PRT-712.02-006 V 5 colif fecales metodo A

PROCEDIMIENTO NMP PARA LA
DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
PRT-712.02-006
Fecha emisión:
1992
Revisión: 5
Fecha revisión:
23-05-2011
Página 1 de 6
OBJETIVO
Este análisis se realiza para estimar la densidad de coliformes fecales en agua, con una
incubación de 24 hrs. por lo cual se obtienen resultados en menor tiempo que el método
tradicional.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Este procedimiento se aplica a muestras de aguas crudas y agua de mar.
3.
FUNDAMENTO
El caldo A-1 puede ser usado para aislamiento directo de coliformes fecales desde agua, no
requiere una etapa de preenriquecimiento.
4.
REFERENCIAS
4.1
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ª Ed. 2005 .Capítulo
9. 9221 E.2 pag 9-57.
5.
TERMINOLOGÍA
5.1
Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos Gram negativos
aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando
ácido y gas dentro de 24 hrs. a 44,5 ± 0,2ºC.
En la actualidad se utiliza el grupo coliformes fecales, especialmente para calificar
sanitariamente la calidad del agua.
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
EQUIPOS
6.1.1
Incubadora a 35º ± 0,5ºC
6.1.2
Baño de agua termorregulado a 44,5º ± 0,2º C
6.1.3
Termómetros calibrados con graduaciones de 0,1ºC
6.2
MATERIALES
6.2.1
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.
6.2.2
Placas Petri de 100 mm de diâmetro
PROCEDIMIENTO NMP PARA LA
DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Sección Microbiología
de Alimentos
PRT-712.02-006
Fecha emisión:
1992
Revisión: 5
Fecha revisión:
23-05-2011
Página 2 de 6
6.2.3
Tubos o botellas de dilución, de vidrio borosilicato con tapas herméticas
6.2.4
Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm
6.2.5
Asa de 3 mm de diámetro
6.2.6
Propipeta
6.3
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
6.3.1
Medio A1 doble concentración
6.3.2
Medio A1 concentración simple
6.3.3
Agua de dilución buffer fosfato estéril o agua peptonada estéril 0.5%
6.4
CEPAS CONTROL
6.4.1
Cepa control positivo: Escherichia coli
6.4.2
Cepa control negativo: Enterobacter aerogenes
7.
DESARROLLO
7.1
SIEMBRA
7.1.1
Se utiliza caldo A-1 en tubos de fermentación y como diluyente, agua de dilución buffer
fosfato estéril o agua peptonada estéril 0.5%.
7.1.2
Agitar la muestra y diluciones, vigorosamente 25 veces en 7 segundos en un arco de 45º
con movimientos de arriba a abajo, para asegurar la homogeneidad de la muestra; este
procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie de diluciones.
7.1.3
Inocular 5 tubos de caldo A-1 doble concentración con 10 mL de muestra cada tubo.
7.1.4
Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 mL de muestra cada tubo.
7.1.5
Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilución buffer
fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilución 1:10.
7.1.6
Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 mL de la dilución 1:10 cada
tubo.
7.1.7
Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilución buffer
fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilución 1:100.
7.1.8
Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 mL de la dilución 1:100 cada
tubo.
PROCEDIMIENTO NMP PARA LA
DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Sección Microbiología
de Alimentos
7.1.9
PRT-712.02-006
Fecha emisión:
1992
Revisión: 5
Fecha revisión:
23-05-2011
Página 3 de 6
Inocular un tubo de medio con A-1 con control positivo utilizando una cepa de
Escherichia coli y otro con el control negativo utilizando una cepa de Enterobacter
aerogenes. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad
de los medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de ambiente.
7.1.10 Agitar la gradilla suavemente para mezclar la muestra y el medio de cultivo e incubar
los tubos inoculados en incubadora a 35º ± 0,5º C por 3 hrs para resucitación.
7.1.11 Luego transferir la gradilla a un baño de agua a 44,5º ± 0,2ºC durante 21 horas ± 2
horas.
7.1.12 Al término del período de incubación se observa la formación de gas en los tubos de
fermentación. Se considera un test positivo para coliformes fecales la presencia de gas,
cualquiera sea la cantidad producida o la efervescencia que se produce al agitar
suavemente el tubo.
Ausencia de gas o ausencia de efervescencia se considera un test negativo para
coliformes fecales.
7.1.13 Anotar los resultados de las muestras en el registro RG-712.00-025 y de las cepas
control en el registro RG-712.00-005, de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-712.00-009.
7.2
CALCULO
7.2.1
La combinación de tubos positivos obtenidos se refiere a la Tabla NMP (Tabla 9221: IV
St. Mt. 2005 Pag. 9-54), y los resultados se expresan como NMP por 100 mL. de
muestra.
7.2.2
Si en lugar de las porciones de muestra de 10-1-0,1 mL, se utiliza 1-0,1-0,01, se lee el
resultado en la Tabla NMP y se multiplica por 10, y si las porciones de muestra son 0,10,01-0,001, el resultado de la Tabla NMP se multiplica por 100.
7.2.3
Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de
3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 5 tubos
ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer
en la Tabla de NMP (Ver Ejemplos).
PROCEDIMIENTO NMP PARA LA
DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Sección Microbiología
de Alimentos
PRT-712.02-006
Ejemplos de determinación de NMP en series de 5 tubos
Ejemplo
Volumen de muestra (mL)
10
1
0,1
0,01
a
5
5
1
0
b
4
5
1
0
c
0
0
1
0
d
5
4
4
1
e
5
4
4
0
f
5
5
5
5
7.3
Fecha emisión:
1992
Revisión: 5
Fecha revisión:
23-05-2011
Página 4 de 6
Lectura
0,001
0
0
0
0
1
2
510
451
001
441
441
552
NMP
330
48
1,8
400
400
54000
EXPRESION DE RESULTADOS
Los resultados se expresan como NMP Coliformes fecales/100 mL de muestra.
8.
REGISTROS
8.1
RG-712.00-005 Registro cepas control baños de agua para análisis de Coliformes
fecales.
8.2
RG-712.00-006 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el
análisis de Coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli.
8.3
RG-712.00-025 Registro de resultados análisis de coliformes, coliformes fecales y E.
coli en muestras de agua.
8.4
RG-712.00-009 Registro control de ambiente.
9.
ANEXOS
Anexo Nº 1
Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales, RG712.00-005.
Anexo Nº 2
Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de
coliformes, RG-712.00-006.
Anexo Nº 3
Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de
agua coliformes fecales y Escherichia coli, RG-712.00-025.
Anexo Nº 4
Registro control de ambiente laboratorio, RG-712.00-009.
PROCEDIMIENTO NMP PARA LA
DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Sección Microbiología
de Alimentos
PRT-712.02-006
Fecha emisión:
1992
Revisión: 5
Fecha revisión:
23-05-2011
Página 5 de 6
Anexo Nº 1
Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales, RG-712.00-005
FECHA
Baño Nº inventario
Baño Nº inventario
Baño Nº inventario
Baño Nº inventario
----------------------
----------------------
----------------------
----------------------
CONTROLES
CONTROLES
CONTROLES
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
CONTROLES
(+)
INIC:
(-)
Anexo Nº 2
Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados
en el análisis de coliformes, RG-712.00-006
FECH
A
Caldo
Lauril
Sulfato
Triptosa
concentra
d
Caldo
Lauril
Sulfato
Triptosa
simple
Agar
Caldo
Rojo
Bilis
Neutro Verde
Cristal Brillant
Violeta
e
(VRB)
Cald
o EC
Cald
o
A-1
Agar Rojo
Neutro
Cristal
Violeta Glucosa
(VRBG)
Agar
MacConke
y Sorbitol
Agar
glucosa
(enterobacteria)
INIC
Fecha emisión:
1992
Revisión: 5
PROCEDIMIENTO NMP PARA LA
DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Sección Microbiología
de Alimentos
Fecha revisión:
23-05-2011
Página 6 de 6
PRT-712.02-006
Anexo Nº 3
Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua
coliformes fecales y Escherichia coli, RG-712.00-025
Nº:.......................Tipo de muestra:.......................................... Analista............................................
Fecha /hora recolección...............................Fecha/hora análisis:...................Tº Ambiental…………….
Medios
CLST (C)
#
CLST (S)
#
Endoles
#
Diluyente
#
CBCB
#
Caldo EC
#
Caldo
MUG
#
EC-
Pipeta
1mL / 5
mL
#
Incubadora/
Baño term.
PORCION DE MUESTRA (mL)
PRESUNTIVO
CLST 24 - 48 hrs 35ºC
Endo Les 24 hrs.
COLIFORMES CONFIRMATIVO
CBVB
48 hrs. a 35 ºC
E.C./E.C.-MUG 24 h/44,5+/- 0,2ºC
N.M.P. Coliformes /100 mL :..............germ / 100 mL
Rcto Coliformes:.................................
N.M.P. Coliformes Fecales :...............germ /100 mL
P/A E.coli:………….............................
Anexo Nº 4
Registro control de ambiente laboratorio, RG-712.00-009
LABORATORIO:...............................................................MES :.....................................AÑO :..............................
FECHA/
LOTE
CONTROL AMBIENTE MESON DE TRABAJO
Lado izquierdo
Placa abierta
Placa cerrada
Lado derecho
Placa abierta
Placa cerrada