Caracterización espectroscópica por Resonancia Magnetica

CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA POR RESONANCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR DE SUSTANCIAS HÚMICAS DE COMPOSTS: UNA REVISIÓN.
ARMADO, ARNALDO
Postgrado en Biotecnología de Microorganismos,
Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.
Departamento de Química, Facultad de Ciencias y Tecnología,
Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.
e-mail: [email protected]
Resumen
Se presenta una revisión de las
aplicaciones de espectroscopía de
resonancia magnética nuclear (RMN) en
la caracterización de sustancias húmicas
(SH) de composts. Se muestra una reseña
de los principios básicos de la
espectroscopía de RMN en una y dos
dimensiones, y su aplicación en el estudio
de sustancias húmicas. Luego se
describen algunos trabajos de aplicación
en la caracterización de compost y
enmiendas orgánicas, realizados en las
variantes de la RMN como lo son RMN
de protones (1H-RMN), de carbono-13
(13C-RMN), de fósforo-31(31P-RMN) y
nitrógeno-15 (15N-RMN). Por ultimo, se
plantea un ejemplo detallado de un
análisis comparativo entre los ácidos
húmicos (AH) y ácidos fúlvicos (AF) de
un compost, donde se empleó la
espectroscopia de RMN de protones (1HRMN) y de carbono-13 (13C-RMN), en
una y dos dimensiones. Esta revisión
pone en relieve la importancia de la RMN
para la determinación de la estructura de
sustancias húmicas en compost.
Palabras claves: Resonancia magnética
nuclear (RMN), sustancias húmicas (SH),
compost.
Abstract
A review of nuclear magnetic resonance
(MNR) spectroscopy applications at
humic substances (HS) characterization is
presented.
A
review
of
NMR
spectroscopy principles in one and two
dimensions, and their applications into
study of humic substances is showed.
After, some researches about applications
on compost characterization and organic
emends, realized in various kind of NMR
like proton (1H-NMR), carbon-13 (13CNMR), phosphoro-31 (31P-NMR) and
nitrogen-15 (15N-NMR), are described. At
end, a detailed example of comparative
analysis between humic acid (HA) and
fulvic acid (FA) of compost are
presented, where proton (1H-NMR) and
carbon (13C-NMR) NMR spectroscopy,
on one and two dimensions, are
employed. This review put in relief the
NMR importance for humic substances
structure determination in compost.
Keywords: Nuclear magnetic resonance
(NMR), humic substances (HS), compost.
Introducción
Una vez que las distintas sustancias
orgánicas de Compost han sido aisladas,
es necesario caracterizarlas, es decir,
distinguir entre su composición y
estructura.
En
este
aspecto,
la
espectroscopia ha hecho un aporte
importante. Las técnicas espectroscópicas
pueden ayudar a determinar que grupos
funcionales están presentes, hasta
proporcionar modelos estructurales de las
sustancias presentes en los composts.
Además, pueden conllevar a definir
alguno de los parámetros de madurez y
estabilidad de las enmiendas orgánicas,
pero una sola técnica no permite conocer
toda la información necesaria para
discernir en los procesos de la
degradación de la materia orgánica
(Chefetz y col, 1996).
Entre las técnicas espectroscópicas usadas
para determinar la estabilidad y madurez
de una enmienda está la Resonancia
Magnética Nuclear (RMN), en sus
variantes como RMN de protones (1HRMN), de carbono 13 (13C-RMN), de
fósforo 31 (31P-RMN) y de nitrógeno 15
(15N-RMN). En los últimos años algunos
investigadores han realizado trabajos
donde analizan las estructuras de las
sustancias húmicas tanto de suelo como
de compost mediante estas técnicas
espectroscópicas, en esta revisión se
pretende recopilar la información más
importante como una herramienta para
futuras investigaciones en el área. Cabe
destacar que las referencias bibliográficas
relacionadas
con
el
análisis
espectroscópico de las sustancias húmicas
de suelo son abundantes, no así en cuanto
a Compost.
Resonancia
magnética
nuclear:
Principios
En presencia de un fuerte campo
magnético las energías de los núcleos de
ciertos elementos se dividen en dos o más
niveles cuánticos como consecuencia de
las propiedades magnéticas de estas
partículas.
Pueden
provocarse
transmisiones entre los niveles de energía
inducidos magnéticamente por la
absorción de radiación electromagnética
de frecuencia apropiada, de igual modo
que
transiciones
electrónicas
son
causadas por la absorción de radiación
ultravioleta o visible (Skoog y West,
1994).
Dado que el objetivo de este trabajo no es
plantear los fundamentos de la RMN,
bastará con enumerar los conceptos de
spin nuclear I y el momento angular P
asociado, su cuantización (en magnitud y
en orientación respecto al campo
magnético B0), su relación con el
momento magnético µ (de la forma µ= γ
P),
que
introduce
la
constante
magnetogírica γ como característica de
cada isótopo, y la frecuencia de Larmor,
ν0, a la que precesionan los spins, y que
lleva a la expresión
ν0= γ B0 / 2π
que para el protón, 1H, cuya constante
magnetogírica vale γH= 26.75 x 107 rad T1 -1
s , operando con un campo magnético
B0= 2.35 T (23500 gauss), da una
frecuencia de Larmor de 100.00 MHz,
dentro del intervalo de la radiofrecuencia.
Como es sabido, la irradiación de la
muestra, por medio de radiación
electromagnética
polarizada
circularmente en el plano perpendicular a
B0 y cuya frecuencia sea precisamente la
de Larmor, lleva a la resonancia del
sistema, produciéndose transiciones entre
los niveles energéticos.
La detección de la absorción de esta
radiofrecuencia en un espectrómetro
RMN no es inmediata, ya que las
cantidades de energía involucradas (hν0)
son muy pequeñas, alrededor de unas
pocas milicalorías por mol. Así, a causa
del pequeño valor de las energías
involucradas, la RMN es una técnica
espectroscópica de muy baja sensibilidad.
En condiciones óptimas, en un
espectrómetro moderno de alto campo
magnético, se requiere un mínimo de
1015 spins de una determinada especie
isotópica para poder detectar señales
útiles en un período de una hora.
A pesar de estas limitaciones, la RMN es
la técnica más ampliamente utilizada en
investigaciones estructurales o dinámicas
de compuestos químicos en fase
condensada, tanto desde el punto de vista
de los físicos como, en especial, del de
los químicos, y más recientemente de los
B
B
biólogos o los médicos. A diferencia de
otras técnicas de investigación estructural,
la RMN no se limita al caso de pequeñas
moléculas de bajo peso molecular y alta
simetría, sino que proporciona datos
precisos y muy útiles incluso con
biopolímeros
de
peso
molecular
relativamente elevado (proteínas), sin
requerir la previa cristalización de la
muestra (Sánchez, 2003)
Esta gran utilidad de la RMN se puede
describir usando las palabras de Richard
R. Ernst, Premio Nóbel de Química 1991:
“Los sistemas de spins nucleares
presentan características singulares que
los predestinan para el estudio de las
moléculas:
1) Los núcleos atómicos empleados como
sensores se encuentran perfectamente
localizados, con diámetros de unos pocos
femtometros, y pueden proporcionar
información sobre la situación de su
entorno inmediato, haciendo así posible
una exploración muy detallada de las
moléculas y de la materia.
2) La energía de interacción de los
sensores con el entorno es pequeñísima,
inferior a 0.2 J mol-1, equivalente a la
energía térmica a 30 mK. De este modo,
la observación y la medición de
propiedades moleculares se pueden
realizar
prácticamente
sin
perturbaciones.
No
obstante,
las
interacciones presentan una elevada
sensibilidad respecto del entorno local.
3) La información sobre la estructura de
las moléculas puede obtenerse a partir de
las interacciones entre pares de núcleos.
Así, las interacciones magnéticas dipolodipolo proporcionan información sobre
las distancias internucleares. Por su
parte, los acoplamientos escalares J
permiten la determinación de ángulos de
torsión.”
Este conjunto de propiedades es el que ha
hecho que la RMN sea hoy una
herramienta imprescindible en todos los
laboratorios de química preparativa y de
bioquímica estructural o dinámica. En
otro contexto, los instrumentos de imagen
por RMN son también imprescindibles en
los hospitales. Pero para llegar a la
situación actual ha sido preciso superar
las dificultades asociadas a la baja
sensibilidad característica de la RMN
(Sánchez, 2003).
Aplicaciones de la Espectroscopia de
resonancia magnética nuclear en el
estudio
de
Compost
(enmiendas
orgánicas)
La
espectroscopía
de
resonancia
magnética nuclear en las ultimas décadas,
ha proporcionado la clave para hacerse
una idea de los detalles estructurales de
las sustancias húmicas (Preston, 1996). Es
una técnica que permite analizar los
diferentes componentes de la materia
orgánica de un suelo, enmienda o
cualquier material orgánico. Un espectro
de RMN puede proporcionar “huellas
dactilares” de carbono o hidrógeno según
sea el caso en diversas muestras
orgánicas, los cuales permiten elucidar
los compuestos orgánicos y sus mezclas
(Schnitzer y col., 1993; Simpson, 2001).
La espectroscopia de RMN, al igual que
otras técnicas no destructivas, como la
espectroscopía
de
Infrarrojo
con
transformada de Furier (IR-TF), puede ser
usada para evaluar las transformaciones
de la materia orgánica en compost y su
madurez, porque permite estimar los
cambios durante el compostaje en el
contenido de alifáticos, carbohidratos,
aromáticos, fragmentos fenólicos y
concentración de grupos carboxílicos
(Chen e Inbar, 1993).
La
polidispersidad y heterogeneidad
estructural de las sustancias húmicas (SH)
inducen efectos específicos en los
parámetros claves de la RMN como el
desplazamiento químico δ, constante de
acoplamiento J, amplitud A, y el ancho
del pico de resonancia a la mitad de la
altura Δν1/2. La heterogeneidad de las SH
causa solapamiento de los picos de
resonancia en sus espectros de RMN,
resultando en señales bastante anchas.
Las variaciones en el tamaño del
agregado,
forma
(conformación
molecular), carga y las interacciones
mutuas de las moléculas húmicas afectan
los tiempos de relajación T1 y T2 de la
RMN. Moléculas y agregados de gran
tamaño
y
fuertes
interacciones
interagregados inducen una movilidad
segmental baja entre las moléculas
húmicas y conduce a un tiempo de
relajación longitudinal lento (T1) y
transversal rápido (Bovey y Mirau, 1996).
Los efectos en la resonancia disminuyen
la intensidad A y aumentan el ancho
medio del pico Δν1/2, lo que provoca que
sea difícil reconocerlo claramente. La
relajación diferencial dentro de la matriz
húmica polidispersa interfiere con el
análisis cuantitativo, el cual está basado
en la determinación de la posición de los
picos de resonancia y su intensidad, tanto
en RMN de una dimensión como de dos
dimensiones. La extensa duración de los
experimentos
de
RMN
en
dos
dimensiones, hace a esta técnica más
susceptible de los efectos de variación de
los tiempos de relajación (T1 y T2).
Debido al extensivo solapamiento de las
señales y el rápido tiempo de relajación,
la constante de acoplamiento no es
comúnmente usada para el análisis de
sustancias
húmicas
en
RMN
unidimensional. En su lugar, usualmente
se realiza el cálculo de integrales
parciales de acuerdo a regiones ordinarias
de
las
subestructuras
húmicas
(Bortiatynsky y col., 1996; Preston,
1996).
La espectroscopía de RMN en dos
dimensiones ofrece muchas ventajas en el
análisis de la compleja estructura de
sustancias húmicas. Un aumento en la
dispersión de la señal en la frecuencia en
dos dimensiones reduce en forma
considerable el solapamiento de picos de
resonancia,
especialmente
en
los
espectros de RMN de correlación
heteronuclear con alta propagación de
frecuencia en la dimensión F1 (eje de
frecuencia vertical en los espectros de
RNM en dos dimensiones) (Croasmun y
Carlson, 1996; Cavanagh y col., 1996).
Adicionalmente, los experimentos de
RMN bidimensional actúan como filtros
que acentúan formas específicas de
enlace. Así, espectros que correlacionan
enlaces
simples,
como
espectros
heteronucleares de cohesión de quantum
simples (en inglés “heteronuclear single
quantum coherence”, HSQC) y espectros
heteronucleares de correlación de
quantum
múltiple
(en
inglés
“heteronuclear
multiple
quantum
correlation”,
HMQC)
muestran
exclusivamente pares de enlaces de
átomos de carbono e hidrógeno, mientras
que patrones de espectroscopía de
correlación homonuclear (en inglés
“homonuclear correlated spectroscopy”,
COSY) exhiben solo acoplamientos
protón-protón geminales (dos enlaces) y
vecinales (tres enlaces). La sensibilidad
de la detección de protones por espectros
de RMN bidimensional en general es
mucho mayor que en los espectros RMN
en una dimensión de cualquier núcleo
(Hertkorn y col., 2002).
El cruce de picos en los espectros de
RMN en dos dimensiones indica un
intervalo de conectividades definido por
el tipo de experimento de RMN realizado,
permitiendo investigar las interacciones
de enlaces, relaciones espaciales, y
cambios químicos (Croasmun y Carlson,
1996; Cavanagh y col., 1996; Hertkorn y
col., 2001).
Aplicaciones de la Espectroscopia de
resonancia magnética nuclear de
protones (1H-RMN) en el estudio de
Composts
Hernández y col. (1990) estudian las
estructuras de los ácidos húmicos (AH)
de lodos residuales, a través de la
espectroscopia de 1H-RMN, consiguiendo
un mayor contenido de grupos
metilénicos (-CH2-) en las cadenas
alquílicas respecto a los AH del suelo, así
como señales de proteínas, grupos
aromáticos y carbohidratos.
Zambrano (2005), evaluó los ácidos
húmicos (AH) de diferentes enmiendas
orgánicas (gallinazas, estiércol de vacuno,
estiércol de chivo, lodo residual, cachaza
y vermicompost) por medio de resonancia
magnética de protones (1H-RMN) y
reporta
similitudes
y
diferencias
espectrales entre los diferentes tipos de
enmiendas estudiadas. Específicamente,
reporta similitudes entre estiércol de
vacuno y chivo, y diferencias de éstos en
comparación con gallinaza. Las señales
observadas en los espectros son atribuidas
a diferentes grupos funcionales:
9 En el intervalo de 0,1 a 1,6 ppm se
encuentran estructuras alifáticas
de grupos metilo y metilenos
(CH3-C-, -CH2-C-, -CH2-[C=C]).
9 Protones de grupos metilenos y
metinos en carbonos alfa de
anillos aromáticos, carboxílicos y
grupos carbonilos, de 1,6 a 3,0
ppm.
9 Protones en carbono de grupos
metilo, metileno o metino
enlazados directamente a oxígeno
o
nitrógeno,
incluyendo
carbohidratos y protones de
aminoácidos, especialmente en
estiércol de vacuno y caprino, en
el intervalo de 3,3 a 5,5 ppm.
9 Protones unidos a carbonos
insaturados y protones aromáticos
de 5,5 a 9,0 ppm; dentro de este
intervalo, de 6,5 a 7,5 ppm se
observa también señales de
protones
de
sustituciones
aromáticas tipo fenoles.
Además, Zambrano (2005) señala que la
naturaleza y origen de las enmiendas
orgánicas, afectan fuertemente la
composición y tipo de grupos funcionales
de los ácidos húmicos. Sin embargo, a
excepción de las gallinazas, y en menor
proporción el lodo residual, los AH
estudiados presentan un fuerte carácter
aromático e instauraciones en cadenas
ramificadas, alquílicas y arílicas, así
mismo, reporta la presencia de grupos
carbonilos
y
ácidos
carboxílicos.
Encontró además que solo el estiércol de
vacuno presenta señales de posibles
grupos aminos.
Zambrano recomienda en su trabajo, que
en futuras investigaciones se caractericen
los AH de las enmiendas estudiadas por
espectroscopia de resonancia magnética
de carbono 13 (13C-RMN) así como por
espectroscopia de masas acoplada a gases
y espectroscopia de resonancia espín
electrón de tal manera de elucidar
posibles
grupos
funcionales
y/o
fragmentos de los ácidos húmicos con
mayor exactitud.
Aplicaciones de la Espectroscopia de
resonancia magnética nuclear de
carbono-13 (13C-RMN) en el estudio de
Composts
Inbar y col. (1991) evaluaron la calidad y
madurez de un compost obtenido a partir
de residuos sólidos de una fabrica de
vinos entre los 0 y 160 días, utilizando
espectroscopia de 13C-RMN. Esta técnica
les permitió evaluar la materia orgánica
en las diferentes etapas del proceso,
consiguiendo señales asociadas a la
presencia
de
alcoholes
alifáticos,
carbohidratos y polisacáridos. Por otra
parte, encontraron que la incorporación de
semillas aumenta la aromaticidad, los
ácidos grasos y disminuye los grupos
carboxilos (-COOH); la piel de la uva
aumenta la aromaticidad y grupos
-COOH y la mezcla de piel y semilla
incrementa la aromaticidad, los grupos
metoxi (-OCH3) provenientes de la
lignina y grupos –COOH.
Schnitzer y col. (1993) estudian la
biomadurez de diferentes compost,
haciendo uso de la 13C-RMN y pirólisis
con espectroscopía de masa. Por medio de
la 13C-RMN, comprobaron los resultados
obtenidos por espectroscopía de masa,
consiguiendo que, entre 0 y 59 días,
disminuye el C alifático, incrementa el C
aromático, no encontraron cambios
significativos en el contenido de
carbohidratos y aumentó la cantidad de
aminoácidos y O alquílicos en todos los
casos.
Chefetz y col, (1996) caracterizaron la
materia orgánica de un compost de
desechos sólidos municipales y definen
parámetros de madurez del producto. Con
el uso de espectroscopía de 13C-RMN se
consiguió un incremento de la
aromaticidad hasta los 90 días, aumento
de grupos -COOH y oxidrilos (-OH)
fenólicos entre 0 y 132 días y
lógicamente, disminución de los grupos
alquílicos. Además, encontraron un
aumento de O alquílicos hasta 34 días,
seguida de una disminución significativa
hasta los 132 días.
Chefetz y col, (1998) reportan que por
medio de espectroscopía de 13C-RMN, los
espectros de la materia orgánica disuelta
de un compost de sólidos municipales,
revelan un aumento en los niveles de
estructuras aromáticas con el tiempo de
compostaje, y concluyen que los niveles
de materia orgánica disuelta constantes
observados durante el curado y las fases
de maduración, representan un estado en
el cual la composición química del
compost cambia continuamente.
Dria y col. (2002) realizaron una serie de
experimentos, con el objeto de evaluar la
calidad de los espectros de 13C-RMN en
estado
sólido
obtenidos
con
espectrofotómetros de alto campo,
evaluando los espectros a diferentes
condiciones. Los resultados obtenidos por
estos autores, demostraron el poder de
aplicación de las técnicas modernas de
RMN en estado sólido a fuertes campos
magnéticos altos. Con estas técnicas, de
alta calidad, espectros semicuantitativos
pueden ser producidos rápidamente,
permitiendo la aplicación de esta técnica a
muchas
muestras
ambientalmente
relevantes, especialmente cuando la
cantidad se limitada.
Entre muchos otros trabajos que reportan
la espectroscopia de 13C-RMN para la
caracterización de sustancias húmicas y
materia orgánica en composts, podemos
citar:
9 Simpson
y
col.
(2002)
“Mejoramiento en espectroscopía
de resonancia magnética nuclear
bidimensional
de
sustancias
húmicas”. Concluyen que las
mejoras obtenidas pueden ayudar
a las actuales estrategias de
caracterización de sustancias
húmicas en suelos, sedimentos y
agua.
9 Chefetz y col. (2002) realizan el
estudio de cómo determinar
componentes de ácidos húmicos
de suelos y compost por
modificaciones químicas, 13CRMN,
pirólisis,
y
por
cromatografía
de
gases
termoquimiolítica acoplada a
espectrometría de masas.
9 Smernik y col. (2003a) realizan la
caracterización
de
materia
orgánica de lodos residuales
13
C-RMN en estado
usando
sólido. Sus resultados muestran
que la materia orgánica del lodo
es significativamente diferente a
la materia orgánica de suelos, lo
que puede tener implicaciones en
la aplicación de este lodo en
suelos agrícolas.
9 Smernik y col. (2003b) estudiando
diferentes lodos residuales, por
dos técnicas de 13C-RMN,
encuentran que la naturaleza
heterogénea de la materia orgánica
del lodo tiene implicaciones en la
aplicación en suelos, ya que tienen
diferentes
velocidades
de
descomposición.
Aplicaciones de la Espectroscopia de
resonancia magnética nuclear de
fósforo-31 (31P-RMN) en el estudio de
Composts
Turner (2004) desarrolló y optimizó un
procedimiento para la caracterización de
P en estiércol de animales (pollos, cerdos
y ganado vacuno) basado en una
extracción alcalina y espectroscopía de
resonancia magnética nuclear de fósforo31 (31P-RMN) en solución. En el estudio
realizado, debido a la baja concentración
de iones paramagnéticos en el extracto de
todos los estiércoles, fue necesario un
largo tiempo de retraso (>5 s) para el
análisis cuantitativo por spectroscopía de
31
P-RMN en solución. Los estiércoles
estudiados contenían
ortofosfato
inorgánico, monoésteres y diésteres de
ortofosfato, y polifosfatos inorgánicos,
pero los resultados fueron influenciados
marcadamente por la concentración de
hidróxido de sodio presente en la solución
extractora, afectando tanto la resolución
del espectro como la composición
aparente de P en los extractos. Con los
resultados obtenidos concluyen que las
condiciones óptimas de extracción
dependen del tipo de estiércol y los
objetivos del estudio.
McDowell y Stewart (2005) usaron
fraccionamiento
secuencial
y
espectroscopia de resonancia magnética
nuclear de fósforo-31 (31P-RMN) para
determinar las formas de P en estiércol
fresco y secado al aire (simulando
condiciones de campo), de animales de
pastoreo (ganado vacuno, ciervos y
ovejas). Los espectros de 31P-RMN del
extracto confirmaron los resultados
obtenidos por
el
fraccionamiento
secuencial,
detectando
una
baja
concentración de monoésteres (9 a 19%
de fósforo total en el extracto) de los
cuales el fitato es el principal
componente. Los datos de 31P-RMN
también mostraron que los cambios de
concentración del fósforo orgánico con el
secado del estiércol, puede ser debido a
degradación de diésteres. Los datos
indican
decrecimiento
en
la
biodisponibilidad de fósforo en los
estiércoles de ganado vacuno, ciervos y
ovejas con el secado y la necesidad de
considerar este efecto con respecto al
retorno del fósforo para la fertilidad del
suelo.
Aplicaciones de la Espectroscopia de
resonancia magnética nuclear de
nitrógeno-15 (15N-RMN) en el estudio de
Suelos y Composts
Thorn y Mikita (2000) trataron sustancias
húmicas de suelo y sedimentos acuáticos
con nitrito de sodio marcado con
nitrógeno-15 (Na15NO2) y analizaron
extractos de las sustancias húmicas por
espectoscopía de 15N-RMN y 13C-RMN
en fase líquida; también trataron dos
compost con
Na15NO2 y fueron
analizados por 15N-RMN en estado
sólido. Los análisis de 15N-RMN
confirmaron que los sitios de sustrato
para la nitrosación en ácidos húmicos son
C aromáticos, C metilénicos activos y N.
Los
autores
concluyen
que
la
combinación potencial de reacciones de
amoniaco, hidroxilamina, amino ácidos y
NO2- con sustancias húmicas, el camino
abiótico para la formación de trazas de N
gaseoso en suelos puede ser compleja; no
obstante, la aplicación de 15N-RMN en
conjunto con espectrometría de masas de
radio isótopos de alta resolución puede
proporcionar un camino para elucidar este
mecanismo con muchos detalles.
Knicker y col. (2001) estudiaron un suelo
contaminado con 2,4,6-trinitrotolueno
(TNT) al cual le adicionaron TNT
marcado con 14C y 15N y fue sometido a
un tratamiento ligero de remediación
anaeróbico-aeróbico, subsecuentemente
fue analizado por radioconteo y por
espectroscopía de 15N-RMN en estado
sólido.
Los resultados obtenidos
demostraron que el tratamiento aeróbicoanaeróbico del suelo representa una
estrategia eficiente para la inmovilización
de TNT reducido en suelos.
Knicker y col. (2002) estudiaron la
formación de compuestos orgánicos
heteroatómicos de nitrógeno en residuos
de una planta vascular después de un
largo período de humificación, utilizando
15
espectroscopía
N-RMN en estado
sólido. Los resultados obtenidos por estos
autores, dan un primer indicio que la
“peatification” (puede ser traducido como
descomposición o compostaje de los
residuos de la planta) es un paso
importante en la formación de
compuestos heteroatómicos de N.
Aplicaciones de la Espectroscopia de
resonancia magnética nuclear en dos
dimensiones: Un ejemplo (Adaptado de
Hertkorn y col., 2002)
Hertkorn y col. (2002) realizaron un
estudio comparativo de la estructura
parcial de ácidos húmicos (AH) y ácidos
fúlvicos (AF) de un compost usando
espectroscopia de resonancia magnética
nuclear de una y dos dimensiones. En esta
investigación se señala que, los espectros
de RMN unidimensional (ver Figura 1)
proporcionan
contenidos
semicuantitativos de los constituyentes
húmicos con una resolución limitada en
detalles estructurales; sin embargo
cuando
se
suplementan
con
la
información disponible de espectros de
RMN bidimensional
homo- y
heteronucleares se dispone de una
asignación de subestructuras húmicas más
confiable. Este trabajo, muestra un
ejemplo de análisis comparativo entre los
AH y AF de un compost con el uso de la
espectroscopia de RMN de protones y
carbono-13 en una y dos dimensiones. Se
reporta que, del análisis detallado del
desplazamiento químico del protón en la
región que normalmente es atribuida a
carbohidratos muestra contribuciones
considerables de aminoácidos, amino y
desoxy azúcares, y cadenas alifáticas
altamente
oxidadas
de
longitud
intermedia.
Los espectros de 1H-RMN de AF y AH
(ver Figura 1a) a simple vista son muy
parecidos. Ambos exhiben prominentes
resonancias en la región de carbohidratos,
de 3,1 a 4,6 ppm (ver Tabla 1), y en
general, las señales dentro de esta región,
son bastante similares con una aparente
menor ancho de banda en el caso de los
AF. En la región (1,95 a 3,1 ppm) de
alifáticos funcionalizados (protones de
grupos funcionales unidos a cadenas
alifáticas) son obvias las diferencias en la
resonancia para cada espectro. La
pronunciada señal observada en la región
de aromáticos para AF (6,77 ppm) está
presente también para el espectro de AH,
pero fuertemente atenuada. La integración
del espectro de 1H-RMN de los AF y AH
para cada región específica de
proporciona la cantidad de protones no
intercambiables como se muestra en la
Tabla 1.
(a)
RMN de AF y AH (Figura 1b). En ellos
se observa que los AH muestran una alta
fracción de resonancia para carbonos
puramente alifáticos (δ< 50 ppm) y
mayor resolución de los picos. Sin
embargo al ver los resultados de la
integración (ver Tabla 2) muestran un
contenido
relativo
de
carbonos
aromáticos para AH de 1,15 respecto al
de AF, que en el espectro de 1H-RMN
esta relación es de 0,85. Esto implica que
el grado de sustitución de aromáticos en
AF es un cuarto menor que en los AH. De
la distribución de la intensidad del
espectro de 1H-RMN se puede deducir
que los fenoles (y posiblemente anillos
heterocíclicos de cinco átomos) en AF
están en promedio menos sustituidos.
Tabla 1. Distribución de hidrógenos nointercambiables entre los diferentes
grupos estructurales de ácidos fúlvicos
(AF) y ácidos húmicos (AH) de un
compost determinados por medio del
1
espectro
H-RMN
unidimensional.
(Adaptado de Hertkorn y col., 2002)
(b)
Figura 1. Espectros (a) de resonancia
magnética nuclear de protones (1H-RMN)
y (b) de carbono-13 (13C-RMN) de
ácidos fúlvicos (arriba) y ácidos húmicos
(abajo) de un Compost. (Adaptado de
Hertkorn y col., 2002)
Cerca de 25% de los protones nointercambiables para AH están presentes
en grupos alifáticos no sustituidos,
mientras que en AF este valor es solo de
14%. En general, aromáticos menos
sustituidos y carbohidratos, parecen ser
los constituyentes principales de los AF,
mientras que en los AH predominan los
alifáticos no sustituidos. Esto es
confirmado por los espectros de 13C-
Intervalo de
δ (1H)
ppm
10.0 a 6.0
6.0 a 4.7
4.6 a 3.1
3.1 a 1.95
1.95 a 0.5
Grupo
Funcional
Asignado
Car-H
acetal
CHnO
Cf-CHn
Cal-CHn
Proporción de H en
los grupos
estructurales
AF
AH
%
18.2
15.6
4.5
6.8
45.0
35.6
18.1
17.1
14.2
24.9
Los espectros de la espectroscopía de
RMN de correlación (COSY) de los AF
muestran un número mayor de picos
cruzados que el de los AH (ver Figura 2).
Con pocas excepciones todos los picos
presentes en el COSY de AH también se
ven en el de AF. La mayoría de la
intensidad total de los picos cruzados se
observan
en
las
regiones
de
desplazamiento químico indicado en la
Tabla 3. La intensidad de los picos
cruzados en el espectro de COSY por
unidad de masa en la muestra de AF, es
considerablemente mayor que para AH.
En los espectros de la espectroscopía de
RMN de total correlación (TOCSY) de
AF y AH se observa un número mayor de
picos cruzados que en sus respectivos
espectros de COSY (Figura 2, Tabla 4).
Además de los espectros y tablas aquí
mostrados, en el trabajo de Hertkorn y
col. (2002), presentan los espectros de
espectroscopía heteronuclear de cohesión
de quantum simples (HSQC) y realizan
un análisis comparativo entre todos los
espectros de RMN en dos dimensiones
realizados por ellos.
Tabla 2. Distribución de cantidad de
carbono de los principales grupos
estructurales de ácidos fúlvicos (AF) y
ácidos húmicos (AH) de un compost
determinados por medio del espectro 13CRMN unidimensional. (Adaptado de
Hertkorn y col., 2002)
Intervalo
Grupo
Funcional
de δ
Asignado
(13C)
ppm
220-187
187-167
167-145
145-108
108-90
90-47
47-0
C=O
(C=O)-XCar-O,N
Car-C,H
O-CO
O(Nf)-CHn
CHn
Proporción de C
en grupo
estructural
AF
AH
%
5.9
3.8
14.2
10.8
8.6
10.1
25.3
28.7
8.4
8.4
27.4
22.2
10.2
16.0
Figura 2.
Espectros de resonancia
magnética nuclear de correlación (COSY)
(arriba) y RMN de total correlación
(TOCSY) (abajo: τmix= 70 ms) de los AF
(izquierda) y AH (derecha) con las
secciones de desplazamiento químico
indicadas en la Tabla 3 (COSY) y 4
(TOCSY). Por razones de claridad solo se
muestra un conjunto de recuadros (con
excepción de BT); un recuadro en los
espectros de TOCSY indica que los
puntos dentro de éste tienen idéntico
desplazamiento químico. (Adaptado de
Hertkorn y col., 2002)
Los autores señalan que el análisis
combinado de varios espectros de RMN
bidimensional,
proporciona
una
resolución superior de los detalles
estructurales cuando se compara con un
análisis exhaustivo de espectros de RMN
unidimensional solamente.
Además, concluyen que, la muy buena
resolución de los detalles estructurales
por el análisis combinado de todos los
espectros de RMN, muestra que el efecto
del procedimiento de fraccionamiento en
la composición y estructura química de
materiales húmicos es muy significante.
Tabla 3. Regiones de desplazamiento
químico en el espectro de RMN de
espectroscopía de correlación (COSY) de
los AF y AH de un compost. (Adaptado
de Hertkorn y col., 2002)
Región
F2
F1
Asignación
AC
4.4-3.0
1.4-1.0
-C-CH-CH-O-
BC
3.2-1.8
3.2-1.8
-Cf-CH-CfH-C-
CC
4.5-3.0
4.5-3.0
-CH(O)-CH(O)-
DC
5.0-4.4
4.4-1.8
-CH(O)-CH-Cf
EC
5.6-4.8
4.4-3.0
-O-CH(O)H-CH
FC
8.5-6.3
8.5-6.3
-CarH-CarH-
Constituyent
e
Ppm
B
Desoxy
azúcar, éter,
éster.
Alifáticos
intrafuncion
ales, β a
heteroátomo
s.
Carbohidrat
os sin C
anomérico.
Alifáticos
funcionaliza
dos unidos a
un
heteroátomo
.
Carbohidrat
os con C
anomérico.
Protones
orto en
anillos
aromáticos
Tabla 4. Regiones de desplazamiento
químico en el espectro de RMN de
espectroscopía de total correlación
(TOCSY) de los AF y AH de un compost.
(Adaptado de Hertkorn y col., 2002)
Región
F2
F1
Asignación
técnicas espectroscópicas de resonancia
magnética nuclear (RMN) en la
elucidación de la estructura de las
sustancias húmicas (SH), tanto del suelo
como de compost.
Por una parte, la RMN en una dimensión,
con el estudio de espectros de 1H-RMN y
13
C-RMN nos permite tener idea de los
grupos funcionales que podrían estar
presentes en las SH. Además, los
espectros de 31P-RMN y 15N-RMN nos
permiten estudiar la biodisponibilidad de
fósforo y nitrógeno para las plantas,
conocer las formas orgánicas de estos
elementos presentes en las SH, y realizar
estudios de las modificaciones que
puedan sufrir sustancias (orgánicas o
inorgánicas) que contengan estos
elementos al ser incorporadas al suelo o a
compost. Por otra parte, la espectroscopía
de RMN en dos dimensiones, ofrece
inmejorables condiciones para obtener
estructuras húmicas muy confiables,
debido a la variedad de espectros que
pueden obtenerse, entre ellos COSY,
TOCSY, HSQC y HMQC.
9
Constituyente
Ppm
AT
2.3-0.5
2.3-0.5
-CHn -CHn-CHn-CHm
BT
4.4-3.0
1.4-1.0
-O-CH-CH-C-
CT
4.5-3.2
3.0-1.4
-N,O-CH-CH-CHf-
DT
4.5-3.0
4.5-3.0
-CH(O)-CH-(O)
ET
4.4-1.0
4.8-4.0
-(C=O)NH-CH-CH-Cf
FT
5.6-4.8
4.4-3.0
-O-CH(O)-CH(O)-
GT
8.5-6.3
8.5-6.3
-CarH-CarH-
B
Cadenas alifáticas
Internas
(m=1-3;n=1-2)
Desoxy azúcares,
éteres, ésteres
Alifáticos
funcionales
con un
heteroátomo.
Carbohidratos sin
C anomérico.
Alifáti.
funcionalizados
unidos a
heteroátomo.
Carbohidratos con
C anomérico.
Protones orto en
anillos aromáticos.
9
9
9
Conclusiones
Al finalizar la presente revisión, no hay
dudas acerca de la importancia que tiene
en la actualidad, la aplicación de las
Agradecimientos
Dr. Jorge Paolini, Centro de
Ecología, Instituto Venezolano de
Investigaciones
Científicas
(IVIC).
Dr. Froilán Contreras y Dr. Pablo
García,
Postgrado
en
Biotecnología
de
Microorganismos, Facultad de
Ciencias, Universidad de los
Andes, Mérida, Venezuela.
Departamento
de
Química,
Facultad
de
Ciencias
y
Tecnología,
Universidad
de
Carabobo, Valencia, Venezuela.
CNU-OPSU, Proyecto Alma
Mater,
Programa
para
la
Formación de Doctores.
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