AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS PATÓGENOS PRESENTES EN LULO, TOMATE DE ÁRBOL Y MORA DE CASTILLA POTENCIALMENTE PATÓGENOS PARA LOS CULTIVOS DE GULUPA (Pasiflora edulis var. edulis sims.) JESENIA MOLINA ROA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito para optar el titulo de MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA BOGOTA 2010 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS PATÓGENOS PRESENTES EN LULO, TOMATE DE ÁRBOL Y MORA DE CASTILLA POTENCIALMENTE PATÓGENOS PARA LOS CULTIVOS DE GULUPA (Pasiflora edulis var. edulis sims.) JESENIA MOLINA ROA APROBADO ________________________________ ____________________________ Ingrid Schuler Ph.D. Decana Académica Janeth Arias M.Sc, M.Ed. Directora de Carrera AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS PATÓGENOS PRESENTES EN LULO, TOMATE DE ÁRBOL Y MORA DE CASTILLA POTENCIALMENTE PATÓGENOS PARA LOS CULTIVOS DE GULUPA (Pasiflora edulis var. edulis sims.) JESENIA MOLINA ROA APROBADO ______________________________________ Ma. Clemencia De La Rotta M.Sc. Directora ________________________ Luis David Gómez MS.c Jurado NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946. “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. AGRADECIMIENTOS A María Clemencia de la Rotta por darme la oportunidad de vincularme al proyecto “Fortalecimiento de la cadena productiva de la gulupa”, y por su gran interés y apoyo durante el desarrollo de este trabajo de grado. A Viviana Pinzón en UMATAS de Venecia. A Jairo Garzón en Vivero Semigar y al Ingeniero Agrónomo Miguel Ángel Choconta en Granada. Al Laboratorio de Fitopatología Universidad Nacional instalaciones. por prestar sus RESUMEN La gulupa (Pasiflora edulis var. edulis sims), es una de las frutas con mayor proyección internacional, exportando más de 700.000 kilos por año, ocupando el cuarto lugar en las exportaciones de frutales después de banano, plátano, bananito y uchuva (Pinzón et al 2007). En Colombia los cultivos de gulupa se encuentran ubicados entre los 1800 y 2400 m.s.n.m., con temperaturas entre 16 y 24ºC, al igual que otra variedad de cultivos, que algunos investigadores han denominado como “cultivos de clima frio moderado” donde se encuentran especies como el lulo (Solanum quitoense Lam), tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt) y mora de castilla (Rubus glaucus Benth). La expansión de este tipo de cultivos favorece la aparición de enfermedades que deterioran la calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos de los cultivos, ya que son fuente permanente de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan. Existen varios géneros de hongos asociados como causantes de enfermedades de origen fungoso en estos cultivos, como Alternaría, Botrytis, Cladosporium spp, y las especies del genero Colletotrichum, gloeosporioides y acutatum, y se espera que puedan tener un posible patio de infección sobre los cultivos de gulupa. De esta manera, en este trabajo se pretende evaluar el efecto de los principales agentes causales de enfermedades en mora de Castilla, tomate de árbol y lulo sobre frutos de gulupa, a través de pruebas de patogenicidad cruzada in vitro. Para este fin, la recolección de muestras se realizó en zonas productoras de estos frutales en el departamento de Cundinamarca. La patogenicidad de los aislamientos se evaluó en cámaras húmedas, inoculando bloques de agar de 5x5 mm con el crecimiento del microorganismo, extraídos de colonias de 15 días de incubación, sobre frutos verdes de gulupa de diferentes tamaños con y sin heridas. Estas cámaras se revisaron diariamente por un periodo de tiempo de 15 días, para determinar la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad. Finalmente, se demostró el potencial de infección cruzada entre los asilamientos (Cladosporium sp, Alternaría sp, Colletotrichum sp.) de clima frio moderado sobre frutos de gulupa, resultados que deben ser tenidos en cuenta dentro del manejo integrado de enfermedades en las especies cultivadas en agroecosistemas similares a los de mora de castilla, tomate de árbol y lulo. Palabras claves: Patogenicidad cruzada in vitro, gulupa, frutales de clima frio moderado. ABSTRACT Gulupa (Passiflora edulis var. Edulis sims), is a fruit with more international, exporting more than 700,000 kilos per year, ranking fourth in exports of fruit after bananas, baby bananas and cape gooseberry (Pinzón et al 2007). In Colombia, crops gulupa are located between 1800 and 2400 meters, with temperatures between 16 and 24 º C, as well as a variety of other crops, which some researchers have called " moderately cold weather crops " which are species like Lulo (Solanum quitoense Lam), tree tomato (Solanum betaceum Sendt cav) and blackberry (Rubus glaucus Benth.) The expansion of such crops encouraged the emergence of diseases that impair the quality of fruits and / or lower crop yields because they are permanent potential inoculum in the ecosystems where they are grown. There are several kinds of fungi to cause diseases related to fungus in these crops, such as Alternaria, Botrytis, Cladosporium spp, and species of the genus Colletotrichum gloeosporioides and acutatum, and is expected to have a possible infection yard on crops of gulupa. Thus, in this work was to evaluate the effect of the causal agents of diseases in blackberry, tree tomato and lulo on gulupa fruits, through cross pathogenicity tests in vitro For this purpose, the collection of samples was carried out in these fruit-producing areas in Cundinamarca. The pathogenicity of the isolates was evaluated in moist chambers, inoculated agar blocks of 5x5 mm with the growth of microorganism colonies taken from 15 days of incubation, on gulupa green fruits of different sizes with and without injuries. These cameras were checked daily for a period of 15 days, to determine the onset of disease symptoms. Finally, we demonstrated the potential of cross infection among the isolates (Cladosporium sp, Alternaria sp, Colletotrichum sp.) moderately cold weather crops on gulupa fruits. Results should be taken into account in the integrated management of diseases in cultivated species in agroecosystems similar to blackberry, tree tomato and lulo. Key words: cross pathogenicity tests in vitro, gulupa ,moderately cold weather fruits. TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 8 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 10 3. MARCO TEORICO 11 3.1 Generalidades del cultivo 11 3.2 Etiología de las principales enfermedades 12 4. OBJETIVOS 14 5. METODOLOGIA 15 5.1 Localización 15 5.2 Tipo de estudio 15 5.3 Aislamientos 16 5.4 Pruebas de patogenicidad cruzada 16 5.5 Caracterización de los aislamientos 18 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 19 6.1 Descripción de los síntomas 19 6.2 Identificación y caracterización 21 6.3 Pruebas de Patogenicidad Cruzada 26 6.4 Reaislamientos 34 7. CONCLUSIONES 35 8. RECOMENDACIONES 36 9. BIBLIOGRAFIA 37 10. ANEXOS 41 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Lulo Figura 2. Tomate de Árbol Figura 3. Síntomas de antracnosis en tallos de mora Figura 4. Aislamientos de lulo en PDA. Fig. 5. Conidias típicas del genero Cladosporium sp. Figura 6. Aislamientos de tomate de árbol en PDA Fig. 7. Conidias típicas del género Alternaria sp. Figura 8. Aislamientos de tallos de mora en PDA. Fig. 9. Forma de las conidias de Colletotrichum provenientes de de tallos de mora. Fig. 10. Pruebas de la inoculación de Botrytis aislado de Lulo. Figura 11. Lesiones de Cladosporium sp. aislado de lulo sobre frutos de gulupa Figura 12. Lesiones de Alternaria sp. proveniente de tallos y frutos de Tomate de Árbol sobre frutos de gulupa. Figura 13. Lesiones de Colletotrichum acutatum en gulupa aislados de tomate de árbol Figura 14. Frutos de gulupa inoculados con Colletotrichum gloeosporioides aislados de tallos de mora. acutatum y C. LISTA DE TABLAS Tabla 1. Codificación de tamaño de los frutos de gulupa. Tabla 2. Codificación de los aislamientos usados en las pruebas de inoculación cruzada. Tabla 3. Resultados obtenidos de las inoculaciones realizadas con heridas en la superficie de los frutos de gulupa y sin heridas. LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Reaislamiento de los patógenos a partir de los frutos de gulupa con síntomas INTRODUCCIÓN En Colombia, la producción frutícola es importante comercialmente por el gran potencial que tiene tanto a nivel nacional como internacional. Las frutas ocupan los renglones de exportación más altos, siendo, después del café y las flores los productos agrícolas de mayor exportación (Pinzón, 2007). En 2006 se exportaron 37,6 millones de dólares en frutas exóticas, de los cuales 4,5 correspondieron a pasifloráceas, y dentro de este grupo, 1,9 a granadilla y 1,7 a gulupa, con una participación del 40%, superada sólo por la granadilla que representó el 50% (Güiza, 2009). En el país, el área sembrada de gulupa para el año 2006 fue de 700 ha aproximadamente (SCCH, 2007), pero el área de cultivo registrada en el ICA con fines de exportación, solamente fue de 86,8 Ha; su producción se encuentra distribuida en los municipios de Cundinamarca, Tolima, Boyacá y Quindío, siendo la zona de Sumapaz la que tiene mayor participación en la producción, en esta región del departamento de Cundinamarca se reporta una producción de 6620 toneladas anuales aproximadamente. La gulupa (Passiflora edulis f. edulis), pertenece al Orden Parietales, Familia Passifloraceae, en la que también se incluyen especies como maracuyá (Passiflora edulis var. flavicarpa), la curuba (Passiflora mollísima), la badea (Passiflora quadrangularis) y la granadilla (Passiflora ligularis). Al parecer son nativas del sur de Perú y los Andes desde Venezuela hasta Chile; en otras apreciaciones, tanto el maracuyá como la gulupa serian originarias del Brasil donde esta última es referenciada como forma púrpura del maracuyá que aun se encuentra en estado silvestre, aunque las divergencias ecológicas y reproductivas entre ellas dejan dudas sobre su origen común y hasta sobre su pertenencia a una misma especie (Quintero, 2008). Para el desarrollo de cultivos de gulupa, se han asumido prácticas y manejos asociados con maracuyá, los cuales evidentemente no satisfacen los requerimientos necesarios para su cultivo, debido a las diferencias marcadas entre las dos formas de P. edulis. La producción se lleva a cabo de manera empírica con base en la tecnología y experiencias de los productores que se tiene acerca sobre los sistemas de producción en maracuyá, granadilla y curuba, sin embargo la información respecto al 8 cultivo y los principales factores que afectan el mismo, es prácticamente nula (Jiménez, 2006). Las características agroecológicas de los cultivos que se encuentran alrededor de la gulupa, que algunos investigadores han denominado como “cultivos de clima frio moderado” permiten la expansión de especies como el lulo (Solanum quitoense Lam), tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt) y mora de castilla (Rubus glaucus Benth), en los cuales también se presentan varias enfermedades que deterioran la calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos, y potencialmente pueden ser nocivas para los cultivos de gulupa, dado que se convierten en fuentes permanentes de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan. Existen varios géneros de hongos asociados como causantes de enfermedades de origen fungoso en estos cultivos, como Alternaría, Botritys, Cladosporium spp, y las especies del genero Colletotrichum, gloeosporioides y acutatum, y se espera que puedan tener un posible patio de infección sobre los cultivos de gulupa. De esta manera, en este trabajo se pretende evaluar el efecto de los principales agentes causales de enfermedades en mora de Castilla, tomate de árbol y lulo sobre frutos de gulupa, a través de pruebas de patogenicidad cruzada, y, contribuir a que los productores implementen un manejo adecuado de los cultivos, con el conocimiento adquirido sobre el rango de hospederos que tiene los agentes, que ocasionan enfermedades en los cultivos agroecológicamente similares a los de la gulupa. Dadas las circunstancias, esta investigación fue formulada dentro del proyecto titulado: “Fortalecimiento de la cadena productiva de la gulupa (Passiflora spp) mediante el Manejo Integrado de Problemas Fitosanitarios en pre y Poscosecha”, que cuenta con financiación del Ministerio de Agricultura, y es ejecutado por estudiantes de la Pontificia Universidad Javeriana, de las Facultades de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia y de Cundinamarca. 9 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La gulupa es una de las frutas con mayor proyección internacional, pues ha tenido una importante acogida en los mercados de Europa, Estados Unidos y Japón, que le ha permitido ganar posicionamiento en el mercado internacional, exportando más de 700.000 kilos por año, ocupando el cuarto lugar en las exportaciones de frutales después de banano, plátano, bananito y uchuva (Pinzón et al 2007). En Colombia, se han realizado algunos estudios en gulupa dirigidos principalmente al conocimiento del manejo de la cosecha (Pinzón, 2006) y poscosecha de frutos (Pachón 2006 citado por Herrera, 2008), así como también al conocimiento general del manejo agronómico del cultivo (Neira, 2006 citado por Herrera, 2008), sin embargo, existen varios aspectos relacionados con los problemas fitosanitarios que se desconocen, y que actualmente causan pérdidas significativas en los cultivos y constituyen una gran limitante para la exportación, teniendo en cuenta que los parámetros de calidad establecidos por los diferentes compradores en el ámbito internacional son altamente exigentes en cuanto a niveles fitosanitarios. JUSTIFICACIÓN En Colombia los cultivos de gulupa se encuentran ubicados entre los 1800 y 2400 m.s.n.m., con temperaturas entre 16 y 24ºC, al igual que otra variedad de cultivos como el lulo, tomate de árbol y mora de castilla. La expansión de este tipo de cultivos favorece la aparición de enfermedades que deterioran la calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos de los cultivos, ya que son potenciales permanente de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan. De esta manera, se hace evidente la necesidad de evaluar el efecto de los agentes patógenos que ocasionan enfermedades en los cultivos mencionados anteriormente, sobre los frutos de gulupa , lo que permitirá, estimar su impacto económico, y sustentar nuevas propuestas de manejo. De esta manera, en esta investigación se evaluará el potencial de infección cruzada entre los aislamientos de patógenos causantes de enfermedades en los cultivos aledaños sobre frutos de gulupa, con el fin de mejorar la sostenibilidad del cultivo y su proyección como cultivo de exportación. 10 3. MARCO TEORICO 3.1 Generalidades del cultivo La planta de gulupa produce anualmente un promedio de 100 kg de fruta y dependiendo de su calidad, entre el 70% y 90% de dicha producción es destinada a la exportación, razón por la cual la fruta es poco conocida a nivel nacional (Ortiz, 2008). Una planta de gulupa puede tener una vida útil de más de 4 años, sin embargo, esto está influenciado en gran parte por la calidad y la cantidad de fruta producida, y por la pérdida de plantas en el tiempo. En los últimos años, la presencia de cultivos de gulupa en el municipio de Granada, Cundinamarca ha tendido a desaparecer; una de las razones se atribuye al manejo inadecuado del cultivo, ya que no se cuenta con un paquete tecnológico que permita a los cultivadores obtener una productividad que cumpla con sus expectativas de producción y exportación; esta situación ha contribuido al manejo de cultivo con un bajo nivel técnico, que ha llevado a que se expandan las enfermedades y con ello una mayor agresividad de los patógenos, debida en parte por unas prácticas de control redundantes, basadas en productos químicos. En el municipio de Granada (Cundinamarca), los productores aseguran hacer control químico contra las principales enfermedades atribuidas en forma preliminar a los hongos de los géneros Alternaria, Fusarium, Botritys, y Cladosporium, entre otros; y a pesar de esto, muchos han perdido la batalla contra estas plagas y han preferido cambiar de actividad. Sin embargo, en algunos casos los cultivos de gulupa son rentables, si al menos se tienen en cuenta la sanidad y las prácticas agronómicas preventivas (Quintero, 2008). Con respecto a patógenos asociados a cultivos de pasifloras en Colombia, solo se cuenta con un inventario de enfermedades de especies de pasifloráceas como el Maracuyá (P.edulis f. sp. flavicarpa), la Granadilla (P. ligularis Juss) y la Curuba (P. mollissima L.) (Buriticá, 1999), pero con respecto a los patógenos de Gulupa (Passiflora edulis f. sp. edulis) no se presenta mayor información. En este inventario se reportan como agentes causales de enfermedad relacionados con estos cultivos diferentes especies de Alternaria, Cladosporium, Colletothichum y Phoma (Ascochyta); por la cercanía taxonómica entre las especies de plantas, estos patógenos se han considerado hasta hoy, como potenciales agentes causales de enfermedades de la gulupa. 11 Los cultivos de gulupa se encuentran ubicados entre los 1800 y 2400 m.s.n.m., con temperaturas entre 16 y 24ºC, ya que a alturas mayores la producción inicia entre los 12 y 18 meses y el tamaño de la fruta es menor. Se desarrolla bien en diferentes tipos de suelo, sin embargo, son más adecuados los suelos arenosos, ya que estos permiten un buen desarrollo radical. Los pH aconsejables deben estar entre 6,5 a 7,5,; es esencial que haya un buen drenaje y un bajo contenido de sales, igualmente, las plantas responden bien a contenidos altos de materia orgánica (Jiménez, 2006). 3.2 Etiología de las principales enfermedades Dentro de las principales enfermedades de origen fungoso en los cultivo de lulo, esta la Gota o tizón ocasionada por Phytophthora infestans; Moho blanco (Sclerotinia sclerotiorum); mancha clorótica (Cladosporium sp) y la antracnosis del fruto, ocasionada por Colletotrichum gloeosporioides siendo esta ultima el problema fitosanitario más limitante. Los cultivos de tomate de árbol son afectados también por antracnosis (C. gloesporoides y acutatum), moho blanco (Sclerotinia sp), añublo foliar (Botrytis sp), cenicilla (Oidium sp), mancha anillada (Phoma sp.), mancha zonada (Alternaría ) y Phytophthora, entre otros (Lozano et al, 2007; Sanabria, 2007). En mora se encuentran las siguientes plagas de origen fungoso: pudrición del fruto causada por Botrytis cinerea; antracnosis (C. gloesporoides y C. acutatum) y la marchitez por Verticillium sp. (Tamayo, 2001). En gulupa Quintero (2008), describe las siguientes enfermedades: Mancha parda (Alternaria passiflorae) Daños en el follaje y frutos afectando el ciclo productivo. En las hojas se presentan manchas de color pardo rojizo, y en condiciones de mucha humedad se presentan márgenes acuosas. Cuando las infecciones progresan, las lesiones se agrandan formando surcos concéntricos muy característicos. Los frutos presentan manchas necróticas circulares ligeramente hundidas de color pardo rojizo. Roña o costra (Cladosporium herbarum). Ataca los frutos en sus diferentes estados de desarrollo. Se caracteriza por la presencia de lesiones ulcerosas de tamaño variable y color pardo, distribuidas de manera aislada, aunque en algunos casos pueden agruparse. 12 Moho gris (Botrytis cinerea).Ataca los botones florales, las flores y en los frutos. Cuando la enfermedad se presenta en los botones florales y en los frutos se observa un moho de color café claro, que en condiciones de alta humedad relativa cubre todo el fruto. Antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides).Este hongo afecta a hojas, tallos y frutos. En las hojas los síntomas aparecen en los márgenes, y se manifiesta como manchas acuosas de forma circular de 5 mm de diámetro, presentan un halo de color verde oscuro. En hojas, tallos y frutos formación de manchas pardas que luego se necrosan. En frutos, la corteza se vuelve quebradiza. Hay formación de ulceras y chancros (Lozano et.,al 2008). Finalmente, la evaluación de enfermedades en frutos de gulupa, permitirá valorar la presencia de estos patógenos en cultivos colombianos, estimar su impacto económico, y sustentar la proposición de estrategias de manejo. 13 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo General Establecer si existe patogenicidad cruzada entre los hongos que producen enfermedades en lulo (frutos), tomate de árbol (frutos y tallos) y tallos de mora de Castilla sobre frutos de gulupa en diferentes estados de desarrollo. 4.2 Objetivos específicos Aislar, identificar los hongos patógenos de frutos de lulo, frutos y tallos de tomate de árbol, y tallos de mora de Castilla. Determinar si existe patogenicidad de los agentes encontrados en lulo, tomate de árbol y mora de castilla, sobre frutos sanos de gulupa en diferentes estados de desarrollo. Clasificar y caracterizar taxonómicamente los hongos de acción patogénica en gulupa, aislados de lulo, tomate de árbol y mora de castilla. 14 5. METODOLOGIA 5.1 Localización La recolección de muestras de lulo (frutos), mora de castilla (tallos), tomate de árbol (frutos y tallos), se realizó en zonas productoras de estos frutales, como los ubicados en los municipios de Venecia, Choachi, Tibacuy y Granada en Cundinamarca; los frutos usados en las pruebas de patogenicidad fueron seleccionados en los supermercados locales, teniendo en cuenta que se encontraran libres de daños mecánicos y síntomas de alguna enfermedad de origen parasitario; los frutos sanos de Gulupa en diferentes estados de desarrollo se recolectaron en los municipios de Venecia, Tibacuy y Granada. El procesamiento de los tejidos, aislamientos, purificación, identificación de los microorganismos y las pruebas de patogenicidad se realizaron en el laboratorio de Fitopatología, de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. 5.2 Tipo de estudio El tipo de investigación realizada es cualitativa y observacional, por lo cual se realizó un análisis descriptivo de los datos mediante registros permanentes de las observaciones sobre las diferentes pruebas adelantadas; de esta manera se registraron datos sobre los diferentes hongos aislados de las muestras tomadas a partir de los cultivos aledaños a la gulupa (lulo, tomate árbol, mora) y si tienen la capacidad de infectar los diferentes estados fenológicos de los frutos de gulupa. 5.3 Aislamientos Los frutos y tallos recolectados fueron lavados con agua corriente y jabón, y se secaron con una toalla de papel estéril. Los tejidos de interés se obtuvieron con la ayuda de un bisturí estéril, cortando fragmentos de tejido infectado y sano aproximadamente de 5x5 mm. Estos fragmentos se sumergieron durante 1 minuto en hipoclorito de sodio a una concentración de 0.525% con el fin de eliminar la flora normal presente en el tejido. Posteriormente, los fragmentos se enjuagaron sumergiéndolos en agua destilada estéril para eliminar los residuos de desinfectante que pudiesen interferir con el desarrollo normal del patógeno. Después, bajo condiciones asépticas, se secaron los fragmentos de tejido utilizando una toalla de papel estéril, para eliminar los excesos de humedad que contribuyeran con la contaminación del aislamiento. 15 Posteriormente, los fragmentos de tejido se sembraron en medio Agar-Papa-Dextrosa (PDA) con acido láctico, colocando cinco fragmentos de tejido en posición equidistante en la placa de agar a través de maniobra con pinzas (Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995 citado por Contreras, 2006). Las placas de agar sembradas se incubaron a temperatura ambiente (±20°C), posteriormente cada uno de los aislamientos obtenidos fue resembrado en placas de PDA por separado con el fin de purificar el hongo, y asimismo se realizaron observaciones microscópicas en los objetivos de 10 y 40X, para tal fin los montajes se colorearon con azul de lactofenol, con el fin de verificar la naturaleza del patógeno y observar la morfología de las conidias, el micelio, entre otras estructuras propias de los microorganismos (Byrne, et al., 1997). La verificación de la naturaleza del hongo se realizó con base en la clave para la identificación de hongos imperfectos de Barnett (1999). 5.4 Pruebas de Patogenicidad Cruzada Este experimento se realizó con el fin de observar la capacidad patogénica que tienen los aislamientos de lulo (frutos), mora de castilla (tallos), y tomate de árbol (frutos, tallos) de generar síntomas de alguna enfermedad sobre frutos sanos de gulupa en diferentes estados de desarrollo. Las pruebas preliminares se realizaron con frutos verdes de diferentes tamaños y totalmente sanos. De acuerdo con los resultados preliminares, las pruebas siguientes se realizaron seleccionando frutos entre 1.4 y 4.2 cm de diámetro, el cual fue medido con un calibrador (pie de rey) (Tabla 1). Se selecciono esta medida dado que los primeros estadios del fruto son más susceptibles a infección por los microorganismos que causan enfermedades en los tejidos epidermales. Tabla 1. Codificación de tamaño de los frutos de gulupa. E1 Diámetro ecuatorial(cm) 1.4 Diámetro polar(cm) 1.8 E2 2.8 3.2 E3 3.8 4.4 E4 4.2 5.0 16 Los frutos seleccionados, se lavaron sumergiéndolos previamente a la inoculación en agua corriente y jabón durante 3-5 minutos. Luego en condiciones asépticas se secaron con una toalla estéril. Para obtener un ambiente de alta humedad y favorecer la germinación y penetración del microorganismo a evaluar, se utilizaron como recipientes cámaras desecadoras, en las que se puede manejar una humedad relativa superior al 80%, mediante la adición de agua destilada estéril separada de los frutos por medio de un disco de porcelana. Estas cámaras se esterilizaron previamente con luz UV por 15 minutos. Los frutos seleccionados se colocaron en la cámara húmeda por un periodo de dos días, para predisponer el tejido al desarrollo de la enfermedad. Después de transcurrido este tiempo, el recipiente fue llevado a una cámara de flujo laminar, para la inoculación de los hongos de interés. En cada una de las pruebas, se emplearon tres frutos por cada aislamiento y dos controles. Cada fruto fue dividido longitudinalmente con un marcador permanente, indicando los diferentes tratamientos y cumpliendo con un diseño completamente aleatorio. Los tratamientos empleados fueron los siguientes: Derecha: Bloques de agar con crecimiento micelial del microorganismo estudiado, sobre pequeñas heridas realizadas en la superficie del fruto. Izquierda: Bloques de agar con crecimiento micelial del microorganismo, sobre la superficie del fruto sin heridas. 17 Como control negativo, sobre la cutícula de algunos de los frutos se realizaron pequeñas heridas con ayuda de un alfiler entomológico, otros no se lesionaron, posteriormente sobre sitios previamente demarcados se colocaron bloques de PDA, totalmente libres de microorganismos. Para los tratamientos con diferentes agentes causales de enfermedades, se usaron bloques de agar de 5x5 mm con el crecimiento del microorganismo, extraídos de colonias de 15 días de incubación. Después de la inoculación todos los materiales permanecieron en cámara húmeda a una temperatura de ±20°C; se utilizó una cámara húmeda por cada cepa obtenida y dos repeticiones, para un total de tres recipientes por aislamiento. Estas cámaras se revisaron diariamente por un periodo de tiempo de 15 días, para determinar la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad. Una vez cumplido el periodo de incubación, se realizaron los respectivos aislamientos para comprobar los postulados de Koch (Cai, 2009). 5.5 Caracterización de los aislamientos Para su observación se realizaron microcultivos con el fin de conocer las principales características taxonómicas de los microorganismos aislados en los diferentes tejidos, y de esta forma, determinar el género y lograr su aproximación a la especie, que incluye la observación macroscópica y microscópica de las colonias de los reaislamientos obtenidos en las pruebas de patogenicidad. En la descripción macroscópica se tuvieron en cuenta aspectos como el color, forma, elevación, borde, apariencia, densidad de las colonias, y el tipo de micelio, este se determinó mediante la observación directa, teniendo en cuenta los siguientes criterios: micelio algodonoso, esponjoso, velloso, si el crecimiento del micelio se extiende por la superficie del agar, si penetra por el medio, y la presencia de micelio aéreo (Contreras, 2006), dichas clasificaciones han sido empleados para realizar y dar a conocer descripciones morfológicas de diversos microorganismos. La descripción microscópica, se basa especialmente en la forma y tamaño de las conidias, la aparición de estados asexuales o sexuales, así como también la formación de otras estructuras taxonómicas, que permiten su ubicación dentro de un género y especie. 18 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1. DESCRIPCION DE LOS SINTOMAS Se observó que los frutos de lulo seleccionados presentaban pudriciones blandas, de color café claro (Fig. 1A), a las que se les realizó el aislamiento correspondiente, encontrando a Botrytis sp. como agente causal de estas pudriciones. Como lo afirma Tamayo (2001), en la enfermedad ocasionada por el hongo conocido como moho gris, se presentan pudriciones blandas en el fruto, y bajo condiciones húmedas produce una capa fructífera visible de conidióforos y conidias sobre los tejidos afectados. En otros frutos se encontraron lesiones circulares de color café, con bordes definidos, y ligeramente levantadas, a manera de costras pequeñas (Fig. 1B), lo cual coincide con las características descritas por Tamayo (2001) para la enfermedad denominada la mona, cuyo agente causal es Cladosporium sp A B Figura 1. Lulo. A. Pudricion blanda ocasionada por Botrytis sp. B. lesiones por Cladosporium sp. Sobre los frutos de tomate de arbol con sintomas de antracnosis, se observaron lesiones de color pardo a negro, con bordes definidos, acompañadas de un ligero hundimiento, localizadas cerca al pedunculo del fruto (Fig. 2A). Al realizar los aislamientos correspondientes se identificaron las dos especies de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides, tal como lo describe Aranzazu y Rondón (1999); también se observaron manchas de color café oscuro, aplanadas o hundidas, pero 19 con márgenes bien definidos (Fig. 2B). En tallos se observaron manchas oscuras, profundas que se extienden y cubren el tallo (Fig. 2D) lo que corresponde a las características descritas por Bernal (2003), para la Mancha parda ocasionada por Alternaria sp. Otros frutos, presentaron lesiones ulcerosas más o menos circulares y levantadas, de color pardo (Fig. 2C), las cuales Bernal (2003), las describe como roña o costras, ocasionadas por el hongo Cladosporium sp., como se confirmó en los aislamientos realizados a partir de estas lesiones. A B C D Figura 2. Tomate de Arbol. A. Sintomas de antracnosis. B. lesiones por Alternaria . en fruto. C. Lesiones por Cladosporium. D. Sintomas de Alternaria. en tallo. La antracnosis en tallos de mora de castilla, se observó como manchas superficiales de color violeta o morado de apariencia oval y con bordes bien definidos (Fig. 3) como lo confirma Forero (2001). También fue común encontrar manchas de tamaño reducido alrededor de las espinas que a medida que avanzan afectan toda la rama y coloniza el tallo principal. Estas lesiones ocasionan la muerte descendente del tejido afectado, en este caso se identificó como agente causal a genero Colletotrichum y sus especies acutatum y gloeosporioides. Figura 3. Sintomas de antracnosis en tallos de mora. 20 6.2. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACION LULO En los aislamientos de pudricines blandas en frutos de lulo , se observaron colonias radiales , de textura algodonosa, cubiertas por un micelio denso, de color blanco y café (Fig. 4A) Características morfológicas similares a las descritas por Ellis (2001) para Botrytis sp. Al realizar el aislamiento de las lesiones asociadas a Cladosporium sp. en frutos de lulo, en medio de cultivo PDA se observaron colonias radiales, de textura aterciopelada cubiertas por un micelio plano y velloso, de color gris o verde-grisáceo, con borde color crema (Fig. 4 B, C), características morfológicas similares a las descritas por Ellis (2001) para Cladosporium sp A B C Figura 4. Aislamientos de lulo en PDA. A Botrytis sp. B y C. Cladosporium sp. De las colonias encontradas de los aislamientos de pudriciones blandas, microscópicamente se observaron hifas septadas, hialinas y ramificadas de manera irregular o dicotómica. Conidióforos septados. El ápice de cada conidióforo finaliza en una ampolla donde se desarrollan conidios, solitarios, unicelulares, lisos, globosos. Características comparables descritas por Barnett (1999) para Botrytis sp. Con respecto, a las colonias encontradas a partir de los aislamientos de roñas o costras en frutos de lulo, microscópicamente se observaron hifas color café claro, septadas, conidióforos rectos o ligeramente flexibles. Las conidias se forman en hifas libres individuales o agrupadas, son lisas, de forma variada, unas elipsoidales, y otras limoniformes o subesfericas, a veces con 1 septo y de color marrón pálido (Fig. 5), características comparables con C.oxysporum, descritas por Ellis (2001), que permiten en forma preliminar ubicar al microorganismo en esta especie.; además este 21 microorganismo ha sido reportado como causante de roñas y costras en frutas de la pasión o maracuyá (Willingham, 2002). Fig. 5. Conidias típicas del genero Cladosporium sp. TOMATE DE ARBOL En los aislamientos realizados a partir de las lesiones asociadas con antracnosis, se obtuvieron colonias radiales de borde definido y aspecto algodonoso; inicialmente el micelio fue de color blanco y se tornó salmón o rosado, debido a la producción de masas de esporas , caracteristica que generalmente presentan los aislamientos de C. acutatum (Fig 6A), como lo describe Reyes (2007); mientras que las colonias de C. gloesporoides presentan tonalidades grisáceas (blanquecinas) (Fig 6B), lo cual coincide con Cai (2009); en las observaciones bajo el estereoscopio, se encontraron los acervulos como masas cremosas de color naranja, comunes en esta especie del hongo. (Fig. 6F). A partir de los aislamientos de las manchas pardas sobre tallos, se obtuvieron colonias planas y ligeramente algodonosas, micelio de color blanco café con reverso negro parduzco (Fig. 6C). Mientras que en los aislamientos de frutos, se observaron colonias de color café claro, aspecto granular y ligeramente algodonosas (Fig.6D), características que corresponden al género Alternaria sp. (Ellis,2001). De las roñas o costras aisladas, se presentaron colonias aterciopeladas de color verde oliva y café, cubiertas por un micelio plano y velloso (Fig. 6E), características macroscópicas que se asocian al género Cladosporium sp. (Tamayo,2001). 22 A B C D E F Figura 6. Aislamientos de tomate de árbol en PDA. A. Colletotrichum acutatum. B. C. gloeosporioides. C. Alternaria aislada de tallo D. Alternaria aislada de fruto E. Cladosporium. F. Acervulos con masas de esporas de C. acutatum. Al realizar la observación microscópica de los aislamientos de tallos y frutos de las manchas pardas en tomate de árbol se observó la presencia de Alternaria sp. Este microorganismo presentó un micelio oscuro, conidióforos que producen conidias que se forman a partir de hifas libres, individuales o agrupadas, con septos transversales y longitudinales, conocidas como dictiosporas, que son de color parduzco, como lo menciona Barnett et al (1999). El hongo Alternaría aislado de tallos de tomate de árbol, presento conidias elipsoidales alargadas, con septos longitudinales y transversales y prolongación apical(Fig. 7A), que se encuentran en cadenas individuales o ramificadas de color café pálido y que salen de conidióforos cortos (Fig. 7B) .Estas características sugieren que posiblemente el microorganismo aislado de tallo de tomate de árbol sea Alternaria alternata (Ellis, 2001), además es una especie reportada por Buritica (1999), para esta especie vegetal. En cuanto al género Alternaría aislado de frutos de Tomate de árbol, presento conidias e hifas con septos de color marrón, en su mayoría solitarias, pero de formas variadas, algunas ovales (Fig. 7C) y otras ovales elongadas (Fig. 7D) con septos transversales, longitudinales y oblicuos. 23 A B C D Fig. 7. Conidias típicas del género Alternaria sp. A. Conidia elipsoidal con prolongación apical. B. Conidias provenientes de cadenas ramificadas. C. Conidias ovales D. Conidias ovales elongadas. MORA DE CASTILLA De los aislamientos de tallos de mora con síntomas de antracnosis, se observaron dos tipos diferentes de Colletotrichum, algunas de las colonias presentaron crecimiento radial, micelio esponjoso y denso de color crema y gris oscuro (Fig. 8A), características que corresponden a C. gloeosporioides, además, se observaron colonias algodonosas de color blanco y rosado (Fig. 8B) especificas de C. acutatum, características descritas para este género según Forero (2001). 24 A B Figura 8. Aislamientos de tallos de mora en PDA. A. Colletotrichum gloesporoides B. C. acutatum. De los aislamientos de Colletotrichum realizados en este trabajo, se tuvo en cuenta la variación en la forma de las conidias, lo cual morfológicamente se ha empleado como un método tradicional de clasificación para diferenciar las dos especies frecuentes en los frutales denominados como de clima frio moderado. La forma de las conidias de C. acutatum son fusiformes, con un extremo terminado en punta y el otro redondo, o con ambos extremos terminados en punta (Fig. 9A) mientras que las conidias de C. gloeosporioides son de forma cilíndrica con los extremos redondos (Fig. 9 B). A BB Fig. 9. Forma de las conidias de Colletotrichum provenientes de de tallos de mora. A. Conidias fusiformes de C. acutatum B. Conidias cilíndricas de C. gloeosporioides. 25 6.3 Pruebas de Patogenicidad cruzada En estas pruebas, se utilizaron aislamientos procedentes de lulo, tomate de árbol y mora sobre frutos de gulupa; en la Tabla 2, se presenta la forma como fueron codificados los microorganismos aislados e identificados. Tabla 2. Codificación de los aislamientos usados en las pruebas de inoculación cruzada. PROCEDENCIA AISLAMIENTO TEJIDO MICROORGANISMO AISLADO CODIGO Lulo Fruto Botrytis LFB Lulo Fruto Cladosporium LFCl Tomate de arbol Tallo Alternaria TTA Tomate de arbol Fruto Alternaria TFA Tomate de árbol Fruto Cladosporium TFCL Tomate de arbol Fruto C. acutatum TFCa Tomate de arbol Fruto C. gloeosporioides TFCg Mora tallo C. acutatum MTCa Mora tallo C. gloeosporioides MTCg A continuación se presentan los resultados obtenidos de las inoculaciones realizadas con heridas en la superficie de los frutos de gulupa y sin heridas, aisladas de lulo tomate de árbol y mora. 26 Tabla 3. Pruebas de inoculación de los aislamientos de lulo, tomate de árbol, y mora de castilla sobre frutos de gulupa con (CH) y sin heridas (SH). Hospedero / código aislamiento Lulo T. árbol Mora LFB LFCL TTA TFA TFca TFcg TFCL MTca MTcg E1 CH SH * * + * + + + + + + + + + + + * Tamaño frutos gulupa E2 E3 E4 CH SH CH SH CH SH * * * * * * + * + * + * + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + * + * + * + Positivo: Síntomas y enfermedad - Negativo: No presenta ninguna sintomatología * Variante: Lesiones atípicas sin desarrollo de la enfermedad Los resultados de la inoculación con LFB, sobre frutos de gulupa fueron variables en los dos casos, con y sin heridas; después del periodo de incubación, se observó crecimiento del microorganismo inoculado sobre los bloques de agar (Fig. 10 A) y en la superficie del fruto se presentaron en los FCH (frutos con heridas) lesiones de color pardo y forma irregular (Fig. 10B); sobre los FSH (frutos sin heridas) las manchas fueron redondas y de aspecto pálido (Fig. 10C). Sin embargo, el microorganismos no produjo una capa fructífera visible de moho gris sobre los tejidos afectados, característica de las enfermedades por Botritys bajo condiciones húmedas (Agrios, 2006) y también reportada por Quintero en 2008, sobre frutos de gulupa afectados por el hongo. En los dos casos el microorganismo se reaisló sobre medio de cultivo artificial (Anexo 1A). 27 A B C Fig. 10. Pruebas de la inoculación de Botrytis aislado de Lulo. A. crecimiento del microorganismo después de 15 días de incubación. B. lesiones irregulares de color pardo en fruto E2 con heridas. C. lesiones redondas de aspecto pálido en frutos E4 sin heridas Dadas las características anteriores, es posible que el microorganismo haya logrado penetrar en el hospedero y producir diversos grados de infección. Sin embargo, según Agrios (2006), incluso después de que el patógeno ha penetrado las estructuras de defensa, el hospedero muestra varios grados de resistencia que consisten en la formación de estructuras que tienen cierta actividad para contrarrestar las invasiones posteriores de los patógenos, como la formación de capas de corcho, y de tejidos necróticos. Teniendo en cuentas las lesiones de apariencia corchosa presentadas sobre la superficie de los frutos (Fig. 10B), posiblemente sea resultado de la estimulación que ejercen las sustancias que secreta el patógeno sobre las células del hospedante. Las capas de corcho no solo inhiben el avance que pueda intentar el patógeno sobre las otras células, sino también bloquean la difusión de cualquier sustancia que el patógeno pueda secretar. Además, estos tejidos necróticos, aíslan al microorganismo de las sustancias vivas de las que depende para nutrirse, crecer y propagarse. De esta manera, Botrytis se comporta como microorganismo saprófito y no como patógeno, porque produce algunos síntomas más no desarrolla el ciclo de la enfermedad sobre frutos de gulupa, aunque es posible que permanezca en estado quiescente en los frutos evaluados, y en campo a medida que los frutos van madurando, el micelio quiescente se active e induzca los síntomas característicos del moho gris. Con respecto a las inoculaciones con Cladosporium sp., LFCl el periodo de incubación fue de 12 días en los frutos de los estados E1 y E2 que presentaron manchas circulares pequeñas con bordes definidos de color café claro y centro pálido (Fig. 11A); sobre los frutos E3 y E4 se presentaron lesiones ulcerosas más o menos circulares y levantadas, de color café claro, que podían estar aisladas o agrupadas (Fig. 11B), aspectos que según Agrios (2006), Quintero (2008) y Galindo (2010), es 28 característico del microorganismo. Sin embargo, las lesiones en frutos de todos los estados fueron diferentes, lo que sugiere un progreso de chancro hasta roña a medida que el fruto crece y se desarrolla la enfermedad. De esta manera sobre los FSH se presentaron lesiones pequeñas de color pardo sin forma definida (Fig. 11C); en todos los casos el microorganismo fue reaislado a partir de las lesiones obtenidas (Anexo 1B), lo cual indica que es posible que bajo ciertas condiciones Cladosporium sp. no posea la capacidad necesaria para iniciar la enfermedad, cuando emplea como mecanismo de penetración las aberturas naturales o la forma directa, necesitando de heridas para inducir la sintomatología, lo cual coincide con lo citado por Torres (1999), quien menciona que la afección por Cladosporium sp., se inicia con la presencia de un vector, el cual al introducir el estilete en el epicarpio, causa heridas que estimulan la reacción en los tejidos de la planta produciendo zonas corchosas. Según los resultados obtenidos en el presente trabajo se sabe que el mecanismo de penetración de Cladosporium posiblemente oxysporum en los frutos de gulupa es más exitoso mediante heridas previamente ocasionadas, lo cual se confirma con el trabajo de Rojas (2010). A B C Figura 11. Lesiones de Cladosporium sp. aislado de lulo sobre frutos de gulupa. A. manchas circulares de borde definido. B. lesiones ulcerosas más o menos circulares y levantadas. C. lesiones pequeñas de color pardo a vino tinto en fruto sin heridas. En relación con los resultados obtenidos sobre los frutos de gulupa inoculados con TTA,(Tabla 3) se observó sintomatología a los 10 ddi (días después de infección) sobre la superficie de los tejidos se presentaron manchas ligeramente hundidas con borde definido y de color parduzco, (Fig. 12A), al realizar un corte superficial se observaron lesiones profundas, en el mesocarpio del fruto (Fig. 12B); algunos de los frutos presentaron lesiones circulares de 5mm de diámetro, ligeramente hundidas y de color pardo rojizo con bordes bien definidas (Fig. 12C), sintomatología que coincide con lo reportado por Agrios (2006) y Quintero (2008). 29 A B C D E F Figura 12. Lesiones de Alternaria sp. proveniente de tallos(A, B, C) y frutos (D, E, F) de Tomate de Árbol sobre frutos de gulupa. En los FCH inoculados con TFA se presentaron síntomas a los 15 ddi manchas similares a las descritas anteriormente (Fig.12 D, E, F), pero superficiales, que no afectaron el mesocarpio. En los FSH de los estados E3 y E4 no presentaron algún tipo de síntomas. Al comparar los resultados de las inoculaciones con TTA y TFA es posible que por las diferencias encontradas en el periodo de incubación, la facilidad de penetrar la superficie del fruto (con y sin heridas), y la severidad de la sintomatología, se trate de dos especies distintas de Alternaria, lo cual se refuerza con las características macroscópicas de los reaislamientos (ANEXO 1.D, E) y microscópicas descritas anteriormente. Con respecto a la inoculación de TFCa, se observaron resultados positivos en FCH y FSH a los 15 ddi; se desarrollaron lesiones profundas, con márgenes definidos de color café negro y con centro blanco grisoso, que avanzan al endocarpio, por lo general acompañadas de micelios del microorganismo inoculado (Fig.13). Mientras que, en las inoculaciones con C. gloesporoides TG4 se observaron resultados positivos en frutos E1 y E4 con heridas, y E1 y E2 sin heridas, presentando lesiones en la superficie del exocarpio de menor tamaño en el mismo tiempo pos infección. Los 30 frutos E3 y E4 sin heridas no presentaron ninguna lesión al compararlos con los controles. Figura 13. Lesiones de Colletotrichum acutatum en gulupa aislados de tomate de árbol Al inocular los frutos de gulupa con TFCl no se presentó ningún tipo de lesión, es posible que se deba, a que algunos patógenos son específicos de una especie particular o de cierto género de plantas, mientras que otros tienen un rango más amplio que incluye muchos grupos taxonómicos de plantas superiores. También puede ser por la variabilidad en las condiciones de la temperatura ambiental, bajo las cuales el patógeno no puede atacar a su hospedero, o a su resistencia a la infección a pesar de que estén presentes ambos componentes , no se produce alguna enfermedad en el hospedero (Agrios, 2006). Sobre los resultados positivos, obtenidos en la inoculación con MTCa sobre los FCH y FSH (Tabla 3) cabe destacar que este microorganismo presentó sintomatología característica en los frutos a los 5 ddi. En los frutos E3 y E4, se presentaron lesiones profundas en el mesocarpio, de aspecto redondo con borde definido de color café claro y hendidas en el centro, con presencia de micelio (Fig. 14A y B), mientras que los frutos pequeños E1 y E2 presentaron momificación, mostrando una colonización total del microorganismo. En las inoculaciones de MTCg sobre FCH se presentaron síntomas característicos a los 12 ddi (Fig. 14C). En los FSH inoculados, se presentaron lesiones escasas, de tamaño pequeño, redondas (puntos) y de color café oscuro. En los dos casos el microorganismo se reaisló sobre medio de cultivo artificial (Anexo 1F). 31 A B C Figura 14. Frutos de gulupa inoculados con Colletotrichum acutatum (A y B) y C. gloeosporioides (C) aislados de tallos de mora. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de la inoculación del genero Colletotrichum sobre frutos inmaduros de gulupa, se puede determinar que C. acutatum tiene mayor actividad patogénica sobre frutos inmaduros de gulupa que C. gloeosporioides, dado que al comparar las cepas TFCa y MTCa se puede determinar que estas últimas fueron más agresivas, ya que el periodo de incubación fue de 5 días, y presentó colonización total en frutos pequeños, y las lesiones características en frutos de los estados E3 y E4. Además, la cantidad de crecimiento del patógeno y la severidad del tejido afectado evidencian la efectividad o patogenicidad del microorganismo. Este periodo de incubación de 5 días coincide con lo reportado para C. acutatum en otros frutos, en los que se observa gran degradación del tejido a las 120 horas pos inoculación (Wharton, 2009). Con respecto a la patogenicidad de C. gloeosporioides, es necesario tener en cuenta que para que se produzca una infección efectiva, no basta con que el patógeno entre en contacto con su hospedero. Los patógenos sintetizan (enzimas, polisacáridos, toxinas) ya sea durante el curso normal de sus funciones o en el momento de desarrollarse sobre ciertos sustratos (Agrios, 2006). Para que el hongo pueda penetrar la cutícula del fruto requiere de un complejo enzimático que le permita macerar la cutícula y penetrar en exocarpio. Según Wattad y Prusky (1994), la secreción de enzimas pectolíticas responsables de la maceración de la pared celular durante el ataque de C. gloeosporioides, es un factor limitante durante la patogénesis y las condiciones que afectan la secreción de estas enzimas, pueden evitar la activación del Colletotrichum sp en la colonización de frutos inmaduros (Parra, 2008). Otro factor que determina la relación parasítica hospedero- patógeno es el pH del hospedero, que puede ser concluyente en la dinámica de las infecciones quiescentes en los diferentes estados fenológicos de los frutos. Yakoby et al, (2000), 32 sugieren que la secreción de pectinasas están influenciadas por el pH, indicando que la susceptibilidad de los frutos está regulada por decrecimientos de compuestos antifungales e incrementos en el pH del pericarpio, que modula la secreción de pectinasas y otras enzimas. Las pectinasas de C. gloeosporioides son secretadas con valores de pH mayores a 5.8, aunque también puede ser producida con valores de 5.1 (Prusky, et al, 2001), lo que indica que cuando los niveles de pH del hospedero son adecuados, se puede iniciar el proceso de infección. Teniendo en cuenta lo anterior y lo citado por Pinzón, (2006) los valores de pH en los estados de madurez de la gulupa están entre 2,99 y 3,60 lo cual permite suponer que posiblemente C. gloeosporioides penetró en los frutos inmaduros de gulupa, y se encuentra en estado inactivo o quiescente, y en este estudio, no mostro una patogenicidad tan severa como C. acutatum, pero que en campo, en donde el microorganismo de una u otra manera se ve favorecido, presente los síntomas de la enfermedad. De esta manera, es importante tener en cuenta que el género Colletotrichum puede infectar en todos los estados de desarrollo del fruto (Hartung, & al., 1981;Daykin & Milholland, 1984, Adaskaveg & al., 2000, citados por Wharton, 2009). La patogenicidad de C. acutatum en este trabajo, posiblemente se deba a que este microorganismo puede aumentar los niveles de pH por la secreción de amonio como ocurre en otros frutos con antracnosis (Prusky et al., 2001) para superar las barreras fisiológicas impuestas por el hospedero. La regulación que C. acutatum, hace sobre el pH es un factor de patogenicidad importante que debe ser tenido en cuenta a la hora de establecer un manejo de la enfermedad. Por otro lado, los dos aislamientos de C. gloeosporioides utilizados TFCg y MTCg se pueden comparar en este estudio, de acuerdo a los resultados, en los cuales el segundo presento mayor patogenicidad, teniendo en cuenta que el periodo de incubación fue menor (12 días), síntomas característicos en FCH y FSH , como lesiones pequeñas; que posiblemente expliquen la penetración y permanencia del microorganismo en un estado de latencia en los tejidos, donde el crecimiento del hongo se restringe a la capa epidérmica 33 6.4 Reaislamientos El posterior reaislamiento de los patógenos a partir de los frutos de gulupa con síntomas, confirmó la presencia de los mismos indicando el cumplimiento de los postulados de Koch (Anexo 1). Finalmente, se pueden determinar que los hongos patógenos aislados de algunos de los frutales cultivados en zonas agroecológicas similares a los de gulupa que se evaluaron en este estudio, presentaron lesiones características de enfermedades en frutos inmaduros de gulupa, que taxonómicamente se clasificaron en los géneros: Cladosporium posiblemente oxysporum aislado de frutos de lulo, Alternaria posiblemente alternata de tallos de tomate de árbol y C. acutatum de tallos de mora, los cuales penetraron fácilmente los tejidos superficiales del frutos, en presencia o ausencia de heridas. 34 CONCLUSIONES Se realizó el aislamiento y la identificación de los siguientes hongos: Botrytis sp. Cladosporium sp. en lulo; Colletotrichum sp., Alternaria sp. , y Cladosporium sp., en tomate de árbol, y Colletotrichum sp. en mora. Se demostró el potencial de infección cruzada entre los aislamientos de Cladosporium sp posiblemente oxysporum proveniente de lulo, Alternaría sp. posiblemente alternata de tomate de árbol y Colletotrichum de mora sobre frutos inmaduros de gulupa, lo cual permite sugerir a los productores la implementación de nuevas estrategias de manejo dado el potencial permanente de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan. Aunque el género Colletotrichum presenta gran variabilidad, en este estudio los sistemas tradicionales de clasificación con base en las características morfológicas y los resultados en las pruebas de patogenicidad permitieron establecer algunos criterios de clasificación de especies dentro del género. De acuerdo a la severidad de las lesiones y el tiempo de incubación en este estudio, se puede deducir que Colletotrichum acutatum proveniente de tallos de mora es el microorganismo más patógeno sobre frutos verdes de gulupa, ya que produjo síntomas severos que necrosaron en forma rápida gran parte del tejido inoculado. En cuanto a las prácticas de manejo, este trabajo, indica en forma preliminar que con la aplicación de Benomyl, utilizado en los cultivos de gulupa, es muy probable que no se esté ejerciendo algún control sobre C. acutatum y que la incidencia de la enfermedad pueda ser mayor a medida que se incrementan las áreas de cultivo y se hace uso inadecuado del control químico. 35 RECOMENDACIONES Adelantar pruebas de patogenicidad cruzada con Colletotrichum sp. proveniente de lulo. Al igual que con microorganismos patógenos provenientes de frijol, que es otra planta asociada a los cultivos de gulupa, en los municipios de Venecia, San Bernardo y Granada en Cundinamarca. Complementar este estudio con pruebas tanto biológicas como de caracterización molecular; ya que finalmente lo que determina el inicio y desarrollo de las enfermedades es la presencia e interacción concurrentes de genes específicos que determinan la virulencia en el patógeno y la susceptibilidad en la planta hospedante. 36 BILIOGRAFIA Afanador-Kafuri, L., Minz, D., Maymon, M., y Freeman, S. 2003. Characterization of Colletotrichum isolates from tamarillo, passiflora, and mango in Colombia and identification of a unique species from the genus. Phytopathology 93:579-587 Aranzazu, L., F. Rondón. 1999. Manejo productivo del cultivo de tomate de árbol (Solanum betacea) y de la antracnosis. Boletín Divulgativo. Corpoica – Pronatta. Produmedios. Santafé de Bogotá, DC, Colombia. Agrios. 2006. Fitopatología. Editorial Limusa S.A de C.V. México D.F. Barnett,1999. Illustrated genera of imperfect fungi. Cuarta Edición. Minnesota. Bernal, J; Cipriano, A; Diaz, D. 2003. 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