TEMA I - Comunidad de Madrid

Ensayos Biotecnológicos
TEMA I. EL LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA
1. BIOTECNOLOGÍA.
La biología es el estudio de los seres vivos.
El problema más común de la biología
molecular es el de reconocer la estructura de las
biomacromoléculas, la detallada función que
cumplen y, aún más, las relaciones entre
estructura y función. Aquí estructura se refiere a
la distribución de los átomos en el espacio
(x,y,z) y sus movimientos (x,y,z,t).
Las herramientas principales son los estudios de
difracción de rayos X y los relacionados con
resonancia magnética nuclear (RMN).
Estas técnicas llegaron a permitir la descripción
de la doble hélice del DNA y las
macromoléculas proteicas (estructuras bien
complicadas) así como la relación de unas con
otras de una manera exacta.
Además de los estudios de difracción de rayos X
y de RMN, existen otras técnicas de
espectroscopía del ultravioleta, del visible y del
infrarrojo, así como la microscopía electrónica.
Ahora entendemos mucho más del mecanismo
de cómo funciona una enzima que lo que cabe
en un tomo entero.
La tecnología trata de resolver los problemas y
proporcionarnos las cosas que necesitamos.
Así, la biotecnología utiliza los seres vivos para
producir lo que necesitamos.
Afinando un poco más, la biotecnología es la
utilización de procesos biológicos para producir
bienes y servicios. Estos bienes incluyen
productos químicos, alimentos, combustibles y
medicamentos, tratamiento de residuos o el
control de la contaminación, etc.
La biotecnología utiliza células vivas o
productos sintetizados por éstas, como las
enzimas. Las células pueden proceder de plantas
o animales conocidos, o pueden ser
microorganismos como las levaduras o las
bacterias.
Se desarrolla en un enfoque multidisciplinario
que involucra varias disciplinas y ciencias como
biología, bioquímica, gran repercusión en la
farmacia, la medicina, la microbiología, la
ciencia de los alimentos, la minería y la
agricultura entre otros campos.
Probablemente el primero que usó este término
fue el ingeniero húngaro KARL EREKI, en 1919,
quien la introdujo en su libro Biotecnología en la
producción cárnica y láctea de una gran
explotación agropecuaria.
Según el Convenio sobre Diversidad Biológica
Salvador Camacho Garrido
de 1992, la biotecnología podría definirse como
"toda aplicación tecnológica que utilice
sistemas biológicos y organismos vivos o sus
derivados para la creación o modificación de
productos o procesos para usos específicos".
El Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la
Biotecnología del Convenio sobre la Diversidad
Biológica define la biotecnología moderna como
la aplicación de:
• Técnicas in vitro de ácido nucleico,
incluidos el ácido desoxirribonucleico
(ADN) recombinante y la inyección
directa de ácido nucleico en células u
orgánulos, o
• La fusión de células más allá de la
familia taxonómica que superan las
barreras fisiológicas naturales de la
reproducción o de la recombinación y
que no son técnicas utilizadas en la
reproducción y selección tradicional.
En España en el año 2005 las actividades de I+D
en Biotecnología emplearon a un 6,6% del total
de personal dedicado a I+D.
2. VENTAJAS Y RIESGOS.
Ventajas:
Entre las principales ventajas de la biotecnología
se tienen:
• Rendimiento superior de los cultivos
dando más alimento con menos
recursos, disminuyendo las cosechas
perdidas por enfermedad o plagas así
como por factores ambientales.
• Reducción de pesticidas que suelen ser
causantes de grandes daños ambientales
y a la salud.
• Mejora en la nutrición. Se puede llegar a
introducir vitaminas y proteínas
adicionales en alimentos así como
reducir los alérgenos y toxinas naturales.
• También se puede intentar cultivar en
condiciones extremas lo que auxiliaría a
los países que tienen menos disposición
de alimentos.
• Mejora en el desarrollo de nuevos
materiales.
Riesgos:
La aplicación de la biotecnología presenta
riesgos que pueden clasificarse en dos categorías
diferentes: los efectos en la salud humana y de
los animales y las consecuencias ambientales.
Además, existen riesgos de un uso cuestionable
de la biotecnología.
1
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Riesgos para el medio ambiente:
Entre los riesgos para el medio ambiente cabe
señalar, la posibilidad de polinización cruzada,
por medio de la cual el polen de los cultivos
genéticamente modificados (GM) se difunde a
cultivos no GM en campos cercanos, por lo que
pueden dispersarse ciertas características como
resistencia a los herbicidas de plantas GM a
aquellas que no son GM. Esto podría dar lugar,
por ejemplo, al desarrollo de maleza más
agresiva o de parientes silvestres con mayor
resistencia a las enfermedades o a los estreses
abióticos, trastornando el equilibrio del
ecosistema.
Otros riesgos ecológicos surgen del gran uso de
cultivos modificados genéticamente con genes
que producen toxinas insecticidas, como el gen
del Bacillus thuringiensis. Esto puede hacer que
se desarrolle una resistencia al gen en
poblaciones de insectos expuestas a cultivos
GM.
También puede haber riesgo para especies que
no son el objetivo, como aves y mariposas, por
plantas con genes insecticidas.
Asimismo se puede perder biodiversidad, por
ejemplo, como consecuencia del desplazamiento
de cultivos tradicionales por un pequeño número
de cultivos modificados genéticamente.
Riesgos para la salud:
Existen riesgos de transferir toxinas de una
forma de vida a otra, de crear nuevas toxinas o
de transferir compuestos alergénicos de una
especie a otra, lo que podría dar lugar a
reacciones alérgicas imprevistas.
Existe además el riesgo de que bacterias y virus
modificados escapen de los laboratorios de alta
seguridad e infecten a la población humana o
animal.
Preocupaciones éticas y sociales.
Los avances en genética y el desarrollo del
Proyecto Genoma Humano, en conjunción con
las tecnologías reproductivas, han suscitado
preocupaciones de carácter ético sobre las cuales
aún no hay consenso.
• Reproducción asistida del ser humano.
• Estatuto ético del embrión y del feto.
• Derecho individual a procrear.
• Sondeos genéticos y sus posibles
aplicaciones discriminatorias: derechos
a la intimidad genética y a no saber
predisposiciones
a
enfermedades
incurables.
• Modificación del genoma humano para
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"mejorar" la naturaleza humana.
• Clonación y el concepto de singularidad
individual ante el derecho a no ser
producto del diseño de otros.
• Cuestiones derivadas del mercantilismo
de la vida (patentes biotecnológicas).
Reconociendo que los problemas éticos
suscitados por los rápidos adelantos de la ciencia
y de sus aplicaciones tecnológicas deben
examinarse teniendo en cuenta no sólo el respeto
debido a la dignidad humana, sino también la
observancia de los Derechos Humanos, la
Conferencia General de la UNESCO aprobó en
octubre de 2005 la Declaración Universal sobre
Bioética y Derechos Humanos.
3. BIOÉTICA.
La bioética abarca las cuestiones éticas acerca de
la vida que surgen en las relaciones entre
biología, nutrición, medicina, política, derecho,
filosofía, sociología, antropología, teología,...
Existe un desacuerdo acerca del dominio
apropiado para la aplicación de la ética en temas
biológicos. Algunos bioéticos tienden a reducir
el ámbito de la ética a la moralidad en
tratamientos médicos o en la innovación
tecnológica. Otros, sin embargo, opinan que la
ética debe incluir la moralidad de todas las
acciones que puedan ayudar o dañar organismos
capaces de sentir miedo y dolor.
El criterio ético fundamental que regula esta
disciplina es el respeto al ser humano, a sus
derechos inalienables, a su bien verdadero e
integral: la dignidad de la persona.
Por la íntima relación que existe entre la bioética
y la antropología, la visión que de ésta se tenga
condiciona y fundamenta la solución ética de
cada intervención técnica sobre el ser humano.
La bioética es con frecuencia material de
discusión política, resultando en crudos
enfrentamientos entre aquellos que defienden el
progreso tecnológico en forma incondicionada y
aquellos que consideran que la tecnología no es
un fin en sí, sino que debe estar al servicio de las
personas.
Principios fundamentales de la
Bioética:
Los cuatro principios definidos por BEAUCHAMP
y CHILDRESS son:
Principio de autonomía:
Principio de respeto a las personas que impone
la obligación de asegurar las condiciones
necesarias para que actúen de forma autónoma.
La autonomía implica responsabilidad y es un
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derecho irrenunciable, incluso para una persona
enferma. Una persona autónoma tiene capacidad
para obrar, facultad de enjuiciar razonablemente
el alcance y el significado de sus actuaciones y
responder por sus consecuencias.
El principio de autonomía tiene un carácter
imperativo y debe respetarse como norma,
excepto cuando se dan situaciones en que las
personas puedan ser no autónomas o presenten
una autonomía disminuida (menores de edad,
personas en estado vegetativo o con daño
cerebral, etc.) siendo necesario en tal caso
justificar por qué no existe autonomía o por qué
ésta se encuentra disminuida.
•
•
Principio de beneficencia:
Obligación de actuar en beneficio de otros,
promoviendo sus legítimos intereses y
suprimiendo perjuicios. En medicina, promueve
el mejor interés del paciente pero sin tener en
cuenta la opinión de éste. Supone que el médico
posee una formación y conocimientos de los que
el paciente carece, por lo que aquél sabe (y por
tanto, decide) lo más conveniente para éste.
Principio de no maleficencia:
Abstenerse intencionadamente de realizar
acciones que puedan causar daño o perjudicar a
otros. Es un imperativo ético válido para todos
los sectores de la vida humana, no sólo en el
ámbito biomédico.
Principio de justicia:
Tratar a cada uno como corresponda con la
finalidad de disminuir las situaciones de
desigualdad (ideológica, social, cultural,
económica, etc.) En nuestra sociedad, aunque en
el ámbito sanitario la igualdad entre todos los
hombres es sólo una aspiración, se pretende que
todos sean menos desiguales, por lo que se
impone la obligación de tratar igual a los iguales
y desigual a los desiguales para disminuir las
situaciones de desigualdad.
El principio de justicia lo podemos desdoblar en
dos: un principio formal (tratar igual a los
iguales y desigual a los desiguales) y un
principio material (determinar las características
relevantes para la distribución de los recursos
sanitarios: necesidades personales, mérito,
capacidad económica, esfuerzo personal, etc.)
Ámbitos de la Bioética:
• Problemas éticos derivados de las
profesiones
sanitarias:
eutanasia,
trasplantes de órganos, reproducción
Salvador Camacho Garrido
•
asistida o mediante fertilización in vitro,
aborto, todos los asuntos implicados en
la relación médico-paciente.
Problemas de la investigación científica,
en particular la investigación biomédica,
que tanto pueden transformar al hombre:
manipulación genética, tecnologías
reproductivas como la clonación, etc.
Los problemas ecológicos, del medio
ambiente y la biosfera: necesidad de
conservación del medio ambiente, como
mantener el equilibrio entre las especies
y el respeto hacia los animales y la
naturaleza, impedir el uso de energía
nuclear, controlar el crecimiento de la
población mundial y el incremento del
hambre en los países pobres, etc.
Influencia social y política de las
cuestiones anteriores, en cuanto a
legislación,
educación,
políticas
sanitarias, etc.
4. EL LABORATORIO
BIOTECNOLÓGICO.
El laboratorio biotecnológico debe ser un
laboratorio exclusivo para el trabajo de las
técnicas de la biología molecular y ser diseñado
siguiendo las recomendaciones de buenas
prácticas de laboratorio (B.P.L.).
Las infraestructuras deben contar con un diseño
con espacio suficiente proporcionando las
condiciones
necesarias
de
movilidad,
luminosidad, ventilación, condiciones de higiene
y desinfección, para facilitar la prevención de la
transmisión de enfermedades; además estas
instalaciones deben facilitar su mantenimiento,
la limpieza y desinfección y permitir el
adecuado control de las plagas.
En cualquier caso el diseño dependerá de la
función a realizar. En general, se trabaja
esencialmente con proteínas y ácidos nucleicos,
y parece evidente que estas dos zonas deben
estar totalmente separadas.
Servicios Usuales Laboratorio
•
•
•
•
•
•
•
Técnicas de purificación, detección y
cuantificación de ácidos nucleicos y
proteínas.
Síntesis de péptidos y oligonucleótidos.
Técnicas para detección de patologías
moleculares.
DNA en estudios forenses.
Radioisótopos.
Secuenciación de ADN.
Cultivos celulares.
3
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Además, en la parte dedicada a los ácidos
nucleicos los procesos deben ser independientes
para evitar riesgos de contaminación cruzada y
por tanto tener cuatro espacios separados
destinados para:
• Extracción de ADN
• Procesos de Pre-PCR
• Procesos de Post-PCR
• Equipos de lectura de resultados y
análisis de datos
El conjunto del laboratorio debería contar con
cabinas de transición y un sistema de prevención
de contaminación por gradiente de presión entre
áreas.
5. LABORATORIO BÁSICO.
Según recomienda la O.M.S. en el "Manual de
Bioseguridad" y también según la Directiva del
Consejo 90/679/CEE, para la protección de los
trabajadores expuestos a agentes biológicos, hay
que
tener
en
cuenta
las
siguientes
recomendaciones:
• El laboratorio debe tener techos, paredes
y suelos fáciles de lavar, impermeables a
los líquidos y resistentes a la acción de
las sustancias químicas y productos
desinfectantes
que
se
usan
ordinariamente en ellos. Los suelos
deben ser antideslizantes.
• Las tuberías y conducciones no
empotradas deben estar separadas de las
paredes y evitar tramos horizontales
para, no acumular el polvo.
• Las superficies de trabajo tienen que ser
impermeables y resistentes a los ácidos,
álcalis, disolventes orgánicos y al calor
moderado. En las poyatas hay que evitar
las baldosas con juntas de cemento.
Además hay que calcular una longitud
de 2 metros lineales por persona.
• Se instalará una iluminación adecuada y
suficiente y que no produzca reflejos. El
nivel recomendado para el trabajo de
laboratorio es de 500 lux, según la
Norma Técnica DIN 5053.
• El mobiliario será robusto. Los espacios
entre mesas, armarios, campanas y otros
muebles serán suficientemente amplios
para facilitar la limpieza.
• En cada unidad del laboratorio debe
haber lavabos de manos, a ser posible
con
agua
corriente,
instalados
preferentemente cerca de la salida.
• Las puertas deben estar protegidas
contra
incendios
y
cerrarse
automáticamente. Además, estarán
Salvador Camacho Garrido
•
•
•
•
•
•
•
•
•
provistas de mirillas con cristal de
seguridad de 40 por 23 cm, situado a la
altura de la mirada. Su misión es evitar
accidentes y poder examinar el interior
del laboratorio sin abrir la puerta.
Fuera de las zonas de trabajo deberán
estar los vestuarios, comedores o zonas
de descanso y, caso de que el edificio
donde esté ubicado el boratorio lo
permita, espacios reservados para
fumadores.
En el mismo laboratorio o local anexo
deberá colocarse un autoclave para la
descontaminación del material de
desecho infeccioso.
Deberá reservarse espacio para guardar
los artículos de uso inmediato, evitando
su acumulación desordenada sobre las
mesas
y
pasillos.
Para
el
almacenamiento a largo plazo se
recomienda un local fuera de la zona de
trabajo.
Habrá que prever espacio e instalaciones
para manejar y almacenar disolventes,
material
radioactivo
y
gases
comprimidos en condiciones adecuadas
de seguridad y siguiendo las normativas
específicas para ello.
Deben existir medios de protección
contra incendios, a nivel de prevención,
evitando que se inicie el incendio y a
nivel de protección, evitando que se
propague el incendio. Así mismo debe
haber un sistema de detección de humos
y/o fuego con alarma acústica y óptica.
Debe disponerse de una instalación
eléctrica segura y de suficiente
capacidad. Se necesita un sistema de
iluminación de emergencia para facilitar
la salida del laboratorio en condiciones
de seguridad. Conviene que haya un
grupo electrógeno de reserva para
alimentar el equipo esencial (estufas,
congeladores, etc.).
Se dispondrá de un botiquín suficiente e
información sobre primeros auxilios.
No existen normas concretas de
ventilación, aunque se recomienda
trabajar en depresión y una renovación
de aire de 60 m3 por persona y hora.
No debe haber ninguna conexión entre
las conducciones de agua destinada al
laboratorio y las del agua de bebida. El
abastecimiento de agua potable al
laboratorio estará protegido contra el
reflujo por un dispositivo adecuado.
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6. NIVELES DE SEGURIDAD.
Nivel de contención biológica 1
Le corresponde el nivel de riesgo I, que indica
escaso riesgo individual y comunitario. Se
aplicarán las medidas del laboratorio básico. No
necesita ningún equipo especial de contención.
Nivel de contención biológica 2
Le corresponde el nivel de riesgo II, indicador
de riesgo individual moderado y riesgo
comunitario limitado.
Nivel de contención biológica 3
Le corresponde el nivel de riesgo III, indicador
de riesgo individual elevado y riesgo
comunitario escaso.
Nivel de contención biológica 4
Le corresponde el nivel de riesgo IV, indicador
de elevado riesgo individual y comunitario. Los
laboratorios de contención máxima en
funcionamiento deben estar supervisados por las
autoridades sanitarias nacionales o de otro tipo.
7. MATERIAL Y APARATOS.
Todos los procesos de análisis deberían estar
automatizados. El laboratorio debería contar con
instrumental moderno y con equipos de alta
tecnología. En cada una de las habitaciones
debería haber sistemas robotizados de manejo de
líquidos, y sistemas optimizados para la
realización de extracción de ADN, PCRs,
secuenciación automática de ADN, para estudios
de expresión génica mediante la tecnología de
MicroArrays, etc.
Un buen laboratorio de ensayos biotecnológicos,
además del instrumental y material usual de
laboratorio debería al menos contar con:
• Analizadores automáticos de secuencias
y fragmentos de ADN
• Sistema bioanalizador
• Equipo integrado de proteómica
• Espectrofotómetro para medidas de
absorbancia, dicroísmo circular (DC) y
fluorescencia
• Microcalorímetros.
• Sistema en flujo continuo para la
detección y el análisis cinético de
interacciones moleculares por Surface
Plasmon Resonance
• Sistema de microdisección por láser
• Equipo de difracción de rayos X de
pequeño ángulo
• Analizador de tamaño de partículas
mediante dispersión por láser
• Ultacentrífuga analítica
• Robot configurado para la preparación
de PCR y purificación de ADN
• Equipos de apoyo: termocicladores,
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cabinas de flujo laminar, campana de
extracción
de
gases,
centrífuga
refrigerada de placas y tubos y otra sólo
para tubos, refractómetro, baños
refrigerados,
pH-metro,
autoclave,
balanza de precisión, estufa de secado,
frigorífico y congeladores, baño de
ultrasonidos, concentrador centrífugo a
vacío y sistema de electroforesis para
geles de acrilamida y agarosa con
transluminador, etc.
Todos y cada uno de los materiales y equipos
serán descritos en el laboratorio, así como su
correcto uso, mantenimiento y conservación,
antes de ser usado por primera vez.
8. REACTIVOS.
Además de todos los reactivos, e incluso medios
a los que estamos acostumbrados en el análisis
químico o en los ensayos microbiológicos, existe
una gran cantidad de reactivos especiales que se
utilizan exclusivamente en los ensayos
biotecnológicos y que se caracterizan por su
elevadísimo grado de pureza.
Sin ánimo de ser exhaustivos, podemos
comentar:
• Tampones.
• Agentes quelatantes.
• Detergentes.
• Antibióticos.
• Aminoácidos y péptidos.
• Nucleótidos y oligonucleótidos.
• Enzimas.
• Activadores.
• Inhibidores.
• Anticuerpos.
• Células.
• Microorganismos.
• Genotecas.
• Kits de uso especifico.
9. PREPARACIÓN DE MEDIOS.
En la actualidad, la mayoría de los medios de
cultivo
se
encuentran
comercializados,
normalmente, bajo la forma de liofilizados que
es preciso rehidratar. En general, la preparación
de un medio de cultivo se reduce simplemente a
pesar la cantidad deseada del mismo y
redisolverla en agua destilada (libre de
inhibidores del crecimiento) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Las sustancias termolábiles se esterilizan por
filtración y se añaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en
autoclave.
Antes de su esterilización, los medios líquidos
5
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en caldo se distribuyen en los recipientes
adecuados (tubos o matraces) y en ningún caso
la altura del líquido en el recipiente debe
exceder de un tercio del volumen total de éste.
Si es un medio sólido, habitualmente se procede
a fundir el agar en un baño María antes de
esterilizarlo. Los recipientes utilizados nunca
deben estar cerrados de forma hermética. Una
vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o
matraces (no en placas de PETRI), se tapa y se
esteriliza.
Caldos y medios sólidos de cultivo pueden
conservarse, una vez esterilizados, a temperatura
ambiente. Sin embargo, para reducir su
deshidratación y el consiguiente cambio de las
concentraciones de los componentes, es
preferible conservarlos a 4 ºC en refrigerador
pero nunca se deben congelar.
Cuando el medio de cultivo posee un pH inferior
a 5, debemos trabajar con sumo cuidado puesto
que el agar se hidroliza, por lo que se
recomienda no refundir, y en caso de absoluta
necesidad añadir más agar-agar base.
10. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN.
Sin ser exhaustivos podemos clasificarlos en
función de su acción:
•
•
•
•
Destrucción.
Calor (seco o húmedo).
Agentes químicos.
Radiaciones.
Agentes
mecánicos
ultrasonidos.
como
los
Separación.
• Filtración.
• Ultracentrifugación.
Inhibición.
•
•
•
Bajas temperaturas.
Desecación.
Liofilización.
11. CULTIVOS PUROS.
El aislamiento microbiano es la obtención de un
cultivo puro. Ya sabemos que un cultivo puro es
aquel que se desarrolla a partir de una célula y
que, por tanto, todos los microbios pertenecen a
la misma especie y cepa.
Los métodos para aislar cultivos puros difieren
según el tipo de cultivo.
En los medios líquidos se sigue una técnica de
dilución límite, así el microorganismo que se
busca en un cultivo mixto se va a encontrar en
mayor cantidad que cualquiera de los otros
microorganismos. Ello es posible conseguirlo
gracias al cultivo puro mediante una serie de
diluciones en tubo. Solo cuando la muestra esta
bien diluida contendrá la bacteria que se busca.
Así se recomienda la confirmación por la
siembra en placa en cuanto a la pureza del
cultivo.
En los medios sólidos se sigue una técnica de
siembra por estrías en placa, en el que se utiliza
un asa de platino, pasándose sobre una parte de
la superficie de un medio de cultivo a base de
agar y se siembra por estrías.
S. aureus en BGA
Salvador Camacho Garrido
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También puede utilizarse el aislamiento directo
en medio selectivo y diferencial. Este se
fundamenta en generar un ambiente de cultivo
diseñado que favorezcan el desarrollo de cierto
tipo concreto de bacterias que precisemos
conseguir y que no sea adecuado para el resto
microbiano.
E. coli en EMB-Levine
12. MANTENIMIENTO DE CULTIVOS
MICROBIANOS.
En cualquier laboratorio de biotecnología es
fundamental el mantenimiento y conservación
de las colecciones de microorganismos con las
que trabajamos ya que, obviamente, son nuestro
reactivo primordial. Existen una gran variedad
de métodos de mantenimiento y conservación de
los microorganismos cuya utilización va a
depender en parte de las características de los
diferentes microorganismos (bacterias, hongos,
virus, algas, protozoos), y en parte del tiempo
previsto:
Mantenimiento:
Cortos períodos de tiempo, días.
Conservación:
Largos períodos de tiempo, años,
Los objetivos de las colecciones de los
microorganismos son muy simples:
• Mantener los cultivos viables a lo largo
del tiempo.
• Mantener los cultivos puros, sin
contaminaciones.
• Mantener los cultivos sin cambios en
sus características, es decir estables.
13. TÉCNICAS DE MANTENIMIENTO
Subcultivo seriado:
Consiste en resembrar el microorganismo cada
cierto tiempo en un medio adecuado;
generalmente se utiliza agar inclinado ya que en
medio sólido se detectan mejor los
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contaminantes que en medio líquido y el hacerlo
inclinado tiene por objeto el evitar la desecación
rápida del medio.
Este método es válido para cortos períodos de
tiempo ( 1 semana - 15 días) por lo que deben
ser resembrados con frecuencia lo que
incrementa el riesgo de contaminación. Además,
al mantenerlos a temperatura ambiente, pueden
crecer y espontáneamente cambiar sus
características genéticas (mutación, pérdida de
plásmidos, etc.) que pueden afectar al carácter
por el que fueron seleccionados. Estos dos
inconvenientes pueden subsanarse en parte
ralentizando
el
metabolismo
de
los
microorganismos al mantenerlos a 4°C con lo
que su crecimiento es inferior y la necesidad de
hacer subcultivos se prolonga a 1 - 3 meses. En
microbiología industrial hay que pensar en
mantener las colecciones durante períodos de
años y no de meses, por lo tanto se utilizan otras
técnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen
los riesgos.
Desecación:
La eliminación del agua (deshidratación) es un
método
de
conservación
que
reduce
drásticamente el metabolismo. Sin embargo, no
todos los microorganismos sobreviven a estos
métodos de secado, por lo que se hace necesario
añadir agentes protectores (leche descremada,
glutamato sódico al 10%). Una vez secos es
importante mantener el producto sellado (tapón
de rosca, ampolla) para evitar el contacto con el
aire ya que son higroscópicos.
Los soportes que se suelen utilizar son arena,
suelo, gel de sílice, previamente secados y
esterilizados por calentamiento con aire caliente
(no utilizar autoclave y sí calor seco). Sobre
estos soportes se añade la suspensión de los
microorganismos y se deja secar a temperatura
ambiente.
También se pueden utilizar como soportes discos
o tiras de papel, agar, discos de gelatina donde
se añade la suspensión de microorganismos y
posteriormente se seca al vacío evitando la
congelación, lo que se denomina L-secado (Ldrying). Estos métodos de secado son
particularmente
útiles
para
conservar
microorganismos productores de esporas, como
los actinomicetos.
Congelación:
Al bajar la temperatura hasta el punto de
congelación o por debajo de éste se reduce el
metabolismo drásticamente hasta el caso de
prácticamente anularlo con nitrógeno líquido (7
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196°C).
Sin embargo, existen una serie de problemas que
debemos tener en cuenta. La formación de
cristales de hielo pueden romper las células,
además al eliminar el agua líquida por
convertirse en hielo existe una concentración de
sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos
problemas se deben utilizar suspensiones que
contengan el mínimo de sales posibles así como
utilizar agentes protectores como el glicerol
(25%) o dimetilsulfóxido (DMSO 10%) que
neutralizan el efecto de las sales. El realizar el
proceso de congelación de una forma rápida o
gradualmente
no
está
claro. Algunos
recomiendan una bajada gradual (1°C/min) hasta
-20°C para posteriormente enfriar rápidamente.
Sin embargo, la descongelación debe ser rápida.
Las distintas temperaturas que se utilizan para la
conservación de los microorganismos por
congelación son:
-30°C:
Congelador de frigorífico. No se recomienda
debido a la formación de eutécticos (suspensión
con distintos puntos de congelación debido a los
solutos que pueden dañar a las células).
-70°C:
Nieve
carbónica
(CO2
sólido)
o
ultracongeladores. Es el método más utilizado en
los laboratorios de microbiología.
-196°C:
Nitrógeno líquido. Se utiliza para la
conservación de bacterias, virus y líneas
celulares. Existen varios problemas prácticos: el
nitrógeno se evapora continuamente por lo que
se debe rellenar regularmente; se deben utilizar
recipientes que resistan bien estas temperaturas
y que estén bien cerrados para evitar la entrada
de nitrógeno líquido.
Liofilización:
Es el método más utilizado por las colecciones
internacionales de cultivos tipo para la
conservación de los microorganismos.
Básicamente consiste en congelar rápidamente
una suspensión de microorganismos y eliminar
el agua como vapor de agua directamente del
hielo sin pasar por el estado intermedio líquido.
Por lo tanto, combina las dos técnicas
anteriormente citadas ya que es una desecación
por sublimación. El sistema requiere tres
componentes: mecanismo de congelación,
bomba de vacío y una trampa de agua.
Los liofilizados se conservan entre 0 y 5°C
durante muchos años. Para su recuperación se
suspende el en el medio de cultivo adecuado y se
incuban a la temperatura adecuada. No obstante,
hay que estudiar, como en los casos anteriores
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(desecación y congelación), las condiciones
óptimas
de
supervivencia
de
nuestro
microorganismo.
14. MICROORGANISMOS
IMPLICADOS.
Debido a la gran variedad que presentan los
microorganismos no existe ningún método
óptimo para todos e incluso para un grupo
particular de microorganismos ya que lo que
funciona bien para algunos no es útil para otros.
No obstante, en líneas generales podemos
asumir lo siguiente:
Algas y cianobacterias:
La mayor parte de los cultivos se han mantenido
como subcultivos seriados a temperaturas entre
10 y 15°C. Para crecer estos cultivos se necesita
luz (fotosintéticos). Algunas cianobacterias
pueden conservarse bien desecadas ya que
presentan formas de resistencia (akinetos). En
general, las algas no aguantan bien la
liofilización ni la desecación. En cuanto a la
congelación los mejores resultados se obtienen
con nitrógeno líquido.
Bacterias:
Prácticamente se han usado todos los métodos
conocidos con buenos y malos resultados,
aunque en líneas generales el mejor método es la
liofilización debido a su facilidad de transporte.
Virus:
Se han utilizado todos los métodos obteniendo
en líneas generales baja supervivencia. Se
recomienda para su conservación durante largos
períodos de tiempo el nitrógeno líquido.
Hongos:
La mayoría de los hongos pueden conservarse
por desecación en suelo. Aunque, al igual que
las bacterias, presentan una gran diversidad
encontrándonos de todo.
15. CULTIVOS CELULARES.
Actualmente se entiende por cultivo celular al
conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento de las células “in vitro”,
manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Dependiendo del grado de preservación de la
estructura del tejido o del órgano de origen y de
su duración hablaremos de diferentes tipos de
cultivos: de órganos, explantes primarios o
secundarios,...
8
Ensayos Biotecnológicos
Se podría hablar de tres tipos de cultivos:
Cultivo de órganos:
Implica que la arquitectura característica del
tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte.
Para ello el órgano se mantiene en un medio del
que obtiene los nutrientes y al que puede liberar
los desechos y en el que mantiene su estructura
tridimensional, en general esférica. Este tipo de
cultivo permite mantener los tipos celulares
diferenciados y es por ello una buena réplica del
tejido de origen, pero por el contrario no permite
su propagación pues el crecimiento, de
producirse, se limita a la periferia y es debido
fundamentalmente a los tipos celulares
embrionarios. La imposibilidad de propagar
obliga a partir en cada nuevo experimento de
nuevo material animal lo que conlleva una
elevada heterogeneidad.
Explantes primarios:
Fragmentos de tejidos o de órganos que se
adhieren a una superficie y en la que proliferan
las células de la periferia del explante.
Cultivo celular:
Supone una disgregación celular ya sea por
medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión
celular se puede cultivar como una monocapa
adherente o en suspensión en el medio de
cultivo. Este tipo de cultivo permite su
propagación, aumentando notablemente la masa
celular del cultivo a lo largo de las generaciones.
Como característica negativa se pierde la
heterogeneidad celular de partida, la población
se hace uniforme y homogénea al predominar en
el cultivo aquellos tipos celulares que tienen
superior tasa de crecimiento.
Salvador Camacho Garrido
Algunas definiciones que son importantes son:
• Cultivo primario
Cultivo establecido a partir de un tejido u
órgano. Las células mantienen la viabilidad un
periodo de tiempo limitado y no se reproducen
en cultivo. En general en cultivo presentan una
reducción en el número total de células vivas a
lo largo del tiempo. Ejemplos: hepatocitos
obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc.
Cultivo de piel
• Línea primaria
Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano
que se mantiene un periodo de tiempo limitado
pero con reproducción de las células en el
cultivo. Ejemplos: fibroblastos dérmicos,
queratinocitos, células endoteliales de aorta
bovina (BAEC), células endoteliales de cordón
umbilical (HUVEC), etc.
• Línea celular continua
Cultivo que se establece a partir de un tejido u
órgano, en muchos casos de un tumor, y que se
mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata
de células “inmortales”.
16. MEDIOS DE CULTIVO
CELULARES.
Medios base:
Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified
Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc.
Componentes:
Hidratos de Carbono, ácidos grasos esenciales y
otros lípidos, aminoácidos, sales minerales,
oligoelementos.
Aditivos:
Antibióticos: Estreptomicina (Gram +/-),
penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y
hongos)
Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc.
Indicador pH.
Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (250%).
Aditivos específicos: Suplemento de piruvato,
suplemento de glucosa, etc.
9
Ensayos Biotecnológicos
17. MANTENIMIENTO DE CULTIVOS
CELULARES.
El cultivo de las células no presenta las mismas
dificultades independientemente del tipo de
célula de que se trate. Hay grandes diferencias
que se relacionan fundamentalmente con el
grado de diferenciación del tipo celular. Así
pues, en general, se puede establecer como
norma que una línea celular será tanto más fácil
de establecer o cultivar cuanto más
indiferenciada sea, con las excepciones de las
líneas tumorales de células diferenciadas.
Las células se cultivan y mantienen a una
apropiada temperatura y mezcla de gases
(habitualmente 37 ºC, 5% CO2 y 95% O2) en un
incubador celular. Las condiciones de cultivo
varían ampliamente para cada tipo celular, y la
variación de las condiciones para un tipo celular
concreto, puede dar lugar a la expresión de
diferentes fenotipos.
Además de la temperatura y la mezcla de gases,
el factor más comúnmente variado en los
sistemas de cultivo es el medio de crecimiento.
Las recetas para los medios de crecimiento
pueden variar en pH, concentración de glucosa,
factores de crecimiento y la presencia de otros
componentes nutritivos. Los factores de
crecimiento usados para suplementar a los
medios derivan a menudo de sangre animal,
como el suero bovino. Estos ingredientes
derivados de la sangre plantean una potencial
contaminación con virus o priones de los
productos farmacéuticos derivados. En la
actualidad se tiende a minimizar o eliminar el
uso de estos ingredientes cuando sea posible.
Las células pueden crecer en suspensión o de
manera adherente. Algunas células viven de
forma natural sin adherirse a una superficie,
como las que existen en el torrente sanguíneo.
Otras necesitan una superficie, como la mayoría
de células derivadas de tejidos sólidos. A las
células que crecen sin unirse a una superficie se
las llama cultivos en suspensión. Algunos
cultivos celulares adherentes pueden crecer en
plástico para el cultivo de tejidos, que puede
estar recubierto con componentes de la matriz
extracelular para aumentar sus propiedades de
adhesión y proporcionar otras señales necesarias
para el crecimiento y diferenciación.
Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo
organotípico que consiste en cultivar las células
en un ambiente tridimensional a diferencia de las
placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de
cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente
similar al tejido vivo. Sin embargo presenta
dificultades técnicas debido a varios factores
(por ejemplo: difusión).
Salvador Camacho Garrido
Una de las primeras líneas celulares humanas, obtenida
de HENRIETTA LACKS, quien falleció de cáncer de útero a
partir de cuál se obtuvieron estas células. El cultivo de
células HeLa que se muestra en la imagen fue teñido
con Hoescht que se une al ADN coloreando de azul el
núcleo.
Propiedades físico-químicas del
Medio:
CO2: Normalmente 5% (2-8% dependiendo del
tipo celular y HCO3pH: (7,0 – 7,7)
Osmolaridad: (290-320) mOsm/Kg
Viscosidad: Suero
Temperatura: 37 ºC en mamífero (aves: 38,5ºC;
epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)
18. BUENAS PRÁCTICAS DE
LABORATORIO.
Las Buenas Prácticas recogen los principales
aspectos que deben asegurarse en un laboratorio
para que los resultados de los ensayos sean
adecuados; y siempre se ha insistido que los
requisitos deben cumplirse con sentido común,
porque no se trata de provocar que la actividades
sean más engorrosas y complicadas; sino por el
contrario, de lograr el buen desenvolvimiento
del trabajo minimizando el esfuerzo.
Los aspectos a considerar son:
• Organización
• Personal
• Instalaciones
• Equipos, Instrumentos
• Reactivos
• Material de laboratorios
10
Ensayos Biotecnológicos
•
•
•
•
•
Métodos analíticos
Muestras
Seguridad
Sistema de Calidad
Documentos
BPL
19. TOMA DE MUESTRAS.
Las muestras deben reunir los requisitos:
• Deberán reflejar las condiciones
generales del lote.
• Se recogerán asépticamente y se
protegerán
de
la
contaminación
exógena.
• Se mantendrán, o no, (en función del
tipo de muestras: congeladas, no
congeladas, perecederas) en las mismas
condiciones.
• Se debe realizar el análisis en tiempo no
superior a 12-24 horas desde la toma de
muestra.
• Debe existir un compromiso entre el
número de muestras para preparar y
analizar y la economía del análisis.
Tanto el número, como el procedimiento de
muestreo así como la preparación y
mantenimiento de la muestras, va a depender del
tipo de muestra y del tipo de ensayo o
diagnóstico que se quiere realizar.
La trazabilidad de las muestras debe estar
garantizada. El sistema de alto rendimiento o
"high throughput" deriva en una gran cantidad
de datos generados que hay que gestionar y
analizar con programas específicos. Por ello el
laboratorio deber contar con un sistema
informatizado
tipo
LIMs
(laboratory
information management systems) que permita
la trazabilidad de cada muestra desde su entrada
hasta el resultado final del análisis.
Salvador Camacho Garrido
EXUDADO NASAL
Muestras nasales (cultivo de fosas nasales):
1. Selección
a. La muestra a elección; es la tomada con un
hisopo al menos a un centímetro dentro de la
fosa nasal.
b. Las muestras de lesiones nasales deben
tomarse del borde creciente de las lesiones.
2. Método
a. Inserte cuidadosamente el hisopo humedecido
con solución salina o agua estéril, al menos un
centímetro dentro de la fosa nasal.
b. Tome la muestra firmemente dentro de la fosa
nasal, rotando el hisopo y dejándolo en un
mismo lugar por 10 a 15 segundos.
c. Retire el hisopo e insértelo en su contenedor
de transporte y lleve la unidad de muestreo al
laboratorio para su cultivo.
3. Etiquetado
a. Etiquete el contenedor con el hisopo con la
información del paciente.
b. Indique si es posible, el grado o probabilidad
de exposición.
4. Transporte
a. Transporte la muestra al laboratorio tan pronto
como sea posible
b. No refrigere las muestras que se destinen para
cultivo.
ADN
1. Muestras directas
Existen un gran número de diferentes muestras
biológicas directas que pueden ser usadas con el
propósito de realizar pruebas de ADN. En la
mayoría de las situaciones, se toma una muestra
de saliva de la parte de la mejilla con un
bastoncillo de algodón. A esto se le conoce como
una muestra bucal (buccal swab) y se trata de un
proceso simple e indoloro de tomar muestras de
ADN de una persona. Las muestras bucales se
han convertido muy pronto en el método más
popular para recoger muestras biológicas
directas para realizar pruebas de ADN.
Dicho esto, pueden surgir situaciones donde no
se quiere o no se puede aportar una muestra
bucal de ADN. En algunos casos, una de las
partes no tiene la voluntad de aportar una
muestra biológica directa. Aunque, existen otras
situaciones en donde una persona puede que
haya fallecido o no se encuentre disponible
físicamente, por consiguiente, no están
disponibles para aportar una muestra biológica
directa de ADN para realizar el examen en
cuestión. Si esto sucede, existen un número de
alternativas a la hora de recoger muestras
biológicas directas, y que por lo tanto pueden
11
Ensayos Biotecnológicos
también ser usadas. Entre estas, podemos
incluir; la sangre, el cabello, las uñas, los huesos
y el semen.
2. Tipos Alternativos de Muestras:
La sangre, solía ser la principal muestra cuando
se trataba de utilizar muestras biológicas directas
que fuesen usadas para pruebas de ADN. Las
muestras de sangre de una persona, pueden ser
examinadas para obtener ADN de muchas
formas diferentes, incluyendo una extracción de
sangre, sangre sobre un material, sangre seca y
manchas o salpicaduras de sangre. Cuando se
introdujo los bastoncillos bucales a la gran
comunidad científica, las muestras de sangre,
ocuparon un segundo lugar, frente a este nuevo
procedimiento.
El cabello, también puede ser usado como una
muestra biológica directa para realizar pruebas
de ADN. Sin embargo, si se va a usar el cabello
para una prueba de ADN, este deberá tener
incorporado o la raíz o el folículo. Además de
esto, la muestra necesitará contener una cierta
cantidad de cabello, y es esencial, evitar
cualquier tipo de contaminación de la muestra,
manipulando
la
muestra
con
guantes
esterilizados.
Tan extraño como puede parecer, las uñas
también pueden usarse como muestras
biológicas directas. Las uñas contienen las
propiedades generales del cabello, por eso es por
lo que pueden ser usadas para extraer ADN y su
posterior examen. Se utiliza una muestra de
estas, cuando la persona acaba de fallecer. Es
mejor utilizar muestras de uñas recién cortadas.
Otra fuente para obtener muestras biológicas
directas, son los huesos. Estas muestras no se
usan comúnmente, ya que son difíciles de
conseguir. De hecho, no todas las instalaciones
que realizan pruebas de ADN, están equipadas
para realizar este tipo de exámenes de ADN. Los
huesos, son solo usados como muestras para su
examen, cuando una persona ha fallecido.
3. Objetos con ADN impreso
A la mayoría de nosotros nos enorgullece
mostrar nuestras preciosas perlas blancas. Nos
las cepillamos, nos damos con hilo dental y nos
las enjuagamos para mantener nuestros dientes
brillantes y limpios. De lo que no nos damos
cuenta, es del hecho de que, mientras más nos
cepillemos nuestros dientes, más ADN se
impregnará en nuestro cepillo de dientes. Un
cepillo de dientes que ha sido usado por una
persona, es una muestra excelente para obtener
ADN. Si piensa en esto, funciona de forma
similar a los bastoncillos de algodón usados en
una prueba abierta de ADN. Para enviar un
cepillo de dientes para una prueba de ADN, no
Salvador Camacho Garrido
se deben tocar las cerdas y dejar que se seque el
cepillo, antes de ponerlo en la bolsa de plástico
para ser enviado.
Dos objetos diarios usados para pruebas de
ADN, y que tienen perfectamente sentido
cuando piensa en ellos, son los sobres y sellos.
Cuando una persona envía una carta,
normalmente lamen la parte del sobre donde se
encuentra el adhesivo, y si no están usando
sellos con auto adhesivo, también suelen lamer
estos también. Dicho esto, antes de gastarse un
dinero en una prueba de ADN, debería de
cerciorarse, de que los objetos fueron lamidos
realmente.
Uno de los mejores objetos diarios que pueden
ser usados para pruebas de ADN, son los gomas
de mascar o común mente conocidas como
chicles. Dicho esto, una muestra de chicle debe
ser pura y no estar contaminada. Sea cuidadoso,
y no manipule el chicle con los dedos desnudos,
recójalo con una bolsa limpia de plástico y
póngalo en una bolsa limpia de plástico.
Fumar no es simplemente un hábito que puede
matar, sino que también puede pillar la
paternidad de una persona. Las colillas de los
cigarrillos, contienen evidencias de ADN.
Mientras más se fume con ese cigarrillo,
mayores serán las evidencias de ADN que esté
almacenará. Para enviar un cigarrillo como
fuente de obtención de ADN, deberá encontrar
varías colillas que hayan sido fumadas por la
persona en cuestión.
OTRAS MUESTRAS
Análisis de la expresión del Gen mdr1
(Multidrug Resistance)
TIPO MUESTRA: S.P (EDTA)
VOLUMEN: 2 ml.
TIEMPO: 15 días
CONSERVACIÓN: 4ºC
TÉCNICA: Secuenciación
Acondrogénesis
(Secuenciación COL2A1)
TIPO MUESTRA: S.P(EDTA)
VOLUMEN: 5ml
TIEMPO: 30 días
CONSERVACIÓN: 4ºC
TÉCNICA: Secuenciación
Genes BRCA 1 y 2
(Secuenciación intrón - exón de los genes BRCA 1 y 2.)
TIPO MUESTRA: S.P. (EDTA)
VOLUMEN: 10 ml.
TIEMPO: 90 días
CONSERVACIÓN: 4º C
TÉCNICA: Secuenciación
Bacterias patógenas
TIPO MUESTRA: S.P. (EDTA), suero, LCR
VOLUMEN: 2ml
TIEMPO: 5 días
CONSERVACIÓN: 4ºC
TÉCNICA: PCR
12
Ensayos Biotecnológicos
Paternidad
TIPO MUESTRA: S.P. (EDTA), escobillón en seco, saliva
VOLUMEN: 5 ml
TIEMPO: 15 días
CONSERVACIÓN: 4º C
TÉCNICA: Gene Scan
20. PREVENCIÓN DE RIESGOS.
En los laboratorios de los centros de
investigación biológica y/o biotecnológica, es
necesaria la utilización en el transcurso de la
investigación de diferentes productos químicos,
radiactivos y material biológico, principalmente
en las áreas de biología molecular, biomedicina
y biotecnología. Los trabajadores están
expuestos a diferentes tipos de riesgos, que los
podemos catalogar en tres grandes grupos:
radiactivos, químicos y biológicos y por tanto es
necesario establecer un plan específico de
evaluación y control para disminuir estos
riesgos. En algunos de estos centros, debido al
número de instalaciones y al número de usuarios
existen servicios específicos denominados de
Seguridad Biológica y
de Protección
Radiológica, que gestionan y controlan la
prevención de estos riesgos específicos.
QUÍMICOS
RIESGOS
Productos
Químicos
Tóxicos
FÍSICOS
BIOLÓGICOS
Virus
Bacterias
Parásitos
Hongos
Cultivos celulares
Animales
Radiaciones ionizantes
* Radioisótopos
* Equipos de Rayos X
* Irradiadores
Radiaciones no ionizantes
Luz Ultravioleta
Ultrasonidos
21. RIESGOS BIOLÓGICOS.
La manipulación y/o la exposición a los agentes
biológicos: virus, bacterias, parásitos, hongos, y
organismos modificados genéticamente puede
suponer un riesgo real para los trabajadores y el
medio ambiente. Las áreas donde se manipulan
estos agentes biológicos en la experimentación
son principalmente las siguientes: microbiología,
inmunología, parasitología, biología celular y
molecular, genética y neurobiología.
Las vías de transmisión de estos agentes
biológicos son: la vía respiratoria, la vía
dérmica, la vía digestiva, y la vía parenteral.
Debido al riesgo que puede suponer para los
trabajadores es necesario establecer un plan
Salvador Camacho Garrido
específico de prevención de riesgos biológicos.
Según la legislación vigente están descritos
diferentes niveles de bioseguridad de acuerdo
con la probabilidad del riesgo de infección y las
medidas disponibles. Estos niveles van del nivel
1, de bajo riesgo hasta el nivel 4 de alto riesgo,
que están descritos, tanto para los laboratorios
cómo para animalarios.
Contención
El término contención utilizado en bioseguridad
se refiere a los métodos seguros para la
manipulación de material biológico infeccioso
en un laboratorio. El objetivo es reducir o
eliminar la exposición de los trabajadores y el
medio ambiente. Esto implica la utilización de
prácticas y técnicas de laboratorio específicas y
los equipos de seguridad (barreras primarias),
principalmente cabinas de seguridad biológica
y/o equipos de protección personal y un diseño y
construcción del laboratorio específico (barreras
secundarias) de acuerdo con los niveles de
contención y/o bioseguridad.
Plan de protección
Para establecer el plan de protección biológica
es preciso realizar una evaluación del riesgo, que
conlleva una evaluación de cada uno de los
puestos de trabajo.
Según la legislación vigente para establecer la
reducción de los riesgos biológicos es necesario
tener en cuenta diferentes aspectos: mínimo
número de trabajadores expuestos, medidas de
seguridad en la recepción, manipulación y
transporte de agentes biológicos, medidas de
protección colectiva y/o equipos de protección
personal, gestión de residuos biológicos,
medidas higiénicas, señalización del biorriesgo,
plan de emergencia, vigilancia de la salud de los
trabajadores y establecer los planes de
formación en bioseguridad precisos. Toda la
información, a disposición de los trabajadores,
deberá estar contenida en el Manual de
Bioseguridad de los laboratorios.
En los centros de investigación biológica se
utilizan diferentes tipos de agentes biológicos,
principalmente en cultivos celulares y/o en
animales de experimentación, por lo que es
necesario disponer de las instalaciones y/o
laboratorios con el diseño y la contención
específica.
En cuanto a los
organismos modificados
genéticamente se clasifican, según la legislación
vigente: de bajo riesgo y de alto riesgo. Las
categorías de confinamiento de estos son de
acuerdo con las especificaciones del 1 al 3. La
13
Ensayos Biotecnológicos
utilización de estos organismos modificados
genéticamente implica la evaluación del riesgo y
clasificación de los mismos para establecer las
medidas de contención precisas y las medidas de
protección según la legislación específica en esta
materia.
Formación
En cuanto a los planes de formación en la
manipulación segura de agentes biológicos
deberán estar establecidos para los usuarios de
los mismos, siendo el empresario el responsable
de habilitar las medidas necesarias para
establecer los planes de formación en esta
materia.
22. AGENTES BIOLÓGICOS.
CLASIFICACIÓN.
Se incluyen dentro de la definición de agentes
biológicos a los microorganismos, con inclusión
de los genéticamente modificados, a los cultivos
celulares y a los endoparásitos humanos,
susceptibles de originar cualquier tipo de
infección, alergia o toxicidad.
El concepto de agente biológico incluye, pero no
está limitado, a bacterias, hongos, virus,
protozoos, rickettsias, clamidias, endoparásitos
humanos, productos de recombinación, cultivos
celulares humanos o de animales y los agentes
biológicos potencialmente infecciosos que estas
células puedan contener, priones y otros agentes
infecciosos
La Directiva 90/679/CEE sobre la protección de
los trabajadores contra los riesgos relacionados
con la exposición a agentes biológicos, en el
artículo 2 establece la clasificación de los
agentes biológicos en cuatro grupos de riesgo,
según su diferente índice de riesgo de infección.
Agente biológico de grupo 1:
Agente biológico que resulte poco probable que
cause enfermedad en el hombre.
Agente biológico de grupo 2:
Agente patógeno que pueda causar una
enfermedad en el hombre y pueda suponer un
peligro para los trabajadores; existen
generalmente profilaxis o tratamientos eficaces.
Agente biológico de grupo 3:
Agente patógeno que pueda causar una
enfermedad grave en el hombre y presente serio
peligro para los trabajadores; existe el riesgo de
que se propague a la colectividad pero existen
generalmente profilaxis o tratamientos eficaces.
Agente biológico de grupo 4:
Agente patógeno que puede causar una
enfermedad grave en el hombre y presente serio
peligro para los trabajadores; existen muchas
Salvador Camacho Garrido
probabilidades de que se propague a la
colectividad; no existen generalmente profilaxis
o tratamientos eficaces.
Estos niveles de riesgo condicionan las medidas
preventivas tanto individuales como colectivas,
la manipulación del material biológico, la
instalación del laboratorio, las medidas de
protección, las técnicas de laboratorio, etc.
23. NORMAS DE ASEPSIA Y
SEGURIDAD.
Es necesario siempre hacer las siguientes
presunciones:
• Todo microorganismo utilizado en el
laboratorio es potencialmente peligroso.
• Todo fluido de cultivo contiene
organismos potencialmente patógenos.
• Todo fluido del cultivo (incluido los
aerosoles que se puedan formar)
contienen sustancias potencialmente
tóxicas e infecciosas.
Por ello se intenta que no toquen ninguna de las
vías de entrada a nuestro organismo.
Sin menoscabo de que siempre hay que seguir al
pie de la letra, tanto las instrucciones del
profesor, como las de los métodos y protocolos a
utilizar, debemos como normas generales tener
presente, no para aprenderlas, sino para
aplicarlas de la forma más rigurosa posible, las
siguientes:
• Siempre debe usarse bata, y esta no debe
salir del laboratorio salvo para su
lavado. Ante la sospecha de trabajar con
bacterias muy infecciosas se debe
utilizar guantes desechables.
• Está terminantemente prohibido comer,
beber o fumar. Tampoco chicle ni
morder bolígrafos.
• Las etiquetas deben ser autoadhesivas,
para evitar la tentación de usar la lengua
para humedecerlas. En cualquier caso es
preferible la utilización de lápices
grasos y rotuladores vitrográficos.
• En un cuaderno deben registrarse todos
los accidentes por pequeños que puedan
parecer. Heridas y rozaduras deben
14
Ensayos Biotecnológicos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
cubrirse perfectamente. Los cultivos
derramados, no se cogen salvo 15 ó 20
minutos después de haber sido tratado él
y su entorno con una solución
bactericida.
Debe tenerse siempre presente la
formación de aerosoles, que puede
ocurrir simplemente al abrir un tubo.
Los cultivos de hongos deben ser
manipulados sin movimientos bruscos y
en campana a ser posible, pues sus
esporas presentan tanto riesgos de
infección como de anafilaxis.
Las asas y agujas de inoculación deben
esterilizarse antes y después de cada uso
evitando cualquier proyección de
material.
Los tubos de cultivo deben estar siempre
en gradillas o en su defecto en vasos al
uso.
A las placas de recuento de un alimento
no se las puede consideran inocuas sólo
porque el alimento pueda ser
consumido. Muchos patógenos como
Staphylococcus y Salmonella pueden
desarrollarse en ese medio en muy poco
tiempo.
Si se usa algodón en pipetas, éste no
evita la contaminación del usuario, sino
que es una precaución para el inóculo,
por lo que nunca se debe pipetear con la
boca, sino usar peras de goma o
similares.
Para evitar aerosoles, el vaciado de
pipetas y líquidos en general, debe
efectuarse lentamente, sin menoscabo de
retrasos entre distintas operaciones.
Las pipetas usadas deben retirarse a
recipientes que contengan solución
desinfectante, así como los portaobjetos
y cubreobjetos una vez separados.
El uso de homogeneizadores y
agitadores debe hacerse tomando
precauciones contra la contaminación
propagada por aire.
No deben utilizarse con cultivos
patógenos las cámaras de siembra de
presión positiva.
Una vez acabado el trabajo, la zona de
trabajo debe quedar perfectamente
limpia y desinfectada y todo el material
usado recogido y listo para ser
esterilizado.
Deben
lavarse
las
manos
cuidadosamente antes y después del
trabajo de laboratorio, y siempre que se
Salvador Camacho Garrido
•
•
abandone el mismo.
Todos los alumnos deben saber ubicar
correctamente el botiquín, los lavaojos,
las duchas de emergencia, los extintores
y cualquier elemento de seguridad.
Ante cualquier duda, siempre, consulta
al profesor.
Además de los citados para los laboratorios
microbiológicos en general:
• Es necesario preparar cada sesión de
trabajo leyendo cada ensayo a efectuar y
familiarizándote con los principios y
métodos implicados.
• Al laboratorio sólo debe llevarse lo
imprescindible
para
el
trabajo:
cuaderno, manual y material de
escritura.
24. VÍAS DE INFECCIÓN.
Las principales vías de entrada de infección en
el organismo son:
• Vía respiratoria: generalmente por
inhalación de aerosoles (también
vapores y gases). Es la principal vía.
• Vía digestiva: ingestión de sólidos y
líquidos, a través de la boca, esófago,
estómago y los intestinos.
• Vía parenteral: a través de cortes y
rozaduras o contacto directo en sangre.
• Vía dérmica:
o Piel: algunos microorganismos como
Brucella pueden penetrar a través de la piel
intacta.
o Ojos:
contacto
directo.
Muchos
microorganismos pueden utilizar como
puerta de entrada los ojos para la infección
sin producir lesiones locales, por lo que a
veces se olvida esta vía.
25. HIGIENE EN EL TRABAJO DEL
LABORATORIO BIOLÓGICO.
Si bien en cualquier trabajo experimental como
los de laboratorio de cualquier tipo, es esencial
la limpieza y el orden, en el caso del laboratorio
15
Ensayos Biotecnológicos
de biotecnología estos aspectos suelen ser
críticos, y no sólo por motivos de seguridad,
sino de la fiabilidad de los resultados obtenidos.
Cualquier persona que trabaje en un laboratorio
de biotecnología debe tener una actitud
combativa en cuanto a la limpieza y el orden. Se
trata no sólo de cumplir de forma rigurosa todas
las normas al efecto, sino de hacerlas cumplir,
puesto que tanto su salud como la calidad de su
trabajo se ve afectada, no sólo por lo que uno
haga, sino también por lo que hagan los demás.
Cualquier norma, por extraña que pueda parecer
en un principio, persigue la calidad del trabajo
en condiciones de seguridad.
Debe tenerse siempre presente que se trabaja con
algo vivo y potencialmente peligroso, para
nuestra salud y la de los demás.
La infección puede ser bidireccional por lo que
entraña riesgos para:
• La salud: Aunque la mayoría de las
muestras no presentan patogenicidad
alguna, siempre cabe la posibilidad de
contraer alguna enfermedad por no
seguir las instrucciones dadas, o no
utilizar todos los medios de protección
individuales y colectivos a nuestro
alcance.
• La calidad del trabajo: Tanto nosotros,
como el material que usamos, podemos
considerarnos como foco de infección y
contaminación para nuestras muestras,
por lo que de nada valdrá nuestro
trabajo si a nuestras muestras y medios
de cultivo los contaminamos por no
seguir la técnica adecuada o trabajar sin
la higiene requerida.
Deben tomarse las normas no como algo
restrictivo a nuestra individualidad, sino como
una herramienta para el aseguramiento de la
calidad en condiciones de seguridad para las
personas, los materiales y los equipos.
26. LIMPIEZA Y ELIMINACIÓN DEL
MATERIAL.
Cualquier trabajo que se realiza en un
laboratorio precisa de una limpieza esmerada, y
aún más en el caso de un laboratorio de
biotecnología debido a que el material se puede
contaminar con mayor facilidad.
Por otro lado, el proceso de limpieza es
generalmente más complejo que el de un
laboratorio químico o físico-químico, puesto que
no solamente es necesario la limpieza sino la
esterilización del material.
También es necesario tener en cuenta, por
respeto al medio ambiente y en cumplimiento de
Salvador Camacho Garrido
estrictas normas de salubridad, que la
eliminación
del
material
desechable
contaminado debe realizarse en las debidas
condiciones de seguridad, por lo que, como ya
se insistirá más adelante, todo el material que se
deseche debe estar en condiciones de esterilidad
absoluta sobretodo los residuos infecciosos.
Como en toda gestión de residuos, en primer
lugar deberían no generarse residuos o que éstos
fueran mínimos. Si esto no es posible, los
residuos se deberían reutilizar. Si tampoco es
posible se deberán tratar y finalmente eliminar
de forma segura.
En cada laboratorio debe establecerse un
procedimiento de gestión de residuos que
considere todos los tipos de residuos que se
generan: banales (no especiales o no peligrosos)
o peligrosos (especiales).
27. RESIDUOS INFECCIOSOS.
Se considera residuo infeccioso a "aquél que es
capaz de producir una enfermedad infecciosa".
Como no existe un test lo suficientemente
confiable para valorar la “infectividad” de los
residuos, conduce a que los volúmenes de
residuos infecciosos tengan una gran
variabilidad.
Para el análisis más preciso de este concepto se
deben tener en cuenta los siguientes requisitos
básicos:
1. Presencia de un agente infeccioso en el
residuo.
2. Concentración suficiente del agente
infeccioso, como para tener capacidad
infectiva.
3. Presencia de un huésped susceptible.
4. Presencia de una puerta de entrada para
el acceso del germen al huésped.
Se considera como residuo infeccioso a:
• Residuos microbiológicos: Medios de
cultivo y todo material empleado en el
laboratorio de microbiología para el
cultivo y conservación de agentes
microbianos.
• Sangre y productos derivados de la
sangre.
• Tejidos y órganos humanos.
• Todo instrumental o material punzocortante (agujas, escalpelos, …).
• Restos
anatómicos
parciales
o
completos de animales contaminados
empleados en investigación.
28. TRATAMIENTO DE RESIDUOS
INFECCIOSOS.
Los métodos considerados válidos en
la
16
Ensayos Biotecnológicos
actualidad son:
1. Incineración (hornos pirolíticos)
2. Esterilización por autoclave (calor
húmedo)
3. Descontaminación química
4. Compactación-trituración
combinado
con descontaminación química
5. Inactivación térmica (microondas)
6. Esterilización por autoclave combinado
con trituración y compactación
En función del tipo de residuos:
• Residuos microbiológicos: autoclave,
incineración,
descontaminación
química.
• Sangre y sus derivados: autoclave,
incineración,
descontaminación
química, sistema cloacal.
• Tejidos y órganos: incineración.
• Material punzo-cortante: incineración.
• Restos de animales de investigación:
incineración.
29. EQUIPOS DE PROTECCIÓN EN EL
LABORATORIO.
Dentro del laboratorio existen una serie de
elementos de seguridad cuya ubicación y
perfecto funcionamiento debe ser conocido por
el analista.
Entre otros:
•
•
•
•
•
•
Elementos contra incendios
Sistemas automáticos contra incendios.
Generalmente mediante rociadores o
aspersores con detección automática.
Puertas cortafuegos. Dotadas con
sistema de apertura antipánico.
Mangueras/Bocas de incendio. Si bien el
agua es un buen elemento contra
incendios por sus propiedades físicoquímicas, sobre todo por su capacidad
de absorber calor, no debe utilizarse con
disolventes inflamables salvo que se le
haya adicionado espumógeno.
Extintores:
• De polvo: Tipo A (para sólidos),
tipo B (para líquidos) y tipo C
(para gases).
• De CO2: Para conductores
eléctricos y electrónicos.
• Especiales: Tipo D para metales
activos.
Mantas ignífugas. Útiles para el control
de pequeños incendios y para tapar a
personas que se han incendiado.
Duchas de seguridad. Sólo para
personas incendiadas y que no tengan
Salvador Camacho Garrido
que efectuar un desplazamiento
excesivo. El correr aporta aire que aviva
el fuego.
Elementos anti-inhalación
• Sistema de ventilación. Mediante un
sistema
de
ventilación
forzada.
Ventilación del laboratorio que debe ser
eficaz e independiente del resto de las
dependencias. La circulación del aire
debe ir siempre de la zona menos
contaminada
a
la
zona
más
contaminada. A veces se trabaja
manteniendo en depresión el laboratorio
respecto de las zonas colindantes.
• Vitrinas extractoras:
• Generales.
• Para disolventes orgánicos.
• Microbiológicas.
Sistemas anti salpicaduras
• Duchas de seguridad.
• Lavaojos.
30. EQUIPOS DE PROTECCIÓN
INDIVIDUAL.
También denominados EPIs es cualquier equipo
destinado a ser llevado o sujetado por el
trabajador para que le proteja de uno o varios
riesgos que puedan amenazar su seguridad o su
salud en el trabajo, así como cualquier
complemento o accesorio destinado a tal fin.
Todo EPI debe de llevar el marcado CE. El
fabricante debe especificar las características del
equipo (nivel de prestación, para qué sustancias
está indicado, tiempo de penetración,…).
El uso de un EPI o varios puede resultar molesto
para el usuario, por lo que al seleccionarlo hay
que considerar el grado de seguridad que debe
proporcionar y la comodidad del usuario.
Protección e cara y ojos
• Pantallas faciales. Cubren toda la cara
del usuario. Las que protegen de algún
tipo de radiación tienen que llevar filtros
especiales. Deben utilizarse durante la
manipulación de: líquidos corrosivos y
criogénicos.
• Gafas. Protegen lo ojos del trabajador.
En caso de riesgo de exposición a
radiaciones
ópticas
(ultravioleta,
infrarrojo o láser) se han de utilizar
filtros
apropiados.
Durante
la
permanencia en los laboratorios, deben
utilizarse siempre.
17
Ensayos Biotecnológicos
Protección de la piel
• Guantes de protección. Protege la
mano, o parte de ella, del usuario. A
veces cubre el brazo. Los guantes se
deben utilizar durante la manipulación
de sustancias tóxicas, corrosivas o
irritantes:
• Guantes
para
productos
químicos.
• Guantes
para
productos
biológicos.
• Guantes para riesgos térmicos
(frío o calor).
• Ropa. Se aconseja llevar ropa de
algodón. La ropa que contiene una
elevada proporción de material sintético
no debe usarse. Evitar trabajar en el
laboratorio con corbatas, medias,
pulseras y cabellos largos. En caso
necesario, se deben utilizar zapatos
apropiados, antiestáticos (para permitir
la continuidad eléctrica con tierra) y con
punta reforzada. A veces es conveniente
el uso de mandiles de uso específico.
Protección respiratoria
•
•
Equipos
dependientes del medio
ambiente. Retienen o transforman los
contaminantes presentes en el aire del
ambiente. Están formadas por: el
adaptador facial y el filtro. El adaptador
facial
asegura
un
espacio
herméticamente cerrado alrededor de las
vías respiratorias, de manera que el aire
no pueda acceder a las vías respiratorias
si no es a través del filtro:
• Máscara completa.
• Mascarilla.
• Mascarilla autofiltrante.
Equipos independientes del medio
ambiente. Se utilizan para casos
especiales como aire deficiente de
oxígeno, elevada concentración de
agentes tóxicos o presumible presencia
de gases tóxicos inodoros. El aire
respirado no es el del medio ambiente:
• Equipos semiautónomos: o
boquillas, que utilizan el aire
proveniente de recipientes a
presión fijos.
• Equipos autónomos: con aire
transportado por el usuario.
Salvador Camacho Garrido
31. EL TRABAJO EN EL
LABORATORIO.
Cuaderno de laboratorio
Todo el trabajo experimental realizado en el
laboratorio debe registrarse en un cuaderno
adecuado, de la forma más detallada posible o
cuando menos con notas muy completas. A
veces algo que parece totalmente superfluo a la
hora de elaborar un informe, resulta crucial.
No existe un cuaderno limpio y otro sucio de
laboratorio, existe un único cuaderno, que debe
llevarse al día, en el que se ponga la fecha, y del
que no puede arrancarse página alguna, por lo
que se recomienda el tipo encuadernado y
numerado. Bajo ningún concepto se utilizarán
hojas sueltas.
Los datos e informaciones se pasan directamente
al cuaderno una vez generados, nunca confíes en
la memoria.
Cíñete a los hechos, ni divagues ni editorialices.
Utiliza sólo tinta negra y permanente.
Mantén el cuaderno limpio; evita manchas y
vertidos.
Utiliza términos aceptados universalmente sobre
todo cuando utilices abreviaturas, nombres
codificados o códigos numéricos.
Reserva las últimas hojas para elaborar al final
una tabla de contenidos y un índice del cuaderno
una vez se acabe.
Informes de laboratorio
Deben elaborarse informes de cada uno de los
trabajos realizados. A nivel dicente deben seguir
un único modelo, que puede ser personal, que
debe incluir al menos los siguientes puntos:
• Número.
• Título.
• Objetivo.
• Material y equipos usados.
• Reactivos.
• Esquema o resumen del trabajo
realizado.
• Procedimientos
utilizados
y
su
descripción.
• Cálculos, si son necesarios.
• Descripción de resultados, apoyándolos
preferentemente con tablas y gráficas.
• Exposición de conclusiones obtenidas.
• Observaciones.
• Referencias.
• Bibliografía. Si la publicación original
no se ha visto, entonces debe darse la
referencia de dónde aparece citada.
18
Ensayos Biotecnológicos
El orden en el laboratorio
Lamentablemente la falta de orden y de limpieza
suelen ser una de las causas más comunes de
accidentes en los laboratorios. Este es el riesgo
cuyo control está al alcance de quienes trabajan
en ellos.
Suele decirse que un espacio está colocado
cuando existe un lugar para cada cosa, y cada
cosa está en su sitio.
Sin menoscabo de cumplir las normas que
supongan trabajar con orden, limpieza en
condiciones de seguridad y de respecto al medio
ambiento, es necesario cumplir con una serie de
requisitos:
Rigor
Se debe trabajar escrupulosamente como dictan
los procedimientos, los protocolos o las normas
aplicables al análisis y no según nuestro parecer.
Rapidez
Los análisis no sólo deben efectuarse de la
forma requerida sino también en el tiempo
establecido. Un analista no tiene “tiempos
muertos”. Debe adelantarse a la siguiente
operación a realizar.
Autonomía
Sin menoscabo del trabajo en equipo, todo el
personal del laboratorio incluido el coordinador
o el jefe del mismo, el analista debe trabajar con
la autonomía suficiente para no molestar el
trabajo del resto del personal del equipo. Para
ello debe poseer unos conocimientos analíticos
sólidos y la imprescindible destreza manual.
Responsabilidad
El analista es absolutamente responsable del
cometido que se le ha encomendado, tanto si es
un proceso analítico completo, como si es una
operación dentro de dicho proceso, en cuyo
caso, la falta de calidad del trabajo en el mismo
afecta a todo el análisis.
Confidencialidad
El coordinador del laboratorio donde se efectúa
el análisis o estudio deberá establecer un sistema
de codificación con el objetivo de garantizar la
confidencialidad de los resultados, los cuales
serán sólo de conocimiento del cliente y no
podrán utilizarse con fines diferentes a los de la
evaluación para los que fue previsto el estudio.
Si como es normal actualmente, se utilizan
ficheros informatizados estos deberán estar
debidamente protegidos acordes a la legislación,
según el R.D. 1720/2007 de 21 de diciembre,
Salvador Camacho Garrido
por el que se aprueba el Reglamento de
desarrollo de la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de
diciembre, de protección de datos de carácter
personal.
32. CUMPLIMIENTO DE NORMAS DE
CALIDAD, SALUD LABORAL Y
PROTECCIÓN AMBIENTAL.
El Instituto de Seguridad e Higiene en el Trabajo
(INSHT) en su afán de facilitar el acceso a la
información pone a su alcance la colección
Notas Técnicas de Prevención (NTP).
Para facilitar su consulta de las NTP se han
clasificado en colecciones, aunque también las
personas familiarizadas con las NTP pueden
acceder a través de los índices tradicionales.
Colecciones:
• Actividades
• Técnicas preventivas
• Gestión preventiva
• Agentes materiales
Entre otros:
• NTP 192:
Genotóxicos:
control
biológico
• NTP 233: Cabinas de seguridad
biológica
• NTP 354: Control biológico de la
exposición a genotóxicos: técnicas
citogenéticas
• NTP 376: Exposición a agentes
biológicos: seguridad y buenas prácticas
de laboratorio
• NTP 409: Contaminantes biológicos:
criterios de valoración
• NTP 447: Actuación frente a un
accidente con riesgo biológico
• NTP 520: Prevención del riesgo
biológico en el laboratorio: trabajo con
virus
• NTP 539: Prevención del riesgo
biológico en el laboratorio: trabajo con
hongos
• NTP 545: Prevención del riesgo
biológico en el laboratorio: trabajo con
parásitos
• NTP 571: Exposición a agentes
biológicos: equipos de protección
individual
• NTP 572: Exposición a agentes
biológicos. La gestión de equipos de
protección individual en centros
sanitarios
• NTP 585: Prevención del riesgo
biológico en el laboratorio: trabajo con
bacterias
• NTP 586: Control biológico: concepto,
19
Ensayos Biotecnológicos
•
•
•
•
•
•
•
•
práctica e interpretación
NTP 609: Agentes biológicos: equipos
de muestreo (I)
NTP 610: Agentes biológicos: equipos
de muestreo (II)
NTP 611: Agentes biológicos: análisis
de las muestras
NTP 628: Riesgo biológico en el
transporte de muestras y materiales
infecciosos
NTP 636: Ficha de datos de seguridad
para agentes biológicos
NTP 772: Ropa de protección contra
agentes biológicos
NTP 807: Agentes biológicos: glosario
NTP 812: Riesgo biológico: prevención
de accidentes por lesión cutánea
33. LEGISLACIÓN.
Legislación sobre Prevención de
Riesgos Laborales
-Ley 31/1995 de Prevención de riesgos laborales
-Ley 54/2003 de modificación de la Ley de
Prevención de riesgos laborales
Agentes Biológicos
-R.D.664/1997, sobre la protección de los
trabajadores contra los riesgos relacionados con
la exposición a agentes biológicos.
Organismos Modificados
Genéticamente
-Ley 9/2003 la que se establece el régimen
jurídico de la utilización confinada, liberación
voluntaria y comercialización de organismos
modificados genéticamente, a fin de prevenir los
riesgos para la salud humana y para el medio
ambiente.
-R.D. 178/2004, por el que se aprueba el
Reglamento General para el Desarrollo y
Ejecución de la ley 9/2003 de 25 de abril por lo
que se establece el régimen jurídico de la
utilización confinada, liberación voluntaria y
comercialización de organismos modificados
genéticamente.
Riesgos químicos
-R.D. 665/1997, de Protección de los
trabajadores contra los riesgos relacionados con
la exposición a agentes cancerígenos.
-R.D. 1124/2000, por el que se modifica el Real
-Decreto 665/1997, de 12 de mayo, sobre la
protección de los trabajadores contra los riesgos
relacionados con la exposición a agentes
Salvador Camacho Garrido
cancerígenos durante el trabajo.
- R.D. 374/2001, de Protección de la salud y
seguridad de los trabajadores contra los riesgos
relacionados con los agentes químicos durante el
trabajo.
-R.D. 349/2003, por el que se modifica el Real
Decreto 665/1997, de 12 de mayo, sobre la
protección de los trabajadores contra los riesgos
relacionados con la exposición a agentes
cancerígenos durante el trabajo, y por el que se
amplía su ámbito de aplicación a los agentes
mutágenos.
Residuos
-Ley 10/98, de Residuos
-Decreto 83/1999, de 3 de junio, por el que se
regulan las actividades de producción y de
gestión de los residuos biosanitarios y
citotóxicos en la Comunidad de Madrid.
-Ley 5/2003 de Residuos de la Comunidad de
Madrid.
Radiaciones ionizantes
-R.D.
1836/1999,
Reglamento
sobre
Instalaciones Nucleares y Radiactivas.
-R.D. 783/2001, Reglamento sobre Protección
Sanitaria contra radiaciones ionizantes.
-Ley 15/1980, sobre creación del Consejo de
Seguridad Nuclear.
-Guía de Seguridad nº 9.2 CSN. Gestión de
materiales residuales sólidos con contenido
radiactivo generados en instalaciones radiactivas
(2002).
-Guía de Seguridad nº 05.01. Documentación
técnica para solicitar la autorización de
construcción y puesta en marcha de las
instalaciones de manipulación y almacenamiento
de isótopos radiactivos no encapsulados (2ª y 3ª
categoría).2005
-Guía de Seguridad nº 05.02. Documentación
técnica para solicitar la autorización de
funcionamiento de las instalaciones de
manipulación y almacenamiento de fuentes
encapsuladas (2ª y 3ª categoría).2005.
-Guía de Seguridad nº 05.10. Documentación
técnica para solicitar la autorización de
funcionamiento de las instalaciones de rayos X
con fines industriales. 2005.
-Orden ECO/1449/2003, sobre Gestión de
materiales residuales sólidos con contenido
radiactivo generados en las instalaciones
radiactivas de 2ª y 3ª categoría en las que se
manipulen o almacenen isótopos radiactivos no
encapsulados.
20
Ensayos Biotecnológicos
TEMA II. LAS PROTEÍNAS
34. CONCEPTO DE PROTEÍNA.
Las proteínas son principios inmediatos
orgánicos, compuestos básicamente por carbono,
hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Además, suelen
contener también azufre y, en algunos tipos de
proteínas, fósforo, hierro, cobre, magnesio,
yodo, etc. Las proteínas son polímeros de unas
pequeñas moléculas que reciben el nombre de
aminoácidos, y que están unidos mediante
enlaces peptídicos. La unión de un bajo número
de aminoácidos da lugar a un péptido. Cuando el
número de aminoácidos que forman la molécula
del péptido no es mayor de 10, se denomina
oligopéptido, y si es superior a 10, recibe el
nombre de polipéptido. Sólo cuando un
polipéptido se halla constituido por más de 50
moléculas de aminoácidos o si el valor de su
peso molecular excede de 5.000 Da, se habla de
proteínas.
35. CLASIFICACIÓN DE LAS
PROTEÍNAS.
Si la proteína está constituida exclusivamente
por aminoácidos, se denomina holoproteína.
Cuando, además de aminoácidos, presenta algún
otro tipo de molécula, recibe el nombre de
heteroproteína.
Holoproteínas:
Atendiendo a su estructura terciaria, las
holoproteínas pueden clasificarse en dos grupos:
filamentosas y globulares:
• Proteínas filamentosas. Son insolubles
en agua y aparecen principalmente en
animales. Pertenecen a este grupo los
colágenos, las queratinas, las elastinas y
las fibroínas.
• Proteínas globulares. Generalmente
son solubles en agua o en disoluciones
polares. Pertenecen a este grupo las
protamidas, las histonas, las prolaminas,
las gluteninas, las albúminas y las
globulinas.
Heteroproteínas:
Las heteroproteínas son moléculas formadas por
la unión de un grupo proteico con otro no
proteico denominado grupo prostético. Según su
grupo prostético, las heteroproteínas se
clasifican en: cromoproteínas, glucoproteínas,
lipoproteínas, fosfoproteínas y nucleoproteínas.
• Cromoproteínas. Las cromoproteínas
poseen como grupo prostético una
Salvador Camacho Garrido
•
•
sustancia coloreada, por lo que reciben
también el nombre de pigmentos. Según
la naturaleza del grupo prostético, se
dividen en: pigmentos porfirínicos y
pigmentos no porfirínicos.
Glucoproteínas. Las glucoproteínas
poseen un grupo prostético que contiene
moléculas de glúcidos. Pertenecen a este
grupo: las glucoproteínas sanguíneas,
las inmunoglobulinas y
algunas
enzimas.
Otras heteroproteínas:
• Lipoproteínas. Son moléculas
cuyo grupo prostético está
constituido por ácidos grasos.
• Fosfoproteínas.
Su
grupo
prostético es el ácido fosfórico.
• Nucleoproteínas. Su grupo
prostético es un ácido nucleico.
36. FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS.
• Función estructural.
• Función de transporte.
• Función enzimática.
• Función hormonal.
• Función de defensa.
• Función contráctil.
• Función de reserva.
• Función homeostática.
37. AMINOÁCIDOS.
Los aminoácidos son compuestos orgánicos que
se caracterizan por poseer un grupo carboxilo (COOH) y un grupo amino (-NH2). Las otras dos
valencias del carbono se saturan con un átomo
de H y con un grupo variable denominado
radical R. Según este radical se distinguen 20
tipos de aminoácidos. Los aminoácidos son
compuestos sólidos, cristalinos, de elevado
punto de fusión, solubles en agua, con actividad
óptica y con comportamiento químico anfótero.
Los aminoácidos son las unidades elementales
constitutivas de las moléculas denominadas
proteínas. Son pues, y en un muy elemental
símil, los "ladrillos" con los cuales el organismo
reconstituye permanentemente sus proteínas
específicas consumidas por la sola acción de
vivir.
Proteínas que son los compuestos nitrogenados
más abundantes del organismo, a la vez que
fundamento mismo de la vida. En efecto, debido
a la gran variedad de proteínas existentes y
como consecuencia de su estructura, las
proteínas cumplen funciones sumamente
diversas, participando en todos los procesos
biológicos
y
constituyendo
estructuras
21
Ensayos Biotecnológicos
fundamentales en los seres vivos. De este modo,
actúan acelerando reacciones químicas que de
otro modo no podrían producirse en los tiempos
necesarios para la vida (enzimas), transportando
sustancias (como la hemoglobina de la sangre,
que transporta oxígeno a los tejidos),
cumpliendo funciones estructurales (como la
queratina del pelo), sirviendo como reserva
(albúmina de huevo), etc.
Los alimentos que ingerimos nos proveen
proteínas. Pero tales proteínas no se absorben
normalmente en tal constitución sino que, luego
de su desdoblamiento ("hidrólisis" o rotura),
causado por el proceso de digestión, atraviesan
la pared intestinal en forma de aminoácidos y
cadenas cortas de péptidos, según lo que se
denomina "circulación enterohepática".
Esas sustancias se incorporan inicialmente al
torrente sanguíneo y, desde allí, son distribuidas
hacia los tejidos que las necesitan para formar
las proteínas, consumidas durante el ciclo vital.
Se sabe que de los 20 aminoácidos proteicos
conocidos, 8 resultan indispensables (o
esenciales) para la vida humana y 2 resultan
"semi
indispensables".
Son
estos
10
aminoácidos los que requieren ser incorporados
al organismo en su cotidiana alimentación y, con
más razón, en los momentos en que el
organismo más los necesita: en la disfunción o
enfermedad. Los aminoácidos esenciales más
problemáticos son el triptófano, la lisina y la
metionina. Es típica su carencia en poblaciones
en las que los cereales o los tubérculos
constituyen la base de la alimentación. Los
déficits de aminoácidos esenciales afectan
mucho más a los niños que a los adultos.
Hay que destacar que, si falta uno solo de ellos
(aminoácidos esenciales) no será posible
sintetizar ninguna de las proteínas en la que sea
requerido dicho aminoácido. Esto puede dar
lugar a diferentes tipos de desnutrición, según
cual sea el aminoácido limitante.
•
•
•
•
•
•
•
38. FUNCIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS.
Esenciales
• L-Isoleucina: Junto con la L-Leucina y
la Hormona del Crecimiento (HGH)
intervienen en la formación y reparación
del tejido muscular.
• L-Leucina: Junto con la L-Isoleucina y
la HGH interviene con la formación y
reparación del tejido muscular.
• L-Lisina: Es uno de los más
importantes aminoácidos porque, en
asociación con varios aminoácidos más,
Salvador Camacho Garrido
•
•
interviene en diversas funciones,
incluyendo el crecimiento, reparación de
tejidos,
anticuerpos
del
sistema
inmunológico y síntesis de hormonas.
L-Metionina: Colabora en la síntesis de
proteínas y constituye el principal
limitante en las proteínas de la dieta. El
aminoácido limitante determina el
porcentaje de alimento que va a
utilizarse a nivel celular.
L-Fenilalanina: Interviene en la
producción
del
colágeno,
fundamentalmente en la estructura de la
piel y el tejido conectivo, y también en
la
formación
de
diversas
neurohormonas.
L-Triptófano: Está implicado en el
crecimiento y en la producción
hormonal, especialmente en la función
de las glándulas de secreción adrenal.
También interviene en la síntesis de la
serotonina, neurohormona involucrada
en la relajación y el sueño.
L-Treonina: Junto con la con la LMetionina y el ácido L- Aspártico ayuda
al hígado en sus funciones generales de
desintoxicación.
L-Valina: Estimula el crecimiento y
reparación
de
los
tejidos,
el
mantenimiento de diversos sistemas y el
balance de nitrógeno.
No esenciales
L-Alanina:
Interviene
en
el
metabolismo de la glucosa. La glucosa
es un carbohidrato simple que el
organismo utiliza como fuente de
energía.
L-Arginina: Está implicada en la
conservación del equilibrio de nitrógeno
y de dióxido de carbono. También tiene
una gran importancia en la producción
de la HGH, directamente involucrada en
el crecimiento de los tejidos y músculos
y en el mantenimiento y reparación del
sistema inmunológico.
L-Asparagina:
Interviene
específicamente en los procesos
metabólicos del Sistema Nervioso
Central (SNC).
Acido L-Aspártico: Es muy importante
para la desintoxicación del hígado y su
correcto funcionamiento. El ácido LAspártico se combina con otros
aminoácidos
formando
moléculas
capaces de absorber toxinas del torrente
22
Ensayos Biotecnológicos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sanguíneo.
L-Citrulina: Interviene específicamente
en la eliminación del amoníaco.
L-Cistina: También interviene en la
desintoxicación, en combinación con los
aminoácidos anteriores. La L - Cistina
es muy importante en la síntesis de la
insulina y también en las reacciones de
ciertas moléculas a la insulina.
L-Cisteina: Junto con la L- cistina y la
L- Cisteina está implicada en la
desintoxicación, principalmente como
antagonista de los radicales libres.
También contribuye a mantener la salud
de los cabellos por su elevado contenido
de azufre.
L-Glutamina: Nutriente cerebral e
interviene específicamente en la
utilización de la glucosa por el cerebro.
Acido L-Glutáminico: Tiene gran
importancia en el funcionamiento del
SNC y actúa como estimulante del
sistema inmunológico.
L-Glicina: En combinación con muchos
otros aminoácidos, es un componente de
numerosos tejidos del organismo.
L-Histidina: En combinación con la
HGH y algunos aminoácidos asociados,
contribuyen al crecimiento y reparación
de los tejidos con un papel
específicamente relacionado con el
sistema cardiovascular.
L-Serina:
Junto
con
algunos
aminoácidos mencionados, interviene en
la desintoxicación del organismo,
crecimiento muscular, y metabolismo de
grasas y ácidos grasos.
L-Taurina: Estimula la HGH en
asociación con otros aminoácidos, esta
implicada en la regulación de la presión
sanguínea, fortalece el músculo cardiaco
y vigoriza el sistema nervioso.
L-Tirosina: Es un neurotransmisor
directo y puede ser muy eficaz en el
tratamiento de la depresión, en
combinación con otros aminoácidos
necesarios.
L-Ornitina: Es específico para la HGH
en asociación con otros aminoácidos ya
mencionados. Al combinarse con la LArginina y con carnitina (que se
sintetiza en el organismo), la L-Ornitina
tiene una importante función en el
metabolismo del exceso de grasa
corporal.
L-Prolina: Está involucrada también en
Salvador Camacho Garrido
la producción de colágeno y tiene gran
importancia en la reparación y
mantenimiento del músculo y los
huesos.
39. CLASIFICACIÓN DE LOS
AMINOÁCIDOS.
Según el radical R, los aminoácidos pueden
clasificarse en alifáticos, aromáticos y
heterocíclicos.
• Aminoácidos alifáticos. Son
aquellos en los que el radical R
es una cadena hidrocarbonada
abierta.
• Aminoácidos aromáticos. Son aquellos
cuyo radical R es un anillo aromático.
• Aminoácidos heterocíclicos. Aquellos
cuyo radical R es una cadena cerrada
con algún átomo distinto del carbono y
del hidrógeno.
Estos a su vez se clasifican en neutros,
ácidos y básicos.
• Neutros. Si el radical R no posee
grupos carboxilo ni amino.
• Ácidos. Si el radical R presenta grupos
carboxilo, pero no amino.
• Básicos. Si el radical R tiene grupos
amino, pero no grupos carboxilo.
40. PROPIEDADES DE LOS
AMINOÁCIDOS.
• El enlace peptídico. Los péptidos están
formados por la unión de aminoácidos
mediante un enlace peptídico. El enlace
peptídico es un enlace que se establece
entre el grupo carboxilo de un
aminoácido y el grupo amino del
siguiente,
dando
lugar
al
desprendimiento de una molécula de
agua. Es de naturaleza covalente, por lo
tanto muy estable. Es un enlace tipo
amida:
H3+N-CH2- COO- + H3+N-CH2-COO-CO-NH -
•
Actividad óptica. Los aminoácidos son
capaces de desviar el plano de luz
polarizada que atraviesa una disolución
de los mismos. Si un aminoácido desvía
el plano de luz polarizada hacia la
derecha, se denomina dextrógiro o (+), y
si lo hace hacia la izquierda, levógiro o
(-). Un aminoácido tendrá una
configuración D si el grupo –NH2, en la
proyección de Fischer, queda situado a
la derecha, mientras que, si se encuentra
a
la
izquierda,
poseerá
una
23
Ensayos Biotecnológicos
H
Nombre
Grupo X en
X C C
NH2
Glicina
H
Alanina
CH3
Valina
(CH3)2CH
Leucina
(CH3)2CHCH2
NEUTROS
OH
CH3CH2CH
Isoleucina
CH3
Serina
HOCH2
Treonina
CH3HOCH2
Metionina
CH3SCH2CH2
Cisteína
HSCH2
Cistina
CH2SSCH2
Fenilalanina
Tirosina
O
CH2
HO
CH2
CH2
Triptófano
N
H
COOH
Prolina
N H
COOH
Hidroxiprolina
N
H
HO
Lisina
BÁSICOS
Arginina
Histidina
H2NCH2CH2CH2CH2
H2N
C
HN
NHCH2CH2CH2
N
CH2
NH
Ácido aspártico
HOOCCH2
Ácido glutámico
HOOCCH2CH2
ÁCIDOS
•
configuración L.
Comportamiento
químico.
En
disolución acuosa, los aminoácidos
muestran un comportamiento anfótero,
es decir, pueden ionizarse como un
ácido, como una base, o como un ácido
y una base a la vez. A pH fisiológico el
grupo carboxilo está disociado y el
amino tiene carga positiva. Puede actuar
como ácido, cediendo el grupo amino un
protón y como base, aceptándolo el
grupo carboxilato. El estado de
disociación depende del pH al que se
encuentre la disolución y lo fuerte que
sea el aminoácido, habiendo muy fuertes
Salvador Camacho Garrido
y muy débiles. Independientemente de
la cadena lateral tienen 2 grupos
disociables, el α-amino y el α-carboxilo.
Para tener el aminoácido totalmente
protonado el pH debe ser muy ácido. La
tendencia a disociarse viene dada por el pK
(pK más pequeño, ácido más fuerte). Como
el carboxilo tiene pK más bajo que el amino
se disocia antes. Al aumentar el pH se
disocia primero α-carboxilo y luego el αamino.
41. CTURA DE LAS PROTEÍNAS.
La organización de una proteína viene definida
24
Ensayos Biotecnológicos
más alargada que la α-hélice, debido a
la
abundancia
de
prolina
e
hidroxiprolina, aminoácidos que no
pueden formar puentes de hidrógeno, lo
que impide la formación de la α-hélice y
da lugar a la aparición de una hélice más
extendida. Presenta tres aminoácidos
por vuelta.
por cuatro niveles estructurales, denominados:
estructura primaria, estructura secundaria,
estructura terciaria y estructura cuaternaria.
Cada una de estas estructuras informa de la
disposición de la anterior en el espacio.
Estructura primaria
La estructura primaria es la secuencia de
aminoácidos de la proteína. Nos indica qué
aminoácidos componen la cadena polipeptídica
y el orden en que dichos aminoácidos se
encuentran. Todas las proteínas presentan un
extremo N-terminal, en el que se encuentra el
primer aminoácido, y un extremo C-terminal, en
el que está situado el último aminoácido.
Estructura secundaria
La estructura secundaria es la disposición de la
secuencia de aminoácidos o estructura primaria
en el espacio. Los aminoácidos adquieren una
disposición espacial estable, la estructura
secundaria. Son conocidos tres tipos de
estructuras secundarias: la α-hélice, la hélice de
colágeno y la conformaciónβ.
• α-hélice. La estructura secundaria en αhélice
se
forma
al
enrollarse
helicoidalmente sobre sí misma la
estructura primaria. Cada vuelta de la
hélice presenta 3, 6 aminoácidos.
•
•
Conformación β. En esta disposición
los aminoácidos no forman una hélice
sino una cadena en forma de zigzag.
Ello es debido a que no existen puentes
de hidrógeno entre ellos. Esta lámina
también es denominada disposición en
lámina plegada.
Hélice de colágeno. El colágeno posee
una disposición en hélice especial, algo
Salvador Camacho Garrido
25
Ensayos Biotecnológicos
Estructura terciaria
La estructura terciaria de una proteína informa
sobre la disposición de la estructura secundaria
de un polipéptido al plegarse sobre sí misma
originando una conformación globular. La
conformación globular en las proteínas facilita
su solubilidad en agua y en disoluciones salinas.
Esto les permite realizar funciones de transporte,
enzimáticas,
hormonales,
etc.
Las
conformaciones globulares se mantienen
estables por la existencia de enlaces entre los
radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios
tipos de enlaces: uno fuerte de tipo covalente, el
puente disulfuro, y otros débiles como los
puentes de hidrógeno. Se ha observado que
existen
combinaciones
de
α-hélice
y
conformación β que aparecen repetidamente en
proteínas distintas. Estas combinaciones suelen
ser estables, compactas y de aspecto globular.
Reciben el nombre de dominios estructurales.
Estructura cuaternaria
La estructura cuaternaria informa de la unión,
mediante enlaces débiles (no covalentes), de
varias cadenas polipeptídicas con estructura
terciaria, idénticas o no, para formar un
complejo proteico. Cada una de estas cadenas
polipeptídicas recibe el nombre de protómero.
Según el número de protómeros que se asocian,
las proteínas que tienen estructura cuaternaria se
denominan dímeros, tetrámeros, pentámeros y
polímeros.
Salvador Camacho Garrido
42. PROPIEDADES DE LAS
PROTEÍNAS.
Las propiedades de las proteínas dependen sobre
todo de los radicales R libres y de que éstos
sobresalgan de la molécula y tengan la
posibilidad de reaccionar con otras moléculas. El
conjunto de aminoácidos de una proteína cuyos
radicales poseen la capacidad de unirse a otras
moléculas y de reaccionar con éstas se denomina
centro activo de la proteína.
• Solubilidad. La solubilidad de estas
moléculas se debe a los radicales R, que,
al ionizarse, establecen puentes de
hidrógeno con las moléculas de agua.
• Desnaturalización. Los enlaces que
mantienen la conformación globular se
rompen y la proteína
adopta la
conformación
filamentosa.
Esta
variación de la conformación se
denomina desnaturalización. Al volver a
las condiciones normales, la proteína
puede, en algunas ocasiones, recuperar
la conformación primitiva, lo que se
denomina renaturalización.
• Especificidad. En su secuencia de
aminoácidos, las proteínas presentan
sectores estables y sectores variables, en
26
Ensayos Biotecnológicos
•
los que algunos aminoácidos pueden ser
sustituidos por otros distintos sin que se
altere la funcionalidad de la molécula.
Ello ha dado lugar, durante el proceso
evolutivo, a una gran variabilidad de
moléculas proteicas, lo que permite que
cada especie tenga sus proteínas
específicas.
Capacidad
amortiguadora.
Las
proteínas, al estar constituidas por
aminoácidos, tienen un comportamiento
anfótero. Tienden a neutralizar las
variaciones de pH del medio, ya que
pueden comportarse como un ácido o
una base y, por tanto, liberar o retirar
protones (H+) del medio.
43. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS.
El primer paso en el aislamiento de una proteína
es la rotura celular, para posteriormente poder
extraer la proteína con un tampón adecuado. El
método de rotura a elegir depende de las
características mecánicas del tejido o células de
donde se va a aislar la proteína, así como de su
localización. Entre los distintos métodos están:
Lisis celular
Válido para células sin pared celular como las
células de tejidos animales, pero no es suficiente
para células vegetales o bacterias. Consiste en
suspender las células en una solución hipotónica
(más diluida que el interior celular). Debido a la
diferencia osmótica el agua difunde al interior de
la célula, causando su hinchamiento y rotura.
Destrucción mecánica
Entre estos métodos se encuentran:
• Homogenización: hacer pasar las
células entre un tubo y un pistón de
vidrio que ajustan casi totalmente
• Moler en un mortero: con arena o
alúmina
• Molino: con perlas de vidrio
• Prensa de French: que hace pasar las
células a gran velocidad a través de un
pequeño orificio
• Sonicación: someter las células a
vibraciones de ultrasonido
Congelación-descongelación.
La rotura se produce al someter las células a un
cambio brusco de temperatura, congelando
primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y
pasándolas rápidamente a temperatura ambiente
(25 ºC).
Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el
proceso de rotura, se utilizan tampones de
extracción para solubilizar las proteínas. Pueden
utilizarse como tales disoluciones acuosas de
Salvador Camacho Garrido
27
Ensayos Biotecnológicos
tampones específicos para proteínas solubles o
bien que contengan además detergentes si se
pretende purificar proteínas asociadas a
membranas, si bien en este caso hay que cuidar
que las enzimas no se desnaturalicen.
Una vez que la proteína se ha extraído de su
entorno natural está expuesta a muchos agentes
que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH
(ácidos y bases fuertes), temperaturas extremas y
la acción de las proteasas (enzimas que
hidrolizan los enlaces peptídicos) son los
principales factores que pueden desnaturalizar
las proteínas. Para evitar o minimizar estos
factores la manipulación de las proteínas durante
el proceso de purificación suele llevarse a cabo
en
disoluciones
tamponadas,
a
bajas
temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso
sea lo más corto posible, además en ocasiones,
es necesario añadir al tampón de extracción
agentes protectores de grupos funcionales
específicos de la proteína o bien inhibidores de
proteasas.
44. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS.
El resultado de todos estos tratamientos es un
lisado u homogenizado que contiene una mezcla
de enzimas, membranas y células rotas. Esta
preparación se somete a centrifugación (10.000
– 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares
y separar el sobrenadante que contiene las
proteínas solubles, del precipitado que además
de restos celulares también contienen proteínas
asociadas a membranas y que para solubilizarlas
requiere un tratamiento adicional con
detergentes. En cualquier caso, la fase soluble
(con o sin detergente) constituye el extracto
crudo donde se encuentra la proteína de interés
objeto de la purificación. A la hora de
centrifugar hay que tener en cuenta que la
centrífuga sea refrigerada, equilibrar los tubos y
asegurarse siempre que los rotores estén fijos.
45. TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN.
La mayor parte de las investigaciones
bioquímicas requieren la purificación, al menos
parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto
requiere generalmente un gran esfuerzo ya que
una célula contiene miles de sustancias
diferentes y la molécula que buscamos puede ser
extremamente inestable o encontrarse a
concentraciones muy bajas.
Para purificar una proteína es imprescindible
tener un método para detectar cuantitativamente
su presencia. Es deseable que este método sea
específico y fácil de llevar a cabo. En este
sentido es mucho más cómodo trabajar con
Salvador Camacho Garrido
enzimas, pues se detectarían mediante su ensayo
de actividad, que en caso de purificar proteínas
no enzimáticas, que se requieren métodos de
selección más específicos.
Los métodos más importantes son los métodos
cromatográficos y la electroforesis.
46. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.
Las separaciones cromatográficas se basan en
las diferencias de carga, tamaño o afinidad de las
diferentes proteínas. Uno de los métodos más
habitualmente utilizados para la separación de
proteínas es la cromatografía en columna,
aunque también existe la cromatografía en papel
y en placa fina (TLC).
La columna está rellena con un material sólido
con las características químicas adecuadas (fase
estacionaria), y una solución tamponada se hace
pasar a través de la columna (fase móvil). El
extracto crudo se aplica en la parte superior de la
columna y va poco a poco entrando en la
columna con la fase móvil. Cada proteína
migrará a distinta velocidad según su grado de
afinidad por la fase estacionaria.
Generalmente estas cromatografías se realizan
de una forma semiautomática, la fase móvil se
hace pasar a la columna a través de una bomba
peristáltica y un colector de fracciones va
recogiendo el eluyente que sale de columna.
Este colector hace que el tubo vaya cambiando
cada cierto número de gotas o de volumen.
Después hay que localizar en qué tubo o tubos
está la proteína que se pretende purificar.
Existen distintos tipos de cromatografía:
• La filtración o exclusión molecular
• El cromatografía de intercambio iónico
• La cromatografía hidrofóbica
• La cromatografía de afinidad
• La cromatografía líquida de alta eficacia
47. CROMATOGRAFÍA DE
EXCLUSIÓN MOLECULAR.
En la filtración en gel o cromatografía de
exclusión molecular, la fase estacionaria esta
constituida por partículas de polímeros de
diferente porosidad. La separación se basa en el
tamaño de las partículas. Las proteínas más
grandes que no pueden penetrar en los poros de
las partículas de la matriz de filtración son
eluidas con más rapidez que las proteínas más
pequeñas que penetran por los poros de las
partículas y siguen un camino más tortuoso y
más largo. El tamaño de los poros internos
depende de la naturaleza del polímero en
cuestión, y permite la entrada a proteínas por
debajo de un determinado peso molecular.
28
Ensayos Biotecnológicos
al soporte por los resto de aminoácidos apolares;
cuanto más residuos de este tipo tenga en su
superficie, más apolar será, más se retendrá en la
columna y se eluirá más tarde. En este caso la
elucción se realiza aumentando la apolaridad de
fase móvil.
50. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.
Muchas proteínas tienen la capacidad de unirse
específicamente a ciertas moléculas, mediante
uniones fuertes, pero no covalentes. En esta
técnica la molécula que se une específicamente a
la proteína se conoce con el nombre de ligando
y se une covalentemente a una matriz inerte.
Cuando el extracto con la mezcla de proteínas se
aplica a la columna, la proteína buscada se unirá
al ligando inmovilizado mientras que las demás
saldrán de la columna con el tampón. En este
caso también se utiliza el incremento de la
fuerza iónica para eluir las proteínas.
48. CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IÓNICO.
En ella, la columna está rellena con un soporte al
que van unidos grupos cargados positivamente
(intercambio aniónico) o negativamente
(intercambio catiónico). Estos grupos cargados
normalmente están neutralizados por iones del
tampón. Estos iones son reversiblemente
reemplazados por las proteínas con más
tendencia a unirse al soporte. Las proteínas
cargadas pueden por lo tanto unirse a
intercambiadores catiónicos o aniónicos
dependiendo de su carga neta. Las proteínas más
cargadas se unirán más fuertemente al
intercambiador y por lo tanto serán más difíciles
de eluir. La afinidad con la que una proteína se
une a un intercambiador iónico depende de la
fuerza iónica del medio, debido a la competencia
entre los grupos cargados de la proteína y los
iones de la fase móvil.
Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas
(retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la
fuerza iónica de la fase móvil aumentando la
concentración de sal (NaCl), de esta forma se
eluyen primero las proteínas mas débilmente
retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor
saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto
más retenidas.
51. CROMATOGRAFÍA HPLC.
Todos estos sistemas pueden automatizarse, en
base a sistemas cromatográficos tales como en la
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC),
en el que se hace uso de bombas de alta presión
(100-400 bares) y columnas con materiales que
soportan altas presiones. Este sistema reduce
notablemente los tiempos de purificación y
utilizan fases estacionarias con mayor poder de
retención, lo que incrementa el rendimiento de
las purificaciones.
49. CROMATOGRAFÍA
HIDROFÓBICA.
Se trata de un método similar al anterior con la
única diferencia de que la fase estacionaria es
apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega
Salvador Camacho Garrido
29
Ensayos Biotecnológicos
HPLC: Cromatografía líquida de separación
rápida de proteínas
Debido a la ausencia de métodos analíticos
fiables se han desarrollado y validado nuevas
metodologías analíticas para la determinación de
proteínas utilizando HPLC con fases
estacionarias perfusivas. Las metodologías
desarrolladas consisten en el desgrasado de las
muestra con acetona, solubilización de las
proteínas en un medio salino a pH básico y
análisis de las proteínas extraídas por
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Fase
Inversa (RP-HPLC) de perfusión con detección
UV y elución en gradiente. También se han
optimizado las etapas de extracción y
separación. A título de ejemplo, las mejores
condiciones que permitían la extracción de las
proteínas, en el caso de la soja, utiliza una
disolución reguladora Tris-HCl a un pH 8.0 (que
en algunos casos puede contener un
modificador), con agitación ultrasónica y
centrifugación obteniendo un sobrenadante que
era directamente inyectado en el sistema
cromatográfico. El método de RP-HPLC de
perfusion elegido consiste en un gradiente lineal
y binario en tres etapas (5-25 % B en 0.8 min,
25-42 % B en 0.8 min, 42-50 % B en 0.6 min, y
finalmente 50-5 % B en 0.5 min) para equilibrar
la columna en las condiciones iniciales entre
inyecciones, siendo las fases móviles A y B, 0.05
% (v/v) de ácido trifluoroacético en agua y 0.05
% (v/v) de ácido trifluoroacético en acetonitrilo,
respectivamente. Se emplea una columna de
perfusion en fase inversa (50 x 4.6 mm d.i.)
empaquetada con partículas de 10 μm de
diámetro de poliestireno-divinilbenceno, un flujo
de fase móvil de 3 mL/min, una temperatura
durante la separación de 50 ºC y detección UV a
280 nm. En estas condiciones, la separación
cromatográfica de los extractos proteicos se
obtiene en menos de 3 min.
Salvador Camacho Garrido
52. MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS.
La electroforesis es una técnica de separación
que se basa en la migración diferencial (en
sentido y velocidad) de partículas cargadas
(analitos) en un campo eléctrico establecido al
efecto (gradiente de potencial).
Estas partículas cargadas pueden ser muy
diversas,
iones
simples,
complejos,
macromoléculas, coloides, materia corpuscular,
células vivas (como las bacterias o hematíes), o
materia inerte como arcillas.
Se trata de una técnica, en que las fuerzas
puestas en juego son de origen físico
(electrostático) aunque otros fenómenos físicoquímicos son fundamentales.
Se asemeja a las cromatografias en que es una
técnica de separación con semejanzas a la
cromatografía plana, aunque es más una
alternativa, y también se asemeja a las técnicas
electroanalíticas de separación, pues las
variables físicas son decisivas en el proceso de
separación, si bien no llega a producirse
electrolisis al no llegar las especies cargadas a
sus respectivos electrodos (reducción catódica o
oxidación anódica).
En un principio, podemos hablar de dos tipos de
técnicas:
• Técnicas de electroforesis libre:
Aplicación de un potencial eléctrico a
una disolución en estado estacionario o
no, en la que las especies se mueven
libremente, sin más implicaciones que
las derivadas de las características de la
disolución y de las especies cargadas.
• Técnicas de electroforesis de zona:
También denominadas electroforesis en
medios estabilizados, en las que el
movimiento se realiza a través de un
medio o soporte sólido (impregnado de
disolución electrolítica), que dificulta el
movimiento iónico libre.
53. PRINCIPIOS BÁSICOS.
En función de que el fenómeno de transporte sea
en disolución, o en un medio estabilizante
podemos tener en cuenta los siguientes
fenómenos:
1. Fenómenos de transporte de disolución:
Pueden originarse diversos fenómenos que se
traducen en transporte de materia:
1. Difusión: Provocado por la existencia de
gradientes de concentración. Afecta tanto a
las partículas cargadas como a las neutras.
2. Migración: Movimiento producido por la
fuerza externa, en este caso el campo
eléctrico y su intensidad y que algunos
30
Ensayos Biotecnológicos
autores denominan electromovilidad. La
movilidad iónica de una especie cargada
vendrá dada por la carga, el tamaño del ion y
la viscosidad del medio. Así pues la
separación
electroforética
vendrá
relacionada directamente por:
a) La movilidad iónica.
b) El gradiente de potencial.
c) El tiempo de aplicación.
d) Otros
factores
adicionales:
concentración del electrolito y cambios
químicos (valor del pH).
3. Convección: Fenómeno no deseado, que
consiste en el transporte de todas las
especies (cargadas o no), causado por un
movimiento o flujo de la disolución:
a) Gradiente de velocidad debido a la
resistencia interna del movimiento.
b) Efectos de capilaridad en soportes
estabilizantes.
c) Electroósmosis o movimiento del
disolvente al aplicar un campo eléctrico.
4. Flujo térmico: Al pasar una corriente
eléctrica por la disolución, se origina una
resistencia que se traduce en calor de
acuerdo con la Ley de Joule. El sistema por
tanto no es isotermo, y al existir gradientes
de temperatura, se origina la movilidad de la
fase líquida que arrastra a las partículas.
2. Fenómenos de transporte en un medio
estabilizante:
En general, el empleo de un medio estabilizante
situado entre los electrodos, en lugar de una
disolución electrolítica minimiza los efectos
indeseables que se presentan en la denominada
electroforesis libre.
Los medios estabilizantes más empleados son de
dos tipos:
• Soportes
compactos:
Con
una
microestructura interna capilar como el
papel polvo de celulosa, vidrio
pulverizado o membranas de acetato de
celulosa.
• Geles:
De
agar-agar
o
de
poliacrilamida.
54. TÉCNICAS.
Aunque puedan existir otras técnicas
electroforéticas y otras formas de clasificación
podemos hablar de:
1. Electroforesis libre: También denominado
método electroforético de límite móvil, es la
técnica más antigua y menos usual, sólo válida
para la determinación de movilidades absolutas
de proteínas solubles. La detección se suele
realizar por la medición de los índices de
Salvador Camacho Garrido
refracción a lo largo de tubos.
2. Isotacoforesis: Técnica más usual, al poseer
elevado poder de resolución, alta frecuencia de
muestreo, precisión elevada y gran flexibilidad,
pero sólo puede separar especies iónicas
cargadas con el mismo signo. Se asemeja a una
cromatografía por desplazamiento, y la
detección se suele conseguir con varios
detectores en serie un termopar, termistor de
conductividad de alta frecuencia o fotométrico.
3. Electroforesis zonal: Se caracteriza por la
existencia de un medio estabilizante, pudiéndose
llevar a cabo en una superficie plana o en una
columna.
1. Electroforesis zonal con soporte sólido: El
medio es un sólido poroso impregnado de
una fase electrolítica. Los principales
fenómenos además de la electromigración,
son los fenómenos de adsorción y exclusión
molecular (filtrado).
a) Soporte material plano:
I.
Electroforesis sobre papel: El
soporte es un papel poroso de
alta calidad. Sus ventajas son la
asequibilidad y fácil manejo de
la técnica, la facilidad del
revelado, su universalidad y el
poder conseguir separaciones
completas. Su desventaja es la
difícil adaptación a mediciones
cuantitativas.
II.
Electroforesis sobre acetato de
celulosa: Posee las ventajas del
papel
reduciendo
considerablemente
los
inconvenientes,
al
poder
efectuar medidas cuantitativas
tras
el
revelado
por
microdensitometría.
III.
Electrocromatografía: Se utiliza
un
soporte
activo
cromatográficamente, dándose
de forma secuencial o al unísono
ambos
fenómenos.
Su
aplicación es más de tipo
preparativo que analítico.
IV.
Inmunoelectroforesis: Es una
técnica en dos etapas, por un
lado la migración electroforética
y por otro la reacción
inmunológica.
b) Soporte en columna: El soporte
(celulosa, almidón o Sephadex™, en
forma de polvo se coloca en una
columna al estilo cromatográfico,
para poder aplicar entre sus
extremos el campo eléctrico. Como
31
Ensayos Biotecnológicos
son inevitables los fenómenos de
adsorción, algunos autores hablan de
electrocromatografía.
2. Electroforesis zonal en gel: Un gel lo
podemos considerar como un sólido
disperso en una fase líquida, si bien, con un
tamaño de partícula muy inferior a los
considerados como sólidos. Además del
empleo como los anteriores soportes, en
plano o en columna, admite dos variaciones:
I.
Electroforesis en gel con
gradiente de porosidad: La
electromigración se ve impedida
por fenómenos de filtración.
II.
Electroforesis
en gel en
presencia
de
detergente
aniónico: Utiliza el dodecil
sulfonato sódico (SDS) que
interacciona
reversiblemente
con las proteínas eliminando las
diferencias de carga, dándose la
separación, sólo en función de
su tamaño molecular, al igualar
la carga de todas las proteínas.
4. Enfoque isoeléctrico: Se basa en la
formación de un gradiente de pH (lineal,
cóncavo, convexo o por etapas) en el medio
estabilizante, donde al colocar la mezcla de
sustancias a separar, que necesariamente deber
ser anfolitos, éstos se mueven hacia el cátodo o
el ánodo hasta llegar a la zona de pH en que se
alcanza el punto isoeléctrico. El medio
estabilizante debe tener una porosidad elevada
para evitar el efecto tamiz, como geles de
poliacrilamida, geles de agarosa, membranas de
acetato de celulosa acondicionadas para este fin
o el Sephadex™.
La técnica puede usarse en columna, en
membranas o en capa fina, siendo bastante
universal, aunque, en general, se usa para
proteínas y péptidos, tanto para fines
preparativos como analíticos (determinación del
punto isoeléctrico).
5. Electroforesis capilar: Su importancia hace
que merezca tratamiento aparte.
55. ELECTROFORESIS CAPILAR.
Es una técnica de separación que se basa en la
diferente movilidad electroforética de las
sustancias a analizar bajo la acción de un campo
eléctrico, en el interior de un tubo capilar. Por
tanto combina el poder de separación de la
electroforesis convencional con el instrumental
propio de la HPLC y que se traduce en:
1. Elevada rapidez de análisis, inferiores a los
30 minutos.
2. Elevada eficacia 105-106 platos por metro.
Salvador Camacho Garrido
3. Bajos volúmenes, del orden de nL.
4. Universalidad.
5. Facilidad de automatización.
Sistemas de Inyección
Para llevar a acabo la introducción de las
sustancias a analizar en el capilar se sustituye
uno de los viales, que contiene el tampón de
separación, por otro vial que contiene la muestra
en disolución; se aplica entonces, durante un
tiempo controlado, una diferencia de presión o
de potencial eléctrico de modo que la muestra se
desplace por el interior del capilar por flujo
hidrodinámico o por electromigración.
Columnas capilares
Son tubos cuyas dimensiones varían entre las 25
–100 μm de diámetro y 25-100 cm de longitud,
generalmente construidas en sílice fundida o
teflón.
Para técnicas especiales se ha recurrido a utilizar
columnas capilares rellenas de partículas o geles
como son:
1. Electroforesis con micelas con uso de SDS.
2. Redes poliméricas, con uso del DNA,
polisacáridos o complejos proteínas-SDS.
3. Geles anclados, con uso de poliacrilamida
lineal, polietilenglicol, metilcelulosa o
alcohol polivinílico.
El empleo de columnas especiales, también da
lugar a técnicas diferenciadas en columna
capilar como son:
a) Isoelectroenfoque capilar.
b) Electrocromatografía capilar.
c) Isotacoforesis capilar.
Detectores
La aparición de la electroforesis capilar como
una importante técnica analítica de separación,
ha originado la adaptación de un variado número
de detectores ya existentes para hacerlos
compatibles con la técnica. Así se han
modificado detectores U.V.-V., y se ha
comprobado la utilidad de otros, como los
espectrómetros
de
masas
(EM),
los
amperométricos y los de fluorescencia. Menos
utilizados, son los conductimétricos, los
radiométricos y los basados en espectroscopia
Raman. Uno de los detectores más novedosos
utilizado en esta técnica es el de fluorescencia
inducida por láser.
56. ELECTROFORESIS DE
PROTEÍNAS.
Para comprobar si la proteína de interés se ha
separado del resto, es decir si la proteína está
32
Ensayos Biotecnológicos
pura, se requieren las técnicas electroforéticas.
La electroforesis de proteínas se lleva a cabo
generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata
de geles porosos, cuya porosidad se puede
regular en función de la concentración de
acrilamida.
Durante la electroforesis la fuerza que provoca
la migración de las proteínas es un campo
eléctrico, y el gel actúa como filtro molecular,
ralentizando la migración de las proteínas en
función de su relación carga/masa. A diferencia
de lo que ocurría en la cromatografía de
filtración, en las electroforesis las proteínas
mayores son retardadas y se mueven más
lentamente a través del gel, ya que las va
frenando el tamaño del poro y las proteínas más
pequeñas avanzan más rápidamente.
En la figura vemos un típico aparato de
electroforesis. El gel se encuentra entre dos
placas (normalmente de vidrio). La colocación
de un peine de electroforesis en la parte superior
antes de que la acrilamida gelifique permite la
formación de unos pocillos, donde se colocarán
posteriormente y una vez retirado el peine, las
muestras, que se desplazarán por calles paralelas
al aplicar el campo eléctrico.
Existen dos tipos principales de electroforesis:
• En Condiciones Nativas
• En Condiciones Desnaturalizantes
Generalmente las proteínas de interés se
analizan incluyendo calles con marcadores
moleculares, que son proteínas de peso
molecular conocido que nos permiten
determinar el peso molecular de la cadena
polipeptídica.
Salvador Camacho Garrido
En la calle 1 se encuentran los patrones de peso
molecular conocido, en la calle 2 se encuentra la
proteína sujeta a estudio, de tal manera que se
puede hacer una relación lineal entre el Log del
peso molecular de las proteínas y la distancia
que recorren en el gel o Rf (distancia de la
banda/distancia del frente).
57. ELECTROFORESIS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA (PAGE).
En condiciones nativas las proteínas se separan
en función de su relación carga/masa. La carga
de una proteína viene determinada por la
composición en aminoácidos y es función del
pH. En condiciones nativas, por tanto, solo
migrarían las proteínas con carga neta al pH de
electroforesis. De entre ellas las proteínas de
mayor tamaño encuentran más dificultades para
atravesar los poros de la red de acrilamida
33
Ensayos Biotecnológicos
estableciéndose un patrón de migración
característico.
Las muestras de proteínas se disuelven en una
pequeña cantidad de una solución tampón, que
contiene glicerol, que hace que la muestra se
sitúe en el fondo del pocillo y un colorante azul
(azul de bromofenol) de pequeño peso molecular
que nos indica la migración del frente. El
tampón de electroforesis cierra el circuito entre
el cátodo (+) y el ánodo (-). El sistema se
conecta a una fuente de alimentación y las
proteínas migran hacia el polo positivo, situado
en la base del gel.
Después el gel se saca del recipiente que lo
contiene y se incuba en presencia del colorante
adecuado (azul de Coomassie), que tiñe por
completo el gel. A continuación se destiñe con
una disolución de etanol/acético y el gel queda
transparente y las bandas de proteínas quedan
teñidas de color azul.
Tipos de desarrollo
• Electroforesis continua:
Es la electroforesis más simple y se lleva a cabo
e un gel de poliacrilamida de composición
uniforme. Presenta problemas de resolución, ya
que el volumen de la muestra impide que todas
las moléculas inicien la electroforesis en el
mismo lugar al mismo tiempo.
• Electroforesis discontinua:
En este tipo de electroforesis se consigue que
todas las moléculas empiecen a separarse al
mismo tiempo y desde el mismo lugar, lo que se
traduce en una mayor resolución.
Para ello se utiliza un gel dividido en dos fases:
a) Gel de separación, donde se realiza la
separación efectiva de las moléculas.
b) Gel de concentración, donde se
concentran los componentes para iniciar
la separación en el mismo punto. Aquí
el porcentaje de acrilamida es más bajo,
ya que interesa que todas las proteínas
penetren por igual en el gel
concentrador. El gradiente de voltaje
hace que las moléculas más alejadas del
gel se muevan a mayor velocidad y
según se acercan al gel de separación
disminuyan su velocidad. Esto hace que
todas las proteínas alcancen el gel de
separación prácticamente al mismo
tiempo ayudadas, también, por el gran
tamaño de poro.
El PI de una proteína es el pH en el que esa
proteína tiene una carga neta igual a cero.
Lógicamente, las proteínas han de estar en
condiciones no desnaturalizadas y especialmente
en ausencia de detergentes.
Para esta separación, la electroforesis tiene lugar
en un gradiente de pH, donde se genera un
campo eléctrico. En este campo, las proteínas
comienzan a moverse según su carga eléctrica y
migran hasta el punto de pH igual a su PI:
entonces quedan con carga neta igual a cero y se
estabilizan.
El gradiente de pH se genera con anfolitos. Estos
anfolitos deben ser compuestos inertes, solubles
en agua y de alta conductividad.
Se suelen usar mezclas de anfolitos que cubren
un rango de PI determinado. Al generar un
campo eléctrico se distribuyen según su PI, y
confieren al entorno un pH igual al PI.
59. ELECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL.
Es una variante de las dos técnicas anteriores
isoelectroenfoque y PAGE. Su principal ventaja
es que la separación en dos dimensiones se
establece en base a los principales parámetros
que diferencian a unas proteínas de otras: el
tamaño y la distribución de carga.
Las dos electroforesis diferentes se realizan
secuencialmente y girando la segunda 90 º con
respecto a la primera.
En la primera dimensión separamos mediante
electroisoenfoque por sus PI.
En la segunda dimensión mediante una
electroforesis discontinua y en condiciones
desnaturalizantes separamos por tamaño
molecular.
El resultado es un mapa completo donde quedan
separadas casi completamente la mayoría de las
proteínas unas de otras. Cada tipo celular posee
su propio patrón bidimensional. Estos mapas son
de mucha utilidad para caracterizar las proteínas
de las que se desconoce su identidad.
58. ISOELECTROENFOQUE.
En esta electroforesis las proteínas se separan en
función del su punto isoeléctrico (PI).
Salvador Camacho Garrido
34
Ensayos Biotecnológicos
60. ELECTROFORESIS EN
CONDICIONES
DESNATURALIZANTES.
En presencia de algunos compuestos químicos,
las proteínas pierden su estructura nativa; tales
compuestos, llamados agentes desnaturalizantes
producen el desplegamiento de la proteína que
queda, así, sin la organización tridimensional
característica de su funcionalidad biológica. En
algunas proteínas hay puentes disulfuro entre los
residuos de cisteínas (para formar cistinas) de
una misma cadena polipeptídica (puentes
intracatenarios) o de diferentes cadenas (puentes
intercatenarios) de algunas proteínas con
estructura cuaternaria. Estos puentes se pueden
romper mediante tratamiento con determinados
agentes reductores, como por ejemplo, el ßmercaptoetanol (ß-ME) o el ditiotreitol (DTT).
Otros agentes desnaturalizantes de proteínas, son
la urea y determinados detergentes. La urea
interfiere con las reacciones hidrofóbicas de las
proteínas y debe incluirse en el tampón de la
muestra y en todos los que se empleen para la
preparación de los geles; las principales
aplicaciones de la urea es en la separación de las
histonas, así como de proteínas nucleares y
ribosomales (ya que tienen mucha tendencia a
agregar y son insolubles) y para el análisis
conformacional de proteínas (mediante geles con
gradientes transversales de urea).
Detergentes
Los detergentes afectan a la estructura nativa de
las proteínas y a las interacciones con otras
moléculas (proteínas, lípidos, etc.), ya que las
interacciones hidrofóbicas de las proteínas son
sustituidas por interacciones detergentesproteína. Existen tres tipos principales de
detergentes:
• Detergentes no iónicos.
Son débilmente desnaturalizantes y no alteran la
carga de las proteínas a las que se unen; se
pueden utilizar en geles con urea y en
electroenfoque. Los más empleados son el Triton
X-100 y el Octilglucósido, particularmente para
solubilizar proteínas de membrana. Se utilizan a
Salvador Camacho Garrido
concentraciones de 0,1-3,0% (p/v) y deben
incluirse en el tampón de la muestra y en el del
gel.
• Detergentes iónicos.
Pueden tener carga positiva (catiónicos) que se
usan para la separación de proteínas muy ácidas
o muy básicas; el más utilizado es el
cetiltrimetilamonio (CTAB). Otros poseen carga
negativa (aniónicos) y un fuerte carácter
desnaturalizante; el más empleado es el
dodecilsulfato sódico o lauril sulfato sódico
(SDS).
• Detergentes anfóteros.
Son débilmente desnaturalizantes y no afectan a
la carga de las proteínas; algunos, como el 3(cloroamidopropil)-dimetilamonio-1propanosulfato (CHAPS) solubilizan muy bien las proteínas
de membrana. Son compatibles con la
utilización de urea y su uso es frecuente como
una alternativa a los detergentes no iónicos
SDS-PAGE
En
condiciones
desnaturalizantes
la
electroforesis se realiza en presencia de un
detergente, el SDS (dodecil sulfato sódico).
El SDS es un detergente aniónico, que se une a
todas las proteínas en la misma proporción
formando una especie de micela cargada
negativamente. La gran carga negativa del SDS
enmascara la carga intrínseca de las proteínas,
con lo que éstas se separan solo en función de su
masa e independientemente de su carga.
El único inconveniente de esta técnica es que el
SDS desnaturaliza las proteínas y las proteínas
multiméricas se separan en sus subunidades. Las
electroforesis en SDS además de permitir
calcular el peso molecular de las cadenas
polipeptídicas, nos indican las distintas
subunidades que posee la proteína.
La siguiente figura nuestra la diferencia entre la
electroforesis nativa (NATIVAPAGE) y la
electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE).
Como se aprecia en la figura una banda en la
Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si la
proteína tiene varias subunidades de distinto
peso molecular, o bien en una banda de menor
peso molecular, si las subunidades poseen el
mismo peso molecular. De la figura se deduce
que, la proteína está pura (pues solo aparece un
banda) y que además posee 2 subunidades de
15000 g/mol (o lo que es lo mismo 15 kDa) cada
una.
35
Ensayos Biotecnológicos
Ventajas
En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis
más utilizada para el análisis de proteínas debido
a:
• La gran mayoría de las proteínas son
solubles en SDS.
• Todos los complejos SDS-proteína
tienen carga negativa y migran, por lo
tanto, en el mismo sentido.
• Su densidad de carga es muy elevada,
por lo que su velocidad de migración
también lo es y las electroforesis son
muy rápidas.
• La separación depende de un parámetro
físico-químico, como es la masa
molecular, que se puede calcular.
• Los complejos SDS-proteína se tiñen
fácilmente.
61. TINCIÓN.
Para detectar las bandas de los distintos
componentes separados, es necesario teñir las
proteínas presentes en el gel. En general es
deseable que los agentes de tinción tiñan por
igual cualquier proteína, de forma que pueda
hacerse estimaciones cuantitativas, con ayuda de
los microdensitómetros.
Usualmente para la tinción de geles de
poliacrilamida se utiliza la tinción de
Coomassie, la tinción con plata, la tinción
fluorescente y la autorradiografía, dependiendo
del fin de nuestro análisis. La tinción con plata
no es utilizada si se desean hacer análisis por
espectrometría de masas (MS) pero es más
sensible que la tinción con Azul de Coomassie,
por otro lado, la tinción fluorescente es muy
sensible y compatible con MS pero los costos de
tinción son elevados.
Azul de Coomassie
Una tinción sensible y barata es la denominada
"Blue Silver" o Coomassie G250. Además, esta
tinción es compatible con MS. Esta compuesta
por azul de coomassie diluido en una solución
coloidal y se utiliza agua destilada para desteñir
Salvador Camacho Garrido
el gel de poliacrilamida.
En primer lugar, hay que proceder a fijar las
proteínas al gel, para evitar la difusión. Para ello,
incubamos con una solución etanol/acético.
A continuación, se procede a la tinción con el
colorante azul de Coomassie. Después de este
paso todo el gel aparece teñido de un color azul
intenso.
Finalmente una nueva incubación con
metanol/acético elimina la tinción excepto en las
zonas donde hay proteína.
La sensibilidad de este método nos permite
detectar bandas con 1 μg de proteína por mm2.
Nitrato de plata
Se utiliza cuando se trabaja con cantidades de
proteínas menores, ya que es unas 100 veces
más sensible.
Fluorescencia
Se suele utilizar fluorescamina, que al reaccionar
con los grupos amino libres de la proteína da
lugar a un compuesto fluorescente detectable. Es
un método bastante sensible, aunque presenta
varios inconvenientes, sobre todo la pérdida de
fluorescencia con el tiempo.
Este método tampoco permite apreciaciones
cuantitativas, ya que la intensidad no solo se
relaciona con la cantidad de proteína sino
36
Ensayos Biotecnológicos
también con el número de grupos amino libres.
Autorradiografía
Es el método más sensible. Puede utilizarse
cuando la muestra está marcada utilizando
aminoácidos con elementos radiactivos (32P, 125I,
3
H, 35S), que permiten detectar las bandas
incluso con cantidades ínfimas de proteínas.
El gel se seca y se expone con una película
sensible a los Rayos X. Las partículas
radiactivas marcan la película, permitiendo su
observación después del revelado.
Con isótopos que tiene baja emisión (3H, 14C,
35
S) podemos amplificar la señal con
fluorografia: El gel desecado se incuba con una
sustancia fluorescente que aumenta la
irradiación de las partículas.
62. TRANSFERENCIA.
Las proteínas separadas en un gel pueden ser
transferidas ('blotting”) a un soporte sólido
(membrana), o ser electroeluidas.
Membranas
La ventaja principal de las membranas es la
versatilidad y la estabilidad de las proteínas en el
soporte: las membranas son menos frágiles,
permiten la incubación con reactivos específicos
y la realización de experimentos tiempo después
de haber resulto una mezcla de proteínas en un
gel.
Las membranas sueles ser de nitrocelulosa de
nylon (las más resistentes) y membranas
Salvador Camacho Garrido
hidrofóbicas de polifluoruro de vinilideno
(PVDF).
Para transferir las proteínas se emplea una
corriente eléctrica (electrotransferencia). Al
interponer una membrana con afinidad por las
proteínas entre el gel y el ánodo (+), las
proteínas que migran del gel gracias a su carga () quedan atrapadas.
El método más sencillo es aplicarlas
directamente en forma de una pequeña gota de
una solución concentrada sobre la membrana. La
absorción de la gota provoca la adhesión de la
proteína a la membrana, quedando en forma de
una mancha o “dot” (es el caso del “dot blot”).
Existen dispositivos que facilitan la aplicación
de las proteínas directamente a la membrana,
aplicando una succión que facilita la penetración
de la solución, y reciben los nombres de “dot
blot” o “slot blot” en función de que la proteína
quede aplicada en forma de una gota circular o
de una línea.
Todo procedimiento de blotting consta de 5
etapas:
1. Inmovilización de proteínas sobre la
membrana ya sea mediante transferencia
(electroforética, aspiración, presión,...) o
mediante aplicación directa.
2. Saturación de todos los lugares de unión de
proteínas de la membrana no ocupados para
evitar la unión no específica de anticuerpos,
que son proteínas.
3. Incubación del blot con anticuerpo primarios
contra la/s proteína/s de interés.
4. Incubación del blot con anticuerpos
secundarios, o reactivos que actúan de
ligando del anticuerpo primario unidos a
enzimas u otros marcadores.
5. Las bandas de proteínas marcadas con
enzimas se hacen visibles por incubación
con los sustratos apropiados para formar
productos coloreados insolubles en el lugar
donde se encuentran las bandas de proteína.
Hay tres métodos para transferir proteínas a las
membranas:
1. Transferencia capilar
2. Transferencia por difusión
3. Transferencia
electroforética
(electroblotting)
La transferencia se puede llevar a cabo en dos
tipos de aparatos y por tanto de dos formas
diferentes: transferencia húmeda, en aparatos
que poseen cámaras que se llenan de tampón y
transferencia semiseca, en aparatos que no
tienen dichas cámaras y, por tanto, no necesitan
tal cantidad de tampón.
37
Ensayos Biotecnológicos
detectadas con ligando específicos. Estos
ligando reconocen exclusivamente una proteína
concreta, y sirven para revelar su presencia,
cuando poseen una marca adicional (radiactiva,
quimioluminiscente, etc.).
En la mayoría de los caos, el ligando es un
anticuerpo específico que reconoce la proteína
en estudio. Cuando un anticuerpo no está
marcado, se emplea un anticuerpo secundario
específico del primero que presente un
compuesto que otorga la señal de detección.
Electroelucción
Es un método utilizado para extraer del gel las
proteínas que hemos separado por electroforesis.
Se realiza en un medio líquido, en un aparato
especial donde se genera un campo eléctrico.
Se corta la banda de un gel y se coloca en el
cátodo (-). Al aplicar un campo eléctrico, la
proteína abandona el gel y se mueve hacia el
ánodo (+). Las proteínas se concentran en una
cámara pequeña, cerrada por una membrana de
diálisis que bloquea su paso hacia el ánodo.
63. ULTRACENTRIFUGACIÓN.
Se denomina centrifugación a una técnica
consistente en someter a una población de
moléculas en disolución (o dispersión) a un
campo de fuerzas de inercia centrífugas.
Una de las aplicaciones más importantes de la
centrifugación (o ultracentrifugación) es el
análisis y separación de una mezcla de proteínas
en disolución.
Este análisis, tanto cualitativo como cuantitativo
se realiza aplicando tres técnicas distintas:
• Registro del diagrama de sedimentación
• Estudio del equilibrio de sedimentación
• Método de gradiente de densidad.
Análisis de la transferencia
Se suelen utilizar dos métodos:
• Tinción:
Se suele usar rojo Ponceau (Ponceau S, Tinta
china o Negro amido) y es un método reversible,
ya que se destiñe fácilmente con agua y no
interfiere con los trabajos posteriores.
• Inmunodetección:
Normalmente, las proteínas transferidas son
Salvador Camacho Garrido
38
Ensayos Biotecnológicos
cualitativo y cuantitativo de la mezcla de
proteínas.
Método del gradiente de densidad
En la aplicación práctica de este método, el tubo
de centrifugación se llena con una disolución
(normalmente de sacarosa) cuya concentración
aumenta regularmente de abajo hacia arriba.
Para ello se toma, como hemos dicho, una
disolución de sacarosa en agua cuya
concentración varía, linealmente, desde 20 g de
sacarosa por 100 g de disolución en el punto
inferior O hasta 5 g de sacarosa por 100 g de
disolución en la superficie libre S. Esta variación
de concentración corresponde a una variación
lineal de densidad entre 1,081 g/cm3 en el punto
O y 1,017 g/cm3 en la superficie libre S, a la
temperatura de 20 °C.
Diagrama de sedimentación
Se denomina de esta forma a la gráfica
correspondiente al gradiente de densidad de las
diferentes especies que constituyen la mezcla en
función de la coordenada X.
Equilibrio de sedimentación
Cuando se cumplen las condiciones requeridas,
las proteínas sometidas a ultracentrifugación
alcanzan un estado de equilibrio caracterizado
por el cese de la migración de moléculas; es
decir, la difusión debida al movimiento
browniano compensa, en todos los puntos del
tubo, al movimiento debido al campo de fuerzas
centrífugas aplicado.
El diagrama registrado cuando se alcanza este
equilibrio de sedimentación contiene tantas
fronteras como proteínas hay en disolución que
tengan diferentes constantes de sedimentación.
El estudio de este diagrama permite el análisis
Salvador Camacho Garrido
Una vez preparada esta solución, la disolución
conteniendo a la mezcla de proteínas se deposita
en la superficie S y la célula completa es
sometida a centrifugación. En el transcurso de
ella, las moléculas proteicas, al desplazarse, se
encuentran con un medio de densidad creciente
y están sometidas a un empuje igualmente
creciente. Por lo tanto, llega un momento en el
que la densidad de la proteína es igual a la
densidad de la disolución de sacarosa, momento
en el cual las fuerzas que actúan sobre la
proteína se anulan, y la molécula permanece fija
en dicho punto al hacerse cero su velocidad de
sedimentación. Por lo tanto, en función de su
masa, las proteínas se separan formando franjas
o estratos claramente visibles o detectables por
medio de radiación ultravioleta.
Una vez hecho esto se puede separar cada
proteína valiéndose de pipetas u otros métodos
de extracción.
39
Ensayos Biotecnológicos
64. SECUENCIACIÓN DE
PROTEÍNAS.
Importancia de la secuenciación
1) Conocer la secuencia de aminoácidos de una
proteína es un requisito para determinar su
estructura 3D y es esencial para entender su
mecanismo macromolecular de acción.
2) La comparación de secuencias entre proteínas
análogas de diferentes especies produce un
conocimiento profundo de la función de las
proteínas y revela relaciones evolucionistas entre
las proteínas y los organismos que las producen.
3) Muchas enfermedades heredadas son
causadas por mutaciones que conducen a un
intercambio de aminoácidos en una proteína. El
análisis de las secuencias de aminoácidos puede
ayudar al desarrollo de pruebas diagnósticas y
terapias efectivas.
Métodos
El método químico comprende:
• El análisis de grupo N-terminal revela el
número de diferentes tipos de
subunidades.
Los
métodos
para
determinar el N-terminal son la reacción
con cloruro de dansylo y su posterior
hidrólisis para liberar el compuesto
fluorescente y la reacción de
degradación de Edman.
• El análisis del grupo C-terminal se hace
con carboxipeptidadas, al no existir un
procedimiento químico, y posterior
análisis del aminoácido libre.
• La ruptura de los puentes disulfuros
entre y dentro de los polipéptidos por
ruptura oxidativa con ácido perfórmico
y posterior reducción con mercaptanos.
• Repetición de los procesos anteriores.
Salvador Camacho Garrido
Actualmente se utiliza la técnica de
secuenciación N-terminal por degradación de
Edman y posterior resolución por HPLC en fase
inversa con detección UV a 270 nm.
El desarrollo de nuevos métodos de ionización
ha permitido a la espectrometría de masas
establecerse como técnica de análisis de
biomoléculas. Actualmente constituye una
técnica insustituible para la detección de
aminoácidos modificados en proteínas naturales
y recombinantes y una alternativa prometedora
para la secuenciación de péptidos y proteínas.
La determinación de la composición de los
aminoácidos mediante EM, tiene técnicas
específicas para el análisis de proteínas (ejemplo
de ellas son los equipos de MALDI-TOF, TOFTOF o “electrospray”). El análisis se efectúa a
aquellas proteínas que hayan resultado de interés
después del análisis por 2-D, para ello, los
péptidos o las proteínas seleccionadas son
recuperados desde los geles, deshidratados,
digeridos enzimáticamente con tripsina y
analizados en los equipos de EM.
La última técnica es la incorporación, a la línea
de trampas iónicas de Finnigan, es la trampa
lineal bidimensional de alto rendimiento LTQ.
Combinando la bien conocida tecnología
patentada de las series LCQ con los últimos
avances de diseño en trampa lineal, óptica,
fuentes iónicas y detectores, la LTQ de Finnigan
está destinada a marcar un nuevo estándar en la
espectrometría de masas.
40
Ensayos Biotecnológicos
El análisis por EM se logró cuando por primera
vez se indujo a que las proteínas o los péptidos
se ionizaran en el alto vacío por aplicación de un
rayo láser que incide en la matriz en la que se
depositan las muestras. Los iones producidos
viajan a diferente velocidad (dependiendo de su
masa) hacia un sistema detector, sitio del EM en
el cual se registran tanto el tiempo de vuelo
como la carga de los iones y ello permite
generar los patrones espectrales de las proteínas
o los péptidos. Las bases de datos, disponibles
hasta el momento, ya cuentan con los valores de
EM de muchas proteínas y para algunas de las
cuales se conoce perfectamente su composición
de aminoácidos (aa).
La composición de aa exacta de los péptidos o
las proteínas, se hace por otro posterior análisis
de EM, sólo que en estos, las proteínas son
digeridas nuevamente, marcadas en sus regiones
carboxilo terminal, separadas por HPLC y
analizadas por EM de ionización de pequeñas
alícuotas
de
los
péptidos
obtenidos.
Nuevamente, con la comparación por
bioinformática de los resultados obtenidos se
logra determinar la composición de aa de los
péptidos y su identificación sin necesidad de
haber purificado, cristalizado y determinado las
propiedades estructurales de las proteínas. Esta
tecnología de EM permite que en un aparato
MALDI-TOF o TOF-TOF puedan evaluarse
hasta 100 proteínas en un lapso de medio día y
en una semana se logren identificar todas las
proteínas contenidas en un gel de 2-D. La
composición de aa de las proteínas es un
proceso mas largo y requiere de al menos dos
días para el análisis de una mezcla de 3 o 4
proteínas. Con esta tecnología, en una semana
puede tenerse la secuencia de aa completa de
por lo menos 10 proteínas. Este proceso es muy
eficiente comparado con la microdegradación de
Edman en la que sólo pueden identificarse un
número limitado de aa en porciones amino
terminal no bloquedas y en cantidades del orden
de mg (en EM se evalúan pico o ng).
La única limitación sería que la proteína
caracterizada no hubiera sido estudiada
previamente y no haya registro de ella, sin
embargo, cada vez crecen más las bases de datos
y lo que hay aún es mucho mayor (de orden de
20000 veces) en comparación con las estructuras
de las proteínas purificadas.
Un nuevo sistema, junto con el software
SEQUEST, permite la identificación de
proteínas a partir de los espectros MS/MS.
Ahora, las proteínas pueden ser identificadas
basándose en la secuencia de los péptidos, no
solo en su peso molecular, y con la capacidad
Salvador Camacho Garrido
única del MSn, se pueden identificar fácilmente
pesos
moleculares
correspondientes
a
fosforilaciones y glicosidaciones.
65. DETERMINACIÓN
ESTRUCTURAL.
Para realizar el análisis conformacional de las
biomoléculas en general y de las proteínas en
particular se utilizan todas las técnicas que
suponen la interacción de la radiación
electromagnética con las biomoléculas:
• Espectroscopía de absorción: VIS, UV e
41
Ensayos Biotecnológicos
IR.
• Espectroscopía
de
emisión:
Fluorimetría,
Fluorescencia
tras
Transferencia
de
Energía
por
Resonancia (FRET).
• Polarimetría,
• Dicroismo Circular.
• Difracción con Rayos X de fibras y
cristales.
• Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
Son estas dos últimas las más utilizadas.
Difracción de rayos X:
La cristalografía de rayos X implica la
determinación de la estructura de proteínas
mediante el estudio del patrón de difracción de
rayos X a través de un cristal de proteína
orientado de forma precisa. El modo como se
difractan los rayos X depende de la densidad
electrónica y la orientación espacial de los
átomos en el cristal. Los mapas de densidad
electrónica se reconstruyen a partir de los datos
de difracción, usando un método matemático
denominado transformada de Fourier; ello
permite construir modelos estructurales.
Hay
que
vencer
muchos
obstáculos
experimentales antes de que la estructura
tridimensional de una macromolécula sea
determinada por difracción de rayos X de
cristales.
Primero la molécula debe ser cristalizada.
Una vez que se ha obtenido el cristal, se produce
un patrón de difracción por irradiación de rayos
X. Este patrón consiste en miles de puntos que
son los datos crudos.
La posición e intensidad de cada punto es
determinada fácilmente. Las fases de las ondas
que formaron cada punto deben ser también
determinada para producir un mapa de densidad
electrónica.
Salvador Camacho Garrido
Resolver el "problema de la fase" es el segundo
obstáculo. A menudo esto se acompaña al
irradiar dos o más derivados del mismo cristal
que difieren solamente en la presencia de iones
de metales pesados. Este es el método del
"remplazo isomórfico" y requiere que los iones
de metal sean incorporados en un cristal sin
afectar la estructura, lo cual en ocasiones no es
posible. Una solución más reciente para resolver
el problema de la fase involucra utilizar la
radiación de sincrotrón a varias longitudes de
onda lo que ha acelerado la velocidad para
resolver estructuras cristalinas.
Resonancia magnética nuclear:
Es una propiedad de algunos átomos que dentro
de un campo magnético pueden sufrir
transiciones entre estados magnéticos, a costa de
absorber radiación electromagnética. La
naturaleza del espectro de absorción se ve
afectada por el tipo de átomo y por su entorno
químico, de modo que la espectroscopia RMN
puede discriminar grupos químicos diferentes.
Los espectros de RMN también se modifican de
acuerdo a la proximidad de los átomos en el
espacio. El análisis de los espectros de RMN
permite, por tanto, reconstruir la configuración
tridimensional de los átomos, proporcionando
una serie de modelos estructurales. La técnica es
adecuada para el análisis de proteínas pequeñas
y solubles.
En general no se utiliza la RMN
monodimensional:
42
Ensayos Biotecnológicos
Si las técnicas de RMN multidimensional:
• Espectroscopía COSY.
•
Espectroscopía NOESY.
Salvador Camacho Garrido
43
Ensayos Biotecnológicos
En la tabla se recogen los métodos más usados
así como sus respectivas sensibilidades.
66. CUANTIFICACIÓN.
Determinar la concentración de proteínas en una
muestra biológica es una técnica de rutina básica
cuando se aborda un esquema de purificación de
una proteína concreta, cuando se quiere conocer
la actividad específica de una preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades,
así como para otros muchos propósitos.
Existen
diferentes
métodos
para
la
cuantificación de proteínas. Muchos de estos
métodos se basan en:
• La propiedad intrínseca de las proteínas
para absorber luz en el UV.
• La propiedad para la formación de
derivados químicos.
• La capacidad que tienen las proteínas de
unir ciertos colorantes.
En general todos hacen uso de la
espectrofotometría de absorción UV-VIS.
Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e
inconvenientes, las principales se recogen en la
tabla siguiente.
Método de Biuret
Se basa en la formación de un complejo
coloreado entre el Cu2+ y los grupos –NH- de los
enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se
acompleja con 4 –NH-. La intensidad de
coloración es directamente proporcional a la
cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la
reacción es bastante específica, de manera que
pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del
método es muy baja y sólo se recomienda para la
cuantificación de proteínas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).
Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie
Salvador Camacho Garrido
44
Ensayos Biotecnológicos
Blue G-250 (también Serva Blue) a las
proteínas. El colorante, en solución ácida, existe
en dos formas una azul y otra naranja. Las
proteínas se unen a la forma azul para formar un
complejo proteína-colorante con un coeficiente
de extinción mayor que el colorante libre. Este
método es sensible (1-15 μg), simple, rápido,
barato y pocas sustancias interfieren en su
determinación. Entre las sustancias que
interfieren están los detergentes y las soluciones
básicas.
Método de BCA
El ácido bicinconínico, en forma de sal sódica,
es un compuesto capaz de formar un complejo
púrpura intenso con iones Cu+ en medio
alcalino. Este reactivo forma la base de un
método analítico capaz de monitorizar el ión
cuproso producido en una reacción entre las
proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción
de Biuret). La estabilidad del reactivo y el
cromóforo proporciona un método para la
cuantificación de proteínas que es sencillo,
rápido, muy sensible, y que muestra una gran
tolerancia a compuestos que afectan a otros
métodos.
Turbidimetría
La turbidimetría mide la disminución de la luz
transmitida a través de una suspensión de
partículas
utilizando
para
ello
un
espectrofotómetro (detector en la misma
dirección del haz de luz, se mide A o T). Se
suele utilizar para soluciones concentradas (para
que haya una buena disminución de la luz
transmitida). Ej.: Determinación de proteínas
totales en suero, líquido cefalorraquídeo (LCR)
u orina (haciendo que las proteínas precipiten
con TCA o ácido sulfosalicílico).
Nefelometría
La nefelometría mide la luz dispersada en
dirección distinta a la luz emitida (generalmente
con ángulos que oscilan entre 15 y 90º).
Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el
que el detector se ubica con un ángulo como en
el ejemplo a 90º). Se suele utilizar para
concentraciones más diluidas.
Proteína + Cu2+ → Cu+
Cu+ + BCA → BCA- Cu+ (complejo púrpura)
Reacción de Folin
Característica de los grupos –OH reductores de
los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto
con los complejos de Cu2+, reducen el reactivo
de Folin generando un color azul.
Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza
fundamentalmente en orina.
Técnicas Dispersivas
También se puede utilizar las técnicas de
dispersión.
Cuando un haz de luz choca con una partícula en
suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la
luz se refleja y parte de la luz se absorbe.
La dispersión de la luz depende de: la longitud
de onda de la luz, del tamaño de la partícula y
del índice de refracción de la partícula en
relación con el medio que la rodea. La
dispersión de la luz se puede medir por
turbidimetría o por nefelometría.
En ambas técnicas, para dar como resultado una
concentración de proteína concreta, se compara
la cantidad de luz dispersada o la tasa de
aumento de dispersión con los valores de dichos
parámetros en estándares proteicos conocidos.
Salvador Camacho Garrido
Método Kjeldahl
Las unidades constitutivas de las proteínas son
los aminoácidos, moléculas que poseen
nitrógeno en su estructura. Si bien se han
encontrado aproximadamente 200 aminoácidos
en la naturaleza, son 20 de ellos los más
frecuentes.
El contenido de Nitrógeno en una proteína varía
de acuerdo al origen de la misma entre 15 % y
18 %, tomándose como un valor promedio 16 %.
En el análisis químico de proteínas, se cuantifica
el contenido de nitrógeno y luego se determina
el porcentaje presente en la muestra
relacionándolo con el origen de la misma
(vegetal, animal, fertilizante, medicamento).
El Método desarrollado por Kjeldahl consta de
tres etapas:
1. Digestión: conversión del nitrógeno
(proveniente de las proteínas, por
45
Ensayos Biotecnológicos
ejemplo) en ion amonio.
2. Destilación: separación por arrastre con
vapor del amoníaco (ion amonio en
medio básico) y posterior solubilización
en una solución ácida de concentración
conocida o mejor hacerlo reaccionar
cuantitativamente con ácido bórico.
3. Valoración: medición de la cantidad de
ácido neutralizado por el amoníaco
disuelto con sosa, o mejor valoración
directa del borato formado con ácido
clorhídrico, lo que indica la cantidad de
nitrógeno presente en la muestra inicial.
De acuerdo con el origen de la muestra, a través
de un factor, se relaciona la cantidad de
nitrógeno encontrado con el porcentaje de
proteínas que lo originaron.
Algunos factores de proteína/nitrógeno, acorde
al origen de la muestra son: gelatina (5,55)
leche, (6,30), carne bovina (6,25), pescado
(6,25), aceite vegetal (5,40) y maíz (6,25).
Salvador Camacho Garrido
46
Ensayos Biotecnológicos
HOC5H2
TEMA III. LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
C4
H
67. LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
En 1868, F. Miescher aisló una sustancia del
núcleo de las células del pus. Se consideró a la
sustancia como característica del núcleo y él la
denominó nucleína. Posteriormente se aisló de
muchos más núcleos y se determinó que estaba
compuesta por una mezcla de una proteína
básica, y un ácido orgánico que contenía fósforo
y que se denominó posteriormente con el
nombre de ácido nucleico.
Tanto
el
DNA
o
ADN
(ácido
desoxirribonucleico) como el RNA o ARN
(ácido ribonucleico) son polinucleótidos, es
decir, polímeros cuyos nonómeros son los
nucleótidos, que se unen unos a otros a través de
uniones fosfodiéster entre el C3’de un
nucleótido y el C5’ del nucleótido adyacente.
Para la formación de los nucleótidos podemos
seguir la siguiente secuencia:
HN
O
O
NH
timina
N
O
O
HN
NH
citosina
O
N
N
NH
uracilo
N
NH
adenina
H
HO C5'H2
C4'
' H
H
C 3'
C4
H
H
H
C3
C2
OH
OH
H
β-D-ribofuranosa
OH
NH
NH2
N
N
HO C5'H2
O
H
C 2'
C1'
H
H
C 4'
H
O
O
N
C1'
H
H
C3'
C 2'
OH
OH
H
1,2'-desoxi-β-D-ribofuranosil citosina (desoxicitidina)
Como el enlace con la base nitrogenada se da en
el nitrógeno a estos nucleósidos se les denomina
N-glicósidos. Como los nombres químicos son
demasiado largos se utilizan términos más
simples:
• Adenina + ribosa = adenosina
• Uracilo + ribosa = uridina
• Guanina + desoxirribosa = desoxiguanosina
• Citosina + desoxirribosa = desoxicitidina
• Timina + desoxirribosa = desoxitimidina
71. NUCLEÓTIDOS.
Los nucleótidos son ésteres de ácido fosfórico de
nucleósidos, en los que el fosfato está en la
posición C-5’.
Otros nucleotidos fosforilados en otra posición
no se encuentran dentro de los ácidos nucleicos.
Los
nucleótidos
se
denominan
desoxirribonucleótidos, y ribonucleótidos en
función del azúcar presente.
69. AZÚCARES.
El azúcar del DNA es la 2-desoxi-D-ribosa,
mientras que en el RNA es la D-ribosa:
Salvador Camacho Garrido
C1
H
N
9-β-D-ribofuranosil adenina (adenosina)
guanina
Tanto las pirimidinas (timina, citosina y uracilo)
como las purinas (adenina y guanina) pueden
existir en forma ceto como en forma de enol.
Las base pirimidínicas uracilo y citosina se
encuentran en el ARN mientras que la timina y
la citosina forman parte del ADN, encontrándose
las bases púricas en los dos tipos de ácidos
nucleicos.
OH
N
N
N
C2
N
HN
H2N
C3
C1
NH2
O
NH2
H
OH
O
70. NUCLEÓSIDOS.
Dentro de la estructura de los ácidos
nucleicos, una pirimidina o una purina están
unidas al azúcar para dar un nucleósido. Los
nucleósidos
son
conocidos
como
desoxirribonucleósidos
si
contienen
desoxirribosa y ribonucleósidos si contienen
ribosa. Los nucleósidos de purina tienen un
enlace β-glicosídico entre el N-9 de la base y el
C-1 del azúcar. En los nucleósidos de pirimidina
la unión es entre el N-1 de la base y el C-1 del
azúcar.
68. BASES NITROGENADAS.
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos
son 5.
Tres derivan de la pirimidina por lo que se
denominan bases pirimidínicas y 2 de la purina
por lo que se denominan bases púricas.
CH3
H
2-desoxi-β-D-ribofuranosa
Base nitrogenada + azúcar Æ Nucleósido
Nucleósido + P Æ Nucleótido
O
HOC5H2
OH
O
47
Ensayos Biotecnológicos
NH2
N
P
O C5'H2
O
C4'
' H
H
C3'
HO
O
OH
N
OH
N
N
OH
HO
NH2
N
H
C 2'
C 1'
H
H
adenosina 5'-fosfato (AMP)
P
OC5'H2
O C4'
H
O
N
O
C1'
H
H
C3'
C2'
OH
OH
H
desoxitimidina 5'´fosfato(dTMP
Estos compuestos tienen un marcado carácter
ácido, resultante de la ionización primaria del
fosfato con un valor del pKa aproximadamente a
1. La ionización secundaria del fosfato ocurre a
valor próximo a pKa 6.
Tanto las bases y los nucleósidos (ya vistos)
como los nucleótidos tienen forma abreviadas de
ser nombrados:
Base
Adenina, A
Guanina, G
Citosina, C
Uracilo, U
Timina, T
Ribonucleótido
Ácido adenílico,
AMP
Ácido guanílico,
GMP
Ácido citidílico,
CMP
Ácido uridílico,
UMP
Ácido timidílico,
TMP
O
Desoxirribonucleótido
Ácido desoxiadenílico,
dAMP
Ácido desoxiguanílico,
dGMP
Ácido desoxicitidílico,
dCMP
Ácido desoxiuridílico,
dUMP
Ácido desoxitimidílico,
dTMP
72. FUNCIONES DE LOS
NUCLEÓTIDOS.
Además de formar la estructura de los ácidos
nucleicos los nucleótidos tienen otras funciones
relevantes:
1. El nucleósido Adenosina tiene funciones de
neurotransmisor
2. El adenosin trifosfato (ATP) es la molécula
universal para transferencia de energía
3. El UDP y el CDP sirven como transportadores
en el metabolismo de glúcidos, lípidos y otras
moléculas
4. El AMPc, GMPc y el propio ATP cumplen
funciones reguladoras;
5. AMP forma parte de la estructura de
coenzimas:
• Niacinaadenina dinucleótido (forma
reducida, NADH).
• Flavina Adenina dinucleótido (FAD).
• Coenzima A (forma acetilada, AcetilCoA).
• Uridina difosfato glucosa (UDPG).
73. POLINUCLEÓTIDOS.
Los ácido nucleicos DNA y RNA son
polinucleótidos; es decir, son polímeros que
contienen subunidades repetidas de varios tipos
de nucleótidos. Los nucleótidos, están unidos
unos a otros a través de la uniones fosfodiéster
entre el C-3’ de un nucleótido y el C-5’ del
Salvador Camacho Garrido
nucleótido adyacente. Estas uniones se repiten
cientos de millones de veces para formar
cadenas o hebras.
La dirección de la cadena de 5’ a 3’se dice
convencionalmente que es descendente o hacia
abajo. En el sentido contrario (de 3’ a 5’) se dice
que va hacia arriba o ascendente.
Para indicar que existen en los extremos 5’ y 3’
uniones fosfato, se debe describir no como unión
entre dos nucleótidos para formar un
dinucleótido, sino que se debe intercalar por
cada fosfato una “p” minúscula entre ellos y otra
para los terminales. Así si quedemos describir el
desoxidinucleótido formado por una adenina y
una timina debemos describirlo como d-pApTp.
O P OO
C5'H2
Adenina
O
C1'
C4'
' H
H
C3'
C2'
O
H
H
H
O
O P OO
C5'H2
C4'
H
Timina
O
H
H
C3'
C2'
O
H
C1'
H
O
O P OO
A
T
3’
3’
P
OH
P
5’
5’
74. ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS.
DNA
El DNA es un polidesoxinucleótido y una de las
moléculas biológicas más grandes, pues algunas
contienen del orden de 108 nucleótidos. Como
base contiene adenina, timina, citosina y
guanina, que codifican la información genética.
48
Ensayos Biotecnológicos
La composición en bases es tan regular que se ha
utilizado como criterio de identificación de
algunos microorganismos.
El ADN es una molécula doble en la cual dos
hebras o cadenas polidesoxinucleotídicas están
unidas a través de un apareamiento de bases
específico a través de enlaces de hidrógeno, 2
para la unión adenina-timina y tres para la unión
citosina guanina.
Los pares de bases se apilan unos sobre otros
con el plano de los pares de bases situados
perpendicularmente a lo largo de una doble
hélice.
La estructura es tal que las dos cadenas o hebras
se encuentran orientadas en direcciones
opuestas, es decir, si una va según 5’ a 3’, la otra
va de 3’ a 5’.
La estructura se enrosca en hélice para unir lo
más posible los pares de bases apiladas.
H
CH3
O
N
Azúcar
N
H
H
N
H
N
Azúcar
N
N
O
H
0,34
O
N
H
O
H
N
Azúcar
N
T
Surco
N
N
N
N
Azúcar
H
A
Surco
N
N
G
C
3,4
OH
P
5'
5'
P
5'
P
5'
3'
P
5'
P
5'
OH
3'
3'
3'
3'
3'
A
T
C
G
T
A
G
C
A
T
Salvador Camacho Garrido
3'
3'
3'
3'
3'
5'
P
3'
5'
P
5'
P
5'
P
P
5'
5'
RNA
En cuanto al RNA es un polirribonucleótido que
utiliza las bases, adenina, guanina, uracilo y
citosina. No sólo se encuentra en el núcleo sino
también en el citoplasma celular, y se considera
que existen tres tipos principales:
• tRNA, o RNA de transferencia que
funciona como un adaptador en la
síntesis de cadenas polipeptídicas. Se
estima que existe al menos uno para
cada proteína.
• rRNA,
o RNA ribosomal que se
encuentra presente en los ribosomas.
• mRNA, o RNA mensajero responsable
de transportar una secuencia de DNA,
para ser traducida en el citoplasma wn
una o más cadena polipeptídica.
Estructuralmente, la mayoría del RNA está
constituido por una sola cadena polinucleotídica,
que puede plegarse sobre si misma, formando
49
Ensayos Biotecnológicos
regiones de doble hélice que contienen los pares
de bases A/U y G/C.
75. BASES MODIFICADAS.
Además de las purinas y pirimidinas de las que
hemos hablado anteriormente, es frecuente
encontrar bases modificadas. Entre las más
abundantes encontramos:
• La
5-metilcitosina,
la
5hidroximetilcitosina y la 6-Metiladenina
que se han relacionado con la regulación
de la expresión del DNA
• La 7-metilguanina y el dihidrouracilo
que forman parte de la estructura de los
RNA
• Hipoxantina
y
Xantina
como
intermediarios metabólicos y productos
de reacción del DNA con sustancias
mutagénicas
• El dihidrouracilo y el 4-tiouracilo son
componentes menores del RNA de
transferencia
• En el DNA de los procariotes las bases
metiladas que se encargan de una
función especifica, dar protección al
DNA celular contra la acción de
enzimas restrictivas de la célula. En las
Salvador Camacho Garrido
bacterias, estas enzimas se encargan de
degradar el DNA de algún virus
bacteriano
76. ÁCIDOS NUCLEICOS VÍRICOS.
La mayoría de los virus son partículas núcleoproteínicas que consisten en una molécula de
ácido nucleico- el cromosoma viral (genoma)empacado en una vaina de proteínas. Los virus
no se consideran una verdadera forma de vida
puesto que solo se replican desde la infección en
una célula.
También podemos encontrar el caso de viróides
o priones. Los viroides son un RNA viral
“desnudo” y los priones son sustancias
proteínicas libres o “desnudas” o partícula
proteínica infecciosa.
Una característica única de los viroides es que la
estructura original parece ser la de un RNA
circular de cadena sencilla. Los estudios de la
secuencia de bases del tiroides indican que hay
una gran homología secuencial y también
apoyan la posibilidad de apareamiento
intramolecular de bases para generar cierto
carácter de doble cadena en la estructura celular.
Cuatro de los viróides cuyas secuencias se
conocen hasta ahora tienen homología
secuencial idéntica en uno de estos segmentos de
doble cadena.
50
Ensayos Biotecnológicos
A título de ejemplo, el genoma viral VIH-1 está
constituido por una molécula bicateriana de
ARN de 9.8 Kb aproximadamente, que codifica
todas las proteínas virales necesarias para la
integridad viral y para cumplir su ciclo
infección-replicación. El genoma de VIH-1
comparte la estructura básica de todos los
retrovirus conocidos, con la secuencia GAG que
codifica las proteínas estructurales de la
nucleocápside viral o core.
77. PLÁSMIDOS.
Los plásmidos (también llamados plasmidios)
son moléculas de ADN extracromosómico
circular o lineal que se replican y transcriben
independientes del ADN cromosómico. Están
presentes normalmente en bacterias, y en
algunas ocasiones en organismos eucariotas
como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a
250 kb. El número de plásmidos puede variar,
dependiendo de su tipo, desde una sola copia
hasta algunos cientos por célula. El término
plásmido fue presentado por primera vez por el
Salvador Camacho Garrido
biólogo molecular norteamericano Joshua
Lederberg en 1952.
Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una
conformación tipo doble hélice al igual que el
ADN de los cromosomas, aunque, por
definición, se encuentran fuera de los mismos.
Se han encontrado plásmidos en casi todas las
bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los
plásmidos no tienen proteínas asociadas.
En la mayoría de los casos se considera material
genético dispensable. Sin embargo, posee
información genética importante para las
bacterias. Por ejemplo, los genes que codifican
las proteínas que las hace resistentes a los
antibióticos están, frecuentemente, en los
plásmidos.
Hay algunos plásmidos integrativos, es decir,
que tienen la capacidad de insertarse en el
cromosoma
bacteriano.
Estos
rompen
momentáneamente el cromosoma y se sitúan en
su interior, con lo cual, automáticamente la
maquinaria celular también reproduce el
plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado
se les da el nombre de episoma.
Se suelen clasificar por su función. Hay 5 clases
principales:
• Plásmidos de fertilidad: los cuales
contienen trans-genes, capaces de
conjugarse.
• Plásmidos de resistencia: los cuales
contienen genes que pueden constituir
resistencia
contra
antibióticos o
venenos. Históricamente conocidos
como Factores R, antes de que se
entendiera la naturaleza de los
plásmidos.
• Col-plásmidos: los cuales contienen
genes que codifican (determinan la
producción de) colinas y proteínas que
pueden matar a otra bacteria.
• Plásmidos degradativos: los cuales
habilitan la digestión de sustancias
inusuales como tolueno o ácido
salicílico.
• Plásmidos virulentos: los cuales
convierten la bacteria en un patógeno.
51
Ensayos Biotecnológicos
78. PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS.
Las principales propiedades físico-químicas de
los ácidos nucleicos que vamos a considerar son
las siguientes:
1. Proporción de bases nitrogenadas.
2. Densidad de los ácidos nucleicos.
3. Desnaturalización
de los ácidos
nucleicos: Temperatura de fusión (Tm).
4. Absorbancia a 260 nm.
5. Cinética de Renaturalización: Curvas
Cot.
6. Hibridación de los ácidos nucleicos.
79. PROPORCIÓN DE BASES
NITROGENADAS.
Al principio se pensaba que los ácidos nucleicos
eran la repetición monótona de un
tetranucleótido, de forma que no tenían
variabilidad suficiente para ser la molécula
biológica que almacenara la información. Sin
embargo, Chargaff (1950) demostró que las
proporciones de las bases nitrogenadas eran
diferentes en los distintos organismos, aunque
seguían algunas reglas. Estas reglas de Chargaff
se cumplen en los organismos cuyo material
hereditario es ADN de doble hélice y son las
siguientes:
1. La proporción de Adenina (A) es igual a la
de Timina (T). A = T. La relación entre
Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T
= 1).
2. La proporción de Guanina (G) es igual a la
de Citosina (C). G= C. La relación entre
Guanina y Citosina es igual a la unidad
(G/C=1).
3. La proporción de bases púricas (A+G) es
igual a la de las bases pirimidínicas (T+C).
(A+G) = (T+C). La relación entre (A+G) y
(T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1.
4. Sin embargo, la proporción entre (A+T) y
(G+C) era característica de cada organismo,
pudiendo tomar por tanto, diferentes valores
según la especie estudiada.
Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos
no eran la repetición monótona de un
tetranucleótido. Existía variabilidad en la
composición de bases nitrogenadas.
Organismo
Tejido
A+T/G+C
-
1,00
Hombre
Timo
1,52
Hombre
Hígado
1,53
Escherichia coli
Salvador Camacho Garrido
Hombre
Esperma
1,52
80. DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS.
Existe una relación lineal entre el contenido en
G+C y la densidad del ADN.
A mayor contenido en G+C mayor densidad
posee el ADN.
Basándose en múltiples estudios de la densidad
de los ADNs de diferentes organismos y de su
composición en bases nitrogenadas, se ha
establecido una fórmula empírica que relaciona
la densidad de flotación (ρ) con el contenido en
G+C expresado en moles por ciento.
Está fórmula es la siguiente:
ρ = 1,660 + 0,00098(G+C)
81. DESNATURALIZACIÓN:
TEMPERATURA DE FUSIÓN.
La proporción A+T/C+G está relacionada en
primer lugar con la estabilidad de la molécula de
52
Ensayos Biotecnológicos
ADN de doble hélice. Cuanto mayor es el
contenido en G+C de una molécula, mayor
cantidad de pares G-C presentará, como
consecuencia tendrá una mayor cantidad de
triples enlaces y, por consiguiente, será
necesario suministrar una mayor cantidad de
energía a esa doble hélice para separar sus dos
hebras (desnaturalización o fusión del ADN).
Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor
cantidad de calor hay que suministrar a un ADN
de doble hélice para desnaturalizarlo.
La temperatura de fusión (Tm) necesaria para
desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla
(punto medio de la reacción ADN doble hélice
→ ADN hélice sencilla) esta directamente
relacionada con el contenido en G+C.
A mayor contenido en G+C mayor temperatura
de fusión (Tm).
Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede
utilizar como una medida del estado físico de la
molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen
forma de S observándose un aumento brusco de
la absorbancia al llegar a una temperatura
determinada, la temperatura de fusión.
Relación entre el contenido en (G+C) y Tm
La purina y pirimidina absorben radiación
ultravioleta es por ello que los nucleótidos y
ácidos nucleicos la absorben también. Esto tiene
varias
aplicaciones:
1) En los métodos de laboratorio para detección
y cuantificación de ácidos nucleicos y sus
componentes
2) Observación de muestras biológicas por
microscopia
3) El efecto mutágeno de la radiación
ultravioleta
4) La esterilización con rayos UV
Curvas de desnaturalización de diferentes
ADNs
82. ABSORBANCIA A 260 nm.
El estado físico de los ácidos nucleicos está
relacionado con su capacidad de absorción de la
luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado
de absorción se produce en estado de doble
hélice, la absorción aumenta cuando se produce
la desnaturalización pasando a estado de hélice
sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la
absorbancia) y, por último, si degradamos este
ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos
libres, de nuevo aumenta la absorbancia.
Salvador Camacho Garrido
83. CINÉTICA DE
RENATURALIZACIÓN: CURVAS
CoT.
La velocidad de renaturalización del ADN de un
organismo está relacionada con su complejidad.
La complejidad se define como la suma del
número de nucleotidos que tiene cada tipo de
secuencia sin tener en cuenta el número de veces
que está repetida.
El ADN de los virus y las bacterias en su
mayoría sólo tiene secuencias que están una sola
vez en el genoma (secuencias únicas). Sin
embargo, los organismos más complejos, como
los eucariontes, presentan distintos tipos de
53
Ensayos Biotecnológicos
secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen
secuencias únicas (SU), secuencias de bajo
número de copias (SBNC, 2-10 copias),
secuencias repetidas (SR, alrededor de 102
copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106
copias).
Tipo de
Secuencia
Nº de
repeticiones
Nº de
nucleótidos
A (SU)
1
5.700
B (SU)
1
7.530
C (SBNC)
4
3.720
D (SBNC)
6
4.350
E (SR)
200
500
F (SAR)
10.000
300
G (SAR)
1.000.000
200
Complejidad
22.300
Si imaginamos un organismo eucarionte con los
tipos de secuencias indicados en la tabla
anterior, su complejidad sería la suma del
número de nucleótidos de cada tipo de secuencia
(22.300) sin tener en cuenta el número de veces
que está repetida cada una de ellas.
No es difícil imaginar que la velocidad de
renaturalización del ADN (paso de dos hélices
sencillas a una doble hélice) esté relacionada con
el número de veces que está repetida una
determinada secuencia.
Supongamos que tenemos dos organismos
hipotéticos distintos, ambos con la misma
cantidad de ADN (1.000.000 de pares de
nucleótidos). El organismo A posee 1.000
secuencias únicas diferentes, cada una con una
longitud media de 1.000
nucleótidos. El
organismo B tiene una secuencia de 100
nucleótidos de longitud que está repetida 10.000
veces. Si extraemos el ADN de estos dos
organismos por separado, lo desnaturalizamos y
las piezas de ADN desnaturalizado de cada
organismo se ponen en condiciones de
renaturalización -tamaño uniforme de los
fragmentos de ADN (entre 250 y 450 pb),
temperatura, condiciones iónicas, etc.- es
evidente que el ADN del organismo B
renaturalizará mucho antes (más rápidamente)
que el del organismo A, ya que es mucho más
probable que la secuencia que está repetida
10.000 veces encuentre otra complementaria en
el medio de reacción para formar la doble hélice.
Las curvas de renaturalización o curvas CoT, de
organismos que carecen de secuencias repetidas
como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen
un sólo punto de inflexión o punto medio de la
Salvador Camacho Garrido
reacción. Todas las secuencias son únicas y
tienen la misma probabilidad de encontrar a su
complementaria para formar la doble hélice.
Las curvas CoT de organismos eucariontes con
diferentes tipos de secuencias, poseen varios
puntos de inflexión. Cada uno de ellos
correspondiente a un tipo de secuencias (únicas,
moderadamente
repetidas,
y
altamente
repetidas).
Como en el caso de las curvas de fusión,
también se utiliza como medida el punto medio
de la reacción de renaturalización, es decir, el
CoT ½ o tiempo al que se ha reasociado la mitad
del ADN. El CoT ½ es directamente
proporcional a la complejidad del ADN del
organismo. Valores de CoT ½ bajos (10-4 a 10-1)
corresponden a secuencias altamente repetidas,
valores de CoT ½ comprendidos entre 10 y 102
corresponden a secuencias moderadamente
repetidas y las secuencias únicas o de bajo
número de copias dan lugar a valores de CoT ½
altos (mayores de 103).
84. HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS.
La molécula de ADN es capaz de adquirir una
estabilidad aún mayor gracias a los enlaces de
hidrógeno que se forman entre grupos de bases
contrapuestas. Estos enlaces de hidrógeno sólo
se forman cuando dos hebras de ADN se sitúan
en posiciones antiparalelas, es decir una cadena
en dirección 5’ 3’ y la otra 3’ 5’. Esta
54
Ensayos Biotecnológicos
interacción mantiene la estructura del ADN
siempre como una doble hélice.
El acoplamiento entre bases de cadenas
antiparalelas es lo que se denomina
apareamiento o hibridación.
Las técnicas de desnaturalización y posterior
renaturalización se utilizan para conseguir la
hibridación de ácidos nucleicos, es decir, una
vez separadas las dos hebras del ADN doble
hélice, es posible volver a formar una doble
hélice con una hebra de ADN que sea
complementaria (hibridación de ADN con ADN)
o volver a formar una doble hélice con un
segmento de ARN que contenga la secuencia
complementaria (hibridación de ADN con
ARN).
El ADN de doble cadena está siempre hibridado
en condiciones normales. El ARN por el
contrario está compuesto por una única cadena y
sólo presentará zonas de hibridación allí donde
existan secuencias de ARN correspondientes a
secuencias complementarias que puedan
enfrentarse en sentido antiparalelo.
Las técnicas de hibridación (desnaturalización y
posterior renaturalización) permiten, por
ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a
un determinado ARN-mensajero. Si se aísla un
mensajero determinado en una célula, es posible
hibridar este ARNm con el ADN de la célula
previamente fragmentado mediante el uso de
enzimas de restricción.
Los principales factores que afectan a la
hibridación de los ácido nucleicos son:
1. Temperatura: En el caso del ADN la
temperatura de fusión (Tm, o
temperatura en la cual la hibridación
está en equilibrio con la desnaturalizada,
es decir, al 50 %) se sitúa entre 80-95
ºC, por tanto el polímero AT estará por
debajo al estar por encima el CG.
2. Fuerza iónica: La concentración salina
del medio estabiliza la estructura en un
rango pero si esta aumenta en exceso se
consigue la desestabilización, mediante
la formación de enlaces de hidrógeno
entre los grupos cargados y el agua. Lo
mismo vale decir para cualquier agente
químico que debilite la interacción entre
pares de bases complementarias.
3. pH: La presencia de medios ácidos o
básicos que protonan/desprotonan los
grupos amino de A, G, y T, hace que
desaparezcan los enlaces de hidrógeno y
por tanto desaparece la estabilidad entre
cadenas.
4. Secuencia: El más importante de los
cuales es la proporción de G+C (en
Salvador Camacho Garrido
organismos superiores nunca llega al 50
% siendo en los humanos del 40 %),
pero que también intervienen, la
longitud, la homología de la secuencia y
la presencia de mutaciones puntuales.
85. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Las enzimas de restricción son endonucleasas
que reconocen una secuencia entre 4-8 pares de
bases en el ADN. El sitio de reconocimiento se
llama sitio de restricción, y la enzima rompe un
enlace fosfodiéster en una hebra y otro enlace
fosfodiéster en la hebra complementaria.
Estas enzimas se encuentran en muchas especies
bacterianas donde funcionan in vivo como parte
de un sistema de restricción y modificación
(sistema R/M). Este sistema es análogo a un
sistema inmune, y le permite distinguir a la
bacteria entre su propio ADN y el ADN
exógeno, siendo este último degradado por la
enzima de restricción. El ADN propio no es
reconocido por sus enzimas de restricción,
puesto que previamente lo ha modificado por
metilación a través de la acción de una
metiltransferasa (enzima que transfiere grupos
metilo desde S-adenosilmetionina a bases
específicas). Existen tres tipos:
• Sistemas tipo I
Una sola enzima (trimérica, posee 3
subunidades) reconoce la secuencia específica
de ADN, metila y restringe. Pero la restricción
no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que
es al azar y en sitios distantes al de
reconocimiento.
• Sistemas tipo II
Enzimas diferentes realizan la restricción y
modificación. La restricción ocurre en el sitio de
reconocimiento o adyacente. Estas enzimas tipo
II son las utilizadas en la clonación genética,
puesto que permiten romper el ADN en sitios
específicos, y así recuperar secuencias
conocidas.
• Sistemas tipo III
Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima
oligomérica que realiza todas las actividades
enzimáticas, y rompen el ADN 25-27 pares de
bases más allá del sitio de reconocimiento.
Las endonucleasas de restricción de tipo II son
enzimas que reconocen secuencias cortas de
ADN de tipo palindrómico y cortan por el
interior de la secuencia diana a la misma altura
en las dos hélices de ADN (corte simétrico) o a
distinto nivel en cada hélice (corte asimétrico).
Dichas endonucleasas de restricción fueron
descubiertas por Werner Arber, Hamilton O.
Smith y Daniel Nathans en la bacteria E.coli,
trabajos por los que recibieron el premio Nobel.
55
Ensayos Biotecnológicos
Estas enzimas forman parte del sistema de
defensa R-S (Sistema de ModificaciónRestricción) de las bacterias frente a la entrada
de ADN exógeno en su interior.
Las enzimas tipo II, dependiendo de su
especificidad, al romper el ADN provocan 2
tipos de cortes:
1. Cortes escalonados, dejando productos con
extremos complementarios (cohesivos). Ej.:
Eco RI
2. Cortes simétricos, dejando productos con
extremos ciegos Romos). Ej.: Alu I
Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos
(con extremos ciegos y con extremos
escalonados), en
Ingeniería Genética se
prefieren
aquellos
con
extremos
complementarios, puesto que permiten la unión
espontánea del gen a clonar con el vector. Si las
moléculas a utilizar presentan extremos ciegos,
hay que conferirles extremos cohesivos, por
ejemplo, utilizando la enzima transferasa
terminal.
Se han identificado más de 2.300 endonucleasas
de restricción tipo II. Se denominan
isoquizómeros a aquellas enzimas que han sido
obtenidas de diferentes especies de bacterias,
pero que reconocen la misma secuencia de
DNA.
Endonucleasa
de restricción
Bacteria de la que
procede
Secuencia que
reconoce (5'- 3') y
lugar de corte (↓)
Eco RI
Escherichia coli
5' G↓AATTC 3'
(asimétrico)
Eco RII
Escherichia coli
5' ↓CCTGG 3'
(asimétrico)
Hae III
Haemophilus
aegyptus
5' GG↓CC 3'
(simétrico)
86. OBTENCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
La obtención de los ácidos nucleicos incluyen
tanto los procesos de extracción como de
separación de los ácidos nucleicos.
El protocolo a utilizar va a depender primero del
tipo de ácido nucleico, de su matriz o
procedencia o incluso del uso al que se va a
destinar. Se utilizan:
• Precipitación salina
• Resinas (Chelex)
• Extracción/precipitación
• HotShot
• Agentes quelatantes
• Adsorción/cromatografía
• Separación Magnética
• Automatización
En general todos tienen casi las mismas fases:
1. Pulverizado
2. Adicción de buffer de extracción
3. Incubación con agitación
4. Centrifugación (desproteinización)
5. Recuperación del ácido nucleico
ADN en solución acuosa
El método general es la extracción con fenol que
desnaturaliza y solubiliza de forma eficaz las
proteínas que contaminan la muestra. Se emplea
a la vez cloroformo que estabiliza la interfase
agua-fenol y hace que no se retenga agua en la
fase orgánica, y alcohol isoamílico, que evita la
formación de espuma en la agitación y ayuda a
la separación de las fases.
El extracto fenólico se precipita con alcohol
(etanol o isopropanol) dando un ADN libre de
fenol y bastante puro. Se necesita la presencia de
iones monovalentes 0,1-0,5 M fácilmente
eliminables con etanol al 70 % donde el ADN se
mantiene insoluble.
ADN genómico
El principal problema que se plantea es proceder
a la ruptura del tejido rápidamente para evitar la
Salvador Camacho Garrido
56
Ensayos Biotecnológicos
actuación de las nucleasas endógenas que
degradan el material genético si no se inactivan.
A continuación se digieren las proteínas con una
proteasa y se elimina junto con los restos por
extracción orgánica.
Posteriormente se precipita el ADN con alcohol.
El método se basa en la extraordinaria actividad
catalítica de la proteinasa K y el uso de SDS
como desnaturalizante en el proceso de
digestión.
ADN cultivos bacterianos
En el caso de que proceda de cultivos
bacterianos el procedimiento consiste en la lisis
celular de un cultivo líquido, eliminando las
proteínas con proteinasa K y eliminando todos
los restos por tratamiento con bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTBA) en presencia de alta
concentración de sales, para recuperar el DNA
por precipitación con isopropanol.
ADN plasmídico
Hay que distinguir entre procedimientos a
pequeña escala y a gran escala.
• Procedimientos a pequeña escala:
Existen varios procedimientos basados en la
ruptura celular a la que se añaden detergentes o
se ponen en condiciones desnaturalizantes,
haciéndolo inestable en disolución y forzando su
precipitación. El ADN plamídico al ser pequeño
y circular no se llega a desnaturalizar totalmente
o se renaturaliza con la suficiente rapidez como
para quedar solubilizado y pueda separarse por
centrifugación.
Las preparaciones así obtenidas también pueden
llevar ARN.
• Lisis alcalina: Se basa en la lisis
bacteriana en una disolución que
contiene SDS y NaOH. Se equilibra con
acetato de potasio, lo que hace que
precipite el ADN cromosómico junto
con el SDS en forma de complejo de
potasio
que
se
elimina
por
centrifugación, para posteriormente
concentrar el ADN buscado por
precipitación con etanol.
• Método de hervido: Es más rápido
aunque más agresivo. Se basa en la
triple acción del calor, lisozimas (para
degradar la pared bacteriana) y el
detergente TritonX100. El calor y el
detergente hacen roturas en la pared
bacteriana de modo que escapa el ADN
y el ARN de bajo peso molecular, pero
no el grande o cromosómico que queda
adherido a la pared celular y que se
Salvador Camacho Garrido
precipita tras una breve centrifugación.
• Procedimientos a gran escala:
Básicamente son los mismos métodos que a
pequeña escala salvo que es necesaria la
purificación por centrifugación en gradientes de
cloruro de cesio o por cromatografía.
ARN
El ARN está localizado esencialmente en el
citoplasma y hay que extremar los cuidados para
obtener intacta su única y pequeña cadena. Por
otro lado las RNasas son enzimas muy activas
que no necesitan cofactores y por tanto difíciles
de inactivar.
La mejor manera de trabajar con ARN es
desnaturalizar la RNasas endógenas tan pronto
como sea posible, trabajar deprisa y no
introducir ninguna para lo que se recomienda:
1. Llevar guantes
2. Usar material de vidrio tratado a 300 ºC
durante 4 horas
3. Utilizar material de plástico reservado a
este fin
4. Tratar con
pirocarbonato de dietilo
(DEPC inhibidor inespecífico de RNasa)
las disoluciones necesarias
Como agente extractor se utiliza tiocianato de
guanidina y utilizando disoluciones ácidas, para
posteriormente precipitar con alcohol. Para
aumentar la riqueza puede repetirse el proceso
tantas veces como sea necesario.
ARN poliadenilado
En muchas ocasiones, el estudio de los genes
requiere de una mayor purificación entre los
distintos tipos de ARN, siendo necesaria la
separación del mARN (que en su mayoría está
poliadenilado en 3’) del resto que es el
mayoritario.
Se hace uso de la cola de poliA para que se una
por afinidad a una columna de polidT acoplado
a celulosa como soporte sólido, eluyendo
posteriormente por cambio en las condiciones
iónicas del medio de incubación.
Las cantidades empleadas normalmente son de 1
mL de oligodT-celulosa por cada 10 mg de ARN
de partida para obtener como resultado, en el
mejor de los casos, multiplicar por 10 la
concentración del ARN mensajero respecto del
total.
Material de
partida
Base de la
separación
Reactivos
específicos
Disoluciones
acuosas
Separación de fases
Precipitación
Fenol
Etanol,
57
Ensayos Biotecnológicos
ADN genómico
eucariotas
selectiva
Disgregación y
extracción
ADN genómico
procariota
Disgregación y
extracción
ADN plasmídico
(OH)
Desnaturalización
ADN plasmídico
(T)
Disgregación y
extracción
Eliminación ADN
Lisozima
TritonX100
Precipitación
selectiva
Tiocianato de
guanidina
Fenol ácido
Etanol,
isopropanol
ARN celular
ARN poliA+
Cromatografía de
afinidad
isopropanol
Proteinasa K
Fenol
Proteinasa K
Fenol
CTAB
NaOH
SDS
Oligo-dTcelulosa
87. PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
Todos los tipos de macromoléculas biológicas
tienen una característica en común que va a
permitir el desarrollo de un método de
separación específico para ellas. Estos métodos
deben ser completamente biocompatibles para
que puedan ser posteriormente útiles al
investigador y, al mismo tiempo, lo
suficientemente potentes para permitir el
aislamiento de la molécula deseada de entre un
mezcla compleja de múltiples componentes que
hacen las veces de “contaminantes” de nuestra
molécula en cuestión.
Los métodos más utilizados para la purificación
de los ácido nucleicos son:
• Centrifugación.
• Bolas magnéticas.
• Electroforesis.
• Cromatografía.
Centrifugación y
ultracentrifugación
En esta tecnología, la muestra se carga
directamente
sobre
la
membrana
de
ultrafiltración y mediante vacío o centrifugación,
se eliminan todos los contaminantes mientras
que la muestra con los ácidos nucleicos
permanecen retenidos en la superficie de la
membrana. Después de un paso de lavado
opcional, se recuperan los ácidos nucleicos
añadiendo agua o un tampón adecuado.
Salvador Camacho Garrido
Meselson y col. (1957) desarrollaron una técnica
de centrifugación en gradiente de densidad.
Cuando se centrifuga a alta velocidad un
solución densa (saturada) de un soluto de bajo
peso molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se
produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas,
la de difusión del soluto y la fuerza de
sedimentación; como consecuencia se produce
un gradiente de densidad que aumenta en la
dirección de la fuerza centrifuga (aumenta a
medida que avanzamos hacia el fondo del tubo
de centrifuga). Si añadimos al centrifugar una
molécula de ADN, está migrará hacia el fondo
del tubo hasta llegar al punto en que la densidad
del soluto de bajo peso molecular (la densidad
del ClCs) coincide con la densidad del ADN
centrifugado
(densidad
de
flotación).
Posteriormente, es posible aislar las moléculas
de ADN de diferente densidad practicando un
orificio en el fondo del tubo y sacando varias
fracciones diferentes. También es posible
pinchar el tubo con una jeringa, justo en la
posición de la banda y extraer el ADN contenido
de esa zona del tubo.
Bolas magnéticas
Con esta tecnología, los ácidos nucleicos se
unen selectivamente a bolas paramagnéticas en
presencia de sales caotrópicas mientras que el
resto de los contaminantes son eliminados de la
muestra. Los ácidos nucleicos purificados se
eluyen de la solución con las bolas
paramagnéticas bajo condiciones de baja
salinidad y están listos para ser usados en
posteriores aplicaciones.
• Paso 1
Lisis, mezcla y captura del ADN
• Paso 2
Lavados repetidos, recogida de partículas y
58
Ensayos Biotecnológicos
resuspensión
• Paso 3
Elución del ADN purificado, y directamente
aplicado a la PCR u otra técnica
88. ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
La electroforesis de ácidos nucleicos es el
método habitual para separar, identificar y
purificar moléculas o fragmentos de DNA y
RNA. En los tampones habitualmente utilizados,
los
ácidos
nucleicos
están
cargados
negativamente y migran hacia el ánodo. Cada
molécula aporta una carga negativa (procedente
del grupo fosfato), por lo que la relación q/m es
prácticamente constante e idéntica para todas las
moléculas, independientemente de su tamaño
(un nucleótido tendrá la misma movilidad que
un fragmento de doble cadena de 800pb o uno
de 5 kb).
La electroforesis de DNA se lleva a cabo en
geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos
soportes son restrictivos para los ácidos
nucleicos, de modo que los diferentes
fragmentos (al tener la misma relación
carga/tamaño), migran en función de su tamaño
y/o conformación (tabla II).
Salvador Camacho Garrido
•
•
Los geles de poliacrilamida (en
cubetas verticales) se emplean para
fragmentos pequeños de DNA (5500pb), así como para la mayoría de los
RNA.
Los geles de agarosa (en cubetas
horizontales) se utilizan para fragmentos
grandes de DNA (500 pb-10 Mb);
utilizando
agarosas
de
distintas
concentraciones (distinto grado de
reticulación)
pueden
separarse
fragmentos de hasta 50 kb aplicando un
campo eléctrico constante; para separar
fragmentos de tamaño superiores a 50kb
se utiliza la electroforesis de campo
pulsante en la que la dirección del
59
Ensayos Biotecnológicos
campo eléctrico cambia periódicamente.
Electroforesis en geles de agarosa
Se trata del método más común para el análisis,
purificación y obtención de DNA. Las agarosas
disponibles comercialmente presentan una
amplia gama de grados de pureza y
especificaciones. La presencia de polisacáridos
sulfatados, contaminantes en algunas agarosas,
puede ser perjudicial, ya que son inhibidores de
las enzimas con las que va a tratarse el DNA
purificado en la electroforesis (polimerasas,
ligasas, endonucleasas de restricción, etc.).
Un aspecto importante de las agarosas es su
estado físico. La agarosa estándar gelifica a
35°C y funde a 80-90°C, aunque las hay
modificadas por adición de grupos hidroxietilo,
que gelifican a menos de 30°C y funden a 65°C.
Estos datos son importantes, ya que finalizada la
electroforesis, el gel se puede licuar a
temperatura superior a la de fusión y así separar
el DNA en disolución.
También es importante tener en cuenta la
fragilidad del gel. Su resistencia mecánica se
expresa en gr/cm2, que representa el peso que
puede soportar 1 cm2 de un gel de agarosa al
1%. La agarosa estándar tiene una resistencia de
1000-2000 gr/cm2, las de bajo punto de fusión
alrededor de 200 gr/cm2 y las de alta resistencia
llegan hasta 6000 gr/cm2.
Hay agarosas de gran reticulado para fragmentos
de pequeño tamaño molecular; utilizadas a
concentraciones de 2,0-4,5% (y mantenidas a
4°C) que separan eficazmente fragmentos de
DNA de 700-3000 pb. Además, algunas son
transparentes lo que facilita enormemente el
proceso de detección.
Finalmente, indicar que en la agarosa, el flujo
electroendosmótico (EEO) va en contra de la
dirección de migración del DNA (hacia el
ánodo), lo que perjudica la resolución, por lo
que es muy aconsejable utilizar agarosas con
valores muy bajos de EEO.
En el modelo más habitual de cubeta horizontal,
la electroforesis se lleva a cabo de modo que el
tampón cubra totalmente el gel; con esta
disposición se disipa mejor el calor generado por
el paso de la corriente y se consigue un campo
eléctrico muy eficaz. Para conseguir el máximo
de resolución, suelen emplearse geles de 15-20
cm de largo y 3-4 mm de grosor.
La separación de fragmentos lineales de DNA de
doble cadena (dsDNA) se realiza a un pH
cercano a la neutralidad, pero para el DNA
monocatenario (ssDNA) se utiliza NaOH
(50mM).
La muestra de DNA se carga en los pocillos en
Salvador Camacho Garrido
una disolución (idealmente en el mismo tampón
de la electroforesis) a la que se le incrementa la
densidad con sacarosa (40% p/v), glicerol (30%
p/v) o ficoll (15% p/v), y se le añade uno o
varios marcadores, como, por ejemplo, azul de
bromofenol (0,25%; tiene una movilidad
electroforética semejante a un dsDNA de
300pb), xylene cianol FF (0,25%) o verde de
bromocresol (0,25%; para geles alcalinos).
El volumen de muestra que se puede cargar
depende de las dimensiones de los pocillos
practicados, del tamaño de los fragmentos de
DNA y de su diversidad, pero no suele
sobrepasar los 50 μL; cuanto mayor sea el
tamaño del DNA, menos cantidad puede
cargarse por pocillo. Para pocillos de tamaño
medio (0,5×0,5×0,15cm) pueden cargarse 500
ng-1μg de DNA de tamaño único; cuando
existen tamaños diferentes, la cantidad puede
incrementarse hasta 30-50 μg. La cantidad
mínima de DNA que puede cargarse depende del
límite del método de detección utilizado y así,
con bromuro de etidio (BrEt) cantidades
menores de 5 ng/pocillo son escasamente
visibles.
Para estimar el tamaño de los fragmentos de
DNA analizados, se incluye en el gel
(habitualmente en los pocillos de los extremos
del gel) un conjunto de patrones, fragmentos de
DNA de tamaños conocidos (fragmentos de
restricción de DNA virales o plasmídicos, como
pBR322, pAT153, fago λ).
Movilidad electroforética del ADN
El voltaje que se aplica en los geles de agarosa
depende de la resolución requerida y del tamaño
de los fragmentos a separar. Entre 1-10 V/cm
(los cm se refieren a la distancia entre los
electrodos), la movilidad electroforética de los
fragmentos lineales de dsDNA es proporcional
al voltaje aplicado; sin embargo, si se
incrementa el voltaje, los fragmentos grandes
cambian su movilidad electroforética, sin que
ésta guarde relación con su tamaño.
En general, la separación de fragmentos grandes
de DNA es mejor a bajos voltajes (aunque esto
60
Ensayos Biotecnológicos
incrementa el tiempo de electroforesis). Sin
embargo, elevados voltajes producen bandas
estrechas y bastante bien resueltas cuando se
trata de fragmentos pequeños.
Cuanto mayor es el fragmento de DNA, más se
retarda a lo largo del recorrido por el gel. Así,
los fragmentos se van ordenando hacia el ánodo
en relación a su tamaño. Por encima de 50 kb,
son tan largos que avanzan prácticamente con la
misma velocidad y no se separan.
Los extremos del fragmento de DNA tienen más
facilidad para moverse y cambiar de dirección
que la parte central, de modo que la estructura
lineal puede combarse, adoptando forma de
horquilla, por lo que puede “engancharse” en las
fibras del gel, dificultando su migración. Este
fenómeno es muy acusado en fragmentos de
tamaño intermedio, y es la causa del fenómeno
conocido como inversión de banda, por la cual
estructuras de tamaño intermedio migran más
lentamente que otras mayores. Este fenómeno es
más acusado a elevadas concentraciones de
agarosa y bajos voltajes.
Si se incrementa el voltaje para intentar acelerar
la separación, las estructuras pueden perder
flexibilidad, deformarse y estirarse en la
dirección del campo eléctrico adoptando forma
de varilla rígida, por lo que no se apreciarían
diferencias de tamaño y no habría separación.
Cuando se trata de estructuras circulares, la
movilidad electroforética aumenta con el grado
de enrollamiento, es decir, cuanto más
“retorcido” este el DNA circular, más compacto
es, atraviesa mejor el gel y tiene mayor
movilidad, por lo que avanza más. Las
estructuras circulares superenrrolladas de DNA
se mueven con una velocidad que depende del
grado de superenrrollamiento (Lk). Aquellas
moléculas con grado de superenrrollamiento
nulo se mueven más lentamente que las de
valores
mayores
de
grado
de
superenrrollamiento (positivo o negativo, es
decir, en un sentido o en otro), y estructuras
superenrrolladas con distinto grado de
superenrrollamiento e idéntico tamaño, pueden
ser separadas por electroforesis en geles de
agarosa.
En la figura se muestra la movilidad
electroforética de distintas formas de DNA
circular en relación a al de un fragmento lineal
del mismo tamaño.
Salvador Camacho Garrido
La temperatura no afecta a la movilidad
electroforética entre 4°C y 30°C, por ello la
electroforesis se lleva a cabo a temperatura
ambiente, salvo que se utilice agarosa de bajo
punto de fusión, en cuyo caso conviene realizar
la electroforesis a 4°C. A los voltajes habituales
a los que se realizan las electroforesis (1-10
V/cm), los pequeños aumentos de temperatura
debidos a la resistencia del gel no afectan al
DNA ni al gel.
Electroforesis bidimensional
También pueden realizarse electroforesis
bidimensionales en geles de agarosa. La muestra
se digiere con una endonucleasa de restricción y
los fragmentos se separan en una primera
dimensión. Posteriormente, los fragmentos se
tratan con una segunda endonucleasa de
restricción sobre el propio gel o sobre una
membrana de DEAE-celulosa (es lo más
habitual) y los subfragmentos obtenidos se
separan en la segunda dimensión, de modo
similar descrito anteriormente para proteínas.
Esta modalidad es habitual en estudios de
“mapeo” genético.
61
Ensayos Biotecnológicos
Electroforesis en condiciones
desnaturalizantes
Se lleva a cabo en modo sumegido como ya se
ha descrito. Se utiliza para la separación de
fragmentos de DNA monocatenario grandes
(1000-2000 nucleótidos) y especialmente para el
análisis de mRNA, que se transfiere
posteriormente a membranas para su detección
(Northern Blot). La transferencia e hibridación
son similares a las descritas para el DNA, pero
teniendo en cuenta que el mRNA es
monocatenario.
Para lograr una buena separación y para calcular
con fiabilidad los tamaños es necesario que las
moléculas
estén
completamente
desnaturalizadas, ya que la estructura secundaria
y terciaria de los ácidos nucleicos está
mantenida esencialmente por el apareamiento
(tanto intercatenario como intracatenario) de
bases complementarias; para asegurar esta
desnaturalización
se
utilizan
agentes
desnaturalizantes como la temperatura, el pH
básico y diversos agentes químicos dependiendo
del soporte y del ácido nucleico. No pueden
utilizarse agentes desnaturalizantes que rompan
los puentes de hidrógeno (urea, formamida) ya
que afectan también a la agarosa (sus fibras se
mantienen mediante puentes de hidrógeno).
89. ELECTROFORESIS EN CAMPO
PULSANTE.
Con las electroforesis descritas hasta ahora, se
pueden separar fragmentos de hasta 20 kpb, e
incluso hasta 50 kpb con geles de agarosa de
muy baja concentración. Schwartz y Cantor
desarrollaron en 1984 un sistema denominado
electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE)
con el que consiguieron separar cromosomas de
levadura de varios cientos de kpb. La PFGE
consigue la separación de grandes fragmentos de
DNA induciendo su reorientación mediante
cambios periódicos en el campo eléctrico, cuya
duración determina el intervalo de tamaños que
se pueden separar (cuanto mayor sea el tamaño
de los fragmentos a separar, mayor ha de ser la
duración de los campos aplicados).
En una PFGE los fragmentos se someten a dos
campos eléctricos de distinta orientación. Al
aplicarse el primero (E1) durante cierto tiempo,
los fragmentos se estiran y se orientan según la
dirección de dicho campo. Si ahora se aplica un
segundo campo (E2), perpendicular al anterior,
se obliga a los fragmentos de DNA a relajarse y
elongarse y alinearse de acuerdo con este
segundo campo eléctrico. Cuanto menos tarde
una molécula en reorientarse, antes migra en la
Salvador Camacho Garrido
dirección de E2; el tiempo que se consume en
esta reorientación depende del tamaño de los
fragmentos, tardando más los mayores.
Aplicando sucesivos cambios de campo eléctrico
(E1/E2/E1/E2/E1/E2, etc.) se consigue la
separación de los fragmentos en función de su
tamaño.
El ángulo α que forman las direcciones de los
campos eléctricos E1 y E2 se denomina ángulo
de reorientación, y determina lo que deben
“girar” los fragmentos de DNA cada vez que
cambia la orientación del campo. Normalmente
se utilizan ángulos >100°; cuando se opera a un
ángulo fijo, éste es de 120°, aunque si el
dispositivo permite seleccionar diferentes
ángulos, se trabaja entre 100° y 120°; esto es
particularmente útil para la separación de
fragmentos muy grandes de DNA (>2 Mb).
La duración de los campos eléctricos que se
alternan se denomina duración del pulso y
determina el intervalo de los tamaños de DNA
que se pueden separar; estos intervalos son muy
variables, desde fracciones de segundo para
fragmentos muy pequeños hasta 1-2 horas para
fragmentos muy grandes (>5 Mb). (Tabla III).
Para una duración de pulso dada, aquellos
fragmentos de gran tamaño que no hayan tenido
tiempo a reorientarse en la nueva dirección del
campo no se separan, pero no permanecen
inmóviles en el gel; se mueven muy lentamente,
pero juntos, sin resolverse en bandas distintas y
aparecen como una zona más o menos ancha en
la parte superior del gel; dicha zona se denomina
zona de compresión.
Es importante destacar que la utilidad de la
PFGE es análoga a la de la electroforesis
convencional, salvo que los fragmentos de DNA
separados son de mayor tamaño. Esto hace que
la transferencia a membranas no pueda hacerse
directamente, ya que para tamaños superiores a
las 20 kb los fragmentos se han de dividir en
otros menores mediante radiación UV o
tratamiento con ácido (HCl). También puede ser
utilizada para electroforesis bidimensionales,
cambiando las condiciones en cada dimensión;
esto permite el “mapeo” genético de grandes
regiones de DNA o de cromosomas enteros
pequeños.
62
Ensayos Biotecnológicos
El equipo necesario para realizar una PFGE se
diferencia
notablemente
del
de
otras
electroforesis, tanto en la cubeta como en la
fuente de alimentación. La cubeta tiene un
conjunto de electrodos en lugar de un par, cuya
disposición y diseño posibilitan las distintas
orientaciones del campo eléctrico; los electrodos
de platino son de mayor grosor que en el resto
de las electroforesis, ya que los cambios
periódicos de polaridad producen una marcada
corrosión de los mismos. La cubeta tiene,
además, un sistema de recirculación del tampón
a temperatura estrictamente controlada, de modo
que no se produzcan variaciones de temperatura
en el gel.
La preparación de los geles de agarosa no difiere
de los ya descrito para otras electroforesis de
DNA; se utilizan geles de agarosa al 0,5-1,0%
(20×20 ó 15×15 cm), de bajo flujo
electroendosmótico y elevada resistencia.
(Figura 26).
La preparación y aplicación de la muestra es la
fase más delicada de la PFGE por el gran
tamaño de las estructuras que se manejan, lo que
las hace fácilmente fragmentables. El DNA suele
cargarse en el gel como una disolución
concentrada (de mucha viscosidad), junto con
agarosa fundida o embebido en pequeños
bloques o tacos de agarosa sólida. (Figura 27).
La utilización de una u otra forma depende del
tamaño del DNA a analizar y de la naturaleza de
la muestra. Los fragmentos de 200-300 kb
pueden cargarse como disoluciones directamente
en el gel, pero para fragmentos mayores de 500
kb no se suele emplear el DNA aislado como tal
y sí las propias células que lo contiene.
90. CROMATOGRAFÍA DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
La cromatografía en columna ha demostrado ser
una herramienta muy útil ya que se dispone de
varios mecanismos de separación. La
modificación
de
las
diferentes
fases
estacionarias ya existentes, así como el
desarrollo de nuevas es la base principal para la
obtención de las condiciones necesarias para la
rápida y eficiente separación de biomoléculas en
general, y ADN y ARN en particular.
Cromatografía de penetrabilidad
El componente básico es una columna
empaquetada con una matriz en gel especial, que
son partículas de un polímero orgánico de
estructura tridimensional, que originan una red
de poros hidrofílicos equilibrados con un
tampón acuoso. La técnica consiste en que las
moléculas de gran tamaño no penetran por los
poros del polímero, por lo que migran mucho
más rápidamente que las de menor tamaño, que
sí son capaces de penetrar por los poros de la
matriz. Al principio del desarrollo de la técnica,
se realizaba a bajas presiones por lo que el rango
de aplicaciones estaba restringido debido a los
elevados tiempos de separación y su poca
resolución. En la actualidad se han desarrollado
Salvador Camacho Garrido
63
Ensayos Biotecnológicos
matrices de sílice estables a elevadas presiones
que se utilizan en columnas de alta presión, para
la separación de biomoléculas en función de su
forma y tamaño.
Cromatografía de intercambio
iónico
Es el método más utilizado para la separación de
ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el
intercambio reversible de los iones en solución
con
los
grupos
funcionales
unidos
covalentemente a una fase estacionaria insoluble
llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico
con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un
intercambiador iónico con grupos cargados
positivamente, pero eluirá de la columna al
cambiar al pH del tampón (tampón de elución)
ya que los iones del tampón de elución
interaccionan con los grupos cargados del ácido
nucleico o del intercambiador iónico,
Salvador Camacho Garrido
respectivamente; primero eluirán de la columna
las moléculas cargadas positivamente que no se
unen a la fase estacionaria y posteriormente, al
añadir el tampón de elución, eluirán las
moléculas con poca carga negativa neta y luego
las de mayor carga negativa neta.
Una modificación de este método es la
extracción en fase sólida, en la que se utiliza
una matriz intercambiadora de aniones
empaquetada en columnas de polipropileno. La
unión se produce bajo condiciones de baja
salinidad y durante los pasos de lavado y elución
se va incrementando la concentración de sales en
los tampones correspondientes. Las impurezas
se eliminan debido a su diferente capacidad de
unión y se obtienen una rápida y eficiente
purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o
RNA).
64
Ensayos Biotecnológicos
Cromatografía de adsorción
Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos
nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo
condiciones nativas, los ácidos nucleicos están
recubiertos de una capa hidratante de moléculas
de agua que mantienen la solubilidad del DNA
en soluciones acuosas. Con la adición de iones
caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye
esta ordenada estructura de moléculas de agua
de la capa hidratante, por lo que las sales
caotrópicas crean un entorno hidrofóbico
alrededor del DNA. Bajo estas condiciones
hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen
perfectamente a la membrana de sílice de las
columnas, mientras que las proteínas, los
metabolitos y otros contaminantes no se unen y,
por lo tanto, son eliminados de la muestra
durante los pasos de lavado. Posteriormente, los
ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de
sílice mediante tampones de elución con baja
concentración de sales (ligeramente alcalinos) o
simplemente agua, ya que permiten recuperar la
capa hidratante de los ácidos nucleicos,
liberándolos así de la membrana.
Con esta tecnología, no se produce ningún
efecto sobre las moléculas de los ácidos
nucleicos ya que la unión intramolecular de los
mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con
este rápido proceso de purificación mediante la
tecnología de la adsorción-desorción sobre
membranas de sílice, se obtiene ácidos nucleicos
altamente purificados y listos para usar en
procesos posteriores como PCR, RT-PCR,
QPCR, secuenciación, blotting, clonación, etc.
91. DETECCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
Como ya se ha comentado anteriormente, el
BrEt se utiliza para la tinción del DNA, lo que se
puede realizar antes (añadiendo el BrEt al propio
Salvador Camacho Garrido
gel durante su formación) o después
(sumergiendo el gel en una disolución con BrEt)
de la electroforesis. Es un agente intercalante, ya
que se intercala entre pares de bases contiguas
del DNA, aumentando la longitud de éste, lo que
reduce la movilidad electroforética del
fragmento considerado en un 15%. Esto se debe
a que al introducirse entre las bases, la doble
hélice de DNA se abre y queda menos girada,
con lo que aumenta su longitud y se hace menos
flexible. Este aumento de tamaño del DNA
tratado con BrEt debe tenerse en cuenta si la
electroforesis se hace en presencia de este
compuesto.
Hay dos maneras fundamentales para visualizar
DNA una vez finalizada la electroforesis:
mediante compuestos fluorescentes que se unen
específicamente a los ácidos nucleicos y con
tinción de plata (normalmente para geles de
poliacrilamida). Si el DNA esta radiactivamente
marcado (32P, 35S) se detecta por autorradiografía
y si lo esta con nucleótidos fluorescentes, las
bandas pueden incluso observarse según van
migrando por el gel.
La detección con BrEt es el método más habitual
para detectar DNA en los geles de agarosa; este
compuesto tiene un rendimiento cuántico
bastante bajo en medios acuosos (polares), pero
se incrementa notablemente cuando pasa a un
entorno hidrofóbico, lo que sucede cuando se
intercala en el DNA. Así, las bandas de DNA
pueden detectarse sumergiendo el gel en una
disolución acuosa de BrEt (0,5-1,0 μg/mL) e
iluminando con luz UV, la cual es absorbida por
la sonda y emitida a λ = 590
nm; puede utilizarse radiación de λ =254 nm,
que es absorbida por el DNA y transferida al
BrEt ó λ= 302 nm ó 366 nm que es absorbida
directamente por la sonda fluorescente.
Si se emplea radiación de 254 nm ó 302 nm, la
intensidad de fluorescencia es mayor que si se
utiliza 366 nm; pero, la de 254 nm produce más
roturas en el DNA que la de 302 nm, por lo que
es ésta última la λ empleada preferentemente.
Puesto que las bandas sólo son visibles mientras
se están iluminando, para tener los resultados de
forma permanente, es necesario fotografiar el gel
bajo iluminación. (Figura 23).
Para los geles habituales (10×6×0,5cm), 20-30
minutos son suficientes para que el BrEt los
impregne, aunque si la concentración de agarosa
es superior al 4 %, el tiempo debe aumentarse.
Con BrEt pueden detectarse bandas conteniendo
1-10 ng de DNA, aunque otros compuestos
fluorescentes (SYBR-Green, TOTO-1 y YOYO1) son capaces de detectar 50-60 pg/banda de
DNA ó RNA.
65
Ensayos Biotecnológicos
92. TRANSFERENCIA A
MEMBRANAS.
Las moléculas de DNA o RNA separadas en los
geles de agarosa pueden ser transferidas a
membranas de nitrocelulosa o de nylon.
La
transferencia
se
realiza
tras
la
desnaturalización del DNA o RNA. La unión a
la membrana ocurre a través del esqueleto
azúcar-fosfato de la molécula de DNA o RNA,
quedando libres y expuestas las bases
nitrogenadas.
Esto permite localizar e identificar secuencias
específicas en los fragmentos transferidos,
incubando la membrana con sondas específicas
radiactivas o de otra naturaleza, que hibridan
con la secuencia complementaria, revelando su
posición por autorradiografía de la membrana.
Salvador Camacho Garrido
De esta manera puede identificarse un fragmento
específico de DNA o RNA entre toda la
población de estructuras separadas por
electroforesis y transferidas a la membrana.
La sensibilidad del método es muy elevada y
pueden detectarse < 0.1 pg de DNA o RNA
usando una sonda marcada con 32P.
Por ejemplo, una secuencia única de 1.000 pb
presente en el genoma humano (1 parte en 3
millones) puede ser detectada por este método a
partir de 10 μg de DNA genómico.
Las membranas de nitrocelulosa dan mejor
resolución que las de nylon, pero éstas últimas
presentan varias ventajas por lo que su uso es
más extendido: tienen una mejor consistencia
(las de nitrocelulosa son bastante frágiles y
pueden desmenuzarse con la manipulación) y
poseen mayor capacidad de unión de DNA,
pudiendo ser utilizadas para hibridaciones
sucesivas; además, producen poca fluorescencia
de fondo (fluorescencia inespecífica) al ser
iluminadas con radiación UV, lo que es muy útil
para la detección de bandas de DNA.
La desnaturalización de los fragmentos de DNA,
previa a la transferencia, se realiza introduciendo
el gel en una disolución de NaOH que se
neutraliza posteriormente. Las cadenas de DNA
desnaturalizadas no deben ser muy largas para
que la transferencia sea efectiva y, así,
fragmentos mayores de 15-20 kb deben ser
fragmentados previamente con radiación UV o
tratamiento ácido.
La transferencia puede realizarse por
capilaridad,
por
electroforesis
(electrotransferencia), por centrifugación o por
succión (mediante una bomba de vacío), aunque
los dos últimos sistemas necesitan dispositivos
específicos, por lo que su uso es más restringido.
Normalmente, la electrotransferencia se utiliza
cuando la separación del DNA se ha realizado en
geles de poliacrilamida (dado que el reticulado
es más denso que el de la agarosa).
El tiempo de transferencia depende del grosor
del gel, del porcentaje de agarosa y del tamaño
de los fragmentos de DNA. Una vez en la
membrana, el DNA se fija a ella mediante
calentamiento a 80°C o iluminación con
radiación UV.
Al igual que en el Western Blot, las regiones de
la membrana no ocupadas por el DNA
transferido deben bloquearse, para evitar que al
añadir la sonda, ésta se una inespecíficamente a
la membrana y produzca un fondo en el
revelado. Para realizar este bloqueo, la
membrana se sumerge en una disolución que
contenga substancias de elevado peso molecular,
como ficoll (400 kDa), polivinilpirrolidona
66
Ensayos Biotecnológicos
(360kDa) o seroalbúmina bovina (66 kDa),
además de DNA heterólogo de diversos orígenes
(bacteriano, timo de ternera, esperma de salmón,
etc.).
La formación de las estructuras híbridas
(heterodúplex) entre la sonda y la secuencia
complementaria buscada es muy dependiente de
las condiciones experimentales (particularmente
de la temperatura); para realizarla se utilizan dos
sistemas: en el primero, la membrana se
introduce en una bolsa de plástico hermética que
contiene la disolución con la sonda,
controlándose la temperatura por inmersión en
un baño termostatizado; el segundo, utiliza
hornos de hibridación, introduciendo las
membranas en botellas que contienen la
disolución de la sonda.
Se pueden distinguir dos técnicas diferentes de
transferencia de los ácidos nucléicos en función
del mismo ADN y ARN: Southern Blot y
Nortern Blot.
Southern Blot
Northern Blot
93. SECUENCIACIÓN DE ADN.
El análisis más detallado de la estructura del
Salvador Camacho Garrido
ADN consiste en averiguar la secuencia de
nucleótidos. A lo largo del tiempo se han
desarrollado diferentes métodos para obtener la
secuencia de nucleótidos del ADN; sin embargo
actualmente los métodos más utilizados son el
de secuenciación automática y el método
enzimático de terminación de cadena de Sanger
también conocido por el método didesoxi.
Método enzimático de terminación
de cadena o método didesoxi de
Sanger
Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas
de un segmento de ADN por el método
enzimático de terminación de cadena, se
necesitan los siguientes compuestos:
• El ADN molde o segmento de ADN que
se desea secuenciar. Para poder
secuenciar un segmento de ADN,
previamente se necesita tener gran
cantidad de ese fragmento, y por tanto,
hay que clonarlo en un vector
apropiado. Además, debe estar en estado
de hélice sencilla.
• Un enzima que replique el ADN,
normalmente la ADN Polimerasa I del
bacteriofago T4. La ADN Polimersa I
del fago T4 emplea como molde ADN
de hélice sencilla y siguiendo las reglas
de complementaridad de las bases
nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a
partir de un cebador o "primer".
• Un cebador o "primer", que suele ser
un oligonucleótido corto de alrededor de
20 bases de longitud necesario para que
la ADN Polimerasa I comience a añadir
nucleótidos por el extremo 3' OH. Este
cebador debe poseer una secuencia de
bases complementaria a la del
fragmento de ADN que se desea
secuenciar. Debido a que la secuencia de
nucleótidos del segmento que se quiere
secuenciar es desconocida, se emplea un
"primer" con secuencia complementaria
al vector empleado para clonar el
fragmento de ADN; además, este
cebador procede de una región del
vector muy cercana al punto de
inserción del ADN problema cuya
secuencia se conoce. El "primer"
utilizado
suele
marcarse
radiactivamente.
• Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de
marcar radiactivamente el cebador, se
marca radiactivamente uno de los cuatro
67
Ensayos Biotecnológicos
•
nucleótidos trifosfato en cada reacción.
Por último, se necesitan nucleótidos
didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y
ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son
nucleótidos modificados que han
perdido el grupo hidroxilo de la posición
3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos
pueden incorporarse a la cadena de
ADN naciente, pero no es posible que se
una a ellos ningún otro nucleótido por el
extremo 3'. Por tanto, una vez
incorporado un nucleótido didesoxi se
termina la síntesis de la cadena de ADN.
En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos
diferentes, cuatro mezclas de reacción.
Cada mezcla de reacción contiene los cuatro
nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y
dGTP), ADN Polimerasa I, un cebador marcado
radiactivamente y un nucleótido dideoxi, por
ejemplo ddATP, a una concentración baja. El
nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este
ejemplo) competirá con su homólogo (dATP)
por incorporarse a la cadena de ADN que se está
sintetizando, produciendo la terminación de la
síntesis en el momento y lugar donde se
incorpora.
Por este sistema, en cada mezcla de reacción se
producen una serie de moléculas de ADN de
nueva síntesis de diferente longitud que
terminan todas en el mismo nucleótido y
marcadas todas radiactivamente por el extremo
5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador
utilizado).
Salvador Camacho Garrido
Los fragmentos de ADN de nueva síntesis
obtenidos en cada mezcla de reacción se separan
por tamaños mediante electroforesis en geles
verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de
espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm),
que permiten distinguir fragmentos de ADN que
se diferencian en un solo nucleótido.
Los productos de cada una de las cuatro mezclas
de reacción se insertan en cuatro calles o carriles
diferentes del gel.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se
pone en contacto con una película fotográfica de
autorradiografía.
La aparición de una banda en una posición
concreta de la autorradiografía en una de las
cuatro calles nos indica que en ese punto de la
secuencia del ADN de nueva síntesis
(complementario al ADN molde) está la base
correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado
en la mezcla de reacción correspondiente.
Teniendo en cuenta que el ADN de nueva
síntesis crece en la dirección 5'-3', si
comenzamos a leer el gel por los fragmentos de
menor tamaño (extremo 5') y avanzamos
aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia
3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva
síntesis en la dirección 5'-3'.
68
Ensayos Biotecnológicos
Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible
determinar el nucleótido existente en esa posición de la
secuencia.
Método automático de
secuenciación
La principal diferencia entre método enzimático
de terminación de cadena y el método
automático de secuenciación radica, en primer
lugar en el tipo de marcaje.
En el método automático en vez de radiactividad
se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar
cuatro mezclas de reacción, cada una con
nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un
fluorocromo distinto.
Este sistema permite automatizar el proceso de
manera que es posible leer al mismo tiempo los
ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro
mezclas de reacción.
La segunda diferencia radica en el sistema de
detección de los fragmentos de ADN.
La detección del tipo de fluorescencia
correspondiente a cada reacción se lleva a cabo
al mismo tiempo que la electroforesis, de
manera que los fragmentos de ADN de menor
tamaño que ya han sido detectados se dejan
escapar del gel, permitiendo este sistema
aumentar el número de nucleótidos que se
pueden determinar en cada electroforesis y, por
consiguiente, en cada etapa de la secuenciación.
Salvador Camacho Garrido
94. ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL.
Una vez demostrado que los ácidos nucleicos
eran los portadores de la información genética,
se realizaron muchos esfuerzos encaminados a
determinar su estructura con exactitud. Watson y
Crick (1953) fueron los primeros investigadores
en proponer una estructura para los ácidos
nucleicos y su labor investigadora se vio
recompensada con el Premio Nobel en 1962,
Premio Nobel que compartieron con M. H. F.
Wilkins y que se les concedió por sus
descubrimientos en relación con la estructura
molecular de los ácidos nucleicos y su
significación para la transmisión de la
información en la materia viva.
Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de
datos ya existentes.
Por un lado, utilizaron los datos obtenidos varios
años antes por Chargaff (1950), relativos a la
composición de bases nitrogenadas en el ADN
de diferentes organismos.
El otro tipo de datos eran los procedentes de
estudios de difracción de rayos X sobre fibras de
ADN.
Para
determinar
la
estructura
tridimensional o disposición espacial de las
moléculas de ADN, se hace incidir un haz de
rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la
difracción de los rayos sobre una película
fotográfica. La película se impresiona en
aquellos puntos donde inciden los rayos X,
69
Ensayos Biotecnológicos
produciendo al revelarse manchas. El ángulo de
difracción presentado por cada una de las
manchas en la película suministra información
sobre la posición en la molécula de ADN de
cada átomo o grupo de átomos.
•
Mediante esta técnica de difracción de rayos X
se obtuvieron los siguientes resultados:
• Las bases púricas y pirimidínicas se
encuentran unas sobre otras, apiladas a
lo largo del eje del polinucleótido a una
distancia de 3,4 Å. Las bases son
estructuras planas orientadas de forma
perpendicular al eje (Astbury, 1947).
• El diámetro del polinucleótido es de 20
Å y está enrollado helicoidalmente
alrededor de su eje. Cada 34 Å se
produce una vuelta completa de la
hélice.
• Existe
más
de
una
cadena
polinucleotídica
enrollada
helicoidalmente (Wilkins et al. 1953,
Frankling y Gosling, 1953).
•
•
•
•
hidrogeno producidos entre las bases
nitrogenadas de cada hélice. Siguiendo
los datos de Chargaff, la adenina de una
hélice aparea con la Timina de la hélice
complementaria mediante dos puentes
de hidrógeno. Igualmente, la Guanina de
una hélice se aparea con la Citosina de
la complementaria mediante tres puentes
de hidrógeno.
Las dos hélices por razones de
complementariedad de las bases
nitrogenadas son antiparalelas, teniendo
secuencias de átomos inversas. Una
hélice lleva la secuencia 5’P → 3’OH,
mientras que la hélice complementaria
sigue la secuencia de átomos 3’OH →
5’P.
El diámetro de la doble hélice es de 20
Å.
Las bases nitrogenadas son estructuras
planas perpendiculares al eje de la doble
hélice y están apiladas unas sobre otras
a una distancia de 3,4 Å. Cada 10 bases,
cada 34 Å se produce una vuelta
completa de la doble hélice (360º).
Las bases se encuentran en sus
configuraciones cetónicas, cumpliendo
así las reglas de apareamiento A-T y GC.
La secuencia de bases nitrogenadas
puede ser cualquiera, no existe ninguna
restricción.
Basándose en estos dos tipos de datos
Watson y Crick propusieron su modelo de
estructura para el ADN conocido con el nombre
de Modelo de la Doble Hélice.
Las características del Modelo de la Doble
Hélice son las siguientes:
• El ADN es una doble hélice enrollada
helicoidalmente “a derechas” (sentido
dextrorso). Algo parecido a dos muelles
entrelazados.
• El
enrollamiento
es
de
tipo
plectonémico: para separar las dos
hélices es necesario girarlas como si
fuera un sacacorchos.
• Cada hélice es una serie de nucleótidos
unidos por enlaces fosfodiéster en los
que un grupo fosfato forma un puente
entre grupos OH de dos azúcares
sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y
5’ del siguiente).
• Las dos hélices se mantienen unidas
mediante puentes o enlaces de
Salvador Camacho Garrido
Además, la estructura en doble hélice propuesta
por Watson y Crick sugería varías propiedades
70
Ensayos Biotecnológicos
importantes del material hereditario:
• Las reglas de complementaridad de las
bases nitrogenadas A-T y G-C sugieren
una forma sencilla de replicación del
material hereditario. Esta forma sencilla
de replicación se denomina Método
Semiconservativo. Cuando el ADN se
replica sus dos hélices se separan y cada
una de ellas sirve de molde para
sintetizar una nueva hélice siguiendo las
reglas de apareamiento de las bases
nitrogenadas.
• La mutación a nivel molecular
consistiría en un cambio en la secuencia
de bases nitrogenadas del ADN.
• Al no existir ninguna restricción en la
secuencia de bases nitrogenadas, el
ADN poseía la suficiente variabilidad
como para ser el material hereditario.
• Además, esta estructura sugería la
existencia de algún código que
permitiera pasar de la secuencia lineal
de bases nitrogenadas en el ADN a la
secuencia lineal de aminoácidos en las
proteínas.
95. ALTERNATIVAS AL MODELO DE
LA DOBLE HÉLICE.
El modelo de la Doble Hélice está basado en
estudios del ADN en disolución (hidratado). La
denominada forma B ó ADN-B tiene un mayor
interés biológico ya que es la que presenta el
ADN en interacción con las proteínas nucleares.
Además de la forma B, existen otras estructuras
posibles que puede presentar el ADN. Algunas
de estas alternativas son las siguientes:
• ADN-B: ADN en disolución, 92% de
humedad relativa, se encuentra en
soluciones con baja fuerza iónica se
corresponde con el modelo de la Doble
Hélice.
• ADN-A: ADN con 75% de humedad,
requiere Na, K o Cs como contraiones,
presenta 11 pares de bases por giro
completo y 23 Å de diámetro. Es
interesante por presentar una estructura
parecida a la de los híbridos ADN-ARN
y a las regiones de autoapareamiento
ARN-ARN.
• ADN-C: ADN con 66% de humedad, se
obtiene en presencia de iones Li,
muestra 9+1/3 de pares de bases por
giro completo y 19 Å de diámetro.
• ADN-Z: doble hélice sinestrorsa
(enrollamiento a izquierdas), 12 pares de
bases por giro completo, 18 Å de
Salvador Camacho Garrido
diámetro, se observa en segmentos de
ADN con secuencia alternante de bases
púricas y pirimidínicas (GCGCGC),
debido a la conformación alternante de
los residuos azúcar-fosfato sigue un
curso en zig-zag. Requiere una
concentración de cationes superior a la
del ADN-B, y teniendo en cuenta que
las proteínas que interaccionan con el
ADN tienen gran cantidad de residuos
básicos sería posible que algunas
convirtieran segmentos de ADN-B en
ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la
Guanina son más accesibles.
•
•
ADN con enrollamiento paranémico:
Las dos hélices se pueden separar por
traslación, cada hélice tiene segmentos
alternantes dextrorsos y sinestrorsos de
unas cinco bases.
Uno de los principales problemas del
modelo de la doble hélice (ADN-B) es
el enrollamiento plectonémico, para
separar las dos hélices es necesario
girarlas como un sacacorchos, siendo
necesario un gran aporte energético.
ADN triple hélice o ADN-H: "In vitro"
es posible obtener tramos de triple
hélice intercalando oligonucleótidos
71
Ensayos Biotecnológicos
cortos constituidos solamente por
pirimidinas (timinas y citosinas) en el
surco mayor de una doble hélice.
Este oligonucleótido se une a pares de
bases A-T y G-C mediante enlaces de
hidrógeno tipo Hoogsteen que se
establecen entre la T o la C del
oligonucleótido y los pares A-T y G-C
de la doble hélice. No se sabe la función
biológica del ADN-H aunque se ha
detectado en cromosomas eucarióticos.
•
ADN cuadruplexo: "In vitro" se han
obtenido cuartetos de Guanina (ADN
cuadruplexo) unidas mediante enlaces
tipo
Hoogsteen,
empleando
polinucleótidos que solamente contienen
Guanina (G). Los extremos de los
cromosomas eucarióticos (telómeros)
tienen una estructura especial con un
extremo 3' OH de cadena sencilla
(monocatenario) en el que se repite
muchas veces en tándem una secuencia
rica en Guaninas. Se piensa que el ADN
cuadruplexo telomérico serviría para
proteger los extremos cromosómicos de
la degradación enzimática. Ejemplo de
secuencia telomérica rica en guaninas
(G):
5´P TGGGTTGGGGTTGGGG......TTGGGG 3'OH
Salvador Camacho Garrido
Además, de las alternativas anteriormente
citadas es necesario tener en cuenta que no todos
los organismos vivos tienen como material
hereditario ADN de doble hélice, algunos virus
tienen ADN de hélice sencilla, ARN de una y de
doble hélice.
• Palíndromos:
plegamiento
o
apareamiento de una hélice consigo
misma. El palíndromo también es una
figura gramatical que se lee igual en los
dos sentidos, por ejemplo: DABALE
ARROZ A LA ZORRA EL ABAD.
Existe ADN palindrómico de hélice
sencilla y de hélice doble. En el
palíndromo de doble cadena la
secuencia de bases se lee igual en
dirección 5’P → 3’OH en ambas
cadenas.
•
Existen algunos virus cuyos ácidos
nucleicos son de una sola hélice: el
ADN de los fagos ΦX174 y M13 es
circular de hélice sencilla, sin embargo,
se ha comprobado que una pequeña
parte resiste la acción de enzimas que
72
Ensayos Biotecnológicos
digieren específicamente ADN de hélice
sencilla. Por tanto, estas regiones
resistentes
de
ADN
presentan
complementariedad
interna
o
autoapareamiento, formando ADN
duplex o doble hélice, teniendo
secuencias palindrómicas.
Una situación semejante se ha
observado en el ARN de hélice sencilla
del
bacteriofago
MS2
(3569
ribonucleotidos y tres genes). En este
caso, el gen de la proteína de la cubierta
del virus presenta segmentos que tienen
complementariedad
interna
(autoapareamiento) que se pliegan sobre
si
mismos
formando
horquillas
(regiones de ARN de doble hélice).
96. CUANTIFICACIÓN.
La cuantificación de los ácido nucleicos
ADN/ARN, se puede realizar por más de un
método:
• Espectrofotometría 260/280 nm
• Fluorescencia con bromuro de etidio
• Espectrofluorometría
• Método de Burton
• Tinción DABA y otros colorantes (V22,
etc.)
•
El ARN transferente (ARN-t) que
transporta los aminoácidos y el ARN
ribosómico (ARN-r) que intervienen en
el proceso de traducción, son ácidos
ribonucleicos de una sola hélice y
también presentan autoapareamiento.
Salvador Camacho Garrido
Espectrofotometría
El ADN, ARN, y los oligonucleótidos pueden
medirse espectrofotométricamente en soluciones
acuosas diluidas:
• Ácidos nucleicos a 260 nm
• Proteínas a 280 nm
• Factor de conversión: 1 unidad de
absorbancia (OD) es aproximadamente:
•50 μg/ml ó ng/μl de ADN de doble
cadena
•40 μg/ml ó ng/μl de ARN
•33 μg/ml ó ng/μl de ADN de hebra
sencilla
•30 μg/ml ó ng/μl de oligonucleótidos
• La pureza se estima utilizando la
relación A260/A280, y debe ser
aproximadamente 1,8 para ADN y 2
para ARN
• La razón A260/A230 de 2,2 puede
utilizarse
para
observar
la
contaminación
con
carbohidratos,
péptidos,
fenoles
o
compuestos
aromáticos.
73
Ensayos Biotecnológicos
Posteriormente se mide la absorbancia a 590700 nm (genneralmente a600 nm) utilizando una
curva patrón (curva de calibrado, como en casi
todos los métodos espectrofotométricos).
Se suele expresar en μg de ADN/mg de material.
Para el ARN se puede efectuar la coloración con
orcinol dando un color verde botella.
Asimismo, se han utilizado otros colorantes:
DABA, V22 ( a partir de taninos naturales), etc.
Fluorescencia
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente
intercalante usado comúnmente como marcador
de ácidos nucleicos en laboratorios de biología
molecular para procesos como la electroforesis
en gel de agarosa. Cuando se expone esta
sustancia a luz ultravioleta, emite una luz rojaanaranjada, que se intensifica unas 20 veces
después de haberse unido a una cadena de ADN.
Este efecto es debido al aumento de la
hidrofobia del medio, y no a la rigidificación del
anillo bencénico, no estando éste entre pares de
bases del ADN.
Como el bromuro de etidio se intercala en el
ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto
mutágeno y, posiblemente puede ser cancerígeno
y/o teratógeno.
Actualmente existen otros compuestos que
cumplen con la función del bromuro de etidio
pero que no tienen efecto mutagénico, como el
sybr safe (Invitrogen).
Método de Burton
El Método de Burton se basa en la reacción de
coloración de las pentosas del extracto de los
ácidos nucleicos con el reactivo de Dische
(difenilamina al 4 % en ácido acético).
Salvador Camacho Garrido
74
Ensayos Biotecnológicos
TEMA IV. EXPRESIÓN GÉNICA
97. CONCEPTO DE GEN.
En 1940, dos biólogos consiguieron relacionar la
acción de los genes con la producción de
enzimas o catalizadores biológicos. George
Beadle y Edward Tatum estaban haciendo crecer
en diferentes medios de cultivo a mutantes de
Neurospora, que es uno de los hongos que
contaminan al pan después de la cocción.
Después de diversas experiencias de hibridación
entre los diferentes cultivos, seguidos de ensayos
bioquímicos refinados, pudieron deducir la
siguiente correlación: La mutación de un gen
único era suficiente para provocar la ausencia de
una enzima dada en la célula.
El papel metabólico de los genes es el de
fabricar las enzimas. Cada gen es responsable de
la síntesis de una enzima. Casi siempre es una
proteína (a veces con nucleótidos).
Simplificando: ¡un gen, una enzima!
Hoy podemos afirmar que un gen es una
secuencia de ácido nucleico, normalmente ADN,
que contiene la información para producir un
polipéptido determinado (proteína).
Un gen, por tanto, es una entidad física estable,
aunque eventualmente puede sufrir algún
cambio (o mutación). Cuando esto ocurre, esta
se hereda también de forma estable.
El gen es considerado como la unidad de
almacenamiento de información y unidad de
herencia al transmitir esa información a la
descendencia. Los genes se disponen, pues, a lo
largo de cada uno de los cromosomas. Cada gen
ocupa en el cromosoma una posición
determinada llamada locus. El conjunto de
cromosomas de una especie se denomina
genoma.
Tipos de genes
Los genes pueden aparecer en versiones
diferentes, con variaciones pequeñas en su
secuencia, y entonces se les denomina alelos
("otro", en griego). Los alelos pueden ser
dominantes o recesivos. Cuando una sola copia
del alelo hace que se manifieste el rasgo
fenotípico, el alelo es dominante. Cuando son
precisas dos copias del alelo (una en cada
cromosoma del par), el alelo es recesivo.
Un gen también puede considerarse como una
secuencia o segmento de ADN necesario para la
síntesis de ARN funcional, como el ARN de
transferencia o el ARN ribosomal. Sin embargo,
estos dos tipos de ARN no codifican proteínas,
puesto que lo hace el ARN mensajero.
Salvador Camacho Garrido
Para ello, la transcripción genera una molécula
de ARN que posteriormente sufrirá traducción
en los ribosomas, proceso por el cual se genera
una proteína.
Muchos genes se encuentran constituidos por
regiones codificantes (exones) interrumpidas por
regiones no codificantes (intrones) que son
eliminadas en el procesamiento del ARN. En
células procariontes esto no ocurre pues los
genes de procariotas carecen de intrones.
La secuencia de bases presente en el ARN
determina la secuencia de aminoácidos de la
proteína por medio del código genético.
Otros genes no son traducidos a proteína, sino
que cumplen su función en forma de ARN. Entre
éstos, encontramos genes de ARN transferente,
ARN ribosómico, ribozimas y otros ARN
pequeños de funciones diversas.
Algunos genes han sufrido procesos de mutación
u otros fenómenos de reorganización y han
dejado de ser funcionales, pero persisten en los
genomas de los seres vivos. Al dejar de tener
función, se denominan pseudogenes, y pueden
ser muy parecidos a otros genes del mismo
organismo que sean funcionales.
Número de genes
Organismo
Priones
Viroides
Virus ARN
Virus ADN
Mycoplasma
Bacteria
Hongo
Mosca
Humanos
Plantas
Nº de genes
0
0-1
1- 25
10 - 300
500
500 - 6000
6000
12000
35000
< 50000
Nº pares bases
0
~ 500
1000 - 23000
25000 - 800000
580000
5·105 - 107
1,3·107
1,6·108
3·109
< 1011
98. CROMOSOMAS.
El ADN desnudo y estirado mediría tanto como
2 metros, por lo tanto debe compactarse.
Por otra parte el compactamiento no es azaroso
aunque si es variable de forma tal de poder
regular la expresión de los genes.
Cuando los factores de transcripción y proteínas
transreguladoras no pueden acceder al ADN, por
estar fuertemente compactado, no puede
realizarse la trasncripción.
Así en algunos tejidos donde la expresión de un
gen no es necesaria, su región regulatoria estará
asociada a histonas y otras proteínas.
Además el empaquetamiento del ADN es
75
Ensayos Biotecnológicos
necesario para comenzar la división de las
células, ya que cuando alcanza su máximo grado
de empaquetamiento se convierte en lo que
conocemos bajo el microscopio como
cromosomas.
Los cromosomas son el mayor grado de
empaquetamiento que alcanza las moléculas de
ADN.
Cada especie tiene un número determinado de
cromosomas y de cierta forma propia de su
especie. Así por ejemplo todos los perros poseen
78 cromosomas y además son todos de la misma
morfología.
Los cromosomas tienen diversas partes que se
muestran en el esquema:
cromosomas ya que cada uno tiene un patrón de
bandas propio de ese cromosoma en cada una de
las especies diferentes.
Luego de obtenida la foto, se amplía y recorta
cada uno de los cromosomas y se los ordena de
mayor
a
menor
tamaño
dentro
de
cada morfología.
99. EL CÓDIGO GENÉTICO.
El código genético viene a ser como un
diccionario que establece una equivalencia entre
las bases nitrogenadas del ARN y el leguaje de
las proteínas, establecido por los aminoácidos.
Después de muchos estudios (1955 Severo
Ochoa y Grumberg; 1961 M. Nirenberg y H.
Mattaei) se comprobó que a cada aminoácido le
corresponden tres bases nitrogenadas o tripletes
(codones).
43= 64 tripletes (61 tripletes
codifican aminoácidos y tres tripletes carecen de
sentido e indican terminación de mensaje).
(1) Cromátida, cada una de las partes idénticas de
un cromosoma luego de la duplicación del ADN.
(2) Centrómero, el lugar del cromosoma en el cual
ambas cromátidas se tocan. (3) Brazo corto. (4)
Brazo largo.
El análisis de los cromosomas de un individuo
se realiza mediante una técnica denominada
CARIOTIPO que se base en obtener una foto de
los cromosomas en la metafase de la división
celular (mitosis), en dónde alcanza mayor estado
de compactación.
Generalmente luego se realiza el bandeo
cromosómico para ayudar a identificar a los
Salvador Camacho Garrido
El código genético
características:
tiene
una
serie
de
76
Ensayos Biotecnológicos
•
•
•
•
•
•
Es universal, pues lo utilizan casi todos
los seres vivos conocidos. Solo existen
algunas excepciones en unos pocos
tripletes en bacterias.
No es ambiguo, pues cada triplete tiene
su propio significado
Todos los tripletes tienen sentido, bien
codifican un aminoácido o bien indican
terminación de lectura.
Está degenerado, pues hay varios
tripletes para un mismo aminoácido, es
decir hay codones sinónimos.
Carece de solapamiento, es decir los
tripletes
no
comparten
bases
nitrogenadas.
Es unidireccional, pues los tripletes se
leen en el sentido 5´→3´.
100.
LA INFORMACIÓN
GENÉTICA.
La información contenida en la secuencia de
nucleótidos del ADN podía generar proteínas;
sin embargo el ADN está en el núcleo y las
proteínas se sintetizan en los ribosomas, los
cuales están situados en el citoplasma. El
intermediario resultó ser un ARNm.
Las etapas del proceso son:
Algunos virus, los ARNvirus se diferencian de
Salvador Camacho Garrido
los virus convencionales en que, en lugar de
contener la envoltura de proteínas una cadena de
ADN, contiene una cadena de ARN. Alguno de
ellos se replican de manera inusual a través de
una forma intermedia de ADN bicatenario. Este
proceso se lleva a cabo mediante una enzima: la
retrotranscriptasa o transcriptasa inversa, que
dirige la síntesis de ADN a través de ARN y
posee una importancia extraordinaria en la
manipulación genética. Una vez se ha pasado de
ARN monocatenario a ADN se inserta dentro del
ADN propio de la célula infectada donde se
comporta como un gen más
101.
DUPLICACIÓN DE ADN.
La vida de los seres vivos es muy variable y, por
tanto, para que esta no se extinga, ha de haber un
momento en se reproduzcan, lo cual lleva
implícito la formación de copias del ADN del
progenitor o progenitores.
Se dieron muchas hipótesis sobre como se
duplicaba el ADN hasta que Watson y Crick
propusieron la hipótesis semiconservativa
(posteriormente demostrada por Meselson Y
Stahl en 1957), según la cual, las nuevas
moléculas de ADN formadas a partir de otra
antigua, tienen una hebra antigua y otra nueva.
Según Watson y Crick, el mecanismo de copia
de los genes, o replicación del DNA se muestra
a sí mismo al verificar la estructura en doble
hélice con dos hebras débilmente ligadas. Hay
una hebra o cadena MOLDE que contiene la
información heredable y sirve de cuño (positiva)
y hay una segunda hebra CODIFICADORA
(negativa) que sirve para volver a fabricar una
nueva hebra positiva con la información real.
Las procesa siempre de 5' → 3'.
Cuando el sistema recibe señales de que hay
77
Ensayos Biotecnológicos
suficientes reservas alimenticias, se dispara el
mecanismo de replicación del DNA. Las dos
hebras se separan por acción enzimática de
desconstrucción de los puentes de hidrógeno que
los ligan. A partir de cada una de las dos hebras
se reconstruyen nuevas dobles hélices, la hebra
primer construye una nueva codificadora y la
vieja codificadora construye una nueva primer.
En los dos casos se avanza de 5' → 3', es decir,
en una doble hélice el proceso va a contramano
de la otra.
De una doble hélice original tenemos al final del
proceso dos dobles hélices iguales (salvo algún
error esporádico). Esos errores se pueden
considerar mutantes, aunque muchos son
“mudos”, o sin incidencia en la construcción de
la enzima o, en general, de la proteína asociada.
102.
DUPLICACIÓN EN
PROCARIONTES.
Hay que recordar que es ADN circular y ocurre
en tres etapas:
• 1ª
etapa:
Desenrrollamiento
y
apertura de la doble hélice en el punto
ori-c.
Intervienen un grupo de enzimas y
proteínas, a cuyo conjunto se denomina
replisoma.
o Intervienen las helicasas que
facilitan en desenrrollamiento.
o Actúan las girasas y topoisomerasas
que eliminan la tensión generada por
Salvador Camacho Garrido
o
la torsión en el desenrrollamiento.
Actúan las proteínas SSBP que se
unen a las hebras molde para que no
vuelva a enrollarse.
•
2ª etapa: Síntesis de dos nuevas
hebras de ADN.
Actúan las ADN polimerasas para sintetizar las
nuevas hebras en sentido 5´-3´, ya que la lectura
se hace en el sentido 3´-5´.
o Intervienen las ADN polimeras I y
III, que se encargan de la replicación
y corrección de errores. La que lleva
la mayor parte del trabajo es la ADN
polimerasa III.
o Actúa la ADN polimerasa II,
corrigiendo daños causados por
agentes físicos.
o La cadena 3´-5´ es leída por la ADN
polimerasa III sin ningún tipo de
problemas (cadena conductora). La
cadena 5´-3´ no puede ser leída
directamente, esto se soluciona
leyendo
pequeños
fragmentos
(fragmentos de Okazaki) que crecen
en el sentido 5´-3´ y que más tarde
78
Ensayos Biotecnológicos
se unen. Esta es la hebra retardada,
llamada de esta forma porque su
síntesis es más lenta.
o La ADN polimerasa III es incapaz
de iniciar la síntesis por sí sola, para
esto necesita un cebador (ARN) que
es sintetizado por una ARN
polimerasa (primasa). Este cebador
es eliminado posteriormente.
3ª etapa: Corrección de errores.
El enzima principal que actúa es la ADN
polimerasa III, que corrige todos los errores
cometidos en la replicación o duplicación.
Intervienen otros enzimas como:
o Endonucleasas que cortan el
segmento erróneo.
o ADN polimerasas I que rellenan
correctamente el hueco.
o ADN ligasas que unen los extremos
corregidos.
103.
DUPLICACIÓN EN
EUCARIONTES.
Es similar a la de los procariontes, es decir,
semiconservativa y bidireccional. Existe una
hebra conductora y una hebra retardada con
fragmentos de Okazaki. Se inicia en la burbujas
de replicación (puede haber unas 100 a la vez).
Intervienen enzimas similares a los que actúan
en las células procariontes y otros enzimas que
han de duplicar las histonas que forman parte de
Salvador Camacho Garrido
los nucleosomas. Los nucleosomas
permanecen en la hebra conductora.
viejos
104.
TRANSCRIPCIÓN EN
PROCARIONTES.
La transcripción es el proceso por el cual se
sintetiza un ARN usando como molde el ADN.
En ella podemos distinguir las siguientes fases:
• Iniciación:
La ARN polimerasa se une a un cofactor que
permite su unión a una región del ADN
llamada promotor, la cual posee una
secuencia TATAAT ó TTGACA.
• Elongación:
La ARN polimerasa recorre la hebra de
ADN hacia su extremo 5´ sintetizando una
hebra de ARNm en dirección 5´-3´
• Finalización:
Presenta dos variantes. En una interviene un
cofactor "p" y en otra no interviene dicho
cofactor. El proceso finaliza al llegar a una
secuencia rica en G y C (zona llamada
operador). El ADN vuelve a su forma
normal y el ARNm queda libre.
• Maduración:
Si lo que se forma es un ARNm no hay
maduración, pero si se trata de un ARNt o
ARNr hay procesos de corte y empalme.
79
Ensayos Biotecnológicos
105.
TRANSCRIPCIÓN EN
EUCARIONTES.
Hay que tener en cuenta:
1. Existen tres tipos de ARN polimerasa: I,
II y III.
2. Los genes están fragmentados en zonas
sin sentido o intrones y zonas con
sentido o exones.
3. Antes ha de madurar y eliminar los
intrones. El proceso en el cual se
eliminan los intrones y empalman los
exones se denomina SPLICING.
4. Desempaquetamiento de las histonas.
En la trascripción de eucariontes se distinguen
las siguientes fases:
• Iniciación:
La ARN polimerasa II se une a una zona
del ADN llamada promotor (posee
secuencias CAAT y TATA).
• Elongación:
La síntesis continúa en sentido 5´-3´. Al
poco se añade una “caperuza” (metilguanosín trifosfato) al extremo 5´.
• Finalización:
Parece que está relacionado con la
secuencia TTATTT. Ahora interviene un
poli-A polimerasa que añade una cola de
poli-A al pre-ARNm (ARNhn).
• Maduración:
Se produce en el núcleo y la hace un
enzima llamada RNPpn, que elimina los
nuevos intrones (I) formados.
Posteriormente las ARN ligasas empalman los
exones (E) y forman el ARNm.
Salvador Camacho Garrido
106.
TRADUCCIÓN.
Tiene lugar en los ribosomas, de una forma muy
similar en procariontes y eucariontes.
Comprende las siguientes etapas:
a) Iniciación:
Comienza por el triplete iniciador del ARNm
(AUG), que está próximo a la “caperuza” 5'.
Este triplete va precedido de la secuencia
AGGAGG (secuencia de Shine-Dalgarno) que
es la zona de unión con el ribosoma.
Se forma el complejo de iniciación con los
factores de iniciación (FI) y la energía
suministrada por el GTP, la subunidad menor del
ribosoma reconoce la “caperuza” y se une al
ARNm en la zona próxima al triplete o codón
iniciador. Esta “caperuza” aporta el ARNt
80
Ensayos Biotecnológicos
iniciador que a su vez aporta el aminoácido
metionina. Este ARNt contiene un triplete
complementario al AUG, es decir el UAC,
llamado anticodón (la proteína sintetizada
contiene en su extremo el aminoácido
metionina).
Una vez encajado el ARNt-metionina, se liberan
los FI y dejan paso a la subunidad mayor del
ribosoma, formándose así el ribosoma completo
y funcional.
En él hay dos sitios claves:
- Sitio P
(sitio peptidil) ocupado por el ARNtmetionina
- Sitio A
(sitio aminoacil) que está libre para recibir
un segundo ARNt (sólo el que su anticodón
coincida con el del codón del ARNm)
cargado con un nuevo aminoácido.
c) Fin de la síntesis de la cadena
peptídica:
Ocurre cuando aparece uno de los codones de
terminación (UAA, UAG,, UGA).
En este momento un factor proteico de
terminación (RF) se une al codón de terminación
e impide que algún ARNt con otro aminoácido
(ARNt-aminoacil) se aloje en el sitio A.
En este momento se produce la hidrólisis de la
cadena peptídica y se separan las dos
subunidades del ribosoma.
b) Elongación de la cadena peptídica:
Es un proceso catalizado por el enzima peptidil
transferasa, el cual, mediante enlaces peptídicos
va uniendo aminoácidos a la cadena peptídica.
Cada vez que llega un aminoácido ocurre un
proceso cíclico de elongación.
Salvador Camacho Garrido
107.
CONTROL DE LA
EXPRESIÓN GÉNICA.
Uno de los problemas con los que se enfrentan
las células eucariotas es la especialización: los
seres humanos tenemos, por ejemplo, más de
81
Ensayos Biotecnológicos
200 tipos de células. Si todas tienen el mismo
genoma, ¿qué las hace diferentes?
Las proteínas: no todas las células poseen las
mismas proteínas.
Para que esto sea así, las células ponen en
funcionamiento mecanismos que les permiten
regular la cantidad y el tipo de proteínas, así
como el momento en que estas se sintetizan.
Mientras que las células procariotas transcriben
casi todos sus genes, las células eucariotas
eligen qué genes transcribir. Cada tipo celular
eucariota expresa sólo una fracción de los genes
que tiene, alrededor del 20%. Es decir, sólo el
20% de los genes que contiene el ADN se
transcribe en ARN y luego se traduce en
proteínas.
De la misma manera en que en nuestras casas no
abrimos todos los grifos de agua al mismo
tiempo sino sólo los que necesitamos usar, las
células sintetizan solamente aquellas proteínas
que necesitan. Aún mas, pueden también regular
la cantidad de proteínas que necesitan,
produciendo 2, 3 o hasta 100 copias cada vez.
Las células regulan, entonces, la expresión de
sus genes mediante diferentes procesos, pero la
forma más eficiente y usual es por medio del
control transcripcional, por el cual la célula
puede aumentar y disminuir la cantidad de ARN
transcripto.
Los controles pueden ser:
• Controles transcripcionales
• Controles postranscripcionales
• Controles postraduccionales
Controles transcripcionales
Por medio de la regulación del inicio de la
transcripción se puede elegir qué genes
“encender” (activar) o “apagar” (inhibir) en un
momento determinado, así como también
regular la cantidad de ARNm producido. Esto se
logra a través de mecanismos muy diferentes,
pero aquí solo discutiremos dos de ellos.
El primero implica mantener apagados ciertos
genes: en determinados tipos celulares, hay
regiones de ADN que están siempre apagadas y
cuyos genes no se transcriben nunca.
El segundo involucra el uso de regiones
regulatorias, ubicadas en la secuencia anterior
al inicio de la transcripción. Estas secuencias
permiten la unión de factores de transcripción
que pueden facilitar o impedir la unión de la
ARN polimerasa al promotor, regulando de esta
manera la cantidad de mensajeros producidos.
Como ya vimos, para que la transcripción ocurra
es necesario que la ARN polimerasa se una al
promotor del gen. Esta unión puede regularse
Salvador Camacho Garrido
utilizando ciertas proteínas, denominadas
factores de transcripción, que se unen a
secuencias específicas cercanas al promotor y
pueden facilitar o impedir la transcripción. Esta
es una manera de regular la cantidad de
moléculas de ARN que se transcriben.
Controles postranscripcionales
• Mecanismos de corte y empalme
(Splicing).
Mediante el splicing, los intrones –secuencias no
codificantes- son eliminados del pre-ARNm y
los exones son unidos: el ARNm maduro está
formado sólo por exones.
En ciertos casos, pueden quedar entre las
secuencias de exones algunos intrones que son
utilizados como molde en la traducción. Esto se
denomina splicing alternativo y en teoría puede
generar proteínas diferentes, de manera
proporcional al número de intrones que contenga
el gen. Por medio de este mecanismo de
regulación se “elige” qué intrones sacar de la
secuencia que va a ser traducida. Si una proteína
contiene tres intrones, se puede crear un ARNm
con uno, dos o tres intrones entre la secuencia
codificante.
Como
resultado
obtenemos
proteínas similares, ya que los exones son
iguales, pero su diferencia está dada por la
secuencia de los intrones.
• Edición del ARN.
En algunos casos, la secuencia del ARNm es
modificada luego de ser transcripta. Los cambios
incluyen la inserción de nucleótidos en regiones
específicas, lo que motiva un corrimiento en el
marco de lectura y genera la expresión de
proteínas muy diferentes.
• Transporte del ARNm al citoplasma.
Para poder ser transportado, el ARNm debe
haber sido procesado correctamente; de lo
contrario es degradado en el núcleo
• Iniciación de la síntesis proteica.
El ARNm contiene en sus extremos secuencias
que no son traducidas y que sirven para regular
la traducción (5’ UTR y 3’ UTR, untraslated
regions). Si esas secuencias son bloqueadas, el
ARN no es reconocido por el ribosoma y no se
puede traducir el mensajero. Por otro lado, las
secuencias que flanquean el codón inicial
(AUG) son determinantes. Si el ribosoma se
“salta” el primer AUG, comenzará la traducción
en el segundo codón produciendo una proteína
con menos aminoácidos y/o secuencia diferente.
• Estabilidad del ARNm.
La vida media de un ARNm está determinada
principalmente por la longitud de la cola poliA.
Una vez en el citoplasma, la secuencia comienza
82
Ensayos Biotecnológicos
a acortarse; cuando se hace demasiado corta el
mensajero es degradado.
• Eliminación de ARNm con errores.
Los ribosomas –junto con otras proteínas- son
capaces de detectar codones de terminación en
lugares erróneos de la secuencia del mensajero
(generados por algún error previo en el splicing
o por mutaciones). ¿Cómo lo hacen?
Reconociendo las secuencias de unión entre los
exones. Si el mensajero es adecuado, todos los
lugares de unión entre los exones deberían
encontrarse antes del codón de terminación. Si
esto no ocurre, el ARNm fallido es degradado.
• ARN de interferencia.
Cuando una célula humana es infectada por un
virus que fabrica una doble cadena de ARN,
ciertas enzimas lo reconocen y lo degradan. Este
mecanismo permite la eliminación de ciertos
virus y puede ser utilizado también para regular
la traducción de un mensajero: si se introduce (o
se transcribe en la misma célula) una cadena de
ARN complementaria a un mensajero, este no
podrá ser traducido y además será detectado
como foráneo y degradado.
Controles postraduccionales
Una vez sintetizadas, las proteínas pueden ser
modificadas mediante la unión de distintas
moléculas (grupos fosfato, adenilatos, azúcares,
etcétera). Estos agregados permiten regular la
acción proteica de manera muy rápida porque no
dependen del proceso de síntesis. Existen
además ciertas proteínas que contienen
segmentos que, bajo ciertas condiciones, se
activan y se separan de la molécula y, por tanto,
puede cambiar su actividad.
Otro mecanismo de regulación es la degradación
de proteínas. La vida media de la proteína puede
ser un parámetro a regular que también actúa de
manera rápida. El sistema ubiquitinaproteosoma lleva a cabo la degradación.
Salvador Camacho Garrido
108.
TÉCNICAS DE ESTUDIO DE
LA EXPRESIÓN GÉNICA.
Estrictamente, el término expresión génica
abarca desde la activación del gen hasta que la
proteína madura se ha localizado en el lugar
adecuado y realiza su función, de tal manera que
dicha proteína contribuye a la expresión del
fenotipo celular.
Este hecho puede ser abordado por técnicas de
análisis de proteínas («binding» molecular, RIA,
ELISA, western blot, inmunohistoquímica).
Además, si la proteína es un enzima se puede
detectar su actividad catalítica.
Finalmente, la hibridación in situ es otra
poderosa herramienta para detectar transcritos
que, a diferencia del Northern blot, permite
localizar el mRNA en áreas de tejido y
determinar también la cantidad relativa del
mensajero in situ.
109.
INMUNOLOCALIZACIÓN.
Es una técnica que permite estudiar la expresión
espacial de un determinado gen mediante la
detección de la proteína que codifica. En este
caso se utiliza como sonda un anticuerpo contra
esa proteína.
El éxito de la técnica depende de forma notable
de la calidad del anticuerpo utilizado, de la
producción del corte histológico y de la
preservación del mismo.
En cuanto al revelado, se utiliza corrientemente
la fosfatasa alcalina en el anticuerpo secundario
o algún anticuerpo fluorescente que permite la
visualización directa por microscopía.
83
Ensayos Biotecnológicos
110.
HIBRIDACIÓN “IN SITU”.
La hibridación in situ permite visualizar una
secuencia de ADN o ARN justo en el sitio físico
en el que se encuentra permitiendo analizar su
distribución en células y tejidos.
La técnica de hibridación in situ está basada en
la capacidad que poseen los ácidos nucleicos
para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de
determinada secuencia de ADN o ARN, que
resulta complementaria con otra secuencia.
Su utilidad reside en la capacidad de poder
demostrar mediante la utilización de una sonda
(formada por una secuencia de ADN
previamente conocida) marcada con un isótopo
radiactivo, la presencia de determinada
secuencia de ADN o ARN complementaria, en
la muestra a estudiar.
Lo que se produce mediante la utilización de
esta técnica es la hibridación (unión), de la
sonda marcada, con la secuencia a buscar (en el
caso de estar presente en la muestra) y
posteriormente mediante técnicas específicas
(autoradiografía o inmunohistoquímica), la
transformación de la secuencia en algo visible.
Aplicaciones
Esta técnica es muy útil, por ejemplo, para
identificar la secuencia de nucleótidos, en
determinadas enfermedades de origen genético.
Las técnicas de hibridación "in situ" permiten
localizar un segmento concreto de ADN (por
ejemplo un gen) en una posición determinada de
un cromosoma eucariótico.
Es posible obtener preparaciones citológicas de
cromosomas en metafase mitótica o en otras
fases del ciclo, desnaturalizar el ADN de los
cromosomas en la propia preparación citológica
y posteriormente hibridar con la pieza de ADN
deseada marcada.
Actualmente, el marcaje suele ser de tipo
fluorescente, denominándose dicha técnica
Hibridación "in situ" mediante fluorescencia
(abreviadamente FISH).
También, es posible marcar todo el ADN de un
genoma o juego de cromosomas completo y
realizar una Hibridación in situ Genómica
(abreviadamente GISH) que permite averiguar si
los cromosomas de un determinado genoma
están presentes.
Otra
aplicación,
consiste
en
detectar
determinados
cromosomas
o
regiones
cromosómicas concretas utilizando sondas o
piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia
y procedentes solamente del cromosoma
deseado, de esta manera, se obtiene lo que se
denomina “Pintura Cromosómica”.
Salvador Camacho Garrido
111.
¿UN GEN UNA PROTEÍNA?
En la jerga de los genéticos, el verbo codificar se
usa frecuentemente para significar que un gen
contiene las instrucciones para sintetizar una
proteína particular, como en la frase el gen
codifica una proteína.
Ahora sabemos que el concepto "un gen, una
proteína" es simplista y que un mismo gen puede
a veces dar lugar a múltiples productos,
dependiendo de cómo se regula su transcripción
y traducción.
Como ya vimos, el genoma eucariota está
constituido por exones o secuencias codificantes
intercaladas con intrones o secuencias no
codificantes. Por medio de la transcripción se
obtiene una molécula de pre-ARNm con exones
más intrones. Como éstos últimos no se
necesitan, la maquinaria molecular se encarga de
editar este pre-ARNm y produce un ARN
maduro, libre de intrones.
Esto es en líneas generales, pero en realidad el
proceso
es
más
complicado.
Existen
mecanismos de “edición del genoma”: el ADN
se corta y vuelve a unir de diferentes maneras.
Este mecanismo es utilizado, por ejemplo, para
la formación de las regiones variables de los
anticuerpos, proteínas producidas por los
linfocitos B en respuesta a la presencia de
moléculas extrañas.
Además, algunas células pueden transcribir
muchos ARNm del mismo gen ya que, por
ejemplo, el ARNm puede empezar o terminar en
distintos sitios del mismo gen.
También existe la posibilidad de que el ARNm
se corte y empalme de maneras diferentes.
Como resultado, un mismo gen puede codificar
más de un polipéptido.
Un gen se define, entonces, como una secuencia
de ADN que se transcribe como una entidad y
que puede codificar un polipéptido o una serie
de polipéptidos relacionados.
Estos mecanismos permiten crear una gran
combinación de proteínas a partir de un pequeño
número de genes.
84
Ensayos Biotecnológicos
112.
TEORÍA DEL OPERÓN.
La teoría del operón surgió para explicar el
método de control de las actividades de los
genes.
Postula tres clases de genes:
Los genes que producen el RNAm que son los
genes estructurales. Un grupo de esos genes de
funciones similares quedan en secuencia en el
cromosoma.
Adyacente a cada grupo de genes estructurales
hay un gen operador, que funciona como el
“interruptor” que pone a funcionar a los genes
estructurales y hace que produzcan su RNAm.
La unidad completa de genes estructurales y su
operador constituye un operón.
En otro sitio del cromosoma existe un gen
regulador que produce una sustancia represora,
que inhibe al gen operador. La molécula del
represor tiene dos sitios activos, uno en el que se
puede unir con el gen operador y otro en el que
se puede unir con un efector específico. Si está
presente el efector, el represor se une con él y
pierde su capacidad para unirse con e inhibir al
gen operador. Con el represor inactivado, el gen
operador queda libre de estimular a los genes
estructurales a que entren en acción. Por tanto, el
efector constituye el agente final de control. En
su ausencia, no se produce RNAm. Ese efector
se puede difundir al interior de la célula desde el
exterior o puede ser producido dentro de la
célula.
113.
TRANSGENES.
Un transgén es un gen o material genético que se
ha transferido natural o por cualquiera de una
serie de técnicas de la ingeniería genética, de un
organismo a otro.
En su forma más precisa el uso de la expresión
transgén se describe un segmento de ADN que
contiene una secuencia de genes que se ha
aislado de un organismo y se introduce en un
organismo diferente.
Este segmento no nativo de ADN puede retener
la capacidad para producir ARN o proteínas en
el organismo transgénico, o puede alterar la
función normal del organismo transgénico o de
Salvador Camacho Garrido
del código genético.
En general, el ADN se incorpora en el
organismo a la línea germinal. Por ejemplo, en
vertebrados esto puede lograrse mediante la
inyección de ADN extraño en el núcleo de un
fertilizado óvulo. Esta técnica es habitualmente
utilizada para introducir genes de enfermedades
humanas o de otros genes de interés en las cepas
de ratones de laboratorio para estudiar la función
o la patología en que ese gen participa.
En un uso más flexible, transgén puede describir
cualquier secuencia de ADN (con independencia
de que contiene un gen que codifica una
secuencia, o si se ha construido artificialmente)
que se ha introducido en un organismo o vector
de construcción en la que anteriormente no se
encontraba.
114.
GENES ANTISENTIDO.
La función de los genes antisentido no es inducir
la expresión de una proteína nueva sino todo lo
contrario, evitan la creación de una existente en
el organismo no transgénico que por cualquier
motivo desea suprimirse. Tómese como botón de
muestra el primer vegetal transgénico comercial,
el tomate Flavr Savr, desarrollado por la
empresa Calgene en 1994. Este tomate era
resistente al ablandamiento, al contener un gen
antisentido de la poligalacturonasa. En este
tomate, el gen antisentido produce la síntesis de
un m-RNA complementario del m-RNA de la
poligalacturonasa, que al unirse a él impide la
síntesis de la enzima responsable de las
características del vegetal que querían
suprimirse.
Un ARN antisentido es la hebra complementaria
(no codificadora) de un hebra ARNm
(codificadora). La mayoría inhiben genes, pero
unos pocos activan la transcripción. El ARN
antisentido se aparea con su ARNm
complementario forman una molécula de doble
hebra que no puede traducirse y es degradada
enzimáticamente. La introducción de un
transgen codificante para un ARNm antisentido
es una técnica usada para bloquear la expresión
de un gen de interés. Un mARN antisentido
marcado radioactivamente puede usarse para
mostrar el nivel de transcripción de genes en
varios tipos de células.
85
Ensayos Biotecnológicos
Algunos tipos ya que se usan como terapia
antisentido.
115.
SILENCIAMIENTO GÉNICO.
El término “silenciamiento génico” se utiliza
habitualmente para describir el “apagado” de un
determinado gen, y es un mecanismo general
que ocurre durante la regulación de la expresión
génica.
A través de este mecanismo, la maquinaria
celular impide la expresión de un gen que
debería estar “encendido” en circunstancias
normales.
La expresión génica se puede regular tanto a
nivel transcripcional como posttranscripcional.
El Silenciamiento Génico Transcripcional
(Transcriptional Gene Silencing o TGS) es el
resultado de la modificación de las histonas.
Esta modificación crea un ambiente de
heterocromatina alrededor de un cierto gen, que
impide el acceso de la maquinaria
transcripcional (factores de transcripción, ARN
polimerasas, etc.).
El Silenciamiento Génico Postranscripcional
(Post-Transcriptional Gene Silencing o PTGS),
en cambio, es un mecanismo que implica la
degradación de un determinado ARN mensajero.
La destrucción de este ARNm impide su normal
traducción y consecuentemente no se sintetiza la
proteína correspondiente.
Tanto el silenciamiento transcripcional como el
postranscripcional son mecanismos que regulan
la expresión de genes endógenos, pero además
son empleados por los organismos para
protegerse de transposones y virus.
Es por eso que se cree que el silenciamiento
génico forma parte de un sistema de defensa
ancestral que resguarda a algunos organismos de
la invasión de ácidos nucleicos infecciosos.
El silenciamiento génico mediado por RNA es
un complejo mecanismo de regulación génica,
conservado en el mundo eucariota (una notable
excepción es S. cerevisiae), que conduce a la
supresión de la expresión génica mediada por
pequeñas moléculas de RNA que inducen la
Salvador Camacho Garrido
destrucción del mRNA, impiden su traducción o
inhiben su transcripción.
Inicialmente descrito como un mecanismo de
defensa molecular contra virus y transposones,
en los últimos años se ha demostrado que este
mecanismo también está implicado en la
regulación de complejos procesos como la
formación de heterocromatina, el desarrollo y la
fisiología de los organismos.
Además de revelar un mundo de regulación
génica
hasta
ahora
desconocido,
el
silenciamiento génico mediado por RNA se ha
convertido en una herramienta fundamental en el
estudio de la función de los genes, permitiendo
incluso el desarrollo de nuevas disciplinas como
la genómica funcional.
116.
OTROS CONCEPTOS.
Existen otras formas de modificar la
información genética de los seres vivos, ya sean
naturales o no:
• Conjugación
• Transducción
• Transformación
• Transfección
• Recombinación
Conjugación Bacteriana
La conjugación bacteriana es el proceso de
transferencia de información genética desde una
célula donadora a otra receptora, promovido por
determinados tipos de plásmidos, que portan un
conjunto de genes cuyos productos participan en
el proceso, y que requiere contactos directos
entre ambas, con intervención de estructuras
superficiales especializadas y de funciones
específicas (pilus sexuales en los Gram
negativos, y contacto íntimo en los Gram
positivos).
Algunos de estos plásmidos se comportan como
episomas, es decir, que pueden integrarse en el
cromosoma; en este caso, si se produce la
conjugación, se puede transferir el propio
plásmido más un segmento adyacente del
cromosoma, que a su vez podrá recombinarse
con secuencias homólogas del cromosoma del
receptor, dando lugar a un cromosoma híbrido.
86
Ensayos Biotecnológicos
DNA atraviese la misma, aunque el éxito
también depende de la actividad de las
endonucleasas que degradan el DNA.
E. coli, genera enzimas que degradan
rápidamente los fragmentos de DNA extraños.
Podemos hacer una célula con la membrana
poco permeable “competente”, facilitando el
proceso de la transformación.
Transducción
La Transducción es un proceso en el cual una
partícula viral sirve como vector en la
transferencia de genes entre bacterias. En
estudios moleculares se utiliza esta característica
como una herramienta para la manipulación
genética de los microorganismos.
La transducción es una de las tres maneras por
los cuales ocurre transferencia de genes entre
microorganismos, donde el ADN bacteriano, es
encapsidado por un virus y transferido a una
célula receptora metabólicamente activa.
En condiciones apropiadas, todos los fagos
líticos pueden actuar como fagos de
transducción generalizada constituyendo un
importante elemento de transferencia genética
no solo entre miembros de la misma especie sino
incluso entre géneros.
Transformación
Es la incorporación de DNA extracelular en el
interior de una bacteria. Es otro método distinto
de transferir material genético de una célula a
otra. Una vez entra una hebra (de las dos) del
DNA donador en la bacteria receptora, debe
producirse recombinación mediante un doble
entrecruzamiento, obteniendo una región
cromosómica constituida por DNA heterólogo.
Cuando esta bacteria se divida, obtendremos la
mitad de bacterias no transformantes y la otra
mitad transformantes.
El que se pueda dar la transformación depende
de la permeabilidad de la pared celular; si la
membrana es permeable, es más fácil que el
Salvador Camacho Garrido
Transfección
La transfección consiste en la introducción de
material genético externo en células eucariotas
mediante plásmidos, vectores víricos (en este
caso también se habla de transducción) u otras
herramientas para la transferencia.
El término transfección para métodos no-virales
se usa en referencia a células de mamífero,
mientras que el término transformación se
prefiere para describir las transferencias novirales de material genético en bacterias y
células eucariotas no animales como hongos,
algas o plantas.
La
transfección
de
células
animales
generalmente se lleva a cabo abriendo poros o
"agujeros" transitorios en la membrana
plasmática
de
las
células
mediante
electroporación, para permitir el paso del
material genético (como construcciones de DNA
superenrollado o siRNA) aunque pueden ser
transfectadas
incluso
proteínas
(como
anticuerpos, por ejemplo).
Además de la electroporación, se pueden utilizar
otras técnicas para efectuar la transfección,
como por ejemplo liposomas producidos
mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el
material genético, que se fusionarán con la
membrana plasmática celular y depositarán su
carga adentro.
Recombinación
La recombinación genética es uno de los
procesos biológicos más importantes que existen
en la naturaleza puesto que permite mezclar los
alelos de los cromosomas homólogos durante la
meiosis, lo cual es fuente de variabilidad
genética.
Esta variabilidad puede dar lugar a la aparición
de seres vivos mejor adaptados a su medio que
serán
seleccionados
para
dejar
más
descendientes.
Además de esta importancia biológica, la
recombinación tiene una gran importancia
científica porque posibilita una técnica para
mapear cromosomas, es decir, colocar de forma
relativa los alelos a lo largo de una cromátida.
La recombinación genética es el proceso por el
87
Ensayos Biotecnológicos
cual una hebra de material genético (usualmente
ADN, pero también puede ser ARN) es rota y
luego unida a una molécula de ADN diferente.
La recombinación de eucariotas comúnmente se
produce
durante
la
meiosis
como
entrecruzamiento cromosómico entre los
cromosomas apareados.
Este proceso conduce a que la progenie tenga
diferentes combinaciones de genes de sus padres
y puede producir alelos quiméricos.
En biología evolutiva se cree que esta mezcla de
genes tiene varias ventajas, incluyendo que
permite a los organismos que se reproducen
sexualmente y evitar el trinquete de Muller.
En genética evolutiva se conoce por trinquete
de Muller (en honor a Hermann Joseph Muller)
al proceso por el que los genomas de una
población asexual acumulan mutaciones
perjudiciales de forma irreversible.
Muller propuso este mecanismo como teoría
para explicar la evolución del sexo. Debe
señalarse que, aunque Muller propuso su
trinquete para explicar el éxito de la
reproducción sexual sobre la reproducción
asexual, el efecto puede no ser común en
organismos que se reproducen asexualmente
pero realizan otras formas de recombinación, y
podría observarse en las partes del genoma de
organismos que se reproducen sexualmente pero
no están sujetas a recombinación.
En biología molecular, "recombinación" también
se refiere a la recombinación artificial y
deliberada de piezas de ADN distintas, a
menudo de diferentes organismos, creando lo
que se llama ADN recombinante.
Salvador Camacho Garrido
88
Ensayos Biotecnológicos
TEMA V. CLONACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
mensajero.
RESTRICTASAS
CORTES
117.
INGENIERIA GENÉTICA.
La Ingeniería Genética o clonación molecular o
tecnología del DNA recombinante son términos
acuñados para describir un amplio número de
técnicas que tienen por objeto la manipulación
de los genes que componen un organismo que
puede ser desde una bacteria hasta una planta o
un ser humano. Se considera que los padres de la
ingeniería genética son dos investigadores
americanos en cuyos laboratorios se estudiaban
durante los años 70 los plásmidos bacterianos
(Stanley Cohen, U. Stanford) y las enzimas de
restricción-modificación (Herbert Boyer, U.
Columbia). Estos científicos colaboraron
estrechamente y sentaron las bases del DNA
recombinante.
La clonación molecular consiste básicamente en
insertar un segmento de DNA que nos interesa, y
que llamamos vector, en una molécula con
capacidad autónoma de replicación. Este vector
artificial se introduce en el organismo
hospedador adecuado, lo que se traduce en la
síntesis de grandes cantidades del DNA deseado.
Cada colonia que proviene de una sola célula se
denomina clon.
La estrategia general de la clonación:
1. Aislamiento del DNA foráneo que
queremos clonar
2. Unión del fragmento al vector o
vehículo de clonación
3. Introducción del vector con el DNA
foráneo en la célula hospedadora
4. Selección de la célula hospedadora con
el DNA foráneo
5. Determinar si la información genética se
mantiene de forma estable
Algunos de estos pasos son más o menos
comunes a todos los organismos; otros como la
introducción del vector con el DNA foráneo en
la célula hospedadora o la selección de la célula
transformada pueden variar mucho según el
organismo en cuestión.
FRAGMENTACIÓN
MECÁNICA
AISLAMIENTO ADN
A PARTIR DE ARN
SÍNTESIS
QUÍMICA
119.
ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCIÓN.
Son enzimas capaces de cortar el DNA:
Tipo I y Tipo III.
Son enzimas multifuncionales (actividades de
restricción y modificación). Necesitan Mg2+,
ATP y S-Adenosilmetionina. Reconocen la
secuencia de reconocimiento, después recorren
un cierto número de bases, unas 1000 en el caso
de endonucleasas tipo I y unas 25 en el caso de
las de tipo III, y cortan por lo que rompen el
DNA por secuencias más o menos al azar.
Tipo II.
Rompen el DNA por la secuencia de
reconocimiento por lo que dan lugar a
fragmentos de longitud y secuencia definidas.
Necesitan Mg2+ pero no ATP.
La utilidad práctica de las endonucleasas tipo II
es incalculable. Se han aislado miles de enzimas
de restricción tipo II en diferentes especies
bacterianas y se emplean como herramientas
para
cortar
el
DNA
artificialmente.
Generalmente
reconocen
secuencias
palindrómicas con entre 4 y 7 pares de bases.
Las secuencias palindrómicas son aquellas que
se leen igual en sentido 5´-3´ en ambas cadenas
complementarias.
118.
AISLAMIENTO DEL ADN
FORÁNEO.
El aislamiento del DNA foráneo puede
efectuarse utilizando una de las dos estrategias
siguiente:
• Selección desde el genoma que lo
contiene
• Síntesis directa a partir de RNA
Salvador Camacho Garrido
89
Ensayos Biotecnológicos
La nomenclatura utilizada para denominar estas
enzimas consiste en:
1º. Tres letras cursivas que corresponden al
nombre del microorganismo: Escherichia coli
(Eco); Haempphilus influenzae (Hin).
2º. La estirpe si la hubiera EcoR, aislada de la
estirpe RY13 de E. coli.
3º. En números romanos un número para
distinguir si hay más de una endonucleasa
aislada de esa misma especie (no se debe
confundir con el tipo).
4º. Todas deberían llevar delante una R de
restricción o un M de metilasa, pero
generalmente se omite.
EcoRI produce el siguiente resultado:
5’-G↓AATT C
3’-C TTAA↓G
5’-G
3’-CTTAA
AATTC-3’
G-5’
Los cortes pueden dar lugar a:
• Extremos cohesivos en 5’ Ej.: Ecori
• Extremos cohesivos e 3’ Ej.: Pst I
• Extremos romos
Ej.: HaeIII
GAATTC
regiones no esenciales para su propagación y
estabilidad.
Plásmidos
Son replicones de DNA circular que se replican
independientemente.
Aparecen de forma natural en las bacterias y
pueden tener entre 5.000 y 400.000 pb.
La organización de la información genética en
bacterias responde en general a un cromosoma
circular y una serie de fragmentos de DNA
circular con capacidad autónoma de replicación
denominados plásmidos.
Pueden introducirse en las células bacterianas
por un proceso llamado transformación.
Las propiedades deseables en un plásmido para
que sea un buen portador genético son:
• Bajo peso molecular, así puede
incorporar más información
• Control relajado (muchas copias por
célula que se replican de forma no
asociada al cromosoma)
• Amplio rango de hospedadores
• Fenotipo seleccionable, es decir, que
posea marcadores genéticos (como
resistencia a antibióticos)
• Buen mapa de restricción
CTTAAG
Corte con EcoRI. Generación de extremos cohesivos.
Los extremos romos son compatibles entre si
para posteriores uniones, pero la unión es más
difícil. Los extremos cohesivos sólo son
compatibles entre sí, si han sido cortados por la
misma enzima o por endonucleasas con la
misma secuencia de corte. Las enzimas con la
misma secuencia de reconocimiento se llaman
isoesquizómeros, pero pueden no cortar por el
mismo sitio.
Plásmido de E. coli pBR322
120.
VECTORES DE
CLONACIÓN.
Todos los vehículos de clonación tienen como
propiedad indispensable que pueden replicarse
autónomamente.
Además es necesario que puedan separarse
fácilmente del resto del genoma y que contengan
Salvador Camacho Garrido
Los plásmidos usados en ingeniería genética son
relativamente pequeños, se replican bajo control
relajado y llevan genes de resistencia específicos
a uno o más antibióticos.
Contienen además un cierto número de sitos de
restricción para endonucleasas en los que el
90
Ensayos Biotecnológicos
DNA que queremos clonar puede insertarse.
Virus
Se emplean para introducir DNA foráneo en una
célula hospedadora. Entre los más utilizados
pueden destacarse como ejemplos los siguientes:
• Para bacterias:
o Fago λ y sus derivados
o Fago M13
• Para plantas: CaMV (virus del mosaico
de la coliflor)
• Para mamíferos: SV40
El fago λ es un virus parásito de E. coli. Su
DNA es una molécula lineal bicatenaria de unos
48,5 Kb, de las cuales aproximadamente 1/3, 23
Kb, no contienen información esencial. En cada
extremo posee prolongaciones cortas 5’
monocatenarias cohesivas que le permiten
recircularizarse en la célula hospedadora, estos
sitios se llaman sitios cos. El corte por los sitios
cos y el empaquetamiento en la cápside pueden
hacerse in vitro.
La cápside normalmente admite entre 38 y 53
Kb (-20% y +10% del DNA de fago λ), por lo
que no se pueden insertar fragmentos muy
grandes de DNA. Como el fago λ normalmente
tiene muchos sitios de corte, por lo general se
usan derivados del fago en los que se han
incluido modificaciones.
Salvador Camacho Garrido
La inclusión del DNA en la cápside se hace de
forma análoga a como ocurre en la naturaleza,
por empaquetamiento in vitro. Existen kits
comerciales que traen las proteínas de la
cápside, la cola y todos los reactivos necesarios.
El fago M13 o el MP8 incluyen un poligando o
polylinker, pequeño fragmento que tiene sitios
de restricción para muchas restrictasas.
Cósmidos
Es un artificio de laboratorio, un plásmido que
posee el sito cos del fago λ, un origen de
replicación igual que otros plásmidos,
marcadores genéticos y puntos únicos de corte
para ciertas restrictasas.
La información se introduce en el hospedador
por empaquetamiento in vitro, igual que en los
fagos, pero una vez dentro del hospedador se
comporta como un plásmido. Puede empaquetar
eficazmente entre 38 y 53 Kb pero dado el
pequeño tamaño de los cósmidos (5,4 Kb)
admite insertos mucho mayores que los que
admiten otros vectores.
91
Ensayos Biotecnológicos
Vectores YACs (yeast artificial
cromosomas)
Algunos genes de eucariotas son tan grandes que
pueden superar los 1.000 kb. Mediante el uso de
genotecas basadas en plásmidos o fagos o
cósmidos sólo es posible clonar pequeños
fragmentos de éstos. Los YACs son segmentos
lineales de DNA de levaduras que contienen
todos los elementos necesarios para la
replicación autónoma en una levadura (origen de
replicación, centrómeros y telómeros).
DNAs de cientos de kilobases pueden insertarse
y clonarse con los YACs. El uso de vectores
capaces de incorporar segmentos de DNA
mayores es necesario cuando vamos a clonar
genomas muy grandes, como el genoma humano
con un millón de pares de bases. Esto reduce el
número de clones necesarios para tener una
librería genómica completa.
121.
UNIÓN ADN-VECTOR DE
CLONACIÓN.
Se produce por la acción de la DNA ligasa, que
sella las mellas existentes entre nucleótidos
adyacentes.
Cuando se unen fragmentos creados por una
endonucleasa de restricción quedan mellas. La
DNA ligasa repara estas mellas. Al producir la
unión entre el inserto y el vehículo de clonación
se debe evitar la recirculación de plásmidos.
Para esto se aumenta la concentración de DNA,
favoreciendo las reacciones intermoleculares.
La reacción del plásmido con fosfatasa alcalina
Salvador Camacho Garrido
elimina los grupos 5`-P e impide también la
recircularización.
La DNA ligasa une nucleótidos adyacentes
mediante un enlace covalente. La DNA-ligasa va
uniendo todos los fragmentos de DNA a la vez
que elimina los ribonucleótidos de los
cebadores.
La Figura muestra esquemáticamente el proceso
de inserción del fragmento de DNA en el vector.
La DNA ligasa usada más habitualmente es la
T4 DNA ligasa, que requiere ATP como
cofactor.
La ligación de moléculas de ADN puede
realizarse de múltiples maneras. En principio,
podemos hablar de ligación intermolecular y
ligación intramolecular.
92
Ensayos Biotecnológicos
así contamos con algunas posibilidades. Por
ejemplo, el empleo de moléculas adaptadoras.
Esto es, pequeñas moléculas de ADN bicatenario
que se unen a los extremos del ADN mediante
ligasas y que tienen una diana de restricción que
nos interesa.
Otra posibilidad es la de añadir al extremo del
ADN una "cola" de mononucleótidos en una de
las moléculas de ADN, y del mononucleótido
complementario en la otra. Esto se realiza
mediante
una
enzima
denominada
polinucleótido transferasa terminal.
La ligación en principio se producirá o bien
entre extremos romos o bien entre extremos de
DNAs digeridos con la misma enzima de
restricción (Eco RI) y que, por tanto, pueden
aparearse.
Sin embargo, en ocasiones, también pueden
producirse entre moléculas digeridas con
enzimas diferentes si los extremos que generan
son compatibles (BamHI, BglII, Bcl ADN
XhoII).
Dos moléculas digeridas con la misma enzima
pueden unirse para formar un círculo, aunque
también pueden adoptar dos configuraciones
diferentes según la orientación en que se unan.
Si esto mismo lo hacemos con moléculas
digeridas con dos enzimas adecuadas (Eco RI y
Not I), podremos controlar la orientación.
En caso de no contar con enzimas adecuadas
para unir las moléculas que nos interesan, aún
Salvador Camacho Garrido
122.
INTRODUCCIÓN DEL
VECTOR/ADN.
La introducción en la célula hospedadora del
vector con el fragmento de DNA que se desea
clonar difiere dependiendo del tipo de vector
utilizado. Los métodos más utilizados se
describen a continuación.
• Transformación.
Se introduce el DNA plasmídico o desnudo en
una
célula
hospedadora.
Esto
ocurre
normalmente en la naturaleza, pero se favorece
con ciertos tratamientos que modifican la
permeabilidad de la membrana al DNA como el
CaCl2 (obtención de células competentes). La
transformación con plásmidos de hasta 10 Kb es
bastante eficiente, más de 20 Kb es casi
imposible.
• Transducción.
El DNA entra por infección con un bacteriófago.
• Transfección.
Introducción del DNA procedente de un virus
sin la cápside; es menos eficaz.
• Conjugación.
Paso del DNA de una célula a otra por pili.
• Fusión de protoplastos.
Se elimina la pared celular de dos células
microbianas, los protoplastos se unen
temporalmente, pasa la información de uno a
otro, luego se separan y se regeneran las paredes
celulares.
93
Ensayos Biotecnológicos
• Microinyección.
Se usa para células de mayor tamaño,
generalmente eucariotas; se requiere un
micromanipulador, aparato con microscopio,
sistema de TV y micropipeta.
• Otros.
Además de los ya mencionamos se pueden
destacar, la electroporación, y la pistola o
bombardeo de partículas que se usa
principalmente para la trasformación de
vegetales.
Hay que tener en cuenta que cualquier
combinación no es posible.
Hay ciertas limitaciones, por ejemplo:
• Los plásmidos con más de 20Kb
difícilmente pueden introducirse por
transformación, por lo que si el inserto
es muy grande debe recurrirse a un
cósmido.
• Los λ derivados, de sito cos a sitio cos
pueden tener entre 38-53 Kb pues se les
elimina hasta 22 Kb inútiles: lo máximo
posible a encapsidar será la diferencia.
• La transfección tiene un rendimiento
mucho menor que los otros métodos.
123.
MÉTODOS DE SELECCIÓN.
En el proceso de clonación, y específicamente
durante la introducción de la asociación vectorDNA foráneo en la célula hospedadora, pueden
ocurrir diferentes posibilidades: que entre en la
célula
hospedadora
el
DNA
foráneo
recircularizado, que entre el vector sólo (ambas
situaciones indeseables) o que entre el portador
genético completo (vector + DNA foráneo).
Debe disponerse de un método sencillo que
permita distinguir estas células diferentes de
forma sencilla. Normalmente, además del
marcador correspondiente los plásmidos llevan
un mecanismo que permiten una primera
selección.
• Resistencia a antibiótico
• Selección genética:
• Inactivación insercional
• Inserción génica positiva
• Hibridación de colonias
• Técnicas genéticas
contendrán así el gen de resistencia al
antibiótico, aunque todavía habrá de buscarse un
mecanismo que permita distinguir si las células
tienen el plásmido solo o con el inserto (DNA
foráneo) correspondiente.
Resistencia ampicilina
Inactivación insercional
Consiste en introducir el DNA foráneo en un gen
marcador del vector, de forma que este gen se
inactive. Por ejemplo, el gen de la βgalactosidasa expresa un enzima que cataliza la
degradación de lactosa para dar glucosa y
galactosa, pero también puede hidrolizar el
enlace o-glucosídico del x-Gal según la
siguiente reacción:
5-Br-4-Cl-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal)
Br-Cl-Indol (azul) + β-D- galactopiranosa
Las colonias con el gen de β-galactosidasa
tendrán color azul en presencia de x-Gal,
mientras que las colonias que permanezcan
blancas en presencia de x-Gal serán células que
han sido transformadas por el vector que
contiene el DNA foráneo en sitio adecuado y,
por tanto, ha inactivado el gen de la βgalactosidasa.
Las bacterias no transformadas o que contenían
solo el inserto recircularizado ya habían sido
eliminadas por carecer de la resistencia a
antibióticos.
Resistencia a antibiótico
Por ejemplo, supongamos un DNA foráneo que
introducimos en un vector que lleva genes de
resistencia a ampicilina. Se prepara un medio de
cultivo con ampicilina. Las células que no han
sido transformadas o han sido transformadas con
el inserto solo recircularizado, no crecerán. Solo
crecerán aquellas que tengan el plásmido, pues
Salvador Camacho Garrido
94
Ensayos Biotecnológicos
Inserción génica positiva
Al DNA foráneo se le pega un marcador de
forma que las colonias con el inserto tienen las
características del marcador.
Hibridación de colonias
Consiste en detectar secuencias de DNA en
colonias transformadas mediante hibridación “in
situ” con sondas marcadas radiactivamente o
con otros marcajes. Se basa en la interacción de
las bases de dos cadenas de DNA
complementarias. Es la misma técnica que se
usa para el Southern blot. Se procede como se
indica a continuación:
• Obtención de la sonda marcada.
Una sonda es una molécula de DNA de cadena
sencilla marcada, que tiene gran homología con
el DNA foráneo que nos interesa.
• Las
sondas
homólogas
son
exactamente complementarias con el
fragmento de DNA que busco, éstas
pueden obtenerse químicamente o a
partir del mensajero siempre que
conozcamos la secuencia, o la de
aquella proteína que codifica.
• Las sondas heterólogas suelen
usarse cuando no conocemos la
secuencia del fragmento buscado,
son complementarias con DNA de
otro organismo con el que se espera
que el gen en cuestión tenga gran
homología.
Las sondas pueden marcarse radiactivamente
con 32P, o con desoxinucleótidos fluorescentes.
• Estrategia de hibridación.
o Se obtiene una réplica de la
placa de agar que contiene las
colonias de la librería colocando
Salvador Camacho Garrido
una membrana de nitrocelulosa
sobre la placa de agar.
o La membrana se trata con
NaOH 0,5M para lisar las
bacterias y desnaturalizar las
cadenas de DNA.
o Se trata con proteinasa k para
eliminar la proteína y dejar el
DNA de cadena simple unido a
la membrana.
o Se incuba la membrana con la
sonda marcada, normalmente en
un horno de hibridación,
introduciéndola en un tubito con
la solución que contiene la
sonda. El tubo va girando
lentamente. Jugando con la
temperatura,
concentración
salina del tampón y tiempo de
hibridación deben encontrarse
las condiciones adecuadas para
la renaturalización del DNA.
o Se lavan bien los restos de
sonda.
o Se pone la membrana en
contacto con una placa de
autorradiografía dentro de un
receptáculo hermético.
o La placa se impresiona por la
radiactividad.
Por este método el fragmento de DNA buscado
puede ser identificado entre librerías genómicas
que contienen hasta un millón de genes.iferentes
95
Ensayos Biotecnológicos
fragmento del DNA total.
Estos hospedadores constituyen una genoteca o
banco de genes.
Luego sólo tendremos que seleccionar de la
genoteca el clon portador de la información que
deseamos. Esto puede presentar problemas, ya
que el gen que nos interesa se puede haber
cortado internamente.
La solución consiste en hacer digestiones
parciales jugando con el tiempo y la temperatura
de incubación, de forma que obtengamos
fragmentos lo más grandes posibles. Además se
hacen digestiones con diferentes restrictasas.
Así, la genoteca tendrá más genes pero nos
aseguramos de que la información genética
buscada está ahí.
Si se trata de una librería de DNA genómico, el
genoma completo del microorganismo se
fragmenta y se introduce en el vector apropiado.
Técnicas genéticas
Supongamos que quiero clonar el gen que
codifica la nitrito reductasa. Utilizo como
hospedador una cepa de E.coli mutante que
carece de nitrito reductasa. Si clono la nitrito
reductasa, la cepa tendrá la nitrito reductasa y
podrá degradar el nitrito. La causa de ésto sólo
puede ser que la mutación ha revertido o que se
ha conseguido introducir el gen de la nitrito
reductasa en E. coli.
124.
OBTENCIÓN DE
GENOTECAS.
Si partimos de cDNA (complementario) o DNA
sintetizando químicamente del gen que nos
interesa, conocemos muy bien lo que deseamos
clonar. Pero si sólo tenemos una cierta función
génica, por ejemplo el gen que codifica una
proteína, y no conocemos la localización de
dicho gen en el genoma correspondiente,
entonces tendremos que obtener una genoteca o
banco de genes para realizar una búsqueda del
gen de interés.
Para obtener una genoteca se procede como se
indica a continuación.
Se aísla el DNA total y se corta en fragmentos
pequeños.
Cada fragmento se une a un vector y se
introduce en la célula hospedadora.
Obtendremos muchas colonias, cada una con un
Salvador Camacho Garrido
Si el vector es un plásmido, se introduce en una
bacteria adecuada y cada colonia de la bacteria
transformada será un clon de células idénticas
portadoras de un tipo de plásmido recombinante.
Cuando se usa como vector un fago, éste se
cultiva sobre un césped de bacterias. Cada
bacteriófago recombinante crea a su alrededor
un halo de células lisadas. Cada uno de estos
96
Ensayos Biotecnológicos
halos contiene fagos idénticos portadores de un
tipo de inserto.
En el caso de organismos eucariotas, la librería
genómica contiene no sólo los genes sino
también las porciones de DNA no codificante
(los intrones). En eucariotas resulta mas útil
construir librerías que incluyan sólo esos genes
que se expresan, para esto se extrae el mRNA
del organismo y se produce el DNA
complementario mediante la transcriptasa
reversa: se trata de una librería de cDNA o de
DNA complementario.
125.
IDENTIFICACIÓN DEL
CLON DESEADO. SONDAS
MOLECULARES.
Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen
en un genoma era como encontrar una aguja en
un pajar.
Si tuviéramos que realizar dicha tarea,
probablemente usaríamos un imán para atraer la
aguja (siempre y cuando esta sea de metal y
posea propiedades magnéticas).
De manera análoga, hoy día podemos encontrar
genes o proteínas usando, respectivamente,
sondas y anticuerpos, que actúan como imanes
moleculares.
La identificación del clon deseado se suele
Salvador Camacho Garrido
realizar mediante sondas moleculares.
Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de
simple cadena complementarias a la región de
ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen
alguna “marca” que permite revelar su unión
(hibridación) a la secuencia elegida y de esa
manera revela presencia de la región buscada.
Una sonda molecular es un fragmento de
pequeño tamaño (normalmente entre 100 y 1000
bases.
En su uso, la sonda se une a la secuencia diana
monocatenaria (ADN1c ó ARN) mediante un
mecanismo de hibridación que forma una
estructura bicatenaria, una de las hebras
pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia
diana. Esta unión se establece porque tanto la
sonda como la diana tienen secuencias en parte o
totalmente complementarias, formándose pares
de bases complementarias.
Las sondas pueden ser “coloreadas” durante su
síntesis utilizando nucleótidos marcados con
isótopos radiactivos. Otra manera de marcarlas
es mediante la unión con una molécula que
pueda ser detectada posteriormente como
fluorescente, un marcador químico que puede
ser detectado por un anticuerpo, o una enzima
cuya actividad produce el cambio de color de su
sustrato.
Una de las técnicas más empleadas para
localizar fragmentos determinados del genoma
(o la expresión de algún gen en particular por
medio de la detección de la presencia de su
correspondiente ARNm) es la hibridación in situ.
Durante este proceso se incuba el ADN con una
sonda (de ADN o ARN) complementaria a la
secuencia buscada, y marcada radiactiva o
químicamente.
La sonda “navega” por el interior de la célula
hasta encontrar una secuencia complementaria a
ella. Una vez que esto ocurra se formará una
doble cadena que permitirá no sólo detectar la
presencia de esta secuencia, sino indicar el lugar
específico que ocupa dentro de la célula. Si se
tratara de un fragmento de un cromosoma, nos
permitiría saber su localización exacta o locus.
Para revelar la presencia de hibridación de la
sonda, la muestra debe exponerse a una placa
radiográfica; en el caso de las sondas marcadas
químicamente se procede a su revelado mediante
el uso de moléculas fluorescentes o que puedan
ser detectadas por colorimetría (utilizando una
enzima que provoque el cambio de color de un
sustrato).
Se puede también utilizar colonias de bacterias
con ADN recombinante con una técnica similar,
pero que usa anticuerpos en vez de sondas. Se
comienza por una colonia de bacterias que
97
Ensayos Biotecnológicos
contengan y expresen el gen de ADNc. Luego se
tratan las bacterias con un anticuerpo marcado,
que se unirá a la colonia que sintetice la proteína
deseada. De esta manera se puede localizar el
gen en cuestión y clonarlo para obtener
múltiples copias.
Obtención
Existen dos tipos de sondas: las que se obtienen
por clonación y las que se preparan por síntesis
(oligonucleótidos). Una vez se obtiene la sonda
deseada tiene que marcarse para poder detectarla
posteriormente
una
vez
efectuada
la
hibridización.
• Por clonación pueden obtenerse:
• Sondas DNA que son secuencias
largas de DNA con una alta
especificidad de hibridación con la
secuencia diana. Son las sondas
apropiadas para detectar DNA
vírico.
Estas
sondas
están
constituidas por doble hélice.
• Sondas RNA que son útiles cuando
la diana no es muy abundante, por
ejemplo para detectar un RNA
mensajero.
• Por síntesis:
Utilizando sintetizadores, se pueden obtener
secuencias cortas de alrededor de 20 bases que
reciben el nombre de oligonucleotidos. Estos
oligonucleótidos sintéticos pueden ser de DNA o
de RNA y pueden ser fabricados de forma
específica (podemos decidir que secuencia
concreta queremos sintetizar).
Marcaje
Para visualizar las moléculas diana se utiliza una
sonda marcada, bien radiactivamente, bien
mediante marcaje inmunológico. Para el uso de
ADN de doble cadena primeramente es
necesario desnaturalizarlo mediante calor o en
condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de
cadena simple marcada se une a la diana; y los
lugares de unión se detectan porque los métodos
de marcaje dejan una señal detectable mediante
fotografía. En los métodos más avanzados se
utilizan marcajes mediante fluorescencia que
emiten señales detectadas mediante láser, como
el utilizado en la PCR a tiempo real.
• Radiactividad
Se puede marcar radiactivamente la sonda
utilizado nucleótidos que tengan alguno de sus
átomos con un isótopo radiactivo, normalmente
32
P, pero también es frecuente el uso de 3H
(tritio).
• Inmunológico
Salvador Camacho Garrido
Aunque el marcaje radiactivo es muy sensible,
conlleva el peligro asociado a la utilización de
radiactividad. Para evitar este peligro se
desarrollaron otros métodos de marcaje basados
en anticuerpos. Las sondas se marcan utilizando
nucleótidos que llevan unida una molécula
(digoxigenina). A la solución se le añaden
anticuerpos específicos que se unen a esa
molécula; y estos anticuerpos llevan asociado un
compuesto luminiscente o fluorescente (Como el
CDP-Star) que deja impronta fotográfica.
Southern y Northern
Independientemente de la naturaleza de la sonda
utilizada (ADN ó ARN), las hibridaciones
efectuadas sobre ácidos nucleicos inmovilizados
en membranas o in situ, serán de tipo Southern
cuando se use ADN como diana a detectar y de
tipo Northern cuando la diana a detectar sea
mayoritariamente de ARN.
126.
SONDAS DE ADN.
DNA probes.
Las sondas genéticas son fragmentos de DNA
que reconocen segmentos de DNA de genes
individuales por homología de secuencia; de esta
manera es posible utilizar como sonda
fragmentos de DNA de un determinado gen de
una especie para buscar el mismo gen en otra
especie (sondas heterólogas).
El fragmento de DNA, puede ser de origen
sintético o natural, y se emplea, generalmente,
en experimentos de hibridación de DNA-DNA
(p ej., un Southern Blot) o DNA-RNA (p. ej., un
Northern Blot) para detectar la presencia de
moléculas de DNA o de RNA, respectivamente,
que posean una secuencia de nucleótidos similar.
La unión de la sonda al DNA problema se
detecta marcando la sonda ya sea con algún
componente radiactivo, o con algún compuesto
fluorescente que permiten una fácil detección.
Para ello, las sondas de DNA se marcan con
isótopos radiactivos (típicamente con 32P) o con
moléculas no radiactivas (p. ej., biotina o
digoxigenina).
Una alternativa al uso de las sondas, cuyo uso
está bastante generalizado, es la utilización de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Una sonda es, por tanto, un fragmento de ADN
conocido que se utiliza para averiguar si los
cromosomas investigados contienen la secuencia
complementaria.
La FDA americana ha autorizado 60 productos
diagnósticos basados en sondas de ADN que
determinan la predisposición a padecer
enfermedades. El desarrollo de ensayos de
98
Ensayos Biotecnológicos
hibridación con sondas de DNA ha supuesto una
revolución en disciplinas tan dispares como la
filogenia (permitiendo, por ejemplo, esclarecer
las relaciones de parentesco entre los seres
vivos) o la microbiología clínica (ayudando al
diagnóstico
de
ciertas
enfermedades
infecciosas).
Actualmente las sondas de ADN pueden
producirse por la técnica de PCR, en cuyo caso,
puede ser:
• Sondas de ADN de doble cadena:
Hechas mediante PCR simétrico.
• Sondas de ADN de cadena sencilla:
Hechas mediante PCR asimétrico.
127.
SONDAS DE ARN.
RNA probes.
Una sonda de ARN es un ARN preparado
usualmente por transcripción a partir de ADN
clonado, el cual es complementario de un
mARN específico o ADN y que se usa
generalmente para estudiar genes de virus,
distribución de ARN específico en tejidos y
células, integración de
ADN viral a los
genomas, transcripción, etc. En tanto es
preferible usar las sondas ADN a nivel
Salvador Camacho Garrido
macroscópico para detectar la presencia de
ADN/ARN de especies o subespecies
específicas, las sondas ARN se prefieren para
estudios genéticos. El marcaje convencional
para las sondas ARN incluyen los radioisótopos
32
P y 125I y el marcador químico biotina. Las
sondas ARN pueden dividirse por categorías en
sondas ARN de sentido +, sondas ARN de
sentido -, o sondas ARN antisentido.
128.
CHIP DE ADN.
Un chip de ADN (del inglés DNA microarrays)
es una superficie sólida a la cual se unen una
serie de fragmentos de ADN.
Las superficies empleadas para fijar el ADN son
muy variables y pueden ser vidrio, plástico e
incluso chips de silicio. Las sondas de ADN son
utilizadas para averiguar la expresión de genes,
monitorizándose los niveles de miles de ellos de
forma simultanea.
El desarrollo de técnicas de hibridación ha
llevado a la miniaturización de los filtros de
nitrocelulosa y a la utilización de matrices
microscópicas en forma de chip de ADN.
De esta manera se pueden colocar en una matriz
una inmensa cantidad de copias génicas
diferentes y mediante un proceso de hibridación
detectar todas aquéllas que tienen una secuencia
parecida. Modificando las características de las
moléculas presentes en la matriz así como
cambiando
las
sondas
utilizadas,
las
posibilidades de análisis de expresión que
proporcionan los chip de ADN son enormes.
Los chips de ADN son colecciones de
oligonucleótidos de ADN complementario
dispuestos en hileras fijadas sobre un soporte,
frecuentemente de cristal. Se utilizan para el
estudio de mutaciones de genes conocidos o para
monitorizar la expresión génica de una
preparación de ARN.
99
Ensayos Biotecnológicos
La tecnología del chip de ADN es un desarrollo
de una técnica muy usada en biología molecular,
el Southern blot.
Con esta tecnología podemos observar de forma
casi instantánea la expresión de todos los genes
del genoma de un organismo. De tal forma que
suelen ser utilizados para identificar genes que
producen ciertas enfermedades mediante la
comparación de los niveles de expresión entre
células sanas y células que están desarrollando
ciertos tipos de enfermedades.
Fabricación
Los chips de ADN son fabricados usando una
gran variedad de tecnologías. El gran desarrollo
de esta técnica ha llegado debido al uso de
robots que son los que realizan el trabajo de
alinear cada uno de los genes en puntos que se
separan unos de otros por distancias
microscópicas.
Los chips de ADN se pueden usar para detectar
ARN, que pueden o no ser traducidas a
proteínas. Los científicos se refieren a esta clase
de análisis como "análisis de expresión". En los
cuales pueden ser analizados desde diez a miles
de genes, pero cada experimento de chip de
ADN debe llevar adjunto los análisis genéticos
en paralelo. Los chips de ADNs han acelerado
de todas formas muchas investigaciones.
El uso de chips de ADN para estudiar la
expresión de diversos genes fue publicado en
1995, en la prestigiosa revista científica Science
y el primer organismo eucariota con todo el
genoma (Saccharomyces cerevisiae) dispuesto
en un chip de ADN, fue publicado en 1997 en la
misma revista.
Chips de doble canal
En este tipo de chips de ADN (Spotted
microarrays) las pruebas son oligonucleótidos,
ADN complementario (ADNc) o pequeños
fragmentos de Reacción en Cadena de la
Polimerasa, que corresponden con ARN
mensajero (ARNm). En este tipo de chip de
ADN se híbrida el ADNc de dos condiciones
que son marcados, cada uno de esas condiciones
con dos fluoróforos diferentes. Las condiciones
son mezcladas e hibridadas en el mismo chip de
ADN. Una vez realizado este primer paso se
procede al escaneo del resultado y a la
visualización del mismo. De esta forma se
pueden observar genes que se activan o se
reprimen en distintas condiciones. La
contrapartida de estos experimentos es que no se
pueden observar niveles absolutos en la
expresión.
Salvador Camacho Garrido
Chips de ADN de oligonucleótidos
En los chips de ADN de oligonuleótidos o
micromarreglos de canal único, las pruebas son
designadas a partes de una secuencia conocida o
un ARNm predicho. Estos chips de ADNs dan
estimaciones del nivel de expresión, pero
distintas condiciones no pueden ser observadas
en una misma matriz, por lo que por cada
condición se ha de utilizar un chip.
Chips de ADN para
Genotipificación
Los chips de ADN pueden ser utilizados para
"leer" las secuencias de un genoma particular en
determinadas posiciones.
Los SNP arrays son un tipo particular de
matrices que son usadas para identificar
variaciones individuales y a través de
poblaciones.
Los oligonucleotidos pequeños son capaces de
identificar polimorfismos de un sólo nucleótido
(SNPs, single nucleotide polymorphisms) que
podrían ser los responsables de variaciones
genéticas dentro de una población, la fuente de
susceptibilidad a distintas enfermedades
genéticas e incluso a ciertos tipos de cáncer.
En general, la aplicación de estas técnicas de
genotipado es forense, ya que son rápidas en
descubrir o medir la predisposición de
enfermedades o incluso permitir el uso de ciertos
medicamentos para tratar ciertas enfermedades
según sea el ADN del enfermo o donante.
Los chips de ADN de SNPs son también
utilizadas para identificación de mutaciones
somáticas en cáncer, sobre todo la perdida de
heterocigosis, la amplificación o la deleción de
100
Ensayos Biotecnológicos
regiones de ADN en el genoma individual de
pacientes afectados, es decir la detección de
aberraciones cromosómicas.
Microarray con 37.500 oligonucleótidos específicos. Arriba a la
izquierda se puede apreciar una región ampliada del chip.
129.
PCR (Polymerase Chain
Reaction).
Es un descubrimiento de B. Mullis de la empresa
Cetus y le valió el premio Nobel de Química en
1993.
Permite, partiendo de un pequeño fragmento de
DNA, obtener un gran número de copias en tan
sólo unas horas. Para ello debemos sintetizar
unos oligonucleótidos adecuados que hibriden
con el principio y el final del fragmento que
deseamos amplificar. Estos oligos actúan como
primers. La PCR consiste en incubar la muestra
de DNA con la enzima polimerasa, dNTPs y los
dos oligonucleótidos sintetizados, y esta mezcla
de ensayo se somete a una serie de ciclos de
temperatura. Por ejemplo:
Fusión
95°C
Hibridización
50-60ºC
Primer Ciclo
•
•
•
Extensión de
La cadena
75ºC
En el primer ciclo obtendremos cadenas de DNA
más largas del fragmento que se desea
amplificar, pero en los ciclos sucesivos la
muestra se irá enriqueciendo en el fragmento
deseado. En 20 ciclos de PCR puede aumentar la
secuencia deseada un millón de veces con gran
especificidad. Realmente puede considerarse la
PCR una forma de clonación molecular sin
células.
La utilización de la Taq pol (polimerasa) de la
bacteria termófila Thermus aquaticus, que no se
desnaturaliza a altas temperaturas, facilitó
mucho esta técnica, pues la polimerasa
tradicional, muy sensible a la temperatura, debe
añadirse en cada ciclo.
La PCR se ha convertido en una técnica
indispensable en una gran variedad de
aplicaciones. Como método de diagnóstico en
clínica, en medicina forense para determinar si
una muestra de pelo o esperma pertenece o no a
un individuo, para mutagénesis dirigida, o en
paleontología molecular, donde secuencias de
organismos extinguidos cuyo DNA se ha
conservado pueden amplificarse, secuenciarse y
compararse con especies contemporáneas.
También se ha conseguido amplificar el DNA de
momias egipcias.
2do Ciclo
95ºC
50 - 60ºC
75ºC
Primero: 1 minuto a 94ºC para separar
las dos cadenas.
Segundo: 1 minuto a 52ºC para que se
una los primers al DNA molde (Tm-5).
Tercero: 2 minutos a 72ºC para que
actúe la polimerasa.
Salvador Camacho Garrido
101
Ensayos Biotecnológicos
130.
TERMOCICLADOR.
•
Un termociclador, también conocido como
máquina de PCR o reciclador térmico de PCR es
un aparato usado en Biología Molecular que
permite realizar los ciclos de temperaturas
necesarios para una reacción en cadena de la
polimerasa de amplificación de ADN o para
reacciones de secuencia con el método de
Sanger.
El modelo más común consiste en un bloque de
resistencia eléctrica que distribuye a través de
una placa una temperatura homogénea durante
tiempos que pueden ser programables,
normalmente con rangos de temperatura de 4 ºC
a 96 °C.
Dado que las reacciones incubadas en el aparato
son en soluciones acuosas, suelen incluir una
placa de tapa calentada constantemente a 103°C
para evitar la condensación de agua en las tapas
de los tubos donde ocurre la reacción, y así
evitar que los solutos se concentren, que de otra
forma modificaría las condiciones óptimas para
la enzima polimerizante y la termodinámica del
apareamiento de los iniciadores.
También existen otras tecnologías menos
populares utilizando distribución de aire caliente
en tubos suspendidos, logrando el mismo
objetivo de transferir calor eficientemente a la
reacción, para que cambien los ciclos de
temperaturas
131.
REACTIVOS.
Para realizar la técnica se necesitan:
• Dexosinucleótidos trifosfato (dNTPs).
• El sustrato para polimerizar nuevo
ADN.
• Dos
cebadores
(o
primers),
oligonucleótidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras
del ADN. Son secuencias cortas, de
entre 6-40 nucleóticos (normalmente de
18-22), que son reconocidos por la
Salvador Camacho Garrido
•
•
•
•
polimerasa permitiendo iniciar la
reacción.
Deben
estar
situados
enfrentados y a no mucha distancia (no
más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN
a amplificar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio
(Mg2+), agregado comúnmente como
cloruro de magnesio (MgCl2), o algún
otro catión divalente. También se puede
emplear manganeso (Mn2+), para
mutagénesis de ADN mediante PCR, ya
que altas concentraciones de Mn2+
incrementan la tasa de error durante la
síntesis de ADN. Actúan como
cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solución tampón que mantiene el
pH adecuado para el funcionamiento de
la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas
polimerasas con temperatura óptima
alrededor de 70ºC (la más común es la
Taq polimerasa).
ADN molde, que contiene la región de
ADN que se va a amplificar.
132.
CICLO DE
AMPLIFICACIÓN.
El proceso de PCR por lo general consiste en
una serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele
consistir en 2-3 pasos de temperaturas. La PCR
común se realiza con ciclos que tienen tres pasos
de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo
están precedidos por un choque térmico
(llamado "hold") a alta temperatura (> 90°C), y
seguido por otro hold al final del proceso para la
extensión de producto final o el breve
almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran
variedad de parámetros. Éstos incluyen la
enzima usada para la síntesis de ADN, la
concentración de iones divalentes y dNTPs en la
reacción, y la temperatura de unión de los
cebadores.
Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una
temperatura de 94-96ºC (ó 98ºC si se está
usando una polimerasa termoestable extrema),
que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo
es necesario para ADN polimerasas que
requieran activación por calor.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se
102
Ensayos Biotecnológicos
separan las dos hebras de las cuales está
constituido). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (9495ºC) de la muestra la forma más habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende, por ejemplo, de la
proporción de G+C que tenga la hebra, como
también del largo de la misma. Otros métodos,
raramente empleados en la técnica de la PCR,
serían la adición de sales o agentes químicos
capaces de realizar la desnaturalización.
Alineamiento/Unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del
cebador, es decir, el cebador se unirá a su
secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 5065ºC durante 20-40 segundos (según el caso),
permitiendo así el alineamiento. Los puentes de
hidrógeno estables entre las cadenas de ADN
(unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la
secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
híbrido de la cadena molde y el cebador, y
empieza a sintetizar ADN. Los cebadores
actuarán como límites de la región de la
molécula que va a ser amplificada.
Conservación
Se lleva a cabo a 4-15°C por tiempo indefinido
para conservar la reacción a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción
de 0.2-0.5 ml, en pequeños tubos de 15-100 μl que se colocan en
el termociclador.
Extensión/Elongación de la cadena
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN
molde para sintetizar la cadena complementaria
y partiendo del cebador como soporte inicial
necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementaria a la hebra molde añadiendo los
dNTP's complementarios en dirección 5'→ 3',
uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el
grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN
creciente (la cual se extiende). La temperatura
para este paso depende de la ADN polimerasa
que usemos. Para la Taq polimerasa, la
temperatura de máxima actividad está en 7080°C (comúnmente 72°C). El tiempo de
extensión depende tanto de la ADN polimerasa
usada como de la longitud del fragmento de
ADN que se va a amplificar. Hay una regla
básica: en su temperatura óptima, la polimerasa
de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación Final
Etapa única que se lleva a cabo a una
temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura
que cualquier ADN sea totalmente ampliado.
Salvador Camacho Garrido
103
Ensayos Biotecnológicos
fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas
de electroforesis, que separan los fragmentos de
ADN generados de acuerdo a su carga, esto es,
longitud, y, en menor medida y dependiendo de
la matriz empleada, a su tamaño.
Típicamente se emplean la electroforesis en gel
de agarosa, para fragmentos grandes; en
acrilamida, para los más pequeños; y, de forma
más rápida y aplicable a la PCR asociada a
marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.
El/los tamaño/s de los productos de la PCR
vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos
de ADN de tamaño conocido, y que se corre en
el gel junto con los productos de PCR.
En la práctica, la PCR puede fallar por varias
razones, pero normalmente es por su
sensibilidad a la contaminación, que a veces
provoca la amplificación de ADN "falso". Por
esto, se han desarrollado un gran número de
técnicas y procesos para optimizar la PCR.
La contaminación con ADNs extraños puede
solucionarse con protocolos y procedimientos
que separen las reacciones pre-PCR de los
contaminantes potenciales del ADN. Esto
normalmente implica la separación espacial de
las áreas de realización de la PCR de las de
análisis o purificación de los productos de PCR,
y la limpieza exhaustiva de la superficie de
trabajo entre la realización de una PCR y la
siguiente.
Las técnicas de diseño de primers son
importantes en la mejora de la obtención de
productos de PCR y en evitar la formación de
productos falsos, y el uso de componentes
alternativos para los tampones o las enzimas
polimerasas pueden ayudar en la amplificación
de regiones de ADN largas o, de cualquier otra
forma, problemáticas.
134.
Grado de amplificación según el número de ciclos
empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto
específico, 3: producto inespecífico); B concentración de
ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la
concentración de ADN respecto del tiempo.
133.
VERIFICACIÓN Y
OPTIMIZACIÓN.
Para verificar que la PCR ha generado el
Salvador Camacho Garrido
TIPOS DE PCR.
PCR anidada
Técnica muy sensible de PCR en la que el
producto de una amplificación es utilizado como
molde para realizar una segunda amplificación
con cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR
es muy específica.
PCR in situ
PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un
portaobjetos. La PCR in situ consiste en una
reacción de PCR en secciones histológicas o
células, donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificación. En la
104
Ensayos Biotecnológicos
técnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificación de ADN blanco y luego detección
mediante hibridación in situ convencional con
sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
detectarse cantidades pequeñísimas de genoma.
Esta tecnología es de gran alcance en la
capacidad de amplificar específicamente una
población
de
secuencias
de
menor
representación.
PCR multiplex
PCR en la cual se amplifica más de una
secuencia en una misma reacción. Emplea dos o
más pares de primers en único tubo con el fin de
amplificar simultáneamente múltiples segmentos
de ADN. Consiste en combinar en una única
reacción todos los pares de primers de los
sistemas
que
queremos
amplificar
simultáneamente, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades
suficientes. Sus ventajas son que se obtiene la
información de varios loci en una sola reacción,
menor cantidad de muestra para el análisis,
menor cantidad de reactivos y rápida
construcción de base de datos.
RT- PCR
Donde el molde inicial es ARN y se requiere de
una transcriptasa inversa, como Tth, para
realizar la conversión del ARN a ADN
complementario.
PCR tiempo real
Reacción de PCR cuya principal característica es
que permite cuantificar la cantidad de ADN o
ARN presentes en la muestra original.
Se puede dividir, en las técnicas basadas en
fluorocromos no específicos y en técnicas
basadas en sondas específicas.
Variaciones de la PCR básica:
• PCR específica de alelo:
Esta técnica de diagnóstico o clonación es usada
para identificar o utilizar los polimorfismos de
una sola base (SNPs).
• PCR "assembly":
Consiste en la síntesis artificial de largas
secuencias de ADN, realizando para ello la PCR
en un fondo de oligonucleótidos largos con
secuencias solapantes cortas.
Salvador Camacho Garrido
• PCR asimétrica:
Es usada para amplificar preferentemente una
cadena del ADN original con respecto a la otra.
• PCR de colonia:
Mediante esta técnica, colonias de bacterias E.
coli pueden ser rápidamente examinadas para
construcciones viables de vectores de ADN.
• Amplificación
dependiente
de
helicasa:
Esta técnica es muy parecida a la PCR
convencional, pero en ella se emplea la enzima
helicasa y una temperatura constante en lugar de
la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de
desnaturalización-extensión.
• PCR hot-start:
Esta técnica reduce la amplificación inespecífica
durante las etapas iniciales de la PCR.
• PCR específica de intersecuencia
(ISSR):
Se trata de un método de PCR para su uso en
huella genética, que amplifica regiones entre
repeticiones de secuencia simple para producir
una huella genética única de longitudes de
fragmento amplificadas.
• PCR inversa:
Es un método usado para poder realizar la PCR
cuando sólo es conocida una secuencia interna.
Muy útil en la identificación de secuencias que
flanquean insertos genómicos.
• PCR mediada por ligación:
Este método usa pequeños linkers de ADN
ligados al ADN de interés y múltiples primers
hibridando estos linkers.
• PCR específica de metilación (MSP):
se usa para detectar mutilaciones en islas CpG
de ADN genómico.
• Amplificación dependiente de sonda
(MLPA):
Permite amplificar varias secuencias objetivo
con un único par de primers, evitando así las
limitaciones de resolución de la PCR multiplex.
• PCR cuantitativa:
Es usada para medir la cantidad de un producto
de PCR (preferentemente en tiempo real).
• PCR-tail:
La PCR termal de entrelazado asimétrico es
usada para aislar una secuencia desconocida que
flanquea una secuencia conocida.
• PCR touchdown:
Se trata de una variante de la PCR cuya finalidad
es reducir el fondo no específico bajando
gradualmente la temperatura de hibridación a lo
largo del progreso de la PCR.
• PAN-AC:
Este método usa condiciones isotermas para la
amplificación, y puede ser usado en células
vivas.
105
Ensayos Biotecnológicos
135.
PCR A TIEMPO REAL.
En la PCR a tiempo real, los procesos de
amplificación y detección se producen de
manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin
necesidad de ninguna acción posterior.
Además, mediante detección por fluorescencia
se puede medir durante la amplificación la
cantidad de ADN sintetizado en cada momento,
ya que la emisión de fluorescencia producida en
la reacción es proporcional a la cantidad de
ADN formado. Esto permite conocer y registrar
en todo momento la cinética de la reacción de
amplificación.
Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a
tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y están diseñados para poder
medir, en cualquier momento, la fluorescencia
emitida en cada uno de los viales donde se
realice la amplificación. Los sistemas de
detección por fluorescencia empleados en la
PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos:
• Agentes intercalantes
• Sondas específicas marcadas con
fluorocromos
Agentes intercalantes
Son fluorocromos que aumentan notablemente la
emisión de fluorescencia cuando se unen al
ADN de doble hélice. El más empleado en PCR
a tiempo real es el SYBR Green I.
El incremento de ADN en cada ciclo se refleja
en un aumento proporcional de la fluorescencia
emitida. Este sistema de detección tiene la
ventaja de que la optimización de las
condiciones de la reacción es muy fácil y,
además, es más barato que las sondas
específicas.
Sondas de hibridación específicas
Son sondas marcadas con dos tipos de
fluorocromos, un donador y un aceptor. El
proceso se basa en la transferencia de energía
fluorescente mediante resonancia (FRET) entre
las dos moléculas. Las más utilizadas son las
sondas de hidrólisis, denominadas también
sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y
las sondas FRET.
• Sondas de hidrólisis.
Son oligonucleótidos marcados con un
fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite
fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el
extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada
por el donador. Para que esto ocurra, las
moléculas donadora y aceptora deben estar
espacialmente próximas. Además, el espectro de
emisión de la primera se ha de solapar con el
Salvador Camacho Garrido
espectro de absorción de la segunda.
• Molecular beacons.
Son sondas parecidas a las anteriores.
Tienen una molécula donadora en el extremo 5’
y una aceptora en el extremo 3’ pero, además,
presentan una estructura secundaria en forma de
asa, en la que reside la secuencia de unión
específica con el ADN diana.
Los extremos permanecen plegados cuando la
sonda no está hibridada, lo que conlleva que
donador y aceptor estén muy cerca uno de otro.
En esta conformación la fluorescencia emitida
por el donador es absorbida por el aceptor y no
es captada por el lector del equipo. Sin embargo,
al hibridar con el ADN diana la sonda se abre,
alejándose donador y aceptor, pudiendo ser
detectada la fluorescencia emitida por el
primero.
• Sondas FRET.
El sistema se compone de dos sondas que se
unen a secuencias adyacentes del ADN diana.
Una de las sondas lleva un donador en el
extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo 5’.
Cuando las sondas están hibridadas, los dos
fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el
donador transfiere su energía al aceptor que, a su
vez, emite la fluorescencia que detecta el lector
del equipo.
En todos estos sistemas, el incremento de ADN
en cada ciclo se corresponde con un aumento de
hibridación de las sondas, lo que conlleva un
aumento en la misma proporción de
fluorescencia emitida. El empleo de sondas
garantiza la especificidad de la detección y
permite identificar polimorfismos o mutaciones
puntuales, pero su coste es más elevado que el
SYBR Green I y la optimización de las
condiciones de la reacción resulta más difícil.
Opciones de los equipos de PCR a
tiempo real
Los programas de los equipos de PCR a tiempo
real tienen diversas opciones:
1. Amplificación y detección de ADN o
ARN diana en la muestra.
2. PCR múltiple.
3. Cuantificación del ADN o ARN diana
en la muestra. Se puede cuantificar la
concentración inicial de ADN (o ARN)
diana en la muestra de manera muy
sencilla, añadiendo simplemente unos
controles externos con concentraciones
conocidas y crecientes de ADN diana
(curva patrón) en la tanda de
amplificación
4. Análisis de curvas de disociación. Se
basa en la aplicación de un gradiente de
106
Ensayos Biotecnológicos
temperaturas creciente después de la
PCR para monitorizar la cinética de
disociación
de
los
fragmentos
amplificados.
Ventajas de la PCR a tiempo real
La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real
es su rapidez, puesto que no se necesita ningún
proceso adicional de detección. Si el equipo
empleado es el Light Cycler o equivalente, esta
ventaja todavía es más acusada, pudiéndose
completar el proceso de amplificación y
detección en 30-40 min. Además, gracias a su
rapidez, estos equipos se pueden rentabilizar al
máximo, permitiendo un flujo mucho mayor de
muestras y de ensayos.
Otra ventaja muy importante de la PCR a tiempo
real es, que al utilizar sistemas cerrados, el
riesgo de contaminación disminuye de forma
muy importante. Los sistemas a tiempo real
permiten cuantificar la concentración inicial de
ácido nucleico presente en las muestras de
manera mucho más sencilla, más precisa y sobre
todo en un rango mucho mayor que en los
procedimientos convencionales.
Asimismo, la determinación de mutaciones
puntuales que pueden estar relacionadas con
resistencias a medicamentos antimicrobianos o
con factores de virulencia, es mucho más fácil.
Los equipos para PCR a tiempo real tienen una
capacidad muy elevada ya que en el mismo
instrumento se pueden llevar a cabo ensayos
cualitativos, cuantitativos, determinación de
mutaciones, PCR múltiple, etc., mientras que
para los procedimientos convencionales se
requieren múltiples equipos.
136.
PCR AUTOMATIZADA EN
TIEMPO REAL.
Supone:
• Ajuste automatizado reproducible
• Puesta en marcha rápida y precisa de la
PCR en tiempo real
• Reduce el volumen de reacción a 5 μl
• Reduce el número de replicados
• Aumento de rendimiento
• Pipeteo con mayor precisión de 1 a
1.000 µl
Salvador Camacho Garrido
Aplicación Informática
Diseño de la placa
La organización de las múltiples ventanas de
visualización, así como las opciones intuitivas
de selección dentro de cada ventana, permite una
configuración fácil y rápida al crear ensayos.
Datos en crudo
Este módulo del software del Mastercycler ep
realplex hace posible observar los datos en
crudo generados en tiempo real, lo que significa
que se puede evaluar inmediatamente PCR en
tiempo real e interrumpir la reacción en cuanto
se haya obtenido el resultado esperado.
107
Ensayos Biotecnológicos
Cuantificación/Cuantificación relativa
Cuantificación
absoluta
de
ADN
o
cuantificación relativa basada en el método
DDCt. Los valores Ct son calculados con el
procedimiento CalQplex™ de Eppendorf de
gran exactitud.
Ensayo +/–
Los valores umbrales se pueden definir a través
de esta opción del módulo de análisis para
permitir la diferenciación entre muestras
positivas y negativas (por ejemplo, para la
detección de patógenos).
Los datos procedentes de las medidas previas del
punto final sirven como fuente para tales
determinaciones.
Identificación génica
La selección de esta opción genera resultados de
discriminación alélica.
137.
APLICACIONES DE LA
PCR.
La técnica de la PCR tiene multitud de
aplicaciones: ya en ciencia básica, como
herramienta de detección y/o generación de
acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en
ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí
mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico.
Punto final
La opción del módulo de análisis para las
medidas del punto final hace que el Mastercycler
ep realplex sirva de “fluorímetro de placas”, y
ayuda en la determinación de las intensidades de
fluorescencia absoluta, sin importar el método
previo de amplificación de ADN.
Salvador Camacho Garrido
Investigación
La PCR convencional se emplea como base para
multitud de técnicas en el laboratorio debido a
su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de
punto final permite controlar y detectar los
fragmentos de ADN de interés.
108
Ensayos Biotecnológicos
•
Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con
cebadores que contienen una secuencia apta para la
recombinación dirigida con un plásmido.
Una aplicación de la PCR de extrema
importancia es la clonación de secuencias de
ADN en vectores, como pueden ser los
plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que
contienen en su extremo 5' una corta secuencia
que permite la interacción posterior con otra
complementaria situada en el vector de
clonación a emplear. Por ejemplo, se puede
incluir una diana de restricción en dichos
cebadores, de modo que, y si ésta no existía
previamente en el fragmento y es única en el
vector, pueda efectuarse una ligación mediante
la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de
restricción apropiada de ambos elementos. Otro
método asimilable a esta vía es el empleo de la
recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5'
de los cebadores una secuencia que faculta a una
recombinasa la recombinación dirigida con un
vector dado.
Medicina
En
medicina,
la
PCR
se
emplea
fundamentalmente como herramienta de
diagnosis:
• Permite genotipar la especie o especies
que provocan un determinado cuadro
infeccioso: para ello, se amplifica una
zona del genoma bacteriano cuyo
producto de PCR posea unas
características de tamaño o temperatura
de fusión que permitan identificarlo de
forma inequívoca. En el caso de
infecciones virales que implican la
integración del genoma del patógeno en
el ADN del hospedador, como es el caso
de la infección por VIH, la PCR
cuantitativa posibilita la determinación
Salvador Camacho Garrido
•
de la carga viral existente y por tanto,
del estadio de la enfermedad.
La PCR también se puede usar en
revisiones médicas rutinarias, como en
los servicios de donantes de sangre, para
test de rutina. A través de esta técnica se
pueden detectar infecciones peligrosas
en el donante (como VIH o Hepatitis B)
mientras aún están en el periodo de
incubación. Dada la sensibilidad de los
test de PCR se pueden tomar muestras
colectivas o "pools" (por ejemplo, 96
pruebas individuales). Si una de estas
muestras colectivas da positivo, se
toman a partir de ella muestras
progresivamente menores hasta que se
encuentra el causante.
El diagnóstico de enfermedades
hereditarias presentes en el genoma es
un proceso largo y complicado que
puede acortarse
significativamente
gracias a la PCR. Cada uno de los genes
prueba se pueden amplificar mediante
sus
correspondientes
primers
y
posteriormente secuenciar para detectar
la existencia de mutaciones.
Paleontología, antropología
biológica, y ciencias forenses
Los campos de la paleontología, antropología
biológica y la medicina y antropología forense
se han visto enormemente beneficiados por esta
técnica, puesto que todas ellas construyen con
frecuencia
el
conocimiento
de
sus
correspondientes disciplinas gracias a restos o
huellas de seres vivos. Uno de los materiales
biológicos que más información puede
proporcionar es el ADN.
La relativa estabilidad de éste permite que,
aunque fragmentado, se conserve durante largos
periodos de tiempo si las condiciones son
propicias. En ocasiones las muestras, intactas
con las que se puede contar son
extraordinariamente
pequeñas
o
están
deterioradas. La PCR soluciona ambos
problemas y proporciona cantidades útiles para
posteriores pasos de análisis. En primer lugar
aumenta la cantidad de material recuperado a
partir de muestras escasas, puesto que como ya
se dijo anteriormente, en teoría basta una sola
molécula para que el proceso pueda tener lugar.
También debido a la naturaleza de la técnica y su
propósito de amplificación de fragmentos
pequeños, esta fragmentación no impide que este
ADN pueda ser empleado como molde para una
reacción de PCR.
• En Paleontología y Antropología la PCR
109
Ensayos Biotecnológicos
•
permite recuperar las escasas cantidades
de ADN que aún no se han degradado.
Algunos lugares en que el ADN podría
preservarse son, la brea, las cenizas
volcánicas, el ámbar, hielos históricos
polares o glaciares, muestras de
ambientes áridos, sedimentos, así como
en los cristales de apatita de restos de
esqueleto, siendo posible de ese modo
caracterizar cadáveres, fósiles u otros
restos mediante genotipado por análisis
de microsatélites; o incluso genomas de
taxones extintos, amplificados de este
modo, como pueden ser los realizados
mediante el ADN genómico del hombre
de Neanderthal. El propósito sería
utilizar este ADN amplificado para
posteriormente
realizar
estudios
filogenéticos o etnográficos o de
poblaciones mediante la comparación de
secuencias de ADN, o el estudio de las
causas de la separación evolutiva de dos
especies.
En las ciencias forenses se emplea para
establecer la filiación de una persona o
para obtener pruebas, a partir de
muestras mínimas, dejadas por el autor
de un crimen como saliva, semen u otros
restos de tejidos.
Agronomía y diversidad
Tal y como la PCR multiplex permite producir
huellas genéticas de individuos concretos, dentro
del marco de la genética forense, existen
métodos basados en la PCR que permiten
discernir entre grupos infraespecíficos de
cultivos de interés agronómico; por ejemplo, de
cultivares.
Para ello, se emplean oligonucleótidos de un
tamaño lo suficientemente pequeño como para
que
“ceben”
de
forma
relativamente
inespecífica, aunque siempre de tal forma que
produzcan un patrón de bandas discreto e
interpretable.
De este modo, la pauta obtenida tras la
electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar
a los individuos de mayor semejanza, que
poseen un comportamiento similar, de los que
divergen.
138.
MARCADORES
MOLECULARES.
Los marcadores moleculares son biomoléculas
que se pueden relacionar con un rasgo genético.
Las biomoléculas que pueden ser marcadores
moleculares son las proteínas (antígenos e
Salvador Camacho Garrido
isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o
fragmentos
de
secuencia
y
función
desconocida). Cuando varios marcadores
moleculares se asocian inequívocamente con un
rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci
de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un
marcador molecular monomórfico es invariable
en todos los organimos estudiados, pero cuando
presenta diferencias en el peso molecular,
actividad enzimática, estructura, o sitios de
restricción, se dice que es polimórfico. A veces
el grado de variación es tal que se denominan
hipervariable.
Los primeros marcadores desarrollados a finales
de los 70 se basaron en la identificación de
proteínas e isoenzimas por electroforesis en
geles de almidón o poliacrilamida. Con ellos se
abrió el conocimiento de la estructura y
heterogeneidad genética entre diferentes
especies, variedades y poblaciones de distinto
origen geográfico. Pero esta técnica tenía una
limitación muy importante: no era capaz de
detectar
suficiente
polimorfismo
entre
variedades o especies próximas debido a que las
proteínas son el resultado de la expresión génica,
que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de
una etapa de desarrollo a otra, de un medio
ambiente a otro, y de una época del año a otra.
Los avances de la tecnología del DNA
recombinante han permitido el desarrollo de los
marcadores moleculares basados en el DNA,
consiguiendo estabilidad en la identificación de
especies y variedades.
El número de técnicas descritas es cada vez más
numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3
categorías:
• RFLP
• MAAP
• STS
Las aplicaciones de los marcadores moleculares
son muy diversas y es de esperar que cada vez se
les encuentren nuevos usos.
Por ahora se vienen empleando en la
diferenciación de individuos, discriminación
entre
clones,
análisis
filogenéticos
y
taxonómicos,
“mapeo”
de
genomas,
cuantificación de variabilidad génica intra e inter
específica, mejoras genéticas, detección de
infecciones o propensión a sufrirlas, localización
de resistencia a enfermedades, y dispersión de
especies.
RFLP
Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos
de restricción.
Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se
basa en la detección de fragmentos de DNA de
110
Ensayos Biotecnológicos
distinto peso molecular (por digestión con la
misma enzima de restricción) en diferentes
organismos. Los fragmentos más fáciles de
analizar son los ¿pequeños? derivados de la
digestión del genoma de las mitocondrias o los
cloroplastos,
puesto
que
delecciones,
sustituciones o mutaciones pueden alterar
significativamente el patrón de bandas
identificable por electroforesis en geles de
agarosa, donde migran de acuerdo con su peso
molecular. En cambio, para moléculas de DNA
de mayor tamaño, como el DNA cromosómico,
el patrón de bandas es tan complejo que es
necesario utilizar sondas específicas para
visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la
técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA
para esta técnica suelen corresponder a genes
previamente conocidos, aunque a veces se usan
DNA preparados a partir de amplificaciones
inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un
tipo de polimorfismo en cada ensayo, el
resultado es muy preciso. Los primeros mapas
genómicos basados en la distribución física de
los genes en vez de la frecuencia de
entrecruzamiento se hicieron utilizando esta
técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de
sondas radiactivas para visualizar los
polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP.
MAAP
Múltiples
perfiles
arbitrarios
de
amplificación.
Término genérico acuñado en 1994 con el que se
designan
las
técnicas
que
emplean
oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas
dactilares complejas. Entre estas técnicas cabe
destacar:
• RAPD (DNA polimórfico amplificado al
azar): Es una de las técnicas más
versátiles desde que se desarrolló en el
año 1990. Se usa una colección de
decanucleótidos para amplificar por
PCR áreas específicas distribuidas al
azar por el genoma. Su pequeñez y la
baja temperatura de alineamiento (36°C)
aseguran que se unen a infinidad de
secuencias en el genoma para conseguir
amplificar muchos fragmentos de DNA.
Estos fragmentos se pueden separar en
geles de agarosa para obtener perfiles
electroforéticos que variarán según el
polimorfismo de los distintos individuos
o
grupos
de
individuos,
y
proporcionarán una huella dactilar
característica. Es muy cómoda, rápida,
requiere poco DNA (que además no
necesita estar muy puro), no presupone
Salvador Camacho Garrido
•
•
conocimientos
previos
sobre
la
secuencia, y se pueden distinguir rápida
y simultáneamente muchos organismos.
Sus inconvenientes son que los
fragmentos amplificados no suelen
corresponder a DNA ligado a algún
carácter, sino al redundante, y que no da
información sobre el número de copias
que el DNA genómico contiene de la
secuencia amplificada. Esta tecnología
ha sido utilizada para la catalogación de
frutos, selección de variedades, y
diferenciación de líneas clonales.
También se está utilizando para el
análisis de las variedades de apio, uva,
limón y olivo.
AP-PCR (PCR con oligonucleótidos
arbitrarios): La idea es similar a la de la
RAPD, desarrollándose a la vez que
ésta, aunque se cambia el diseño de los
oligonucleótidos y el tipo de PCR. Los
oligonucleótidos han de ser largos (no
menos de 20 nt), y la PCR consta dos de
ciclos de baja astringencia (poco
específicos)
que
permite
la
polimerización de una batería de
fragmentos característicos de cada
variedad. Esta fase va seguida de ciclos
de alta astringencia para amplificar
(visualizar) específicamente las bandas
anteriores. Los fragmentos amplificados
se pueden hacer migrar en un gel de
agarosa para observar las grandes
diferencias entre especies, o bien se
puede marcar radiactivamente y hacer
migrar en gel de poliacrilamida para
obtener resultados mucho más finos y
precisos.
Existe
una
variación
denominada DAF (Huellas dactilares
por amplificación de DNA) que utiliza
oligonucleótidos de 5 a 15 bases, pero
las huellas proporcionadas suelen ser
muy complejas y difíciles de interpretar.
AFLP (Polimorfismo de la longitud de
los fragmentos amplificados): Esta
técnica se desarrolló en 1995 y combina
el uso de enzimas de restricción y
oligonucleótidos para PCR, de manera
que se obtienen marcadores moleculares
muy específicos sin necesidad de
conocer la secuencia con anterioridad.
El DNA se corta con dos enzimas de
restricción, una de corte muy frecuente,
y otra de corte poco frecuente. A los
fragmentos se les ligan oligonucleótidos
de extremos compatibles con las
enzimas usadas y se amplifica por PCR.
111
Ensayos Biotecnológicos
Jugando con la complementariedad del
oligonucleótido y con el sitio de
restricción se puede disminuir o
aumentar el número de bandas
amplificadas. Una ventaja especial de
esta técnica es que es capaz de generar
muchos marcadores moleculares en una
sola reacción. Por eso el resultado debe
resolverse en un gel de poliacrilamida
de alta resolución, puesto que no se
resolverían en agarosa. Esta técnica ya
se ha usado con éxito en patatas y
cebada.
STS
Sitios etiquetados por la secuencia.
• SSLP (Polimorfismo de longitud en las
secuencias discretas): Desarrollada a
partir de 1989, aprovecha las secuencias
conocidas, únicas dentro del genoma,
para amplificarlas por PCR. El
polimorfismo se suele encontrar
fácilmente cuando lo que se amplifican
son intrones en lugar de exones. La
ventaja principal es la velocidad con la
que se pueden realizar los análisis una
vez que las parejas de oligonucleótidos
se han establecido claramente. Por tanto
se combinan la rapidez de la RAPD con
la especificidad de la RFLP. Por la
manera en que se determinan los
oligonucleótidos y por la forma de
analizar los polimorfismos, esta técnica
ha derivado en otras que enumeramos a
continuación.
• SSR
(Repetición
de
secuencias
discretas): Descrita en 1989. En los
genomas existe un DNA ubicuo y
abundante denominado microsatélite
que consiste en mono-, di-, tri- y
tetranucleótidos repetidos en tándem.
Este DNA, que es muy polimórfico, se
ha utilizado como marcador molecular
cuando la secuencia del motivo repetido
se clona y secuencia para usarla en el
análisis de poblaciones. De esta manera
se han estudiado con éxito numerosos
árboles, aunque en algunos se ha visto
que los microsatélites son menos
variables de lo que se esperaba. Otras
siglas para designar esta técnica son
ISSR, IMA, ISA, IRA, y RAMP.
• EST (Sitios etiquetados por la
expresión): Descrita en 1991. Su
particularidad proviene del hecho que
los oligonucleótidos se han deducido a
partir de cDNA parcial o completamente
Salvador Camacho Garrido
•
•
•
•
secuenciado.
Curiosamente
el
polimorfismo
sólo
se
observa
claramente cuando los fragmentos
amplificados se cortan con enzimas de
restricción, lo que hace que el método
sea realmente costoso en tiempo y
dinero.
CAPS
(Secuencia
polimórfica
amplificada y cortada): Descrita en
1993. Los fragmentos amplificados se
someten a una restricción enzimática y
se migra en un gel de agarosa. Las
variaciones se detectan por presencia o
ausencia de sitios de restricción. Se
pueden así localizar cambios finos en
una zona específica.
SCAR
(Regiones
amplificadas
caracterizadas
y
secuenciadas):
Descrita en 1993. Esta técnica
aprovecha que las RAPD proporcionan
principalmente fragmentos de DNA
altamente repetido. Estos fragmentos de
RAPD se clonan y secuencian para
elaborar oligonucleótidos específicos.
Aunque permite el desarrollo rápido de
marcadores moleculares, el grado de
polimorfismo obtenido es bastante bajo.
D/TGGE (Geles de electroforesis en
gradiente
desnaturalizante/térmico):
Descrita
en
1987. Analiza
el
polimorfismo a través de la estabilidad,
a distintas condiciones desnaturalizantes
o
de
temperaturas,
del
DNA
amplificado. Su principal problema
reside en las dificultades técnicas para
mantener estables las condiciones
experimentales.
SSCP (Polimorfismo de conformaciones
monocatenarias): Descrita en 1989. Esta
técnica se basa en el análisis del
polimorfismo a través de las diferencias
conformacionales de fragmentos de
DNA monocatenario. Las distintas
conformaciones son detectables como
un cambio de movilidad en geles de
poliacrilamida no desnaturalizante. Es
especialmente útil cuando las reacciones
de PCR producen bandas de DNA de
gran tamaño (en general superior a 15
kpb) o bien bandas de tamaño muy
próximo. Puede llegar a distinguir
cambios de pocos nucleótidos en una
secuencia de más de 1 kpb. Se está
utilizando para caracterizar árboles de
interés forestal.
112
Ensayos Biotecnológicos
139.
BIOINFORMÁTICA.
La bioinformática, según una de sus definiciones
más sencillas, es la aplicación de tecnología de
computadores a la gestión y análisis de datos
biológicos.
Los
términos
bioinformática,
biología
computacional y, en ocasiones, biocomputación,
son utilizados en muchas situaciones como
sinónimos y hacen referencia a campos de
estudios interdisciplinarios muy vinculados, que
requieren el uso o el desarrollo de diferentes
técnicas que incluyen informática, matemática
aplicada, estadística, ciencias de la computación,
inteligencia artificial, química y bioquímica,
para solucionar problemas, analizar datos, o
simular sistemas o mecanismos, todos ellos de
índole biológica, y usualmente (pero no de
forma exclusiva) en el nivel molecular.
El núcleo principal de estas técnicas se
encuentra en la utilización de recursos
computacionales para solucionar o investigar
problemas sobre escalas de tal magnitud que
sobrepasan el discernimiento humano. La
investigación en biología computacional se
solapa a menudo con la biología de sistemas.
Los principales esfuerzos de investigación en
estos campos incluyen el alineamiento de
secuencias, la predicción de genes, montaje del
genoma, alineamiento estructural de proteínas,
predicción de estructura de proteínas, predicción
de la expresión génica, interacciones proteínaproteína, y modelado de la evolución.
Una constante en proyectos de bioinformática y
biología computacional es el uso de
herramientas
matemáticas
para
extraer
información útil de datos producidos por
técnicas biológicas de alta productividad, como
la secuenciación del genoma. En particular, el
montaje o ensamblado de secuencias genómicas
de alta calidad desde fragmentos obtenidos tras
la secuenciación del ADN a gran escala es un
área de alto interés.
Otros objetivos incluyen el estudio de la
regulación genética para interpretar perfiles de
expresión génica utilizando datos de chips de
ADN o espectrometría de masas.
Salvador Camacho Garrido
Alineamiento de diferentes proteínas de hemoglobina.
El alineamiento de secuencias biológicas es una de las
herramientas básicas de la bioinformática.
140.
PRINCIPALES ÁREAS DE
INVESTIGACIÓN.
Análisis de secuencias
Con la creciente cantidad de datos, desde hace
mucho se ha vuelto poco práctico analizar
secuencias de ADN manualmente. Hoy se usan
programas de computadora para estudiar el
genoma de miles de organismos, conteniendo
miles de millones de nucleótidos. Estos
programas pueden compensar mutaciones (con
bases intercambiadas, borradas o insertadas) en
la secuencia de ADN, para identificar secuencias
que están relacionadas, pero que no son
idénticas. Una variante de este alineamiento de
secuencias se usa en el proceso de
secuenciación.
La secuenciación conocida como "shotgun" (o
por perdigonada) fue usada, por ejemplo, por el
Instituto de Investigación Genómica -The
Institute for Genomic Research, TIGR, hoy J.
Craig Venter Institute- para secuenciar el primer
genoma de bacteria (Haemophilus influenzae).
No da una lista secuencial de nucleótidos, pero
en cambio nos ofrece las secuencias de miles de
pequeños fragmentos de ADN (cada uno de
aproximadamente 600 a 800 nucleótidos de
largo). Las terminaciones de estos fragmentos se
superponen y, cuando son alineados de la
manera correcta, constituyen el genoma
completo del organismo en cuestión.
La secuenciación shotgun proporciona datos de
secuencia rápidamente, pero la tarea de
ensamblar los fragmentos puede ser bastante
complicada para genomas muy grandes.
En el caso del Proyecto Genoma Humano, llevó
varios meses de tiempo de procesador (en una
estación DEC Alpha de alrededor del 2000) para
ensamblar los fragmentos. El shotgun
sequencing es el método de elección para todos
los genomas secuenciados hoy en día y los
algoritmos de ensamblado genómico son un área
crítica de la investigación en bioinformática.
Otro aspecto de la bioinformática en análisis de
secuencias es la búsqueda automática de genes y
113
Ensayos Biotecnológicos
secuencias reguladoras dentro de un genoma. No
todos los nucleótidos dentro de un genoma son
genes. Dentro del genoma de organismos más
avanzados, grandes partes del ADN no sirven a
ningún propósito obvio. Este ADN, conocido
como "ADN basura", puede, sin embargo,
contener elementos funcionales todavía no
reconocidos.
La bioinformática sirve para estrechar la brecha
entre los proyectos de genoma y proteoma (por
ejemplo, en el uso de secuencias de ADN para
identificación de proteínas).
Mapa del cromosoma X del ser humano (extraído de la página
web del NCBI). La transcripción del genoma humano es uno
de los mayores logros de la bioinformática.
Anotación de genomas
En el contexto de la genómica, anotación es el
proceso de marcado de los genes y otras
características biológicas de la secuencia de
ADN.
El primer sistema software de anotación de
genomas fue diseñado en 1995 por Owen White,
quien fue miembro del equipo que secuenció y
analizó el primer genoma en ser descodificado
de un organismo independiente, la bacteria
Haemophilus influenzae. White construyó un
software para localizar los genes (lugares en la
secuencia de DNA que codifican una proteína),
el ARN de transferencia, y otras características,
así como para realizar las primeras atribuciones
de función a esos genes.
La mayoría de los actuales sistemas de anotación
genómica trabajan de forma similar, pero los
programas disponibles para el análisis del
genoma se encuentran en continuo cambio y
Salvador Camacho Garrido
mejora.
Biología evolutiva computacional
La Biología evolutiva es el estudio del origen
ancestral de las especies, así como de su cambio
a través del tiempo. La informática ha apoyado a
los biólogos evolutivos en diferentes campos
clave. Ha permitido a los investigadores:
• Seguir la evolución de un alto número
de organismos midiendo cambios en su
ADN,
en
lugar
de
hacerlo
exclusivamente mediante su taxonomía
física u observaciones fisiológicas.
• Más recientemente, ha permitido
comparar genomas completos, lo que
permite el estudio de eventos evolutivos
más complejos, tales como la
duplicación de genes, la transferencia
horizontal de genes, o la predicción de
factores significativos en la especiación
bacteriana.
• Construir modelos computacionales
complejos de poblaciones para predecir
el resultado del sistema a través del
tiempo.
• Seguir y compartir información sobre un
amplio y creciente número de especies y
organismos.
Los esfuerzos futuros se centrarán en reconstruir
el cada vez más complejo árbol filogenético de
la vida.
El área de investigación de las ciencias de la
computación que utiliza algoritmos genéticos se
confunde ocasionalmente con la Biología
evolutiva computacional, pero ambas áreas no
guardan relación.
Medición de la biodiversidad
La biodiversidad de un ecosistema puede
definirse como el conjunto genómico completo
de todas las especies presentes en un medio
ambiente particular, sea este una biopelícula en
una mina abandonada, una gota de agua de mar,
un puñado de tierra, o la biosfera completa del
planeta Tierra. Se utilizan bases de datos para
recoger los nombres de las especies, así como de
sus descripciones, distribuciones, información
genética, estado y tamaños de las poblaciones,
necesidades de su hábitat, y cómo cada
organismo interactúa con otras especies.
Se usa software especializado para encontrar,
visualizar y analizar la información; y, lo que es
más importante, para compartirla con otros
interesados. La simulación computacional puede
modelar cosas tales como dinámica poblacional,
o calcular la mejora del acervo genético de una
114
Ensayos Biotecnológicos
variedad (en agricultura), o de una población
amenazada (en biología de la conservación). Un
potencial muy excitante en este campo es la
posibilidad de preservar las secuencias
completas del ADN, o genomas, de especies
amenazadas de extinción, permitiendo registrar
los resultados de la experimentación genética de
la Naturaleza in silico para su posible
reutilización futura, aún si tales especies fueran
finalmente perdidas.
Análisis de la expresión génica
La expresión génica de muchos genes puede
determinarse por la medición de niveles de
mRNA mediante múltiples técnicas, incluyendo
chips de ADN, secuenciación de EST (Expressed
Sequence Tag), análisis en serie de la expresión
génica (Serial Analysis of Gene Expression SAGE), MPSS o diversas aplicaciones de
hibridación in situ.
Todas estas técnicas son extremadamente
propensas al ruido y/o sujetas a sesgos en la
medición biológica, y una de las principales
áreas de investigación en la biología
computacional trata del desarrollo de
herramientas estadísticas para separar la señal
del ruido en los estudios de expresión génica con
alto volumen de procesamiento. Estos estudios
se usan a menudo para determinar los genes
implicados en un desorden: podrían, por
ejemplo, compararse datos de microarrays de
células epiteliales cancerosas con datos de
células no cancerosas para determinar las
transcripciones que son activadas o reprimidas
en una población particular de células
cancerosas.
Análisis de la regulación
La regulación génica es la compleja
orquestación de eventos que comienzan con una
señal extracelular tal como una hormona, que
conducen a un incremento o decremento en la
actividad de una o más proteínas. Se han
aplicado técnicas bioinformáticas para explorar
varios pasos en este proceso. Por ejemplo, el
análisis del promotor de un gen implica la
identificación y estudio de las secuencias motivo
en los alrededores del ADN de la región
codificante de un gen. Estos motivos influyen en
el alcance según el cual esa región se transcribe
en ARNm. Los datos de expresión pueden usarse
para inferir la regulación génica: podrían
compararse datos de microarrays provenientes
de una amplia variedad de estados de un
organismo para formular hipótesis sobre los
genes involucrados en cada estado. En un
Salvador Camacho Garrido
organismo unicelular, podrían compararse etapas
del ciclo celular a lo largo de variadas
condiciones de estrés (choque de calor,
inanición, etc.). Podrían aplicarse, entonces,
algoritmos de agrupamiento (algoritmos de
clustering, o análisis de cluster) a esa
información de expresión para determinar qué
genes son expresados simultáneamente. Por
ejemplo, los promotores de estos genes se
pueden buscar según la abundancia de
secuencias o elementos regulatorios.
Análisis de la expresión de
proteínas
Los microarrays de proteínas y la espectrometría
de masas de alto rendimiento pueden
proporcionar una instantánea de las proteínas
presentes en una muestra biológica. La
bioinformática está muy comprometida en dar
soporte
a
ambos
procedimientos.
La
aproximación a los microarrays de proteínas
encara similares problemas a los existentes para
microarrays destinados a ARNm, mientras que
para la espectrometría de masas el problema es
casar grandes cantidades de datos de masa
contra masas predichas por bases de datos de
secuencias de proteínas, además del complicado
análisis estadístico de muestras donde se
detectan múltiples, pero incompletos, péptidos
de cada proteína.
Análisis de mutaciones en el
cáncer
En el cáncer, los genomas de las células
afectadas son reordenados en complejas y/o aún
impredecibles maneras. Se realizan esfuerzos
masivos de secuenciación para identificar
sustituciones individuales de bases (o puntos de
mutación de nucleótidos) todavía desconocidos
en una variedad de genes en el cáncer. Los
bioinformáticos continúan produciendo sistemas
automatizados para gestionar el importante
volumen de datos de secuencias obtenido, y
crean nuevos algoritmos y software para
comparar los resultados de secuenciación con la
creciente colección de secuencias del genoma
humano y de los polimorfismos de la línea
germinal.
Se están utilizando nuevas tecnologías de
detección física, como los microarrays de
oligonucleótidos para identificar pérdidas y
ganancias cromosómicas (técnica denominada
hibridación genómica comparativa), y los arrays
de polimorfismos de nucleótido simple para
detectar puntos de mutación conocidos.
Otro tipo de datos que requiere novedosos
115
Ensayos Biotecnológicos
desarrollos informáticos es el análisis de las
lesiones encontradas de forma recurrente en
buen número de tumores, principalmente por
análisis automatizado de imagen clínica.
Predicción de la estructura de las
proteínas
Alineamiento estructural de tiorredoxinas del ser
humano y mosca del vinagre. Las proteínas se muestran
como cintas, con la proteína humana en rojo y la de la
mosca en amarillo. Generado con PDB 3TRX y 1XWC.
La predicción de la estructura de las proteínas es
otra importante aplicación de la bioinformática.
La secuencia de aminoácidos de una proteína,
también llamada estructura primaria, puede ser
determinada fácilmente desde la secuencia de
nucleótidos sobre el gen que la codifica.
En ausencia de mejores términos, la información
estructural de las proteínas se clasifica
usualmente como estructura secundaria, terciaria
y cuaternaria. Una solución general viable para
la predicción de tales estructuras permanece
todavía como problema abierto. Por ahora, la
mayoría de los esfuerzos han sido dirigidos
hacia heurísticas que funcionan la mayoría de
las veces.
Una de las ideas clave en bioinformática es la
noción de homología. En la rama genómica de la
bioinformática, se usa la homología para
predecir la función de un gen: si la secuencia de
gen A, cuya función es conocida, es homóloga a
la secuencia de gen B, cuya función es
desconocida, puede inferirse que B podría
compartir la función de A.
En la rama estructural de la bioinformática, la
homología se usa para determinar qué partes de
una proteína son importantes en la formación de
la estructura y en la interacción con otras
proteínas. En la técnica denominada modelado
por homología, esta información se usa para
predecir la estructura de una proteína una vez
Salvador Camacho Garrido
conocida la estructura de una proteína
homóloga. Esta es, actualmente, la única vía
para predecir estructuras de proteínas de una
manera fiable.
Otras técnicas para predecir la estructura de las
proteínas incluyen el enhebrado de proteínas
(protein threading) y el modelado de novo
(desde cero), basado en las características físicas
y químicas.
Al respecto, pueden verse también motivo
estructural (structural motif) y dominio
estructural (structural domain).
Genómica comparativa
El núcleo del análisis comparativo del genoma
es el establecimiento de la correspondencia entre
genes (análisis ortólogo) o entre otras
características
genómicas
de
diferentes
organismos. Estos mapas intergenómicos son los
que hacen posible rastrear los procesos
evolutivos responsables de la divergencia entre
dos genomas. Una multitud de eventos
evolutivos actuando a diferentes niveles
organizativos conforman la evolución del
genoma.
Al nivel más bajo, las mutaciones puntuales
afectan a nucleótidos individuales. Al mayor
nivel, amplios segmentos cromosómicos
experimentan
duplicación,
transferencia
horizontal, inversión, transposición, borrado e
inserción. Finalmente, los genomas enteros están
involucrados en procesos de hibridación, etc.,
conduciendo a menudo a una súbita especiación.
La complejidad de la evolución del genoma
plantea muchos desafíos excitantes a
desarrolladores de modelos matemáticos y
algoritmos, quienes deben recurrir a un espectro
de técnicas algorítmicas, estadísticas y
matemáticas que se extienden desde exactas,
heurísticas, con parámetros fijados, y mediante
algoritmos de aproximación para problemas
basados en modelos de parsimonia.
Modelado de sistemas biológicos
La biología de sistemas implica el uso de
simulaciones por ordenador de subsistemas
celulares (tales como redes de metabolitos y
enzimas que comprenden el metabolismo,
caminos de transducción de señales, y redes de
regulación genética), tanto para analizar como
para visualizar las complejas conexiones de
estos procesos celulares.
La vida artificial o la evolución virtual tratan de
entender los procesos evolutivos por medio de la
simulación por ordenador de sencillas formas de
vida (artificial).
116
Ensayos Biotecnológicos
Análisis de imagen de alto
rendimiento
Se están usando tecnologías de computación
para acelerar o automatizar completamente el
procesamiento, cuantificación y análisis de
grandes cantidades de imágenes biomédicas con
alto contenido en información. Los modernos
sistemas de análisis de imagen incrementan la
habilidad del observador para realizar análisis
sobre un amplio o complejo conjunto de
imágenes, mejorando la precisión, la objetividad
(independencia de los resultados según el
observador), o la rapidez. Un sistema de análisis
totalmente desarrollado podría reemplazar
completamente al observador. Aunque estos
sistemas no son exclusivos del campo de las
imágenes biomédicas, cada vez son más
importantes tanto para el diagnóstico como para
la investigación. Algunos ejemplos:
• Cuantificación y localización subcelular
con alta productividad y precisión.
• Morfometría.
• Análisis y visualización de imágenes
clínicas.
• Determinación de patrones en el flujo
del aire en tiempo real de la respiración
pulmonar de animales vivos.
• Cuantificación del tamaño de la oclusión
a través de imágenes en tiempo real,
tanto por desarrollo como por
recuperación, de lesiones arteriales.
• Realización
de
observaciones
conductuales basadas en prolongadas
grabaciones en vídeo de animales de
laboratorio.
• Observaciones en infrarrojo para la
determinación
de
la
actividad
metabólica.
Acoplamiento proteína-proteína
En las últimas dos décadas, decenas de miles de
estructuras tridimensionales de proteínas han
sido determinadas por cristalografía de rayos X
y espectroscopía mediante resonancia magnética
nuclear de proteínas (RMN de proteínas). Una
cuestión central para los científicos es si resulta
viable la predicción de posibles interacciones
proteína-proteína solamente basados en esas
formas 3D, sin realizar experimentos
identificativos de estas interacciones. Se han
desarrollado una variedad de métodos para
enfrentarse al problema del acoplamiento
proteína-proteína, aunque parece que queda
todavía mucho trabajo en este campo.
Salvador Camacho Garrido
141.
HERRAMIENTAS.
Las herramientas software para bioinformática
van desde simples herramientas de línea de
comandos hasta complejos programas gráficos y
autónomos situados en compañías de
bioinformática, en servicios web o en
instituciones públicas.
Software
La más conocida herramienta de biología
computacional
entre
los
biólogos
es,
probablemente, BLAST, un algoritmo para
determinar la similitud de secuencias arbitrarias
con otras secuencias, probablemente residentes
en bases de datos de proteínas o de secuencias
de ADN.
El NCBI (National Center for Biotechnology
Information, EE.UU.), por ejemplo, proporciona
una implementación muy utilizada, basada en
web, y que trabaja sobre sus bases de datos.
Para alineamientos múltiples de secuencias, el
clásico ClustalW, actualmente en su versión 2,
es el software de referencia. Puede trabajarse
con una implementación del mismo en el EBI
(Instituto Europeo de Bioinformática).
BLAST y ClustalW son sólo dos ejemplos de los
muchos programas de alineamiento de
secuencias disponibles. Existe, por otra parte,
multitud de software bioinformático con otros
objetivos: alineamiento estructural de proteínas,
predicción de genes, predicción de estructura de
proteínas, predicción de acoplamiento proteínaproteína, o modelado de sistemas biológicos,
entre otros.
Servicios Web
Se han desarrollado interfaces basadas en SOAP
117
Ensayos Biotecnológicos
(siglas de Simple Object Access Protocol), que
es un protocolo estándar que define cómo dos
objetos en diferentes procesos pueden
comunicarse por medio de intercambio de datos
XML y en REST (Representational State
Transfer,
transferencia
de
estado
representacional) para una amplia variedad de
aplicaciones bioinformáticas, permitiendo que
una aplicación, corriendo en un ordenador de
cualquier parte del mundo, pueda usar
algoritmos, datos y recursos de computación
alojados en servidores en cualesquiera otras
partes del planeta. Las principales ventajas
radican en que el usuario final se despreocupa de
actualizaciones y modificaciones en el software
o en las bases de datos.
integradores y extensibles para la gestión del
flujo de trabajo bioinformático.
Los servicios bioinformáticos básicos, de
acuerdo a la clasificación implícita del EBI,
pueden clasificarse en:
• Servicios de obtención de información
en línea (consultas a bases de datos, por
ejemplo).
• Herramientas de análisis (por ejemplo,
servicios que den acceso a EMBOSS).
• Búsquedas
de
similitudes
entre
secuencias (servicios de acceso a
FASTA o BLAST, por ejemplo).
• Alineamientos múltiples de secuencias
(acceso a ClustalW o T-Coffe).
• Análisis estructural (acceso a servicios
de alineamiento estructural de proteínas,
por ejemplo).
• Servicios de acceso a literatura
especializada y ontologías.
La disponibilidad de estos servicios web basados
en SOAP a través de sistemas tales como los
servicios de registro, (servicios de distribución y
descubrimiento de datos a través de servicios
web) demuestra la aplicabilidad de soluciones
bioinformáticas basadas en web. Estas
herramientas varían desde una colección de
herramientas autónomas con un formato de
datos común, y bajo una única interface
autónoma o basada en web, hasta sistemas
Salvador Camacho Garrido
118
Ensayos Biotecnológicos
TEMA VI. APLICACIONES DE LA
TECNOLOGÍA DEL ADN
142.
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE.
Las moléculas de ADN producidas mediante la
unión de dos o más fragmentos de ADN se
denominan
Moléculas
de
ADN
Recombinantes.
Hasta las postrimerías de 1970, el ADN era una
molécula que presentaba amplias dificultades
para su análisis bioquímico. Su gran longitud y
monotonía hacían que la secuencia de
nucleótidos pudiese sólo ser estudiada mediante
mecanismos indirectos. Para esto se recurría a la
determinación de la secuencia de las proteínas o
del ARN.
Hoy la situación ha cambiado por completo y el
ADN ha pasado a ser una de las moléculas más
fáciles de estudiar. Mediante las técnicas que ya
hemos visto es factible separar regiones
determinadas del ADN, obtenerlas en grandes
cantidades y determinar su secuencia de
nucleótidos a una velocidad de varios cientos de
nucleótidos al día. También se nos hace posible
alterar un gen (sometido a ingeniería) y
transferirlo a células en cultivo o a la línea
germinal de animales, donde el gen modificado
se incorpora como parte funcional y permanente
del genoma.
La tecnología del ADN recombinante constituye
una suma de técnicas siendo las más
importantes:
• La rotura específica del ADN mediante
nucleasas de restricción, que facilita el
aislamiento y la manipulación de los
genes individuales.
• La secuenciación rápida de todos los
nucleótidos de un fragmento purificado
de ADN, que posibilita determinar los
límites de un gen y la secuencia de
aminoácidos que codifica.
• La hibridación de los ácidos nucleicos
que hace posible localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN,
utilizando la capacidad que tienen estas
moléculas de unirse a secuencias
complementarias de otros ácidos
nucleicos.
• La clonación del ADN, mediante la cual
se puede conseguir que un fragmento de
ADN se integre en un elemento génico
autorreplicante (plásmido o virus) que
habita en una bacteria, de tal manera que
Salvador Camacho Garrido
•
una molécula simple de ADN puede ser
producida generando muchos miles de
millones de copias idénticas.
La ingeniería genética mediante la cual
se pueden alterar secuencias de ADN
produciendo versiones modificadas de
los genes, los cuales se pueden insertar a
células u organismos.
143.
APLICACIONES.
La biotecnología es, en su definición más
amplia, el conjunto de técnicas y herramientas
que permite la modificación de organismos
vivos o parte de los mismos, transformación de
materiales vivos o inertes, usando procesos que
implican formas vivas, con el propósito de
producir nuevo conocimiento y/o desarrollar
procesos, productos y servicios.
La gran variedad de técnicas existentes en el
sector biotecnológico y la constante aparición de
nuevas tecnologías, han provocado el carácter
horizontal y multisectorial de la bioempresa
actual.
Las diferentes técnicas pueden integrarse en un
conjunto de plataformas tecnológicas que a su
vez sirven de base para las diferentes áreas de
actividad existentes en la biotecnología.
Entre las principales plataformas se encuentran
la genómica, proteómica y bioinformática, que a
base de la exploración de las secuencias de ADN
o ARN de los organismos y la caracterización de
las estructuras de las correspondientes proteínas
y sus funciones, permiten importantes avances
en las distintas áreas de la biotecnología.
Alrededor de este núcleo de tecnologías se
agrupan dos grandes sectores:
• Salud humana y animal
• Agroalimentación y medio ambiente
Estos dos sectores se dividen a su vez en varios
subsectores (salud humana, salud animal,
alimentación, agricultura y medio ambiente),
siguiendo la clasificación con los distintos
segmentos (diagnóstico, tratamiento preventivo,
biorremediación, etc.).
El sector de la salud humana y animal incluye
empresas cuyas principales actividades residen
en el desarrollo de productos y servicios
destinados al tratamiento, la prevención o el
diagnóstico de enfermedades (producción de
vacunas, antibióticos, fármacos, kits de
diagnóstico, etc.).
Otros segmentos que han surgido recientemente
son los xenotrasplantes, la fármaco-genómica y
la ingeniería celular y de tejidos.
Entre las principales actividades que realizan
estas compañías, dentro de la agroalimentación y
medio ambiente, figura la elaboración de
119
Ensayos Biotecnológicos
alimentos
con
técnicas
biotecnológicas
tradicionales (empresas vitivinícolas, industria
quesera, etc.) o innovadoras (alimentos
funcionales, nutracéuticos, novel food), la
mejora
de
cultivos
y
semillas,
la
biorremediación, el reciclaje, el tratamiento de
residuos y la limpieza de sitios contaminados
por actividades industriales, etc.
144.
CLASIFICACIÓN DE LAS
APLICACIONES.
Además de las aplicaciones analíticas como la
identificación de proteínas y microorganismos y
la identificación y cuantificación de agentes
tóxicos y mutagénicos, cuya importancia hace
que las tratemos de forma diferenciada, las
aplicaciones de la biotecnología son numerosas
y se suelen clasificar como:
• Biotecnología roja:
Se aplica a la utilización de la biotecnología en
procesos médicos. Algunos ejemplos son el
diseño de organismos para producir antibióticos,
el desarrollo de vacunas más seguras y nuevos
fármacos, los diagnósticos moleculares, las
terapias regenerativas y el desarrollo de la
ingeniería genética para curar enfermedades a
través de la manipulación génica.
• Biotecnología blanca:
También
conocida
como
biotecnología
industrial, es aquella aplicada a procesos
industriales. Un ejemplo de ello es el diseño de
microorganismos para producir un producto
químico o el uso de enzimas como catalizadores
industriales, ya sea para producir productos
químicos valiosos o destruir contaminantes
químicos peligrosos (por ejemplo utilizando
oxidorreductasas). También se aplica a los usos
de la biotecnología en la industria textil, en la
creación de nuevos materiales, como plásticos
biodegradables y en la producción de
biocombustibles. Su principal objetivo es la
creación de productos fácilmente degradables,
que consuman menos energía y generen menos
desechos
durante
su
producción.
La
biotecnología blanca tiende a consumir menos
recursos que los procesos tradicionales
utilizados para producir bienes industriales.
• Biotecnología verde:
Es la biotecnología aplicada a procesos
agrícolas. Un ejemplo de ello es el diseño de
plantas transgénicas capaces de crecer en
condiciones ambientales desfavorables o plantas
resistentes a plagas y enfermedades. Se espera
que la biotecnología verde produzca soluciones
más amigables con el medio ambiente que los
métodos tradicionales de la agricultura
industrial. Un ejemplo de esto es la ingeniería
Salvador Camacho Garrido
genética en plantas para expresar plaguicidas,
con lo que se elimina la necesidad de la
aplicación externa de los mismos, como es el
caso del maíz Bt. Si los productos de la
biotecnología verde como éste son más
respetuosos con el medio ambiente o no, es un
tema de debate.
• Biotecnología azul:
También llamada biotecnología marina, es un
término utilizado para describir las aplicaciones
de la biotecnología en ambientes marinos y
acuáticos. Aún en una fase temprana de
desarrollo sus aplicaciones son prometedoras
para la acuicultura, cuidados sanitarios,
cosmética y productos alimentarios.
• Biotecnología gris:
La biotecnología gris se aplica a las tecnologías
medioambientales. Aquí los procedimientos
biotecnológicos ayudan al saneamiento del
suelo, el tratamiento de las aguas residuales, la
depuración de los gases de escape y de los gases
contaminantes, así como el reciclaje de los
desechos y sustancias residuales.
Algunos autores la consideran dentro de la
biotecnología blanca.
145.
BIOTECNOLOGÍA ROJA.
La biotecnología roja es aquella aplicada a la
salud humana y animal.
Entre las aplicaciones más importantes se
encuentran:
• Diagnóstico molecular y biosensores:
Se basa en la detección de marcadores
moleculares, sensibles y específicos, presentes
en los seres vivos que sean indicadores de
alguna característica del estado fisiológico del
cuerpo (patologías y enfermedades, estados de
estrés celular…). Esto permite un diagnóstico
precoz, comprobar el estado de la enfermedad e
incluso la elección del mejor tratamiento. Entre
los marcadores presentes se encuentran
marcadores genéticos (variedades genéticas que
predisponen a ciertas enfermedades, como el
cáncer), proteínicos (enzimas que silencian
genes o están defectuosas…) o moleculares
120
Ensayos Biotecnológicos
(productos secundarios del metabolismo…).
Para esto se utilizan microarrays, tanto de genes
como de proteínas o oligonucleótidos, técnicas
inmunohistoquímicas… De esta forma se
implanta la llamada “medicina personalizada”,
donde se administra la droga adecuada, con la
concentración y lugar precisos, gracias al estudio
genético, proteínico e histológico del paciente.
• Ingeniería celular y de tejidos:
Se basa en la producción de células y tejidos que
sustituyan a aquellos que están degradados, se
han extirpado o han perdido su función, por lo
que se considera también medicina regenerativa.
Para ello utilizan el conocimiento de la
ingeniería genética, cultivos celulares, células
madre…
•
Proteínas
recombinantes
anticuerpos monoclonales:
y
Se basa en la utilización de las células como
herramientas para producir fármacos de forma
barata y eficiente. En base a estas tecnologías se
han podido descubrir y producir multitud de
sustancias con capacidad terapéutica.
• Terapia génica:
Se basa en la modificación del material genético
de las células (sólo en la línea somática y no la
germinal,
totalmente
prohibida
en
la
legislación), para aumentar, sustituir, disminuir o
silenciar la expresión de ciertos genes y sus
respectivas proteínas resultantes, en pos de curar
alguna enfermedad o característica fisiológica no
deseada.
• Nuevas dianas terapéuticas, nuevos
fármacos y nuevas vacunas:
De la mano de otras áreas de la biotecnología se
han podido descubrir nuevos fármacos (a partir
de librerías naturales del mundo marino, de
plantas o animales) que tienen capacidad
terapéutica en dianas de enfermedades ya
conocidas o nuevas (receptores de membrana,
enzimas o los propios genes). De la misma
forma, se están descubriendo nuevas vacunas
más eficaces para todo tipo de enfermedades,
como las llamadas vacunas recombinantes, que
utilizan sólo las partes que confieren inmunidad
al cuerpo sin tener que utilizar el patógeno en su
totalidad.
• Nuevos sistemas de administración de
fármacos y vacunas:
Gracias a la implantación de la nanotecnología y
al avance de la química, disponemos de nuevas y
prometedoras formas de administrar fármacos y
vacunas. Por ejemplo, la administración
controlada de fármacos, que sólo se liberan ante
unas circunstancias muy determinadas, a la
concentración adecuada y sólo en la zona
afectada.
Salvador Camacho Garrido
•
Genética de poblaciones y fármaco
genética:
Consiste en el estudio de la distribución y
evolución de la variabilidad genética entre los
individuos de una o varias poblaciones, lo que
hace que respondan, junto con las variables
ambientales, de forma diferente a las
enfermedades y a las distintas terapias. De esta
forma se puede obtener valiosa información
sobre las distintas variables genéticas y su
relación con las enfermedades y con la respuesta
a sus distintas terapias (para así conseguir una
“medicina personalizada”).
146.
BIOTECNOLOGÍA BLANCA.
El término “biotecnología blanca” hace
referencia a la rama de la biotecnología dedicada
a optimizar los procesos industriales, buscando
reemplazar a las tecnologías contaminantes por
otras más limpias o amigables con el ambiente.
Básicamente, emplea organismos vivos y
enzimas para obtener productos más fáciles de
degradar, y que requieran menos energía y
generen menos desechos durante su producción.
El uso de enzimas o biocatalizadores es uno de
los avances más significativos en el área de la
biotecnología blanca. Las ventajas de su uso
residen en la alta selectividad y eficiencia de las
enzimas en comparación con los procesos
químicos. Mientras los procesos químicos
convencionales requieren alta presión y alta
temperatura, los microorganismos y sus enzimas
trabajan a presión y temperaturas normales.
Además, las enzimas son biodegradables y
muchas de ellas pueden funcionar en solventes
orgánicos, alta concentración de sales y otras
condiciones extremas. Las enzimas hoy se
aplican a prácticamente todas las industrias,
incluyendo la farmacéutica, alimentaria,
química, textil, de detergentes, del papel, etc.
Los detergentes son probablemente el mejor
ejemplo de cómo el empleo de enzimas reduce
los costos, ya que el lavado sin enzimas requiere
casi el doble de energía que el lavado con
enzimas. En la industria textil, se estima que la
incorporación de enzimas al lavado reduce el
consumo de energía y de agua en un 50%.
121
Ensayos Biotecnológicos
Entre otros aspectos podemos considerar:
• Nuevos materiales:
Gracias al estudio de las rutas enzimáticas de los
seres vivos y vías de transformación novedosas,
se están produciendo todo tipo de nuevos
materiales, biodegradables o no y más eficientes.
Tal es el caso de los bioplásticos, nuevos tejidos,
materiales para la construcción (como tela de
araña), etc.
• Energía:
Teniendo en cuenta la futura falta de
combustibles fósiles y de la contaminación que
estos crean en nuestro medio ambiente, se está
empezando una revolución en lo concerniente a
la producción de combustibles renovables
utilizando técnicas biológicas. Tal es el caso del
bioetanol y el biodiesel o el uso de la biomasa.
•
Química:
Los
avances
en
los
conocimientos
biotecnológicos está permitiendo realizar
transformaciones químicas de una forma más
eficiente y efectiva, utilizando enzimas, o
células enteras, diseñadas para optimizar
transformaciones conocidas y otras aún por
conocer, que da lugar a productos de química
básica (como el hidrógeno), biomateriales (como
el propanodiol) y de química fina o bioquímica
(como las vitaminas).
• Factorías celulares y bioprocesos:
Utilizando las células como factorías y el estudio
de los diferentes bioprocesos, se están
produciendo todo tipo de productos de una
forma más eficiente o novedosa. Como nuevas
enzimas para detergentes, degradación o
conservación de materiales, vitaminas, proteínas
recombinantes aplicados a la salud o a la
alimentación…
•
Mejora de los procesos industriales:
Gracias a la eficiencia de los procesos
biológicos, la biotecnología ambiental logra
optimizar procesos industriales tradicionales, o
el desarrollo y la generación de otros nuevos
(por ejemplo el uso de la bacteria Thiobacillus
ferrooxidans en los procesos de extracción del
cobre y oro). La biotecnología aplicada a la
industria de papel y celulosa también es un buen
ejemplo de biotecnología blanca. Durante el
Salvador Camacho Garrido
tratamiento de la madera, la eliminación de la
lignina requiere de altas temperaturas y de
tratamientos con oxígeno y cloro, que dan como
resultado la formación de derivados clorados
tóxicos.
Como alternativa puede emplearse el
"biopulping", un tratamiento con xilanasas,
enzimas que degradan el xilano de la
hemicelulosa, eliminando la lignina a la que está
asociada.
Muchos
investigadores
están
intentando también disminuir (o modificar) el
contenido de lignina por modificación genética
de los árboles destinados a la producción de
papel y celulosa. En este sentido cabe mencionar
también la obtención de patata y mandioca
transgénicas para la obtención de almidón con
más amilopectina, óptima para esta industria.
La biotecnología blanca es una tecnología clave
para el desarrollo de la denominada
bioeconomía que esencialmente pretende entre
sus objetivos básicos la transformación del
conocimiento que aportan las ciencias de la vida
en productos nuevos, sostenibles, ecoeficientes y
competitivos. Para lograrlo hay que combinar de
forma óptima los procesos biotecnológicos con
los procesos bioquímicos clásicos y nuevos,
especialmente en la producción de sustancias de
la química básica, de los materiales y de los
biocarburantes, entre otros.
147.
BIOTECNOLOGÍA VERDE.
La biotecnología verde produce mejoras de la
competitividad en los sectores agrícola,
ganadero y forestal, incrementando la
productividad y resistencia de las especies y
variedades, tanto vegetales como animales. Se
ha generado centenares de biopesticidas que
mejoran los rendimientos agrícolas y
122
Ensayos Biotecnológicos
disminuyen nuestra dependencia de pesticidas
tradicionales.
El reemplazo parcial de fertilizantes y
plaguicidas químicos por agentes biológicos
también puede considerarse parte de la
biotecnología blanca aplicada a la actividad
agropecuaria.
Por otro lado, los biofertilizantes y los
inoculantes biológicos son una alternativa a los
fertilizantes químicos. La primera generación de
estos biofertilizantes son bacterias de la rizosfera
fijadoras de nitrógeno que se encuentran
naturalmente en las raíces de las leguminosas.
La biotecnología también puede proporcionar
piensos con mejores cualidades nutricionales
para mantener la sostenibilidad de la producción
ganadera, así como nuevos productos para la
alimentación humana con propiedades no sólo
nutricionales, sino también farmacéuticas,
conocidos como productos nutracéuticos.
Finalmente, las plantas y animales transgénicos
también pueden ser utilizados como biofactorías
para la producción de numerosos productos
especializados.
Como ejemplos, cabe mencionar el uso de:
• Microorganismos libres o simbiontes
para la fijación de nitrógeno.
• Baculovirus, virus que infectan y matan
a las orugas que parasitan a los cultivos
de soja y otras leguminosas.
• Esporas
del hongo Metarhizium
anisopliae para combatir la cigarrita de
la hoja de la caña de azúcar o la broca
de los cítricos.
• Toxinas de la bacteria Bacillus
thuringiensis o Bt, en sus varias
formulaciones, e incluso formando parte
de cultivos genéticamente modificados
para resistir el ataque de insectos (como
el maíz y el algodón Bt).
Las actividades más importantes las podemos
clasificar en:
• Cultivo in vitro de plantas:
Estas técnicas permiten producir, en condiciones
de laboratorio, plantas completas a partir de
fragmentos muy pequeños de partes de las
plantas como hojas, raíces o tallos e incluso a
partir de una única célula vegetal. De este modo
se pueden producir plantas idénticas a las
seleccionadas y libres de agentes patógenos en
un tiempo reducido.
• Producción vegetal asistida por
marcadores moleculares:
Consiste en el empleo de marcadores
moleculares para seleccionar una determinada
característica de interés. Un marcador molecular
es una secuencia de ADN de longitud corta que
Salvador Camacho Garrido
se encuentra estrechamente ligada a la
característica de interés cuya selección permite
seleccionar el rasgo deseado.
• Hibridación:
En ocasiones, la descendencia procedente del
cruce de dos variedades o especies diferentes
suele tener características deseadas. Este
fenómeno se conoce como “vigor híbrido” y
suele dar lugar a plantas de mayor
productividad.
• Biofertilizantes y biopesticidas:
Los biofertilizantes y biopesticidas permiten
sustituir pesticidas químicos que pueden
contener sustancias contaminantes y dar lugar a
efectos indeseables sobre los cultivos.
• Ingeniería genética de plantas y
animales:
La ingeniería genética permite transferir de
forma selectiva genes de un organismo a otro
dando lugar a nuevos cultivos vegetales, nuevos
animales o nuevas materias. Existen multitud de
cultivos vegetales que han sido modificados
genéticamente como el algodón, el maíz y la
soja.
• Alimentos funcionales:
Son aquellos que, sin tener capacidad
terapéutica, mejoran el estado de salud o
previenen frente a ciertas enfermedades
(vitaminas, fibra, antioxidantes, probióticos…).
Cada vez están mas presentes en multitud de
alimentos cotidianos.
148.
ORGANISMOS
MODIFICADOS GENÉTICAMENTE.
La biotecnología verde, al contrario de lo que
podría parecer por su denominación, ha sido
objeto de una fuerte oposición por parte de los
colectivos ecologistas. Debido al fuerte rechazo
que han suscitado las plantas transgénicas en
dichos colectivos y en sectores amplios de la
sociedad, las plantas transgénicas han sido
objeto de una gran atención mediática.
Durante los últimos diez años, los términos
"biotecnología",
"organismo
modificado
genéticamente" (OMG) o "transgénico" han
irrumpido en la vida cotidiana de los ciudadanos
de nuestro país. Cuando estos términos se usan
en la producción de fármacos no suelen crear
polémicas ni conflictos, sino esperanza y
confianza. Por el contrario, su uso en agricultura
y alimentación genera de entrada, rechazos y
desconfianza. En buena medida, esta situación
parte de que la comunidad científica y la
sociedad entienden bajo estos términos
conceptos muy distintos. En el fondo de todo
ello existe un retraso muy generalizado entre los
últimos avances de la genética, que se han
123
Ensayos Biotecnológicos
producido a un ritmo vertiginoso durante los
últimos dos decenios, y el conocimiento social
de los mismos.
Desde que en el Neolítico comenzó la
agricultura y la ganadería, la especie humana ha
utilizado la genética en la mejora de los cultivos
y los animales de granja. Durante miles de años
lo hizo de una forma empírica, sin tener un
conocimiento de aquello que manipulaba. Hace
apenas ciento cincuenta años que Gregor
Mendel demostró que tenían que existir unas
estructuras físicas, posteriormente denominadas
genes, responsables de la herencia y tan solo
cincuenta años que conocemos que los genes de
cualquier organismo vivo están hechos de unas
moléculas denominadas ADN. Pero esa falta de
conocimientos no ha evitado que el hombre, de
forma inconsciente, usara sobre todo dos
técnicas genéticas, la mutación y el cruce sexual,
en la mejora agroalimentaria. En la primera de
ellas uno de los miles de genes que forman el
genoma de un organismo cambia al azar y, bien
deja de ejercer su función natural o lo hace de
una forma exagerada o nueva. La mutación suele
ser espontánea y es la base de la llamada
variabilidad natural que no es más que la
aparición de mutantes, ej. Las naranjas sin
pepitas. En la segunda técnica, denominada
hibridación por quienes se han ocupado de la
mejora genética, se mezclan los miles de genes
de los genomas de dos organismos parentales
para generar una descendencia portadora de
combinaciones de los genes de ambos. En los
dos casos se persigue encontrar un mutante o un
descendiente que tenga características más
adecuadas a la aplicación perseguida, ej. Las
diferentes razas caninas.
Tanto la mutación como el cruce sexual son el
fundamento de metodologías en las que el azar
juega un papel primordial. Hace apenas treinta
años distintos grupos de investigadores
desarrollaron procedimientos para aislar genes
concretos de un genoma. Al conjunto de esas
técnicas, y de otras consistentes en analizar
genes aislados, modificarlos e introducirlos en el
organismo original o en uno distinto, se le
denomina ingeniería genética. La gran diferencia
entre esta técnica y las anteriormente descritas
radica en dos aspectos: cuando se emplean
técnicas de ingeniería genética se manejan genes
aislados perfectamente identificados en los que
es posible introducir mutaciones en puntos
concretos, y dirigir su localización a zonas
específicas de los cromosomas.
Por "transgénico" la comunidad científica
entiende un organismo que porta en su genoma
genes provenientes del genoma de otro
Salvador Camacho Garrido
organismo. La sociedad entiende el concepto
como artificial.
Todo lo anterior ha dado lugar a que en
ocasiones la biotecnología verde se emplee
como sinónimo de la modificación genética de
plantas y ha eclipsado el resto de aplicaciones de
la biotecnología en el campo de la agricultura.
149.
Se ha creado:
TIPOS DE OMG.
Bacterias y levaduras transgénicas
Consiste en la misma idea, aplicada a los
encargados de modificar alimentos (producción
de vino, cerveza, queso…), de forma que se
produzcan alimentos
con características
especiales
(mejores
características
organolépticas, nuevas sustancias, mayor rango
de tolerancia ambiental…) o mejorar la
producción (crecimiento más rápido, mejor
eficacia enzimática…).
Plantas transgénicas
Gracias a los avances en ingeniería genética, es
posible crear plantas transgénicas, a partir de la
variedad de especies de plantas agrícolas, con
multitud de nuevas capacidades: resistencia a
plagas y pesticidas, resistencias a factores
ambientales (sequías, salinidad, falta de luz…),
aumento de la productividad o aceleración del
crecimiento, contenido nutricional mejorado
(con mayor cantidad de ciertas sustancias o
presencia de las mismas cuando antes esa planta
no las poseía), plantas como biofarmacias (con
presencia de sustancias terapéuticas), etc. Las
posibilidades comerciales y de desarrollo son
amplísimas, con una importante direccionalidad
a paliar los problemas de los países en vías de
desarrollo (como el llamado “arroz dorado”).
Las plantas transgénicas son plantas cuyo
genoma ha sido modificado mediante ingeniería
genética.
La transgénesis ha permitido obtener variedades
con características agronómicas de interés. Este
es el caso de las variedades de cultivos
resistentes a plagas, cultivos resistentes a
herbicidas o resistentes a condiciones
ambientales adversas. El caso de variedad
transgénica resistente a plagas más conocido es
el del maíz Bt que porta el transgén de la
proteína Cry de la bacteria Bacillus thurigiensis.
Esta proteína resulta tóxica para una de las
principales plagas del maíz, el “taladro”, siendo
inocua para mamíferos, aves e insectos no diana.
De este modo, el maíz Bt es más resistente a la
plaga del “taladro” que se alimenta del tallo y las
124
Ensayos Biotecnológicos
hojas del cultivo creando galerías (que son vía
de entrada para hongos productores de
micotoxinas) lo que da lugar a cultivos más
productivos y con un mejor estado sanitario.
Una segunda generación de plantas transgénicas
ha ido dirigida a la obtención de plantas con
características nutricionales y organolépticas
mejoradas. Este es el caso del “arroz dorado”,
una variedad de arroz que acumula betacaroteno
y otros carotenos precursores de la vitamina A
en su semilla. Dicho cultivo fue desarrollado con
la financiación de la Fundación Rockefeller, el
Instituto Federal Suizo de Tecnología (Zurich),
el programa Biotech de la Comunidad Europea y
la Oficina Federal Suiza de Educación y Ciencia
con el objetivo de proporcionar los aportes de
vitamina A extra a las poblaciones que no
consumen la suficiente cantidad de esta vitamina
imprescindible en su dieta diaria.
Hay que tener en cuenta que la falta de vitamina
A en la población infantil tiene graves
consecuencias y se estima que cada año
alrededor de 500.000 niños en todo el mundo
pierden la vista a causa del déficit de vitamina A
en el Sudeste de Asia y ciertas áreas de África y
Latinoamérica. En todas estas zonas, el arroz es
el alimento básico.
Existe una tercera generación de plantas
transgénicas menos conocida que las anteriores
debido a que su impacto mediático ha sido más
reducido.
Estas
plantas
se
modifican
genéticamente con el objetivo de producir
compuestos de interés como tal. Dichas plantas
funcionan como biofactorías de compuestos de
alto valor añadido de aplicación en el campo
farmacéutico, biosanitario o industrial.
Animales transgénicos
Se han obtenido o podrían obtenerse para
diversas aplicaciones animales transgénicos que
expresen un solo gen introducido, con una serie
de posibles beneficios para la producción de
alimentos o la salud humana. Dichos animales
están en diversas etapas de evolución. Las
primeras solicitudes de aprobación de animales
transgénicos para la producción de alimentos
corresponden a varias especies de peces que
expresan genes introducidos de la hormona del
crecimiento.
La producción de mamíferos transgénicos para
la agricultura es difícil y costosa, debido sobre
todo a su baja tasa de reproducción y la
fecundación y desarrollo internos. Muchos
individuos transgénicos iniciales son un mosaico
para el transgén, es decir, lo tienen en algunas
células, pero no en todas. Por ello, la obtención
de mamíferos transgénicos para la agricultura se
Salvador Camacho Garrido
ha retrasado. Sin embargo, los núcleos de células
cultivadas transformadas o de células
transformadas procedentes de un animal
mosaico se pueden utilizar como material
donante para la clonación de células somáticas
con intervención de transferencia nuclear,
obteniéndose individuos que son transgénicos en
todas sus células. Este sistema se podría utilizar
en último término para producir líneas
transgénicas destinadas a la producción de
alimentos, como se está haciendo ya para la
obtención
de
cerdos
destinados
a
xenotrasplantes, en los que se han de expresar
varios transgenes e inactivar varios genes del
huésped.
Así sus aplicaciones son:
• Producción de animales mejorados
• Mejor calidad de los productos
• Productos novedosos
• Bioindicadores
• Salud humana
• Sanidad animal
• Lucha biológica
150.
BIOTECNOLOGÍA AZUL.
La biotecnología azul o biotecnología marina y
de acuicultura presenta algunas de las
aplicaciones más claras como son: el diseño de
vacunas más efectivas que disminuyan la
mortalidad de los peces por enfermedades
infecciosas, y eviten la administración de
medicamentos costosos y poco efectivos; la
caracterización de marcadores genéticos
asociados a características de interés comercial,
que permita la selección de reproductores que
tuvieran en su ADN las características deseadas.
La biotecnología azul es muy influyente en la
acuicultura, que es la cría o cultivo de
organismos acuáticos para tener una mayor
producción. Para esto es necesario un estudio
minucioso de la forma de cultivo y engorde,
cría, dietas y patrones alimenticios, patologías,
consecuencias en el entorno, etc.
En síntesis, la biotecnología azul se ocupa de los
nuevos productos que se pueden obtener de la
explotación de la biodiversidad marina. El 80%
de los seres vivos del mundo se encuentran en
ecosistemas acuáticos que reúnen por tanto, gran
parte de la biodiversidad del planeta.
Asimismo, los organismos marinos concentran
un número muy elevado de compuestos
125
Ensayos Biotecnológicos
químicos diferentes, algunos de los cuales son
novedosos para la ciencia. Toda esta
biodiversidad y diversidad química conducirá al
desarrollo de nuevos productos en áreas de
aplicación diversas.
“La biotecnología azul se ocupa de los nuevos
productos que se pueden obtener de la
explotación de la biodiversidad marina”.
Entre otras ocupaciones, podemos destacar:
• Materias primas de origen marino:
Los productos de origen marino están
introducidos en muchos sectores industriales
entre los que cabe destacar el sector alimentario,
sanitario y la agricultura. Los tres principales
grupos de productos son las algas y sus
derivados, la quitina y el quitosano procedente
del caparazón de los crustáceos, y las vitaminas,
colorantes y lípidos derivados de microalgas.
Las algas marinas son la fuente de la que se
extraen tres hidrocoloides muy importantes que
se emplean en varios sectores como el agar, los
alginatos y el carragenano.
En segundo lugar, la quitina y el quitosano se
emplean habitualmente en sanidad en
cicatrización de heridas, en elaboración de
alimentos, para envoltorios de uso alimentario,
para la floculación de impurezas en líquidos, y
en agricultura como acondicionadores de suelos.
En último lugar, las microalgas son una fuente
de productos de interés como los surfactantes,
betacarotenoides
y
ácidos
grasos
poliinsaturados.
• Alimentos,
aditivos alimentarios,
nutracéuticos
y
suplementos
nutricionales:
Los productos de origen marino son
ampliamente utilizados en el sector alimentario
desde hace tiempo. En concreto, el agar, los
alginatos y el carragenano, mencionados en el
punto anterior, se emplean como agentes
gelificantes en productos lácteos y alimentos
preparados.
“El 80% de los seres vivos del mundo se
encuentran en ecosistemas acuáticos y los
organismos marinos concentran un número muy
elevado de compuestos químicos diferentes,
algunos de los cuales son novedosos para la
ciencia”.
Los alimentos funcionales constituyen una
categoría de productos en crecimiento y en
ocasiones incorporan productos de origen
marino como ácidos grasos poliinsaturados, y
productos concentrados procedentes de animales
o plantas acuáticas. En el campo de los
alimentos bajos en calorías y grasas, los
productos de origen marino pueden jugar un
papel importante debido al poder “saciante” y
Salvador Camacho Garrido
bajo contenido calórico.
• Productos cosméticos:
Las algas marinas proporcionan varios
ingredientes que se emplean en la formulación
de productos cosméticos como encapsuladores
de principios activos, antioxidantes e
ingredientes cosméticos bioactivos. En concreto,
los protectores solares y los agentes reparadores
son áreas de interés creciente para la industria
cosmética que está buscando compuestos con
dichas actividades en el mar.
• Productos farmacéuticos:
Gran parte de los fármacos disponibles son
productos naturales o compuestos derivados de
sustancias naturales (análogos sintéticos o
semisintéticos). Debido a la gran biodiversidad y
diversidad química de los océanos, los
compuestos de origen marino constituyen una
fuente interesante de compuestos bioactivos.
De hecho, se han obtenido multitud de
compuestos bioactivos a partir de invertebrados
marinos y microbios que muestran actividad
sobre células humanas.
El principal reto que se encuentran los biólogos
marinos y los químicos es que en la actualidad
se pueden aislar una elevada cantidad de
compuestos
novedosos
procedentes
de
invertebrados marinos. Estudiar todas estas
moléculas, y sus actividades, es muy complicado
y requiere de nuevos desarrollos en aislamiento,
identificación, caracterización y técnicas de
screening.
• Equipamiento
médico
y
biomateriales:
En la medicina actual, se emplean compuestos
biocompatibles tanto de origen sintético como
natural. Los hidrocoloides de origen natural
marino como el quitosano, la quitina, los
alginatos y los corales se emplean como
biomateriales de uso rutinario en medicina.
De hecho, los productos de origen marino se
emplean como biomateriales de uso quirúrgico y
como componentes de aparatos de uso
ortopédico y cardiovascular. Asimismo, los
ingredientes de origen marino se pueden
emplear como excipientes y componentes de
formulación de fármacos.
• Terapia celular, ingeniería tisular y
medicina regenerativa:
La biotecnología azul y la investigación en
biología marina contribuirán al avance de estas
áreas punteras de la medicina mediante el
desarrollo de nuevas sustancias de origen marino
como compuestos bioactivos, adhesivos, antiadhesivos,
coloides
biocompatibles,
nanoestructuras y materiales porosos.
Asimismo, existe el potencial de descubrir
126
Ensayos Biotecnológicos
nuevas moléculas que alteren la habilidad de las
células tumorales de unirse y multiplicarse o dar
lugar a metástasis.
• Diagnóstico:
Existen varios productos de origen marino que
se emplean en el mercado de diagnóstico como
el caso de la ficoeritrina fluorescente procedente
de algas y la fosfatasa alcalina procedente de
gambas que se emplean como reactivos de
laboratorio.
Se espera que según avance el conocimiento en
torno al mecanismo de acción de compuestos
bioactivos de origen marino, se abrirán nuevos
usos en el campo del diagnóstico.
• Herramientas de investigación:
Tres de los bioreactivos más empleados en la
actualidad se han descubierto a partir de
organismos marinos u organismos extremófilos
acuáticos. La primera de ellas, la Taq
polimerasa, es una enzima procedente de un
microorganismo que habita manantiales de agua
caliente y se emplea en la PCR. Por otro lado, la
aecuorina es un indicador bioluminiscente del
calcio que procede de una medusa. En tercer
lugar, la Proteina Fluorescente Verde (GFP),
procede de la misma medusa y que transforma la
señal de la aecuorina en luz verde.
Recientemente, se ha aislado una nueva ADN
polimerasa,
la
polimerasa
VentR,
de
microorganismos que habitan las chimeneas de
los fondos marinos. Dicha polimerasa resulta de
gran utilidad para la PCR, o reacción en cadena
de la polimerasa, una técnica que permite
amplificar pequeñas cantidades de ADN o ARN
y que requiere de enzimas estables a altas
temperaturas
• Agricultura:
La biotecnología marina está permitiendo
descubrir nuevos compuestos bioactivos con
actividades herbicidas y pesticidas de interés.
Por otro lado, los ingredientes de origen marino
se emplean cada vez más en alimentación animal
y acuicultura debido a que pueden permitir
sustituir los compuestos de origen sintético que
se emplean en los piensos.
“Debido a la gran biodiversidad y diversidad
química de los océanos, los compuestos de
origen marino constituyen una fuente interesante
de compuestos bioactivos”.
En el caso de la acuicultura, las microalgas
pueden proporcionar una fuente de alimento
fresco para las especies cultivadas. De este
modo, se podrán obtener dietas más adaptadas
para las especies cultivadas que permitan
mejorar la productividad y la calidad de las
mismas.
• Remediación y energía:
Salvador Camacho Garrido
Los vertidos de hidrocarburos son una de las
fuentes de contaminación más importantes para
los océanos. Se están desarrollando nuevos
dispersores, microorganismos y enzimas de
origen marino que permiten controlar los
vertidos y favorecer su eliminación.
En la actualidad hay un gran interés en
desarrollar nuevas fuentes de energía no
contaminantes que ayuden a reducir las
emisiones de CO2 y contribuyan al control del
cambio climático. En este sentido, las
microalgas y las bacterias fotosintéticas
constituyen una apuesta prometedora como
fuente para la obtención de hidrógeno de origen
biotecnológico y para la obtención de biodiesel.
A pesar de sus prometedoras perspectivas y de
los productos que ya se encuentran en el
mercado, la biotecnología azul se encuentra aún
en una fase temprana de desarrollo. Queda aún
mucho que investigar y mucho que conocer para
poder desarrollar nuevos bienes y servicios
basados en la biotecnología azul.
151.
BIOTECNOLOGÍA GRIS.
La biotecnología gris se aplica a las tecnologías
medioambientales. Aquí los procedimientos
biotecnológicos ayudan al saneamiento del
suelo, el tratamiento de las aguas residuales, la
depuración de los gases de escape y de los gases
contaminantes, así como el reciclaje de los
desechos y sustancias residuales.
En ocasiones, los términos biotecnología blanca
y gris se suelen emplear indistintamente. Hay
que tener en cuenta que la aplicación de la
biotecnología en la industria (la denominada
biotecnología blanca o industrial) suele redundar
en un menor impacto ambiental de las
actividades industriales. Sin embargo, la
biotecnología gris va más allá de los beneficios
ambientales de las aplicaciones a nivel industrial
127
Ensayos Biotecnológicos
de la biotecnología ya que la biotecnología
puede ser aplicada directamente para producir
beneficios medioambientales.
La biotecnología puede tener efectos
beneficiosos
sobre
el
medioambiente
contribuyendo al mantenimiento de la
biodiversidad, ayudando a la eliminación de
contaminantes presentes en el ambiente o
mediante el desarrollo de tecnologías limpias
para el tratamiento de residuos peligrosos.
• Limpieza de contaminantes:
En la actualidad, existen multitud de ambientes
en los se encuentran contaminantes presentes
bien en el suelo, en las aguas o en el aire. Los
tratamientos que se pueden emplear para
descontaminar estos ambientes pueden basarse
en técnicas físico-químicas o biológicas. En
ocasiones, se suelen aplicar ambos tipos de
técnicas de manera combinada y coordinada.
Los seres vivos presentan actividades
metabólicas que les permiten asimilar o
modificar las diferentes sustancias presentes en
el medioambiente. Los seres vivos, sean
microorganismos, plantas o animales, pueden
degradar sustancias presentes en el medio en
presencia de oxígeno, un proceso denominado
biodegradación aeróbica, o en ausencia de
oxígeno, dando lugar a una biodegradación
anaeróbica.
Utilizando plantas y microorganismos se
consiguen descontaminar aguas (lodos activos y
digestiones
anaerobias),
suelos
(fitorremediación) y la atmósfera (biofiltros).
En cierta forma dentro de este concepto del
reciclado y revalorización de los residuos hay
que señalar que el tratamiento biológico de las
aguas residuales urbanas es posiblemente una de
las aplicaciones más antiguas del biorreciclado y
que aporta grandes beneficios sociales y
ambientales, sobre todo en regiones donde la
escasez de agua es evidente. Lo mismo sucede
con el proceso de compostaje biológico de los
residuos sólidos urbanos, un proceso bien
establecido por décadas y que sirve para
disminuir el uso de fertilizantes químicos.
• Contribución al mantenimiento de la
biodiversidad:
La biodiversidad hace referencia a la diversidad
de la vida y fue definido en el Convenio sobre la
Diversidad Biológica de Rio como la
variabilidad de organismos vivos de cualquier
fuente, incluidos entre otras cosas, los
ecosistemas marinos, terrestres, y otros
ecosistemas acuáticos, así como los complejos
ecológicos de los que forman parte; y
comprende la diversidad dentro de cada especie,
entre diferentes especies y entre los ecosistemas,
Salvador Camacho Garrido
lo que corresponde a los tres niveles jerárquicos
fundamentales de la organización de la vida.
La biotecnología contribuye a la conservación
de la biodiversidad a través del desarrollo de
herramientas para su análisis, para su
conservación y para su recuperación. En primer
lugar, las modernas técnicas de biología
molecular permiten detectar la variabilidad y
analizar la diversidad de los ecosistemas. En
segundo lugar, la biotecnología ha desarrollado
técnicas que permiten conservar genomas en
bancos u organismos vivos en colecciones de
cultivos y bancos de germoplasma. En último
lugar, se han desarrollado técnicas de clonación
que en el futuro podrían permitir la clonación de
especies extintas o en peligro de extinción,
permitiendo su recuperación.
Biorremediación y biodegradación
La biorremediación es el proceso por el cual son
utilizados microorganismos para limpiar un sitio
contaminado.
Los
procesos
biológicos
desempeñan un papel importante en la
eliminación de contaminantes y la biotecnología
aprovecha la versatilidad catabólica de los
microorganismos para degradar y convertir
dichos compuestos. En el ámbito de la
microbiología ambiental, los estudios basados en
el genoma abren nuevos campos de
investigación in silico ampliando el panorama de
las redes metabólicas y su regulación, así como
pistas sobre las vías moleculares de los procesos
de degradación y las estrategias de adaptación a
las cambiantes condiciones ambientales. Los
enfoques
de
genómica
funcional
y
metagenómica aumentan la comprensión de las
distintas vías de regulación y de las redes de
flujo del carbono en ambientes no habituales y
para compuestos particulares, que sin duda
acelerarán el desarrollo de tecnologías de
biorremediación
y
los
procesos
de
biotransformación. Los entornos marinos son
especialmente vulnerables ya que los derrames
de petróleo en regiones costeras y en mar abierto
son difíciles de contener y sus daños difíciles de
mitigar. Además de la contaminación a través de
las actividades humanas, millones de toneladas
de petróleo entran en el medio ambiente marino
a través de filtraciones naturales. A pesar de su
toxicidad, una considerable fracción del petróleo
que entra en los sistemas marinos se elimina por
la actividad de degradación de hidrocarburos
llevada a cabo por comunidades microbianas, en
particular,
por
las
llamadas
bacterias
hidrocarbonoclásticas (HCB). Además varios
microorganismos
como
Pseudomonas,
Flavobacterium, Artrhrobacter y Azotobacter
128
Ensayos Biotecnológicos
pueden ser utilizados para degradar petróleo. El
derrame del barco petrolero Exxon Valdez en
Alaska en 1989 fue el primer caso en el que se
utilizó biorremediación a gran escala de manera
exitosa, estimulando la población bacteriana
suplementándole nitrógeno y fósforo que eran
los limitantes del medio.
152.
FERMENTACIÓN.
La palabra «fermentación» es confusa en
Microbiología porque con ella se hace referencia
a cuatro tipos de procesos diferentes: el
metabolismo microbiano en ausencia de
oxígeno, la producción de metabolitos
secundarios, la modificación de compuestos
químicos por microorganismos en crecimiento y
el crecimiento bacteriano en sí cuando el interés
del cultivo es la producción de biomasa.
La fermentación es el proceso por el que las
células pueden obtener energía sin llevar a cabo
un proceso de fosforilación oxidativa. Esto es:
en la fermentación, la energía se obtiene
mediante un proceso químico de fosforilación a
nivel de substrato sin que se produzca una
variación neta del poder reductor de la célula.
Los primeros estudios científicos serios sobre
procesos de fermentación se llevaron a cabo por
Pasteur en el análisis de los procesos de
producción y alteración del alcohol durante la
fabricación del vino.
Los procesos de fermentación son universales;
esto es, se encuentran en todo tipo de
organismos y, por consiguiente, probablemente
represente una de las formas más antiguas de
conservación de la energía.
Existe una gran diferencia entre respiración y
fermentación.
En cualquier proceso de oxidación se produce
una transferencia de electrones desde el
compuesto reducido que se oxida hasta el
compuesto oxidado que se reduce, y en esa
transferencia de electrones se produce la
liberación de energía. En los procesos oxidativos
el aceptor final de los electrones de la oxidación
es el oxígeno o, de una manera más general,
cualquier compuesto inorgánico oxidado. Sin
embargo, en los procesos fermentativos, la
transferencia de electrones se produce hasta
llegar a un aceptor final que es un compuesto
orgánico oxidado. Por consiguiente, en un
proceso de fermentación tanto el donador de
electrones como el aceptor son compuestos
orgánicos, mientras que en un proceso de
respiración el donador de los electrones es
orgánico y el aceptor inorgánico.
Otra manera de plantear el mismo proceso es
considerar que en un proceso de respiración el
Salvador Camacho Garrido
aceptor final de electrones es siempre externo
mientras que en un proceso de fermentación el
aceptor final es interno.
La respiración es mucho más efectiva
energéticamente que la fermentación porque en
aquella la oxidación del compuesto orgánico es
más completa que en esta y, como resultado de
ello, se liberan 688 kcal/mol (ΔGo) en la
respiración de glucosa y sólo 58 kcal/mol en la
fermentación. (Estos valores hay que
considerarlos a la luz de la necesidad de 7,3
kcal/mol para la síntesis de ATP).
Las rutas fermentativas son anaerobias porque
no requieren oxígeno como aceptor final de los
electrones. Esto no quiere decir que en ausencia
de oxígeno sólo se pueda producir fermentación:
el aceptor final de los electrones puede ser un
compuesto inorgánico oxidado que los reciba al
final de la cadena respiratoria produciéndose un
proceso de fosforilación oxidativa en ausencia
de oxígeno. En estos procesos decimos que los
microorganismos son capaces de respirar otras
moléculas diferentes al oxigeno como son los
nitratos (NO3-) o los sulfatos (SO4=).
153.
RUTAS FERMENTATIVAS.
Rutas fermentativas para la
utilización del piruvato
En la oxidación de un mol de glucosa a piruvato
se producen en total 2 moles de ATP como
rendimiento neto (se producen 4 moles de ATP y
se consumen dos) y se genera también un mol de
NADH+H+. Cuando se produce la entrada en el
ciclo de Krebs del piruvato se va a generar una
gran cantidad de NADH+H+ que se reoxida
principalmente mediante la fosforilación
oxidativa.
Cuando una célula carece de cadena respiratoria,
el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y,
por consiguiente, no se puede regenerar el
agente aceptor de hidrógeno necesario para las
primeras fases de la glicolisis. Los procesos
fermentativos reducen el piruvato regenerando el
NAD+ necesario para los procesos metabólicos
iniciales del catabolismo de la glucosa.
Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato
de maneras diversas dando lugar a distintos
procesos de fermentación que se conocen por
sus productos finales.
• Fermentación etanólica o alcohólica:
El piruvato se reduce para formar etanol y CO2:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP
Este es el proceso de fermentación que lleva a
cabo Saccharomyces cerevisiae y algunas
129
Ensayos Biotecnológicos
(pocas) bacterias.
Su importancia industrial es evidente: la
fermentación alcohólica produce el alcohol
presente en las bebidas fermentadas (vino
cerveza, etc.) y el CO2 que se libera en esta
fermentación es el causante del esponjamiento
de la masa de pan durante su fermentación. En
este último caso el proceso de cocción posterior
durante la fabricación permite eliminar todo el
alcohol de manera que no queda presente en el
producto final.
• Fermentación homoláctica:
Se denomina así la fermentación cuyo único
producto final es el ácido láctico. Su ecuación
global es:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 ácido láctico + 2 ATP
Estas bacterias producen el piruvato por
catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de
Embden-Meyerhof (vía glucolítica clásica).
Es un proceso de fermentación presente en
muchas
bacterias
del
grupo
láctico:
Streptococcus
(grupo
de
enterococos),
Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus.
Su importancia industrial estriba en la bajada del
pH de los productos donde se encuentran estas
bacterias: esta bajada del pH como consecuencia
de la liberación de ácido láctico es suficiente
para producir unos cambios químicos en el
producto (precipitación de proteínas durante el
cuajado de la leche), cambios microbiológico
(protección del deterioro microbiano de
alimentos como consecuencia de la eliminación
de la flora competidora) y organolépticos (los
ácidos orgánicos de cadena corta, y entre ellos el
ácido láctico tienen características de producción
de sabor) que hacen de esta fermentación un
proceso muy relevante en la producción de
alimentos.
La fermentación homoláctica es la causante de
las agujetas producidas en los músculos después
de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de
oxígeno aportada a las fibras musculares no es
suficiente para asegurar toda la reoxidación del
NADH+H+. Las agujetas se producen por los
depósitos de ácido láctico entre las fibras
musculares. Asimismo,
la
fermentación
homoláctica es responsable de la alteración del
esmalte dental en la boca causado por bacterias
lácticas como flora habitual.
• Fermentación heteroláctica:
Denominada así porque su producto final no es
exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene
un rendimiento menor al de la fermentación
homoláctica como se desprende de la
producción de sólo un mol de ATP por mol de
glucosa fermentada. La obtención del piruvato
Salvador Camacho Garrido
en estas bacterias se logra mediante el
catabolismo de la glucosa por la ruta de las
pentosas.
La reacción global es:
Glucosa + ADP + Pi
Ac. láctico + etanol + CO2 + ATP
Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo
láctico pertenecientes a los géneros Leuconostoc
y Lactobacillus.
Industrialmente el proceso es relevante en la
producción de alimentos fermentados (por
ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora
de este tipo de fermentación es Lactobacillus
acidophilus que facilita el metabolismo de la
leche.
• Fermentación del ácido propiónico:
Las bacterias que presentan este tipo de
fermentación, pueden utilizar tanto azúcares
como lactato como puntos de partida para el
proceso. La ruta es un proceso complejo en el
que se genera acetato, CO2 y ácido propiónico
como productos finales.
Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias
del tipo Propionibacterium y otras anaerobias
estrictas presentes en el rumen de herbívoros
donde llevan a cabo una fermentación
secundaria de los productos de las
fermentaciones lácticas primarias.
Industrialmente
Propionibacterium
es
importante en la fermentación del queso para
producir el tipo suizo: la fermentación
propiónica utiliza en este caso el lactato
producido en las fermentaciones lácticas
primarias produciendo CO2 responsable de los
«ojos» del queso suizo y acumulación de ácidos
orgánicos de cadena corta responsables de
características organolépticas.
• Fermentación ácido-mixta:
La fermentación ácido mixta produce ácido
acético, etanol, H2, CO2 y proporciones
diferentes de ácido láctico o propiónico
(fórmico) según las especies. Es un tipo de
fermentación que llevan a cabo las
enterobacterias. En esta ruta de fermentación se
produce ATP además de la reoxidación del
NADH+H+.
La producción de formiato o CO2 + H2 depende
de la presencia en la bacteria de una enzima
denominada formiato-liasa responsable del paso.
No todas las bacterias la tienen y su actividad es
detectable por la producción de grandes
cantidades de gas (el H2 es insoluble) como
consecuencia de la fermentación del azúcar.
• Fermentación butanodiólica:
Es una variante de la anterior presente en
algunas enterobacterias como Klebsiella,
Serratia y Erwinia, especie en la que se da una
130
Ensayos Biotecnológicos
fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta
ruta se desprende CO2 y se logra como producto
final el 2.3-butanodiol. Como paso intermedio
de la ruta se produce acetoína que puede servir
para la identificación de las bacterias que
presentan esta ruta mediante la reacción de
Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias
muy
semejantes como Escherichia y
Enterobacter.
• Fermentación del butanol:
Es un tipo de fermentación llevado a cabo por
bacterias anaerobias estrictas del género
Clostridium. En el curso de esta fermentación se
producen compuestos orgánicos disolventes de
gran
importancia
industrial
y
que,
históricamente, han sido los primeros productos
industriales
bacterianos
de
importancia
económica relevante durante la 1ª Guerra
Mundial (trabajo de Weizmann).
Rutas fermentativas de utilización
de aminoácidos
En algunas bacterias del género Clostridium se
producen procesos acoplados de oxidación de
aminoácidos con el objeto de producción de
energía. Como en estos procesos no se utiliza
ningún aceptor externo de los electrones de la
oxidación (el aceptor es el segundo aminoácido
de la pareja) técnicamente constituyen procesos
de fermentación de aminoácidos en los que se
llega a la desaminación y descarboxilación de
los aminoácidos que intervienen en la pareja.
El ejemplo más representativo es la
desaminación y descarboxilación oxidativa de la
alanina a acetato acoplada con la desaminación
reductiva de la glicina en el proceso conocido
como reacción de Stickland (fermentación
anaerobia de pares de aminoácidos).
154.
FERMENTACIONES
INDUSTRIALES.
Tradicionalmente se ha utilizado la palabra
fermentación en microbiología industrial para
describir los procesos de cultivo de
microorganismos con propósitos industriales.
Sin embargo, no hay que confundir esta
utilización del térmico con el proceso
bioquímico de fermentación consistente en la
regeneración del poder reductor (del NADH)
por un procedimiento no oxidativo. La
fermentación que tiene lugar en la producción
del vino, en este sentido, comprende ambos
significados:
por
un
lado,
se
trata
bioquímicamente de un proceso de fermentación
(producción de alcohol a partir de glucosa en
condiciones anaerobias) y es una fermentación
Salvador Camacho Garrido
industrial en el sentido de que se trata de un
proceso industrial llevado a cabo por
microorganismos.
El desarrollo de una fermentación industrial
incluye dos tipos de procesos denominados, por
sus nombres en inglés, procesos upstream y
procesos downstream.
Los procesos upstream comprenden la selección
y preparación del microorganismo, la
preparación del medio de cultivo y de las
condiciones de fermentación y el cultivo.
Los procesos downstream incluyen la
purificación del producto y el tratamiento de los
residuos de la fermentación.
Los productos fabricados por fermentaciones
industriales pueden agruparse grosso modo en
dos clases:
• Los productos de gran volumen y bajo
valor (en este grupo se incluyen los
productos alimenticios, bebidas, aditivos
alimentarios y algunos productos
químicos producidos por fermentación).
•
Los productos de bajo volumen y alto
valor (los fármacos, por ejemplo).
Por otro lado, hay que señalar que tienen origen
en fermentaciones industriales un gran número
de productos de uso cotidiano que pertenecen a
diferentes grupos:
131
Ensayos Biotecnológicos
•
Alimentos (derivados lácteos y de
vegetales fermentados), bebidas (vino,
cerveza, etc.), aditivos alimentarios
(vinagre, ácido cítrico, carotenos, etc.).
• Productos farmacéuticos: antibióticos ßlactámicos
(penicilinas
y
cefalosporinas),
antibióticos
aminoglicósidos
y
tetraciclinas;
compuestos antitumorales y otros
fármacos (lovastatina, por ejemplo,
utilizada para controlar la producción de
colesterol).
• Enzimas microbianas tales como
proteasas, amilasas, etc.
• Productos
químicos
tales
como
alcoholes, polisacáridos, disolventes
(acetona), lípidos, productos base para la
producción de plásticos, etc.
• Productos recombinantes diseñados por
ingeniería genética.
Actualmente existe una gran tendencia al uso de
biomasa en biotecnología industrial
155.
BIORREFINERIAS.
La biorrefinería trata de incrementar el valor de
la biomasa a través de su aprovechamiento
completo, optimizando mediante procesos muy
bien integrados el consumo de agua y de
energía, la producción de CO2 y el reciclado de
los residuos. Se trata de aumentar así la
ecoeficiencia y la competitividad de la
producción de las distintas sustancias químicas
que se puedan generar a partir de la biomasa.
Mediante la biorrefinería se pretende también
aumentar el valor añadido de los subproductos y
residuos derivados de otras industrias.
156.
APLICACIONES DE LA
SECUENCIACIÓN DE ADN.
o Detección de mutaciones
o Secuenciación de ADNs fósiles
o Diagnóstico de enfermedades
genéticas
o Identificación de especies y
control de cruces entre animales
o Proyecto genoma humano
o Clonación
o Aplicaciones forenses
Detección de mutaciones
Esta técnica nos permite localizar mutaciones
previamente descritas. Se emplea así la
secuenciación de ADN como un método de
diagnóstico: una vez que se ha caracterizado la
relación de una enfermedad con una
determinada mutación puntual (mutaciones en el
gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la
galactosemia, mutaciones en c-Ras y cáncer,
etc.) o de una pequeña deleción (deleción de 3
bases en el gen CFTR en la fibrosis quística),
puede desarrollarse un método de detección
rutinario. Además, la secuenciación automática
puede emplearse como método de screenig en la
localización de nuevas mutaciones.
Secuenciación de ADNs fósiles
El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar
secuencias de ADN a partir de unas pocas copias
intactas presentes en especímenes de museo y
descubrimientos arqueológicos, en los cuales la
mayoría de las moléculas están dañadas o
degradadas, para proceder posteriormente a su
estudio mediante secuenciación.
Diagnóstico prenatal / Diagnóstico
preimplantación
Diagnóstico de enfermedades hereditarias o
determinación del sexo del feto previamente a su
implantación en procesos de fecundación in
vitro.
Una o dos células del pre-embrión se retiran en
el estado de 8 a 16 células, previo a la
implantación. Estas pueden utilizarse para
amplificar un gen o genes específicos y así
estudiar la enfermedad genética o el sexo
(utilizando genes específicos del cromosoma Y).
Identificación de especies y control
de cruces entre animales
Las técnicas para identificar especies pueden ser
muy importantes para descubrir fraudes
comerciales, tales como vender carne de una
especie más barata a los precios de otra más
Salvador Camacho Garrido
132
Ensayos Biotecnológicos
cara, o el comercio ilegal de especies en peligro.
Estos estudios pueden realizarse utilizando el
ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias
altamente variables entre especies distintas,
aunque sean cercanas entre sí, y bastante
conservadas dentro de la misma especie. Los
controles de relaciones parentales en animales
tienen importancia forense para el control de
comercio ilegal de especies protegidas.
Individuos jóvenes de especies en peligro son
sacados de sus lugares de nacimiento y
"disfrazados" por certificados veterinarios
falsos. En estos casos, el estudio familiar es el
único medio de descubrir el origen ilegal de los
individuos.
Proyecto Genoma Humano
El Proyecto Genoma Humano es un proyecto
internacional cuyo objetivo final es obtener una
descripción completa del genoma humano a
través de la secuenciación del ADN. El genoma
que se investiga es el genoma nuclear.
Desde su inicio, el proyecto ha sido justificado
especialmente por los beneficios médicos que se
espera obtener del conocimiento de la estructura
de cada gen humano. Esta información
proporcionará una capacidad de diagnóstico en
individuos con riesgo de ser portadores del gen
de alguna enfermedad. También se espera que
aporte un marco de trabajo para el desarrollo de
nuevas terapias, además de nuevas estrategias
para la terapia génica.
Aplicaciones forenses y otras
Las aplicaciones forenses son múltiples:
• Pruebas de paternidad
• Pruebas de parentesco biológico
• Identificación de personas desaparecidas
• Delitos contra la libertad sexual
• Estudio de escenarios de un crimen, etc.
Entre otras:
• Diagnóstico
de
enfermedades
hereditarias
• Donantes de esperma y óvulos
Clonación
Salvador Camacho Garrido
133
Ensayos Biotecnológicos
157.
BIOSENSORES.
Las técnicas de análisis de laboratorio más
habituales, ya sean de contaminantes químicos o
sustancias biológicas, son generalmente tediosas
e indirectas. Contar con dispositivos de alta
sensibilidad, portátiles y de medición directa
supondría un ahorro de tiempo y costes. Hacia
este objetivo se dirige el trabajo de muchos
grupos.
Combinando
componentes
ópticos
y
microelectrónicos con materiales biológicos
(proteínas o ADN), se desarrollan tres modelos
de biosensores, macro, micro y nano, basados en
la tecnología de silicio.
En ellos la vida y la microelectrónica se alían
para servir de base a unos dispositivos con
múltiples aplicaciones, ya que cambiando la
parte
biológica
pueden
medir
desde
contaminantes ambientales hasta variaciones
genéticas o contaminaciones en alimentos.
Cuando se imagina un biosensor casi todo el
mundo piensa en un aparato de medición de
sustancias biológicas. La definición más correcta
sería un dispositivo compuesto por dos
elementos fundamentales: el sensor, en este caso
microelectrónico, y el receptor biológico, por
ejemplo una proteína o una cadena de ADN.
Esos dos componentes, más otros de
funcionamiento y conversión de señal forman, el
biosensor, que puede medir todo tipo de
sustancias, no sólo biológicas.
De hecho, se trabaja más en el control
mediambiental (estudios de contaminantes
orgánicos de aguas de origen agrícola e
industrial, como el DDT o los clorofenoles) que
casi en análisis genéticos.
Estos dispositivos siguen un planteamiento
tecnológico similar al biosensor más clásico y
difundido comercialmente, el usado por los
diabéticos para medir la concentración de
glucosa en sangre. En éste se integra una
enzima, que actúa como receptor biológico,
situada sobre un electrodo. La enzima
permanece en estado seco, hidrofilizada, hasta
que entra en contacto con la gota de sangre del
paciente, que la regenera y activa dando lugar a
una reacción química y en consecuencia a un
movimiento de electrones. El electrodo registra
esos cambios y los traduce en la información
que aparecerá en la pantalla en tan sólo unos 30
segundos.
Otras aplicaciones de este tipo de tecnología son
las usadas en alimentación para el análisis de
alimentos susceptibles de contener sustancias
nocivas como la bacteria Salmonella, por
ejemplo. Incluso, en Japón se usa uno para
analizar si el pescado está fresco o no. También
Salvador Camacho Garrido
hay muchos grupos de investigación trabajando
en la creación de biosensores para la detección
rápida de agentes contaminantes en caso de
guerra química y bacteriológica. Y otra área muy
importante de aplicación es la de los análisis
clínicos para analizar de forma rápida y directa,
por ejemplo, infecciones como las producidas
por el virus de la hepatitis o el virus del sida.
Biosensor óptico fabricado con tecnología
microelectrónica de silicio y empleado para la medida
de parámetros clínicos y contaminación medioambiental
Como los biosensores son dispositivos de
análisis
que
nos
permiten
detectar
específicamente una sustancia, podemos
utilizarlos para analizar la composición o
características moleculares de los seres vivos, o
detectar si un determinado microorganismo está
presente en un ambiente.
Sus partes principales son:
Una zona sensora o reactiva, formada por un
elemento de reconocimiento biológico (ácido
nucleico, anticuerpo, enzima...) capaz de unirse
específicamente a la sustancia que se quiere
detectar.
Éste está acoplado a un sistema transductor que
permite procesar la señal (óptica, eléctrica,
mecánica o de otro tipo) producida por la
interacción entre el elemento de reconocimiento
y la sustancia buscada.
La unión de estos dos mundos opuestos, el vivo
y el inerte, es lo que confiere a los biosensores
sus características especiales de selectividad y
sensibilidad.
Existen muchísimos tipos de biosensores
diferentes, y sus aplicaciones actuales son ya
numerosas en los campos de la biotecnología, la
salud, el medio ambiente y la alimentación.
Uno de los tipos de biosensores más utilizados
en la actualidad son los denominados:
“Microarrays” o “Biochips”
Se construyen depositando cientos o miles de
biomoléculas (generalmente proteínas o cadenas
cortas de ADN) sobre una superficie sólida (por
134
Ensayos Biotecnológicos
ejemplo de vidrio, silicio u oro), en posiciones y
concentraciones conocidas.
Cada punto está separado de sus vecinos por
unos 100 o 150 μm. La muestra problema que se
quiere analizar se marca con un reactivo
fluorescente, de forma que cuando se ponga en
contacto con el biochip quedará unida a unas de
las moléculas sensoras y no a otras, y producirá
una señal fluorescente en esos puntos.
Las aplicaciones de los biochips son numerosas
en la actualidad: determinación de la
biodiversidad microbiana presente en un
ambiente concreto, detección de bacterias
contaminantes en el agua o en un alimento,
descubrimiento de mutaciones en una bacteria o
un virus que les hacen resistentes a los fármacos
que toma un paciente infectado, análisis de
nuestra mayor o menor propensión a padecer
cáncer y un largo etcétera.
158.
DOGMAS Y PARADIGMAS
NUEVOS.
La ingeniería genética ha basado su desarrollo
mediante la interpretación reduccionista de las
leyes de la genética Mendeliana y de las teoría
evolucionista Darwiniana, puesto que considera
a los seres vivos como la suma de genes que
codifican características específicas que pueden
cortarse y trasladarse de un organismo a otro sin
generar desequilibrios en el nuevo organismo,
considerando que los genes se expresan
Salvador Camacho Garrido
individualmente y son estables. Pero los nuevos
descubrimientos de la genética muestran como
no son tan ciertas estas premisas sobre los genes.
Los organismos transgénicos son impredecibles,
pueden mutar, recombinarse, migrar o saltar de
un sitio del genoma a otro (“jumping gens”): es
decir, los genes se puede activar y desactivar,
generando así nuevos arreglos del ADN y
ampliación de secuencias.
Algunos autores señalan que no existen
suficientes conocimientos de cómo y en qué
condiciones ocurre la transferencia de ADN.
Los resultados del Proyecto Genoma Humano
(PGH) también han sido distintos a los
esperados:
La secuencia de ADN que conforma el genoma
humano contiene codificada la información
necesaria para la expresión, altamente
coordinada y adaptable al ambiente, del
proteoma humano, es decir, del conjunto de las
proteínas del ser humano. Las proteínas, y no el
ADN, son las principales biomoléculas
efectoras; poseen funciones estructurales,
enzimáticas,
metabólicas,
reguladoras,
señalizadoras..., organizándose en enormes redes
funcionales de interacciones. En definitiva, el
proteoma fundamenta la particular morfología y
funcionalidad de cada célula. Asimismo, la
organización estructural y funcional de las
distintas células conforma cada tejido y cada
órgano, y, finalmente, el organismo vivo en su
conjunto. Así, el genoma humano contiene la
información básica necesaria para el desarrollo
físico de un ser humano completo.
El genoma humano presenta una densidad de
genes muy inferior a la que inicialmente se había
predicho, con sólo en torno al 1,5% de su
longitud compuesta por exones codificantes de
proteínas.
Un 70% está compuesto por ADN extragénico y
un 30 % por secuencias relacionadas con genes.
Del total de ADN extragénico, aproximadamente
135
Ensayos Biotecnológicos
un 70% corresponde a repeticiones dispersas, de
manera que, más o menos, la mitad del genoma
humano corresponde a secuencias repetitivas de
ADN. Por su parte, del total de ADN
relacionado con genes se estima que el 95%
corresponde
a
ADN
no
codificante:
pseudogenes, fragmentos de genes, intrones,
secuencias UTR…
Contenido en genes y tamaño del genoma de
varios organismos
Especie
Tamaño
(Mb)
Nºgenes
Mycoplasma genitalium
0,58
500
Streptococcus
pneumoniae
2,2
2300
Escherichia coli
4,6
4.400
Saccharomyces
cerevisiae
12
5.800
Caenorhabditis elegans
97
19.000
Arabidopsis thaliana
125
25.500
Drosophila
melanogaster (mosca)
180
13.700
Oryza sativa (arroz)
466
45.00055.000
Mus musculus (ratón)
2500
29.000
Homo sapiens (ser
humano)
2900
27.000
En el caso del hombre, hemos pasado de unos
140.000 – 170.000 genes, a la cifra más aceptada
de 27.000 (algunos autores hablan de unos
40.000 genes, de los cuales de 27.000 – 29.000
serían codificanates y el resto posibles
codificantes), con una producción estimada de
unas 30.000 proteínas. Resumiendo muchos
menos genes y proteínas de las estimadas para
nuestro pretendido ego de mejor y más complejo
sistema viviente. Asimismo independientemente
de la raza o etnia, todos compartimos el 99,99 %
del genoma.
Salvador Camacho Garrido
159.
NUEVAS TENDENCIAS EN
BIOTECNOLOGÍA.
Sin entrar en valoraciones, estos son algunos
pronósticos:
• En el caso de las fermentaciones más
habituales se utilizarán cada vez más m.o.
manipulados por ingeniería genética, con
modificaciones en las características
organolépticas de los productos.
• La agricultura utilizará cada vez menos
pesticidas y abonos pero será preciso la
selección de semillas.
• La utilización de plásticos biodegradables
ayudarán a la limpieza medioambiental.
• Dentro del sector farmacéutico las técnicas
genéticas se consolidarán tanto en diagnosis
como en producción de vacunas.
• Aparecerán
nuevos
medicamentos
biotecnológicos.
• La medicina personalizada y el diagnóstico
con biochips llegará a ser común.
• La proteómica y la famacogenómica
descubrirán marcadores no conocidos.
• Mediante el xenotrasplante se acabará con la
falte de donantes de órganos.
• La ingeniería de tejidos y los sistemas
biohíbridos servirán de soporte a la función
hepática y renal.
• Las “células madre” serán una terapia
decisiva para muchas enfermedades.
• Plantas y animales transgénicos producirán
importantes proteínas humanas.
• Se espera la implantación de la
biotecnología a escala nanométrica y el uso
masivo de la bioelectrónica con nuevos
biosensores.
Nanobiotecnología
La nanobiotecnología es una rama de la
nanotecnología con aplicaciones o usos
biológicos y bioquímicos. A menudo la
nanobiotecnología estudia elementos existentes
en la naturaleza para fabricar nuevos
dispositivos.
El término bionanotecnología es usado a
menudo como sinónimo de nanobiotecnología,
aunque a veces se hace una distinción entre
ambas. Si hacemos la distinción entre ambas, la
nanobiotecnología se refiere a usar la
nanotecnología para alancanzar las metas de la
biotecnología,
mientras
que
la
bionanotecnología puede referirse a cualquier
superposición entre la biología y la
nanotecnología, incluyendo el uso de
biomoléculas como parte o inspiración de
dispositivos nanotecnológicos.
136
Ensayos Biotecnológicos
Objetivo destacado son los nanosensores
Los nanosensores son cualquier punto sensorial
biológico, químico, o físico usado para
transportar información acerca de nanopartículas
al mundo macroscópico. Aunque los seres
humanos todavía no han podido sintetizar
nanosensores, las predicciones para su uso
principalmente incluyen varios propósitos
medicinales y como entradas a construir otros
nanoproductos,
tales
como
chips
de
computadores que trabajen a nanoescala y los
nanobots.
Actualmente, hay propuestas varias maneras
para hacer nanosensores, incluyendo la litografía
de arriba hacia abajo, ensamblaje de abajo hacia
arriba, y autoensamblado molecular.
Por otra parte, los nanoarrays permitirán utilizar
técnicas de detección distintas de la
fluorescencia, y algunos de ellos ni siquiera
requieren marcaje alguno de la muestra que se
va a analizar.
Esto resulta muy importante, porque se ha
comprobado que si no es preciso marcar ni
modificar previamente la muestra, la
sensibilidad
de
detección
mejora
considerablemente.
Con todo ello, una de las ideas actuales es poder
desarrollar un nanochip provisto de miles de
puntos sensores que pudiera ser integrado en
nuestro organismo y analizar en tiempo real los
componentes de nuestra sangre.
Además de los nanoarrays, la llegada de la
nanotecnología al mundo de los biosensores ha
permitido
construir
sistemas
analíticos
totalmente diferentes a los conocidos hasta hace
una década.
Así, por ejemplo, se ha desarrollado un aparato
basado en nanohilos de silicio capaz de detectar
y caracterizar virus concretos mediante los
cambios en conductividad eléctrica que estos
producen al unirse a un nanocable sumergido en
una muestra líquida natural.
Con todos ello, los avances actuales están
permitiendo fabricar autenticos laboratorios en
miniatura (“lab on a chip”).
Una punta de prueba de nanosensor que lleva un rayo
láser (azul) penetra una célula viva para detectar la
presencia de un producto que indica que la célula se ha
expuesto a una sustancia que causa cáncer
A pesar de la gran utilidad actual de los
microarrays, la ciencia sigue avanzando y ya se
están desarrollando otros biosensores, aún más
pequeños y potentes.
Se basan, una vez más, en las nuevas
posibilidades que la nanotecnología pone en
nuestras manos, y que por ejemplo nos permiten
separar las moléculas sensoras no unos cientos
de micrómetros sino sólo unos pocos
nanómetros.
Por ejemplo, se dispone ya de nanoarrays de
proteínas o de ADN formados por puntos de 100
nm de diametro, y se han desarrollado sensores
formado incluso por moléculas individuales.
Así, todo el proceso de detección puede hacerse
en mucho menos espacio, y es posible realizar el
análisis partiendo de cantidades muy pequeñas
de muestra.
Salvador Camacho Garrido
Mediante nanopartículas superparamagnéticas
137
Ensayos Biotecnológicos
(partículas que responden a un campo magnético
pero no quedan magnetizadas al desaparecer
éste) se ha hecho posible la separación
inmunomagnética de células, de organelas ,el
aislamiento del RNA mensajero de células muy
específicas, el análisis del DNA (con fines
clínicos o forenses), el aislamiento y
purificación de proteínas, etc.
En un escenario ideal, empieza a ser posible por
ejemplo el detectar mediante screening los
cambios iniciales que se producen en la
malignización de las células. En efecto, la
inyección intravascular de "nanovectores"
(nanoestructuras sólidas o huecas con un
diámetro entre 1 y 1000 nanómetros) permite la
visualización no invasiva e in vivo de ciertos
marcadores moleculares, pudiendo detectarse
así, en fases muy precoces, muchas
enfermedades.
En este mismo sentido se están empleando
nanopartículas "inteligentes" para estudiar la
actividad de la telomerasa. A nivel experimental
y gracias también a nanopartículas marcadas con
integrinas se ha conseguido obtener imágenes de
la angiogénesis mediante RMN. Igualmente se
están utilizando nanopartículas de óxido de
hierro, conjugadas con anexina-V que a su vez
es capaz de reconocer a la fosfatidilserina
presente en las células con apoptosis, para
estudiar in vitro, mediante RMN la apoptosis
celular inducida. Este campo tiene y tendrá
muchas otras más aplicaciones clínicas,
especialmente en el estudio del cáncer.
Actualmente, con la posibilidad de controlar las
aposiciones
moleculares
(a
un
rango
nanométrico) se ha hecho posible incrementar en
un millón la densidad de capas de información
integrada en los llamados "nanoarrays". Esta
información, basada en la lectura de
nanopartículas fluorescentes está especialmente
orientada al estudio ultrasensible de las
alteraciones de los ácidos nucleicos o a la
detección de perfiles proteómicos.
Los llamados "quantum dots" (nanopartículas
semiconductoras recubiertas con un polímero
inerte) bioconjugadas con anticuerpos marcados
se utilizan como sensores ópticos, para
reconocer visualmente la presencia de
determinadas moléculas en células vivas.
Existen también sensores biomoleculares de
detección masiva, capaces de detectar al mismo
tiempo un gran número de diferentes moléculas
proteómicas del suero o tejidos, y se utilizan
para el diagnóstico, pronóstico y monitorización
terapéutica de determinados cánceres, entre
ellos, el cáncer prostático. Estos multisensores
se basan en los llamados micro o
Salvador Camacho Garrido
"nanocantilever arrays" que consisten en un
gran número de micro o "nanopalancas" capaces
de sufrir una deflexión cuando se fijan a ellas
determinadas biomoléculas. Estas deflexiones
son analizadas mediante luz láser.
Los "nanoalambres" de silicona son otros
sensores biomoleculares de detección masiva y
simultánea. Operan como biotransistores de
efecto campo a escala nanométrica, dando a
conocer mediante cambios en su conductancia,
las posibles fijaciones de determinadas
moléculas en su superficie. Entre sus
aplicaciones prácticas está la posibilidad de
detectar diferentes tipos de virus. Para la
detección molecular in vivo se empiezan a
utilizar a nivel experimental sensores
implantables, equipados con una tecnología
capaz de enviar la información al exterior del
organismo. No obstante estos sensores
implantados tienen aún el inconveniente de que
muy pronto se hacen inservibles por la adsorción
inespecífica de proteínas séricas.
También los "nanotubos" de carbono han sido
utilizados como sensores altamente específicos
de los anticuerpos responsables de ciertas
enfermedades autoinmunes.
Los "nanofiltros" fabricados en chips de
silicona, con poros que oscilan entre rangos de 5
y 100 nanómetros se están utilizando para
separación de moléculas, transporte y entrega
controlada de fármacos, inmunoaislamiento de
células y para el transporte y caracterización del
DNA.
Este campo tiene y tendrá muchas otras más
aplicaciones.
138
Ensayos Biotecnológicos
TEMA VII. IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS Y
PROTEÍNAS
160.
PROTEÓMICA.
La proteómica puede definirse como la
genómica funcional a nivel de proteínas. Es la
ciencia que correlaciona las proteínas con sus
genes; estudia el conjunto completo de proteínas
que se pueden obtener de un genoma. La
proteómica intenta resolver preguntas como:
¿Qué función tienen las proteínas?, ¿Qué tipo de
modificaciones postransduccionales sufren las
proteínas y cuál es su función?, ¿Cómo varían
las proteínas de una célula enfrentada a distintas
condiciones ambientales?
Conocer el proteoma de un organismo es tener
una imagen dinámica de todas las proteínas
expresadas por ese organismo, en un momento
dado y bajo determinadas condiciones concretas
de tiempo y ambiente. Las células expresan
varios miles de proteínas diferentes y cada una
de ellas puede experimentar numerosas
modificaciones en respuesta a microambientes
diferentes.
También es posible entender la proteómica como
el conjunto de técnicas que permiten analizar el
conjunto de proteínas presentes en la célula en
determinado momento, o sea, el proteoma.
Estas
técnicas
incluyen
el
2D-PAGE
(electroforesis de poliacrilamida de dos
dimensiones) y la MS (espectrometría de
masas). La manera más fácil de hacer un estudio
proteómico es comparar los proteomas de dos
condiciones y observar sus diferencias.
Las principales áreas de estudio de la proteómica
son:
• Identificación
de
proteínas
y
caracterización de sus modificaciones
postraducionales
• Proteómica de "expresión diferencial"
• Estudio de las interacciones proteínaproteína
La espectrometría de masas (MS) presenta
numerosas ventajas frente al método de Edman:
es más sensible, permite analizar directamente
las mezclas proteicas y ofrece un mayor
rendimiento por muestra.
Por ello, es el método utilizado en las dos
técnicas de identificación de proteínas más
comunes: la identificación por “huella peptídica”
y el análisis MS/MS.
161.
ESPECTROMETRÍA DE
Salvador Camacho Garrido
MASAS.
La espectrometría de masas (MS) permite
analizar la composición de diferentes elementos
químicos e isótopos atómicos, separando los
núcleos por su relación masa-carga.
Análisis MS/MS
Las etapas para el análisis son:
• Digestión en solución
• Extracción de los péptidos
• Espectrometría
de
masas
de
ionización por electrospray
• Utilización de bases de datos
La ionización por electrospray (ESI) es una
técnica utilizada en espectrometría de masas
para producir iones (ESI-MS).
Es especialmente útil en la producción de iones
a partir de macromoléculas, pues supera la
propensión de estas a fragmentarse cuando se
ionizan. El desarrollo de la ionización por
electrospray para el análisis de macromoléculas
biológicas fue premiado con el premio Nobel de
química a John Bennett Fenn en 2002.
•
•
•
•
Funcionamiento
Se introduce el analito (ion) disuelto en un
solvente más volátil por un capilar de metal
muy pequeño y cargado.
Debido a la repulsión de las cargas
eléctricas, el líquido se sale del capilar y
forma un aerosol, una nube de pequeñas
gotas (10 μm) altamente cargadas.
Conforme el solvente se evapora, las
moléculas de analito se aproximan, se
repelen y finalmente, cuando la repulsión de
las cargas positivas vence la tensión
superficial, estallan las gotas (Explosión de
Coulomb).
El proceso se repite hasta que el analito está
libre de solvente, de modo que no quedan
139
Ensayos Biotecnológicos
más que iones.
• Los iones se mueven hacia el analizador de
masas.
Una de las ventajas de la Espectrometría de
masas de ionización por electrospray es que
puede acoplarse online a la cromatografía
líquida, pues, a diferencia de lo que sucede en el
MALDI-TOF, el volumen de muestra es
suficientemente grande.
La comparación de los datos del espectro de
fragmentación
experimental
con
los
almacenados en bases de datos es similar al
llevado a cabo en la identificación por huella
peptídica: las coincidencias entre los datos
experimentales y los datos del servidor se
muestran en orden decreciente de probabilidad.
Para evaluar la identificación de la proteína se
ha de tener en cuenta su presencia en las bases
de datos, maximizar la asignación de fragmentos
generados y comprobar si las características de
la proteína identificada y la proteína problema
coinciden. No obstante, para mejorar la
precisión de la identificación es recomendable
repetir varias veces el proceso de identificación
del péptido, para disponer así de varios espectros
de fragmentación.
162.
IDENTIFICACIÓN POR
HUELLA PEPTÍDICA.
La huella peptídica o PMF (Peptide mass
fingerprinting), es una técnica analítica de
identificación de proteínas desarrollada en 1993
por varios grupos de forma independiente. En
este método, la proteína desconocida en estudio
es hidrolizada (mediante proteasas específicas de
secuencia, generalmente la tripsina) en pequeños
péptidos cuyas masas absolutas pueden
determinarse mediante un espectrómetro de
masas acoplado al detector adecuado, como el
MALDI-TOF o el ESI-TOF.
Salvador Camacho Garrido
Las masas obtenidas son comparadas con una
base de datos biológica de proteínas cuya
secuencia se conoce o bien a través de
información genómica, esto es, mediante un
enfoque in silico. Para este menester se emplean
herramientas de software capaces de traducir las
secuencias
nucleotídicas
del
genoma,
depositadas en la base de datos, a secuencias de
aminoácidos (esto es, los componentes de las
proteínas); luego, se corta teóricamente la
secuencia de la cadena polipeptídica y se
calculan las masas absolutas de los péptidos
obtenidos. La ulterior comparación entre huella
de tamaños de péptidos obtenida con las
depositadas en la base de datos permite asociar
estadísticamente la proteína desconocida con la
más semejante de la base de datos (asociación
que puede ser de identidad).
La mayoría de las bases de datos asumen que la
proteína está constituida de un sólo péptido, lo
que supone una desventaja.
Para el uso de la técnica de la huella peptídica
debe disponerse de la proteína pura, o, de existir
mezclas de dos o tres, debe acoplarse un MS/MS
adicional.
Como paso preparativo, el aislamiento de la
proteína de interés suele realizarse mediante
electroforesis en gel bidimensional o mediante
electroforesis SDS-PAGE.
Los análisis adicionales mediante MS/MS
pueden ser directos, generalmente mediante
MALDI-TOF/TOF o nanoLC-ESI-MS/MS, y
análisis de los elementos recortados del gel de
electroforesis bidimensional.
163.
MALDI-TOF.
MALDI-TOF es una técnica de ionización suave
utilizada en espectrometría de masas. Se
denomina MALDI por sus siglas en inglés
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
(desorción/ionización láser asistida por matriz) y
TOF por el detector de iones que se acopla al
MALDI y cuyo nombre procede también de sus
siglas en inglés Time-Of-Flight.
MALDI-TOF
permite
el
análisis
de
biomoléculas (biopolímeros como las proteinas,
los péptidos y los azúcares) y moléculas
orgánicas grandes (como los polímeros, los
dendrímeros y otras macromoléculas) que
tienden a hacerse frágiles y fragmentarse cuando
son ionizadas por métodos más convencionales.
Funcionamiento
La macromolécula es primero implantada en una
matriz sólida que, a menudo, consiste en un
material orgánico como ácido trans-3140
Ensayos Biotecnológicos
indoleacrílico y sales inorgánicas como cloruro
de sodio o trifluoruroacetato de plata.
Se utiliza una matriz para proteger a la
biomolécula de ser destruida y para facilitar la
vaporización y la ionización.
La muestra es entonces irradiada con un láser
pulsado, como un láser de nitrógeno. La energía
del láser expulsa iones electrónicamente
excitados
de
la
matriz,
cationes
y
macromoléculas neutras, que crean una densa
nube de gas por encima de la superficie de la
muestra. La macromolécula es ionizada por las
colisiones y acomplejación con pequeños
cationes.
El MALDI-TOF es un instrumento muy
utilizado en proteómica para la identificación de
proteínas, en particular, en la identificación por
huella peptídica.
164.
OTRAS TÉCNICAS.
Además de las descritas, se emplean otras
técnicas o más clásicas o más novedosas. Entre
ellas merece la pena destacar:
• La electroforesis automática.
• Las células artificiales.
Electroforesis automática
Son sistemas totalmente automatizados para la
realización de proteinogramas en acetato de
celulosa. Los sistemas aplican los sueros, corren
la electroforesis, colorean y decoloran la tira y la
leen automáticamente, transmitiendo los datos al
ordenador que controla la máquina, con un
potente software de gestión de los trazados
electroforéticos.
Mapa de péptidos (MALDI-TOF)
Extracto crudo digestión “en gel”
14000
Intensidad
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
1000
1500
2000
2500
3000
m/z
Mediante el método denominado “peptide mass
fingerprinting” las proteínas se identifican por
comparación de una lista de masas peptídicas
experimentales con la lista de masas peptídicas
calculadas de todas las entradas de una base de
datos.
Identificación de la proteína a partir del mapa de péptidos
(“peptide-mass fingerprinting”)
Búsqueda en MASCOT
(D.Pappin, ICRF, Londres)
1. gi|191618 Mass: 223549 Score: 87
(M76598) alpha cardiac myosin heavy chain [Mus musculus]
Observed
Mr(expt) Mr(calc)
Delta
Start
End Miss
1061.02
1060.01
1060.13
-0.12
1366 - 1374
0
1085.02
1084.01
1084.32
-0.31
436 443
0
1239.27
1238.26
1238.28
-0.01
1253 - 1262
0
1346.49
1345.48
1345.52
-0.04
24 34
0
1442.63
1441.62
1441.61
0.02
1680 - 1691
0
1489.17
1488.16
1488.57
-0.41
1117 - 1128
0
1602.80
1601.79
1601.82
-0.02
955 968
1
1703.76
1702.75
1702.90
-0.14
1423 - 1436
0
1741.93
1740.92
1740.98
-0.06
726 741
0
1840.03
1839.02
1838.99
0.03
1179 - 1195
0
1896.08
1895.07
1895.02
0.06
1198 - 1214
0
1979.38
1978.37
1978.18
0.19
1620 - 1636
0
2107.39
2106.38
2106.35
0.03
1619 - 1636
1
2277.72
2276.71
2276.54
0.17
1063 - 1081
1
2343.63
2342.62
2342.42
0.20
887 906
0
2809.57
2808.56
2809.04
-0.48
1000 - 1024
1
2837.05
2836.04
2836.07
-0.02
1654 - 1678
1
No match to: 1771.94
Salvador Camacho Garrido
Peptide
ANSEVAQWR
MFNWMVTR
TLEDQANEYR
LEAQTRPFDIR
NNLLQAELEELR
IEELEEELEAER
DIDDLELTLAKVEK
LQNEIEDLMVDVER
ILNPAAIPEGQFIDSR
DLEEATLQHEATAAALR
HADSVAELGEQIDNLQR
MEGDLNEMEIQLSQANR
KMEGDLNEMEIQLSQANR
LTQESIMDLENDKLQLEEK
NDLQLQVQAEQDNLNDAEER
ALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTK
DTQLQLDDAVHANDDLKENIAIVER
Es válido para suero, orinas concentradas,
hemoglobina, con una capacidad de procesado
de 8 muestras en técnica semimicro por tira y 24
muestras por ciclo, lo que da una velocidad
media de 24 muestras/ 80 min.
Células Artificiales
El método, basado en un tipo de emulsión
denominado WOW (Water-Oil-Water), toma un
segmento de las células vivas, las cuales utilizan
una membrana grasa para mantener el medio
interior separado del medio exterior. La capa
aceitosa que rodea cada minúscula gotita de
agua actúa como barrera, conteniendo de esta
manera genes, proteínas y otros materiales.
Paralelamente, se insertan en las gotas, bacterias
inofensivas que contenían genes a analizar. El
hecho de limitarse a realizar pruebas
individuales dentro de una célula tipo burbuja
permite emplear un método ampliamente
utilizado en el análisis de las células vivas.
Este método se basa en la introducción de un
marcador fluorescente que se “enciende” al ser
141
Ensayos Biotecnológicos
activado por la proteína apropiada, y la
clasificación de las células para encontrar
aquellas que contienen las proteínas marcadas y
sus genes de codificación.
Los dispositivos automatizados para la
clasificación de las células pueden manejar
millares de gotitas por segundo.
165.
TIPADO MOLECULAR DE
MICRORGANISMOS.
La sociedad actual demanda el “tipado”
molecular de los microorganismos, puesto que
dentro incluso de una misma especie, no todos
los microorganismos presentan la misma
virulencia, morbilidad o mortalidad, ni tampoco
la misma resistencia a fármacos o antibioticos.
Por tanto, además de los métodos clásicos, se
exige la puesta a punto de métodos de tipo
molecular, o dirigidos
a una determinada
molécula, una proteína, o a indeterminado gen o
secuencia de gen productora de dicha molécula.
Ello ha dado lugar a que podamos clasificar las
técnicas en:
• Técnicas clásicas
• Técnicas inmunológicas
• Técnicas genéticas
Técnicas clásicas
Los Métodos clásicos son los usados por la
Medicina, la Fisiología y la Microbiología y
adolecen de inmediatez, lo que en términos de
salud pública puede suponer graves riesgos:
Comprenden:
• Estudios morfológicos.
• Ensayos de tinción.
• Pruebas bioquímicas.
• Cultivos
clásicos
en
medios
diferenciales.
• Antibiogramas.
• Cultivos en medios cromogénicos.
Salvador Camacho Garrido
166.
TÉCNICAS
INMUNOLÓGICAS.
El diagnóstico rápido de las enfermedades
infecciosas se ve facilitado por el empleo de
técnicas inmunológicas abreviadas. Ninguna de
ellas es tan específica o sensible como el cultivo,
por lo que este último debe ser considerado el
"estándar de oro" frente a cualquier
comparación.
Las técnicas inmunológicas pueden estar
orientadas a la búsqueda de anticuerpos o de
antígenos.
Las destinadas a la búsqueda de anticuerpos
necesitan del tiempo necesario para que se
produzca un alza significativa del título de
anticuerpos.
Los antígenos en cambio, pueden ser detectados
desde el comienzo de la enfermedad. Constituye
una ventaja el que aún durante el tratamiento
con antibióticos, los antígenos sean detectables.
Entre
las
enfermedades
infecciosas
diagnosticadas por exámenes serológicos están
sífilis, rubéola, leptospirosis, toxoplasmosis,
mononucleosis infecciosa, etc.
Existen diferentes exámenes que permiten su
titulación, entre los que se cuentan aglutinación,
precipitación, fijación del complemento,
hemoaglutinación, neutralización,
inmunofluorescencia,
ensayo
inmunoenzimático,
radioinmunoensayo, etc.
Los exámenes serológicos se usan en la
determinación del grado de inmunidad que
posee un sujeto para el diagnóstico de una
infección aguda.
• Diagnóstico del estado inmune.
Es de interés verificar el estado inmune del
sujeto. Una situación de este tipo, por ejemplo,
es determinar el grado de inmunidad frente a
rubéola en una mujer en edad fértil.
• Diagnóstico de infección aguda.
El diagnóstico de infección aguda se establece
comparando los títulos de dos sueros pareados,
uno obtenido en la fase aguda y otro en la fase
de convalescencia, o 14 días después de la
primera muestra. El suero de fase aguda debe
obtenerse tan temprano como sea posible en el
142
Ensayos Biotecnológicos
transcurso de la enfermedad. El suero de la fase
convaleciente debe extraerse no antes de 10 días
de comenzada la enfermedad, de preferencia 2-4
semanas después.
• Sueros pareados.
Cuando se usan sueros pareados, la conversión
de seronegativo a seropositivo o un aumento de
4 veces o más del título de anticuerpos obtenido
inicialmente es indicador de infección reciente.
Sería altamente recomendable que en todo
paciente hospitalizado con un estado febril no
diagnosticado, se guarde una muestra de suero
congelado, para su uso en eventuales estudios
serológicos. Para que las pruebas serológicas
pareadas tengan validez ambas muestras de
suero (fase aguda y fase de convalescencia)
deben procesarse simultáneamente.
• Muestra única de suero (fase aguda).
Una muestra única de suero también puede ser
útil para el diagnóstico. Los anticuerpos tipo
Igm aparecen tempranamente durante la
infección primaria y persisten por varias
semanas. Por lo tanto, la presencia de
anticuerpos Igm es indicadora de infección
reciente.
167.
EL SISTEMA INMUNITARIO.
El término inmunidad tiene su origen en un
vocablo romano que significa privilegio de
exención o ‘estar libre’ y que hace referencia a la
capacidad que poseen los seres vivos de no
sufrir continuamente las enfermedades que
ocasionan la agresión de los microorganismos.
Se relaciona, por tanto, con las enfermedades de
origen microbiano, pero también con
enfermedades no infecciosas como alergias,
anafilaxia y asma, por errores en este Sistema
Inmunológico.
El sistema inmunitario (SI) protege al organismo
de una amplia variedad de agentes infecciosos
(bacterias, hongos, parásitos y virus) que pueden
ocasionar en el organismo que los recibe
diferentes enfermedades. Para ello es capaz de
reconocer a los componentes del agente
patógeno e iniciar una serie de respuestas
encaminadas a eliminarlo y cuyas características
fundamentales son
• La especificidad
• La memoria
Inmunizaciones
Salvador Camacho Garrido
Respuesta inmunológica
Desde una concepción clásica se ha hablado de
dos tipos de respuesta inmunológica:
• Inmunidad
humoral cuando la
respuesta inmunitaria está mediada por
anticuerpos
• Inmunidad
celular cuando está
mediada por células.
Ambos tipos de respuesta pueden tener la
característica de ser:
• Específicas a un determinado patógeno
o por el contrario
• Inespecífica o producirse de un modo
general.
Disfunciones
Las principales células que participan en las
respuestas inmunitarias son los leucocitos, los
glóbulos blancos de la sangre, de los que se
distinguen varios tipos siendo los principales los
linfocitos y los fagocitos que, mediante su
presencia y la secreción de diferentes sustancias
solubles que son capaces de producir, median en
la respuesta del SI ante una agresión.
Las disfunciones del SI se pueden entender en
una triple vertiente:
• Hipersensibilidad:
respuesta
inmunitaria exagerada (véase alergia,
asma y anafilaxia)
• Inmunodeficiencia:
respuesta
inmunitaria ineficaz (por ejemplo el
Síndrome
de
Inmunodeficiencia
Adquirida o SIDA)
• Enfermedad autoinmune: reacción
inadecuada frente a autoantígenos
168.
ANTÍGENOS Y
ANTICUERPOS.
Se entiende como antígeno (Ag) cualquier
molécula
que
puede
ser
reconocida
específicamente por cualquiera de los
componentes del SI; en un sentido más
restrictivo se entiende como Ag cualquier
molécula capaz de inducir la producción de
anticuerpos específicos.
Los anticuerpos (Ac), también conocidos como
inmunoglobulinas, son un grupo de moléculas
143
Ensayos Biotecnológicos
séricas que producen los linfocitos B. Los
diferentes tipos de Ac tienen una estructura
básica común a todos ellos, pero el sitio por el
que se unen al Ag es específico de cada uno; la
parte de la molécula que se une al Ag se
denomina región Fab (fragment antigen
binding) mientras que la zona que interactúa con
otros elementos del SI se denomina región Fc.
Algunas células del SI tienen sobre su superficie
receptores de Fc por lo que si un Ac se une a un
patógeno esas células también pueden unirse a
él. La zona de la molécula del Ag a la que se une
el Ac se denomina epítopo y una molécula de
Ag puede tener varios de ellos por lo que los Ac
en realidad son específicos de un epítopo y no de
la molécula completa de Ag.
Los linfocitos B están programados para
codificar un receptor de superficie especifico de
un determinado Ag tras lo cual se multiplican y
se diferencian en células plasmáticas que
producen los Ac. También los linfocitos T
pueden reconocer Ag aunque no producen Ac.
Los linfocitos B y T están programados
genéticamente para ser capaces de reconocer
específicamente a un determinado Ag antes
incluso de haber entrado en contacto con él.
Cuando se produce el contacto entre el linfocito
y el Ag, los linfocitos que son capaces de
reconocerlo
empiezan
un
proceso
de
proliferación que conduce en pocos días a la
existencia de un número suficiente para
ocasionar una respuesta inmunitaria que permita
la eliminación del Ag.
El proceso por el que los linfocitos, que son
capaces de reconocer a un determinado antígeno,
proliferan se llama selección clonal. Una vez
producido el contacto inicial con un antígeno
determinado, los sucesivos contactos con el
mismo antígeno se van a caracterizar por obtener
una respuesta mucho más rápida y enérgica que
la inicial debido a que ésta da lugar a la
producción de linfocitos de memoria que
persisten.
El sistema inmunitario dispone de diferentes
mecanismos de defensa que se denominan
genéricamente sistemas efectores; ejemplo de
ellos son la neutralización, la fagocitosis,
Salvador Camacho Garrido
reacciones citotóxicas o la apoptosis celular
(muerte celular programada).
169.
EL SISTEMA LINFOIDE.
Las células que participan en las respuestas
inmunitarias se organizan para formar tejidos y
órganos; el conjunto de ellos se denomina
sistema linfoide.
Existen dos grandes grupos de órganos linfoides,
los primarios o centrales y los secundarios o
periféricos.
• Órganos linfoides primarios:
En ellos se desarrollan y se diferencian los
linfocitos dando lugar a células maduras a partir
de sus precursores (proceso denominado
linfopoyesis). En los humanos, la población de
linfocitos T madura en el timo y la de linfocitos
B en la médula ósea y en el hígado fetal. En
estos órganos se adquiere el repertorio de
receptores específicos de Ag’s de tal forma que
se presenta tolerancia a los autoantígenos
(moléculas propias capaces de inducir una
respuesta inmune), y cuando viajan a la periferia
solo se reconocen Ag’s extraños.
• Órganos linfoides secundarios:
Es necesaria la presencia de macrófagos, células
presentadoras de antígenos además de linfocitos
T y B maduros para que se produzca la respuesta
inmunitaria y se crean en estos órganos.
Estos órganos son el bazo, los ganglios linfáticos
y otros tejidos asociados a la inmunidad de las
mucosas, como las amígdalas y las placas de
Peyer intestinales; la médula ósea también actúa
como órgano secundario.
144
Ensayos Biotecnológicos
170.
LAS CÉLULAS DEL
SISTEMA INMUNITARIO.
Todas las células del SI tienen su origen en
células madres de la médula ósea que originan
fundamentalmente dos tipos de diferenciación,
la linfoide, que da lugar a los linfocitos, y la
mielode, que da origen a los fagocitos.
Existen por lo tanto en el SI dos grandes tipos de
células que intervienen en los procesos de
inmunidad: los fagocitos y los linfocitos.
Además existen otras células, como las células
presentadoras de antígeno (CPA) a las células
T, mastocitos, células endoteliales, etc., que
también intervienen en las respuestas
inmunitarias y que no pertenecen a ninguno de
estos grupos.
Fagocitos
Los fagocitos son capaces de ingerir y degradar
antígenos y microorganismos. Dentro de ellos
encontramos los fagocitos mononucleares y los
neutrófilos polimorfonucleares.
La función de los fagocitos es fagocitar a los
patógenos, antígenos y deshechos celulares,
gracias a un proceso en el que también
participan los anticuerpos y los componentes del
sistema del complemento e incluyen a:
• Neutrófilos:
Son los leucocitos más abundantes (>70%). Su
tamaño es de 10-20 μ de diámetro y se clasifican
como granulocitos debido a sus gránulos
citoplasmáticos de lisosomas y de lactoferrina.
Pasan menos de 48 horas en la circulación antes
de migrar a los tejidos, debido a la influencia de
los estímulos quimiotácticos. Es en ellos donde
ejercen su acción fagocítica y eventualmente
mueren.
Salvador Camacho Garrido
• Monocitos:
Células circulares que se originan en la médula
ósea y constituyen cerca del 5% del total de
leucocitos de la sangre, donde permanecen sólo
unos tres días. Después atraviesan las paredes de
las vénulas y capilares donde la circulación es
lenta. Una vez en los órganos, se transforman en
macrófagos, lo que se refleja en el aumento de
su capacidad fagocítica, de la síntesis de
proteínas, el número de lisosomas y la cantidad
de aparato de Golgi, microtúbulos y
microfilamentos. Estos últimos se relacionan
con la formación de seudópodos, responsables
del movimiento de los macrófagos.
• Macrófagos:
Se trata de células de gran tamaño con función
fagocítica, presente en la mayoría de los tejidos
y cavidades. Algunos permanecen en los tejidos
durante años y otros circulan por los tejidos
linfoides secundarios. También pueden actuar
como células presentadoras de antígenos.
Linfocitos
Los linfocitos son de dos clases principales,
según donde se desarrollan:
• Linfocitos B
• Linfocitos T
En los humanos, las células B se diferencian en
la médula ósea y en el hígado fetal y las células
T en el timo. En estos órganos en los que se
diferencian los linfocitos, órganos linfoides
primarios, las células B y T adquieren la
capacidad para reconocer Ag’s por medio de la
145
Ensayos Biotecnológicos
adquisición de receptores de superficie
específicos.
Los linfocitos controlan la respuesta inmune.
Reconocen el material extraño (antigénico) y lo
distinguen del propio. Se clasifican en dos tipos
principales:
• Células B:
Representan cerca del 5-15% de todos los
linfocitos circulantes. En el feto, se producen en
el hígado y después en la médula ósea. Se
distribuyen en los tejidos linfoides secundarios y
responden a los estímulos antigénicos
dividiéndose y diferenciándose a células
plasmáticas,
liberadoras
de
anticuerpos
(inmunoglobulinas), gracias a la acción de
citocinas secretadas por las células T.
• Células T:
Se desarrollan en el timo a partir de células
madre linfocíticas de la médula ósea de origen
embrionario. Después expresan receptores
antigénicos específicos y se diferencian en dos
subgrupos. Uno expresa el marcador CD4 y el
otro el CD8. A su vez, constituyen diferentes
poblaciones que son: los linfocitos T Helper
(auxiliadores), los citotóxicos y los supresores.
Sus funciones son:
1) ayudar a las células B a producir anticuerpos
2) reconocer y destruir a los patógenos y
3) controlar el nivel y la calidad de la respuesta
inmunológica.
Existe una tercera clase de linfocitos que no
expresan receptores de Ag’s y que se denominan
células asesinas naturales (NK, natural killer).
Se calcula que en el organismo humano existen
del orden de 1012 células linfoides y que
aproximadamente 109 linfocitos se producen
diariamente; la mitad de ellos se renuevan en
poco más de un día, sin embargo otros persisten
durante años e incluso algunos, probablemente,
de por vida.
Los linfocitos producen moléculas de diversa
naturaleza que se denominan de un modo
general mediadores solubles de la inmunidad.
Los principales son los anticuerpos y las
citoquinas, pero además producen diferentes
Salvador Camacho Garrido
substancias séricas, como el complemento, que
actúan en procesos inflamatorios.
Durante la respuesta inmunitaria las citoquinas
transmiten señales entre diferentes tipos
celulares; entre sus principales tipos se
encuentran los interferones (IFN) que evitan la
diseminación de algunas infecciones víricas, las
interleucinas (IL) que fundamentalmente
inducen la diferenciación y multiplicación de
algunas células, los factores estimulantes de las
colonias (CSF) que intervienen en la
diferenciación y multiplicación de las células
madre de la médula ósea, los factores de
necrosis tumoral (TNF) o el factor
transformador del crecimiento (TGF).
Los linfocitos B están programados para
codificar un receptor de superficie específico de
un determinado Ag tras lo cual se multiplican y
diferencian en células plasmáticas que producen
Ac.
Los linfocitos T tienen diversas funciones.
Algunos interactúan con las células B y los
fagocitos mononucleares y se denominan células
T colaboradoras (células Th, de Helper); otras
destruyen células infectadas por agentes
intracelulares y se denominan células T
citotóxicas (Tc). La mayoría (más del 90%) de
las células T son células Th.
171.
ENSAYOS
INMUNOLÓGICOS.
Dentro de los procedimientos inmunológicos,
los más útiles y prácticos son los que se basan en
la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo.
La propiedad que tienen las inmunoglobulinas
de unirse a un antígeno, la especificidad de esta
unión y el hecho de que pueda ser visualizable
por fenómenos de precipitación, aglutinación y
otros mecanismos indirectos (marcaje con
fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas)
hacen que éstos métodos se utilicen de forma
muy amplia.
Los ensayos pueden hacerse con dos tipos de
anticuerpos:
Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales son los anticuerpos
que se derivan de muchas y diversas células o
variedades de células, similares a la mezcla de
anticuerpos encontrados en sueros.
Los anticuerpos policlonales son por lo tanto una
mezcla de muchas diversas especificidades.
Podemos afirmar que los anticuerpos
policlonales corresponden a múltiples epítopes y
tienden a contener varias inmunoglobulinas.
146
Ensayos Biotecnológicos
•
Anticuerpos monoclonales
Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo
homogéneo producido por una célula híbrida
producto de la fusión de un clon de linfocitos B
descendiente de una sola y única célula madre y
una célula plasmática tumoral.
Los anticuerpos monoclonales (Mab, del inglés
monoclonal antibody), son anticuerpos idénticos
porque son producidos por un solo tipo de célula
del sistema inmune, es decir, todos los clones
proceden de una sola célula madre. Es posible
producir anticuerpos monoclonales que se unan
específicamente con cualquier molécula con
carácter antigénico. Este fenómeno es de gran
utilidad en bioquímica, biología molecular y
medicina.
Aunque el principio es idéntico en todas las
técnicas (unión antígeno-anticuerpo) hoy en día
se emplean diversos métodos, basados cada uno
de ellos en un procedimiento distinto para
visualizar la unión.
Reacciones de aglutinación:
• Pruebas de aglutinación directa
• Pruebas de aglutinación indirecta
• Pruebas de inhibición de la aglutinación
2. Inmunoensayos con reactivos marcados.
• Según el tipo de marcador:
• Radioinmunoensayos (RIA)
• Enzimoinmunoensayos (EIA)
• Fluoroinmunoensayos (FIA)
• Según que el formato de ensayo
emplee:
• Reactivo
limitante:
Inmunoensayos
competitivos
• Reactivo en exceso: Inmunoensayos no
competitivos
• Según que el formato de ensayo
implique:
• Separación de fracción libre y enlazada:
Inmunoensayos heterogéneos
• Sin separación: Inmunoensayos homogéneos
172.
TÉCNICAS DE
PRECIPITACIÓN EN GEL.
Cuando la reacción Ag-Ac se realiza en
determinadas condiciones, el complejo formado
se inestabiliza y precipita, de tal forma que el
precipitado formado es fácilmente detectable y
cuantificable.
Inmunodifusión en Gel de Agar
La inmunodifusión en gel de agar (AGID) es
una técnica que permite la visualización de un
anticuerpo pero necesita de dos días para
confirmar un diagnóstico. Se coloca el suero a
analizar en un lugar, un control positivo en otro
lugar, y el antígeno soluble en el tercer lugar (en
la parte superior también).
La formación de una línea blanca de la
precipitación entre la muestra y el antígeno
(flecha en la imagen) se considera un resultado
positivo.
Una clasificación
1. Inmunoensayos directos.
Medida directa del complejo Ag-Ac.
• Reacciones de precipitación sobre gel:
• Pruebas de inmunodifusión
• Inmunoelectroforesis
• Reacciones de precipitación en
disolución:
• Inmunonefelometría
• Inmunoturbidimetría
Salvador Camacho Garrido
147
Ensayos Biotecnológicos
Técnicas de doble difusión
Se conoce como Técnica Ouchterlony:
Inmunodifusión Radial
La inmunodifusión radial es una técnica de
análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se
utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos
IgG, IgM e IgA que hay en el suero de un
individuo.
La técnica de inmunodifusión radial es lenta y
poco sensible ya que necesita mucha cantidad de
anticuerpos (o antígeno) para que se formen
complejos.
El antígeno en suspensión se mezcla con agaragar en estado líquido y luego éste se vierte
sobre una placa (generalmente un portaobjetos
de microscopía). Una vez solidificado, con una
pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) que
contendrán la muestra de suero. Se deja incubar
de modo que el suero con anticuerpos se difunde
por la placa de agar y reacciona con el antígeno
embebido en la placa. Al cabo de 24 horas se ha
creado un precipitado fruto de la reacción entre
antígeno y anticuerpo que se muestra en la placa
como una línea blanca rodeando al pocillo (en
ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar
su visionado). El diámetro de este círculo es un
reflejo de la concentración de anticuerpos que
teníamos en la muestra de suero, de modo que a
mayor diámetro, mayor concentración de
anticuerpo.
Salvador Camacho Garrido
Para cuantificar la cantidad exacta de
anticuerpos es preciso disponer de una recta
estándar (o patrón) previamente creada. Esta
recta se hace a partir de muestras de anticuerpos
conocidas en cada pocillo, que reaccionan con el
antígeno; en el eje x el área del círculo y en el
eje y la concentración de anticuerpos conocida.
Al final se comparan los valores obtenidos de la
muestra de suero frente a los valores de la recta
patrón, obteniendo así el valor de la
concentración de anticuerpos para cada muestra
de suero del individuo.
Del mismo modo, se puede calcular mediante
una metodología análoga la cantidad de antígeno
presente en una muestra, embebiendo esta vez
en agar anticuerpo y creando la recta patrón en
base a concentraciones conocidas de antígeno.
Actualmente
las
clásicas
placas
de
inmunodifusión
radial
de
siempre
se
comercializan tipo kit para pequeños volúmenes
de IgA, IgG e IgM, C3, C4, ATIII o transferrina.
148
Ensayos Biotecnológicos
2 horas).
La inmunofijación es un proceso en dos etapas:
1) electroforesis en gel de agarosa,
separación de las proteínas y
2) inmunoprecipitación, aplicación de un
anticuerpo monoespecífico del antígeno
de interés sobre el gel de agarosa. Por
difusión pasiva se produce localmente
una reacción de precipitación antígenoanticuerpo.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis es una técnica
cualitativa que permite la identificación de
diferentes componentes proteicos a través de
arcos de precipitación, que tienen movilidad
electroforética semejante, pero poseen diferente
peso molecular y/o diferentes determinantes
antigénicos.
La
inmunoelectroforesis
se
realiza
preferentemente en geles agarosa y se distinguen
dos etapas:
1) la muestra de proteínas se somete a
separación electroforética y
2) terminada la electroforesis, las
proteínas son precipitadas con antisueros
poli o mono-específicos, aplicados en el
agar en un canal paralelo al eje de
migración.
Luego de un período de difusión en cámara
húmeda, se observan arcos de precipitación cuya
forma y posición dependen de las características
inmunoquímicas y de la concentración de cada
proteína.
173.
TÉCNICAS DE
PRECIPITACIÓN EN DISOLUCIÓN.
En esencia se basa en la formación cuantitativa
de un precipitado, Ag-Ac, y la medida de este
mediante una técnica instrumental.
Se basa en la medida de los efectos producidos
por los complejos Ag-Ac sobre un rayo de luz
que se hace pasar a través de la suspensión en
donde se forman dichos complejos.
Inmunofijación
La inmunofijación es una técnica cualitativa
alternativa
y/o
complementaria
de
la
inmunoelectroforesis
que
permite
la
identificación de componentes proteicos a través
de la formación de bandas de precipitación
antígeno-anticuerpo en un corto tiempo de
incubación.
La ventaja de esta técnica con respecto a la
inmunoelectroforesis es su mayor sensibilidad y
un tiempo corto de obtención de resultados (1 a
Salvador Camacho Garrido
149
Ensayos Biotecnológicos
Inmunopreciipitación
Aplicación: Detección del grupo sérico ABO
Inmunoturbidimetría
Inmunonefelometría
174.
TÉCNICAS DE
AGLUTINACIÓN.
Cuando el antígeno se encuentra unido o
formando parte de células, bacterias o partículas,
la reacción Ag-Ac puede ser detectada por el
aglutinado celular o bacteriano formado, que es
fácilmente visualizable.
Aglutinación indirecta
También denominadas de aglutinación pasiva.
Células o partículas insolubles soportan los
antígenos que aunque son reconocidos por los
anticuerpos no pueden aglutinarse por lo que se
requiere la presencia de un anticuerpo
antiinmunoglobulina
para
realizar
la
aglutinación.
Aglutinación directa
Agrupamiento de una suspensión de partículas
debido a la reacción entre un Ag presente en la
superficie de las mismas y un Ac específico
contra él.
Salvador Camacho Garrido
150
Ensayos Biotecnológicos
anticuerpos anti-toxoplasma.
Para la detección de Ag se utilizan ensayos de
aglutinación indirecta inversa. En este caso se
emplea como reactivo partículas recubiertas de
Ac. Ejemplo detección del Ag de superficie de la
Hepatitis B.
Inhibición de la aglutinación
Aplicaciones: Test del embarazo
Test de Coombs
Existen dos tipos de Test de Coombs:
7. Directo
Es una prueba que se utiliza para medir la
presencia de anticuerpos en la superficie de los
glóbulos rojos.
El examen de Coombs directo se utiliza para
detectar autoanticuerpos contra los propios
glóbulos rojos (GR) de un individuo. Muchas
enfermedades y medicamentos (por ejemplo,
quinidina, metildopa y procainamida) pueden
llevar a la producción de estos anticuerpos.
Estos anticuerpos algunas veces destruyen los
glóbulos rojos y causan anemia. Este examen
algunas veces se lleva a cabo para diagnosticar
la causa de anemia, ictericia o anomalías en la
apariencia de los glóbulos rojos bajo el
microscopio. También detecta anticuerpos hacia
los glóbulos rojos en la circulación. Es
importante para la determinación de la
compatibilidad entre donador y el receptor en el
caso de transfusiones de sangre. Detecta también
la presencia de anticuerpos anti Rh en la madre
durante el embarazo. Evalúa la necesidad de
administrar inmunoglobulina Rho (D). Ayuda a
confirmar el diagnóstico de anemia hemolítica.
8. Indirecto:
Es una prueba que se utiliza para medir la
presencia de anticuerpos para los glóbulos rojos
en
suero.
El examen de Coombs indirecto detecta
anticuerpos circulantes contra los glóbulos rojos.
El propósito principal de este examen es
determinar si el paciente tiene anticuerpos en el
suero capaces de adherirse a los glóbulos rojos
(aparte de los del sistema principal ABO o los de
tipo Rh).
Aplicación: Detección de Ac. Por ejemplo
Salvador Camacho Garrido
Hemoaglutinación por virus
Algunos virus poseen en su envoltura
proyecciones cortas de una constitución química
definida
(glicoproteínas)
denominadas
hemoaglutininas. Estas tienen la propiedad de
unirse a glóbulos rojos de ciertas especies
animales, formando en suspensión, un enrejado
de glóbulos rojos-virus.
En los virus del grupo Orthomixovirus
(Influenza
humana)
y
Paramixovirus
(Parainfluenza tipo 3) la ubicación de la enzima
neuraminidasa entre las glicoproteínas virales,
determina que en algunos virus (por ejemplo,
Parainfluenza tipo 3) la técnica de
hemoaglutinación deba realizarse a bajas
temperaturas para retrasar la elución de los
eritrocitos por la acción de la neuraminidasa.
La neuraminidasa actúa sobre la unión entre los
glóbulos rojos y la hemoaglutinina provocando
la destrucción del sitio receptor específico en el
glóbulo rojo con posterior elución del virus. Este
fenómeno es visualizado en el fondo del pocillo
de la policubeta por la formación de un pequeño
151
Ensayos Biotecnológicos
botón rojo. Los Adenovirus y Enterovirus son
capaces de hemoaglutinar glóbulos rojos de
ciertas especies, pero no poseen la enzima
neurominidasa, por lo que la hemoaglutinación
es
irreversible.
En
otros
virus,
la
hemoaglutinación está asociada a una fracción
soluble del virus separable de la partícula viral
(Poxvirus).
La característica principal de la técnica de
hemoaglutinación es la rapidez, el bajo costo de
los reactivos y la simplicidad de su realización,
lo que determina su fácil adaptación a
laboratorios de escasa infraestructura.
175.
TÉCNICAS DE
INMUNOFLUORESCENCIA.
La inmunofluorescencia (IF) es una técnica que
emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.
Los fluorocromos son moléculas que al ser
excitadas con la energía de una determinada
longitud de onda son capaces de emitir energía
de una longitud de onda mayor.
Se aplica en diagnóstico de patologías cutáneas
y renales e investigación.
Inmunofluorescencia directa
La IF directa permite la detección de antígenos
en un paso. Utiliza anticuerpos conjugados a
isotiocianato de fluoresceína. La lectura se
realiza en un microscopio de fluorescencia, que
emite luz ultravioleta de una determinada
longitud de onda.
El anticuerpo se marca con fluoresceína, con lo
que se puede conocer la unión Ag-Ac a través
del seguimiento de la fluorescencia emitida por
el mismo.
Las ventajas de la IF son, que es una técnica
rápida, reproducible, permite tinciones dobles e
incluso se aplica en microscopia confocal. Las
desventajas son su baja sensibilidad, que las
reacciones no son permanentes y que, por tanto,
es necesario fotografiar las reacciones positivas
para documentar los casos. Además, requiere
microscopio de fluorescencia, que es un
instrumento de relativo alto costo.
Por otra parte, las muestras deben ser procesadas
en fresco, ya que se requieren cortes por
congelación en criostato. Para enviar las
muestras de piel en fresco se requiere
usualmente envolverla en una gasa humedecida
en suero y procurar que el traslado no se demore
más de 45 minutos. Para el transporte de
muestras desde sitios alejados existe la
posibilidad de utilizar un medio especial de
conservación para el trasporte y para ello es
necesario contactar previamente con el
laboratorio de Anatomía Patológica para las
instrucciones correspondientes.
Salvador Camacho Garrido
152
Ensayos Biotecnológicos
Inmunofluorescencia indirecta
La inmunofluorescencia indirecta permite la
detección de autoanticuerpos circulantes; contra
antígenos
tisulares,
como
anticuerpos
antinucleares (AAN), antitiroídeos (AAT), antiDNA y otros de importancia en enfermedades
autoinmunes de relevancia clínica.
ANTICUERPOS
ANTÍGENO
PATRÓN
FLUORESCENTE
Anti-centrómero
Centrómero
cromosoma
Centromerico en
HEp-2, puede ser
negativo en tejido.
Anti-DNA
DNA doble hebra
Periférico u
homogéneo, típico
pero cualquier es
ibl
Anti-Histona
Proteínas básicas
unidas a DNA
Homogéneo o
periférico.
Anti-Jo-1
Proteína, histidina
tRNA sintetasa
Moteado o no se
detecta
Anti-Nucleolar
Antígenos
nucleolares
Nucleolar
Anti-PCNA
Antígenos
PCNA en HEp-2, no
nucleares de células
se detecta en tejido
en proliferación
Anti-RNP (nRNP,
U1 RNP)
Anti-Sm
Proteína acídica,
U1
ribonucleoproteína
( t t bl )
Nucleoproteína
acídica
(extractable)
Moteado
Moteado
Anti-Scl-70
Proteína no histona
Moteado o no
básica, DNA
detectado
topoisomerasa
Anti-huso
Huso en células en
división
Huso en HEp-2, no
detectado en tejido
Anti-SSA (Ro)
Proteína acídica
Moteado
frecuentemente en
HEp-2, no detectado
t jid
Anti-SSB ( La)
Proteína acídica
(extractable)
Moteado
Salvador Camacho Garrido
176.
TÉCNICAS DE
RADIOINMUNOENSAYO.
El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del
inglés Radioimmunoassay) es un método
radioinmunométrico que se basa en la formación
específica de los complejos Ag-Ac lo que le dota
de una gran especificidad unido a la sensibilidad
de los métodos radiológicos.
Se une al anticuerpo un isótopo radiactivo,
siendo posible la cuantificación del complejo
Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.
RIA Directo
El RIA se basa en la competencia existente entre
el antígeno no marcado y una cantidad conocida
del antígeno marcado para formar los complejos
Ag-Ac o Ag*-Ac. Con estos tres componentes
(Ag, Ag* y Ac) puede realizarse el ensayo en el
que manteniendo constante la cantidad de Ag* y
Ac se observará que a mayor cantidad de Ag
menos Ag* queda unido a la cantidad fija de Ac
(y por tanto menos radiactividad), lo que
permitirá relacionar la radiactividad con la
concentración de Ag. El marcado se realiza con
14
C o 125I.
1. Se obtienen anticuerpos específicos.
Para ello se inyectan en un animal
pequeñas cantidades en varias dosis del
antígeno muy purificado. El animal
generará anticuerpos que podrán ser
recogidos del plasma sanguíneo.
2. Se marca el antígeno radiactivamente.
El antígeno marcado debe seguir siendo
reconocible por el anticuerpo.
153
Ensayos Biotecnológicos
3. Se añaden Ac a una placa de titulación y
quedan unidos al soporte sólido, tras lo
que se agrega el Ag* en cantidad
conocida y el Ag de la muestra
problema.
4. Se elimina el antígeno no unido por
decantación y lavado, y se determina la
cantidad de marcaje unido.
5. Se interpola el valor obtenido en la recta
de calibración que debe haberse
realizado con anterioridad.
Para la realización del calibrado se dispone de
varios tubos en los que se añaden una cantidad
fija de Ac y de Ag* y una cantidad variable de
Ag a la que se añade suero normal para enrasar
al mismo volumen. Así obtendríamos una tabla
como la adjunta.
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
…
Tabla de calibrado
Antisuero Ag* Ag
Suero normal
1mL
1mL 0mL
1mL
1mL
1mL 0,1mL
0,9mL
1mL
1mL 0,2mL
0,8mL
1mL
1mL 0,3mL
0,7mL
1mL
1mL 0,4mL
0,6mL
1mL
1mL 0,5mL
0,5mL
…
…
…
…
calibrado). En este paso se establece una
competencia en la que el Ac se une al
Ag fijo al soporte o al problema.
3. Se eliminan el Ac no inmovilizado y el
Ag soluble y se determina la cantidad de
Ac* que se ha inmovilizado.
4. Se construye una curva de calibrado
representando la cantidad de Ac*
inmovilizado frente a la concentración
de Ag soluble añadida o bien se
interpola la radiactividad medida en esta
curva de calibrado.
RIA de Sandwich
1. Se inmoviliza una concentración fija del
Ac1 (no marcado) en un soporte sólido.
Tras lo que se satura el soporte.
2. Se añade la muestra problema (o de
calibrado) de Ag.
3. Se añade Ac*2 (marcado) que se una a
otro epítopo del Ag.
4. Eliminación del Ac*2 no unido.
5. Se determina la cantidad de anticuerpo
marcado unido.
6. A partir de una recta patrón se interpola
el valor obtenido para saber la
concentración de Ag presente o bien se
realiza la recta de calibrado.
En el tubo 1 Ac no se une a Ag. En el tubo 2 la
mayoría se une a Ag*, la competencia se va
desplazando poco a poco a Ag por lo que la
radiactividad de la muestra va disminuyendo
(disminuyen los complejos Ac-Ag*).
RIA de Inhibición
Usado cuando no se puede marcar el antígeno.
1. Se inmoviliza una cantidad constante de
antígeno en un soporte sólido. Se suele
saturar con BSA, leche en polvo o
caseína para que no se una nada más al
soporte.
2. Se añade una cantidad constante de Ac
marcado (Ac*), el Ag frío a medir (o de
Salvador Camacho Garrido
177.
TÉCNICAS DE
ENZIMOINMUNOENSAYO.
El enzimainmunoanálisis (EIA) es una
metodología que permite cuantificar anticuerpos
o antígenos en muy baja concentración (menos
de 1 ng/ml) en la mayoría de los líquidos
biológicos y sobrenadante de cultivos celulares.
Se ha usado ampliamente en el estudio de la
respuesta de anticuerpos frente antígenos
complejos. En el laboratorio de inmunología se
utiliza corrientemente para detectar y cuantificar
autoanticuerpos y diversas proteínas e
inmunoglobulinas en baja concentración en los
líquidos biológicos.
Podemos decir que utiliza un anticuerpo
marcado con un sistema enzimático, cuya
actividad se modifica en razón a la reacción
antígeno.
El anticuerpo se une a una enzima, con lo que es
154
Ensayos Biotecnológicos
posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a
través de la acción que dicha enzima ejerce
sobre un substrato cuyos cambios son fácilmente
cuantificables.
De acuerdo a lo anterior el EIA puede aplicarse a
una amplia gama de situaciones, entre las que
destacan las siguientes:
1. Apoyo diagnóstico a enfermedades
autoinmunes
2. Diagnóstico
de
enfermedades
infecciosas
3. Diagnóstico de enfermedades alérgicas
4. Estudio de marcadores tumorales
5. Cuantificación de proteínas circulantes
en baja concentración
6. Niveles plasmáticos de drogas y
hormonas
El enzimainmunoanálisis se basa en dos
fenómenos biológicos: la alta especificidad del
anticuerpo por su antígeno y la amplificación de
la unión antígeno-anticuerpo por reacciones
químicas llevadas a cabo por enzimas. Por tanto,
esta metodología consiste en una reacción
inmunológica y una indicadora enzimática.
El EIA en fase líquida sin etapas de separación,
se conoce como sistema homogéneo, ejemplo, el
EMIT
(enzyme-multiplied
immunoassay
technique).
El EIA en fase sólida requiere etapas de
separación y recibe el nombre de sistema
heterogéneo, ejemplos, ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay), MEIA (EIA en
micropartículas).
ELISA
Por su importancia merece tratamiento aparte.
biomoléculas. Representa una simplificación de
las técnicas blot.
La mezcla, que contiene la molécula, se aplica
directamente sobre una membrana de
transferencia para ser identificada por
anticuerpos.
La técnica ofrece importantes ahorros en tiempo,
al no necesitar la cromatografía o la
electroforesis en gel. Sin embargo, si dos
moléculas de diferentes tamaños son detectadas,
aún aparecen como un único punto.
Inmunohistoquímica
Es similar a ELISA pero utilizando los tejidos,
mediante cortes histológicos.
• Ventajas
• Pone en evidencia el Ag en el propio tejido.
• La relación estructural entre las células es
más sencilla de evaluar.
• Visualización en microscopía óptica.
• Desventajas
• Tratamiento de la muestra.
• Infraestructura necesaria.
• Personal capacitado
Dot blot
El Dot blot (o Slot blot) es una técnica de
biología molecular utilizada para la detección de
Salvador Camacho Garrido
155
Ensayos Biotecnológicos
(inmunocitoquímica).
Inmunoblot
Es una técnica consistente en la separación
electroforética de proteínas para posteriormente
ser
reveladas
con
el
empleo
de
antiinmunoglobulina G marcada con peroxidada.
Western blot
El western blot es un método en biología
molecular/bioquímica/inmunogenética para la
detección de proteínas en una muestra de un
tejido homogeneizado o extracto. Implementa
gel electroforesis para separar proteínas
desnaturalizadas de la masa. Las proteínas son
transferidas desde el gel hacia la membrana
(originalmente de nitrocelulosa), donde son
examinadas utilizando anticuerpos específicos
para la proteína. Por tanto tenemos tres etapas:
1. Electroforesis
2. Transferencia (Blotting)
3. Inmunoensayo enzimático
Los investigadores pueden examinar la cantidad
de proteínas en una muestra y comparar los
niveles de presencia entre varios grupos. Otras
técnicas, también usando anticuerpos, permiten
la detección de proteínas en tejidos
(inmunohistoquímica)
y
células
Salvador Camacho Garrido
178.
ELISA.
ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbed Assay)
se caracteriza por su elevada sensibilidad,
especificidad, rapidez y economía, comparables
e incluso superiores a numerosas técnicas de
diagnostico serológicas (inmunofluorescencia,
inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo, etc.);
156
Ensayos Biotecnológicos
si a todo esto se añade su gran versatilidad en
campos como la Parasitología, Bacteriología,
Micología, Virología, Toxicología, etc., es fácil
deducir la gran importancia de estas técnicas y
sus enormes posibilidades de aplicación sobre
todo en Patología Animal y Vegetal en los que
gracias a estas técnicas se pueden estudiar
grandes poblaciones en un corto plazo y de
manera sencilla, rutinaria y sin instalaciones
costosas.
Hoy en día la técnica de ELISA se aplica en la
mayoría de laboratorios, constituyendo uno de
los métodos de diagnóstico más extensamente
utilizados en análisis rutinarios así como en
investigación. La técnica de radioinmunoensayo
ha sido prácticamente reemplazada por el
método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac
mediante colorimetrías en lugar de radiometrías.
Ventajas
• Utiliza muestras de fácil recolección (suero,
sangre, leche).
• Rápida.
• Alta sensibilidad y especificidad.
• Permite cuantificar.
• Versatilidad en técnicas.
Desventajas
• Espectrofotómetro
• Infraestructura necesaria.
• Personal técnico.
La técnica ELISA se basa en la detección de un
antígeno inmovilizado sobre una fase sólida
mediante
anticuerpos
que
directa
o
indirectamente producen una reacción cuyo
producto, por ejemplo un colorante, puede ser
medido espectrofotométricamente.
Dispositivos
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde
los tubos de cristal de los orígenes a las actuales
microplacas de 96 pocillos de plástico tratado
para aumentar su capacidad de adsorción
(fenómeno de superficie) de moléculas y con
fondos de pocillo ópticamente claros para poder
realizar las medidas de densidad óptica en
instrumentos específicos, espectrofotómetros de
lectura de placas que han recibido el nombre de
lectores ELISA. Actualmente se están
desarrollando dispositivos de mayor capacidad,
por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados
para los sistemas de 'screening' masivo de los
sistemas robotizados (HTS, 'High-throughput
system').
Salvador Camacho Garrido
Los lectores ELISA son espectrofotómetros
capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia
de un espectrofotómetro convencional, con
capacidad de leer todas las longitudes de onda
del ultravioleta y el visible de manera continua,
los lectores de ELISA disponen de sistemas de
filtros que sólo permiten la lectura de una o
pocas longitudes de onda. Son la que se
corresponden con las necesarias para determinar
la densidad óptica de los cromógenos más
comúnmente utilizados.
Fases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las
siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del
antígeno:
Con un enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina,...). El anticuerpo conjugado a la enzima
se emplea en los ensayos directos e indirectos,
sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en
ensayos de competición de antígeno.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo)
a los pocillos:
La unión de anticuerpos o antígenos se realiza
con facilidad a la superficie de plásticos tratados
que tienen gran afinidad por proteínas.
3. Formación de una o más capas de
inmunocomplejos:
En el caso del antígeno unido a la placa se puede
detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno
157
Ensayos Biotecnológicos
marcado (ELISA directo) o empleando un
anticuerpo primario anti-antígeno y un
secundario anti primario marcado (ELISA
indirecto). Este segundo método permite la
amplificación de la señal al poderse unir uno o
más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo
primario. En el caso del anticuerpo unido a la
placa se incuba con una mezcla de antígeno y
antígeno marcado. Se ensayan diferentes
relaciones de antígeno sin marcar frente a una
cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo
de competición del antígeno.
4. Revelado de la reacción enzimática:
Después de un lavado para eliminar todas las
moléculas marcadas no fijadas en forma de
inmunocomplejos se añade el sustrato
enzimático en solución. Se deja reaccionar y se
lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría.
Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de
ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificación de un antígeno en solución, la
detección de un anticuerpo en una solución (por
ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o
la determinación de la subclase (idiotipo) de un
anticuerpo. A continuación se describen los más
comunes.
• ELISA directo:
(Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas
ELISA se preparan recubriendo los pocillos con
las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antígeno. Se incuban con
anticuerpos marcados. Indican la presencia de
antígeno en la solución analizada. Es necesario
incluir controles negativos que serán muestras
del mismo tipo de las analizadas (sangre,
orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la
ausencia del antígeno buscado. Asimismo se
incluyen controles positivos (soluciones donde
se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha
añadido).
Salvador Camacho Garrido
• ELISA indirecto:
Las placas ELISA se preparan de una forma
idéntica a la anterior. Los controles positivos y
negativos son los mismos. El sistema de
detección emplea dos anticuerpos: uno primario
contra el antígeno, y uno secundario marcado
contra el primario. La detección tiene mayor
sensibilidad por presentar una amplificación de
señal debida a la unión de dos o más anticuerpo
secundarios por cada primario. Es el ensayo más
popular, como lo es la inmunofluorescencia
indirecta, pues un mismo anticuerpo secundario
marcado y un mismo sistema enzimático
permiten cuantificar una gran cantidad de
antígenos.
• ELISA sándwich:
(Ensayo de captura de antígeno y detección
mediante inmunocomplejos). Se trata de un
ensayo muy empleado en el que se recubre el
pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno.
Después de lavar el exceso de anticuerpo se
aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antígeno, que será retenido en el
pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que
elimina el material no retenido se aplica una
solución con un segundo anticuerpo antiantígeno marcado. Así pues, cada molécula de
antígeno estará unida, a un anticuerpo en la base
que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran
especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo
158
Ensayos Biotecnológicos
anticuerpo.
Otra forma de definirlas:
ELISA DIRECTO – determinación de
antígenos
• El anticuerpo específico comercial está
generado
contra
algún
epítopo
localizado en el antígeno.
• Generalmente se usan anticuerpos de
alta afinidad.
• Los dos anticuerpos reconocen la misma
molécula (antígeno). En algunos casos
no podrán
reconocer el mismo
epítopo.
ELISA INDIRECTO – determinación de
anticuerpos
• El antígeno debe estar purificado.
• El primer anticuerpo reconoce un
epítopo del antígeno. El anticuerpo
secundario reconoce al
anticuerpo
primario (que actúa como antígeno
suyo).
ELISA DE COMPETICIÓN – determinación
de antígenos
• Se
necesitan
tres
anticuerpos
específicos.
• Se produce la reacción antígenoanticuerpo en fase líquida que luego se
inmoviliza.
• El primer y segundo anticuerpo
reconocen un epítopo del antígeno. El
anticuerpo terciario marcado reconoce al
anticuerpo secundario (que actúa como
antígeno suyo).
Epítopo: porción del antígeno que es reconocida por
el anticuerpo.
179.
OTRAS TÉCNICAS.
Se incluyen técnicas en las que el anticuerpo se
utiliza marcado, por ejemplo, con ferritina u oro
coloidal
visualizables
al
microscopio
electrónico, seroneutralización, etc.
Salvador Camacho Garrido
Técnicas de citometría.
La señal producida por la excitación del
fluorocromo permite conocer el porcentaje de
células que es reconocido por el anticuerpo
monoclonal empleado.
Reacción de fijación de
complemento
Esta reacción sigue siendo el método de elección
para el diagnostico indirecto de enfermedades
infecciosas
importantes
en
veterinaria:
brucelosis, paratuberculosis.
Posee alta especificidad y sensibilidad.
La prueba se basa en que los complejos
antígeno-anticuerpo fijan el complemento, se
impide que este se una a un sistema indicador
que consiste en glóbulos rojos de ovino,
recubiertos de anticuerpos antihematies.
El consumo in vitro del complemento en la
primera etapa por la unión antígeno-anticuerpo,
evitará que los glóbulos rojos sean lisados
(prueba positiva); sin embargo si se observa
hemólisis revelará la fijación del complemento a
este segundo inmunocomplejo, lo que demuestra
la ausencia de anticuerpos específicos al
antígeno de la primera fase.
Seroneutralizacion
Este método está considerado de referencia para
cualquier estudio serológico pues es el que más
se correlaciona entre la respuesta "in vitro" y la
respuesta "in vivo".
En esta prueba se puede valorar la capacidad que
tienen los anticuerpos presentes en un suero
problema para neutralizar la actividad biológica
de un antígeno.
Son altamente sensibles y especificas.
Se pueden realizar mediante 2 vías:
5. La concentración viral se mantiene
constante y el suero diluido.
6. El suero se mantiene constante y el
antígeno diluido.
159
Ensayos Biotecnológicos
Se podrá así determinar la capacidad
neutralizante del suero o del antígeno.
La valoración biológica de la efectividad del
proceso se puede realizar sobre cultivos
celulares o animales de laboratorio.
Pruebas de Protección.
Son similares a las de neutralización solo que se
realizan por completo in vivo.
La capacidad de protección que posee un suero
puede ser valorada mediante su inoculación en
diluciones seriadas en un grupo de animales de
laboratorio, para luego desafiarlo con el
antígeno.
El valor de protección de los sueros se expresa
como Dosis Protectiva 50% (DP50%).
El cálculo se realiza mediante pruebas
estadísticas como la de Reed y Muench.
Test de histocompatibilidad
La identificación del antígeno principal de
Salvador Camacho Garrido
histocompatibilidad de los donadores de tejido
para transplante y de los receptores potenciales,
se hace, generalmente, con pruebas serológicas.
La pareja donante y receptor debe tener grupos
sanguíneos ABO idénticos y además los
antígenos de histocompatibilidad deben ser lo
más idénticos posible para minimizar la
probabilidad de rechazo del transplante.
También el ensayo de microtoxicidad de
Terasaki, es una prueba de tejidos para el
trasplante de órganos de donantes y receptores
que requiere sólo 1 μL de cada uno de los
antisueros utilizados para identificar antígenos
de leucocitos humanos (HLA). El ensayo se
adoptó como norma internacional para
tipificación de tejidos.
180.
ENSAYOS DE TIPO
GENÉTICO.
Frente a la presión de contar con un diagnóstico
precoz y acertado del agente etiológico, durante
los últimos años se han introducido técnicas
punta, derivadas fundamentalmente de la
biología molecular.
El continuo crecimiento exponencial de la
comprensión de las bases genéticas moleculares
de la enfermedad humana y animal ha sido
apoyado por los progresos tecnológicos en el
desarrollo de nuevas técnicas moleculares que
han venido a substituir los métodos intensivos de
trabajo empleados previamente.
Estas nuevas técnicas moleculares en la
actualidad le han permitido a los científicos
tener un gran avance en el área de la medicina
como de la investigación, ya que gracias al
desarrollo de estas técnicas es que se ha logrado
llevar a cabo la producción de medicamentos y
vacunas para combatir una serie de
160
Ensayos Biotecnológicos
enfermedades, incluso incurables, que afectan
desde hace tiempo tanto al hombre como a los
animales de manera tanto individual como
colectiva.
Los avances en la comprensión de las bases
biológicas de la biodiversidad microbiana a
nivel de subespecies puede mejorar el marco
conceptual requerido para una apropiada
interpretación epidemiológica de los resultados
de tipificación. Por lo que una adecuada y más
amplia aplicación de estas técnicas puede dar luz
a la epidemiología de infecciones adquiridas por
el hombre y/o animales, permitiéndole con ello
tener un control más eficaz de estas, así como
llevar a cabo mejores estrategias de prevención.
Son muchas las técnicas:
• Sondas de ácidos nucleicos.
• Hibridación de ácidos nucleicos.
• La huella dactilar de plásmidos o PF.
• Análisis de endonucleasas de restricción
de ADN de plásmidos o REAP.
• Análisis de endonucleasas de restricción
de ADN cromosómico utilizando
enzimas de corte y electroforesis
convencional.
• Polimorfismo de largos fragmentos de
restricción o RFLP utilizando análisis de
pruebas de ADN.
• La electroforesis en gel de campos
pulsantes o PFGE.
• El AP-PCR y otras técnicas relacionadas
con la tipificación basada en la
amplificación de ácidos nucleicos.
• La secuenciación.
181.
SONDAS DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
En este último tiempo se ha producido un
ambiente de excitación en la comunidad
microbiológica, debido al uso de las
denominadas "sondas de ácidos nucleicos" Estas
sondas permitirían a los microbiólogos
identificar a aquellos patógenos difíciles de
cultivar, hacerlo en forma rápida y con un alto
grado de especificad y efectuarlo directamente
de las muestras clínicas.
Las sondas de ácidos nucleicos son fragmentos
de ácido desoxirribonucleico (ADN) o de ácido
ribonucleico (ARN) marcados con algún
elemento que les permite revelar, mediante una
señal, su presencia. Estos fragmentos pueden
cumplir su tarea como sondas debido a que
tienen la capacidad de unirse a fragmentos
complementarios eventualmente presentes en la
muestra que se desea analizar.
Una determinada secuencia sólo será reconocida
Salvador Camacho Garrido
por otra complementaria. Y el reconocimiento
por complementariedad resulta altamente
específico.
El uso de las sondas se basa en el
descubrimiento, realizado en la década del 60,
de que es posible hibridar ácidos nucleicos en
función de la complementariedad de sus
secuencias de nucleótidos. Puestas en contacto
dos soluciones de ácidos nucleicos (una que se
desea analizar y otra, cuya composición es
conocida por los investigadores, que actúa como
sonda), se realizará un reconocimiento muy
específico de secuencias complementarias
eventualmente presentes en la solución que se
analiza: las sondas reconocerán, si las hubiera,
las secuencias complementarias que se desea
identificar, se unirán a ellas y revelarán su
presencia mediante la marca de la que son
portadoras.
182.
TÉCNICAS DE
HIBRIDACIÓN.
Con las técnicas de hibridación es posible
detectar cantidades mínimas de ADN. Para el
infectólogo esto significa la posibilidad de
diagnosticar
microorganismo
en
forma
específica, cuando el aislamiento es imposible,
poco sensible, impracticable, demanda un
trabajo exagerado o es muy costoso. Las
técnicas de hibridización son capaces de detectar
el equivalente a 0,1 pg de ADN. También sería
capaz de detectar infecciones latentes o
abortivas. En situaciones que la multiplicación
viral es mínima o no se produce, las técnicas de
hibridación son más sensibles que el aislamiento
viral directo para determinar la presencia del
virus.
Esta tecnología puede utilizarse con ventaja en
la caracterización de aquellos microorganismos
responsables de un brote epidémico, precisando
en esa forma su pertenencia a una misma cepa.
Permite determinar la resistencia a los
antibióticos de microorganismos tales como
Salmonella, así como también define la
epidemiología de las infecciones.
La hibridación o renaturalización de ácidos
nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el
cual se combinan dos cadenas de ácidos
nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases
complementarias, en una única molécula de
doble cadena, que toma la estructura de doble
hélice, donde las bases nitrogenadas quedan
ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos
la muestra con la longitud de onda a la que
absorben estas bases (260 nm), la absorción de
energía será mucho menor si la cadena es doble
que si se trata de la cadena sencilla, ya que en
161
Ensayos Biotecnológicos
esta última los dobles enlaces de las bases
nitrogenadas, que son las que captan la energía,
están totalmente expuestos a la fuente emisora
de energía.
Los nucleótidos se unirán con sus
complementarios bajo condiciones normales:
A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A.
Así
que
dos
cadenas
perfectamente
complementarias se unirán la una a la otra
rápidamente. Por el contrario, debido a las
diferentes geometrías de los nucleótidos, una
simple variación de las parejas anteriores lleva a
la inconsistencias entre las cadenas y dificultará
la unión.
El proceso de hibridación se puede revertir
simplemente calentando la solución que contiene
a la molécula. El porcentaje de G+C dentro de la
cadena
condiciona
la
temperatura
de
alineamiento y de desnaturalización ya que G se
une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A
se une a U o T mediante dos puentes de
hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más
energía para romper tres enlaces que para
romper dos, dicha energía se traduce en una
mayor temperatura. El % G+C no es igual para
todas las especies, es más, el % G+C es distinto
incluso entre el ADN nuclear y el ADN
mitocondrial, lo que da bastante juego en los
protocolos de extracción de ADN, según que
tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre
otros motivos porque existen enfermedades
genéticas debidas a mutaciones en el ADN
mitocondrial.
En biología molecular experimentalmente se
llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación:
Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo
Northern, para uniones ADN-ARN.
Southern blot
Southern blot, hibridación Southern o,
simplemente, Southern, es un método de
biología molecular que permite detectar la
presencia de una secuencia de ADN en una
mezcla compleja de este ácido nucleico. Para
ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de
agarosa con el fin de separar (en base a la
longitud) los fragmentos de ADN y, después,
una transferencia a una membrana en la cual se
efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre
procede del apellido de su inventor, un biólogo
inglés llamado Edwin Southern.
Salvador Camacho Garrido
Northern blot
Northern blot es una técnica de detección de
moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una
secuencia dada dentro de una mezcla compleja
(por ejemplo, un ARN mensajero para un
péptido dado en una extracción de ARN total).
Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete
a una electroforesis en gel a fin de separar los
fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se
transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una
membrana cargada positivamente en la cual se
efectúa la hibridación de una sonda molecular
marcada radiactiva o químicamente.
El nombre de la técnica deriva de la propia de la
detección de ácido desoxirribonucleico (ADN),
denominada Southern blot en honor a su
descubridor; de este modo, al desarrollarse la
técnica equivalente para ARN se empleo el
punto
cardinal
opuesto
(«northern»,
septentrional en inglés, frente al meridional
«southern»).
183.
PF.
La Huella Dactilar de Plasmidos.
Otro ejemplo lo constituyen los fingerprints del
ADN tratado con endonucleasas de restricción,
que son una poderosa herramienta para la
identificación de microorganismos en las
infecciones nosocomiales.
La huella dactilar de plásmidos fue la primera
técnica molecular utilizada como una
herramienta de tipificación.
Los plásmidos son elementos de ADN
extracromosómico que están presentes en
muchos aislamientos clínicos y pueden ser
identificados por simples procedimientos de lisis
de células seguidos de electroforesis en gel de
los lisados. El número y tamaño de los
plásmidos presentes es utilizado como base para
la identificación de cepas. Esta técnica de
tipificación de cepas ha sido utilizada con éxito
en el análisis de brotes de infecciones
nosocomiales y en infecciones adquiridas en
comunidad causadas por una variedad de
especies de bacterias Gram-negativas.
En general esta técnica es más utilizada para
estudios epidemiológicos que están limitados
162
Ensayos Biotecnológicos
tanto temporalmente como geográficamente y
puede complementar a otras técnicas como la
PFGE, para proporcionar una base para
diferenciar aislamientos que están relacionados
genotípicamente pero que están separados
epidemiológicamente por periodos moderados
de tiempo, como a varios meses
184.
REAP.
Análisis de Endonucleasas de Restricción de
ADN de Plásmidos.
En la actualidad esta técnica es utilizada
principalmente como una alternativa para los
aislamientos de estafilococos que contienen
frecuentemente plásmidos múltiples, y para
seleccionar especies de Enterobacteriaceae que
tienen
a
menudo
grandes
plásmidos
característicos.
Algunas cepas de bacterias contienen solamente
un plásmido grande, de un rango de tamaño de
100 a 150 kb. Debido a que es difícil diferenciar
plásmidos en este rango de tamaño,
especialmente los que varían solamente de 10 a
15 kb, algunos investigadores han adicionado
una endonucleasa de restricción para aumentar
el poder de discriminación de la electroforesis en
gel de agarosa. Esto puede ser útil cuando los
plásmidos grandes producen muchos fragmentos
de restricción que puede hacer la interpretación
más difícil, especialmente cuando están
presentes plásmidos múltiples grandes.
Actualmente, la REAP ha mejorado en su
reproducibilidad y poder de discriminación por
lo que es la técnica preferida de tipificación de
plásmidos y es de particular interés para la
realización de estudios epidemiológicos de
infecciones institucionales con organismos
resistentes a múltiples antibióticos. Utilizado
conjuntamente con delineación clonal por
tipificación de ADN cromosómico, es esencial
para localizar la diseminación de genes de
resistencia antibiótica móviles como los que
codifican la beta-lactamasa de amplio espectro.
185.
AFLP.
Análisis de Endonucleasas de Restricción de
ADN Genómico.
Una de las técnicas nuevas y más promisorias es
el AFLP. Este método combina una aplicabilidad
universal con alto poder de discriminación y
reproducibilidad. Un gran número de
publicaciones describen el uso de esta técnica
para plantas y “mapeo” genético animal,
diagnósticos clínicos, estudios filogenéticos, y
tipificación de bacterias.
Está basada en la detección de fragmentos de
Salvador Camacho Garrido
restricción genómica por amplificación con
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
puede ser utilizada para ADNs de cualquier
origen o complejidad.
La técnica comprende tres pasos:
1) la restricción del ADN y la ligazón de
adaptadores oligonucleótidos.
2) la amplificación selectiva de juegos
de fragmentos de restricción.
3) análisis del gel de los fragmentos
amplificados.
El ADN es cortado con enzimas de restricción, y
los adaptadores de la doble hebra están ligados
al final de los fragmentos del ADN para generar
la plantilla de ADN para la amplificación. La
secuencia de los adaptadores y el sitio de
restricción adyacente sirven como sitios de
unión de los primers para la subsecuente
amplificación de los fragmentos de restricción.
Para el análisis del AFLP solamente se necesita
una pequeña cantidad de ADN genómico
purificado; este es digerido como ya se
menciono con dos enzimas de restricción, una
con una frecuencia media de corte (como la
EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de
corte (como la MseI o TaqI).
La infrecuente restricción de los sitios de
amplificación, o IRS-PCR, es otra variación de
esta propuesta que esta basada en la
amplificación selectiva de secuencias de ADN
con sitios de restricción infrecuentes a los lados.
Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta
fácilmente y un muy buen nivel del patrón de
reproducibilidad para un amplio rango de
bacterias patógenas tanto Gram positivas como
negativas.
186.
PFGE.
Técnica de electroforesis en gel de campos
pulsantes.
La electroforesis en gel de campos pulsantes
(PFGE por sus siglas en inglés) fue descrita en
1984 como una herramienta para examinar el
ADN cromosómico de organismos eucariotas.
Ha sido uno de los progresos más útiles de la
epidemiología molecular en las décadas pasadas;
emerge en los 90´s como una técnica de la huella
dactilar considerada el estándar de oro para la
tipificación molecular de microorganismos, ya
que ha demostrado que es altamente efectiva
para muchas especies bacterianas tanto Grampositivas como los estafilococos, enterococos, y
mycobacterias y Gram-negativas como E. coli,
otras Enterobacteriaceae, y Pseudomonas.
En general, la PFGE es una de las técnicas de
tipificación más reproducibles y altamente
163
Ensayos Biotecnológicos
discriminatorias, en comparación con otras
técnicas moleculares.
En esta técnica, el genoma bacteriano, que
típicamente es de 2.000 a 5.000 kpb en tamaño,
es digerido con una enzima de restricción que
tiene pocos sitios de reconocimiento y que
genera aproximadamente de 10 a 30 fragmentos
de restricción que van de 10 a 800 kb. Todos
estos fragmentos pueden ser separados como un
patrón de distintas bandas por PFGE, usando
una cámara diseñada especialmente que cambia
de posiciones en el gel de agarosa entre tres
juegos de electrodos que forman un hexágono
alrededor del gel.
La preparación del ADN genómico y la macrorestricción son llevados a cabo en bacterias que
se ensamblan en los pozos de agarosa.
Utilizando
unidades
de
electroforesis
programables especiales, los cambios de
orientación periódica de los campos eléctricos o
electroforesis en gel de campos pulsantes,
permiten la separación y determinación del
tamaño de los fragmentos de macro-restricción.
La PFGE escanea más del 90% del cromosoma
para reordenar fragmentos de gran tamaño tales
como
duplicaciones,
cancelaciones,
o
inserciones de secuencias que se detectan como
un cambio en el tamaño o número del
fragmento.
Los patrones de restricción del ADN de los
aislamientos en estudio son comparados unos
con otros para determinar sus relaciones.
Algunos resultados con esta técnica pueden
llevar a conclusiones diferentes entre
laboratorios, como por ejemplo, que los
aislamientos puedan ser designados como
relacionados con brotes, o no relacionados con
brotes de alguna enfermedad.
Las principales dificultades asociadas con esta
técnica son las relacionadas a las demandas
técnicas del procedimiento y costos iniciales
del equipo. La preparación de ADN genómico
apropiado requiere de 1 a 3 días, dependiendo de
los organismos a examinar, y los costos del
equipo requerido (incluyendo el aparato de
electroforesis y el transiluminador) varia entre
10.000 y 20.000 €. Sin embargo, el método es
operacional en el laboratorio, y puede ser
aplicado a un amplio rango de especies con solo
un mínimo de modificaciones.
187.
PCR.
La Reacción en cadena de la Polimerasa.
La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR
por sus siglas en inglés) es una técnica que se
utiliza comúnmente en los laboratorios de
Salvador Camacho Garrido
investigación médicos y biológicos para
amplificar (crear copias múltiples de) el ADN,
sin utilizar un organismo vivo, tal como E. coli o
una levadura. Asimismo, se emplea en una
variedad de tareas, tales como la detección de
enfermedades hereditarias, la identificación de
huellas digitales genéticas, diagnóstico clínico,
análisis forense del ADN, detección de
patógenos en el hombre, animales, plantas, y
alimentos, e investigación en biología molecular.
La PCR fue inventada a principios de los 80´s
por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el
premio Nobel en química en octubre de 1993
por este logro, siete años después de haber
publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis
fue la de desarrollar un proceso a través del cual
el ADN se pudiera multiplicar artificialmente a
través de ciclos repetidos duplicativos llevados a
cabo por una enzima llamada ADN-Polimerasa.
La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en
los organismos vivos, donde funciona para
duplicar el ADN cuando las células se dividen.
Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y
creando una hebra complementaria.
El proceso original de PCR actualmente ha sido
mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa
que procede de una bacteria termófila que vive
en aguas termales. La ADN-Polimerasa o Taq
polimerasa tomada de estos organismos es
termoestable (estable en las altas temperaturas).
Actualmente la Taq polimerasa se utiliza
frecuentemente en la práctica de PCR. Una
desventaja de la Taq es que incurre a veces en
equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a
mutaciones (errores) en la secuencia del ADN.
La PCR que ha sido utilizada por varios años
para la detección directa de muchos tipos de
agentes infecciosos en muestras clínicas, ha sido
adaptada para ser usada como una herramienta
de tipificación. La ventaja de la PCR es su
habilidad para producir literalmente millones de
copias de un segmento de ADN particular con
alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4 horas.
El procedimiento requiere una plantilla de ADN
que puede estar presente en la muestra en
pequeñas
cantidades;
dos
primers
(oligonucleótidos que flanquean las secuencias
de la plantilla de ADN que va a ser amplificado)
y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.
Un ensayo típico de PCR requiere
aproximadamente de 3 horas para completar 30
ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de
desnaturalización, en donde la doble hebra de
ADN es fundida en hebras únicas; una fase de
alineación, en donde los primers se unen a las
secuencias blanco en las hebras separadas; y una
fase de extensión, en donde la síntesis de ADN
164
Ensayos Biotecnológicos
procede de los primers a partir de cada hebra de
la plantilla de ADN, generando dos nuevas
copias de la doble hebra de la plantilla original.
Después de cada 30 ciclos, una sola copia inicial
de la plantilla de ADN teóricamente puede ser
amplificado a 1 billón de copias (230).
El uso válido de esta técnica es crítico para
mantener la calidad de muchas bases de datos de
ADN producidas.
Es un hecho establecido que diversos factores
pueden influenciar la validez de los resultados
obtenidos por PCR, incluyendo la presencia de
componentes inhibitorios, la calidad de la
plantilla de DNA, y la carencia de optimización
con respecto a componentes de la reacción y las
condiciones de los ciclos termales.
Todos estos factores pueden comprometer la
especificidad y sensibilidad de la reacción,
pudiendo llevar a resultados falsos-negativos,
falsos-positivos, o no reproducibles. Pero menos
conocido, sin embargo, es la variación de los
resultados atribuidos en la PCR debido al
subóptimo
funcionamiento
de
los
termocicladores, siendo este el aspecto particular
de la técnica que constituye las bases de los
estudios interlaboratorios.
188.
AP-PCR.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa con
Primers Arbitrarios.
Esta técnica simple y rápida ha sido
sucesivamente aplicada para la delineación de
cepas genotípicas y análisis de poblaciones
genéticas de un amplio rango de patógenos
microbianos, incluyendo bacterias, hongos y
protozoos.
La discriminación es buena y puede
correlacionarse con
otras técnicas de
genotipificación.
El poder discriminatorio es variable de acuerdo
al número y secuencia de los primers arbitrarios
y a las condiciones de amplificación. Aunque
requiere de varios factores técnicos para ser
estrictamente
estandarizado
para
una
reproducibilidad óptima.
La tipificación con esta técnica, y con métodos
similares como el RAPD y el DAF, están
basados en la amplificación por PCR de baja
astringencia utilizando un primer simple de
secuencia arbitraria, típicamente de 10 pares de
bases.
Después de varios ciclos adicionales, se obtiene
una cepa específica de segmentos de ADN
amplificados de varios tamaños.
Los productos resultantes del PCR pueden
representar una variedad de fragmentos de ADN
de diferentes tamaños que son visualizados a
Salvador Camacho Garrido
través de electroforesis en gel de agarosa.
Publicaciones recientes han descrito condiciones
y primers específicos para analizar aislamientos
de Staphylococcus aureus.
En la actualidad es considerado el método más
adecuado para una tipificación comparativa
rápida, pero inadecuado para bibliotecas de
tipificación en programas de vigilancia
epidemiológica.
189.
OTRAS TÉCNICAS
BASADAS EN PCR.
ERIC-PCR
Amplificación de secuencias intergénicas de
consenso repetitivas de enterobacterias
(Amplification Of Enterobacterial Repetitive
Intergenic Consensus).
ERIC-PCR es otra técnica de tipificación
utilizada para estudiar la relación clonal en
diversas bacterias Gram-negativas, como A.
baumannii. Los patrones de ADN que se
obtienen con la ERIC-PCR suelen ser menos
complejos que los generados mediante REPPCR.
Las secuencias repetitivas palindrómicas
extragénicas (secuencias REP) y las secuencias
consenso
repetitivas
intragénicas
de
enterobacterias (secuencias ERIC) son algunas
de las secuencias que más se han utilizado en
estudios epidemiológicos de brotes infecciosos.
REP-PCR
Amplificación de elementos palindrómicos
extragénicos repetitivos (Repetitive Extragenic
Palindromic).
La REP-PCR es otra técnica de tipificación en la
que se utilizan cebadores que hibridan con
secuencias de ADN repetidas o repetitivas
(secuencias rep) que se encuentran distribuidas
en el cromosoma de muchas enterobacterias y
algunas bacterias Gram-positivas y hongos. Con
esta técnica se amplifican las regiones que
separan las secuencias rep, por lo que el
polimorfismo resulta de la variabilidad en la
repetición de dichas secuencias y de la distancia
entre copias contiguas causadas por inserciones
o deleciones de ADN.
La técnica de REP-PCR se caracteriza por su
simplicidad (no requiere el uso de enzimas de
restricción,
ni
técnicas
electroforéticas
especiales), rapidez (menos de 24 h) y su
relativo bajo coste, una vez que se dispone de un
termociclador.
Los patrones de bandas suelen ser sencillos,
como en A. baumannii, aunque en otros
165
Ensayos Biotecnológicos
microorganismos, como Escherichia coli, la
interpretación de los patrones es algo más
dificultosa debido a la proximidad que existe
entre algunas bandas y al mayor número de
bandas.
Esta técnica posee un poder de discriminación y
reproducibilidad inferiores a los de la PFGE,
aunque puede incrementarse con la utilización
de cebadores fluorescentes, aunque esto
encarece bastante la técnica debido a que se
necesita un secuenciador automatizado de ADN
para analizar los patrones de bandas de ADN.
Análisis de la secuencia de
nucleótidos.
La secuenciación de nucleótidos de genes
amplificados por PCR es el medio más preciso y
sensitivo de indexar el polimorfismo del ADN
localizado para la tipificación de cepas
bacterianas. Sin embargo, el tiempo requerido y
los costos del procedimiento actualmente limitan
el uso de este método, aún cuando se ha aplicado
a varios tipos de virus como el de la hepatitis y
el VIH y también a bacterias como
Streptococcus pyogenes. Con el rápido progreso
de la automatización, es probable que en los
siguientes años la resecuenciación con PCR
pueda ser utilizada para la tipificación
Salvador Camacho Garrido
epidemiológica de virus, bacterias y otros
patógenos.
MLST
El tipado de secuncias multilocus (Multilocus
sequence typing).
El procedimiento caracteriza a los aislados de
especies bacterianas mediante la secuencias de
ADN del interior de varios fragmentos (por lo
general siete) de los genes de limpieza.
Aproximadamente 450-500 pb se utilizan de
cada gen, ya que estos pueden ser utilizados con
exactitud utilizando un secuenciador automático
de ADN.
Para cada gen, las diferentes secuencias dentro
de una especie bacteriana se asignan como
distintos alelos y, para aislar cada uno se define
el perfil o la secuencia tipo (ST).
El primer ensayo de MLST fue desarrollado para
Neisseria meningitidis, el agente causal de la
meningitis meningocócica y la septicemia.
El principio de MLST es simple: consiste en la
técnica de PCR de amplificación seguida de la
secuenciación del ADN. Las diferencias entre las
cepas pueden ser controladas por los nucleótidos
en un número variable de genes, según el grado
de discriminación deseada.
El esquema de trabajo de MLST implica:
1) la recopilación de datos
2) el análisis de datos
3) análisis de secuencias multilocus.
PCR- Ribonotipado
La PCR-ribotipia se basa en la amplificación de
las regiones espaciadoras que separan los genes
ribosomales 16S y 23S.
Esta técnica es reproducible aunque posee un
poder de discriminación bajo, que puede
incrementarse con la utilización de enzimas de
restricción.
En algunos estudios realizados se ha observado
que el análisis de los patrones de restricción de
los de los genes ribosomales (amplificados
ARDRA) y/o las regiones espaciadoras que
separan los genes ribosomales 16S y 23S es una
técnica con un poder de discriminación bastante
inferior a de la AP-PCR, la ERIC-PCR y el
PFGE.
190.
KITS COMERCIALES.
166
Ensayos Biotecnológicos
Salvador Camacho Garrido
167
Ensayos Biotecnológicos
TEMA VIII. IDENTIFICACIÓN DE
AGENTES TÓXICOS Y
MUTAGÉNICOS
191.
TOXINAS.
Las toxinas son proteínas o lipopolisacáridos que
causan daños concretos a un huésped. En los
vertebrados, las toxinas son destruidas por acción
enzimática principalmente en el hígado.
Las toxinas, en general, son sustancias creadas por
plantas y animales que son venenosas o tóxicas
para el ser humano. La mayoría de las toxinas que
causan problemas en humanos son liberadas por
microorganismos como bacterias y virus.
192.
TIPOS DE TOXINAS.
Aunque la primera clasificación sería en función
de su origen primario, es decir, naturales o
antropogénicas, lo más normal es catalogarlas
según:
• Su función química
• Su origen
• Según la parte atacada
• Según la patogenia asociada
Según función de propiedades
químicas y origen
Las toxinas pueden dividirse, en función de sus
propiedades químicas y según su origen, en grupos
fundamentales:
• Exotoxinas:
Son proteínas solubles generadas por patógenos, y
presentes en las bacterias Gram positivas y Gram
negativas. Presenta enzimas citolíticas. Se conocen
tres tipos:
• Enterotoxinas
• Citotoxinas
• Neurotoxinas
• Endotoxinas:
Corresponden a los lipopolisacáridos de las
membranas bacterianas Gram negativas. Todas son
resistentes al calor. Como:
• Chutoxinas
• Renatoxinas
• Gastrotoxinas
De especial importancia por su letalidad podemos
destacar:
o Aflatoxinas:
Producidas por hongos como Amanita phalloides,
Aspergillus flavus o Aspergillus parasiticus, que
pueden contaminar semillas y nueces con
sustancias cancerígenas.
o Batraciotoxina o Batracotoxina:
Salvador Camacho Garrido
Es el más letal de todos, es producido por la rana
Dardo Venenoso, además del pituí que produce la
llamada homobatracotoxina con efectos similares
Según las partes que atacan y sus
consecuencias
También pueden dividirse según las partes que
atacan y sus consecuencias:
• Hemotoxina: Ataca la sangre (impidiendo
que coagule) y destruye tejidos(piel).
• Estomostoxina: Causa dolor intenso.
• Necrotoxina: Sustancia producida por
ciertas cepas de estafilococos que destruye
las células de los tejidos.
• Neurotoxina: Ataca al Sistema nervioso.
• Conotoxina: Causa parálisis.
• Atraxicotoxina: Causa un aumento del
pulso cardíaco, presión arterial y asfixia.
• Cardiotoxina: Causa ataques al corazón,
asfixia, parada cardio-respiratoria e
infartos.
• Miotoxina: Ataca a los músculos.
193.
TOXINAS VEGETALES.
Las sustancias tóxicas vegetales se dividen en seis
grupos principales:
• Alcalóides:
Son compuestos complejos, cuyo nombre proviene
de álcali. Han sido descubiertos más de 5.000 tipos
diferentes de ellos. Todos contienen al menos un
átomo de nitrógeno y son de carácter básico.
Producen una acción fisiológica intensa sobre el
sistema nervioso central o el parasimpático. Están
difundidos en cerca del 10% del reino vegetal.
o Andrometodoxina (Rododendro, Kalmia)
o Atropina (Estramonio)
o Colchicina (Cólquico)
o Conidina (Conidio)
o Gelsemina (Jazmín Amarillo)
o Hosciamina (Estramonio, Beleño Negro)
o Madragorina (Mandrágora)
o Papaverina (Opio)
o Solanina (Dulcamara)
o Taxina (Tejo)
• Glucósidos:
Sustancias en las cuales un azúcar se une por
enlaces químicos a otra molécula. Dentro de este
grupo se pueden distinguir entre cardiacos y
cianogenéticos.
o Arbutina (Kalmia)
o Briomina (Nueza)
o Esculina
o Cumarina
o Ligustrina (Alheña)
o Ranucolina
169
Ensayos Biotecnológicos
Cardíacos
Han sido descubiertos más de 400, la mayor parte
en plantas afines al lirio, la digital y el oleandro.
o Convalamarina o Convalarina (Muguete)
o Digitalina o Digitoxina (Digital, se obtiene el
fármaco también llamado Digital)
o Eleborina (Eleboro Fétido, Eleboro Negro o
Rosa de Navidad)
o Neriosido (Adelfa)
o Robitina (Acacia espinosa)
Cianogenéticos
Llamados así porque liberan cianuro de hidrógeno
(HCN) al ser hidrolizados por algunas enzimas. Se
pueden hallar en gran variedad de plantas, y el
daño principal producido es el de la destrucción de
glóbulos rojos por medio de la inhibición de la
citocromo-oxidasa, una molécula encargada de
transportar el oxigeno.
o Amigdalina
o Laurel-cerezo
o Mandioca o yuca brava
o Saúco
• Fitotoxinas
Son gruesas moléculas proteínicas, que
generalmente pueden ser destruidas por un
prolongado calentamiento. Se encuentran entre las
plantas conocidas como de mayor toxicidad y no
son destruidas por los procesos digestivos.
o Ricino
• Oxalato
Están constituidas por finos cristales de oxalato de
calcio y generalmente se encuentran entre las
Aráceas. Provocan una inmediata irritación local si
son masticadas, y graves problemas renales si son
absorbidas por el intestino.
• Resinoides
Son sustancias complejas y muy diferentes entre
ellas. La única propiedad que comparten una vez
extraídas es ser
semisólidas a temperatura
ambiente, y que se pueden quemar fácilmente.
o Iridina (Lirio Fétido, Iris Policromo)
• Bociógenos
Son sustancias que se encuentran en las coles, e
impiden la asimilación del iodo por parte del
organismo, elemento necesario para que la
glándula tiroides funcione normalmente. Pueden
provocar inflamación y disfuncionalidad de dicha
glándula.
Salvador Camacho Garrido
194.
TOXINAS ANIMALES.
Los reptiles, serpientes, culebras y artrópodos
suelen ser animales ponzoñosos, es decir aquéllos
que liberan toxinas por medio de un acto de
picadura o mordedura. Las toxinas son producidas
en glándulas o en un grupo de células secretoras
muy desarrolladas.
Muchas criaturas usan venenos para atacar a sus
presas o como método de defensa. Algunos de esos
animales almacenas toxinas en sus glándulas e
inyectan el veneno. Otros animales producen el
veneno en su piel.
Algunos ejemplos de los más tóxicos:
Rana veneno flecha: Su piel contiene un químico
tóxico que pone enfermo o mata a cualquier animal
que la toque o la coma. Dos microgramos de esta
toxina (una cantidad similar a la de una cabeza de
alfiler) podrían matar a un mamífero grande o
incluso a una persona.
Pez piedra: Una potente toxina almacenada en sus
13 espinas puede detener a cualquier depredador
que se cruce en su camino. En humanos, el veneno
causa un intenso dolor, inflamación de los tejidos,
conmoción y finalmente la muerte.
Serpiente Taipán de interior: Una mordedura
contiene suficiente toxina (110 miligramos) como
para matar a 100 personas. Su toxina puede causar
vómitos y hace que se detenga la respiración.
Avispas del mar: Un golpe accidental contra sus
tentáculos y sus potentes aguijones te perforarán.
Además de causar un dolor insoportable su veneno
puede paralizar el corazón o los pulmones, y
también disolver la piel.
Pulpo de anillos azules: El mordisco de este pulpo
no duele, pero las neurotoxinas presentes en su
saliva empiezan enseguida su temible trabajo. En
cuestión de minutos, la persona que recibió el
mordisco experimenta entumecimiento, debilidad
muscular y poco después, la víctima deja de
respirar y muere.
Escorpión dorado israelí: Aunque su aguijón no
es particularmente largo o fuerte, un pinchazo de
este escorpión (el más exótico del mundo) causa un
dolor insoportable, fiebre, coma, convulsiones,
parálisis y muerte.
Araña de tela en embudo de Sydney: Sus
colmillos inoculan una neurotoxina que causa un
gran dolor y puede matar a una persona en 15
minutos. Su veneno no afecta a la mayor parte de
los mamíferos ¡solo a nosotros!
Caracol de concha marmórea: Un diente afilado
en su extremo actúa como un arpón. El veneno,
una neurotoxina, viaja a través del diente hacia el
interior de la víctima, paralizándola casi de
inmediato. Los humanos que sufren su aguijonazo
experimentan debilidad, y la muerte.
170
Ensayos Biotecnológicos
195.
TOXINAS MARINAS.
La mayoría de las floraciones de algas
microscópicas, no produce problemas a otros seres
vivos, sin embargo hay algunos tipos de algas
microscópicas que al crecer en cantidad y en forma
excesiva producen efectos de toxicidad en otros
seres vivos, hasta el hombre, con consecuencias
para la salud humana y en actividades que el
hombre desarrolla ligadas al mar, por ejemplo la
acuicultura, pesquería artesanal, turismo, etc. Este
último tipo de floraciones de algas por ser dañinas
se les denomina “Floraciones de Algas Nocivas”, y
que comúnmente le hemos llamado “Mareas
Rojas”.
Muchas de las especies que producen estas
floraciones nocivas tienen características tóxicas.
Lo que significa que en su metabolismo vital
producen toxinas de distinto tipo, las cuales son
acumuladas por los organismos bentónicos
(mariscos) que se alimentan del fitoplancton,
siendo para ellos la toxina un compuesto
inofensivo, pero extraño, motivo por el cual lo
acumulan, por ello se les ha denominado a éstos,
“Organismos Transvectores”, tales como los
moluscos filtradores (cholguas, choritos, choro
zapato, almejas, ostión, macha, lapas, berberecho,
culengue, ostra, alas de ángel, navajuelas,
picorocos, y otros) y organismos gastrópodos
(loco, caracol, locate y palopalo).
Una persona al consumir un marisco, estaría
ingiriendo una pequeña cantidad de toxina, pero
muy concentrada, por lo que esa persona
presentaría síntomas de intoxicación, según el tipo
de toxina que haya tenido el marisco que se comió.
Salvador Camacho Garrido
196.
TOXINAS MICROBIANAS.
Las toxinas microbianas son toxinas producidas
por microorganismos, incluyendo bacterias, virus y
hongos. Las toxinas microbianas son determinantes
importantes de la virulencia responsable de
patogenicidad microbiana y/o evasión de la
respuesta inmune del hospedador. Algunas toxinas
bacterianas, tales como las neurotoxinas
botulínicas, son las más potentes toxinas naturales
conocidas. Sin embargo, las toxinas microbianas
también tienen usos importantes en investigación
médica e investigación aplicada. Aplicaciones
potenciales de investigación de toxinas incluyen el
combate de la virulencia microbiana, el desarrollo
de noveles drogas contra el cáncer y otros
medicamentos, y el uso de toxinas como
herramienta en neurobiología y biología celular.
Algunos ejemplos:
• Neurotoxina botulínica
• Toxina antrácica
• Citotoxina subtilasa
• Toxina de Pasteurella multocida
• Toxinas RTX de Vibrio
• Toxina de Helicobacter pylori
• Toxinas de Staphylococcus
• Ribotoxinas fungícas
• Toxinas de Cianobacterias
197.
TOXINAS EN LOS
ALIMENTOS.
Hay literalmente miles de toxinas originadas en los
alimentos, sin embargo, solamente algunas causan
brotes (por ejemplo, las toxinas en los mariscos) o
son de importancia para la salud pública (por
ejemplo, las micotoxinas).
Como ejemplos:
• Mycotoxinas
• Aflatoxinas
• Ocratoxinas
• Tricotecenos
• Zearalenone
• Alcaloides de Pyrrolizidine
• Ciguatera
• Escombrotoxina
• Fitohemaglutinina
• Grayanotoxina
• Tetrodotoxina
171
Ensayos Biotecnológicos
• Toxinas de los mariscos
TETRODOTOXINA
- Consumo de peces globo (Fugu) en Japón y
China
- La toxicidad depende de la especie, el sexo, la
estación y el ciclo reproductor de los animales
- Acumulación en gónadas e hígado
Para más información, consultar la página Web en
castellano de la Agencia para Sustancias Tóxicas y
el Registro de Enfermedades (ATSDR, por sus
siglas en inglés), que tiene que realizar una serie de
funciones relacionadas a los efectos sobre la salud
humana de sustancias peligrosas que se encuentran
en el medio ambiente.
Estas funciones incluyen evaluaciones de salud
pública de sitios que contienen desperdicios,
consultas de salud con respecto a sustancias
peligrosas en específico, vigilancias y registros de
salud, respuestas a emergencias debido a la
emisión o derrame imprevisto de sustancias
peligrosas, investigación aplicada en respaldo a
evaluaciones de salud pública, elaboración y
difusión de información y educación y
adiestramiento
relacionados
a
sustancias
peligrosas.
198.
TÓXICOS.
Tóxico y por extensión veneno es toda sustancia
química que, administrada a un organismo vivo,
tiene efectos nocivos. El estudio de los venenos es
conocido como toxicología.
En la ciencia de la toxicología, el sujeto de estudio
es el efecto de una sustancia o condición externa y
sus ulteriores efectos en los seres vivos:
organismos,
sistemas
orgánicos,
órganos
individuales,
tejidos,
células,
unidades
subcelulares. Un concepto central de la toxicología
es que la toxicidad resulta de una interacción entre
la sustancia química y el organismo, por lo que
ésta variará según la especie, el tiempo de
exposición, la edad, el sexo, la vía de
administración y la concentración (dosis).
199.
CLASIFICACIÓN DE LOS
TÓXICOS.
En una primera aproximación podríamos clasificar
a los tóxicos según su origen en naturales y
antropogénicos o producidos por la actividad
humana.
Clasificación fisiopatológica
En función de los efectos en el organismo:
• Irritantes:
• Vías respiratorias superiores
• Tejido pulmonar
• Bronquios y alvéolos terminales
• Asfixiantes:
• Simples
• Bioquímicos
• Anestésicos y narcóticos
• Sistémicos
• Otros
•
•
•
•
Vías de entrada
Digestiva
Pulmonar
Mucosas
Parenteral
Mecanismo de acción
• Sobre la estructura celular:
Salvador Camacho Garrido
172
Ensayos Biotecnológicos
Degeneración protoplamática con destrucción de la
materia viva o necrosis.
• Sobre las funciones celulares:
Aquellos que implican fenómenos bioquímicos
locales,
como
anoxemiantes,
tetanizantes,
metahemoglobinizantes, paralizantes, depresivos
del sistema nevioso central, etc.
200.
MUTACIONES.
La mutación en genética y biología, es una
alteración o cambio en la información genética
(genotipo) de un ser vivo y que, por lo tanto, va a
producir un cambio de características, fenotipo,
que se presenta súbita y espontáneamente, y que se
puede transmitir o heredar a la descendencia.
La unidad genética capaz de mutar es el gen que es
la unidad de información hereditaria que forma
parte del ADN.
En los seres pluricelulares, las mutaciones sólo
pueden ser heredadas cuando afectan a las células
reproductivas. Una consecuencia de las mutaciones
puede ser una enfermedad genética, sin embargo,
aunque a corto plazo puede parecer perjudicial, a
largo plazo las mutaciones son esenciales para
nuestra existencia.
Sin mutación no habría cambio y sin cambio la
vida no podría evolucionar.
La definición de mutación a partir del
conocimiento de que el material hereditario es el
ADN y de la propuesta de la doble hélice para
explicar la estructura del material hereditario
(Watson y Crick 1953), sería que una mutación es
cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos
del ADN.
201.
TIPOS DE MUTACIONES.
En principio se podría distinguir dos tipos
generales de mutación:
• Mutación somática:
Es la que afecta a las células somáticas del
individuo.
Como
consecuencia
aparecen
“individuos mosaico” que poseen dos líneas
celulares diferentes con distinto genotipo. Una vez
que una célula sufre una mutación, todas las
células que derivan de ella por divisiones mitóticas
heredarán la mutación (herencia celular). Un
individuo mosaico originado por una mutación
somática posee un grupo de células con un
genotipo diferente al resto, cuanto antes se haya
dado la mutación en el desarrollo del individuo
mayor será la proporción de células con distinto
genotipo. En el supuesto de que la mutación se
hubiera dado después de la primera división del
cigoto (en estado de dos células), la mitad de las
células del individuo adulto tendrían un genotipo y
Salvador Camacho Garrido
la otra mitad otro distinto. Las mutaciones que
afectan solamente a las células de la línea somática
no se transmiten a la siguiente generación.
• Mutaciones en la línea germinal:
Son las que afectan a las células productoras de
gametos apareciendo, de este modo, gametos con
mutaciones. Estas mutaciones se transmiten a la
siguiente generación y tienen una mayor
importancia desde el punto de vista evolutivo.
202.
MUTACIONES SEGÚN SU
CONSECUENCIA.
Las consecuencias fenotípicas de las mutaciones
son muy variadas, desde grandes cambios hasta
pequeñas diferencias tan sutiles que es necesario
emplear técnicas muy elaboradas para su
detección.
• Mutaciones morfológicas
Afectan a la morfología del individuo, a su
distribución corporal. Modifican el color o la
forma de cualquier órgano de un animal o de una
planta. Suelen producir malformaciones. Un
ejemplo de una mutación que produce
malformaciones en humanos es aquella que
determina la neurofibromatosis. Esta es una
enfermedad hereditaria, relativamente frecuente (1
en 3.000 individuos), producida por una mutación
en el cromosoma 17 y que tiene una penetrancia
del 100% y expresividad variable. Con frecuencia
origina retardo mental y macrocefalia.
• Mutaciones letales y deletéreas
Son las que afectan la supervivencia de los
individuos, ocasionándoles la muerte antes de
alcanzar la madurez sexual. Cuando la mutación no
produce la muerte, sino una disminución de la
capacidad del individuo para sobrevivir y/o
reproducirse, se dice que la mutación es deletérea.
Este tipo de mutaciones suelen producirse por
cambios inesperados en genes que son esenciales o
imprescindibles para la supervivencia del
individuo. En general las mutaciones letales son
recesivas, es decir, se manifiestan solamente en
homocigosis o bien, en hemicigosis para aquellos
genes ligados al cromosoma X en humanos, por
ejemplo.
• Mutaciones condicionales
Son aquellas que sólo presentan el fenotipo
mutante en determinadas condiciones ambientales
(denominadas condiciones restrictivas), mostrando
la característica silvestre en las demás condiciones
del medio ambiente (condiciones permisivas).
• Mutaciones bioquímicas o nutritivas
Son los cambios que generan una pérdida o un
cambio de alguna función bioquímica como, por
ejemplo, la actividad de una determinada enzima.
Se detectan ya que el organismo que presenta esta
173
Ensayos Biotecnológicos
mutación no puede crecer o proliferar en un medio
de cultivo por ejemplo, a no ser que se le
suministre un compuesto determinado.
• Mutaciones de pérdida de función
Las mutaciones suelen determinar que la función
del gen en cuestión no se pueda llevar a cabo
correctamente, por lo que desaparece alguna
función del organismo que la presenta. Este tipo de
mutaciones suelen ser recesivas.
• Mutaciones de ganancia de función
Cuando ocurre un cambio en el ADN, lo más
normal es que corrompa algún proceso normal del
ser vivo. Sin embargo, existen raras ocasiones
donde una mutación puede producir una nueva
función al gen, generando un fenotipo nuevo. Si
ese gen mantiene la función original, o si se trata
de un gen duplicado, puede dar lugar a un primer
paso en la evolución.
203.
TIPOS DE MUTACIONES
SEGÚN MECANISMO CAUSAL.
Según el mecanismo que ha provocado el cambio
en el material genético, se suele hablar de tres tipos
de mutaciones:
• Mutaciones cariotípicas o genómicas
• Mutaciones cromosómicas
• Mutaciones génicas o moleculares
En el siguiente cuadro se describen los diferentes
tipos de mutaciones y los mecanismos causales de
cada una de ellas.
Por sustitución de bases
genómica
Aneuploidía
Hay una tendencia actual a considerar como
mutaciones en sentido estricto solamente las
génicas, mientras que los otros tipos entrarían
en el término de aberraciones cromosómicas.
204.
MUTACIÓN GÉNICA.
En Genética se denomina mutación génetica,
mutación molecular o mutación puntual a los
cambios que alteran la secuencia de nucleótidos
del ADN. Estas mutaciones pueden llevar a la
sustitución de aminoácidos en las proteínas
resultantes. Un cambio en un solo aminoácido
puede no ser importante si es conservativo y ocurre
fuera del sitio activo de la proteína. De lo contrario
puede tener consecuencias severas, como por
ejemplo: La sustitución de valina por ácido
glutámico en la posición 6 de la cadena
polipéptidica de la beta-globina da lugar a la
enfermedad anemia falciforme en individuos
homocigóticos debido a que la cadena modificada
tiene tendencia a cristalizar a bajas concentraciones
de oxígeno.
molecular
Por inserciones o deleciones de
bases
Inversiones
Mutación
cromosómica
Deleciones o duplicaciones
Translocaciones
Poliploidía
Salvador Camacho Garrido
Entre las mutaciones genéticas podemos distinguir:
• Mutación por sustitución de bases:
Se producen al cambiar en una posición un par de
bases por otro (son las bases nitrogenadas las que
distinguen los nucleótidos de una cadena).
Distinguimos dos tipos que se producen por
diferentes mecanismos bioquímicos:
o Mutaciones transicionales o simplemente
transiciones, cuando un par de bases es
sustituido por su alternativa del mismo tipo.
Las dos bases púricas son adenina (A) y
174
Ensayos Biotecnológicos
guanina (G), y las dos pirimídicas son citosina
(C) y timina (T). La sustitución de un par AT,
por ejemplo, por un par GC, sería una
transición.
o Mutaciones transversionales o transversiones,
cuando un par de bases es sustituida por otra
del otro tipo. Por ejemplo, la sustitución del
par AT por TA o por CG.
• Mutaciones de corrimiento estructural:
Cuando se añaden o se quitan pares de nucleótidos
alterándose la longitud de la cadena. Si se añaden o
quitan pares en un número que no sea múltiplo de
tres (es decir si no se trata de un número exacto de
codones), las consecuencias son especialmente
graves, porque a partir de ese punto, y no sólo en
él, toda la información queda alterada. Hay dos
casos:
o Mutación por pérdida o deleción de
nucleótidos: En la secuencia de nucleótidos se
pierde uno o más nucleótidos y la cadena se
acorta en una unidad.
o Mutación por inserción de nuevos nucleótidos:
Dentro de la secuencia del ADN se introducen
nucleótidos adicionales, interpuestos entre los
que ya había, alargándose la cadena
correspondientemente.
• Mutaciones en los sitios de corte y
empalme (Splicing) :
Las mutaciones de corrimiento del marco de
lectura también pueden surgir por mutaciones que
interfieren con el splicing del ARN mensajero. El
comienzo y final de cada intrón en un gen están
definidos por secuencias conservadas de ADN. Si
un nucleótido muta en una de las posiciones
altamente conservada, el sitio no funcionará más,
con las consecuencias predecibles para el ARNm
maduro y la proteína codificada. Hay muchos
ejemplos de estas mutaciones, por ejemplo,
algunas mutaciones en el gen de la beta-globina en
la beta-talasemia son causadas por mutaciones de
los sitios de splicing.
Otros autores distinguen cuatro tipos:
• Transición: Mutación donde es sustituida
una base púrica por otra púrica y una
pirimidínica por otra pirimidínica.
• Transversión: Es una mutación en la cual
una base púrica se sustituye por una
pirimidínica y viceversa.
• Adicción: Se produce la unión de una o
muy pocas bases nitrogenadas.
• Deleción: Se escinden una o varias bases
nitrogenadas. En ocasiones el material que
se retira en un lugar, se añade en otro.
Las mutaciones de transición y transversión son
problemáticas si afectan a los tripletes de inicio y
final de lectura.
Salvador Camacho Garrido
Las de adicción y deleción generan mutantes de
corrimientos y generan una modificación profunda
del material genético.
205.
MUTACIÓN CROMOSÓMICA.
Son las mutaciones que afectan a la secuencia de
los hipotéticos fragmentos en que podría
subdividirse transversalmente un cromosoma.
Muchas de ellas son apreciables al microscopio
gracias a la técnica de bandas con la que se
confecciona el cariotipo.
Dentro de las mutaciones cromosómicas
encontramos:
• Mutación
por inversión de un
fragmento cromosómico.
• Mutación por deleción o pérdida de un
fragmento cromosómico.
• Mutación por duplicación de un
fragmento cromosómico.
Suelen estar asociadas casi siempre con deleciones
en otro cromosoma.
• Mutación por translocación o inserción
de un fragmento cromosómico,
Es decir por un cambio en la posición de un
fragmento cromosómico. La translocación puede
ocurrir en un solo cromosoma, entre cromosomas
homólogos o entre cromosomas diferentes.
175
Ensayos Biotecnológicos
o
o
o
206.
MUTACIÓN GENÓMICA.
Son las mutaciones que afectan al número de
cromosomas o todo el genoma.
• Poliploidía:
Es la mutación que consiste en el aumento del
número normal de “juegos de cromosomas”. Los
seres poliploides pueden ser:
o Autopoliploides, si todos los juegos proceden
de la misma especie.
o Alopoliploides, si proceden de la hibridación,
es decir, del cruce de dos especies diferentes.
• Haploidía:
Son las mutaciones que provocan una disminución
en el número de juegos de cromosomas.
• Aneuploidía:
Son las mutaciones que afectan sólo a un número
de ejemplares de un cromosoma o más, pero sin
llegar a afectar al juego completo. Las aneuploidías
pueden ser monosomías, trisomías, tetrasomías,
etc., cuando en lugar de dos ejemplares de cada
tipo de cromosomas, que es lo normal, hay o sólo
uno, o tres, o cuatro, etc. Entre las aneuplodías
podemos encontrar diferentes tipos de trastornos
genéticos en humanos como pueden ser:
o Trisomía 21 o Síndrome de Down o
mongolismo que tienen 47 cromosomas.
o Trisomía 18 o Síndrome de Edwards. También
tienen 47 cromosomas.
o Monosomía X0 o Síndrome de Turner.
Salvador Camacho Garrido
Trisomía sexual XXX.
Trisomía sexual XXY
Klinefelter.
Trisomía sexual XYY.
o
síndrome
de
207.
CAUSAS DE LAS
MUTACIONES.
En principio las mutaciones pueden ser:
• Mutaciones naturales o espontáneas:
Son las que se producen en condiciones normales
de crecimiento y del ambiente. Representan la base
de la evolución biológica.
Surgen normalmente como consecuencia de errores
durante el proceso de replicación del ADN. Tales
errores ocurren con una probabilidad de 10-7 en
células haploides y 10-14 en diploides, aunque
también intervienen las lesiones o daños fortuitos
en el ADN y los elementos genéticos transponibles.
• Mutaciones inducidas:
Son las mutaciones provocadas artificialmente por
algún agente exógeno, generalmente conocido,
llamado agente mutágeno. Entre los agentes
mutágenos encontramos:
o Agentes físicos:
1. Radiaciones ionizantes: Como los
rayos ultravioleta, los rayos X,
partículas alfa, beta y gamma de
fuentes radiactivas como el radio,
uranio, cobalto y rayos cósmicos que
aumentan con la disminución de la
capa de ozono.
2. Choque térmico.
3. Ultrasonidos de altísima energía.
4. Centrifugación masiva.
o Agentes químicos:
1. Análogos de bases de ácidos nucleicos
como la 5-bromouracilo, o la 2aminopurina, moléculas que se
176
Ensayos Biotecnológicos
o
parecen estructuralmente a las bases
púricas o pirimidínicas pero que
muestran propiedades de apareamiento
erróneas;
2. Agentes alquilantes como el gas
mostaza, el yoduro de metilo o la
nitrosoguanidina,
que
reacciona
directamente con el ADN originando
cambios químicos en una u otra base y
produciendo también apareamientos
erróneos
3. Agentes intercalantes como los
colorantes de acridina (proflavina,
acridina), que separan entre si 2 pares
de bases del ADN.
4. Alcaloides como la cafeína.
5. Agentes que atacan al ADN como la
formalina y el ácido nitroso.
6. Carcinógenos como el benzopireno,
sulfato de cobre, ácido bórico, ácido
fórmico, colchicina, uretano.
7. Drogas como el LSD, nicotina.
8. Edulcorantes como el ciclamato.
9. Peróxidos como el agua oxigenada.
10. Otros muchos más.
Agentes biológicos:
1. Virus
2. Bacterias.
3. Transposones.
208.
ERRORES DE REPLICACIÓN.
Se describirán tres tipos de errores durante la
replicación del ADN:
• La tautomería:
Las
bases
nitrogenadas
se
encuentran
habitualmente en su forma cetónica y con menos
frecuencia aparecen en su forma tautomérica
enólica o imino. Las formas tautoméricas o
enólicas de las bases nitrogenadas (A*, T*, G* y
C*) muestran relaciones de apareamiento distintas:
A*-C, T*-G, G*-T y C*-A. El cambio de la forma
normal cetónica a la forma enólica produce
transiciones. Los errores en el apareamiento
incorrecto de las bases nitrogenadas pueden ser
detectados por la función correctora de pruebas de
la ADN polimerasa III.
• Las mutaciones de cambio de fase o
pauta de lectura:
Se trata de inserciones o deleciones de uno o muy
pocos nucleótidos. Según un modelo propuesto por
Streisinger, estas mutaciones se producen con
frecuencia en regiones con secuencias repetidas.
En las regiones con secuencias repetidas, por
ejemplo, AAAAAAAAAAA..., o por ejemplo,
ATATATATATATATAT...., durante la replicación se
puede producir el deslizamiento de una de las dos
Salvador Camacho Garrido
hélices (la hélice molde o la de nueva síntesis)
dando lugar a lo que se llama el "apareamiento
erróneo deslizado". El deslizamiento de la hélice
de nueva síntesis da lugar a una adición, mientras
que el deslizamiento de la hélice molde origina una
deleción. En el gen lac I (gen estructural de la
proteína represora) de E. coli se han encontrado
puntos calientes (regiones en las que la mutación
es muy frecuente) que coinciden con secuencias
repetidas: un ejemplo es el punto caliente CTGG
CTGGCTGG.
• Deleciones y duplicaciones grandes:
Las deleciones y duplicaciones de regiones
relativamente grandes también se han detectado
con bastante frecuencia en regiones con secuencias
repetidas. En el gen lac I de E. coli se han
detectado deleciones grandes que tienen lugar entre
secuencias repetidas. Se cree que estas mutaciones
podrían producirse por un sistema semejante al
propuesto por Streisinger ("Apareamiento erróneo
deslizado") o bien por sobrecruzamiento desigual.
209.
CAMBIOS QUÍMICOS
ESPONTÁNEOS.
Los más comunes son depurinación y
desaminación de bases específicas y los daños
oxidativos del ADN.
• Despurinación
En la despurinación, una purina A ó G se pierde
del DNA al romperse el enlace glucosídico entre
la base nitrogenada y el azúcar al que está unida
con pérdida de una Adenina (A) o de una Guanina
(G). Como consecuencia aparecen sedes
apurínicas. Existe un sistema de reparación de este
tipo de lesiones en el ADN. Este tipo de lesión es
la más recurrente o frecuente: se estima que se
produce una pérdida de 10.000 cada 20 horas a
37°C.
• Desaminación
Consiste en la pérdida de grupos amino. La
Citosina (C) por desaminación se convierte en
Uracilo (U) y el Uracilo empareja con Adenina (A)
produciéndose transiciones: GC→AT. El Uracilo
(U) no forma parte del ADN, existiendo una
enzima llamada glucosidasa de uracilo encargada
de detectar la presencia de U en el ADN y retirarlo.
Al retirar el Uracilo (U) se produce una sede
apirimidínica. La 5-metilcitosina (5-Me-C) por
desaminación se convierte en Timina (T). La
Timina (T) es una base normal en el ADN y no se
retira, por tanto estos errores no se reparan. Este
tipo de mutación también genera transiciones.
• Daños oxidativos en el ADN
El metabolismo aeróbico produce radicales
superoxido O22-, peróxido de hidrógeno H2O2 e
hidroxilo. Estos radicales producen daños en el
177
Ensayos Biotecnológicos
ADN, y una de las principales alteraciones que
originan es la transformación de la Guanina (G) en
8-oxo-7,8-dihidro-desoxiguanina que se aparea con
la
Adenina
(A).
La
8-oxo-7,8-dihidrodesoxiguanina recibe el nombre abreviado de 8oxo-G. Esta alteración del ADN produce
transversiones: GC→TA. La Timidina se convierte
en Glicol de timidina.
210.
ELEMENTOS GENÉTICOS
TRANSPONIBLES.
Los elementos genéticos transponibles son
secuencias de ADN que tienen la propiedad de
cambiar de posición dentro del genoma, por tal
causa también reciben el nombre de elementos
genéticos móviles. Por tanto, cuando cambian de
posición y abandonan el lugar en el que estaban, en
ese sitio, se produce un deleción o pérdida de
bases. Si el elemento transponible estaba insertado
en el interior de un gen, puede que se recupere la
función de dicho gen. De igual forma, si el
elemento genético móvil al cambiar de posición se
inserta dentro de un gen se produce una adición de
una gran cantidad de nucleótidos que tendrá como
consecuencia la pérdida de la función de dicho
gen. Por consiguiente, los elementos genéticos
transponibles producen mutaciones.
Transposones en Bacterias
En Bacterias existen dos tipos de transposones:
• Transposón Simple, Secuencia de
Inserción o Elemento de Inserción (IS):
Los transposones simples contienen una secuencia
central con información para la transposasa y en
los extremos una secuencia repetida en orden
inverso. Esta secuencia repetida en orden inverso
no es necesariamente idéntica, aunque muy
parecida. Cuando un transposón simple se integra
en un determinado punto del ADN aparece una
repetición directa de la secuencia diana (5-12 pb).
• Transposón Compuesto (Tn):
Contienen un elemento de inserción (IS) en cada
extremo en orden directo o inverso y una región
central que además suele contener información de
otro tipo. Por ejemplo, los Factores de
transferencia de resistencia (RTF), poseen
información en la zona central para resistencia a
antibióticos
(cloranfenicol,
kanamicina,
tetraciclina, etc.).
Tanto los elementos IS como los trasnposones
compuestos (Tn) tienen que estar integrados en
otra molécula de ADN, el cromosoma principal
bacteriano o en un plasmidio, nunca se encuentran
libres.
Salvador Camacho Garrido
Transposones en plantas
Los transposones fueron descubiertos por Barbara
McClintock (entre 1951 y 1957) en el maíz, sin
embargo, cuando postuló su existencia la
comunidad
científica
no
comprendió
adecuadamente sus trabajos. Años más tarde, ella
misma comparó los "elementos controladores" que
había
descrito
(elementos
cromosómicos
transponibles) del maíz con los transposones de los
plasmidios. Sus trabajos recibieron el Premio
Nobel en 1983.
Dentro de las familias de elementos controladores
de maíz se pueden distinguir dos clases:
• Los elementos autónomos:
Capaces de escindirse de la sede donadora y
transponerse.
• Los elementos no autónomos:
Son estables, y solamente se vuelven inestables en
presencia de los autónomos en posición trans.
En el sistema Ac-Ds (Activador-Disociación)
estudiado por McClintock, Ac es el elemento
autónomo y Ds es el elemento no autónomo.
Transposones en mamíferos
En mamíferos se conocen tres clases de
secuencias que son capaces de transponerse o
cambiar de posición a través de un ARN
intermediario:
• Retrovirus endógenos:
Semejantes a los retrovirus, no pueden infectar
nuevas células y están restringidos a un genoma,
pero pueden transponerse dentro de la célula.
Poseen largas secuencias repetidas en los extremos
(LTR), genes env (con información para la
proteína de la cubierta) y genes que codifican para
la transcriptasa inversa, como los presentes en
retrovirus.
• Retrotransposones o retroposones:
Carecen de LTR y de los genes env (con formación
para la proteína de la cubierta) de retrovirus.
Contienen genes para la transcriptasa inversa y
pueden transponerse. Tienen una secuencia rica en
pares A-T en un extremo. Un ejemplo, son los
elementos LINE-1 (elementos largos dispersos) en
humanos y ratones.
• Retropseudogenes:
Carecen de genes para la transcriptasa inversa y
por consiguiente son incapaces de transponerse de
forma independiente, aunque si pueden cambiar de
posición en presencia de otros elementos móviles
que posean información para la transcriptasa
inversa. Poseen una región rica en pares A-T en un
extremo y los hay de dos tipos:
o Pseudogenes procesados: están en bajo número
de copias y derivan de genes transcritos por la
ARN Poilimerasa II, siendo genes que
178
Ensayos Biotecnológicos
codifican para polipéptidos. Estos pseudogenes
procesados carecen de intrones.
o SINES (elementos cortos dispersos): están en
alto número de copias en mamíferos. Dos
ejemplos son la secuencia Alu de humanos y
B1 de ratón, que derivan de genes transcritos
por la ARN polimerasa III utilizando un
promotor interno.
La secuencia Alu es la más abundante en el
genoma humano, existiendo 750.000 copias
dispersas por el genoma, aproximadamente existe
una copia cada 4000 pb.
211.
REVERSIÓN Y SUPRESIÓN
DE MUTACIONES.
Un fenotipo mutado puede volver al fenotipo
normal, lo que ocurre a través de dos mecanismos
diferentes a nivel del genotipo: reversión y
supresión.
En la reversión ocurre una segunda mutación en el
mismo sitio donde había ocurrido la primera. Si
esto conduce a la incorporación del mismo
aminoácido original se habla de una reversión
verdadera. Si no se incorpora el mismo
aminoácido, sino que es otro pero que le confiere
mayor funcionalidad a la proteína en comparación
con la proteína mutada, se dice que se trata de una
reversión parcial.
En la supresión también ocurre una segunda
mutación, pero en un sitio diferente donde había
ocurrido la primera mutación. Pero el cambio en el
fenotipo es la vuelta del fenotipo mutado al
normal.
La supresión puede ocurrir en el mismo gen, y se
tiene una supresión intragénica, ó puede ocurrir en
un gen diferente. En este último caso la supresión
es del tipo intergénica.
Un ejemplo de mutaciones supresoras intergénicas
ocurre en el caso de los tRNA supresores: si en un
gen ocurre una mutación nonsense, el producto
será una proteína truncada (mutada). Si en otro gen
diferente, que codifica un tRNA ocurre una
mutación en la secuencia de bases que codifican
para el anticodón, y se formara una secuencia
capaz de reconocer a un triplete de término,
entonces este tRNA mutado va a traducir el triplete
nonsense, y se va a suprimir por lo tanto el efecto
de la mutación.
Además existen mecanismos enzimáticos que se
encargan de reparar daños puntuales del ADN.
Así por ejemplo, cuando actúa la luz UV (el sol es
una fuente poderosa de luz UV, pero una gran
cantidad de esta radiación es eliminada al atravesar
la capa de ozono en la atmósfera) que induce
mutaciones puntuales del tipo dímeros de
pirimidinas -y dos pirimidinas vecinas en una
Salvador Camacho Garrido
misma hebra formarán dímeros de estructuras tipo
ciclobutano que impiden que el DNA sea un
molde adecuado para la replicación y
transcripción- la célula tiene 2 mecanismos
enzimáticos para reparar el daño causado por los
dímeros
de
pirimidinas:
reparación
por
fotoreparación y reparación por excisión.
En la fotoreparación participa una enzima tipo
fotoliasa que se activa en presencia de luz de
longitud de onda entre 320 y 370 nm.
En el mecanismo de reparación excisión participa
una endonucleasa, luego la DNA pol. I con su
actividad de exonucleasa, luego la DNA pol. I con
su actividad de polimerasa y finalmente una DNA
ligasa.
212.
OTROS CONCEPTOS.
Tasa de mutación
Las tasas de mutación han sido medidas en una
gran variedad de organismos. En mamíferos la
tasa de mutación va de 1 en 2,2·109 bases
núcleotídicas, mientras que, en el otro extremo de
la escala los virus de ARN tienen una tasa de
mutación del orden de 1 en 106.
La cantidad de mutaciones tiene relación con el
tipo de enzima involucrada en la copia del material
genético. Esta enzima (ADN o ARN Polimerasa,
según el caso) tiene distintas tasas de error y esto
incide directamente en el número final de
mutaciones. A pesar de que la incidencia de las
mutaciones es relativamente grande en relación
con el número de organismos de cada especie, la
evolución no depende solo de las mutaciones que
surgen en cada generación, sino de la interacción
de toda esta acumulación de variabilidad con la
selección natural y la deriva genética durante la
evolución de las especies.
Dominancia y Recesividad
La mayoría de las mutaciones son recesivas debido
a que la mayor parte de los genes codifican
179
Ensayos Biotecnológicos
enzimas.
Si un gen es inactivado, la reducción en el nivel de
actividad de la enzima puede no ser superior al
50% ya que el nivel de transcripción del gen
remanente puede aumentarse por regulación en
respuesta a cualquier aumento en la concentración
del sustrato.
Asimismo, la proteína en si misma puede estar
sujeta a regulación (por fosforilación, por ejemplo)
de tal forma que su actividad pueda ser aumentada
para compensar cualquier falta en el número de
moléculas.
En cualquier caso, a menos que la enzima controle
la velocidad del paso limitante en la ruta
bioquímica, una reducción en la cantidad de
producto puede no importar.
No obstante existen algunos casos de dominancia:
• Haploinsuficiencia:
En este caso, la cantidad de producto de un gen no
es suficiente para que el metabolismo sea el
normal. Quizás la enzima producida sea la
responsable de regular la velocidad del paso
limitante en una reacción de una ruta metabólica.
• Efecto dominante negativo:
Ciertas enzimas tiene una estructura multimérica
(compuesta por varias unidades) y la inserción de
un componente defectuoso dentro de esa estructura
puede destruir la actividad de todo el complejo. El
producto de un gen defectuoso, entonces, interfiere
con la acción del alelo normal.
• Ganancia de función:
Es imposible imaginar que por una mutación un
gen pueda ganar una nueva actividad, pero quizá el
sitio activo de una enzima pueda ser alterado de tal
forma que desarrolle especificidad por un nuevo
sustrato. Si no ¿cómo puede ocurrir la evolución?
• Dominancia a nivel organísmico pero
recesividad a nivel celular:
Algunos de los mejores ejemplos de esto se
encuentran en el área de la genética del cáncer. Un
ejemplo típico sería el de un gen supresor de tumor
como en retinoblastoma.
Polimorfismo
Las mutaciones pueden considerarse patológicas o
anormales, mientras que los polimorfismos son
variaciones normales en la secuencia del ADN de
unos individuos a otros y que superan el uno por
ciento en la población, por lo que no pueden
considerarse patológicas. La mayoría de los
polimorfismos proceden de mutaciones silentes.
Mutación y cáncer
El cáncer está causado por alteraciones en
oncogenes, genes supresores de tumores y/o genes
de micro-ARN. Un solo cambio genético es
Salvador Camacho Garrido
usualmente insuficiente para que se desarrolle un
tumor maligno. La mayor parte de la evidencia
indica que tal desarrollo involucra un proceso de
varios pasos secuenciales en los cuales ocurren
alteraciones en varios, frecuentemente muchos, de
estos genes.
Un oncogén es un gen que, cuando es desregulado,
participa en el inicio y desarrollo del cancer. Las
mutaciones génicas que dan como resultado la
activación de los oncogenes incrementan la
posibilidad de que una célula normal se convierta
en una célula tumoral. Desde la década de los 70 se
han identificado docenas de oncogenes en los seres
humanos. Los oncogenes, al menos en sentido
figurado, son los perpetuos antagonistas de los
genes supresores tumorales, los cuales actúan
previniendo el daño del ADN y mantienen las
funciones celulares bajo un equilibrado control.
Existe mucha evidencia que apoya la noción de
que la pérdida o inactivación por mutaciones
puntuales de los genes supresores de tumores
puede llevar a una célula a transformarse en
cancerosa.
Los oncogenes se originan a partir de mutaciones
en genes normales, llamados proto-oncogenes. Los
proto-oncogenes usualmente codifican para
proteínas que ayudan a regular el ciclo celular o la
diferenciación celular y se hallan frecuentemente
involucrados en la transducción de señal y en la
ejecución de señales mitogénicas.
Se ha descubierto, por otro lado, que los microARNs (pequeños ARNs de 20 a 25 nucléotidos de
longitud) pueden controlar la expresión de los
oncogenes regulándolos negativamente. Por esa
razón, las mutaciones en los micro-ARNs pueden
llevar a la activación de los oncogenes.
Hipermutación somática
La hipermutación somática (SHM) es un
mecanismo celular, que forma parte del modo en
cómo se adapta el sistema inmune a nuevos
elementos extraños (por ejemplo bacterias).
Su función es diversificar los receptores que usa el
sistema inmunitario para reconocer elementos
extraños (antígeno) y permite al sistema inmune
adaptar su respuesta a las nuevas amenazas que se
producen a lo largo de la vida de un organismo.
La hipermutación somática implica un proceso de
mutación programada que afecta a las regiones
variables de los genes de inmunoglobulina. A
diferencia de muchos otros tipos de mutación, la
SHM afecta solo a células inmunitarias
individuales y sus mutaciones, por lo tanto, no se
trasmiten a la descendencia.
213.
EFECTOS DE LAS
180
Ensayos Biotecnológicos
MUTACIONES.
Ninguno de los agentes mutágenos produce
mutaciones específicas. Entre los efectos de las
mutaciones encontramos:
Efectos Nocivos:
Son especialmente peligrosas en los gametos,
cigotos o células de un embrión del que pueden
surgir individuos u órganos anómalos.
Si afecta a células en continua división puede
surgir un cáncer, al alterar los oncogenes o los
genes supresores. La mayoría de las mutaciones
son letales, pero también pueden producir
numerosas enfermedades hereditarias, congénitas y
enfermedades crónicas en el adulto.
Muchos de los contaminantes ambientales son
agentes mutagénicos que no sólo afectan al ser
humano sino también a los componentes
biológicos de los ecosistemas, provocando en
muchos casos severos desequilibrios y daños
permanentes.
Efectos Beneficiosos:
Las mutaciones pueden inducir cambios que
adaptan los seres vivos al medio ambiente. Una
sustitución de un nucleótido en la secuencia del
ADN puede pasar desapercibida, pero también
puede producir alteraciones importantes en la
función biológica de una proteína. Las mutaciones
nuevas tienen mayor probabilidad de ser
perjudiciales que beneficiosas en los organismos, y
esto se debe a que son eventos aleatorios con
respecto a la adaptación, es decir, el que ocurra o
no una mutación particular es independiente de las
consecuencias que puedan tener en sus portadores.
Las tasas de mutación han sido medidas en una
gran variedad de organismos. En humanos y en
organismos pluricelulares, una mutación ocurre
entre 1 de cada 100.000 gametos o 1 de cada
1.000.000. A pesar de que la incidencia de las
mutaciones es relativamente grande en relación
con el número de organismos de cada especie, la
evolución no depende ni mucho menos de las
mutaciones que surgen en cada generación, sino de
la acumulación de toda la variabilidad durante la
evolución de las especies.
214.
ENSAYOS DE TOXICIDAD.
Los ensayos de toxicidad son los bioensayos
empleados para reconocer y evaluar los efectos de
los contaminantes sobre la biota. En los bioensayos
se usa un tejido vivo, organismo, o grupo de
organismos, como reactivo para evaluar los efectos
de cualquier sustancia fisiológicamente activa.
Estos ensayos, básicamente, consisten en la
exposición de grupos de organismos, a
Salvador Camacho Garrido
determinadas concentraciones del tóxico por un
tiempo determinado. Los organismos deben estar
en buenas condiciones de salud, previamente
aclimatados a las condiciones del ensayo, y se
mantienen en condiciones ambientales constantes.
Además se dispone de grupos de control (que no se
exponen al tóxico). Luego se miden y registran los
efectos biológicos observados en cada uno de los
grupos, control y tratados y, posteriormente, se
efectúa un análisis estadístico de los datos
obtenidos.
Los efectos tóxicos a evaluar pueden ser:
mortalidad,
inmovilidad,
inhibición
del
crecimiento de la población, alteración del
comportamiento, etc. Se determinan distintas
variables como, por ejemplo, la concentración letal
50 (CL50), que es la concentración letal para el 50
% de los individuos expuestos. Las condiciones de
los cultivos y los ensayos deben estar altamente
estandarizadas para permitir la comparación de los
resultados.
Los ensayos de toxicidad permiten establecer los
límites permitidos para los distintos contaminantes,
evaluar el impacto de mezclas sobre las
comunidades de los ambientes que las reciben y
comparar la sensitividad de una o más especies a
distintos tóxicos o a diferentes condiciones para el
mismo tóxico. Es útil para la investigación básica
del fenómeno de toxicidad, establecer criterios o
patrones de calidad de aguas superficiales o
efluentes, la evaluación del impacto ambiental y
del riesgo ecológico y el monitoreo de las
condiciones de un agua.
Generalmente, no es suficiente para proteger la
biota registrar en un ecosistema dado las
concentraciones de las sustancias químicas; los
programas para monitorear tales sustancias suelen
ser muy caros, y aquellas de alta toxicidad,
generalmente, deben detectarse en concentraciones
muy bajas, usando equipo costoso y personal muy
entrenado; y en un solo ambiente puede haber
cientos de contaminantes con efectos muchas veces
no aditivos. Por lo tanto, se necesitan los ensayos
biológicos que son relativamente simples, rápidos
y económicos, y pueden brindar información
adicional sobre el riesgo potencial, incluyendo
efectos tóxicos como generación de cáncer,
malformaciones, desórdenes de conducta, efectos
acumulativos, antagonismos y sinergismos.
Los ensayos pueden ser de laboratorio (con un
número reducido de especies, y en condiciones
estandarizadas que reproducen sólo en forma muy
parcial las condiciones naturales en el ambiente), o
de campo (con “encierros” sometidos a las
condiciones del medio).
Mediante los ensayos de toxicidad se estudian las
181
Ensayos Biotecnológicos
relaciones dosis o concentración / efecto y dosis o
concentración / respuesta.
Efecto: cambio biológico evaluable por una escala
de intensidad o severidad.
Respuesta: proporción de la población expuesta
que manifiesta un efecto definido.
215.
EFECTOS DEL TÓXICO EN
LAS PRUEBAS.
Tras la exposición del organismo o grupos de
organismos a distintas concentraciones de la
muestra problema, se miden y registran los efectos
biológicos observados en cada uno de los grupos
tratados y en los grupos control y, posteriormente,
se efectúa un análisis estadístico de los datos
obtenidos.
La cantidad de tóxico suministrada se puede
expresar de dos formas:
• Concentración: masa de tóxico por
unidad de volumen de agua.
• Dosis: cantidad de tóxico que penetra en el
organismo por unidad de masa de tejido o
de ser vivo sobre el que actúa.
La toxicidad que experimentan los organismos tras
los ensayos puede ser de dos tipos:
• Toxicidad aguda: efecto adverso (letal o
subletal) inducido sobre los organismos de
ensayo en prueba durante un periodo de
exposición del material de ensayo,
usualmente de pocos días.
• Toxicidad crónica: efectos tóxicos a largo
plazo, que pueden mantenerse en alrededor
de la décima parte de la vida media de la
especie. Están relacionados con cambios
en el metabolismo, crecimiento o
capacidad de supervivencia.
216.
ESPECIES IMPLICADAS.
Los organismos empleados para los ensayos deben
tener alta sensibilidad a los tóxicos, ya que al
establecer las concentraciones seguras para ellos se
Salvador Camacho Garrido
espera proteger a todo el ecosistema, pero hay que
tener en cuenta que distintas especies tienen
diferente sensitividad a distintas sustancias
químicas. Más de 150 especies desde bacterias
hasta mamíferos se usaron como organismos para
test, pero sólo unas 40 tuvieron cierta aprobación
oficial.
De cualquier forma los organismos implicados
serán diferentes en función tanto del tóxico a
evaluar como al sustrato al que pertenece.
Así a título de ejemplo para el estudio de la
contaminación del agua:
SUSTANCIAS NO DESEABLES Y TÓXICAS INCLUIDAS EN
ESTÁNDARES DE AGUA
Sustancias indeseables
Sustancias tóxicas
Nitratos
Organoclorados
Arsénico
Antimonio
Nitritos
Hierro
Berilio
Selenio
Amonio
Manganeso
Cadmio
Pesticidas
Sulfuro de
hidrógeno
Cobre
Cianuros
HAP
Hidrocarburos
Zinc
Cromo
Fenoles
Fósforo
Mercurio
Boro
Flúor
Níquel
Surfactantes
Bario
Plomo
Para ello los organismos implicados son:
ESPECIES UTILIZADAS EN ENSAYOS DE TOXICIDAD
Agua salada
Agua dulce
Algas
Champia parvula
(alga roja)
Selenastrum capricornutum
(alga verde)
Pólipos
-
Hydra attenuata (clase
Hydrozoa)
Nematodos
-
Panagrellus redivivus
Crustáceos
Mysidopsis bahia
(familia misidos)
Ceriodaphnia dubia, Daphnia
magna, Daphnia pulex, Daphnia
similis (familia dáfnidos)
Peces
Cyrinidon
variegatus
Pimephales promelas
217.
ÍNDICES DE TOXICIDAD.
Los efectos biológicos que se producen en los
ensayos se pueden definir de varias formas, que
van a ser los parámetros que se utilicen para
determinar la toxicidad. A continuación se definen
los parámetros más usados:
1. Concentración efectiva (CEx):
Concentración del efluente que produce efectos
182
Ensayos Biotecnológicos
negativos apreciables en un porcentaje "x" de la
población de ensayo. Se usa el CE50 o EC50, que
sería la concentración efectiva que afecta al 50 %
de la población.
2. Concentración letal (CLx):
Concentración del efluente que produce la muerte
de un porcentaje "x" de la población de ensayo. Se
usa el CL50 o LC50, que sería la concentración
letal que mata al 50 % de la población.
3. NEANO (nivel de efectos agudos no
observados):
Mayor concentración del efluente para la cual la
mortalidad registrada es del 10 % o menor.
4. CENO (concentración de efectos no
observables):
Mayor concentración continuada medida de un
efluente para la cual no se observa reacción crónica
alguna en las especies ensayadas.
5. MCEO (menor concentración que
produce efectos observables):
Se define como la menor concentración del
efluente para la que puede observarse algún efecto
sobre la especie ensayada. Se determina con
técnicas de análisis de varianzas.
Para emplear y utilizar los resultados de los
ensayos de toxicidad se emplean las unidades de
toxicidad (UT), que son las que se utilizan como
criterio base de la normativa:
• Unidad tóxica aguda (UTa):
Inversa de la dilución del efluente que causa la
respuesta aguda al finalizar el periodo de
exposición de la especie. Se puede calcular
mediante la siguiente expresión:
UTa = 100 / CL50
• Unidad tóxica crónica (UTc):
Inversa de la dilución del efluente para la cual no
se observa respuesta alguna en ninguno de los
organismos al final del periodo de exposición
crónica o continua. Se puede calcular mediante la
siguiente expresión:
UTc = 100 / CENO
218.
PROTECCIÓN DE LA
TOXICIDAD.
Una vez determinados todos los parámetros
anteriores, se definen los criterios de calidad de las
aguas, que establecen normas y limitaciones en la
presencia de agentes tóxicos, para de esta forma
asegurar la protección de los usos específicos del
agua. Los criterios actuales sobre el control de la
calidad del agua intentan proteger las aguas por un
lado, de la toxicidad aguda y, por otro, de la
toxicidad crónica.
Salvador Camacho Garrido
• Protección contra la toxicidad aguda.
Se utiliza el criterio de máxima concentración
(CMC), que no deben ser superiores a 0,3 veces la
UTa de los resultados del ensayo más sensible de
los realizados:
CMC = UTa / DCI ≤ 0,3 · UTa
En donde: DCI es la dilución crítica inicial. En los
vertidos al mar es la dilución alcanzada en la zona
más cercana a donde se produce el vertido
suponiendo que se producen las peores condiciones
ambientales. En los vertidos a ríos es la dilución
alcanzada en la frontera de la zona de mezcla
El criterio agudo toma como valor del CMC aquel
que constituye una buena aproximación de CL1, ya
que se ha comprobado que el factor 0,3 cubre el 91
% de los cocientes CL50/CL1 en diversos ensayos
de toxicidad de efluentes para períodos de 96
horas. Normalmente la CMC hace referencia a la
concentración media en cuatro días que no puede
ser superada más que una vez cada tres años.
• Protección contra la toxicidad crónica
Se utiliza el criterio de concentración continua
(CCC), que no debe ser superior a 1,0 veces la UTc
de los resultados de los ensayos de la más sensible
de entre al menos tres especies ensayadas:
CCC = UTc / DCI ≤ 1,0 · UTc
En donde DCI tiene el mismo significado que en la
expresión de CMC. El criterio de concentración
continua previene los efectos crónicos en el
entorno exterior de la zona inicial de mezcla de los
vertidos y hace referencia a la concentración media
horaria que no puede ser superada en más de una
ocasión cada tres años.
219.
CLASIFICACIÓN DE LOS
ENSAYOS DE TOXICIDAD.
En principio se pueden realizar los ensayos de dos
formas diferentes:
• Ensayos in vivo.
• Ensayos in vitro.
En función de su utilidad podemos clasificarlos en:
• Ensayos toxicológicos.
• Ensayos ecotoxicológicos.
En función del método:
• Ensayos convencionales.
• Ensayos especiales.
En función de la información requerida:
• Ensayos de cardiotoxicidad.
• Ensayos de hepatotoxicidad.
• Ensayos de neurotoxicidad.
• Ensayos de carcinogénesis.
• Ensayos de mutagénesis, etc.
183
Ensayos Biotecnológicos
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
Métodos
Toxicidad aguda por vía oral
Toxicidad aguda (oral): método de dosis fija
Toxicidad aguda (oral): método de clase tóxica
aguda
Toxicidad aguda por inhalación
Toxicidad aguda por vía cutánea
Toxicidad aguda – irritación de la piel
Toxicidad aguda – irritación ocular
Sensibilización de la piel
Toxicidad por administración continuada (28
días) por vía oral
Toxicidad por administración continuada (28
días) por inhalación
Toxicidad por administración continuada (28
días) por vía cutánea
Mutagénesis (ensayo citogenético in vitro en
mamíferos, análisis cromosómico)
Mutagénesis (ensayo citogenético en vivo en
médula ósea de mamíferos, análisis
cromosómico)
Mutagenicidad (ensayo de micronúcleos)
Mutagénesis (ensayo de mutación revertida en
Escherichia coli)
Mutagénesis (ensayo de mutación revertida en
Salmonella typhimurium)
Mutación
genética
en
Saccharomyces
cerevisiae
Recombinación mitótica en Saccharomyces
cerevisiae
Mutación génica de células de mamífero in
vitro
Lesión y reparación de ADN: síntesis de ADN
no programada en células de mamífero in vitro
Ensayo in vitro de intercambio de cromátidas
hermanas
Ensayo de letalidad recesiva ligada al sexo en
Drosophila melanogaster
Ensayo de transformación de células de
mamífero in vitro
Ensayo de letalidad dominante en roedores
Ensayo citogenético en células germinales en
mamífero in vivo
Ensayo de la mancha en ratón
Translocación hereditaria en ratón
Toxicidad oral subcrónica: ensayo de 90 días
en roedores
Toxicidad oral subcrónica: ensayo de 90 días
en no roedores
Toxicidad dérmica subcrónica: ensayo de 90
días en roedores
Toxicidad subcrónica por inhalación: ensayo
de 90 días en roedores
Ensayo
de
toxicidad
crónica
B.31. Estudio de teratogenicidad: roedores y
no roedores
Salvador Camacho Garrido
o
o
o
o
o
o
o
Ensayo de carcinogénesis
Ensayo combinado de toxicidad crónica y
carcinogénesis
Ensayo de toxicidad para la reproducción en
una generación
Ensayo de toxicidad para la reproducción en
dos generaciones
Toxicocinética
Neurotoxicidad retardada de sustancias
organofosforadas por administración única
Neurotoxicidad retardada de sustancias
organofosforadas. Estudio por administración
continuada de 28 días
220.
ENSAYOS DE
MUTAGENICIDAD.
Entre las sustancias con efecto tóxico merecen ser
destacadas aquéllas que por su estructura son
capaces de interaccionar con los ácidos nucleicos,
presentando una posible actividad mutagénica y/o
carcinogénica.
La toxicidad que afecta al material genético y que
manifiesta una expresión retardada en el tiempo se
denomina genotoxicidad.
Algunas sustancias genotóxicas son mutágenos, es
decir, son sustancias capaces de incrementar la tasa
de mutación; algunas otras son carcinógenos,
capaces de incrementar la tasa de aparición de un
tumor. Se ha demostrado experimentalmente que
existe una correlación positiva entre agentes
genotóxicos y carcinogénicos.
No todos los agentes que contribuyen al desarrollo
de cánceres humanos son genotóxicos. Un posible
mecanismo de acción para estos carcinógenos no
genotóxicos consiste en su capacidad de interferir
con los mecanismos de reparación del DNA o de
incrementar la respuesta mutagénica a otros
agentes, motivo por el cual se les suele designar
con el término de comutágenos.
Muchas de estas sustancias pueden alcanzar el
medio ambiente, fundamentalmente el acuático, y
producir efectos directos o indirectos sobre el
hombre y los animales, incluso a bajas
concentraciones. Esto obliga a la adopción de
estrictas medidas de control, siendo imprescindible
la realización de pruebas de determinación de
genotoxicidad,
mutagenicidad
y/o
carcinogenicidad de todas las sustancias químicas
de uso frecuente, así como de mezclas complejas
debidas a actividad humana presentes en el medio
ambiente.
Los estudios epidemiológicos han servido para
determinar agentes específicos asociados con una
determinada ocupación laboral y el riesgo de
desarrollar algunos tipos de cáncer. No obstante,
estos métodos de detección de sustancias
184
Ensayos Biotecnológicos
genotóxicas
presentan
también
numerosas
desventajas debidas principalmente a su naturaleza
de investigación no experimental.
Entre los marcadores biológicos estudiados se
encuentran las aberraciones cromosómicas, el
intercambio de cromátidas hermanas y los
micronúcleos en células somáticas.
Son también numerosos los ensayos que emplean a
diversos organismos como elementos de
investigación para determinar el potencial
genotóxico de una sustancia química o muestra
ambiental.
Entre los ensayos de genotoxicidad con
organismos superiores cabe citar el ensayo de
intercambio de cromátidas hermanas en peces o el
ensayo de determinación de micronúcleos en los
linfocitos periféricos de larvas de anfibios de los
géneros Pleurodeles o Xenopu.
También, un vegetal tan trivial como la cebolla
(Allium cepa), ha sido empleado en un ensayo de
determinación de la genotoxicidad en el que se
investigan parámetros citológicos como el índice
mitótico, aberraciones cromosómicas, aneuploidía
y c-mitosis.
Los ensayos con células de mamíferos, roedores
fundamentalmente, son asimismo muy útiles en la
predicción de mutagénesis celular.
El ser humano o al menos alguno de sus
componentes también han sido empleados en
ensayos de este tipo.
La gran variedad de ensayos de determinación de
la genotoxicidad indica la importancia que se le
está dando actualmente a las sustancias
genotóxicas. Pero según Heinrich V. Malling:
“Puedo recordar la excitación que me causó hace
años saber que algunas sustancias químicas a las
que se encuentra expuesto el hombre eran
mutagénicas. Hoy en día sabemos que el humo de
los cigarrillos, la comida cocinada, el café, las
drogas, los tintes del pelo y muchas otras
sustancias, contienen mutágenos. Pero, ¿es acaso
esta situación peor que la que existía cuando
vivíamos en cavernas, inhalando el humo de los
fuegos y comíamos granos mohosos?”
221.
TIPOS DE ENSAYOS.
Frente a estos clásicos ensayos de determinación
de toxicidad a nivel genético, la tendencia actual es
el empleo de ensayos a corto plazo que permiten la
obtención de resultados en intervalos de tiempo
relativamente cortos. A la rapidez hay que sumarle
las ventajas de la economía y la de emplear
grandes poblaciones en los ensayos. La mayoría de
estos ensayos utilizan como elementos de
experimentación a microorganismos, sobre todo
bacterias, o a cultivos celulares.
Salvador Camacho Garrido
Entre tales ensayos se pueden distinguir las
siguientes categorías:
• Ensayos de mutagenicidad directa.
Tales ensayos están basados en la selección de
mutaciones directas en varios loci génicos. Estos
ensayos conllevan la pérdida de una función o
estructura de la cepa salvaje, tal como el ensayo en
Salmonella typhimurium. La cepa empleada en el
ensayo, S. typhimurium SV3 presenta una
mutación en el gen araD que la hace incapaz de
convertir a la L-ribulosa-5-fosfato a D-xilulosa-5fosfato, en la ruta metabólica de la arabinosa. La
acumulación
de
L-ribulosa-5-fosfato,
un
intermediario tóxico, ocasiona la muerte celular.
Por consiguiente, la cepa SV3 es sensible a la Larabinosa. Las células se convierten en resistentes
debido a la producción de mutaciones directas en
al menos uno de los tres loci genéticos situados
antes del gen araD en el operón de la arabinosa.
• Ensayos de reversión o retromutación.
En ellos se evalúa la producción de mutaciones
inversas que suprimen el efecto de una mutación
original sobre un rasgo fenotípico claramente
observable. Sin duda alguna, el ensayo más
conocido y empleado de este tipo es el de reversión
de la auxotrofia para histidina de cepas de S.
typhimurium, mejor conocido por el nombre de test
de Ames. Si las cepas de S. typhimurium
auxotrofas para histidina son expuestas a
sustancias mutagénicas, se producirá una reversión
a la prototrofia de las mismas, que puede ser
evaluada mediante recuento en un medio mínimo
carente de histidina. Con objeto de simular la
posible incidencia de estas sustancias en
mamíferos y, por consiguiente, en seres humanos,
suele incluirse en el ensayo el empleo de la
fracción microsomal (S9) de hígado de rata o
humano.
• Ensayos de genotoxicidad basados en el
sistema SOS de reparación de daños
genéticos.
La expresión de un gen del sistema SOS puede ser
medida directamente por medio de su fusión con el
gen lacZ, el gen estructural de la ß-galactosidasa
en Escherichia coli. En el ensayo SOS Chromotest,
las cepas de E. coli se mezclan con las sustancias a
ensayar, determinándose tras un periodo de
incubación de 2 horas los niveles de ßgalactosidasa. Cuando tales sustancias son
genotóxicas ocasionan un aumento en los niveles
de ß-galactosidasa respecto a los controles, pues se
inducen los genes de mecanismo SOS.
222.
TEST DE AMES.
El test de Ames es un ensayo biológico para
evaluar el potencial mutagénico de compuestos
185
Ensayos Biotecnológicos
químicos. Como el cáncer está vinculado a menudo
con el daño de el ADN, la prueba también sirve
como un ensayo rápido para estimar el potencial
cancerígeno de un compuesto, ya que las pruebas
estándar para la carcinogenicidad hecha sobre
roedores necesitan años para completarse y son
caras de hacer.
Principio de la prueba
La prueba utiliza cepas de Salmonella
typhimurium, construidas por ingeniería genética,
capaces de detectar compuestos que causan
mutaciones génicas por dislocamiento del cuadro
de lectura (frameshift) o por sustitución de pares de
bases del ADN. Para la detección de substancias
promutagénicas, se incluye el ensayo de fracción
microsomal de hígado de rata, un sistema de
activación metabólica, que permite la evaluación
de metabolitos de la muestra problema.
Procedimiento general
La prueba utiliza varias cepas de la bacteria
Salmonella typhimurium que llevan mutaciones en
genes implicados en la síntesis de histidina, por lo
que requieren histidina para el crecimiento. La
variable está poniendo a prueba la capacidad del
mutágeno para provocar un retorno al crecimiento
en un soporte libre de histidina. Las cepas del
probador están especialmente construidas para
tener una mutación con cambio puntual en los
genes necesarios para sintetizar histidina, que
permite la detección de mutágenos que actúan a
través de diferentes mecanismos. Algunos
compuestos son muy específicos, causando
reversiones en sólo una o dos cepas.
El probador de cepas también lleva mutaciones en
los genes responsables de la síntesis del
lipopolisacárido, haciendo que la pared celular de
las bacterias sea más permeable, y en la supresión
reparan el sistema para hacer la prueba más
sensible.
Se añade extracto de hígado de rata para simular el
efecto del metabolismo, ya que algunos
compuestos, como el benzopireno, no son
mutagénicas, pero sí los son sus productos
metabólicos.
Las bacterias se extienden sobre una placa de agar
con una pequeña cantidad de histidina. Esta
pequeña cantidad de histidina en el medio de
cultivo permite a las bacterias crecer por un tiempo
inicial y tener la oportunidad de mutar. Cuando la
histidina se agota sólo las bacterias que han
mutado para obtener la capacidad de producir su
propia histidina van a sobrevivir. La placa se
incuba posteriormente durante 48 horas.
La mutagenicidad de una sustancia es proporcional
Salvador Camacho Garrido
al número de colonias observadas.
Problemas
Como la Salmonella es una célula procariota, no es
un modelo perfecto para los seres humanos. Un
modelo adaptado in vitro se ha hecho con las
células de eucariota, por ejemplo de levadura.
Modificaciones
Diferentes cepas de S. typhimurium auxotróficas a
histidina son expuestas a una muestra con y sin
activación metabólica y plaqueadas en agar medio
mínimo con histidina/biotina. Dada la composición
del medio de cultivo, se forman colonias con las
células prototróficas a histidina (his-), procedentes
de mutaciones espontáneas u originadas de
mutaciones provocadas por la muestra problema.
Después de 66 horas de incubación a 37°C, las
colonias revertantes son contadas.
El valor igual o mayor a dos, de la expresión
obtenida de dividir el número de revertantes en las
placas de prueba entre el número de revertantes de
las placas control, indica la presencia de actividad
mutagénica en la muestra problema.
Otra modificación a la prueba de Ames original fue
sugerida, donde se prueba directamente la muestra
que pasa previamente por un proceso de filtración
por membrana, modificándose las concentraciones
de agar, en el agar de superficie.
El método directo, como se denomina, aumenta la
sensibilidad del ensayo, permitiendo una
concentración in situ de la muestra en alrededor de
10 a 20 veces; es decir, que la muestra problema
adicionada presenta una mayor respuesta al análisis
en función del aumento de compuestos
genotóxicos como consecuencia del proceso de
filtración de la muestra problema.
Este método también tiene la ventaja de poder ser
utilizado en muestras problema que presentan alta
viscosidad; en estos casos puede ser utilizada la
técnica de pre-incubación.
La prueba de Ames método directo se utiliza en la
evaluación de mutagenicidad de muestras
problema (agua, aire, lixiviados de residuos
sólidos, extractos acuosos, etc.). Asimismo, es
considerada parte esencial de las pruebas
toxicológicas para la detección y localización de
fuentes que generen un daño potencial por la
presencia de compuestos genotóxicos.
Método directo.
El método de la prueba de Ames modificado es el
método directo, el cual se realiza como se describe
a continuación:
1. Antes de iniciar cualquier operación,
desinfectar la campana de flujo laminar,
186
Ensayos Biotecnológicos
usando alcohol al 70%. Trabajar siempre en
campana de flujo laminar.
2. Colocar los tubos de ensayo (13x100 mm, con
tapa de polipropileno), en un número suficiente
para realizar las pruebas por triplicado, en
baño seco regulando la temperatura a 48 ± 2
°C.
3. Fundir el agar de superficie de varias
concentraciones (tabla 21.5) y estabilizar a 48
± 2 °C.
4. Adicionar a cada tubo de ensayo estéril (por
triplicado): 0.1, 0.5, 1.0, 1.5., 2.0 mL de la
muestra directa, 0.1 mL de cultivo (de una
noche) de S. typhimuirum y 0.5 mL de mezcla
S9 (solamente para la prueba con activación
metabólica).
5. Incubar con agitación suave durante 30
minutos a 37 °C para realizar el proceso de
pre-incubación.
6. Posteriormente, adicionar el volumen de agar
de superficie de acuerdo con los volúmenes
descritos en la tabla 21.5.
7. Agitar cada tubo levemente por 3 segundos
con ayuda de un vórtex a baja velocidad y
verter su contenido en cada placa de agar
medio mínimo.
8. Inmediatamente
realizar
movimientos
circulares a la placa, de forma que el agar de
superficie se distribuya uniformemente sobre
el medio de cultivo.
9. Dejar que se solidifique en una superficie
plana.
10. Incubar las placas en forma invertida a 37 ± 2
°C por 66 horas.
Método para extractos
El método para extractos emplea la prueba de
Ames, y se realiza como se describe a
continuación:
1. Adicionar 10, 25, 50 y 100 μL del extracto,
cuyo disolvente es dimetilsulfoxido, a cada
tubo de ensayo estéril, por triplicado.
2. Ajustar cada volumen a 100 μL con
dimetilsulfoxido.
3. Adicionar 0,1 mL de cultivo (de una noche) de
S. typhimuirum.
4. Adicionar 0,5 mL de mezcla S9 (solamente
Salvador Camacho Garrido
para la prueba con activación metabólica).
5. Incubar con agitación suave durante 30
minutos a 37 °C para realizar el proceso de
pre-incubación.
6. Posteriormente, adicionar el volumen de agar
de superficie de concentración 1X para todos
los volúmenes, descrito en la tabla 21.5.
7. Agitar cada tubo levemente por 3 segundos
con ayuda de un vórtex a baja velocidad y
verter su contenido en cada placa de agar
medio mínimo.
8. Inmediatamente
realizar
movimientos
circulares a la placa, de forma que el agar de
superficie se distribuya uniformemente sobre
el medio de cultivo.
9. Dejar que se solidifique en una superficie
plana.
10. Incubar las placas en forma invertida a 37 ± 2
°C por 66 horas.
11. Realizar los controles negativos y positivos
(utilizarlos de acuerdo con las cepas que se
emplearán en el experimento). Para ambos
casos se emplea agar de superficie de
concentración 1,0X.
12. A los controles negativos únicamente se les
adiciona 0,1 mL de cultivo bacteriano de una
noche y 0, 5 mL de la mezcla S9, mientras que
para los controles positivos debe adicionarse el
volumen adecuado del control específico, 0,1
mL de cultivo bacteriano de una noche y 0,5
mL de la mezcla S9 (cuando sea con activación
metabólica).
13. Incubar en placas en forma invertida a 37 ± 2
°C por 66 horas.
Conteo
Para el conteo se usa un contador semiautomático
tipo Quebec o un estereoscopio. El uso de uno u
otro dependerá del tamaño de las colonias. Los
valores obtenidos son anotados en el formato que
se use en el procedimiento.
187
Ensayos Biotecnológicos
Cabe mencionar que la morfología de las colonias
de S. typhimurium es muy característica: son
blancas, translúcidas, con superficie lisa y bordes
regulares.
La presencia de colonias con morfología diferente
indica contaminación, por lo que la placa debe ser
desechada.
Durante el conteo de las colonias revertantes en las
placas se verifica la presencia del “fondo de la
placa” en las placas control negativo y la
frecuencia de reversión espontánea, así como la
eficiencia del control positivo.
El ensayo deberá repetirse si el “fondo de la placa”
está ausente o alterado.
La ausencia indica que la concentración de la
muestra es sumamente tóxica o si la tasa de
reversión espontánea estuviera fuera de lo esperado
o si los controles positivos no tuvieran actividad
mutagénica frente a las cepas de prueba.
Salvador Camacho Garrido
188
Ensayos Biotecnológicos
ESQUEMA DEL TETS DE AMES
Salvador Camacho Garrido
189
Ensayos Biotecnológicos
ÍNDICE
1.
BIOTECNOLOGÍA.
1
2.
VENTAJAS Y RIESGOS.
1
3.
BIOÉTICA.
2
4.
EL LABORATORIO BIOTECNOLÓGICO.
3
5.
LABORATORIO BÁSICO.
4
6.
NIVELES DE SEGURIDAD.
5
7.
MATERIAL Y APARATOS.
5
8.
REACTIVOS.
5
9.
PREPARACIÓN DE MEDIOS.
5
10.
TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN.
6
11.
CULTIVOS PUROS.
6
12.
MANTENIMIENTO DE CULTIVOS MICROBIANOS.
7
13.
TÉCNICAS DE MANTENIMIENTO
7
14.
MICROORGANISMOS IMPLICADOS.
8
15.
CULTIVOS CELULARES.
8
16.
MEDIOS DE CULTIVO CELULARES.
9
17.
MANTENIMIENTO DE CULTIVOS CELULARES.
10
18.
BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO.
10
19.
TOMA DE MUESTRAS.
11
20.
PREVENCIÓN DE RIESGOS.
13
21.
RIESGOS BIOLÓGICOS.
13
22.
AGENTES BIOLÓGICOS. CLASIFICACIÓN.
14
23.
NORMAS DE ASEPSIA Y SEGURIDAD.
14
Salvador Camacho Garrido
191
Ensayos Biotecnológicos
24.
VÍAS DE INFECCIÓN.
15
25.
HIGIENE EN EL TRABAJO DEL LABORATORIO BIOLÓGICO.
15
26.
LIMPIEZA Y ELIMINACIÓN DEL MATERIAL.
16
27.
RESIDUOS INFECCIOSOS.
16
28.
TRATAMIENTO DE RESIDUOS INFECCIOSOS.
16
29.
EQUIPOS DE PROTECCIÓN EN EL LABORATORIO.
17
30.
EQUIPOS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL.
17
31.
EL TRABAJO EN EL LABORATORIO.
18
32.
CUMPLIMIENTO DE NORMAS DE CALIDAD, SALUD LABORAL Y PROTECCIÓN
AMBIENTAL.
19
33.
LEGISLACIÓN.
20
34.
CONCEPTO DE PROTEÍNA.
21
35.
CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS.
21
36.
FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS.
21
37.
AMINOÁCIDOS.
21
38.
FUNCIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS.
22
39.
CLASIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS.
23
40.
PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS.
23
41.
CTURA DE LAS PROTEÍNAS.
24
42.
PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS.
26
43.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS.
27
44.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS.
28
45.
TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN.
28
46.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.
28
47.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR.
28
Salvador Camacho Garrido
192
Ensayos Biotecnológicos
48.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.
29
49.
CROMATOGRAFÍA HIDROFÓBICA.
29
50.
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.
29
51.
CROMATOGRAFÍA HPLC.
29
52.
MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS.
30
53.
PRINCIPIOS BÁSICOS.
30
54.
TÉCNICAS.
31
55.
ELECTROFORESIS CAPILAR.
32
56.
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS.
32
57.
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (PAGE).
33
58.
ISOELECTROENFOQUE.
34
59.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL.
34
35
60.
ELECTROFORESIS EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES.
35
61.
TINCIÓN.
36
62.
TRANSFERENCIA.
37
63.
ULTRACENTRIFUGACIÓN.
38
64.
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS.
40
65.
DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL.
41
66.
CUANTIFICACIÓN.
44
67.
LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
47
Salvador Camacho Garrido
193
Ensayos Biotecnológicos
68.
BASES NITROGENADAS.
47
69.
AZÚCARES.
47
70.
NUCLEÓSIDOS.
47
71.
NUCLEÓTIDOS.
47
72.
FUNCIONES DE LOS NUCLEÓTIDOS.
48
73.
POLINUCLEÓTIDOS.
48
74.
ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
48
75.
BASES MODIFICADAS.
50
76.
ÁCIDOS NUCLEICOS VÍRICOS.
50
77.
PLÁSMIDOS.
51
78.
PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
52
79.
PROPORCIÓN DE BASES NITROGENADAS.
52
80.
DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
52
81.
DESNATURALIZACIÓN: TEMPERATURA DE FUSIÓN.
52
82.
ABSORBANCIA A 260 NM.
53
83.
CINÉTICA DE RENATURALIZACIÓN: CURVAS COT.
53
84.
HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
54
85.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
55
86.
OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
56
87.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
58
88.
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
59
89.
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE.
62
90.
CROMATOGRAFÍA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
63
91.
DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
65
92.
TRANSFERENCIA A MEMBRANAS.
Salvador Camacho Garrido
66
194
Ensayos Biotecnológicos
93.
SECUENCIACIÓN DE ADN.
67
94.
ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL.
69
95.
ALTERNATIVAS AL MODELO DE LA DOBLE HÉLICE.
71
96.
CUANTIFICACIÓN.
73
97.
CONCEPTO DE GEN.
75
98.
CROMOSOMAS.
75
99.
EL CÓDIGO GENÉTICO.
76
100.
LA INFORMACIÓN GENÉTICA.
77
101.
DUPLICACIÓN DE ADN.
77
102.
DUPLICACIÓN EN PROCARIONTES.
78
103.
DUPLICACIÓN EN EUCARIONTES.
79
104.
TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIONTES.
79
105.
TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIONTES.
80
106.
TRADUCCIÓN.
80
107.
CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.
81
108.
TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.
83
109.
INMUNOLOCALIZACIÓN.
83
110.
HIBRIDACIÓN “IN SITU”.
84
111.
¿UN GEN UNA PROTEÍNA?
84
112.
TEORÍA DEL OPERÓN.
85
113.
TRANSGENES.
85
114.
GENES ANTISENTIDO.
85
115.
SILENCIAMIENTO GÉNICO.
86
116.
OTROS CONCEPTOS.
86
117.
INGENIERIA GENÉTICA.
Salvador Camacho Garrido
89
195
Ensayos Biotecnológicos
118.
AISLAMIENTO DEL ADN FORÁNEO.
89
119.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN.
89
120.
VECTORES DE CLONACIÓN.
90
121.
UNIÓN ADN-VECTOR DE CLONACIÓN.
92
122.
INTRODUCCIÓN DEL VECTOR/ADN.
93
123.
MÉTODOS DE SELECCIÓN.
94
124.
OBTENCIÓN DE GENOTECAS.
96
125.
IDENTIFICACIÓN DEL CLON DESEADO. SONDAS MOLECULARES.
97
126.
SONDAS DE ADN.
98
127.
SONDAS DE ARN.
99
128.
CHIP DE ADN.
99
129.
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION).
101
130.
TERMOCICLADOR.
102
131.
REACTIVOS.
102
132.
CICLO DE AMPLIFICACIÓN.
102
133.
VERIFICACIÓN Y OPTIMIZACIÓN.
104
134.
TIPOS DE PCR.
104
135.
PCR A TIEMPO REAL.
106
136.
PCR AUTOMATIZADA EN TIEMPO REAL.
107
137.
APLICACIONES DE LA PCR.
108
138.
MARCADORES MOLECULARES.
110
139.
BIOINFORMÁTICA.
113
140.
PRINCIPALES ÁREAS DE INVESTIGACIÓN.
113
141.
HERRAMIENTAS.
117
142.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE.
119
196
Salvador Camacho Garrido
Ensayos Biotecnológicos
143.
APLICACIONES.
119
144.
CLASIFICACIÓN DE LAS APLICACIONES.
120
145.
BIOTECNOLOGÍA ROJA.
120
146.
BIOTECNOLOGÍA BLANCA.
121
147.
BIOTECNOLOGÍA VERDE.
122
148.
ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE.
123
149.
TIPOS DE OMG.
124
150.
BIOTECNOLOGÍA AZUL.
125
151.
BIOTECNOLOGÍA GRIS.
127
152.
FERMENTACIÓN.
129
153.
RUTAS FERMENTATIVAS.
129
154.
FERMENTACIONES INDUSTRIALES.
131
155.
BIORREFINERIAS.
132
156.
APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN DE ADN.
132
157.
BIOSENSORES.
134
158.
DOGMAS Y PARADIGMAS NUEVOS.
135
159.
NUEVAS TENDENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA.
136
160.
PROTEÓMICA.
139
161.
ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
139
162.
IDENTIFICACIÓN POR HUELLA PEPTÍDICA.
140
163.
MALDI-TOF.
140
164.
OTRAS TÉCNICAS.
141
165.
TIPADO MOLECULAR DE MICRORGANISMOS.
142
166.
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS.
142
167.
EL SISTEMA INMUNITARIO.
143
197
Salvador Camacho Garrido
Ensayos Biotecnológicos
168.
ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS.
143
169.
EL SISTEMA LINFOIDE.
144
170.
LAS CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO.
145
171.
ENSAYOS INMUNOLÓGICOS.
146
172.
TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN GEL.
147
173.
TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN DISOLUCIÓN.
149
174.
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN.
150
175.
TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA.
152
176.
TÉCNICAS DE RADIOINMUNOENSAYO.
153
177.
TÉCNICAS DE ENZIMOINMUNOENSAYO.
154
178.
ELISA.
156
179.
OTRAS TÉCNICAS.
159
180.
ENSAYOS DE TIPO GENÉTICO.
160
181.
SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
161
182.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.
161
183.
PF.
162
184.
REAP.
163
185.
AFLP.
163
186.
PFGE.
163
187.
PCR.
164
188.
AP-PCR.
165
189.
OTRAS TÉCNICAS BASADAS EN PCR.
165
190.
KITS COMERCIALES.
166
191.
TOXINAS.
169
192.
TIPOS DE TOXINAS.
169
198
Salvador Camacho Garrido
Ensayos Biotecnológicos
193.
TOXINAS VEGETALES.
169
194.
TOXINAS ANIMALES.
170
195.
TOXINAS MARINAS.
171
196.
TOXINAS MICROBIANAS.
171
197.
TOXINAS EN LOS ALIMENTOS.
171
198.
TÓXICOS.
172
199.
CLASIFICACIÓN DE LOS TÓXICOS.
172
200.
MUTACIONES.
173
201.
TIPOS DE MUTACIONES.
173
202.
MUTACIONES SEGÚN SU CONSECUENCIA.
173
203.
TIPOS DE MUTACIONES SEGÚN MECANISMO CAUSAL.
174
204.
MUTACIÓN GÉNICA.
174
205.
MUTACIÓN CROMOSÓMICA.
175
206.
MUTACIÓN GENÓMICA.
176
207.
CAUSAS DE LAS MUTACIONES.
176
208.
ERRORES DE REPLICACIÓN.
177
209.
CAMBIOS QUÍMICOS ESPONTÁNEOS.
177
210.
ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES.
178
211.
REVERSIÓN Y SUPRESIÓN DE MUTACIONES.
179
212.
OTROS CONCEPTOS.
179
213.
EFECTOS DE LAS MUTACIONES.
180
214.
ENSAYOS DE TOXICIDAD.
181
215.
EFECTOS DEL TÓXICO EN LAS PRUEBAS.
182
216.
ESPECIES IMPLICADAS.
182
217.
ÍNDICES DE TOXICIDAD.
182
199
Salvador Camacho Garrido
Ensayos Biotecnológicos
218.
PROTECCIÓN DE LA TOXICIDAD.
183
219.
CLASIFICACIÓN DE LOS ENSAYOS DE TOXICIDAD.
183
220.
ENSAYOS DE MUTAGENICIDAD.
184
221.
TIPOS DE ENSAYOS.
185
222.
TEST DE AMES.
185
Salvador Camacho Garrido
200