tema 8: ingeniería genética y microorganismos transgénicos.

TEMA 8: INGENIERÍA GENÉTICA Y MICROORGANISMOS
TRANSGÉNICOS.
Ingeniería genética: conjunto de métodos para es traer dan de una célula, manipularlo «in vitro»
e introducirlo y expresarlo en otra célula, generalmente de una especie diferente.
Desarrollo de cepas
-Incrementar la produccion: regulación, permeabilidad, resistencia.
- Propiedades fermentativas mejoradas: sin pigmentos, necesidades reducidas de oxígeno, menor
producción de espuma, capacidad de crecer en sustratos baratos, etc...
- Productos finales únicos: en metabolitos secundarios.
Etapas en la clonación de genes.
1.- Obtención y modificación del gen de interés.
2.- Elección del vector. El vector es una molécula de ADN que hemos construido nosotros
modificando distintos fragmentos naturales de ADN y nos permite que el gen primero que he
localizado que es el que lleva el con tenido de información que yo quiero, ese lo puedo introducir
dentro del na célula y que allí permanezca estable. El vector es el vehículo, el que hace que este
gen permanezca estable.
3.- Recombinación. Cuándo y o tengo el gen de interés y el vector tengo que unirlos en una sola
molécula. Cortar y pegar fragmentos de ADN.
4.- Introducción del DNA recombinante.
5.- Detección del gen. Detectar que células tienen el gen que me interesa. Fase esencial, me
permite limpiar de las células que no Me interesan.
6.- Propagación de la célula.
1.- OBTENCIÓN Y MODIFICACIÓN DEL GEN DE
INTERÉS.
Localizamos primero la fuente, que células tienen el gen
que yo quiero clonar. Hay que integrar el gen en una
composición génica, en ambos extremos de ese gen de
interés tiene que tener un promotor que permita que la
ARN polimerasa haga la transferencia correcta, y tiene
que tener una secuencia al final que controle hasta donde se hace esa copia.
Para hacer más sencillo en el laboratorio el reconocimiento de los recombinantes le pongo un
marcador (gen que se exprese que sea fácil de detectar, que nos permita la selección de forma
rápida)
- A.1 - Aislar y modificar el gen deseado.
Métodos de aislamiento:
 Directo:
Localizo la célula que queremos, aíslo el ADN completo y lo rompo mediante
endonuclesas de restriccion. Cada fragmento lo clono en un vector y lo introduzco en una
célula
compatible.
Al final lo que obtendré es una genoteca, que en conjunto va a contener todo el genoma
de la célula. De todas las células que contienen plasmidos con fragmentos del genoma
donador, sólo una tiene el gen que me interesa. Como las endonucleasas de restricción
cortan al azar, lo más probable es que en ese fragmento esté
el gen que me interesa entre otras muchas cosas, por lo que
las debo eliminar.
Fuente del DNA ⟶ Obtención directa:
» Ventaja: facilidad. Cualquier laboratorio lo puede hacer.
» Inconvenientes: numerosos clones aislados (necesidad de
buenas técnicas de selección), genes con intrínsecos no se
expresan bien en procariotas, la expresión depende del
reconocimiento correcto de los promotores de un organismo a
otro, la elección de codones puede no ser la correcta (aunque
todos los codones sean funcionales hay uno o dos que sino
preferentes, si el ADN procede de un ser humano, el codón
preferente que codifica para cada aminoácido va a ser distinto
de lo que está preparado la maquinaria metabólica , lo que la
enlentece), modificaciones para exportación.

Retrotranscripción:
Usamos una enzima sobre el RNAm que esta en el citoplasma y ya ha sido modificado, ya
hemos eliminado la secuencias no codificantes; este primer transcrito ya es completo, una
vez que sale del nucleo solo tenemos la secuencia modificada, flanqueado por el promotr y
el terminador; al obtener este RNAmaduro solo tengo el
material genetico que codifica; solo nos interesa la
secuencia a traducir, que ya es universal para procariotas
y eucariotas.
Si este RNAm maduro lo pongo en contacto con la RT
(Del retrovirus) me produce el DNA, primero una cadena
y luego se ccopia a si misma y destruye el RNA; asi
obtenemos como una U, una cadena unica de DNA con
dos cadenas complementarias y una cadena sencilla, est
se rompe con una nucleasa de cadena sencilla.
Fuente del DNA ⟶ Síntesis enzimatica:
»Ventajas: si el RNAm es abundante, será fácil obtener
el clon deseado. Los intrones no son problema.
»Inconvenientes: el RNAm que queremos no es
abundante, es necesaria la selección. Los genes
clonados no tienen sistemas de expresión tenemos que
unirlos a un promotor (hoy en día no es un
inconveniente). La elección de codones puede ser incorrecta. Modificaciones post
traducción.

PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) es una técnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la célula de duplicar el
ADN.
Se trata de una técnica usada para crear un
gran número de copias de un segmento de
ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización,
apareamiento con cebadores y extensión por
una ADN polimerasa termoresistente.
Técnica enzimatica tambien, en la que
necesitamos saber solo para conocer un gen
un primer (Secuencia de incio) y la secuencia
final
Se necesita una mezcla de reaccion que
contenga Taq polimerasa, cebadores o primers
(marcan que se va a seleccionar) y los nucleotidos trifosfato. El aparato usado es el
termociclador
Fuente del DNA ⟶ Síntesis química:
Nos permite sintetizar un gen completo y además nos permite cambiar lo que nos
interese cambiar. Inconveniente: es más lento más costoso, mas problemático, poca
cantidad.
»Ventajas: nos e necesita seleccionar después de clonar. Secuencias en promotores,
sitio de unión a ribosomas, etc. Pueden optimizarse. Los codones pueden elegirde de
acuerdo con la célula hospedadora.
»Inconvenientes: necesidad de conocer la secuencia del gen. Dificultades, cada vez
menos, en la síntesis.
Un gen suele tener mil quinientos pares de bases.
- A.2 - Modificar el gen. Promotor.
El promotor es un elemento de DNA donde se ancla la DNApolimerasa
Promotores constitutivos; se expresan de forma continua, sin factres intrinsecos o ambientales
que los regulen; tienen que ver con el metabolismo primario; hay algunos con gran afinidad por la
DNApolimerasa, y así hay una alta expresión del gen; posible incoveniente: se expresan en todos
los tejidos (por ejemplo en las plantas transgenicas, nos interesa que algo se exprese en la raíz o
el tallo, pero no en el fruto porque así pasa a otros organismos).
Promotores inducibles, solo se expresa durante un tiempo por el inductor. Existen en todos los
seres vivos (ej el del gen lactosa), el que se usa con mas frecuencia es el 35s, que es de un virus
mosaico de la coliflor
Promotores específicos de tejido o de órgano, solo se expresa el gen en el tejido, así se
elimina la presencia de la proteína en los tejidos que no nos interesan. Muchos específicos de
semillas.
Ej: Se aisló el gen CRYIA y CRY9 del Bacillus thuringiensis que produce una proteina que es
toxina contra larvas de insectos (especialmente lepidopteros).
Se aislaron genes de resistencia a dos herbicidas, glifosato y glufosinato, producidos por bacetrias
del suelo (agrobacterium, Ochrobactrum...).
Una vez que tenían ambos genes se busco el promotor. El promotor 35S que induce la expresión
génica en todas las células todo el tiempo (al ser constitutivo), se unió a los de B.thuringiensis, se
demostró que una proteína aloctona podía provocar alergias; luego se cambio al promotor de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa, es muy potente (ya q es la enzima mayoritaria d la fotosíntesis),
además es una enzima fotosintética y solo se expresa en los tejidos que realizan la fotosíntesis, la
hoja (donde actúan los larvas de los insectos); los herbicidas eran de absorción folial, por tanto
también nos interesa.
Los terminadores, hay que usar las secuencias que responden mejor, las q son especificas del
tejido donde quiero expresar el gen, aquí no hay tanta variedad, asique se elige la especifica y ya
está.
Gen marcador: se puede usar una proteína fluorescente (inconveniente, me ayuda a detectar
pero no a seleccionar), asique se usa como gen marcador un gen de resistencia, así se cultivan
las células en una placa petri con el antibiótico que confiere resistencia este gen arcador, siembro
los transformantes y las que no tienen el gen marcador morirán y me quedare con los que me
interesa; ya no se usa para no crear más resistencias.
2.- ELECCIÓN DEL VECTOR
En la naturaleza no hay un vector de clonación que tenga las características que necesitamos, por
ello lo creamos. Permite que entre el ADN en la célula y que el ADN que se ha construido se
mantenga estable y que se reproduzca de manera sincrónica con el material celular.
Si no existiera el vector, al dividirse de forma no sincrónica solo una célula Heredará el fragmento
de DNA introducido y al avanzar las generaciones, en la 4º ya estará tan diluido que lo he perdido.
Por ello el vector es autoreplicativo (replicón) así se replica a la vez que la célula y se hereda igual
que todos los genes que están en el interior del cromosoma; todas las generaciones llevan su
material genético y el introducido por el vector.
Los plásmidos actúan como replicones, y no existen plásmidos naturales que nos sirvan como
vectores, luego se construyeron los vectores, cogiendo fragmentos de distintas partes de
plásmidos o de transposones para montar uno con las características interesantes, el primero
construido fue el pBR322, sus características:
- Tiene un origen de replicación y tiene que ver con la célula que se quiere replicar (en este
caso es en E.coli que es con lo que se trabaja en ese momento), si quisiera que sirviera
para otro tipo de células cambiaria el origen de replicación.
- Usaron dos fragmentos de DNA de otro plásmido para marcarle dos genes de resistencia
a AB (en aquel momento se usaba esto como marcador)
-Se necesitaba que dentro del gen de resistencia existiera secuencias específicas de corte
para endonucleasas de restricción, para que al cortar con las endonucleasas se introduce
ahí el DNA interesado y se deja de producir ese ab
- Es necesario que sea pequeño, ya que lo voy a estar manipulando y así es más
resistente a distintos factores físicos como la centrifugación.
SELECCION DE VECTOR:
- Origen de replicación adecuado
- Marcadores que permitan la selección
- Sitios único de corte, deseable que están en
uno de los dos genes marcadores
- Tamaño q permita su manipulación sin
ruptura por razones físicas
3.- RECOMBINACIÓN
Etapa central del proceso. Basado en las
endonucleasas de restricción, hay tres
tipos, I, II, III. Se juntan al DNA extraño, si
es parecido o estabilizan; si es diferente lo
eliminan. Es la seguridad de la célula para
que elementos muy extraños no se
introduzcan en su genoma (sistemas de
modificacion-restriccion).
Este sistema tiene una endonucleasa
(rompen) y una metilasa (colocan metilos en
ciertas posiciones), si no está el DNA
metilado
de
forma
parecida,
las
endonucleasas lo rompen
El I y el III no sirven en el laboratorio ya que están integradas en un complejo multiproteico y la
ruptura del DNA se produce a partir de un punto de forma aleatoria y lo degradan
El tipo II son útiles ya que la metilasa es independiente de la endonucleasa, y porque localizan
unas secuencias especificas para cada uno y dentro de esta secuencia rompen el DNA sin
degradarlo. Sus nombres de las bacterias donde se aislaron. Pueden generan extremos romos
(cortan al segundo nivel), o extremos con colas cohesivas (no al mismo nivel, sino en diferentes
pares- corte asimétrico, quedan colas monocatenarias complementarias) esto último es lo que
permitió la recombinación.
Usar la transferasa terminal.
Cuando no puedo utilizar la misma endonucleasa de
restricción, puedo digerir el plásmido vector con una
endonucleasa de restricción de corte al mismo nivel y se
abre el ADN circular, en ese fragmento de ADN obtenido
por síntesis enzimática por la PCR, lo modifico usando una
transferasa terminal, una ADN polimerasa pero q no
requiere molde, pega en los extremos de las cadena
nucleótidos.
En los extremos de cada una de las cadenas pega
nucleótidos al azar, si yo pego timina, he generado mi
molécula de ADN con una cola monocatenaria de timina.
Con el pasajero, cortado en extremos, lo hago reaccionar
con otro nucleótido distinto; el complementario al usarlo
con otro trozo de ADN. En este caso tengo otro tipo de
molécula híbrida. Tiene ventajas sobre la técnica anterior.
Es una enzima muy corriente que se extrae del timo de los
animales.
Usar plasmidos con un coli linker
En esos vectores de clonación les voy a meter un fragmento de ADN conocido con el nombre de
coli linker, que contiene en un espacio muy pequeño de ADN una secuencia muy corta, contiene
secuencias de reconocimiento para decenas de endonucleasas de restricción, con esto garantizo
poder cortar el vector en el punto que a mí me interesa, por tanto va a ser muy difícil que no pueda
utilizar la endonucleasa de restricción en el vector y en el pasajero.
4.- INTRODUCCIÓN DEL DNA RECOMBINANTE.
Vector y pasajero unido mediante la recombinación in vitro, ahora hay que meterlo dentro de la
célula.
Como se introduce. Tres tipos.
- La primera deriva de la transformación génica. Con las bacterias que trabajamos hemos
aprendido a provocarle un estado similar al estado de competencia natural, pero artificial, para que
así se permita la entrada de moléculas de ADN.
Técnicas: choque osmótico y choque térmico.
Paso mi población de células a un medio con una concentración salina alta y las enfrío, de manera
que permeabilizo la célula y en ese estado puedo introducir el material genético. La eficiencia no
es muy alta, así que se ideó un nuevo sistema llamado electroporacion; esta es mucho más fácil
de llevar a cabo y es la que más se utiliza.
Sea el método que sea, nosotros conseguimos introducir en la célula el ADN «fabricado» en el
laboratorio, obteniendo así una célula recombinante.
Otro método, complejo y que ha ido cayendo en desuso, basado en la transducción (transporte de
genes de una célula a otra).
Voy a utilizar el virión como un sistema de transporte e inyección de ADN. Esto se consigue
teniendo virus efectivos (dos o tres tipos), que ninguno
de ellos sean capaces de formar una partícula viral
completa porque le faltan proteínas necesarias, pero que
la suma de todos ellos formen la suma de las proteínas
necesarias. Las proteínas una vez completas se
autoensamblan y además introducen dentro de la cabeza
ese material genético, obteniendo así pseudoviriones.
Ese virión se va a comportar idénticamente igual que uno
normal, se une a la célula y va a inyectar el ADN, esta
técnica es muy eficiente, pero es costosa de realizar por
ese motivo ha caído en desuso.
- Cañón de genes: consiste en disparar bolitas de
oro recubiertas de ADN a células. Se utiliza con
mucha
frecuencia
en
biología
vegetal.
Este material genético impulsado por la máquina
mediante recombinación (no muy bien conocido)
introduce los genes en las células diana.
5.- DETECCIÓN DEL GEN.
Es fácil si hay genes reporteros.
Se utilizan metodologías que nos
permiten detectar el gen sin
necesidad de marcadores o de
reporteros
Se cultivan células que hemos
sometido a los procesos de
transformación y sobre ellas ponemos
un papel de nitrocelulosa para que se
adhieran todas las colonias que han
crecido en la placa. A continuación
sobre este papel liso las células con
lisozimas y detergente, dejo libre el
contenido celular, del cual me
interesa sólo el ADN, como lo que
quiero detectar es un fragmento de ADN que es el que a mí me interesa, lo que tengo que hacer
es desnaturalizar el ADN, es decir, calentarlo, para que se deshaga la doble hélice. Utilizo
nitrocelulosa porque a esta se adhiere muy bien el ADN y así puedo lavar y eliminar lo que no me
interesa.
Por tanto tenemos ADN de cadena sencilla adherido a la nitrocelulosa procedente de cada una de
las colonias. Vierto sobre el papel de nitrocelulosa el nuevo ADN sintético, para que se hibride el
gen que quiero, este se tiñe, por tanto ya se en que colonia esta mi gen.
Se puede hacer mediante técnicas inmunológicas detectando el producto del gen, con una base
diferente para pegar proteínas y en vez de introducir ADN híbrido tendría que introducir
anticuerpos de proteínas.
Este sistema dura días, pero nos permite identificar las colonias que tienen el gen que a mi me
interesa.
Normalmente se usa e.coli como recombinantes; a partir de aquí hay tres vías fundamentales
1- Que la propia bacteria sea capaz de producir y exportar el producto del gen de forma activa,
esto ocurre con la insulina porque es una molécula sencilla. Entonces solo hay que propagar las
células a nivel industrial y purificar el producto
2- Sí lo que nos interesa obtener es un ser vivo transgénico diferente a una bacteria (planta),
entonces a partir de la bacteria que contiene el gen que nos interesa hay que diseñar un sistema
que nos permita transferir el gen, esto se realiza usando la capacidad q tiene una bacteria
patógena de plantas (agrobacterium thurifaciens?) que inyecta un bloque de ADN para q la planta
forme un tumor que contenga las sustancias que le interesan para vivir; nosotros cambiamos los
genes de la bacteria por los nuestros e infecto a la planta; obtenemos plantas transgénicas
(resistentes a sequias, que se rieguen con agua de mar...)
3- La bacteria no tiene capacidad de modificar la proteína como lo hacen las células humanas, ya
que tiene que estar glicosilada; hago lo mismo que con las plantas pero con células humanas,
obtengo cultivos de tejido donde introduzco el gen, se produce la síntesis de la proteína y su
glicosilacion, obtenemos una proteína humana activa; obtenemos muchas proteínas de uso
terapéutico, que en células de bacterias no funcionarían bien.
6.- PROPAGACIÓN DE LA CÉLULA (Producción industrial)
ADN de la célula donadora, vamos a recombinar ese vector e introducir dentro de una célula
(bacteria e.coli) y vamos a detectar nuestros recombinantes. Que podemos hacer a partir de aquí
⟼ BIOTECNOLOGÍA.
Hay tres vías fundamentales: la propia bacteria sea capaz de producir y exportar el producto de
ese gen de forma activa, esto es lo que ocurre con la insulina, lo único que tenemos que hacer es
propagar las células de forma industrial.
A veces esto no es posible, motivos: lo que me interesa es tener un ser vivo diferente de una
bacteria si no un transgénicos (plantas); entonces a partir de esa bacteria tengo que idear un
sistema que me permita transferirlo a una planta, esto se hace mediante una bacteria patogena de
plantas (muy bien conocida, agrobacterium thurifsciens), esta es capaz de inyectar un bloque de
ADN que infecta a la planta y produce un tumor que contiene las sustancias que a ella le interesan
para vivir. Nosotros cambiamos los genes de las bacterias por los nuestros a la planta.
Otra opción la bacteria no tiene capacidad para modificar una PT de la misma forma que lo hace
las células y para que la proteína se activa tiene que ser glicosilada. Tengo que tener cultivo de
tejidos en los que introduzco ese gen en lo que se va a producir la síntesis de esa PT y por
supuesto la glicosilacion, esto sirve para la obtención de una gran cantidad de PT de uso
terapéutico.
Cultivo en masa para la producción del beneficio industrial que me interesa tener. Para ver la
tecnología de la fermentación.
- FASES DE PROCESO FERMENTATIVO.
Un proceso fermentativo es un esquema de procesos que nos permitan un cultivo a gran escala
de los MO de utilización industrial. El primero de ellos es propio fermentador, es un recipiente que
nos permite desarrollar el microorganismo; tiene que cubrir los requisitos esenciales, tenemos que
garantizar que estén los nutrientes en contacto con las células, necesitamos añadir un sistema de
generación, añadir precursores desde fuera a lo largo del proceso, controlar el pH y de
temperatura.
Para llevar a cabo el proceso de fermentación necesitamos:
- Células que hemos obtenido y que nos interesan, estas células tienen que seguir unos
protocolos para que no cambien, a partir de una alícuota pequeña de estas tenemos que generar
un inoculo que tenga la cantidad exacta de células y con una calidad contrastada
- Medio de cultivo, se suelen usar productos de desecho de la industria alimentaria (hoy día el
coste de este medio no se tiene tanto en cuenta, ya que los productos de la industria alimentaria
dificultan el último proceso de purificación)
- Cuando ya está las células dentro del medio, cambia sobre una semana el desarrollo-proceso
de fermentación.
- Etapa final: purificación.
Cuando preparo esto, obtengo un caldo de fermentación, con dos elementos, las células y el
sobrenadante de cultivo. Lo primero q hay q hacer es la separación de estos dos elementos, para
ello hay diferentes metodologías. Un vez separado, hay q tener en cuanta q nos interesa,
obtenemos las células. Lo habitual es q no nos interese toda la célula sino una molécula concreta,
entonces hay q discernir donde está esta molécula, en el sobrenadante o en las células. Si son las
células lo primero q hay q hacer es romper la biomasa (hay diferentes métodos, cuando los
enzimas intracelulares son labiles-termolabiles, no puedo usar técnicas que den calor como
sonicacion o cavitación). Con la célula rota vuelvo a separar sobrenadante del resto.
Si nos interesa el sobrenadante tengo q purificar directamente, aquí es donde está la dificultad de
los medios con subproductos de la industria alimentaria, usamos tratamientos como extracción
con disolventes, tamizado irregular...