Tema de muestra
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tema 4 Genética forense 1. ¿QUÉ ES LA GENÉTICA FORENSE? Con la denominación de genética forense se define el uso de ciertas técnicas empleadas en genética para la identificación de los individuos en base al análisis del ADN. El ácido desoxirribonucleico o ADN, es una sustancia química que se encuentra en el núcleo de todas las células del cuerpo y permanece invariable; por ello en la actualidad es muy usado en ciencia forense como una herramienta fundamental para la determinación del vínculo filial ya que el ADN proviene un 50% del óvulo materno y, el 50% restante, del espermatozoide paterno. La función del ADN dentro de la célula es transmitir los caracteres hereditarios y esto lo realiza ordenándole a la célula (codificando) que fabrique determinadas proteínas. A un sector de la cadena de ADN que codifica la fabricación de una proteína se la denomina gen. Por ejemplo, el color de los ojos, color del pelo, grupo sanguíneo, etc., son manifestaciones de los genes que poseemos. Los genes de todos los seres humanos son poco variables y constituyen un gran porcentaje de la información contenida en la molécula de ADN; la información restante, incluye sectores que pueden exhibir un cierto grado de variabilidad entre los individuos. En consecuencia, todos los seres humanos tenemos sectores del ADN en común y otros que no lo son. El llamado análisis de ADN es un conjunto de técnicas utilizadas para detectar sectores en la cadena de ADN que son variables en la población. Estas regiones son denominadas regiones polimórficas o polimorfismos. Al analizar un determinado número de regiones polimórficas la probabilidad de que dos individuos sean genéticamente iguales es prácticamente nula, excepto en los gemelos univitelinos. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense 47 TEMA 4 Genética forense 1. ¿QUÉ ES LA GENÉTICA FORENSE? Con la denominación de genética forense se define el uso de ciertas técnicas empleadas en genética para la identificación de los individuos en base al análisis del ADN. El ácido desoxirribonucleico o ADN, es una sustancia química que se encuentra en el núcleo de todas las células del cuerpo y permanece invariable; por ello en la actualidad es muy usado en ciencia forense como una herramienta fundamental para la determinación del vínculo filial ya que el ADN proviene un 50% del óvulo materno y, el 50% restante, del espermatozoide paterno. La función del ADN dentro de la célula es transmitir los caracteres hereditarios y esto lo realiza ordenándole a la célula (codificando) que fabrique determinadas proteínas. A un sector de la cadena de ADN que codifica la fabricación de una proteína se la denomina gen. Por ejemplo, el color de los ojos, color del pelo, grupo sanguíneo, etc., son manifestaciones de los genes que poseemos. Los genes de todos los seres humanos son poco variables y constituyen un gran porcentaje de la información contenida en la molécula de ADN; la información restante, incluye sectores que pueden exhibir un cierto grado de variabilidad entre los individuos. En consecuencia, todos los seres humanos tenemos sectores del ADN en común y otros que no lo son. El llamado análisis de ADN es un conjunto de técnicas utilizadas para detectar sectores en la cadena de ADN que son variables en la población. Estas regiones son denominadas regiones polimórficas o polimorfismos. Al analizar un determinado número de regiones polimórficas la probabilidad de que dos individuos sean genéticamente iguales es prácticamente nula, excepto en los gemelos univitelinos. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense 47 La hemogenética forense nace a principios del siglo pasado, cuando Karl Landsteiner describe el sistema ABO de los eritrocitos, y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisión hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística cuyo objetivo era la identificación genética tanto en casos de investigación criminal como en estudios biológicos de la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), enzimas eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse a una persona como posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigio biológico hallado en el lugar de los hechos. Pero fue a mediados del siglo pasado cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su estructura, y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula, que la Hemogenética Forense evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy en día puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense. Esta subespecialidad se centra básicamente en tres áreas: - Identificación de personas desaparecidas a partir del cadáver. - Investigación de la filiación, tanto desde el punto de vista de la reclamación como de la impugnación. - Criminología, análisis de restos orgánicos como pelos, semen, saliva, sangre, etc., que han quedado en la escena de un crimen o de un delito sexual. Para realizar su objetivo la Genética Forense emplea dos técnicas principalmente: la RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica) y la PCR. La elección de la técnica a aplicar estará determinada por la cantidad y calidad del ADN presente, siendo la PCR la más utilizada, ya que la RFLPs presenta grandes restricciones en estos aspectos. Estas limitaciones son superadas por la PCR o amplificación en cadena de la polimerasa, ya que ésta permite amplificar más de un millón de veces una muestra de ADN. Con el uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser las halladas en un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa, son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética. Las regiones o fragmentos utilizados son los llamados marcadores genéticos, microsatélites o STRs. Estos marcadores genéticos son regiones conocidas del ADN, muy variables de un individuo a otro y que se heredan sin cambios de una generación a la siguiente. A las distintas formas heredables de estos marcadores genéticos se les denomina alelos, por lo tanto constituyen una herramienta muy valiosa en los estudios de identificación genética y filiación ya que cada individuo tendrá unos marcadores genéticos distintos a los del resto, tendrá sus propios alelos. 48 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. La PCR fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo. La PCR opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un sólo fragmento en unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin demasiada formación en biología molecular. La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación o reproducción del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. La mayor parte del ADN es de doble cadena, es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria. Durante la replicación las dos cadenas se separan y una enzima (una proteína que inicia reacciones químicas) especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales. La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o bases (ATP, GTP, CTP, TTP). El segundo es un cebador oligonucleotídico. La PCR utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en una ampolla. La reacción tiene lugar en tres fases: - Desnaturalización: la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90º a 95º C durante 30 segundos; ésto provoca la separación de las dos cadenas. - Templado: la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 55º C durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN escindido. - Polimerización: la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75° C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense 49 La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de PCR resultaba fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzimas en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en las versiones modernas de la PCR se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq polimerasa, extraida de una bacteria termófila como esta proteína no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la PCR, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La Taq polimerasa hoy en día se fabrica con bacterias modificadas genéticamente. El uso de la PCR exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación. Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados por medio de un proceso de electroforesis, proceso en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. La electroforesis consta de las siguientes etapas: - El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5’-GGCC-3’. - Tras la digestión del ADN, los fragmentos resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa, que es un carbohidrato extraído de un alga. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra. Debido a que se analizan regiones polimórficas que varían de un individuo a otro según la distribución de nucleótidos, éstas describen distintas distribuciones de las bandas originadas por la electroforesis de acuerdo al peso de los fragmentos, llamada huella genética. La ciencia ha entrado en los ámbitos judicial y policial por la puerta de las investigaciones de crímenes violentos y de desaparecidos, pero su uso no ha hecho más que empezar. El procedimiento de investigación para la identificación forense comienza cuando se comparan patrones genéticos del sospechoso o la víctima, con aquellos derivados de 50 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense una muestra o evidencia; con sólo uno de los dos alelos que sean distintos, ya es suficiente para excluir en forma categórica al sospechoso. El examen de estos polimorfismos o de patrones característicos presentes en las secuencias de nucleótidos es hoy la herramienta más poderosa para confirmar o descartar la existencia de parentesco entre individuos. El análisis del ADN nuclear por métodos como la técnica PCR, permite detectar determinados fragmentos de ADN que difieren en su longitud, según los individuos, porque se trata de secuencias cuyo número varía de una a otra persona. Estos polimorfismos, se heredan siguiendo las leyes de Mendel y dan lugar, en el análisis por electroforesis que separa los segmentos de ADN por su masa o longitud, a un patrón de bandas que constituye lo que se ha llamado huella genética. Este patrón, resulta de la combinación de patrones de bandas de los padres, por lo tanto, de acuerdo a las coincidencias con ellos se puede excluir o incluir a un presunto padre. El uso adecuado de esta metodología permite establecer la inclusión de la paternidad con una certeza mayor del 99,99%. Existe un ADN, el de las mitocondrias (ADN mt), que se hereda sólo a través de la madre. El ADN mitocondrial está constituido por dos hebras circulares: H (heavy) y L (light). Cada molécula se aloja en los recovecos externos de la membrana interna de la mitocondria. El may or peso de la hebra exterior se debe a su adjunción a esta membrana. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense 51 Una burbuja de iniciación en la cadena pesada, llamada D-loop, parece ser un mecanismo de control. Es una región polimórfica con dos regiones hipervariables, muy útiles para seguir linajes maternos, siendo por lo tanto apropiada para determinar la individualidad genética. Cabe señalar que si bien esta región evoluciona con la suficiente rapidez como para que pueda tener una función caracterizadora, lo hace en una medida tal que permite el reconocimiento de patrones comunes con parientes maternos próximos. La amplificación del loop D mediante la técnica PCR y su posterior secuenciación, permiten evaluar si dos individuos son hijos de la misma madre. La probabilidad de que dos personas no emparentadas tengan la misma secuencia de nucleótidos en el loop D del ADNmt es muy baja, sólo del 0,27%. Sin embargo, a pesar de la importancia implícita en este hecho, es otro el rasgo que concede un valor inestimable a este método. Cuando hay sólo un pariente sobreviviente y éste se encuentra a más de una generación de distancia del individuo en cuestión, la identidad sólo puede ser resuelta mediante este procedimiento, en cuyo caso el parentesco debe ocurrir por vía materna. Este método ha sido de mucha utilidad para identificar cadáveres NN hallados en fosas comunes. Por medio de la utilización de las pruebas de ADN se han podido resolver casos emblemáticos en muchos países, como por ejemplo casos de asesinato, y se han logrado identificar los restos de detenidos desaparecidos. En ambos casos existía la posibilidad de comparar la huella genética con las muestras aportadas por sus familiares, lo que en el caso de los segundos se ha estructurado en un banco de ADN para evitar que los decesos de las parientes de más edad impidan seguir este arduo proceso. Hay crímenes que quedan en la memoria colectiva como la idea de que la justicia no llegó a la verdad, que se castigó a inocentes o que no pagaron todos los culpables. Ésta es otra aplicación de la Genética Forense, demostrar que ciertas personas condenadas no son las responsables de los crímenes. La incorporación de las pruebas de ADN ha revolucionado la investigación policial y los sistemas de identificación, gracias a el descubrimiento del ADN y la creación de técnicas de identificación de individuos, hoy en día se pueden resolver casos que hace algunos años atrás hubieran quedado en el misterio dando un consuelo a los familiares de las victimas pagando los verdaderos responsables del crimen, o en el caso de identificación de cuerpos, los familiares tienen la seguridad de que realmente son sus familiares. Los hijos pueden tener las claves para saber a través de una sencilla prueba quien es su padre o si no lo es. También se benefician tanto a las mujeres que buscan reconocimiento de filiación para sus hijos como los hombres que desean demostrar que están siendo acusados falsamente de ser padres biológicos de un niño que es imputado como suyo. Se cree que los estudios realizados pueden ser de gran utilidad no sólo en el campo forense para el esclarecimiento de hechos delictivos, identificación de cadáveres y pruebas 52 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense de paternidad, sino también en el entorno de la zoología, la antropología, la paleontología y la arqueología, a pesar de que el estudio de ADN antiguo ha generado siempre controversia debido a la elevada probabilidad de contaminación. Éste es un campo en el cual queda mucho por descubrir. 2. GLOSARIO - ADN (ácido desoxirribonucleico): un ácido nucleico compuesto de dos cadenas polinucleotídicas que se disponen alrededor de un eje central formando una doble hélice, capaz de autorreplicarse y codificar la síntesis de ARN. Lugar donde está “depositada” la información genética. Ácido nucleico que funciona como soporte físico de la herencia en el 99% de las especies. La molécula, bicatenaria, esta formada por dos cadenas antiparalelas y complementarias entre sí. Su unidad básica, el nucleótido, consiste en una molécula del azúcar desoxirribosa, un grupo fosfato, y una de estas cuatro bases nitrogenadas: adenina, timina, citosina y guanina. - Alelo (del griego allelon = “el uno al otro”, recíprocamente): formas alternativas de un gen, se hereda separadamente de cada padre (p. ej. en el locus para el color de ojos puede haber un alelo para ojos azules o uno para ojos negros). Uno o más estados alternativos de un gen. - Amplificación: un aumento del número de copias de un fragmento específico de ADN. Puede producirse in vivo o in vitro. Ver clonación, reacción en cadena de la polimerasa. - Cebador (en inglés primer): cadena polinucleotídica corta a la cual se agregan nuevos desoxirribonucleótidos por acción de la ADN polimerasa. - Doble hélice: la forma que toman las dos hebras de ADN cuando se encuentran unidas. - Endonucleasa (del griego endon = dentro; asa = sufijo que indica actividad enzimática): enzima que corta una molécula de ADN en un sitio interno de la secuencia de nucleotídica. - Endonucleasa de restricción: enzima que reconoce específicamente determinadas secuencias y corta a la molécula de ADN en ese sitio. De las bacterias se obtuvieron más de 400 enzimas que reconocen mas de 150 diferentes secuencias de ADN (sitios de corte por enzimas de restricción). - Genes (del griego genos = nacimiento, raza; del latín genus = raza, origen): segmentos específicos de ADN que controlan las estructuras y funciones celulares; la unidad funcional de la herencia. Secuencia de bases de ADN que usualmente codifican para una secuencia polipetídica de aminoácidos. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense 53 - Genética: el estudio de la herencia de los caracteres. - Locus (del latín: lugar, plural loci): posición que ocupa un determinado gen en un cromosoma. - Marcador (del inglés marker; pob. del italiano marcare = “señalar una cosa para que se distinga de otra”): una posición física identificable en un cromosoma cuya herencia puede seguirse (p.ej. un gen o un sitio que corta una enzima de restricción). Los marcadores pueden ser una región del ADN que se expresa (gen) o un segmento de de ADN que no se conoce que codifica pero que se puede seguir su manera de heredarse( ver RFLP iniciales del inglés Restriction Fragment Lenght Polymorphism). - Polimerasa (ADN o ARN): enzimas que catalizan la síntesis de ácidos nucléicos en base a templados preexistentes, utilizando ribonucleótidos para el ARN y desoxirribonucleótidos para el ARN. - Polimorfismo: diferencia entre las secuencia de ADN entre individuos. - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de las iniciales en inglés Polimerase Chain Reaction): método de amplificación de una secuencia de bases del ADN usando una polimerasa termoestable y dos cebadores (“primers”) de 20 bases de largo de la secuencia a ser amplificada, uno complementario de las secuencias final de la hebra (+) y otro de la otra secuencia final de la hebra (-). En razón que las nuevas cadenas de ADN sintetizadas pueden subsecuentemente servir de moldes adicionales para la misma secuencia de cebadores, sucesivos “ciclos” de anillado de cebadores, alargamiento de la cadena y disociación del ADN bicatenario formado producen rápidamente grandes cantidades de la secuencia original (amplificación). La PCR puede utilizarse para detectar una secuencia definida en una muestra de ADN. - RFLP: (del inglés restriction-fragment-length polymorphisms: polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción): bajo esta sigla se reconocen las variaciones entre individuos de la longitud de los fragmentos de ADN cortados por enzimas de restricción. Este hecho generalmente es causado por mutaciones en el sitio de corte. - Secuencia de bases: el orden de las bases de los nucleótidos en una molécula de ADN. 54 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN genética para téc. esp. en laboratorio clínico Tema 4. Genética forense La hemogenética forense nace a principios del siglo pasado, cuando Karl Landsteiner describe el sistema ABO de los eritrocitos, y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisión hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística cuyo objetivo era la identificación genética tanto en casos de investigación criminal como en estudios biológicos de la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), enzimas eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse a una persona como posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigio biológico hallado en el lugar de los hechos. Pero fue a mediados del siglo pasado cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su estructura, y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula, que la Hemogenética Forense evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy en día puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense. Esta subespecialidad se centra básicamente en tres áreas: - Identificación de personas desaparecidas a partir del cadáver. - Investigación de la filiación, tanto desde el punto de vista de la reclamación como de la impugnación. - Criminología, análisis de restos orgánicos como pelos, semen, saliva, sangre, etc., que han quedado en la escena de un crimen o de un delito sexual. Para realizar su objetivo la Genética Forense emplea dos técnicas principalmente: la RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica) y la PCR. La elección de la técnica a aplicar estará determinada por la cantidad y calidad del ADN presente, siendo la PCR la más utilizada, ya que la RFLPs presenta grandes restricciones en estos aspectos. Estas limitaciones son superadas por la PCR o amplificación en cadena de la polimerasa, ya que ésta permite amplificar más de un millón de veces una muestra de ADN. Con el uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser las halladas en un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa, son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética. Las regiones o fragmentos utilizados son los llamados marcadores genéticos, microsatélites o STRs. Estos marcadores genéticos son regiones conocidas del ADN, muy variables de un individuo a otro y que se heredan sin cambios de una generación a la siguiente. A las distintas formas heredables de estos marcadores genéticos se les denomina alelos, por lo tanto constituyen una herramienta muy valiosa en los estudios de identificación genética y filiación ya que cada individuo tendrá unos marcadores genéticos distintos a los del resto, tendrá sus propios alelos. 48 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. La PCR fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo. La PCR opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un sólo fragmento en unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin demasiada formación en biología molecular. La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación o reproducción del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. La mayor parte del ADN es de doble cadena, es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria. Durante la replicación las dos cadenas se separan y una enzima (una proteína que inicia reacciones químicas) especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales. La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o bases (ATP, GTP, CTP, TTP). El segundo es un cebador oligonucleotídico. La PCR utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en una ampolla. La reacción tiene lugar en tres fases: - Desnaturalización: la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90º a 95º C durante 30 segundos; ésto provoca la separación de las dos cadenas. - Templado: la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 55º C durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN escindido. - Polimerización: la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75° C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense 49 La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de PCR resultaba fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzimas en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en las versiones modernas de la PCR se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq polimerasa, extraida de una bacteria termófila como esta proteína no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la PCR, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La Taq polimerasa hoy en día se fabrica con bacterias modificadas genéticamente. El uso de la PCR exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación. Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados por medio de un proceso de electroforesis, proceso en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. La electroforesis consta de las siguientes etapas: - El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5’-GGCC-3’. - Tras la digestión del ADN, los fragmentos resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa, que es un carbohidrato extraído de un alga. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra. Debido a que se analizan regiones polimórficas que varían de un individuo a otro según la distribución de nucleótidos, éstas describen distintas distribuciones de las bandas originadas por la electroforesis de acuerdo al peso de los fragmentos, llamada huella genética. La ciencia ha entrado en los ámbitos judicial y policial por la puerta de las investigaciones de crímenes violentos y de desaparecidos, pero su uso no ha hecho más que empezar. El procedimiento de investigación para la identificación forense comienza cuando se comparan patrones genéticos del sospechoso o la víctima, con aquellos derivados de 50 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense una muestra o evidencia; con sólo uno de los dos alelos que sean distintos, ya es suficiente para excluir en forma categórica al sospechoso. El examen de estos polimorfismos o de patrones característicos presentes en las secuencias de nucleótidos es hoy la herramienta más poderosa para confirmar o descartar la existencia de parentesco entre individuos. El análisis del ADN nuclear por métodos como la técnica PCR, permite detectar determinados fragmentos de ADN que difieren en su longitud, según los individuos, porque se trata de secuencias cuyo número varía de una a otra persona. Estos polimorfismos, se heredan siguiendo las leyes de Mendel y dan lugar, en el análisis por electroforesis que separa los segmentos de ADN por su masa o longitud, a un patrón de bandas que constituye lo que se ha llamado huella genética. Este patrón, resulta de la combinación de patrones de bandas de los padres, por lo tanto, de acuerdo a las coincidencias con ellos se puede excluir o incluir a un presunto padre. El uso adecuado de esta metodología permite establecer la inclusión de la paternidad con una certeza mayor del 99,99%. Existe un ADN, el de las mitocondrias (ADN mt), que se hereda sólo a través de la madre. El ADN mitocondrial está constituido por dos hebras circulares: H (heavy) y L (light). Cada molécula se aloja en los recovecos externos de la membrana interna de la mitocondria. El may or peso de la hebra exterior se debe a su adjunción a esta membrana. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense 51 Una burbuja de iniciación en la cadena pesada, llamada D-loop, parece ser un mecanismo de control. Es una región polimórfica con dos regiones hipervariables, muy útiles para seguir linajes maternos, siendo por lo tanto apropiada para determinar la individualidad genética. Cabe señalar que si bien esta región evoluciona con la suficiente rapidez como para que pueda tener una función caracterizadora, lo hace en una medida tal que permite el reconocimiento de patrones comunes con parientes maternos próximos. La amplificación del loop D mediante la técnica PCR y su posterior secuenciación, permiten evaluar si dos individuos son hijos de la misma madre. La probabilidad de que dos personas no emparentadas tengan la misma secuencia de nucleótidos en el loop D del ADNmt es muy baja, sólo del 0,27%. Sin embargo, a pesar de la importancia implícita en este hecho, es otro el rasgo que concede un valor inestimable a este método. Cuando hay sólo un pariente sobreviviente y éste se encuentra a más de una generación de distancia del individuo en cuestión, la identidad sólo puede ser resuelta mediante este procedimiento, en cuyo caso el parentesco debe ocurrir por vía materna. Este método ha sido de mucha utilidad para identificar cadáveres NN hallados en fosas comunes. Por medio de la utilización de las pruebas de ADN se han podido resolver casos emblemáticos en muchos países, como por ejemplo casos de asesinato, y se han logrado identificar los restos de detenidos desaparecidos. En ambos casos existía la posibilidad de comparar la huella genética con las muestras aportadas por sus familiares, lo que en el caso de los segundos se ha estructurado en un banco de ADN para evitar que los decesos de las parientes de más edad impidan seguir este arduo proceso. Hay crímenes que quedan en la memoria colectiva como la idea de que la justicia no llegó a la verdad, que se castigó a inocentes o que no pagaron todos los culpables. Ésta es otra aplicación de la Genética Forense, demostrar que ciertas personas condenadas no son las responsables de los crímenes. La incorporación de las pruebas de ADN ha revolucionado la investigación policial y los sistemas de identificación, gracias a el descubrimiento del ADN y la creación de técnicas de identificación de individuos, hoy en día se pueden resolver casos que hace algunos años atrás hubieran quedado en el misterio dando un consuelo a los familiares de las victimas pagando los verdaderos responsables del crimen, o en el caso de identificación de cuerpos, los familiares tienen la seguridad de que realmente son sus familiares. Los hijos pueden tener las claves para saber a través de una sencilla prueba quien es su padre o si no lo es. También se benefician tanto a las mujeres que buscan reconocimiento de filiación para sus hijos como los hombres que desean demostrar que están siendo acusados falsamente de ser padres biológicos de un niño que es imputado como suyo. Se cree que los estudios realizados pueden ser de gran utilidad no sólo en el campo forense para el esclarecimiento de hechos delictivos, identificación de cadáveres y pruebas 52 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense de paternidad, sino también en el entorno de la zoología, la antropología, la paleontología y la arqueología, a pesar de que el estudio de ADN antiguo ha generado siempre controversia debido a la elevada probabilidad de contaminación. Éste es un campo en el cual queda mucho por descubrir. 2. GLOSARIO - ADN (ácido desoxirribonucleico): un ácido nucleico compuesto de dos cadenas polinucleotídicas que se disponen alrededor de un eje central formando una doble hélice, capaz de autorreplicarse y codificar la síntesis de ARN. Lugar donde está “depositada” la información genética. Ácido nucleico que funciona como soporte físico de la herencia en el 99% de las especies. La molécula, bicatenaria, esta formada por dos cadenas antiparalelas y complementarias entre sí. Su unidad básica, el nucleótido, consiste en una molécula del azúcar desoxirribosa, un grupo fosfato, y una de estas cuatro bases nitrogenadas: adenina, timina, citosina y guanina. - Alelo (del griego allelon = “el uno al otro”, recíprocamente): formas alternativas de un gen, se hereda separadamente de cada padre (p. ej. en el locus para el color de ojos puede haber un alelo para ojos azules o uno para ojos negros). Uno o más estados alternativos de un gen. - Amplificación: un aumento del número de copias de un fragmento específico de ADN. Puede producirse in vivo o in vitro. Ver clonación, reacción en cadena de la polimerasa. - Cebador (en inglés primer): cadena polinucleotídica corta a la cual se agregan nuevos desoxirribonucleótidos por acción de la ADN polimerasa. - Doble hélice: la forma que toman las dos hebras de ADN cuando se encuentran unidas. - Endonucleasa (del griego endon = dentro; asa = sufijo que indica actividad enzimática): enzima que corta una molécula de ADN en un sitio interno de la secuencia de nucleotídica. - Endonucleasa de restricción: enzima que reconoce específicamente determinadas secuencias y corta a la molécula de ADN en ese sitio. De las bacterias se obtuvieron más de 400 enzimas que reconocen mas de 150 diferentes secuencias de ADN (sitios de corte por enzimas de restricción). - Genes (del griego genos = nacimiento, raza; del latín genus = raza, origen): segmentos específicos de ADN que controlan las estructuras y funciones celulares; la unidad funcional de la herencia. Secuencia de bases de ADN que usualmente codifican para una secuencia polipetídica de aminoácidos. CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense 53 - Genética: el estudio de la herencia de los caracteres. - Locus (del latín: lugar, plural loci): posición que ocupa un determinado gen en un cromosoma. - Marcador (del inglés marker; pob. del italiano marcare = “señalar una cosa para que se distinga de otra”): una posición física identificable en un cromosoma cuya herencia puede seguirse (p.ej. un gen o un sitio que corta una enzima de restricción). Los marcadores pueden ser una región del ADN que se expresa (gen) o un segmento de de ADN que no se conoce que codifica pero que se puede seguir su manera de heredarse( ver RFLP iniciales del inglés Restriction Fragment Lenght Polymorphism). - Polimerasa (ADN o ARN): enzimas que catalizan la síntesis de ácidos nucléicos en base a templados preexistentes, utilizando ribonucleótidos para el ARN y desoxirribonucleótidos para el ARN. - Polimorfismo: diferencia entre las secuencia de ADN entre individuos. - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de las iniciales en inglés Polimerase Chain Reaction): método de amplificación de una secuencia de bases del ADN usando una polimerasa termoestable y dos cebadores (“primers”) de 20 bases de largo de la secuencia a ser amplificada, uno complementario de las secuencias final de la hebra (+) y otro de la otra secuencia final de la hebra (-). En razón que las nuevas cadenas de ADN sintetizadas pueden subsecuentemente servir de moldes adicionales para la misma secuencia de cebadores, sucesivos “ciclos” de anillado de cebadores, alargamiento de la cadena y disociación del ADN bicatenario formado producen rápidamente grandes cantidades de la secuencia original (amplificación). La PCR puede utilizarse para detectar una secuencia definida en una muestra de ADN. - RFLP: (del inglés restriction-fragment-length polymorphisms: polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción): bajo esta sigla se reconocen las variaciones entre individuos de la longitud de los fragmentos de ADN cortados por enzimas de restricción. Este hecho generalmente es causado por mutaciones en el sitio de corte. - Secuencia de bases: el orden de las bases de los nucleótidos en una molécula de ADN. 54 CONOCIMIENTOS APLICADOS EN GENÉTICA PARA TÉC. ESP. EN LABORATORIO CLÍNICO Tema 4. Genética forense
