NTE INEN 0307: Leche en polvo. Ensayo de la fosfatasa

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NTE INEN 0307 (1980) (Spanish): Leche en
polvo. Ensayo de la fosfatasa
CDU: 637
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AL 03.01-309


 Norma Técnica
Ecuatoriana
LECHE EN POLVO
INEN 307
ENSAYO DE LA FOSFATASA
1977-06
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
1. OBJ ETO
1.1 Esta norma tiene por objeto establecer el método rápido de Scharer para el ensayo de la fosfatasa,
usado para verificar el empleo de leche pasteurizada en la fabricación de la leche en polvo.
2. ALCANCE
2.1 Esta norma se aplica a los siguientes tipos de leche:
a)
Tipo I.
Leche en polvo.
b)
Tipo II.
Leche semidescremada en polvo.
c)
Tipo III.
Leche descremada en polvo.
3. TERMINOLOGIA
3.1 Fosfatasa. Es una enzima que, en estado activo, libera fenol de los esteres fenil-fosfóricos; está presente,
principalmente, en la leche fresca y es desactivada fácilmente con el calor.
3.2
Unidad de fosfatasa. Es, para los efectos de esta norma, una medida indirecta de la cantidad de
3
fosfatasa activa presente en la leche en polvo, que corresponde a 1 mg de fenol liberado por 1 000 cm de
leche o producto lácteo.
4. CONDICIONES GENERALES
4.1 Deberán cumplirse las disposiciones generales indicadas en la Norma INEN 17,
4.2 Las muestras deberán ensayarse tan pronto como lleguen al laboratorio; en caso contrario, deberán
mantenerse a una temperatura comprendida entre 3°C y 5°C.
4.3 El material de vidrio y los tapones que se usen para este ensayo deberán estar completamente limpios,
mantenerse separados del resto del instrumental de laboratorio y no usarse para otras finalidades.
4.4 Deberá usarse una pipeta estéril para cada muestra, teniendo precaución de no contaminarla con saliva.
4.5
El ensayo deberá realizarse en tal forma que no incida la luz solar directa sobre la muestra o los
reactivos.
4.6 Para cada muestra analizada deberá realizarse un control positivo y un control negativo, con el fin de
verificar el buen estado y funcionamiento de los reactivos.
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5. FUNDAMENTO
5.1 El método se basa en la acción que ejerce la fosfatasa sobre el fosfato fenil disódico, liberando fenol,
que
se detecta haciéndolo reaccionar con 2,6 -dicloroquinona-cloroimida (CQC) para formar indofenol que produce
color azul en medio básico.
5.2 La cantidad de enzima activa se mide en "unidades de fosfatasa", comparando la coloración de la muestra
ensayada con soluciones coloreadas estandarizadas.
5.3 Las principales reacciones que ocurren en el ensayo son las siguientes:

6. INSTRUMENTAL
6.1 Tubos de ensayo, estériles, con tapón de goma (completamente libre de fenol) y calibrados a 5; 5,5 y 8,5
3
cm , hasta la parte superior del menisco.
6.2 Tubos de ensayo, de 18 mm x 150 mm, completamente limpios y secos, provistos de varillas de vidrio.
3
3
6.3 Pipetas de 5 cm , gradudadas con divisiones de 0,1 cm .
3
6.4 Pipetas volumétricas, de 0,5 cm .
6.5 Baño de agua, con regulador de temperatura ajustado a 40 ± 1°C
3
6.6 Frasco gotero, de vidrio color ámbar, calibrado para proporcionar aproximadamente 50 gotas por cada cm
de reactivo CQC (ver 7.12).
6.7 Termómetro, graduado hasta no menos de 100°C.
6.8 Centrífuga, para operar a (314,10 rad/s) 3 000 r/min.
6.9 Papal de estaño.
6.10 Balanza analítica, sensible a 0,1 mg.
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7. REACTIVOS
7.1 Sesquicarbonato de sodio, (NaHCO3.Na2CO3.2H2O), reactivo para análisis.
7.2 Sulfato de cobre, (CuSO4.5H2O), reactivo para análisis.
7.3 Solución 0,1 N de ácido clorhídrico, debidamente estandarizada.
7.4 Alcohol metílico, o alcohol etílico, reactivo para análisis.
7.5 Alcohol n-butílico, neutralizado, con punto de ebullición comprendido entre 116 ° C y 118 ° C (ver A.1).
3
3
7.6 Solución al 7,5% de alcohol n-butílico. Diluir 7,5 cm de alcohol n-butílico neutralizado, a 100 cm con agua
destilada.
7.7 Fenol anhidro, reactivo para análisis.
7.8 Fosfato fenil disódico, exento de fenol (ver A. 2.1); debe guardarse en refrigerador.
7.9 2,6 -Dicloro-quinona-cloroimida, (CQC) cristalina, especial para trabajos con fosfatasa.
7.10 Solución tampón. Disolver 100µg de sesquicarbonato de sodio deshidratado en agua destilada y diluir
3
hasta un volumen de 1 000 cm .
3
7.11 Sustract tampón. Disolver 0,5 g de fosfato fenil disódico en 25 cm de solución tampón y completar el
3
volumen a 250 cm con agua destilada. Guardar la solución en refrigerador, protegida de la luz, y usar
únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación (ver A.2.2).
3
7.12 Reactivos (CQC). Disolver 30 mg de 2,6-dicloroquinona-cloroimida en 10 cm de alcohol metílico o etílico.
Transferir parte de la solución a un frasco gotero (ver 6.6) y el resto a un frasco ámbar con tapón de vidrio.
Guardar la solución en refrigerador y usarla únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación. Si
antes de los 7 días aparece un color pardo, desecharla.
3
7.13 Catalizador. Disolver 200 mg de sulfato cúprico en 100 cm de agua destilada.
3
7.14 Solución patrón de fenol, de 1 mg/cm . Pesar, con aproximación a 0,1 mg, exactamente un gramo de
3
fenol anhidro; transferir a un matraz aforado de 1 000 cm , completar el volumen con solución 0,1 N de ácido
clorhídrico y disolverlo. La solución es estable durante varios meses en refrigeradora.
3
7.15 Solución A de fenol. Diluir 10 cm , exactamente medidos, de solución patrón de fenol hasta un volumen
3
3
de 1 000 cm con agua destilada. Cada cm de esta solución contiene 10 g de fenol. Guardar la solución en
refrigerador y usarla únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación.
3
7.16 Solución B de fenol. Debe prepararse inmediatamente antes de su uso. Diluir 10 cm , exactamente
3
3
medidos, de solución A de fenol hasta un volumen de 50 cm con agua destilada. Cada cm de esta solución
contiene 2 µg de fenol.
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7.17 Soluciones testigo. Preparar tres soluciones testigo correspondientes a 1,3,4 y 5 unidades de fosfatasa
(ver 3.2), de la manera siguiente:
7.17.1 Agregar a cuatro tubos de ensayo (ver 6.1) las cantidades de solución B de fenol, agua destilada y
solución tampón, que se indican en la tabla 1.
TABLA 1. Composición de las soluciones testigo.
UNIDADES DE
FOSFATASA
(µg)
Solución B de fenol
3
(cm )
Agua destilada
3
(cm )
Solución Tampón
3
(cm )
1,0
0,5
4,5
0,5
3,0
1,5
3,5
0,5
4,0
2,0
3,0
0,5
5,0
2,5
2,5
0,5
7.17.2 Agregar a cada tubo dos gotas de catalizador y seis gotas de reactivos CQC, mezclar inmeditamente y calentar durante 5 min a 40° ± 1°C, en baño de agua.
3
7.17.3 Extraer el azul indofenol, desarrollado en cada tubo, con 3 cm de alcohol n-butílico neutralizado y
dejar la mezcla en reposo, hasta que se separen completamente las dos fases.
7.17.4 Extraer de cada tubo, con una pipeta, una porción medida del extracto alcohólico, transferir a otro
tubo de ensayo y diluir con un volumen igual de alcohol n-butílico neutralizado.
7.18 Leche fresca, sin pasteurizar y almacenada durante un tiempo no mayor de 48 h.
8. PREPARACION DE LA MUESTRA
8.1 La leche en polvo es un producto que absorbe fácilmente la humedad y olores extraños; por tanto, es
necesario que todos los utensilios y recipientes, además de limpios y estériles, estén secos.
8.2 La extracción de la muestra debe realizarse en un ambiente seco y exento de polvo y olores, lo más
rápidamente posible, procurando reducir al mínimo el tiempo que el producto que se ha de ensayar
permanezca en contacto con el aire.
8.3 Transferir la leche en polvo a un frasco limpio, estéril y bien seco, de capacidad aproximadamente dos
veces el volumen de la muestra, e inmediatamente tapar y homogeneizar, invirtiendo varias veces el recipiente
que lo contiene.
8.4 Extracto para ensayo. Pesar 1,0 g de la porción preparada y transferir a un tubo de ensayo de 18 mm x
3
150 mm (ver 6.2), que contiene 1,0 cm de solución al 7,5% de alcohol n-butílico. Disgregar el material
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con la varilla de vidrio y agregar 9,0 cm adicionales de solución al 7,5% de alcohol n-butílico. Mezclar bien la
suspensión con la varilla de vidrio y dejarla en reposo durante 30 min, hasta que la grasa se haya recolectado
en la parte superior y las proteínas en el fondo. Usar como extracto para ensayo el Iíquido claro
de la parte
central.
3
8.5 Muestra para control negativo. Transferir aproximadamente 5 cm de extracto para ensayo a un tubo
y
calentar a 85°C, durante un tiempo no menor de 1 min; introducir el tubo en agua caliente y controlar la
temperatura con un termómetro (el tiempo de calentamiento se registra desde que la temperatura de la muestra
alcanza los 85°C); finalmente, agitar el extracto para asegurar la inactivación completa de la fosfatasa.
3
8.6 Muestra para control positivo. Agregar 0,1 cm de leche fresca (previamente hervida durante 1 min y
3
enfriada a temperatura ambiente) (ver 7.18) a 10 cm de extracto para ensayo.
9. PROCEDIMIENTO
9.1 Debe efectuarse un ensayo sobre el extracto para ensayo (ver 8.4) y sobre cada una de las dos muestras
para control (ver 8.5 y 8.6).
3
9.2 Usando una pipeta limpia, transferir 0,5 cm del extracto para ensayo al tubo de ensayo respectivo. Repetir
la operación, usando cada vez una pipeta limpia, con las muestras para control negativo y positivo.
3
9.3 Agregar a cada tubo 5,0 cm de sustracto tampón y, luego de mezclar el contenido de cada tubo, verificar
el pH y ajustarlo a 9,5 ó 10,0 con la solución tampón o con sesquicarbonato de sodio dihidratado, en caso de
ser necesario.
9.4 Tapar los tubos e invertirlos varias veces, para que la mezcla sea completa.
9.5 Colocar los tubos en el baño de agua a 40° ± 1°C e incubarlos durante 15 min.
9.6 Retirar los tubos del baño de agua y agregar a cada uno seis gotas de reactivo CQC y dos gotas de
catalizador. Taparlos e invertirlos varias veces, para mezclar su contenido e incubar nuevamente a 40° ± 1°C
durante 5 min.
3
9.7 Retirar los tubos del baño de agua, enfriarlos en corriente de agua y agregar a cada uno 3 cm de alcohol
n-butílico neutralizado. Taparlos e invertirlos cuatro o cinco veces (con intervalos de un segundo entre cada
inversión), para mezclar su contenido y extraer el azul de indofenol, y colocarlos horizontalmente sobre una
superficie plana durante 2 min, para permitir la separación del alcohol butílico. A continuación, repetir una vez
más las operaciones de agitación y separación.
9.8 Si se forma una emulsión y no se consigue una capa alcohólica clara y transparente, enfriar los tubos
sumergiéndolos en agua con hielo durante 5 min y centrifugarlos a (314,10 rad/s) 3 000 r/min durante 5 min.
9.9 Colocar los tubos en posición vertical y comparar los colores de las capas de alcohol butílico con los
colores de las soluciones testigo. La comparación debe hacerse contra una luz blanca uniforme.
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9.10 La capa de alcohol butílico correspondiente a la muestra para control negativo no debe presentar ninguna
coloración; en caso contrario, debe repetirse la determinación, después de verificar el buen estado de los
reactivos (ver nota 1) y la correcta preparación de la muestra para control negativo.
9.11 La capa de alcohol butílico, correspondiente a la muestra para control positivo, debe presentar un color
azul de mayor intensidad que el correspondiente a la solución testigo con 1 unidad de fosfatasa; en caso
contrario, debe repetirse la determinación, después de verificar el buen estado de los reactivos y la correcta
preparación de la muestra para control positivo.
9.12 La capa de alcohol butílico, correspondiente al extracto para ensayo, no debe presentar coloración o debe
presentar un color azul de menor intensidad que el correspondiente a la solución testigo con 1 unidad de
fosfatasa; en caso contrario, debe compararse la coloración con las soluciones testigo restantes.
10. INFORME DE RESULTADOS
10.1 Dependiendo del color de la capa de alcohol butílico, correspondiente a la determinación sobre el extracto
para ensayo (ver 9.12), luego de compararlo con los colores de las cuatro soluciones testigo (ver 7.16), debe
reportarse el resultado como: cero unidades de fosfatasa, si es incolora, o su valor relativo con respecto a las
concentraciones de las soluciones testigo.
Ejemplos:
menos de 1 unidad de fosfatasa,
entre 3 y 4 unidades de fosfatasa,
más de 5 unidades de fosfatasa,
etc.
10.2 En el informe de resultados, deben indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse,
además, cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada como opcional, así como cualquier
circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.
10.3 Deben incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra.
NOTA 1. Cualquier color que se desarrolle en el ensayo sobre una muestra para control negativo no puede deberse a la presencia
de fosfatasa residual, sino a contaminación de los reactivos.
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ANEXO A
ACONDICIONAMIENTO DE LOS REACTIVOS
A.1 Neutralización del alcohol n-butílico.
A.1.1 Para determinar el grado de acidez del alcohol n-butílico, mezclar un volumen de alcohol con un volumen
igual de agua destilada en un tubo de ensayo; añadir unas gotas de indicador azul de bromo timol; tapar el tubo,
agitar su contenido y dejar separar las fases. Si et alcohol está neutro, la capa acuosa deberá
presentar una
coloración verde o ligeramente azul; sí está ácido, la coloración será amarilla.
A.1.2 Para neutralizar el alcohol n-butílico, agregar una solución 0,1 N de hidróxido de sodio, hasta que al
ensayar una pequeña porción con indicador azul de bromotimol, aplicando el procedimiento descrito en
A.1.1,
se obtenga una coloración verde o ligeramente azul.
A.2 Purificación del fosfato fenil disódico
A.2.1
3
Determinación de la presencia de fenol. Disolver 100 mg de fosfato fenil disódico en 5 cm de
solución tampón (ver 7.10), agregar una gota de reactivo CQC (ver 7.5), agitar muy bien la solución y dejarla
en reposo durante 10 min. La presencia de coloración azul indica la contaminación del fosfato fenil disódico con
fenol.
A.2.2
Preparación del sustracto tampón. SÍ el fosfato fenil disódico está contaminado con fenol, el
3
sustracto tampón debe prepararse de la manera siguiente: disolver 0,5 g de fosfato fenil disódico en 25 cm de
solución tampón; transferir la solución a un tubo de separación y agregar 2 gotas de reactivo CQC; agitar muy
bien la solución y dejarla en reposo durante 10 min, para que se desarrolle completamente el color; agregar 10
3
cm de alcohol n-butílico neutralizado y agitar la mezcla enérgicamente, para extraer el azul de indofenol; dejar
la mezcla en reposo hasta que la fase alcohólica se separe completamente y eliminar la capa alcohólica; diluir la
3
capa acuosa restante, libre ya de fenol, con agua destilada hasta 500 cm y verificar el pH, que debe estar
comprendido entre 10 y 10,5; guardar la solución en refrigerador, protegida de la luz, y usarla únicamente dentro
de los 7 días siguientes a su preparación.
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APENDICE Z
Z.1 NORMAS A CONSULTAR
INEN 17
Leche y productos lácteos. Examen microbiológico.
Disposiciones generales.
Z.2 NORMAS PUBLICADAS SOBRE EL TEMA
INEN
3
Leche y productos lácteos. Definiciones.
INEN
4
Leche y productos lácteos. Muestreo.
INEN 299
Leche en polvo. Determinación de la humedad.
INEN 300
Leche en polvo. Determinación de la grasa.
INEN 301
Leche en polvo. Determinación de la proteína.
INEN 302
Leche en polvo. Determinación de las cenizas.
INEN 303
Leche en polvo. Determinación de la acidez.
INEN 304
Leche en polvo. Determinación de bacterias activas.
INEN 305
Leche en polvo. Determinación de bacterias coliformes.
INEN 307
Leche en polvo. Determinación del índice de solubilidad.
Z.3 BASES DE ESTUDIO
Método AOAC de análisis. Dried milk, nonfat dry milk and malted milk. Residual phosphatase. Official
Final.
Action. Association of Official Analytical Chemists. Washington, 1970.
Propuesta de Norma Centroamericana ICAITI 34046 h 13. Leche y productos lácteos. Determinación de la
fosfatasa. Método rápido Scharer. Instituto Centroamericano de Investigaciones y Tecnología Industrial,
Guatemala, 1970.
Norma Británica BS 4225. Specification for spray dried skimmed milk power for Cantees. Bristish
Standards
Institution. Londres, 1967.
William G. Walter. Standard methods for the examination of dairy products. Published by: American Public
Health Association Inc. 1740. Nueva York, 1967.
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INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
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FOSFATASA. 
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Fecha de iniciación:
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
Sr. Manuel Tobar Zaldumbide
Dr. Alberto Proaño
Ing. Nicolás Guillén
Dr. Germán Fierro y
Dr. Sergio Coellar
Ing. Carlos Molina
Ing. Jaime Flores González
Sr. Luis González y
Dr. Hernán Avila Orejuela
Dr. Nelson Valle P.
Dr. Gustavo Guerra
Dr. Jorge Donoso
Sr. Carlos Pazmiño Gallo
Ing. Federico Schaerer
Ing. Ejvind Christensen
Sr. José E. Muñoz
Sr. Pablo Lozada
Ing. José Arellano
Dra. Leonor Orozco 
Fecha de aprobación: 1976-10-01
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HERTOB, PROMISA, EL ANGEL
MINISTERIO DE LA PRODUCCION
MINISTERIO DE LA PRODUCCION
PASTEURIZADORA QUITO. ILESA, SUPER DE
GUAYAQUIL E INDUSTRIA LECHERA
CARCHI
CAMARA DE AGRICULTURA DE LA 1ra. Zona
CAMARA DE AGRICULTURA DE LA 1ra. Zona
PRODUCTOS LACTEOS GONZALEZ
PRODUCTOS LACTEOS GONZALEZ
INSTITUTO NACIONAL DE NUTRICION
INSTITUTO NACIONAL DE NUTRICION
DIRECCION DE HIGIENE MUNICIPAL
INDUSTRIA LECHERA CAP
FAO
FAO
COLEGIO DE QUÍMICOS DE PICHINCHA
INSTITUTO DE COMERCIO EXTERIOR E INTEGRACION
CENTRO DE DESARROLLO CENDES
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Por Acuerdo Ministerial No. 337 del 1980-03-12
Registro Oficial No.
154 del 1980-03-25
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