando dicha actividad.
Básicamente, la matriz de un suelo está compuesta por cinco componentes principales:
Minerales (50% del volumen total), aire y agua (del 25 al 50% del volumen), organismos
vivos (1% de volumen) y materia orgánica (de 3 a 6% del volumen).
1.2.2.2. Fracciones minerales
El mineral predominante en un suelo es el dióxido de silicio (SiO 2 ). Igualmente se
encuentran en abundancia el aluminio y el hierro, mientras que el calcio, magnesio,
potasio, titanio, manganeso, nitrógeno, azufre, sodio y fósforo están presentes en menor
cuantía (Alexander, 1991). La composición química varía de un suelo a otro y, en un
mismo suelo, a diferentes profundidades. Los microorganismos obtienen parte de los
nutrientes que necesitan de la fracción mineral del suelo, siendo dichos nutrientes
nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, azufre, hierro, calcio, manganeso, zinc, cobre y
molibdeno. Sin embargo los microorganismos pueden disponer con facilidad únicamente
de una pequeña parte de estos minerales, convirtiéndolos más en una provisión de lento
empleo, que en una fuente de rápido uso.
Los suelos se clasifican según el tamaño de sus partículas, teniendo en cuenta tres
componentes principales: Arcilla (Pasa por un tamiz de 0,002mm), Limo (Queda retenido
en el tamiz de 0,002mm pero pasa a través del tamiz de 0,05mm) y Arena (Queda retenida
en el tamiz de 0,05mm aunque pasa a través del de 2mm), (Torres and Zuluaga, 2009).
14
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
El área específica (área/volumen) de los diferentes tipos de partículas afecta directamente
las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo (tabla 4). La arcilla constituye el
tipo de partícula que mayor efecto produce sobre las propiedades de un suelo,
principalmente debido a la alta actividad superficial que la caracteriza. La mayor parte de
sus partículas son de naturaleza coloidal, tienen una carga superficial negativa y de forma
plana; además, son buenos absorbentes de agua, iones y gases. Las partículas de mayor
tamaño, como la arena, no tienen el mismo nivel de actividad superficial. Los principales
efectos asociados a las partículas de arena están relacionados con el tamaño del poro del
suelo y, por tanto, con el movimiento del aire y el agua a través del mismo (las arenas no
afectan en gran medida a las propiedades químicas y biológicas del suelo).
La presencia en un suelo de superficies que absorban con gran intensidad determinadas
clases de compuestos puede reducir la disponibilidad de compuestos orgánicos para la
biodegradabilidad. También afecta la disponibilidad de nutrientes, la capacidad de
intercambio de cationes en el suelo de los minerales arcillosos (NH 4+, K+, Na+ , Ca 2+, Mg2+)
y los compuestos orgánicos que constan de zonas con carga eléctrica superficial negativa.
El amonio, por ejemplo, que tiene carga positiva, pasa a estar disponible en menor grado
para su uso directo por plantas y microorganismos y queda retenido en el suelo más
tiempo que los nitratos, oxidándose y pasando a tener carga negativa.
Tabla 4. Clasificación de las partículas de un suelo ( Millar et al., 1958; citado en Torres and
Zuluaga, 2009: p. 9)
Tipo de partícula
Diámetro (mm)
Área específica (m2/kg)
Arena
Gravilla
Arena gruesa
Arena media
Arena fina
Arena muy fina
Limo
Arcilla
-1,0-2,0
0,5-1,0
0,25-0,5
0,1-0,25
0,05-0,1
0,002-0,05
0,002
-1,1
2,3
4,5
9,1
22,7
45,4
1130,0
15
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
1.2.2.3. Materia orgánica
La fracción orgánica del suelo está compuesta por residuos de plantas y animales, células
microbianas y productos resultantes del metabolismo microbiano, comúnmente llamado
humus. El humus es materia orgánica que ha sufrido varias degradaciones y
transformaciones. Está compuesto en su mayor parte por sustancias polimerizadas:
compuestos aromáticos, polisacáridos aminoácidos, polímeros del ácido urónico y
compuestos que contienen fósforo (Alexander, 1991; citado en Viña, 2005). Mucha de la
materia orgánica de un suelo, en particular el humus, es ligeramente soluble únicamente
en agua y de alguna forma resistente a la biodegradación. El material húmico tiene
propiedades coloidales y una carga neta negativa; por lo tanto, la importancia que tiene en
el proceso de formación de complejos organometálicos es considerable.
1.2.2.4. Gases en el suelo
Existe una relación directa entre las cantidades de agua y aire contenidas en un volumen
de suelo, ya que el espacio de poros que no ocupe el gas lo ocupa el agua. Los principales
gases que conforman un suelo son, en esencia, los mismos que se encuentran en la
atmósfera terrestre. El aire de la atmósfera está compuesto, aproximadamente, por un
78,08% de nitrógeno, un 20,94% de oxígeno, un 0,035% de dióxido de carbono y un 0,93%
de gases inertes como el argón y el neón. Sin embargo, las concentraciones relativas de
dichos gases en el suelo, específicamente del O 2 y del CO 2 , dependen de la aireación del
mismo y de la actividad microbiana en todo el perfil. En un suelo con buena aireación la
concentración de O 2 puede oscilar entre el 18% y 20% y la concentración del CO 2 puede
alcanzar valores tan altos como del 1% al 2%. En suelos con menor aireación (como los
suelos arcillosos con un alto contenido en agua y una actividad microbiana considerable) el
CO 2 puede llegar a presentarse en una concentración del 10% (Torres and Zuluaga, 2009).
En cuanto a la actividad microbiana, el nivel de aireación de un suelo no es tan importante
como las condiciones en el interior de los agregados. Aquellos suelos que en general están
bien aireados pueden tener zonas microscópicas anaerobias en el interior de las
formaciones de agregados, las cuales constituyen una explicación relativa a la presencia
de bacterias anaerobias, tales como los clostridium, en las capas superiores de un suelo
(Eweis et al., 1999).Las bacterias aerobias al mismo tiempo que colonizan zonas
microscópicas, consumen todo el oxígeno allí almacenado, dando lugar a las condiciones
que las bacterias anaerobias necesitan para desarrollarse y sobrevivir. Se calcula que la
16
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
transición de condiciones aerobias a anaerobias tiene lugar para valores de la
concentración de oxígeno inferiores al 1%; al mismo tiempo se cree que manteniendo una
aireación adecuada del suelo, el porcentaje del espacio de los poros ocupado por aire no
disminuiría por debajo de un 10% (Paul and Clark, 1989; citado en Torres and Zuluaga,
2009).
1.2.2.5. Humedad en el suelo
Para darse una idea general de la importancia que tiene el agua para el suelo es necesario
resaltar que junto con sus sales disueltas, forma la llamada solución del suelo; ésta es
esencial para abastecer de nutrimentos a las plantas que en él se desarrollan. La humedad
del suelo influye significativamente en la actividad biológica, puesto que un suministro
adecuado de agua es esencial para el crecimiento y la estabilidad microbiana. Un suelo
con una humedad demasiado baja da lugar a zonas secas y a una disminución en la
actividad microbiana; sin embargo, demasiada humedad inhibe el intercambio de gases y
el movimiento de oxígeno a través del suelo y deriva en la aparición de zonas anaerobias,
lo cual daría lugar a la eliminación de las bacterias aerobias y el aumento de la presencia
de anaerobios o anaerobios facultativos (Torres and Zuluaga, 2009). El agua que se
encuentra en un suelo se clasifica en tres tipos:
Gravitacional: Es el agua que está disponible para los microorganismos y las raíces de las
plantas. Ésta juega un papel importante en el transporte de contaminantes y otras
materias.
Capilar: Es el agua que está contenida en los poros, también está disponible para los
microorganismos del suelo.
Osmótica: Es el agua que está retenida por las partículas de arcilla y el humus y, opuesto a
los otros dos tipos de agua, no es de fácil alcance para los microorganismos y las raíces de
las plantas.
El contenido de agua en un suelo, en peso o volumen, es función de la presión de succión
o, como también se le conoce, el potencial de la matriz. Como concepto, el potencial de la
matriz constituye una medida de la tenacidad con la que es retenida el agua en los poros o
en la matriz de un suelo. Principalmente el agua es retenida en los poros por efecto capilar
y por adsorción. En la práctica, el potencial de la matriz es una medida de la succión
necesaria para que un determinado volumen de suelo contenga una cierta cantidad de
agua. La relación entre el potencial de la matriz y la humedad del suelo se representa
17
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
gráficamente mediante la curva característica de la humedad de un suelo, la cual es única
para cada tipo de suelo. Según los diferentes tipos de suelo, cuanto mayor sea el
contenido de arcilla de un suelo, mayor será su capacidad de retener agua y la variación
de la pendiente de la curva característica suelo-agua será más gradual (Eweis et al., 1999).
En la bibliografía la presión de succión puede expresarse en bares (bar) y algunas veces
en atmósferas (atm) o en mega pascales (MPa), pero en el laboratorio normalmente se
expresa en centímetros de succión de agua. La altura de la columna de agua se traduce
como medida de presión mediante la ecuación:
Donde:
: Presión (kg/ms2)
Densidad del agua (kg/m3)
Constante gravitacional (9,81m/s2 h)
Altura de la columna de agua (m)
Los tres tipos de agua anteriormente mencionados, pueden ser eliminados de la matriz de
un suelo si se aumenta la presión de succión. Se estima (tabla 5), que la actividad
microbiana óptima se obtiene para las humedades correspondientes a 0,5bar de presión
de succión (Paul and Clark, 1989; citado en Torres and Zuluaga, 2009). A presiones de
succión menores el suelo tiene demasiada humedad y puede encharcarse, mientras que
en presiones mayores el suelo está demasiado seco.
Tabla 5. Presión de succión necesaria para eliminar agua en el suelo (Torres and Zuluaga,
2009: p. 15).
Tipo de agua
Gravitacional
Capilar
Osmótica
Presión de suelo necesaria
para eliminar toda el agua
(m)
0-3
3-150
150-1 500
(bar)
0-0,3
0,3-15
15-150
1.2.2.6. Microflora autóctona del suelo
La red de poros formada como resultado de la asociación de las partículas minerales
(arenas, limos y arcillas) y la materia orgánica, provee una gran variedad de tamaños y
espacios, lo que condiciona el tipo y la diversidad de las poblaciones microbianas
existentes (Sessitsch et al., 2001; citado en Viñas, 2005). En términos generales se
18
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
encuentran en el orden de 106-109 bacterias cultivables por gramo de suelo, mientras que
los hongos se encuentran en dos órdenes de magnitud menos como unidades formadoras
de colonias, pero representan una parte importante de la biomasa del suelo (Alexander,
1997; Atlas and Bartha, 1997). Sin embargo, la estructura de la población microbiana en
los microhábitats (poros) del suelo, aún sigue siendo poco conocida (Sessitsch et al., 2001;
citado en Viñas, 2005), y además se estima que tan solo entre 0,1-1% de los
microorganismos son cultivables. La organización estructural de las partículas del suelo,
confiere una heterogeneidad espacial para los microorganismos, que se caracteriza por la
presencia de diferentes sustratos, nutrientes, concentraciones de oxígeno, contenido de
agua líquida, así como de un pH variable (Ladd et al., 1996; citado en Viñas, 2005). Este
hecho implica que en un suelo se puedan encontrar una gran variedad de poblaciones
microbianas con capacidades metabólicas distintas, condicionadas también por la
biodisponibilidad de las distintas fuentes de carbono y energía, que a su vez está
condicionada por las características físico-químicas propias de cada suelo (Kästner, 2000).
1.2.3. Procesos naturales que ocurren durante los derrames de hidrocarburos en el
suelo
Luego de producirse un derrame de petróleo se producen
una serie de cambios
progresivos de las propiedades físico-químicas del hidrocarburo en cuestión, atribuibles al
proceso de intemperización, el cual incluye parámetros tales como: evaporación,
fotooxidación, y biodegradación. La intemperización es la pérdida de ciertos componentes
del petróleo a través de una serie de procesos naturales que comienzan una vez que
ocurre el derrame y continúan indefinidamente.
La existencia de tres fases en el suelo, así como la gran diversidad de materiales que
pueden constituirlo, lo convierten en un compartimiento ambiental muy complejo. La
distribución de los contaminantes orgánicos se encuentra condicionada por estas
características, pudiéndose encontrar adsorbidos sobre el particulado o materia orgánica
(mayoritariamente aquellos compuestos de elevada hidrofobicidad como los HAPs y los
aceites minerales), en disolución, o en fase de vapor (Mackay and Betts, 1991; Means et
al., 1980; Weissenfels et al., 1992). Los contaminantes orgánicos que se encuentran en la
superficie de suelo pueden sufrir evaporación, disolución, dispersión, fotooxidación y
emulsificación. De este modo en el conjunto del suelo, los contaminantes orgánicos
pueden ser transformados fisicoquímicamente o sufrir biodegradación (Bossert and Bartha,
19
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
1984). Además los productos de oxidación parcial procedentes de los compuestos
orgánicos (como los HAPs y otros hidrocarburos) pueden ser movilizados en la fase
acuosa (son más polares), pudiendo ser transportados hasta otros suelos o ambientes
acuosos (Bossert and Bartha, 1984).
Las características que determinan el comportamiento de los hidrocarburos en el ambiente
son la densidad, presión de vapor, coeficiente de partición agua/suelo, polaridad (McBride,
1994), electronegatividad, hidrofobicidad (característica química que condiciona otros
parámetros
específicos
como
la
movilidad
y
estabilidad
química,
acumulación,
bioacumulación y sorción química), y solubilidad en agua. La alta solubilidad de un
compuesto químico promueve su mayor movilidad, teniendo menor probabilidad de ser
acumulativo, bioacumulativo, volátil y persistente. Como compuesto químico altamente
soluble es propenso a ser biodegradado y metabolizado por los microorganismos, el
contenido de materia orgánica del suelo es importante en la adsorción de los
contaminantes orgánicos (Ney, 1990; citado en Ortínez et al., 2003).
De acuerdo a su solubilidad, los compuestos químicos se pueden clasificar en los
siguientes rangos: baja solubilidad (< 10ppm); solubilidad media (entre 10 y 1 000ppm) y
alta solubilidad (> 1 000ppm).
El coeficiente de distribución agua/suelo de contaminantes no polares es fuertemente
dependiente del contenido de materia orgánica del suelo o alternativamente del contenido
de carbón orgánico del suelo (Chiou et al., 1998; citado en Ortínez et al., 2003), expresado
por la siguiente relación:
.
Donde:
Koc: Coeficiente de partición en suelo.
Kd: Coeficiente de distribución agua/suelo.
foc: Contenido de carbón orgánico del suelo.
La tabla 6, representa el destino de los contaminantes orgánicos en el ambiente en función
de su coeficiente de distribución en suelo y solubilidad en el agua:
20
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
Tabla 6. Relación de compuestos orgánicos y su destino en el ambiente (Ney, 1990; citado
en Ortínez et al., 2003: p. 38).
Suelo
Adsorción
Movilidad
Acumulación
Bioacumulación
Contaminación a la
cadena alimenticia
Solubilidad
Persistencia
Disipación
N: Insignificante.
Koc>10 000
S<10ppm
Sí
Koc: 1 000-10 000
S: 10-1000ppm
Otra vía
Koc<1 000
S> 1 000ppm
N
N
Sí
Sí
Otra vía
Otra vía
Otra vía
Sí
N
N
Sí
Otra vía
N
N
Sí
Sí
Otra vía
Otra vía
Otra vía
Sí
N
Sí
El comportamiento de los hidrocarburos (en función de las características fisicoquímicas
antes mencionadas) depende además de las características del medio como son la unidad
del suelo, permeabilidad, estructura, tamaño de las partículas, contenido de humedad y de
materia orgánica, así como la profundidad del manto freático; factores climatológicos como
la temperatura y la precipitación pluvial. Todas las variables en su conjunto definen el
tamaño y la distribución tridimensional del frente de contaminación en una zona específica.
1.2.4. Efectos de la contaminación por hidrocarburos sobre los suelos
De manera general, la contaminación por hidrocarburos en el suelo tiene un efecto
importante sobre sus propiedades físico-químicas, pudiendo retardar o impedir el
crecimiento de la flora microbiana y la vegetación existente sobre el área contaminada.
Cuando los hidrocarburos cubren la superficie del suelo, interrumpen la interacción
electrostática entre la superficie de las partículas del suelo y el agua, reduciendo su
capacidad de retención de agua. Durante los periodos de sequía, la cantidad de humedad
retenida en el suelo puede no ser suficiente para satisfacer la demanda de la vegetación,
produciendo resequedad y muerte de la vegetación (Adams et al., 2006; Zavala et al.,
2005) y la flora microbiana, la cual requiere condiciones mínimas de humedad (20%) para
su crecimiento y desarrollo. Relacionado a este problema está la repelencia al agua, en
ciertos suelos sobre todo arenosos que han sufrido algún periodo largo de sequía o
quema, se desarrolla una lámina delgada de hidrocarburos meteorizados que reduce la
21
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
capacidad del suelo a humectarse después de un periodo de estiaje (Roy and McGill,
2000). Por su parte dicha película de hidrocarburos reduce la transferencia de oxígeno
suelo-atmósfera, así, el rápido consumo de oxigeno por los microorganismos en la
oxidación de la materia orgánica y las propias fracciones de hidrocarburo, provocan la
aparición de condiciones de anaerobiosis, eliminando consecuentemente las poblaciones
de microorganismos aerobios en el suelo.
Por otra parte, muchos nutrientes de importancia para las plantas y microorganismos son
catiónicos, tales como el NH 4 +, K+, y Ca2+. Estos nutrientes catiónicos son retenidos en el
suelo, aún en áreas con precipitaciones altas, debido a la interacción electrostática de las
partículas de suelo con carga negativa (Porta et al., 1999). Cuando los hidrocarburos, poco
polares y sin carga, cubren esta superficie, se interrumpe la interacción entre las partículas
del suelo y los cationes, reduciéndose la capacidad del suelo para retenerlos.
Otra propiedad importante que se ve afectada por la presencia de hidrocarburos es la
compactación, al ocurrir un derrame de petróleo en un suelo mineral inmediatamente
disminuye su densidad aparente debido al incremento de carbono orgánico (Zavala et al.,
2005). Después de algunos meses los hidrocarburos residuales, sobre todo los muy
meteorizados, reducen la capacidad del suelo de volver a su situación natural luego de una
compresión temporal, asociada al carácter parcialmente oxidado de los hidrocarburos
residuales, y a que su estructura química presenta "terminales pegajosas", que
incrementan su viscosidad y adherencia. Martínez and López (2001) reportaron una
reducción del 87% de la porosidad en un suelo agrícola, correspondiente al cambio
inducido por la contaminación con aceites.
Finalmente, la presencia de aguas de producción o formaciones geológicas (domos
salinos), pueden alterar la conductividad eléctrica, la relación de adsorción de Na y a veces
el pH del suelo debido a las altas concentraciones de sales disueltas.
1.3. Metodologías y técnicas más empleadas en la remediación de suelos
contaminados con hidrocarburos
1.3.1. Tecnologías de remediación. Clasificación
El término “tecnología de tratamiento” implica cualquier operación unitaria o serie de
operaciones unitarias que altere la composición de una sustancia peligrosa o contaminante
a través de acciones químicas, físicas o biológicas de manera que reduzcan la toxicidad,
movilidad o volumen del material contaminado (EPA, 2001).
22
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
Las tecnologías de remediación pueden clasificarse de diferentes maneras, en base a los
siguientes principios: estrategia de remediación; lugar en que se realiza el proceso de
remediación y tipo de tratamiento. Es importante mencionar que cada una de estas
clasificaciones
proporciona
información
diferente
acerca
de
las
tecnologías
de
remediación. A continuación se describen con más detalle las clasificaciones anteriores
(Deuren et al., 2000; Seller, 1999).
1.3.1.1. Estratégia de remediación
Son tres estrategias básicas que pueden usarse separadas o en conjunto,para remediar la
mayoría de los sitios contaminados:
1.3.1.1.1. Destrucción o modificación de los contaminantes
Alteración de la estructura química del contaminante. Dentro de ellos se pueden citar el
empleo de la incineración, en la cual se somete el suelo o matriz contaminada a
temperaturas cercanas a los 10000C lográndose la destrucción total de contaminante; y la
biorremediación en la cual se logra la destrucción parcial o total de los contaminantes
mediante un conjunto de técnicas o prácticas basadas en el uso de organismos vivos,
dentro del mismo se destacan el uso de plantas (Fitorremediación) y el empleo de
bacterias, hongos y otros microorganismos (Biopilas, Bioestimulación, Bioaumentación,
Land Farming, entre otros).
1.3.1.1.2. Extracción o separación del contaminante
Aprovecha las propiedades físico-químicas del contaminante, tales como volatilidad,
solubilidad y carga eléctrica. Dentro de ellos destacan la desorción térmica, en la cual se
somete el suelo o matriz contaminada a temperaturas más bajas (250-5500C) para
conseguir la desorción en vez de la destrucción del contaminante; el lavado químico donde
se aprovecha la solubilidad de los componentes del contaminante, tanto en solventes
orgánicos, como en agua; la aireación o arrastre gaseoso, el cual consiste en hacer pasar
una corriente de aire o vapor a través del suelo o matriz contaminada, favoreciendo la
volatilización de los componentes de bajo peso molecular; y la separación mecánica a
partir del uso de la fuerza centrífuga para separar la matriz del contaminante, entre otros.
1.3.1.1.3. Aislamiento o inmovilización del contaminante
Los contaminantes son estabilizados, solidificados o contenidos con el uso de métodos
físico-químicos. Dentro de esta estrategia se agrupan técnicas tales como la vitrificación,
que consiste en someter el suelo o la matriz a altas temperaturas (1 600-2 300°C)
23
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
consiguiendo su vitrificación, con lo que se llegan a fundir los materiales del suelo,
produciéndose una masa vítrea similar a la obsidiana; y el confinamiento o aislamiento del
suelo o matriz contaminada del ambiente natural de origen (sellado y encapsulado).
La selección de cada una de las estrategias explicitadas en el punto anterior o su
combinación, dependen básicamente del lugar donde se ejecute el tratamiento en sí, o sea
de la capacidad de aplicación de la misma en el área contaminada o en áreas confinadas y
preparadas para tales fines.
1.3.1.2. Lugar de realización del proceso de remediación
En general se distinguen dos tipos de tecnologías:
“in-situ”: Son las aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los
contaminantes son removidos del suelo contaminado sin necesidad de excavar el sitio. Es
decir, se realizan en el mismo sito donde se encuentra la contaminación.
“ex-situ”. Requiere de excavación, dragado o cualquier otro proceso para remover el suelo
contaminado antes de su tratamiento, puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera
de él (off site).
1.3.1.3. Tipo de tratamiento
Esta clasificación se basa en el principio de la tecnología de remediación y se divide en
tres tipos de tratamiento: tratamiento biológico o biorremediación (uso del potencial
metabólico de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar, transformar o
remover los contaminantes a productos metabólicos); tratamiento físico-químico (uso de
las propiedades físicas y/o químicas del contaminante o del medio para destruir, separar o
contener la contaminación); y tratamiento térmico (uso de calor para incrementar la
volatilización
(separación),
quemar,
descomponer
y/o
fundir
(inmovilización)
los
contaminantes en un suelo).
1.4. La biorremediación como método de tratamiento de suelos contaminados por
hidrocarburos
1.4.1. Generalidades
La capacidad metabólica de las poblaciones microbianas, frente a los contaminantes
presentes en un suelo, es el fundamento sobre el que se sustenta la tecnología de
biorremediación (Alexander, 1999). Generalmente, en un suelo con contaminación
recurrente o con episodios previos de contaminación, las poblaciones microbianas
autóctonas se habrán seleccionado en favor de la metabolización del contaminante, el cual
24
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
puede ser transformado con mayor rapidez que la materia orgánica húmica del suelo
(Kästner,
2000).
Numerosos
microorganismos
poseen
la
capacidad
de
utilizar
hidrocarburos como única fuente de carbono y se encuentran ampliamente distribuidos en
la naturaleza. Estos se encuentran sin embargo en bajas concentraciones en áreas no
contaminadas y se incrementan en ambientes sometidos a impactos crónicos de petróleo
(Núñez, 2003). Por este motivo, en emplazamientos previamente contaminados, la
bioestimulación de la población microbiana auctóctona, puede acelerar el proceso de
biodegradación de los contaminantes, siempre y cuando los compuestos no sean de gran
recalcitrancia (Alexander, 1999). Únicamente en aquellos casos de contaminación puntual
o de compuestos de gran recalcitrancia, puede ser necesaria la inoculación de poblaciones
alóctonas, procedentes de cultivos de laboratorio con capacidades degradativas
especializadas para posibilitar la degradación de los contaminantes existentes. Sin
embargo, a menudo la falta de adaptación de las poblaciones exógenas, puede poner en
peligro su supervivencia (Dejonghe et al., 2001; Kästner, 2000). Por lo tanto, antes de
iniciar cualquier estudio de biorremediación, es esencial conocer si la población microbiana
existente en el suelo es potencialmente degradadora de los contaminantes presentes y es
suficiente para llevar a cabo el proceso de biodegradación en un tiempo razonable (Wrenn
and Venosa, 1996).
1.4.2. Clasificación
La biorremediación puede ser aplicada “in-situ” o “ex-situ” , siendolos métodos más usados
son la bioestimulación y la bioaumentación.
1.4.2.1.
Bioestimulación
Consiste en la adición de nutrientes, sustratos o tensoactivos que estimulen el crecimiento
y la actividad metabólica de los microorganismos degradadores presentes en la zona
impactada (Baheri and Meysami, 2002). Generalmente se emplean fertilizantes,
suplementos y/o factores de crecimiento. También pequeñas cantidades de contaminantes
pueden actuar como estimulante natural, pues activan los operones que regulan la síntesis
de las enzimas que intervienen en el proceso de biorremediación (Andersson et al., 1998;
Razak et al., 1999; Mathew et al., 1999).
1.4.2.2. Bioaumentación
Comprende el uso de enzimas o cultivos de microorganismos con alta capacidad de
oxidación con el propósito de eliminar sustancias indeseables, donde se asegura que estén
25
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
presentes
los
microorganismos
específicos
capaces
de degradar
el compuesto
contaminante no deseado hasta sus moléculas básicas (Shmaefsky, 1999) siendo las
bacterias los microorganismos más comúnmente utilizados para este proceso. En
condiciones controladas ésta es una técnica práctica y económicamente efectiva para
eliminar la contaminación por hidrocarburos. Los microorganismos deben estar presentes
en suficiente cantidad y diversidad. También deben tener asegurados sus requerimientos
esenciales para lo cual se controlan rigurosamente parámetros como: nivel de oxígeno,
nutrientes inorgánicos, acceso al sustrato, agua y otras condiciones como pH, temperatura,
salinidad, propiedades del contaminante, etc. (Biotechnology, 2001).
1.4.3. Fundamentos bioquímicos de la biorremediación
El fundamento bioquímico de la biorremediación se basa principalmente en la serie de
reacciones de oxidación-reducción (cuyo fin es la obtención de energía) que se producen
en la cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las células. La cadena la inicia
un sustrato orgánico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la célula y que actúa
como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba
degradando y consumiendo dicha sustancia (Maroto and Rogel, 2009).
Los aceptores más comúnmente utilizados por los microorganismos son el oxígeno, los
nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de carbono. Cuando el oxígeno es utilizado
como aceptor de electrones la respiración microbiana se produce en condiciones aerobias,
y los procesos de biodegradación serán de tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos
o el dióxido de carbono se produce en condiciones reductoras o anaerobias, y los procesos
de biodegradación serán de tipo anaerobio (figura 1).
Figura 1. Esquema de las reacciones (Maroto and Rogel, 2009: p. 298)
La biodegradación microbiana es un proceso complejo que consiste en la transformación
de los hidrocarburos en otros compuestos más solubles e inestables, llevada a cabo por
26
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
acción de monooxigenasas y dioxigenasas, enzimas que oxidan a los hidrocarburos con
incorporación directa de oxígeno molecular (Swannell et al., 1995; Venosa et al., 2000).
La misma está acompañada de importantes modificaciones cuantitativas de las diferentes
fracciones del petróleo, observándose un relativo incremento en los compuestos polares y
una disminución en la fracción asfalténica (Joseph et al., 1994; Wang et al., 1998).
Las n-parafinas son degradadas más rápidamente seguido por los aromáticos, isoalcanos,
cicloparafinas, y policíclicos aromáticos de cadenas largas (Prince, 1993). Cuando se trata
de petróleos pesados se mantiene esta secuencia de degradación incluidas las resinas y
los asfaltenos, compuestos de alto peso molecular que se acumulan como resultado de la
biodegradación y persisten en el medio ambiente por décadas, pero que sin embargo y
afortunadamente, no son tóxicos a la biota (Haines et al., 1996).
Los alcanos pueden ser degradados con gran facilidad por la acción de numerosas
bacterias ya que son simples cadenas carbonadas. Los de C 12 -C 18 son los atacados más
fuerte y rápidamente. Los menores de C 12 son evaporados o eliminados, son tóxicos para
los microorganismos y, por tanto, menos utilizados. Por encima de C 18 tienen una
consistencia sólida, son insolubles y difícilmente emulsionables. Los superiores a C 27 son
poco biodegradables; aunque, desde el metano hasta compuestos con más de 40 átomos
de carbono, son susceptibles a una oxidación microbiana en condiciones favorables
(Aggaewal et al., 1997).
La degradación de este tipo de hidrocarburo comienza normalmente por la oxidación del
grupo metilo terminal mediante oxígeno para dar alcohol, aldehído y un ácido carboxílico.
Una vez formado este último, ocurre la β-oxidación con pérdida de dos átomos de carbono
en cada caso hasta dar el acetil CoA que se degrada por el ciclo de Krebs (o el propionil
CoA, sí el número de átomos de carbono es par).
En cuanto al proceso de biodegradación de los cicloalcanos, sólo se conoce que como
resultado final en la biodegradación se obtienen ácidos, pero no se ha descrito un
mecanismo de bioxidación típico de estos compuestos en la literatura (Atlas, 1993).
Algunos autores plantean que el mecanismo de bioxidación de los cicloalcanos debe ser
similar al de los isoalcanos como un proceso de cometabolismo (Martinkova et al., 1985;
Murakami et al., 1985).
Los isoalcanos son metabolizados mediante un proceso de cometabolismo o cooxidación,
el cual consiste en que un sustrato puede ser oxidado por la acción enzimática de
27
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
microorganismos sin ser fuente de energía de los mismos, sino que para obtenerla, y como
base para su crecimiento, usan a los n-alcanos (Atlas and Bronner, 1881; Rontani, 1986).
Estos hidrocarburos son usados como única fuente de carbono y energía por muy pocas
especies microbianas como Pseudomonas fluorecens y Mycobacterium vaccas (Núñez,
2003).
En el caso de los hidrocarburos aromáticos, que comprende al benceno (C 6 H 6 ) y sus
homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de
carbono están asociados en anillos, pero solamente una valencia de cada dos, es
saturada. Al producirse la oxidación del anillo, éste se abre por un doble enlace y se
obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil. Así, en
dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes
productos intermedios. Por otra parte, la práctica ha demostrado que los hidrocarburos
heterocíclicos, que tienen otro átomo distinto al carbono en cada uno de sus anillos,
también pueden ser degradados ( Liu et al., 1995 ; Herbert et al., 1996; Daly et al., 1997).
Además de los mecanismos antes señalados se conocen los de α y ω-oxidación, los cuales
se presentan fundamentalmente en los procesos de biodegradación de petróleos
asfalténicos o cuando ocurre una inhibición por altas concentraciones de sustrato posterior
a la metil-oxidación, estos mecanismos son tan efectivos en la oxidación de los
hidrocarburos como los de β-oxidación, sólo que la velocidad de degradación es más lenta
lo que trae consigo un mayor tiempo de interacción entre el microorganismo y el petróleo.
1.4.4. Consorcios Bacterianos degradadores de hidrocarburos
La capacidad de degradación microbiana de hidrocarburos es un hecho conocido desde
finales del siglo XIX, a partir de las observaciones de Miyoshi (1895) sobre la especie
Botrytis cinerea. (Rahn (1906) expuso la habilidad de diversas especies de hongos, de
usar parafina como única fuente de energía. Más tarde en Fush and Ponsford (1912)
elaboraron una amplia lista de bacterias capaces de degradar diferentes tipos de
hidrocarburos (Santiago et al., 1978).
En la actualidad, la literatura especializada refiere una gran variedad de microorganismos
hidrocarbonoclastas:
 Proteobacteria, Mycobacterium y Sphingobacterium (Kanaly et al., 2000).
 Planococcus spp (Engelhardt et al., 2001).
 Pseudomonas spp (Lim and Halos, 1997; Al-Gounaim and Diab, 1998).
28
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
 Bacillus, Brevibacterium (Lim and Halos, 1997)
 Corynebacterium spp (Lim and Halos, 1997; Al-Gounaim and Diab, 1998).
 Arthrobacter spp., Acinetobacter spp., y Flavobacterium spp (Razak et al., 1999).
 Acinetobacter calcoaceticus y otras especies de los géneros (Lim and Halos, 1997).
 Marinobacter y Alcanivorax (Shutsubo, 2001).
 Nocardioforms (Lim and Halos, 1997; Radwan et al., 1995).
 Rhodobacter sphaeroides y Rhodovulum sp (Sasaki et al., 2000).
 Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus macerans, Corynebacterium sp,
Micrococcus varians (Morales, 2006).
 Algunas especies de Candida y Rhodotorula son los más representativos entre las
levaduras (Prabhakaran and Sivadas, 1995); (Fonseca, 1998).
 Cladosporium, Penicillium y Aspergillus son los más frecuentes entre los hongos
filamentosos (Fonseca, 1998).
La concentración y composición de la comunidad microbiana así como las tasas de
transformación de los hidrocarburos está influenciada por diversos factores, tales como la
temperatura, el pH,
oxígeno, humedad, disponibilidad de nutrientes, estructura,
composición y disponibilidad del contaminante.
1.4.5. Factores que condicionan la biodegradación de los hidrocarburos
1.4.5.1. Temperatura
Es uno de los factores ambientales más importantes que afecta la actividad metabólica de
los microorganismos y la tasa de biodegradación. Generalmente, las especies bacterianas
crecen a intervalos de temperatura bastante reducidos, entre 15 y 45ºC (condiciones
mesófilas), decreciendo la biodegradación por desnaturalización de las enzimas a
temperaturas superiores a 40ºC e inhibiéndose a inferiores a 0ºC (Maroto and Rogel,
2009).
1.4.5.2. pH
Afecta significativamente la actividad microbiana. En consecuencia, cuanto mayor sea la
diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de
tolerancia. No existen condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos los casos,
pero en términos generales el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos es
máximo dentro de un intervalo de pH situado entre 6 y 8. En general, el pH óptimo para las
bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es más ácido para los hongos (pH
29
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
4-5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es neutro (pH 7,4-7,8)
(Dibble and Bartha, 1979). Así mismo el pH también afecta directamente la solubilidad del
fósforo y el transporte de metales pesados en el suelo.
1.4.5.3. Oxígeno
Es el aceptor final de electrones generalmente empleado en procesos biológicos y también
es necesario en determinados tipos de reacciones de oxidación-reducción catalizadas por
enzimas. Los microorganismos oxidan compuestos orgánicos o inorgánicos obteniendo así
la energía necesaria para su crecimiento. El proceso de oxidación da lugar a electrones
que intervienen en una cadena de reacciones en el interior de la célula, y al final deben ser
vertidos en el entorno. El aceptor final de electrones es el receptor de los mismos y en el
caso de un metabolismo aerobio, O 2 es el aceptor y H 2 O es el producto.
La mayor parte de los hidrocarburos presentes en los productos petrolíferos son
degradados con mayor extensión y rapidez de forma aerobia (O 2 como aceptor final de
electrones), ya que en ausencia de O 2 , y en presencia de aceptores de electrones
alternativos (NO 3-, SO 4 2-, CO 2 , Mn4+ y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser degradados,
pero con tasas de biodegradación muy inferiores a las aerobias (Holliger and Cender,
1996; Grishchenkov et al., 2000; Massias et al., 2003).
1.4.5.4. Nutrientes
El metabolismo microbiano está orientado a la reproducción de las células y requieren que
los constituyentes químicos se encuentren disponibles para su asimilación y sintetización.
Los nutrientes principalmente requeridos son el fósforo y el nitrógeno, por tanto, las
concentraciones asimilables de dichos elementos presentes en el suelo suelen ser
limitantes para un incremento y activación de la población microbiana, mientras que otros
nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO 4 2- ya están presentes en cantidades
suficientes ( Menn et al., 2000).
Aunque en general la adición de fuentes inorgánicas de N y P al suelo es beneficiosa para
los procesos de biodegradación, de igual manera el uso excesivo de nutrientes inorgánicos
también puede inhibir los procesos de biodegradación (Zhou and Crawford, 1995; margesin
and Schinner, 1997; Genouw et al., 1994).
1.4.5.5. Humedad
Los microorganismos requieren condiciones mínimas de humedad (20%) para su
crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio de
30
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
transporte a través del cual los compuestos orgánicos y nutrientes son movilizados hasta el
interior de las células. Un exceso de humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir
la concentración de oxígeno en el suelo (Maroto and Rogel, 2009).
Por lo anterior, la humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación,
fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el
contenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades
de cada suelo, el tipo de contaminación y si la biodegradación es aerobia o anaerobia.
1.4.5.6. Estructura, composición y disponibilidad del contaminante
La inherente biodegradabilidad de un hidrocarburo depende, en gran medida, de su
estructura molecular. Siendo los parámetros que más van a afectar la halogenación, la
existencia de ramificaciones, la baja solubilidad en el agua y la diferente carga atómica.
Por su parte la tasa de degradación depende tanto de la capacidad de transporte y del
metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto.
La relación entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los
factores limitantes para la biodegradación es la transferencia de masas, ya que los
microorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidades
biodegradativas al estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgánicos
diferentes.
Por lo tanto la adsorción, la absorción, desadsorción, disolución y la difusión son
fenómenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan la biodisponibilidad de
los contaminantes (Stucki and Alexander, 1987; Tabak et al., 1995; Harms and Bosma,
1996; Bosma et al., 1997). Un fenómeno que afecta de forma negativa a la
biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento de los hidrocarburos,
producidos por fenómenos como adsorción con la materia particulada del suelo; absorción
a la materia orgánica del suelo (ácidos húmicos, fúlvicos y humina); baja difusividad de los
compuestos (principalmente desde los micro poros); la disolución en fases líquidas no
acuosas (FLNAs) y la formación de uniones covalentes con la materia orgánica e
inorgánica del suelo.
1.4.6. Polémica actual sobre el empleo de las técnicas de biorremediación
Aquellos que proponen la bioestimulación plantean que la amplia distribución de los
microorganismos en los más variados ecosistemas, permite que los autóctonos de la zona
contaminada sean capaces de biorremediar; siendo necesaria únicamente la adición de
31
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
fertilizantes y nutrientes para estimular el crecimiento de las poblaciones de especies
biodegradadoras (Biotechnology, 2001). Quienes proponen la bioaumentación insisten en
el hecho de que la mejor forma de eliminar la sustancia no deseada es añadir al sitio
cultivos microbianos capaces de degradar los contaminantes específicos de cada situación
(Aldrett et al., 1997; Biotechnology, 2001).
La bioaumentación reduce el tiempo de respuesta ante un derrame y no afecta el medio
ambiente sino que elimina los materiales contaminantes liberados al medio antes y durante
las labores de contingencia. El uso de la bioestimulación como técnica de biorremediación
es cuestionable. Los microorganismos autóctonos capaces de producir enzimas para la
degradación de hidrocarburos se encuentran en la naturaleza en porcentaje bajo y
requieren un período de tiempo relativamente largo para su adaptación. Por otra parte los
fertilizantes añadidos al medio pueden ser utilizados de forma competitiva por otros
microorganismos, limitando así el crecimiento de las especies hidrocarbonoclastas (Núñez,
2003). Cuando se aplica de forma adecuada la bioaumentación resulta más eficiente,
rápida y menos costosa que la bioestimulación (Venosa et al., 1996).
Conclusiones parciales
1. La mezcla compleja de hidrocarburos y elementos no carbonados que componen al
petróleo le confiere propiedades particulares, las cuales dependen del origen y
composición del mismo. Así, es muy resistente a la degradación natural especialmente
a los procesos de degradación biológica, afectados fundamentalmente por la presencia
de fracciones deletéreas (HPAs, BTEX, etc.), y recalcitrantes (Asfaltenos, Resinas,
etc.).
2. El suelo constituye la Interfaz entre la tierra, el aire y el agua, en el cual se producen la
mayoría de las reacciones bioquímicas pertenecientes al ciclo de la materia orgánica,
el nitrógeno y otros minerales, su complejos compartimentos ambientales y
propiedades físico-químicas y biológicas, condicionan el comportamiento y la
distribución de los hidrocarburos en el mismo (evaporación, disolución, adsorción,
lixiviación, biodegradación, etc.).
3. Los estudios realizados sobre la contaminación con hidrocarburos, demuestran que en
el área del Caribe y en especial en nuestro país, existe contaminación por
hidrocarburos tanto en ecosistemas acuáticos como terrestres, observándose una
32
Capítulo I. Revisión Bibliográfica
tendencia al incremento de los derrames producidos por accidentes y la acumulación
de pasivos ambientales sin alternativas de solución en los últimos años.
4. La revisión bibliográfica nos permitió identificar los diversos métodos físico- químicos y
biológicos de tratamiento de residuos petrolizados y de descontaminación de espacios
naturales contaminados; siendo de ellos los métodos de biorremediación los de mayor
aplicabilidad teniendo en cuenta su efectividad en cuanto a costos, y que generalmente
son destruidos la totalidad de los contaminantes requiriendo un mínimo de tratamiento
posterior.
33
Capítulo II. Materiales y Métodos
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Breve descripción de la zona de estudio
La zona de estudio se localiza en la península de “Punta Majagua”, ubicada en la porción
centro-norte de la Bahía de Cienfuegos, Cuba. Con una extensión promedio de 100 000m2
constituye una barrera de protección natural de la ciudad ante penetraciones del mar y
otros eventos meteorológicos. La presencia en el área de los restos de cuatro tanques
cuyas características se describen en el anexo 1 con aproximadamente 371m3 de fueloil y
lodos de deposición de alta viscosidad, así como 108m3 de residual derramado, tras el
abandono de las instalaciones de la Unidad Distribuidora de Combustibles de Cienfuegos,
provocaron la contaminación de aproximadamente 70 000m2 de la zona objeto de análisis.
2.2. Tratamiento de los residuos petrolizados
El esquema de biorremediación de residuos petrolizados propuesto, se basó en el uso de
la técnica de bioaumentación, a partir del uso del bioproducto BIOIL-FC, tal y como se
describe en el diagrama del anexo 2.
2.2.1. Diseño y preparación del área de biorremediación
Fue diseñada un área de biorremediación (anexo 3), para lo cual se tuvieron en cuenta los
criterios básicos de diseño de áreas de manejo para el tratamiento “ex-situ” de residuos
petrolizados,
tales
como
requerimientos
de
aislamiento
o
impermeabilización,
homogeneidad, humedad, temperatura, oxigenación, nutrientes, entre otros, descritos por
Bermúdez (2011).
2.2.2. Microorganismos empleados
Fue utilizado un cultivo mixto de bacterias aislado de los sedimentos de la bahía de
Cárdenas, Matanzas (Joseph et al., 1994) formado por las cepas CBM-225 (Bacillus
alcalophilus), CBM-60 (Bacillus licheniformis), CBM-226 (Bacillus macerans), CBM-232
(Corynebacterium sp.) y CBM-234 (Micrococcus varians) pertenecientes a la Colección de
Bacterias Marinas (CBM) del Centro de Bioproductos Marinos, CITMA (Morales, 2006). Este
cultivo se incluye en la formulación del producto BIOIL-FC patentado por el Centro de
Bioproductos Marinos (CEBIMAR) diseñado para combatir la contaminación de petróleo en
diferentes ecosistemas (Núñez, 2003).
2.2.3. Medios de cultivo
Medio basal salino agarizado para el conteo de microorganismos degradadores de
hidrocarburos (Finnerty, 1994)
34
Capítulo II. Materiales y Métodos
KH 2 PO 4
Na2 HPO 4
Ext. de Levadura
NH 4 Cl
MgSO 4 ·7H 2 O
pH= 7
6,00 g
4,00 g
1,00 g
5,30 g
0,20 g
CaCl 2 ·2H 2 O
EDTA
FeSO 4 ·7H 2 O
Agar
H 2 O dest. (c.s.p.)
0,01 g
0,10 g
0,01 g
20,00 g
1,00 L
Luego de esterilizado el medio de cultivo se añadió asépticamente una emulsión de
petróleo en agua al 1% de concentración final de la fuente de carbono.
Medio basal salino para la obtención de biomasa a nivel de laboratorio (MF) (Ortíz, 2004)
Sacarosa
20,00 g
MgSO 4 ·7H 2 O
0,20 g
Na2 HPO 4
2,60 g
NH 4 Cl
5,30 g
Ext. de Levadura
1,00 g
EDTA
0,10 g
CaCl 2 ·2H 2 O
0,01 g
FeSO 4 ·7H 2 O
0,01 g
pH = 7
H 2 O dest. (c.s.p.)
1,00 L
Medio de Producción (MP) para la obtención de biomasa a nivel industrial (Núñez, 2003)
Azúcar
30,0 g
Levadura Torula 1,0 g
pH = 7
0,2 g
(NH 4 ) 2 HPO 4
5,0 g
MgSO 4 ∙7H 2 O
0,2 g
H2O
corriente. 1,0 L
(c.s.p.)
Los medios de cultivo fueron esterilizados a 121oC por 15min, excepto para la escala de
20L que el tiempo fue de 45min, bajo similares condiciones.
2.2.4. Proceso de fermentación
Todos los experimentos desarrollados a escala de zaranda fueron realizados a partir de
cultivos de 24h en cuñas de agar nutriente. Los preinóculos de cada una de las cepas
integrantes del BIOIL-FC fueron cultivados en 100mL de medio de fermentación (MF)
(Ortíz, 2004) durante 24h. Posteriormente los cultivos fueron inoculados al 5% (v/v) en
500mL de este medio en Erlenmeyers de 2L de capacidad. Todas las fermentaciones
hasta esta escala fueron realizadas en zaranda orbital Infors a 125r·min-1 y 30 ±2oC.
El inoculo fue escalado a un nivel de fermentación en botellones de 18L de volumen
efectivo de medio de fermentación (MF) con una concentración inicial de 106cel·mL-1, el
mismo fue cultivado durante 24h, determinándose DO como control de calidad en el
momento que se alcanzó una concentración de 109cel·mL-1, utilizado como criterio para
comenzar la producción industrial.
35
Capítulo II. Materiales y Métodos
La producción industrial fue realizada a partir del medio de cultivo MP en tres escalas de
producción correspondiente a 800, 3 000 y 10 000L. En las dos primeras etapas fue
utilizado un cultivo en lote (batch) con un tiempo de duración entre 10 y 12h.
Para la obtención de los volúmenes finales de bioproducto a aplicar fue utilizada una
tecnología de cultivo semicontinuo con adiciones y extracciones de 7 000L cada 4h
aproximadamente hasta lograr el volumen final de producción de 76 640L.
El control microbiológico del proceso productivo fue realizado por conteo celular en cámara
de Neubauer y la homogeneidad del cultivo por tinción de Gram, cuando la concentración
celular alcanzó un valor de 108cel·mL-1, se procedió a la aplicación del producto
suministrando lotes de 7 000L por aspersión mediante un camión cisterna con una bomba
impulsora hasta alcanzar el volumen total a aplicar en el área impactada.
2.3. Monitoreo y control del proceso de biorremediación
2.3.1. Muestreo
Fue aplicado un muestreo estratificado antes del tratamiento, 45, 90 y 120 días después de
aplicado el BIOIL-FC. Fueron identificados cuatro estratos geográficos o parcelas cuyos
criterios de homogeneidad fueron las propiedades y el volumen de los hidrocarburos
dispuestos. Para la elección de los puntos de muestreo fue seleccionado un patrón de
recorrido por estrato. En los estratos 1 y 4 se establecieron 12 y 21 puntos de muestreo
respectivamente siguiendo un patrón en cuadrículas; en el estrato 2 se tomaron16 puntos
con un patrón en zigzag; mientras que en el 3 se fijaron 9 puntos de muestreo asumiendo
un patrón en diagonal, de acuerdo con los criterios establecidos en INTA, (1984) (anexo 3).
El número de submuestras fue seleccionado teniendo en cuenta los criterios establecidos
por Brady and Weil (2008) e ICA (1992). Las cuales fueron colectadas en la columna de
suelo hasta 30cm, tamizadas y homogenizadas mediante el método de cuarteo descrito
por Bubuda (2004).
Para los ensayos microbiológicos fueron colectadas siete muestras integradas en frascos
de vidrio estériles de 250mL de capacidad. Procesadas durante las primeras horas de la
colecta según la metodología descrita por Harrigan and Mc Cance (1968) y Miravet et al.,
(2009)
De manera análoga para los análisis físico-químicos fueron tomadas siete muestras
integradas en cada muestreo; conservadas añadiendo 1mL de HCl
(conc) ,
refrigeradas a 40C
36
Capítulo II. Materiales y Métodos
y transportadas al laboratorio en un término no mayor de 24h de acuerdo a los
requerimientos establecidos en CEAC (2008)
2.3.2. Determinaciones analíticas
2.3.2.1. Análisis microbiológico
2.3.2.1.1. Determinación de Microorganismos Heterótrofos Totales
La concentración de bacterias heterótrofas aerobias presentes en el suelo fue determinada
según la metodología descrita por la norma (ISO4833, 1991). Las siembras fueron
incubadas a 37oC durante 48h, posteriormente fue realizado el conteo directo de las
unidades formadoras de colonias expresadas como UFC·g-1 suelo.
2.3.2.1.2. Determinación de Microorganismos Degradadores de Petróleo
La concentración de bacterias hidrocarbonoclastas fue determinada en medio (Finnerty,
1994) agarizado con petróleo ligero (Merey) al 1% como única fuente de carbono y
energía. Las siembras fueron incubadas a 30oC y luego de 10 días fue realizado el conteo
directo de las unidades formadoras de colonias, expresadas como UFC·g-1 suelo.
2.3.2.1.3. Absorbancia
Las determinaciones fueron realizadas en un espectrofotocolorímetro Spekol 11, en
cubetas de 1mL, a una longitud de onda (λ) de 650nm y fueron expresadas como unidades
de DO.
2.3.2.1.4. Número total de células
Fue utilizado el método de conteo directo en cámara de Neubauer según la metodología
descrita por Madigan et al., (2003).
2.3.2.1.5. Velocidad específica de crecimiento
La velocidad específica de crecimiento (µ) fue determinada en la fase exponencial del
crecimiento, mediante el modelo de crecimiento no restringido (López and Gódia, 1998).
2.3.2.2. Análisis físico-químico
Previo a las determinaciones analíticas cada muestra fue sometida a un pretratamiento,
que consintió en secar entre 8 y 15g de suelo en una estufa con temperatura controlada a
45ºC durante 16h. Posteriormente fue macerada en un mortero hasta obtener partículas
inferiores a 250μm (CEAC, 2010a).
2.3.2.2.1. Determinación de Hidrocarburos Totales del Petróleo
37
Capítulo II. Materiales y Métodos
La concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo (HTP) se determinó por el método
gravimétrico (EPA, 1998) y (Fernández et al., 2007) utilizando como solvente de extracción
hexano/acetona (CEAC, 2010a). Todos los solventes empleados pertenecen a la marca
BDH.
2.3.2.2.2. Determinación de Saturados, Aromáticos, Resinas y Asfaltenos
La concentración de las fracciones saturadas, aromáticas, resinas, y asfalténicas (SARA),
fue determinada por el método gravimétrico (EPA, 1996) y (Fernández et al., 2007), como
solvente de extracción fue utilizado el diclorometano/acetona y hexano (CEAC, 2010b).
2.3.2.2.3. Velocidad de degradación de hidrocarburos
La velocidad de degradación de hidrocarburos fue determinada mediante ajustes
polinomiales en función de la cinética de cada una de las fracciones del petróleo.
2.3.2.3. Determinación del porciento de remoción de hidrocarburos
El porciento de remoción de hidrocarburos fue calculado de acuerdo a la metodología
descrita por (Rosa, 1998) mediante la expresión:
2.3.2.4. Análisis Ecotoxicológicos
2.3.2.4.1. Ensayos de fitotoxicidad sobre la germinación en plantas terrestres.
Para la evaluación de la fitotoxicidad fue realizada la prueba de germinación de semillas en
frijol (Faciola Vulgaris) y maíz (Zea Maíz), de acuerdo con los criterios de referencia
establecidos en EPA (1996).
2.3.2.4.2. Ensayos de fitotoxicidad sobre el crecimiento en plantas terrestres.
Para la evaluación de la fitotoxicidad de compuestos tóxicos fue aplicada la prueba de
crecimiento en plantas terrestres para frijol (Faciola Vulgaris) y maíz (Zea Maíz). Esta
prueba fue realizada con la combinación de los métodos EPA (1984) y EPA (1996).
2.4. Tratamiento estadístico de los resultados
Fue aplicado un diseño aleatorizado por bloques completos con un factor categórico
(Montgomery, 2004). Como factor de efecto fijo fue tomado el tiempo de tratamiento para
0, 45, 90 y 120 días.
38
Capítulo II. Materiales y Métodos
Los estratos o parcelas fueron considerados como bloques fijos para minimizar el efecto de
la heterogeneidad de residuos petrolizados sobre las variables de respuesta descritas en el
epígrafe 2.3.2.
Para verificar el cumplimiento de los supuestos de idoneidad del modelo fue realizado el
análisis de residuos, posteriormente fue aplicado una transformación Box-Cox con
λ 1 =0,296 a los datos obtenidos de cada variable para excluir el incumplimiento del
supuesto de homogeneidad de varianza de los residuos para la prueba f. La idoneidad del
nuevo modelo obtenido fue verificado a partir del análisis del cumplimiento de los
supuestos de ų=0, normalidad, homogeneidad de varianza e independencia de los
residuos.
Para realizar el análisis de similitud de medias de cada variable de respuesta por
tratamiento fue realizado un análisis de varianza de clasificación simple y una prueba de
múltiple rangos LSD de Fisher. La prueba de hipótesis para las variables físico-químicas
fue aplicada con el fin de contrastar con el valor de concentración establecido por la norma
de vertimiento de hidrocarburos (SEMARNAT, 2003) en cada tratamiento con α=0,05. El
análisis de la potencia de la dócima fue realizado para el tratamiento a los120 días.
Tanto para el análisis de comparación de medias de la concentración de microorganismos
heterótrofos totales y degradadores de hidrocarburos como para los resultados obtenidos
en las pruebas ecotoxicológicas, fue utilizado el método no paramétrico de Kruskal-Walis.
Todos los datos fueron procesados con el paquete estadístico Statgraphics Centurión XVII.
2.5. Análisis costo-beneficio
Para el análisis costo-beneficio fueron determinados los indicadores dinámicos de
rentabilidad del proyecto (VAN, TIR y PRD) tomando como referencia la metodología ABC.
Los mismos fueron calculados con una variabilidad de ±30% de los ingresos planificados
en una hoja de cálculo en Microsoft Excel. Además fue realizado un análisis de sensibilidad
a los ingresos del proyecto (±30%) para detectar posibles fluctuaciones de la inversión
durante su ejecución (anexo 4).
Para la determinación de los costos del proyecto fueron considerados los costos de
inversión (adquisición de equipos y accesorios) y de producción (fuerza de trabajo,
materias primas y materiales, subcontrataciones a terceros, entre otros). Para la
determinación de los ingresos fueron consideradas las ventas totales por concepto de
39
Capítulo II. Materiales y Métodos
cobros periódicos al cliente, los ingresos por ahorro de agua, materias primas y materiales,
los gastos evitados por tratamiento, y los ingresos por externalidades (anexo 5).
Los criterios tomados para la determinación de los ingresos por externalidades fueron:
ahorros por daños y perjuicios de la contaminación al suelo, las aguas de la bahía, la flora
y la fauna; ahorro por impago de multas ambientales y ahorros por daños a la salud de los
pobladores de la zona.
40
Capítulo III. Resultados y Discusión
3. RESULTADOS Y DISCUCIÓN
3.1. Diseño del área de manejo
Para el tratamiento “ex-situ” de los residuos oleosos se diseñó una parcela de 115m x 75m,
limitada por muros de contención de 1,70m de alto x 2,00 m de ancho, la cual fue
seccionada en cuatro parcelas cuyas dimensiones se describen en la siguiente tabla.
Tabla 7. Dimensiones de las parcelas del área de biorremediación de residuos
petrolizados.
1
Largo
(m)
23,82
Ancho
(m)
21,74
Área
(m2)
517,85
2
60,00
30,00
1800,00
*
53,58
754,39
5014,03
Parcelas
3
*
4
107,66
*Parcela circular de diámetro 31m.
Los muros de contención permitieron minimizar los riesgos de contaminación del resto de
la zona terrestre y las aguas de la bahía, debido a posibles penetraciones del mar y
escorrentías pluviales al estar el área ubicada a menos de 30m del mar, en una zona baja
con reportes históricos de inundaciones costeras.
Las dimensiones de las parcelas se calcularon teniendo en cuenta el volumen total de
mezcla a tratar (1 916m3) y una altura mínima de la columna (30cm) en la cual se logró una
actividad metabólica óptima de los microorganismos hidrocarbonoclastas aerobios,
corroborada posteriormente con los ensayos microbiológicos realizados durante el proceso
de biorremediación.
Por su parte el seccionamiento del área en cuatro estratos, permitió realizar la aplicación
homogénea del BIOIL-FC en la totalidad del área a tratar; además permitió realizar de
manera eficiente el mezclado y la humectación periódica de las parcelas y aplicar un
muestreo representativo de cada uno de los estratos geográficos.
La impermeabilización del área de manejo se logró a partir de la compactación de la arcilla
de relleno presente en la zona objeto de análisis, como muestra el perfil de suelo tomado
por la Empresa Nacional de Investigaciones Aplicadas (ENIA) (anexo 6).
41
Capítulo III. Resultados y Discusión
Los residuos confinados en cada tanque y derramados en la zona fueron mezclados y
homogenizados con tierra fértil (1 437m3) en una proporción 1:3 (v/v), dispuestos en el área
de manejo de acuerdo a la distribución descrita en la tabla 8.
Tabla 8. Volumen de hidrocarburos, tierra fértil y mezcla total, dispuesta en cada parcela
del área de biorremediación.
Procedencia
Residual
(m3)
Tierra fértil
(m3)
Total
(m3)
Parcelas
51,59
154,77
206,36
3
TK-2
197,64
592,92
790,56
4
TK-3
4,11
12,33
16,44
1
TK-4
Derramados
117,96
107,7
353,88
323,1
471,84
430,8
2
4
de los residuos
TK-1
3.2. Obtención industrial de BIOIL-FC
3.2.1. Fermentación a escala industrial
Debido a la magnitud de la contaminación de las áreas a tratar fue necesaria la producción
de BIOIL-FC en biorreactores de capacidad industrial para lograr un proceso fermentativo
eficiente.
En
los
fermentadores
industriales
generalmente
sólo
se
permite
la
implementación de agitación pneumática, aún cuando no se logra homogeneidad en el
sistema por los patrones de flujo que se crean. El costo de construcción y operación de
estos sistemas disminuye la potencia utilizada para el mezclado de los componentes
mediante la agitación mecánica.
Para el biorreactor de inóculo de volumen total de 1 000L se trabajó con un volumen
efectivo de 800L y para el de producción (volumen total de 12 000L) se trabajó solo a 10
000L, con el fin de evitar el derrame de espuma que se crea en todo proceso fermentativo,
la cual se incrementa con la presencia de metabolitos con actividad superficial
(biotensioactivos) producido por una de las cepas que conforman el producto BIOIL-FC,
necesario para favorecer los procesos de biodegradación de hidrocarburos (Ortíz, 2004).
El proceso de obtención de BIOIL-FC en el fermentador de 800L de volumen efectivo
muestra que el incremento de biomasa en el tiempo se corresponde con una curva típica
de crecimiento (Aiba et al., 1973) (figura 2). En estas condiciones se alcanzó una velocidad
específica de crecimiento promedio de 0,3472 ±0,004h-1, similar a la obtenida en la escala
42
Capítulo III. Resultados y Discusión
de laboratorio. Así mismo los niveles de biomasa alcanzados garantizaron el desarrollo
efectivo del proceso industrial de obtención de BIOIL-FC.
Conc. micr.x108 (cel·mL-1)
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
t (h)
Figura 2. Perfil de fermentación promedio para la obtención de 800L de BIOIL-FC, que se
corresponde con el inóculo para el proceso a escala industrial.
La figura 3 muestra el perfil de fermentación del sistema semicontinuo a nivel industrial,
que permitió obtener las cantidades necesarias de bioproducto a aplicar en cada área. En
esta figura se aprecia una rápida recuperación del cultivo después de cada extracción y
adición de medio de cultivo, lográndose altas concentraciones de biomasa. La velocidad
específica de crecimiento promedio del proceso fue de 0,415 ±0,050h-1 similar a las
obtenidas en las escalas anteriores.
16
Conc. micr.x108 (cel·mL-1)
14
12
10
8
6
4
2
0
0
15
30
45
t(h)
Figura 3. Perfil de fermentación del sistema semicontinuo en la obtención de los 76 000L
de BIOIL-FC aplicados en el área de biorremediación.
43
Capítulo III. Resultados y Discusión
Es necesario señalar que la µ de un cultivo es dependiente de diferentes factores
ambientales como el pH, temperatura, concentración y tipo de sustrato, oxígeno disuelto,
etc. El desarrollo de un proceso productivo en equipamientos que no posibilitaron el control
de la temperatura en cada etapa, en particular en el horario de madrugada donde se
alcanzaron temperatura por debajo de 25oC, afectaron las reacciones del metabolismo
microbiano y por tanto la velocidad especifica de crecimiento.
Por otra parte, la utilización de nutrientes de calidad fertilizante con elevadas
concentraciones de impurezas y sólidos en suspensión utilizados en la escala industrial
interfiere en el crecimiento celular y en las determinaciones analíticas.
Bajo estas condiciones no se lograron perfiles de fermentación del cultivo similares a nivel
de laboratorio y a escala industrial. No obstante, durante el proceso industrial se demostró
la efectividad del sistema de fermentación utilizado para las capacidades instaladas, ya
que se produjo el incremento de la biomasa bacteriana en el tiempo, permitiendo obtener
los volúmenes de bioproducto necesarios para la aplicación.
3.2.2. Aplicación del BIOIL-FC
En la tabla 9 se describen los volúmenes de BIOIL-FC aplicados en el área de manejo.
Tabla 9. Volúmenes de BIOIL-FC aplicados para cada una de las parcelas de trabajo en el
área de biorremediación.
1
Volumen
(L)
657,60
2
18 873,10
3
4
8 254,40
48 854,40
Parcelas
La aplicación en las áreas correspondientes al área de manejo ascendió a un total de 76
640L de BIOIL-FC.
Estos resultados demuestran que la relación de aplicación de BIOIL–FC en área
contaminada
fue
aproximadamente
a
40L/m3;
relación
que
ha
sido
utilizada
satisfactoriamente en otros tratamientos con este bioproducto en diferentes ecosistemas.
Bajo esas condiciones en los tratamientos realizados en los Lácteos de Pinar del Rio
(Núñez et al., 2009) se alcanzaron porcentajes de remoción superiores al 90%.
44
Capítulo III. Resultados y Discusión
3.3. Análisis microbiológico
Los resultados obtenidos de los ensayos microbiológicos realizados para cada una de las
observaciones se describen en el anexo 7.
Las concentraciones de microorganismos heterótrofos y degradadores de hidrocarburos
variaron en el tiempo en las áreas tratadas (figuras 4 y 5), antes y después del tratamiento
(Kruskal-Walis; p<0,5).
Los microorganismos degradadores se identificaron por la reducción del compuesto debido
a la actividad microbiana en la cadena de trasporte de electrones y por el cambio de las
características físicas del petróleo (desmenuzamiento y emulsificación) (Swannell et al.,
1995).
El análisis de los resultados arrojó que antes del tratamiento microbiano en las parcelas de
biorremediación existían concentraciones de bacterias heterótrofas en el orden entre 105 y
106 cel·mL-1, probablemente relacionado con la carga microbiana procedente de la capa
vegetal con la cual se mezclaron los residuos petrolizados.
a
6
9x10
a
a
a
8x106
Concentración (UFC·g-1)
0 días
45 días
90 días
120 días
165 días
a
6
7x10
6x106
a
a
5x106
a
4x106
6
3x10
a
aa
1x106
a
a
a
ab
b
b
b
b
b
a
a
a
a
2x106
a
aa
b
b
b
b b
b
b
0
1
2
3
4
5
6
7
Observaciones
Figura 4. Concentración de microorganismos heterótrofos totales antes y durante el
tratamiento de las parcelas con BIOIL-FC (Kruskal-Walis; p<0,5).
45
Capítulo III. Resultados y Discusión
Concentración(UFC·g-1)
6
9.0x10
8.5x106
8.0x106
7.5x106
7.0x106
6.5x106
6.0x106
5.5x106
5.0x106
4.5x106
4.0x106
3.5x106
3.0x106
2.5x106
2.0x106
1.5x106
1.0x106
5.0x105
0.0
a
a
a
0 días
45 días
90 días
120 días
165 días
a
aab
a
a
a
a
ab
bb
1
b
b
c
2
a
b
b
b
c
c
a
ab
3
b
b
b
c
c
4
bb
c
c
5
b
b
6
7
Observaciones
Figura 5. Concentración de microorganismos degradadores de hidrocarburos antes y
durante el tratamiento de las parcelas con BIOIL-FC (Kruskal-Walis; p<0,5).
La concentración de bacterias degradadores de hidrocarburos antes del tratamiento con
BIOIL-FC se encontraban en el orden desde 104 cel·mL-1 en cada una de las parcelas.
Venosa et al., (2000) refirieron que aunque los microorganismos degradadores
comprenden el 1 % de la población heterótrofa total en ambientes no contaminados, éstos
se incrementan hasta un 10 % por un derrame de petróleo. Bajo estas condiciones debió
incrementarse la concentración de microorganismos degradadores, sin embargo los
niveles determinados en estas áreas se encontraban disminuidos luego de largos períodos
de tiempo con la presencia de altas concentraciones de la contaminación petrogénica. De
acuerdo a estas observaciones se infiere que las áreas no presentaban una alta capacidad
de autodepuración debido a la magnitud del impacto de la contaminación y el tipo de
petróleo contaminante.
En estas condiciones los niveles de degradadores de petróleo (104 cel·mL-1) no serían
suficientes para la autodepuración del sistema, por lo que se hizo necesario un proceso
bioaumentación con el producto BIOIL-FC. Además, los procesos de biorremediación por
bioaumentación evitan la excreción de metabolitos tóxicos que se forman durante el
46
Capítulo III. Resultados y Discusión
proceso de biodegradación cuando se utilizan fertilizantes orgánicos para favorecer la
autodepuración del sistema (Lee and Tremblay, 1995; Magot et al., 2000). Durante el
proceso de biorremediación el análisis de los resultados demostró, que se produjo un
incremento del número de microorganismos degradadores a partir del segundo muestreo
posterior a la aplicación del bioproducto. La concentración de estos microorganismos fue
aumentando en un orden con respecto al muestreo que le antecedió, llegando a
predominar en el total de la población de heterótrofos. Esto pudiera estar relacionado con
el suministro del producto BIOIL-FC con una carga directa de microorganismos
hidrocarbonoclastas, así como a condiciones de nutrientes y oxigenación suficientes para
favorecer los procesos metabólicos de multiplicación celular y de oxidación del petróleo
contaminante del área tratada, corroborado con los resultados del análisis de
concentración de hidrocarburos en cada muestreo.
Es importante destacar que para la totalidad de las estaciones se produjo una disminución
significativa de la concentración de microorganismos degradadores al final de la
experiencia, relacionada con una disminución notable de la concentración de hidrocarburos
del petróleo (figura 6) como fuente de carbono necesaria para realizar los procesos de
síntesis y/o multiplicación celular.
Los resultados demuestran la ventaja de este producto, pues mientras existan
hidrocarburos en el medio ocurre el crecimiento poblacional. Sin embargo cuando la
concentración de petróleo disminuye drásticamente, la población microbiana añadida, para
el proceso de biorremediación por técnica de bioaumentación, decrece significativamente
lo cual evidencia el mínimo impacto que tiene este producto en el ambiente.
Resultados similares aparecen descritos luego de los accidentes ocurridos en las bahías
de Cienfuegos (1992) y de Matanzas (1998), en los derrames de las playas Jibacoa (2001)
y Varadero (2005); así como en el tratamiento de las parcelas de los Lácteos de Pinar del
Río (2009) (Núñez et al., 2009)
3.4. Análisis físico-químico
Los resultados obtenidos de los ensayos físico-químicos realizados para cada una de las
observaciones se describen en el anexo 8.
3.4.1. Análisis de la concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo
La biodegradación microbiana es un proceso complejo que consiste en la transformación
de los hidrocarburos en otros compuestos más solubles e inestables, llevada a cabo por
47
Capítulo III. Resultados y Discusión
acción de monooxigenasas y dioxigenasas, enzimas que oxidan a los hidrocarburos con
incorporación directa de oxígeno molecular (Lee and Levy, 1989)
Las diferencias en la composición y concentración de hidrocarburos en el petróleo influyen
en su biodegradación. Así, un mismo microorganismo, puede presentar diferentes
porcentajes de remoción ante crudos de diferente procedencia o composición química en
iguales condiciones experimentales. Además los resultados de la biodegradación de los
hidrocarburos serán diferentes en dependencia de los microorganismos que lleven a cabo
el proceso (Lee and Levy, 1989).
El comportamiento de la concentración de hidrocarburos en el tiempo para cada área
Concentración (mg.kg-1)
tratada se muestra en la siguiente figura.
45000
42000
39000
36000
33000
30000
27000
24000
21000
18000
15000
12000
9000
6000
3000
0
Observación 1
Observación 2
Observación 3
Observación 4
Observación 5
Observación 6
Observación 7
0
45
90
120
Intervalo de muestreo (días)
Figura 6. Variación y dispersión de las concentraciones de HTP por tratamiento durante el
proceso de biorremediación con el bioproducto BIOIL-FC (LSD Fisher, p<0.05).
A partir de la aplicación del BIOIL-FC se detectó una rápida y significativa degradación de
los hidrocarburos en cada una de las observaciones, obteniéndose concentraciones de
hidrocarburos totales inferiores a 3000 mg·Kg-1 , valores que no superan los límites
permisibles para este tipo de ecosistema (SEMARNAT, 2003).
48
Capítulo III. Resultados y Discusión
En la siguiente figura se presentan los niveles de remoción de hidrocarburos obtenidos en
el proceso de tratamiento con BIOIL-FC en cada una de las observaciones tomadas en el
área de manejo.
100
% de Remoción
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
Observaciones
Figura 7. Porcentaje de remoción de hidrocarburos obtenidos a los 120 días de aplicado el
bioproducto BIOIL-FC.
Como se puede apreciar en todos los casos se obtienen porcientos de remoción superiores
al 90% en solo 120 días después de la interacción de los microorganismos integrantes del
BIOIL-FC con los contaminantes a pesar de ser un residual con carácter asfalténico (tabla
11).
Es significativo señalar que numerosos autores han estudiado la degradación de residuos
petrolizados similares al contaminante y solamente han detectado una buena degradación
en largos períodos de tiempo. Lee and Tremblay (1995) necesitaron 333 días para tener
resultados favorables de la degradación de un crudo pesado.
En la tabla 10 se muestran los valores de velocidad de degradación de HTP para cada
observación.
49
Capítulo III. Resultados y Discusión
Tabla 10. Valor modular de la velocidad de degradación de HTP en el proceso de
biorremediación con BIOIL-FC, utilizando un modelo cinético de primer orden.
Observaciones
Velocidad de degradación
(mg⋅(kg⋅h)-1)
R2
1
273,70a
0,996
2
198,90a
245,90a
329,20a
258,50a
219,30a
189,80a
0,975
0,976
0,989
0,908
0,994
0,997
3
4
5
6
7
El análisis estadístico de los datos demostró que no existen diferencias significativas entre
los valores de velocidad para cada parcela, lo que sugiere cierta homogeneidad en el
proceso de biorremediación dado por la preparación del área y el control de las
condiciones ambientales relativas a ella, como humedad, mezclado, entre otras. El valor de
velocidad media del proceso de biorremediación del área de manejo fue de 245,0±35,7
mg⋅(kg⋅h)-1
Los modelos de degradación para cada observación concuerdan con cinéticas de primer
orden, lo cual está relacionado con el mecanismo de degradación. La oxidación de los HTP
ocurre inicialmente mediante un mecanismo de metil-oxidación, proceso que en este caso
es muy rápido y el paso limitante es la β-oxidación representada por el coeficiente de
primer orden (Head, 1998).
A partir de los modelos cinéticos resultantes y la velocidad de los procesos de degradación
para cada uno de las parcelas, es poco probable que ocurran mecanismos de ∝-oxidación
y ω-oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia degradativa de los
microorganismos frente a los hidrocarburos (Head, 1998).
BIOIL-FC es un compuesto basado en células libres que utiliza los hidrocarburos del
petróleo en la síntesis de material celular para la multiplicación, acompañado de un gran
requerimiento energético. Mediante este mecanismo se obtiene acetil-Coa, que se
incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de
compuestos esenciales y la obtención de energía.
50
Capítulo III. Resultados y Discusión
Análisis cinéticos de fracciones del petróleo fueron realizados por Núñez (2003) y
Cabranes (2006), demostrando que los mecanismos más utilizados por las cepas
integrantes del BIOIL-FC, eran la metil y la β-oxidación, lo que corrobora los resultados
obtenidos en esta experiencia.
3.4.2. Análisis de la concentración de las fracciones saturadas, aromáticas, resinas y
asfalténicas
Los resultados de la biorremediación de los suelos contaminados demuestran una
significativa reducción de las cuatro fracciones fundamentales y más aún de las resinas y
asfaltenos típica de un petróleo añejado y que son las fracciones más complejas y difíciles
de degradar por los microorganismos. En todos los casos se lograron disminuir los niveles
de estas fracciones por debajo de la norma (SEMARNAT, 2003).
Tabla 11. Resultados de los análisis de SARA para las parcelas del área de
biorremediación antes y 120 días después del tratamiento con BIOIL-FC.
Observaciones
1
2
3
t(días)
Saturados
(mg·Kg-1)
Aromáticos
(mg·Kg-1)
Resinas
(mg·Kg-1)
Asfaltenos
(mg·Kg-1)
0
14180,0
21270,0
16140,0
29290,0
120
610,0
2245,0
2060,0
4879,0
Remoción(%)
95,7
7020,0
863,0
89,4
19540,0
3680,0
87,2
16950,0
2630,0
83,3
30906,0
8665,0
87,7
15270,0
980,0
93,6
20940,0
870,0
95,9
14340,0
743,0
94,8
7220,0
213,0
97,1
9900,0
81,2
16800,0
856,0
94,9
20940,0
1345,0
93,6
19120,0
1098,0
94,3
9630,0
709,0
92,6
21840,0
84,5
13660,0
1897,0
86,1
15678,0
3109,0
80,2
13980,0
1089,0
92,2
10320,0
993,0
90,4
17520,0
72,0
21310,0
3324,0
84,4
22980,0
5690,0
75,2
20083,0
3492,0
82,6
25009,0
4400,0
82,4
42380,0
0
120
Remoción(%)
0
120
Remoción(%)
0
4
120
Remoción(%)
0
5
120
Remoción(%)
0
6
120
Remoción(%)
0
7
51
Capítulo III. Resultados y Discusión
120
Remoción(%)
245,0
97,5
2290,0
89,5
2034,0
88,4
8765,0
79,3
En la tabla se observa un decrecimiento de los porcentajes de remoción en función de la
complejidad de las fracciones, desde Saturados hasta Asfaltenos. Es importante destacar
los altos porcientos de remoción (mayor que 70%) para la fracción asfalténica, dada su
complejidad y persistencia en los ecosistemas. La degradación de los compuestos del
petróleo por microorganismos se lleva a cabo secuencialmente en este orden: n-parafinas,
isoparafinas, aromáticos, naftalenos, resinas y asfaltenos, a través de mecanismos de metil
y β-oxidación (Lee and Levy, 1989; Magot et al., 2000), similar al mecanismo de los
operones referidos por Madigan et al., (2003).
Sin embargo al utilizar el BIOIL-FC esta secuencia de degradación se favorece pues se
utiliza un cultivo mixto que aunque utiliza una estrategia de degradación similar la misma
ocurre simultáneamente en todas las fracciones en dependencia de la afinidad de cada
una de las cepas por las diferentes fracciones (Núñez, 2003).
A continuación se presentan los valores de velocidad para cada una de las fracciones.
Tabla 12. Valor modular de la velocidad de degradación de cada una de las fracciones en
el proceso de de biorremediación con BIOIL-FC, utilizando diferentes modelos cinéticos de
primer y segundo orden.
Observaciones
Saturados
Aromáticos
Resinas
Asfaltenos
Metil
β
R2
β
R2
β
R2
β
R2
1
0,98
229,20
0,99
155,00
0,99
120,00
0,97
197,90
0,98
2
0,15
1,64
2,00
52,63
310,00
402,50
0,99
0,99
0,99
122,00
133,80
159,10
0,96
0,98
0,98
120,00
95,60
102,70
0,98
0,98
0,99
188,20
146,10
146,20
0,99
0,99
0,99
1,65
0,70
1,03
302,20
138,60
200,60
0,97
0,98
0,99
158,00
147,30
73,23
0,99
0,98
0,96
109,50
80,98
125,60
0,97
0,99
0,99
139,20
168,00
283,90
0,99
0,97
0,99
3
4
5
6
7
La degradación de los compuestos del petróleo se realiza mediante mecanismos de metil y
β-oxidación (Lee and Levy, 1989; Magot et al., 2000), además, durante la biodegradación
52
Capítulo III. Resultados y Discusión
de los petróleos asfalténicos no sólo ocurren estos mecanismos clásicos de oxidación que
son más eficientes. También ocurren los mecanismos de α y ω oxidación, donde los
compuestos intermediarios que se obtienen son más largos y por ello el proceso de
biodegradación necesitará más tiempo que durante la oxidación de petróleos ligeros.
A partir de los modelos cinéticos resultantes y la velocidad de los procesos de degradación
para cada uno de los sustratos ensayados, es poco probable que ocurran mecanismos de
∝-oxidación y ω-oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia
degradativa de los microorganismos frente a los hidrocarburos (Head, 1998).
El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos es la metil-oxidación,
sin embargo de forma similar a lo ocurrido con el análisis de hidrocarburos totales, este
paso no es limitante para la bioxidación de las fracciones de Aromáticos, Resinas y
Asfaltenos, siendo limitado el proceso fundamentalmente por la β-oxidación, quien permite
que sea una biodegradación eficiente para mineralización de los compuestos del petróleo.
A diferencia de estas fracciones, para la fracción de Saturados ajustan a un modelo
cinético de segundo orden donde el coeficiente cuadrático se corresponde con la velocidad
a la cual ocurre el mecanismo de metil-oxidación. Esto puede estar asociado con la
utilización de un cultivo mixto (BIOIL- FC) que dado el diseño del mismo se crean
competencias entre las cepas que lo integran y las obligan a degradar todas las fracciones
simultáneamente, por lo cual durante la degradación de las fracciones aromáticas, resinas
y asfalténicas se obtienen intermediarios saturados y nafténicos ocurriendo un
solapamiento en la degradación y la formación de compuestos Saturados (Núñez, 2003).
Es por ello que las velocidades de ambos mecanismos son significativas en la degradación
de esta fracción que aparentemente es la más simple.
Sin embargo en las células libres se observó que el valor modular del coeficiente
correspondiente a la β-oxidación es mayor que en las células inmovilizadas (tabla 12). En
las primeras se requiere de la síntesis de material celular para la multiplicación,
acompañado de un gran requerimiento energético. Mediante este mecanismo se obtiene
acetil-Coa, que se incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para
garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.
El paso determinante en la velocidad de degradación de los hidrocarburos evaluados es la
metil-oxidación. El coeficiente de este mecanismo es mayor en las células inmovilizadas,
53
Capítulo III. Resultados y Discusión
por lo que la velocidad global del proceso de biodegradación es mayor en estas
condiciones.
La superioridad de la degradación de petróleo, cuando se lleva a cabo por cultivos mixtos
exógenos (bioaumentación), está dada por una mayor velocidad de degradación por el uso
de poblaciones grandes de bacterias que garantizan la acción microbiana tanto en
hidrocarburos gaseosos como líquidos y sólidos de las series alifáticas, aromáticas, resinas
y asfalténicas de forma simultánea más eficiente que con cultivos puros al aprovechar la
competencias que se crean entre sus integrantes (Sirvins and Tramier, 1985).
Estos elementos demuestran una rápida respuesta de la biomasa bacteriana añadida, lo
cual posibilitó la recuperación del ecosistema afectado en sólo 120 días. En contraste con
los resultados obtenidos en el tratamiento de derrames por bioestimulación, que la
mitigación de los daños ocasionados requiere varios meses y hasta años.
Los resultados obtenidos con la aplicación del BIOIL-FC, resultan notablemente eficientes
no sólo al compararlos con valores referidos en la literatura, sino al tener en cuenta que los
residuos de hidrocarburos permanecieron durante más de 10 años en las áreas antes de la
aplicación del tratamiento.
3.5. Análisis ecotoxicológico
Los resultados obtenidos de los ensayos ecotoxicológicos realizados para cada una de las
observaciones se describen en el anexo 9.
3.5.1. Determinación de la fitotoxicidad sobre la germinación de semillas en frijol y
maíz
El la figura 8 se comparan los resultados de los ensayos de germinación de frijol (Faciola
Vulgaris) y maíz (Zea Maíz) de una muestra patrón contra las muestras obtenidas a los 90
y 120 días de aplicado el proceso de biorremediación con BIOIL-FC.
54
Capítulo III. Resultados y Discusión
15
Germinación (Frijol)
22
20
14
18
Rango Promedio
13
Rango Promedio
Germinación (Maíz)
12
11
10
9
16
14
12
10
8
6
8
Patrón
90 días
120 días
Muestras
Patrón
90 días
120 días
Muestras
Figura 8. Rango promedio de germinación de semillas de frijol y maíz, obtenidos a los 90 y
120 días de aplicado el bioproducto BIOIL-FC.
Como se puede apreciar en la figura, a los 90 días de tratamiento es evidente que aún las
concentraciones de hidrocarburos no permiten la absorción de nutrientes por parte de las
semillas evaluadas en suelos con tales características. Sin embargo, a los 120 días la
germinación se comportó de forma similar a las obtenidas en los controles; evidenciando
una recuperación de la capacidad de absorción de agua por parte de la semillas y la no
presencia de componentes tóxicos en el medio que inhiban el proceso de germinación. Tal
comportamiento es coincidente con la disminución de las concentraciones de HTP y cada
una de sus fracciones fundamentales en el suelo, reportados en los análisis físico-químicos
discutidos en el epígrafe 3.4.
3.5.2. Ensayos de fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento en plantas terrestres
3.5.2.1. Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de frijol
55
Capítulo III. Resultados y Discusión
Altura de la Planta
10.0
22
20
16
14
12
2.0
8.0
7.5
10
1.5
1.0
7.0
8
0.5
6.5
6
4
6.0
Patrón
0.45
0 días
90 días
Muestras
120 días
0.0
Patrón
Peso Seco Planta
0.40
0.32
0.35
0 días
90 días
Muestras
120 días
Patrón
24
Peso Húmedo Raíz
0 días
90 días
Muestras
120 días
Materia Seca Planta
22
20
0.30
18
0.25
0.20
Porciento (%)
Peso (g)
0.30
0.28
0.26
0.15
16
14
12
10
0.24
0.10
8
6
0.22
0.05
Patrón
16
Peso Húmedo Planta
2.5
8.5
Largo (cm)
Altura (cm)
3.0
9.0
18
Peso (g)
Largo de la Raíz
9.5
Peso (g)
24
0 días
90 días
Muestras
Patrón
120 días
Materia Seca Raíz
0 días
90 días
Muestras
Patrón
120 días
6
Nitrógeno Total
22
0 días
90 días
Muestras
120 días
Proteína Bruta
20
14
10
8
16
Porciento (%)
Porciento (%)
Porciento (%)
18
12
14
12
10
8
4
2
6
6
4
Patrón
0 días
90 días
Muestras
120 días
Patrón
0 días
90 días
Muestras
120 días
Patrón
0 días
90 días
Muestras
120 días
Figura 9. Ensayos de toxicidad del suelo sobre el crecimiento de frijol, obtenidos durante el
proceso de tratamiento con BIOIL-FC.
El análisis integral de los parámetros que pondera el estudio para brindar un criterio sobre
el posible efecto tóxico agudo, y su influencia sobre el crecimiento del fríjol; comparando,
como muestra en la figura 9, el suelo patrón con los resultantes del tratamiento a los 0, 90
y 120 días, demuestra que para el suelo sin tratamiento disminuyen significativamente la
altura de la planta, el largo de la raíz, el peso húmedo de la raíz, el % de materia seca de la
raíz, el % de nitrógeno total y el % de proteína bruta de la planta. Así, aumenta
significativamente el peso húmedo de la raíz y el % de materia seca de la planta, no se
afecta el peso seco de la planta, ni el peso seco de la raíz.
Similar análisis, pero para el suelo biorremediado a los a los 90 días, nos muestra que la
planta no recupera la altura, el largo de la raíz, el peso húmedo de la planta, el % de
56
Capítulo III. Resultados y Discusión
nitrógeno total y el % de proteína bruta. Sin embargo, recupera el % de materia seca de la
raíz y aumenta significativamente el peso húmedo y seco de la raíz.
En el suelo biorremediado a los 120 días no se restablece ni el % de nitrógeno total y ni el
% de proteína bruta; pero si se restablecen la altura de la planta, el largo de la raíz, el % de
materia seca de la raíz, el % de materia seca de la planta y aumenta significativamente el
peso húmedo y seco de la panta y la raíz.
El análisis integral de los resultados antes expuestos, para la especie estudiada y bajo
dichas condiciones experimentales, nos sugiere que el proceso de biorremediación
contribuye significativamente en la restauración de las características iníciales del
compartimiento ambiental tratado; demostrado a través de la viabilidad que muestra el
mismo en el proceso de crecimiento de la planta ensayada, medido a través de las
variables que directamente miden el grado de toxicidad.
3.5.2.2. Determinación de la fitotoxicidad del suelo sobre el crecimiento de maíz.
La evaluación del estudio de toxicidad sobre el crecimiento de maíz, como se aprecia en la
figura 10; sugiere que el suelo sin tratamiento disminuye significativamente el peso
húmedo de la planta, pero aumenta significativamente el largo de la raíz, no afecta la altura
de la planta, el peso seco de la planta, el peso húmedo de la raíz, el peso seco de la raíz, y
el % de materia seca de la planta y de la raíz.
En el suelo biorremediado a los a los 90 días, observamos que no se recupera ni el largo
ni el peso húmedo de la raíz; mientras que en este mismo estudio, pero a los 120 días, se
restablece el largo y el peso húmedo de la raíz. Parámetros afectados, como se indicó
anteriormente, en la muestra inicial y a los 90 días.
El análisis integral de los parámetros que dan una medida de la toxicidad, bajo las
condiciones de este experimento, nos muestra que estos resultados son coincidentes con
los ensayos descritos para Faciola Vulgaris.
57
Altura de la Planta
34
30
Peso (g)
28
16
14
24
20
10
0 días
90 días
Muestras
120 días
18
Patrón
24
Peso Seco Planta
22
0 días
90 días
Muestras
Patrón
120 días
10.0
Peso Húmedo Raíz
18
Peso (g)
2.2
0 días
90 días
Muestras
120 días
Materia Seca Planta
9.5
20
2.0
9.0
16
14
12
8.5
8.0
10
7.5
8
1.8
6
0 días
90 días
Muestras
4.0
Materia Seca Raíz
3.8
Porciento (%)
20
18
16
7.0
Patrón
120 días
0 días
90 días
Muestras
120 días
0 días
90 días
Muestras
120 días
23
Nitrógeno Total
21
3.4
20
3.2
3.0
2.8
2.6
0 días
90 días
Muestras
120 días
Proteína Bruta
22
3.6
19
18
17
16
2.4
15
2.2
14
13
2.0
Patrón
Patrón
Porciento (%)
Patrón
Porciento (%)
26
22
12
2.4
22
Peso Húmedo Planta
32
18
2.6
Peso (g)
Largo de la Raíz
20
Patrón
2.8
22
Porciento (%)
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
Largo (cm)
Altura (cm)
Capítulo III. Resultados y Discusión
Patrón
0 días
90 días
Muestras
120 días
Patrón
0 días
90 días
Muestras
120 días
Figura 10. Ensayos de toxicidad del suelo sobre el crecimiento de maíz, obtenidos durante
el proceso de tratamiento con BIOIL-FC.
3.6. Análisis costo-beneficio
Los resultados obtenidos de la determinación de los costos e ingresos para el cálculo de
los indicadores dinámicos de rentabilidad del proyecto, se describen en el anexo 4.
El Valor Neto Agregado (VAN) fue mayor que cero en condiciones normales de ejecución
del proyecto ($37674.61), mientras que la tasa Interna de Rentabilidad (TIR) fue superior a
la tasa de interés normal en el mercado de capitales (20-25%), como se puede observar en
la tabla 13.
58
Capítulo III. Resultados y Discusión
Tabla 13. Valores de la Tasa Interna de Rentabilidad para condiciones normales de
ejecución del proyecto de biorremediación y para posibles fluctuaciones de los ingresos
(±30%).
TIR (%)
Fluctuación de ingresos (%)
41
-30
23
0
95
+30
Del análisis de la tabla anterior se deduce que el proyecto no es sensible a las posibles
variaciones de las tasas de intereses, incluso con una reducción de hasta un 30% de sus
ingresos planificados.
En las figuras 11 y 12 se representan los Períodos de Recuperación de la Inversión (PRD)
para condiciones normales de ejecución del proyecto y para una disminución del 30% de
los ingresos planificados.
$100,000.00
Flujo de caja acumulado
$80,000.00
$60,000.00
$40,000.00
$20,000.00
Flujo de caja
acumulado
$0.00
-$20,000.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-$40,000.00
-$60,000.00
Meses
Figura 11. Período de recuperación de la Inversión en condiciones normales de ejecución
del proyecto de biorremediación.
59
Capítulo III. Resultados y Discusión
$30,000.00
Flujo de caja acumulado
$20,000.00
$10,000.00
$0.00
-$10,000.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Flujo de caja
acumulado
-$20,000.00
-$30,000.00
-$40,000.00
-$50,000.00
Meses
Figura 12. Período de recuperación de la Inversión para una disminución del 30% de los
ingresos planificados del proyecto de biorremediación.
Del análisis de la figura 11 se deduce que es posible recuperar la inversión en un término
no mayor de dos meses y medio (PRD= 2,4) bajo condiciones normales de ejecución del
proyecto. Así, la figura 12 nos indica que con una disminución del 30% de los ingresos
planificados es posible recuperar la inversión apenas en un término inferior a tres meses y
medio (PRD=3,3).
El análisis de sensibilidad a los ingresos (figura 13) corroboró los resultados obtenidos del
cálculo de los indicadores dinámicos de rentabilidad.
80000.0
Flujo de caja acumulado
70000.0
60000.0
50000.0
40000.0
Ingresos
30000.0
20000.0
10000.0
0.0
-40
-20
0
20
40
Porciento de Ingresos (%)
Figura 13. Análisis de sensibilidad a los ingresos del proyecto de biorremediación.
60
Capítulo III. Resultados y Discusión
Del análisis de sensibilidad para posibles fluctuaciones de la inversión resultó que el VAN
siempre es positivo incluso para fluctuaciones por debajo del 30%de los ingresos, lo que
conjuntamente con el análisis de la Tasa Interna de Rentabilidad y el Período de
Recuperación de la Inversión nos permite aseverar que el proyecto de biorremediación de
suelos contaminados con hidrocarburos es económicamente factible.
61
Conclusiones
CONCLUSIONES
1. El diseño de las parcelas de biorremediación resultó ser adecuado para el tratamiento
de los 479m3 de residual petrolizado; lográndose las condiciones idóneas de
homogeneidad, aireación y humedad del medio, lo que propició una actividad
metabólica óptima de los microorganismos hidrocarbonoclastas aerobios.
2. El cultivo semicontinuo a escala de producción, permitió fermentar y aplicar 76 640L de
BIOIL-FC en solo 40h, obteniéndose concentraciones de biomasa en el orden de
108cel·mL-1 para cada incremento, y una velocidad específica de crecimiento promedio
de 0,415 ± 0,050h-1, similar a las obtenidas en las escalas de zaranda, botellones y
800L respectivamente.
3. Los análisis microbiológicos iníciales revelaron niveles de bacterias heterótrofas (BHT)
en el orden de 105 y 106cel·mL-1, mientras que las concentraciones de bacterias
degradadoras de petróleo (BDP) estuvieron en el orden de 104cel·mL-1. Posterior a la
aplicación del BIOIL-FC se produjo un incremento de BDP (106cel·mL-1), llegando a
predominar en el total de la población de heterótrofos totales.
4. Al finalizar
el tratamiento se produjo de una disminución
significativa las
concentraciones de BDP (105cel·mL-1), relacionado con una reducción considerable de
las concentraciones de hidrocarburos del petróleo en cada una de las parcelas de
biorremediación.
5. Se logró una reducción significativa de los niveles de hidrocarburos totales del petróleo
(HTP) a los 120 días posteriores a la aplicación del BIOIL-FC; obteniéndose
porcentajes de remoción superiores al 90%.
6. Las concentraciones de HTP obtenidas en cada una de las parcelas analizadas fueron
inferiores a 2 845mg·kg-1, valores que no superan los límites máximos permisibles
establecidos por la norma (SEMARNAT, 2003) .
7.
Se obtuvieron porcentajes de remoción superiores al 70% de las fracciones pesadas y
superiores al 90% de las fracciones medias y ligeras, obteniéndose en cada una de las
parcelas analizadas valores de concentración inferiores a 6 000 y 3 000 mg·kg-1
respectivamente, inferiores a los límites máximos permisibles establecidos por la
norma (SEMARNAT, 2003).
8. La velocidad media de degradación de HTP fue de 245,0±35,7mg⋅(kg⋅h)-1 mientras que
para las fracciones fundamentales del petróleo (SARA) se reportaron velocidades
62
Conclusiones
medias de degradación en el orden de 233,7±86,6; 135,5±22,7 ;107,8±11,8 y
181,4±37,4mg⋅(kg⋅h) -1 respectivamente; mediantes mecanismos de
metil y β-
oxidación.
9.
Los resultados obtenidos de los ensayos de germinación de semillas para frijol y maíz
a los 120 días, demostraron una recuperación de la capacidad de absorción de agua
por parte de las semillas y la no presencia de componentes tóxicos en el medio que
inhibiesen la germinación, de manera similar a los resultados obtenidos en el control
utilizado.
10. Las pruebas de fitotoxicidad sobre el crecimiento apara ambas especies tuvieron un
comportamiento similar , restableciéndose a los 120 días la altura de la planta, el largo
de la raíz, el % de materia seca de la raíz, el % de materia seca de la planta, el peso
húmedo y seco de la panta y la raíz. Lo que demuestra una recuperación de las
características iníciales del compartimiento ambiental tratado.
11. Los resultados microbiológicos, fisicoquímicos y ecotoxicológicos obtenidos en el
proceso de biorremediación con BIOIL-FC, unido a los resultados del análisis costobeneficio, con un VAN de $37674,61 una TIR de 60% y un PRD de 2,4 meses
demuestran que el proyecto de saneamiento de suelos contaminados con
hidrocarburos por métodos biocorrectivos en la península de “Punta Majagua”, es
factible tanto desde el puno de vista ambiental como económico.
63
Recomendaciones
RECOMENDACIONES
1. Complementar los estudios de toxicidad del residual con la implementación de otros
ensayos toxicológicos en organismos vivos y con el monitoreo de metales pesados
componentes del petróleo como criterio de disposición final.
2. Proseguir con el monitoreo de bacterias degradadoras hasta alcanzar concentraciones
similares a las existentes antes de la aplicación de BIOIL FC.
3. Hacer extensivo este tipo de tratamiento en otras zonas contaminadas con
hidrocarburos en el país.
64
Bibliografía
BIBLIOGRAFÍA
La bibliografía ha sido compilada utilizando el Software EndNote X 4, versión del sistema
Harvard Author-Date.
ADAMS, R. H., ÁLVAREZ, A. L., ESCALANTE, E. & GUTIÉRREZ, M. 2006. Dose - Response
Relationship of Organisms in Soil with Heavily Weathered Hydrocarbons and Changes in
Fertility Parameters. in: 13th Int. Environmental Petroleum Conference, San Antonio, Texas,
EEUU, pp. 16-20.
AGGAEWAL, P. K., FULLER, M. E., GURGAS, M. M., MANNING, J. F. & DILLON, M. A. 1997. Use
os stable iso-tope analyses for monitoring the pathways and rates of intrinsic and enhanced
in situ biodegra-dation, Environ. Sci. Technol, vol. 31, pp. 590-596.
AIBA, S., HUMPHREY, A. & MILLIS, N. 1973. Biochemical Engineering. , Academic Press, New
York.
AL-GOUNAIM, M. Y. & DIAB, A. 1998. Ecological Distribution and Biodegradational Activities of OilDegrading Marine Bacteria in the Arabian Gulf Water at Kuwait, Arab-Gulf-J-Sci-Res, vol.
16, no. 2, pp. 359-377
ALDRETT, S., BONNER, J. S., MCDONAL, T. J., MILLS, M. A. & AUTENRIETH, R. L. 1997.
Degradation of Crude Oil Enhanced by Commercial Microbial Cultures. in: 1997 International
Oil Spill Conference, American Petroleum Institute, Washington D.C, pp. 995-996.
ALEXANDER, M. 1994. Biodegradation and bioremediation. San Diego: Academic Press.
ALEXANDER, M. 1997. Introduction into soil microbiology, John Wiley & Sons, New York.
ALEXANDER, M. 1999. Biodegradation and Bioremediation,Segunda edición, Academic Press,
Inc.,San Diego,
ANDERSSON, A., WALLBERG, P., NORDBAECK, J., BERGQVIST, P. & SELSTAM, E. 1998.
Effect of nutrient enrichment in the distribution and sedimentation of polychlorinated
biphenils (PCB) in sea wa-ter, Hydrobiol, vol. 337, no. 1-3, pp. 45-56.
ARREJURÍA, F. 1994. Noche negra. Hombre Internacional. pp. 48-51.
ATLAS, R. M. 1993. Handbook of Microbiological Media, CRC press, Boca Raton, Fl.
ATLAS, R. M. 1995. Petroleum biodegradation and oil spill bioremediation, Mar Poll Bull, no. 31,
pp.178-182.
ATLAS, R. M. & BARTHA, R. 1997. Microbial Ecology, fundamentals and applications,
Benjamin/Cummings Publishing Company, Redwood City, CA.
ATLAS, R. M. & BRONNER, A. 1881. Microbial hydrocarbondegradation within interdial zones
impacted by the “Amoco Cadiz” oil spillage”. “Amoco Cadiz” consequeences d une pollution
accidentelle par hydrocarbures, COLLOQUES, P. S. A. D., pp. 251-256.
65
Bibliografía
AYELÉN, M. 2008. Crecimiento vegetal en suelos biorremediados con enmiendas orgánicas en el
NO de Patagonia. Tesis de Licenciatura. Comahue. Comahue, Facultad de Ingeniería,
Departamento de Ingeniería, Universidad Nacional del Comahue.
BAHERI, H. & MEYSAMI, P. 2002. Feasibility of Fungi Bioaugmentation in Composting a Flare Pit
Soil, Journal of Hazardous Materials, vol. 89, no. 2-3, pp. 279-286.
BARTHA, R. 1986. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation. in: Microb. Ecol, pp. 156172.
BERGUEIRO, J. R. & DOMÍNGUEZ, F. 1996. Evaporación de mezclas de hidrocarburos, no. 11,
pp. 300-304.
BERMÚDEZ, J., CASTRO, Y., CASTRO, D. & POMA, J. R. 2011. Biorremediación de Arollo la
Bomba. Cienfuegos. Informe de Servicios. Cienfuegos: CEAC.
BIOTECHNOLOGY,
O.
2001.
About
Biorremediation
[Online].
Available:
http://www.obio.com/bioremediation.htm [Accessed Abril, 12, 2010].
BOSMA, T. N., MIDDELDORP, J. M., SCHRAA, G. & ZENDER, J. B. 1997. Mass transfer limitation
of biotransformation: quantifying bioavailability, Env. Sci. Technol, vol. 31, pp. 248 -252.
BOSSERT, I. D. & BARTHA, R. 1984. The fate of petroleum in soil ecosystems. In R. M. Atlas, (ed),
Petroleum microbiology. MacMillan Publishing Co. New York, pp. 453-473.
BRADY, N. & WEIL, R. 2008. The Nature and Properties of Soils, Pearson-Prentice Hall,Upper
Saddle River, New York.
BUBUDA, C. 2004. Muestro de suelos. Criterios Básicos, laboratirio de Suelos. CIEFAP-UNPSJB,
Buenos Aires, no.1, pp. 1-4.
CABRANES, Y. 2006. Cinetica de degradación de hidrocarburos del petroleo por Bacillus
alcalophilus cepa CBM-225. Tesis de Maestria. La Habana. La Habana, Facultad de
Biología, Universidad de la Habana.
CASTRO, Y. & BERMÚDEZ, J. 2011. Diagnóstico Inicial. Empresa Comercializadora de
Combustible de Matanzas Informe de Servicios. Cienfuegos: CEAC.
CEAC 2008. Muestreo de Contaminantes Orgánicos (L-SA-50), Centro de Estudios Ambientales de
Cienfuegos, Cienfuegos.
CEAC 2010a. Determinación de Hidrocarburos Totales en suelos. Método gravimétrico (L-SA-507),
Centro de Estudios Ambientales, Cienfuegos.
CEAC 2010b. Determinación de SARA en aguas, suelos y sedimentos contaminados. (L-SA-510 ),
Centro de Estudios Ambientales, Cienfuegos.
CLARK, R. & BROWN, D. W. 1997. Petroleum: properties and analyses in biotic and
abioticsystems. En : D. C. Malins (Ed.), Effects of Petroleum on arctic and subarctic
environments and organisms. Academic Press Inc. London, pp. 1-75.
66
Bibliografía
CHAINEAU, C. & OUDOT, J. L. 1995. Microbial degradation in soil microcosmos of fueloil
hydrocarbons from drilling cuttings, Env. Sci. Technol, vol. 29, pp. 1615-1621.
CHIOU, C. T., MCGRODDY, S. E. & KILE, D. E. 1998. Partition Characteristics of Polycyclic
Aromatic Hydrocrabons on Soils and Sediments, Environmental Science Technology
Journal, vol. 32, no. 2, pp. 264-269.
DALY, K., DIXON, A. C., SWANNELL, R. P., LEPO, J. E. & HEAD, I. M. 1997. Diversity among
aromatic hydrocarbon-degrading bacteria and their meta-cleavage genes Appl. Microbiol,
vol. 83, pp. 421-429.
DÁVALOS, L. 2010. Dossier: Accidente de la plataforma Deepwater Horizon [Online]. Caracas.
Available: http://caracas1067.wordpress.com/ambiente/dossier-accidente-de-la-plataformadeepwater-horizon/ [Accessed Junio,2 2010].
DEJONGHE, W. N., BOON, D., SEGHERS, E., TOP, M. & VERSTRAETE, W. 2001.
Bioaugmentation of soils by increasing microbial richness: missing links, Env. Microbio, vol.
3, pp. 649-65.
DEUREN, J. V., LOYD, T., CHHETRY, S., LIOU, R. & PECK, J. 2000. Remediation technologies
screening matrix and reference guide
[Online]. FRTR. [Accessed 22 de Diciembre, 2011].
DIBBLE, J. & BARTHA, R. 1979. Effect of environmental parameters on biodegradation of oil slidge
. 37:729-39., Appl. Environm. Microbiol, vol. 37, pp. 729-739.
ENGELHARDT, M. A., DALY, K., SWANNELL, R. P. & HEAD, I. M. 2001. Isolation and
characterization of a novel hydrocarbon-degrading, Gram-positive bacterium, isolated from
intertidal beach sedi-ment, and description of Planococcus alkanoclasticus sp, J Appl
Microbiol, vol. 90, no. 2, pp. 237-247.
EPA 1984. Terrestrial plants, growth test (OECD-208), Environmental Protection Agency, USS.
EPA 1996. Ecological Effects Test Guideline. Seed Germination / Root Elongation Toxicity Test
(OPPTS 850.4200), Environmental Protection Agency, USS.
EPA 1998. N-hexane extractable material (hem) for sludge, sediment, and solid samples (Method
9071b), Environmental Protection Agency, USS.
ERCOLI, E. C. 1999. Biorremediación de suelos altamente contaminados. in: Ingep, 3º International
Seminar, Lima, Perú.,
EWEIS, J., ERGAS, D., CHAG, E. & SCHOROEDER, E. 1999. Principios de Biorrecuperación,
Madrid, España.
FERNÁNDEZ, L., ROJAS, N. & ROLDAN, T. 2007. Manual de técnicas de análisis de suelos
aplicadas a la remediación de sitios contaminados Instituto mexicano del Petroleo, México
DF.
67
Bibliografía
FINNERTY, N. R. 1994. Biosurfactants in enviromental Biotechnology, Curr. Opin. Biotechnol, vol.
5, no. 3, pp. 291-295.
FONSECA, E. L. 1998. BIOIL: Bioproducto para combatir derrames de petróleo en el mar. Tesis de
Maestría. La Habana, Facultad de Biología, Universidad de la Habana.
FONSECA, E. L., BELLOTA, M., VILLAVERDE, M., MARTÍNEZ, J., NÚÑEZ, R., RIVERÓN, L. A.,
JOSEPH, N. & FUENTES, M. 1994. Tratamiento de un derrame de petróleo combustible en
la Bahía de Cienfuegos, Cuba. Archivo Científico. OCIM. Instituto de Oceanología. .
FUSH, E. & PONSFORD, H. I. 1912. Reportado por Santiago, G.; Hereguini, O.; Matey, P. y Pérez,
A. (1978). Degradación bacteriana de hidrocarburos. Bol. Inst. Español Oceanogr., vol. 4,
no. 263, pp. 96-104. .
GENOUW, G., DE NAEYER, F., VAN MEENEN, P., VAN DEWERF, H., DE NIJS, W. &
VERSTRAETE, W. 1994. Degradation of oil sludge by landfarming- a case study at the
Ghent harbor. Biodegradation. vol. 5, pp. 37-46.
GRISHCHENKOV, V., TOWNSEND, R. T., MCDONALD, T. J., AUTENRIETH, R. L., BONNER Y, J.
S. & BORONIN, A. M. 2000. .Degradation of petroleum hydrocarbons by facultative
anaerobic bacteria under aerobic and anaerobic conditions, Process Biochemistry (Oxford),
vol. 35, pp. 889-896.
HAINES, J., WRENN, B. A., HOLDER, E. L., STROHMEIRER, K. L., HERRINGTON, R. T. &
VENOSA, A. D. 1996. Measurement of hydrocarbin-degrading microbial populations by a
96-well mostprobable-numerprocedure, Ind. Microbio, vol. 16, no. 1, pp. 36-41.
HARAYAMA, S., KISHIRA, H., KASA, Y. & SHUTSUBO, K. 1999. Petroleum biodergadation in
marine environments, J. Mol. Microbiol. Biotechnol, vol 1, pp. 63-70.
HARMS, H. & BOSMA, T. M. 1996. Mass transfer limitation of microbial growth and pollutant
degradation, J. Ind. Microbiol, vol. 16, pp. 1-9.
HARRIGAN, W. & MC CANCE, M. E. 1968. Métodos de Laboratorio en Microbiología. Academia
León. España.
HEAD, I. 1998. Bioremediation: toward a credible technology. Microbiol, vol. 44, pp. 599-608.
HERBERT, B. E., MCDONALD, T. J., CONTI, E. & MOFFITT, A. E. 1996. Quantification of in situ
polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation usig conservative internal markers.
American Chemical Society, Division of Enviromental Chemistry, Extended Abstracts, vol.
36, pp. 200-202.
HOLLIGER, C. & CENDER, A. J. 1996. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons, Cur. Opin.
Biotechnol, vol. 7, pp. 326-330.
HOWE-GRANT, M. 1996. Petroleum, Wiley Inerscience Publication, New York.
ICA 1992. Fertilización en diversos cultivos,Quinta aproximación,Produmedios, Santafé de Bogotá.
68
Bibliografía
INTA 1984. Normas de muestreo de suelos para análisis de fertilidad. EEA Bordenave. Circular de
extensión 17.
ISO4833 1991. (E). International Standard. Microbiology-general guidance for the enumeration of
micro organism colony count technique at 30 °C.
JOSEPH, N., CAPÓ, M. C., BELLOTA, M., RAMOS, Y. & FUENTES, M. 1994. Aislamiento y
selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos en la plataforma cubana,
Ciencias Biológicas. Microbiología, vol. 27.
KANALY, R. A., BARTHA, R., WATANABE, K. & HARAYAMA, S. 2000. Rapid mineralization of
benzo[a]pyrene by a microbial consortium growing on diesel fuel, Appl Environ Microbiol,
vol. 66, no. 10, pp. 4205-4211.
KÄSTNER, M. 2000. Humification: process or formation of refractory soil organic matter.in J.Klein
(Ed),
Biotechnology.
Environmental
processes
II,Soil
decontamination,
Wiley-
VCH,Weinheim, pp. 89-126.
LADD, J. N., FOSTER, R. C., NANNIPIERI, P. & OADES, J. M. 1996. Soil structure and biological
activity. Soil Biochem, pp. 23-78.
LEE, K. & LEVY, E. M. 1989. Enhancement of the natural biodegradation of condensate and crude
oil on beaches of Atlantic Canada. Proceedings of the Oil Spill Conference, American
Petroleum Institute. Washington, D.C, pp 479-487.
LEE, K. & TREMBLAY, G. H. 1995. Biorremediation of oiled beach sediments. Assessment of inorganic and organic fertilizers, evolving technologics. in: Oil spill Conference, pp. 07-112.
LIM, S. T. & HALOS, P. S. M. 1997. Solation, characterization and determination of bioremediation
po-tential of oil-degrading bacteria from the Manila Bay [Philippines], Philippine J. Biotech,
vol. 6, no. 1, pp. 1-12.
LIU, Z., JACOBSON, A. M. & LUTHY, R. G. 1995. Biodegradation of naphtalene in aqueous nonionic surfactant system, Appl. Envirom. Microbiol, vol. 63, pp. 270-276.
LÓPEZ, S. J. & GÓDIA, C. F. 1998. Ingeniería Bioquímica, SINTESIS, S.A. .
LUQUE, J., AMARI, M., NAKAMATSU, V., CIANO, N. & MACKEPRANG, O. 1998. Saneamiento de
un área de derrames de HC mediante la biodegradación. Ade inyección directa CG-FIDs in:
Asociación Argentina de la Ciencia del Suelo, XVI Congreso Argentino de la Ciencia del
Suelo. Carlos Paz., pp.325.
MACKAY, N. & BETTS, W. B. 1991. The fate of chemicals in soil. In W. B. Betts
(Ed),Biodegradation: natural and synthetic materials, Springer Verlag. London, pp. 89-117.
MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M. & PARKER, J. 2003. Brock. Biología de los Microorganismos,
Pearson Educación, Madrid.
69
Bibliografía
MAGOT, M., OLLIVIER, B. & PATEL, B. 2000. Microbiology of petroleum reservoirs. Antonie van
Leeu-wenhoek, AMOP, vol. 77, no. 12, pp. 103-116.
MARGESIN, R. & SCHINNER, F. 1997. Bioremediation of diesel-oil-contaminated alpine soils at low
temperature, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 47, pp. 462-468.
MAROTO, E. & ROGEL, J. M. 2009. Aplicación de sistemas de biorremediación de suelos y aguas
contaminadas por hidrocarburos, GEOCISA.DIV, Protección Ambiental de Suelos, pp. 297305.
MARTÍNEZ, V. E. & LÓPEZ, F. 2001. Efecto de hidrocarburos en la propiedades físicas y químicas
de suelo arcilloso, Revista Terra Latinoamericana, vol. 19, no. 001, pp. 9-17.
MARTINKOVA, L., KRALOVA, B. & DEMMEROVA, K. 1985. Microbial degradation of hydrocarbon,
Chemiché Listy, vol. 79, no. 10.
MASSIAS, D., GROSSI, V. & BERTRAND, J. C. 2003. In situ anaerobic degradation of petroleum
alkanes in marine sediments: preliminary results, Comptes Rendus Geoscience, pp. 435439.
MATHEW, M., OBBARD, J. P., TING, Y. P., GIN, Y. H. & TAN, H. M. 1999. Bioremediation of Oil
Con-taminated Beach Sediments Using Indigenous Microorganisms in Singapore, Act.
Biotech, vol. 19, no. 3, pp. 225-233.
MCBRIDE, M. B. 1994. Environmental chemistry of soil. Oxford, University Press, New York, USA.
MEANS, J. C., WARD, S. G., HASSETT, J. & L, B. W. 1980. Sorption of polynuclear aromatic
hydrocarbons by sediments and soils, Env. Sci. Technol, vol. 14, pp. 1524-1528.
MELAINE, A. 2009. Determinación de hidrocarburos totales del petroleo en suelos y sedimentos de
la cuenca del rio Coatzacoalcos. Tesis de Ingeniería. Veracruz, Facultad de Ciencias
Químicas, Universidad Veracruzana.
MELLO, R., SOLDAN, A. L. & RIBIERO, L. 1984. Fundamentos da Química Orgánica para a
Geoquímica do Petroleo. Geoquímica do Petroleo Rio de Janeiro. Brasil: CENPES, Divisao
de Exploracao.
MENDOZA, R., PAGANI, E. & PORTAL, R. 2001. Saneamiento de piletas con residuos de petróleo
en patagonia. Efecto sobre la cobertura vegetal y las características del suelo. in: Gerencia
Ambiental, pp. 464-471.
MENN, F. M., EASTER, J. P. & SAYLE, G. S. 2000. Bacterial activity enhancement and soil
decontamination. In H.J.Rehm, G.Reed, A.Pühler and P.Stadler, editors, Biotechnology,
Environmental processes II, Soil decontamination, Wiley-VCH. Weinheim, pp. 425-439.
MILLAR, C. E., TUCK, L. M. & FOTH, H. D. 1958. Fundamentals of soil Science, New York, USA.
70
Bibliografía
MIRAVET, M. E., LUGIOYO, M., ENRÍQUEZ, D. & DELGADO, Y. 2009. Manual de Técnicas
Microbiológicas para la evaluación de la calidad ambiental de ecosistemas marinos costeros
México, Honorable Ayuntamiento de Solidaridad 2008-2011.
MIYOSHI, Y. 1895. Reportado por Santiago, G.; Hereguini, O.; Matey, P. y Pérez, A. (1978). Degradación bacteriana de hidrocarburos. Bol. Inst. Español Oceanogr, vol. 4, no. 263, pp. 96104.
MONTGOMERY, D. C. 2004. Diseño y Análisis de Experimento, Editorial Félix Varela, La Habana.
MORALES, M. 2006. Conservación y evaluación de microorganismos marinos en colección.
Informe final de proyecto. Programa ramal de sistemática y colecciones. La Habana: Centro
de Bioproductos Marinos.
MURAKAMI, A., SUZUKI, A., YAMOVE, A. & KUSEMA, T. 1985. Degradation of crude oils by Pseudomonas sp in enriched seawater medium, Journal of the oceanographical spciety of
Japana, vol. 4, no. 5.
NEY, R. 1990. Fate and Transport of Chemical in the Environmental, Abs Group Inc, EEUU,
NÚÑEZ, R. 2003. Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la
biorremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. La Habana, Facultad
de Biología, Universidad de la Habana.
NÚÑEZ, R., ORTÍZ, E., ORAMA, J. & BARBÁN, O. 2008. Biorremediación del rio y la ensenada de
Bacunayagua. Informe de servicio. La Habana: CEBIMAR.
NÚÑEZ, R., ORTÍZ, E., ORAMA, J. & BARBÁN, O. 2009. Biorremediación de las lagunas de
oxidación de tres complejos lácteos de la provincia de pinar del río. Informe de Servicios. La
habana: CEBIMAR.
ORTÍNEZ, O., IZE, I. & GAVILÁN, A. 2003. La restauración de suelos contaminados con
hidrocarburos en México, Gaceta ecológica, vol. 069, pp. 83-92.
ORTÍZ, E. 2004. Obtención y Caracterización de un biotensioactivo a partir de Bacillus licheniformis
IDO-60. Tesis de Dotorado. La Habana, Facultad de Biología, Universidad de la Habana.
PAUL, E. & CLARK, F. 1989. Soil Microbiology and Biochemistry, Academies Press.
PORTA, C. J., LÓPEZ, R. M. & C, R. I. B. 1999. Edafología para la Agricultura y el Medio Ambiente,
Mundi-Prensa, Madrid, España, p. 849
PRABHAKARAN, N. & SIVADAS, P. 1995. Hydrocarbon degrading yeasts from Cochin Backwater,
J. Mar. Biol. Assoc, vol. 37, no. 1-2, pp. 226-230.
PRINCE, R. C. 1993. Petroleum spill bioremediation in marine enviroments Rev. Microbiol, vol. 19,
pp. 217-242.
QUIROGA, A. & RODRIGO, L. A. 1990. Curso sinoptico de geoquímica del petroleo, Revista
técnica de yacimientos petrolíferos fiscales bolibianos, vol. 11, no. 4, pp. 330-506.
71
Bibliografía
RADWAN, S., SORKHOH, N. A., FARDOUN, F. & HASAN, R. H. 1995. Soil management
enhancing hydrocarbon biodegradation in the polluted Kuwaiti desert, Appl. Microbiol.
Biotech, vol. 44, no. 1-2, pp. 265-270.
RAHN, J. 1906. Reportado por Santiago, G.; Hereguini, O.; Matey, P. y Pérez, A. (1978). Degradación bacteriana de hidrocarburos. Bol. Inst. Español Oceanogr, vol. 4, no. 263, pp. 96-104.
RAZAK, C. N., WANG, W. F., RAHMAN, S. H., BASRI, M. & SALLEH, A. B. 1999. Isolation of the
Crude Oil Degrading Marine Acinetobacter sp. E11, Acta Biotechnol, vol. 19, no. 3, pp. 213223.
RONTANI, J. F. 1986. Gas chromatographic and gas chromatografy/mass spectrometry applied to
de determination of to new pathwai of pristane degradation by to marine mixed bacterial
population, Mar. Chem, vol. 18, no. 2, pp. 9-16.
ROSA, C. 1998. Metodología para la evaluación aproximada de la carga contaminante. La Habana,
Cuba: CIGEA.
ROY, J. L. & MCGILL, W. B. 2000. Investigation into mechanisms leading to the development,
spread and persistence of soil water repellency following contamination by crude oil, Soil Sc,
pp. 595-606.
SANTIAGO, G., HEREGUINI, O., MATEY, P. & PÉREZ, A. 1978. Degradación bacteriana de
hidrocarburos Bol. Inst. Español Oceanogr, vol. 4, no. 263, pp. 96-104.
SASAKI, K., TAKAHASHI, M. & NAGADOMI, H. 2000. Bioremediation of sediment mud of Oyster
Farm by Denitrifying and Marine Photosynthetic Bacteria Inmovilized on Porous Ceramic,
ISEB, vol. 5, pp. 1- 4.
SELLERS, K. 1999. Fundamentals of hazardous waste site remediation. Lewis Publisher.
SEMARNAT 2003. Límites máximos permisibles de hidrocarburos en suelos y las especificaciones
para su caracterización y remediación (nom-138-SEMARNAT/SS-2003), Diario Oficial de la
Federación, Mexico. DF.
SESSITSCH, A., WEILHARTER, A., GERZABEK, H., KIRCHMANN, H. & KANDELER, E. 2001.
Microbial population structures in soil particle size fractions of a long-term fertilizer field
experiment. Appl. Env. Microbiol, vol. 67, no. 4215-4224.
SHMAEFSKY, B. R. 1999. Bioremediation: Panacea or fad? Access Excellence [Online]. The
National Health Museum. Available: http://www.accessexcellence.org/LC/ST/st3bg.html
[Accessed 23 de Marzo, 2010].
SHUTSUBO,
K.
2001.
Petroleum
biodegradation.
[Online].
Available:
http://salmon.mbio.co.jp/mbi/english/kamaishi/program/petroleum/petroleum.html [Accessed
Marzo, 22, 2010].
SIRVINS, A. & TRAMIER, B. 1985. Biodegradation of hydrocarbons, Recherche, 16 (171).
72
Bibliografía
STUCKI, G. & ALEXANDER, M. 1987. Role of dissolution rate and solubility in biodegradation of
aromatic compounds, Appl. Env. Microbiol, vol. 53, pp. 292-297.
SWANNELL, R. P., CROFT, B. C., GRANT, A. L. & KENNETH, L. 1995. Evaluation of
Bioremediation Agents in Beach Microcosms 2(2/3): . Spill Sci.Tech. Bull, vol. 2, no. 2-3, pp.
151-159.
TABAK, H., GOVIND, R., GAO, C., LAI, L., YAN, X. & PFANSTIE, S. I. 1995. Determination of
bioavailability and biodegradation kinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil, In
D.W.Tedder and F.G.Pohland, editors, Emerging technologies in hazardous waste
management, ACS symposium series 607, Washington.
TORRES, K. & ZULUAGA, T. 2009. Biorremediación de suelos contaminados por hidrcarburos.
Medellín, Facultad de Minas e Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia.
VENOSA, A. D., MACNAUGHTON, S. J., STEPHEN, J. R., CHANG, Y.-J. & WHITE, D. C. 2000.
Microbial popula-tion during bioremediation of an experimental oil spill. Proceedings of the
8th International Symposium on Microbial Ecology.
VENOSA, A. D., SUIDAN, M. T., WRENN, B. A., STROHMEIRER, K. L., HAINES, J. R.,
EBERHART, B. L., KING, D. & HOLDER, E. 1996. Bioremediation of an experimental oil spill
an the shoreline of Delaware Bay, Enviro. Sci. Techol, vol. 30, pp. 1764-1775.
VIÑAZ, M. 2005. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterización
microbiológica, química y ecotoxicológica. Barcelona, Facultad de Biología, Universidad de
Barcelona.
WANG, Z. D., FINGAS, M., BLENKINSOPP, S., SERGY, G., LANDRIAULT, M., SIGOUIN, L.,
FOGHT, J., SEMPLE, K. & WESTLAKE, D. W. S. 1998. Comparison of oil composition
changes due to biodegradation and physical weathering in different oils. J. Chromatog, pp.
89-107.
WEISSENFELS, W., KLEWER, D. H. & LANFHOFF, J. 1992. Adsorption of polycyclic
aromatichydrocarbons (PAHs) by soil particles: influence on biodegradability and biotoxicity,
Appl.Microbiol. Biotechno, vol. 36, pp. 689-696.
WRENN, B. A. & VENOSA, A. D. 1996. Selective enumeration of aromatic and aliphatic
hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number procedure Can. J. Microbiol,
vol. 42, pp. 252–258.
ZAVALA, J., GAVI, F., HOWARD, R., FERRERA, R., PALMA, D. J. & VAQUERA, H. 2005.
Derrames de petróleo en suelos y adaptación de pastos tropicales en el activo cinco
presidentes, Tabasco, México, Terra Latinoamericana, vol. 23, pp. 293-302.
ZHOU, E. & CRAWFORD, R. L. 1995. Effects of oxygen, nitrogen, and temperature on gasoline
biodegradation in soil. Biodegradation, vol. 6, pp. 127-140.
73
Anexos
ANEXOS
Anexo 1. Tanques de almacenamiento de hidrocarburos situados en la península de “Punta
Majagua”. Características generales.
Descripción
u/m
TK-1
TK-2
TK-3
TK-4
Diámetro
m
31
31
34
34
Perímetro
m
97,34
97,34
106,76
106,76
3
0,068
51,59
32
0,262
197,64
24
0,005
4,11
50
0,130
117,96
70
Columna HC
Volumen HC
Distancia al mar
m
m2
m
Anexos
Anexo 2. Proceso de biorremediación mediante la técnica de bioaumentación con BIOILFC.
Proceso de
Biorremediación
Fase de diagnóstico
Diagnóstico del área
impactada
Planificación y
proyección de la
solución técnica
Fase ejecutiva
¿Se requiere
tratamiento “exsitu”?
Sí
Diseño y
construcción del área
de manejo
Acondicionamiento
del residual
Monitoreo y control
del proceso de
fermentación
Acciones
correctivas
No
Escalado y
producción industrial
del BIOIL-FC
¿Cumple los
requerimientos de
calidad?
Si
Aplicación del
BIOIL-FC
Monitoreo y control del
proceso de degradación
de hidrocarburos
Acciones
correctivas
No
¿Cumple los
requerimientos de
calidad?
Si
Disposición final
Fin de Proyecto
Informe Final
No
Anexos
Anexo 3. Parcelas o estratos de biorremediación, puntos y patrones de muestreo del área
de manejo de residuos petrolizados.
Anexos
Anexo 4. Indicadores dinámicos de rentabilidad del proyecto (VAN, TIR y PRD).
Inversión ($)
Tasa de interes
Concepto
Ingresos
Costos Operacionales
Beneficio Operacionales
Depreciación
Beneficios antes Impuestos
Impuestos
Beneficios despues Imp.
Inversión
Flujo de caja
Flujo de caja Actualizado
Flujo de caja al descontado
acumulado
VAN
TIR
PRD (Meses)
Inversión ($)
Tasa de interes
Concepto
Ingresos
Costos Operacionales
Beneficio Operacionales
Depreciación
Beneficios antes Impuestos
Impuestos
Beneficios despues Imp.
Inversión
Flujo de caja
Flujo de caja Actualizado
Flujo de caja al descontado
acumulado
VAN
TIR
PRD (Meses)
0.15
0
Flujo de Caja Mensual
1
$64,597.27
$17,319.57
$47,277.70
$3,379.10
$43,898.60
$13,169.58
$30,729.02
2
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
$34,108.12
$29,659.23
$21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38 $21,838.38
$16,512.96 $14,359.09 $12,486.17 $10,857.54 $9,441.34
$21,838.38 $21,838.38 $21,838.38
$8,209.86 $7,139.01 $6,207.83
-$40,549.18 -$10,889.94
$ 37,674.61
60%
2.4
$5,623.01 $19,982.10 $32,468.27 $43,325.81 $52,767.14
$60,977.00 $68,116.01 $74,323.84
$0.00
$0.00
$0.00
$40,549.18
-$40,549.18
-$40,549.18
0.15
0
$0.00
$0.00
$0.00
$40,549.18
-$40,549.18
-$40,549.18
3
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
4
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
5
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
6
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
Sensibilidad a la disminución de los ingresos (30%)
Flujo de Caja Mensual
3
4
5
6
7
$32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35 $32,948.35
$17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57
$15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78 $15,628.78
$3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10
$3,379.10
$12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68 $12,249.68
$3,674.91 $3,674.91 $3,674.91 $3,674.91
$3,674.91
$8,574.78 $8,574.78 $8,574.78 $8,574.78
$8,574.78
1
$45,218.09
$17,319.57
$27,898.52
$3,379.10
$24,519.42
$7,355.83
$17,163.59
2
$32,948.35
$17,319.57
$15,628.78
$3,379.10
$12,249.68
$3,674.91
$8,574.78
$20,542.69
$17,863.21
$11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88 $11,953.88
$9,038.85 $7,859.87 $6,834.67 $5,943.19 $5,167.99
-$40,549.18 -$22,685.97 -$13,647.12
$ 6,078.79
23%
3.3
7
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
-$5,787.25
$1,047.42
$6,990.61 $12,158.60
8
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
8
$32,948.35
$17,319.57
$15,628.78
$3,379.10
$12,249.68
$3,674.91
$8,574.78
9
$47,069.08
$17,319.57
$29,749.51
$3,379.10
$26,370.41
$7,911.12
$18,459.29
9
$32,948.35
$17,319.57
$15,628.78
$3,379.10
$12,249.68
$3,674.91
$8,574.78
$11,953.88 $11,953.88 $11,953.88
$4,493.91 $3,907.74 $3,398.04
$16,652.50 $20,560.25 $23,958.29
Anexos
Inversión ($)
Tasa de interes
Concepto
Ingresos
Costos Operacionales
Beneficio Operacionales
Depreciación
Beneficios antes Impuestos
Impuestos
Beneficios despues Imp.
Inversión
Flujo de caja
Flujo de caja Actualizado
Flujo de caja al descontado
acumulado
VAN
TIR
PRD (Meses)
0.15
0
$0.00
$0.00
$0.00
$40,549.18
-$40,549.18
-$40,549.18
-$40,549.18
$ 69,270.44
95%
2.0
Sensibilidad al incremento de los ingresos (30%)
Flujo de Caja Mensual
3
4
5
6
7
$61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80 $61,189.80
$17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57 $17,319.57
$43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23 $43,870.23
$3,379.10 $3,379.10 $3,379.10 $3,379.10
$3,379.10
$40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13 $40,491.13
$12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34 $12,147.34
$28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79 $28,343.79
1
$83,976.45
$17,319.57
$66,656.88
$3,379.10
$63,277.78
$18,983.34
$44,294.45
2
$61,189.80
$17,319.57
$43,870.23
$3,379.10
$40,491.13
$12,147.34
$28,343.79
$47,673.55
$41,455.26
$31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89 $31,722.89
$23,987.06 $20,858.32 $18,137.67 $15,771.88 $13,714.68
$906.08
$31,722.89
$11,925.81
8
$61,189.80
$17,319.57
$43,870.23
$3,379.10
$40,491.13
$12,147.34
$28,343.79
9
$61,189.80
$17,319.57
$43,870.23
$3,379.10
$40,491.13
$12,147.34
$28,343.79
$31,722.89 $31,722.89
$10,370.27 $9,017.63
$24,893.14 $45,751.46 $63,889.12 $79,661.01 $93,375.69 $105,301.50 $115,671.77 $124,689.39
Anexos
Anexo 5. Costos de inversión, producción e ingresos del proyecto de biorremediación de
suelos contaminados por hidrocarburos.
COSTOS DE INVERSIÓN
Costo Directo (CD)
Costo Equipos (CE)
Costo Tuberías. y accesorios
Instrumentación. y control (IC)
Instalación Eléctrica (IE)
Costo Edificación
Servicios. y facilidades (SF)
Total Costo Directo (CD)
Costo Indirecto (CI)
Ing. y Supervisión
Gastos de Contratación
Contingencias
Total Costo Indirecto(CI)
Capital Fijo de Inversión
Costo Total de Inversión
COSTOS DE PRODUCCIÓN
Costo Directo
Materias Primas (MP)
Utilidades (U)
Mano de obra (MO)
Supervisión (S)
Mantenimiento (M)
Suministro (Su
Gastos de laboratorio. (GL)
Subcontratación 3ros
Total CDP
Cargo Fijo (FC)
Depreciación (D)
Seguros ,Impuestos (SI)
Total FC
Gastos Generales (GG)
Distribución
Desarrollo e Investigaciones.
Financiación
Valor $
15592,00
1871,04
2338,80
1559,20
0,00
5457,20
26818,24
Valor $
2681,82
1877,28
2413,64
6972,74
33790,98
40549,18
Valor $
10174,80
1020,20
17724,10
1772,41
3379,10
844,77
102,02
9171,11
44188,51
Valor $
3379,10
0,00
3379,10
Valor $
0,1CTP
0,05 CTP
0,15 CTP
Anexos
Total GG
Costo Total de Producción
Ingresos por ventas
Ahorros por operación
Agua dejada de pagar por ahorro
Materias primas y materiales
Gastos evitados por tratamiento
Ahorro por externalidades
Ahorro por daños y perjuicios al suelo, las Aguas
de la bahía, la flora y la fauna
Ahorro por impago de multas ambientales
Ahorro por daños a la salud de los pobladores
de la zona.
Total de ingresos
4527,79
52095,39
INGRESOS
400644,44
Valor $
0,48
2,92
2,06
Valor $
9000,00
13500,00
18000,00
441149,90
Anexos
Anexo 6. Perfil de suelo de la zona seleccionada para la construcción del área de manejo
de residuos petrolizados.
Anexos
Anexo 7. Resultados de los análisis microbiológicos en las parcelas del área de
biorremediación durante el tratamiento con BIOIL-FC.
Intervalo de muestreo
(Días)
BHT
(cel·mL-1)
U
BDP
(cel·mL-1)
U
0
1,00E+06
±1,00E+03
2,50E+04
±1,58E+02
0
8,00E+05
±8,94E+02
3,50E+04
±1,87E+02
0
0
0
0
0
45
45
45
45
45
45
45
90
90
90
90
90
90
90
120
120
120
120
120
120
120
165
165
165
165
165
5,00E+05
7,50E+05
1,30E+06
7,40E+06
6,00E+05
2,95E+06
4,30E+06
3,15E+06
1,90E+06
3,05E+06
2,60E+06
3,65E+06
2,90E+06
2,71E+06
4,81E+06
4,00E+06
8,57E+06
9,14E+06
8,85E+06
8,10E+06
3.50E+06
1,65E+06
4,15E+06
3.50E+06
4,95E+06
4,80E+06
1,38E+06
6,64E+05
2,36E+05
2,50E+06
1,75E+06
±7,07E+02
±8,66E+02
±1,14E+03
±2,72E+03
±7,75E+02
±1,72E+03
±2,07E+03
±1,77E+03
±1,38E+03
±1,75E+03
±1,61E+03
±1,91E+03
±1,70E+03
±1,65E+03
±2,19E+03
±2,00E+03
±2,93E+03
±3,02E+03
±2,97E+03
±2,85E+03
±1,87E+03
±1,28E+03
±2,04E+03
±1,87E+03
±2,22E+03
±2,19E+03
±1,17E+03
±8,15E+02
±4,86E+02
±1,58E+03
±1,32E+03
4,00E+04
5,00E+04
6,50E+04
3,50E+04
3,50E+04
2,73E+06
3,14E+06
3,08E+06
3,32E+06
2,47E+06
2,48E+06
3,14E+06
2,85E+06
1,95E+06
2,70E+06
5,00E+06
8,40E+06
8,45E+06
7,90E+06
1,00E+06
1,01E+06
8,77E+05
1,75E+06
9,50E+05
9,64E+05
5,32E+05
9,86E+05
5,05E+05
3,05E+05
9,27E+05
1,16E+06
±2,00E+02
±2,24E+02
±2,55E+02
±1,87E+02
±1,87E+02
±1,65E+03
±1,77E+03
±1,75E+03
±1,82E+03
±1,57E+03
±1,57E+03
±1,77E+03
±1,69E+03
±1,40E+03
±1,64E+03
±2,24E+03
±2,90E+03
±2,91E+03
±2,81E+03
±1,00E+03
±1,00E+03
±9,37E+02
±1,32E+03
±9,75E+02
±9,82E+02
±7,29E+02
±9,93E+02
±7,10E+02
±5,52E+02
±9,63E+02
±1,08E+03
Anexos
165
165
7,77E+05
2,43E+05
±8,82E+02
±4,93E+02
1,06E+06
1,05E+06
±1,03E+03
±1,03E+03
Anexos
Anexo 8. Resultados de los análisis físico-químicos en las parcelas del área de biorremediación durante el tratamiento con
BIOIL-FC.
Intervalo de muestreo
(Días)
HTP
(mg·Kg-1)
U
Saturados
(mg·Kg-1)
U
Aromáticos
(mg·Kg-1)
U
Resinas
(mg·Kg-1)
U
Asfaltenos
(mg·Kg-1)
0
35450
±4254
14180
±1701
21270
±2552
16140
±1936
29290
0
0
0
0
0
0
45
45
45
45
45
45
45
90
90
90
90
90
90
90
120
120
26060
32070
41880
33460
26850
24140
21790
13320
17530
23456
12329
16850
16560
9460
7480
6830
9760
5510
5690
7690
2789
1236
±3127
±3848
±5025
±4015
±3222
±2896
±2396
±1465
±1928
±2580
±1356
±1853
±1711
±898
±710
±648
±927
±523
±540
±730
±306
±135
7020
15270
20940
14340
7220
9900
5530
5420
3640
6110
2520
1750
2299
1740
2490
1340
1420
1580
863
678
610
863
±842
±1832
±2512
±1720
±866
±1188
±608
±596
±400
±672
±277
±192
±252
±165
±236
±127
±134
±150
±81
±64
±67
±94
19540
16800
20940
19120
9630
21840
14570
12390
8900
10987
9870
4567
13250
8400
9980
3150
5678
4730
2050
7820
2245
3680
±2344
±2016
±2512
±2294
±1155
±2620
±1602
±1362
±979
±1208
±1085
±502
±1457
±798
±948
±299
±539
±449
±194
±742
±380
±532
16950
13660
15678
13980
10320
17520
9098
9980
7654
10540
7480
6750
10310
3456
4845
4460
6590
2460
2245
5987
2060
2630
±2034
±1639
±881
±1677
±1238
±2102
±1000
±1097
±841
±1159
±822
±742
±1134
±311
±436
±401
±593
±221
±202
±538
±226
±289
30906
21310
22980
20083
25009
42380
16802
21220
15190
15690
14250
14090
29370
10329
12345
9456
8768
7614
8440
15678
4879
8665
Anexos
120
120
120
120
120
2845
2334
1456
1143
1389
±312
±256
±160
±125
±152
980
870
743
213
245
±107
±95
±81
±23
±26
856
1345
1098
709
2290
±490
±724
±270
±246
±658
1897
3109
1089
993
2034
±208
±341
±119
±109
±223
3324
5690
3492
4400
8765
Anexos
Anexo 9. Resultados de los análisis ecotoxicológicos en las parcelas del área de biorremediación durante el tratamiento con
BIOIL-FC.
Ensayos de fitotoxicidad sobre la germinación de semillas
Muestra
Frijol (Faciola Vulgaris)
Maíz (Zea Maíz)
14,50
8,75
14,50
20,50
7,50
20,50
Patrón
90 días
120 días
Muestra
Patrón
0 días
90 días
120 días
Muestra
Patrón
0 días
90 días
120 días
Altura
de la
planta
(cm)
22,5
6,88
5,63
12,5
Altura
de la
planta
(cm)
11,75
3,25
5,75
22,25
Ensayos de fitotoxicidad sobre el crecimiento de la planta
Frijol (Faciola Vulgaris)
Largo
Peso
Peso
Peso
Materia
Materia
de la
húmedo
seco de
húmedo
Seca
Seca raíz
Raíz
planta
la planta de la raíz
Planta
(%)
(cm)
(g)
(g)
(g)
(%)
6,82
2,35
0,42
0,29
22,25
14,4
8,57
0,98
0,09
0,32
7,25
6,06
8,97
0,66
0,08
0,23
7,25
7,96
7,05
1,81
0,16
0,27
8,50
9,64
Maíz (Zea Maíz)
Largo
Peso
Peso
Peso
Materia
Materia
de la
húmedo
seco de
húmedo
Seca
Seca raíz
Raíz
planta
la planta de la raíz
Planta
(%)
(cm)
(g)
(g)
(g)
(%)
20,46
30,95
2,27
10,50
7,30
21,73
10,17
18,34
1,80
6,50
9,80
15,55
14,45
20,65
2,00
18,50
9,70
18,38
20,19
32,86
2,66
22,50
8,10
21,68
Nitrógeno
Total (%)
Proteína
Bruta
(%)
21,25
5,38
6,5
18,75
5,38
2oo
2,25
4,83
Nitrógeno
Total (%)
Proteína
Bruta
(%)
3,60
2,22
2,23
2,70
22,50
13,98
14,50
16,80