Obtención de EPA / DHA

Tecnologías para el enriquecimiento de
aceites de pescado en EPA y DHA
José Luis Guil Guerrero
Área de Tecnología de Alimentos
Universidad de Almería
Pesada carga de calorías y
grasa saturada
Temp-A.ppt 11/10/2013 2
Vs.
EPA+DHA%
ACEITE
CONCENTRADO
PURIFICADO
≈25
≈40-90
≈ 100%
EPA ó DHA
Ventajas
Inconvenientes
- Estructura de triglicérido
- Menor alteración
- Más barato
- ¿Presencia de
insaponificable/colesterol?
- Más calorías/dosis
- Sensorialmente pobre
- ¿Metales pesados?
- ¿Presencia de
insaponificable/colesterol?
- Menos calorías
- Ausencia de metales
pesados
- Eliminación de saturados
- Mayor coste
- Posibilidad de alteración
oxidativa
- No suele estar en forma de
triglicéridos
Se trata de un producto para ensayos farmacológicos,
tratamientos de algunos casos de cáncer, o de uso como
reactivo de laboratorio
Un poco de historia…
Uno de los primeros procedimientos para
concentrar EPA y /o DHA fue el método de
formación de cristales con urea
Response Surface Methodology
Proceso tóxico debido a la
presencia de metil / etilcarbamatos
Temp-A.ppt 11/10/2013 6
Obtención de EPA / DHA
1.3e4
16:0
1.2e4
1.1e4
18:1n918:3n6 18:4n3
18:2n618:3n3
17:0
(patrón
interno)
18:0
Biomasa
1.0e4
9000
8000
7000
6000
5000
20:0
20:
1
4000
Extracto lipídico
3000
10
5
Time (min.)
9.815
1.747
1.3e4
15
1020
11.444
5
1.2e4
1.1e4
1.0e4
Ácidos grasos
9000
8000
4000
10.651
3.386
5000
7.582
6000
4.847
2.343
7000
3000
1.722
1.4e4
10
Time (min.)
15
20
Concentrados de EFAs
9.459
5
1.3e4
1.2e4
1.1e4
1.0e4
9000
EPA ó DHA
8000
8.721
6000
5000
10.295
7000
4000
5
10
Time (min.)
15
EFA 98% pureza
20
Obtención de EFAs
Biomasa
Extracción /
Saponificación
Simultánea
Extracción: /presión/ disolventes/
FSC
Extracto lipídico
Saponificación-HCl / Enzimas
Ácidos grasos
“Winterization”
Cristalización con urea
Ésteres
etílicos
Sales
Na/K
Diferencias
de solubilidad
Concentrados de EFAs
Destilación molecular
Cromatografía
líquida en columna
abierta/
Purificación
enzimática/
Cromatografía FSC
EPA ó DHA
HPLC
Cromatografía líquida columna
abierta
Purificación
enzimática
Procesado de pescado para obtener concentrados de DHA y EPA
Concentración de EPA/DHA: “Winterization”
Aceite pescado + Solvente
• Acetona
• Hexano
1.3e4
16:0
1.2e4
1.1e4
18:1n918:3n6 18:4n3
18:2n618:3n3
17:0
(patrón
interno)
18:0
1.0e4
1
2
2
1
3
9000
8000
3
7000
6000
5000
20:0
2
0:
1
4000
3000
β’
Cristalización (-70 a 4º C)
β
5
Centrifugación
10 min, 6.000 Xg
10
5
Time (min.)
15
1020
Ácidos grasos libres
Triglicéridos
Wanasundara, U.N. (1996)
‘Marine Oils: Stabilization,
Structural Characterization
and Omega-3 Fatty Acid
Concentration’, Ph.D. thesis,
Memorial University of
Newfoundland, St. John’s, NF,
Canada
Enriquecimiento de ácidos grasos ω3 totales de aceite de grasa de foca mediante cristalización a baja temperatura.
A, forma de triglicéridos, B, forma de ácidos grasos libres
Procesado de pescado para obtener DHA y EPA
Transesterificación de aceite de pescado
AG1
Q, 60 min
AG2
+ CH3-COCl + EtOH
AG3
Glicéridos, aceite
de pescado
Cloruro de
acetilo
AG-COOEt
Destilación
molecular
Ésteres etílicos
Etanol
Reacilación enzimática
Las lipasas pueden catalizar la esterificación, hidrólisis o intercambio de ésteres de ácidos
grasos.
La reacción es reversible y, en condiciones de baja actividad de agua, las enzimas
funcionan “al revés”, sintetizan un enlace éster en lugar de su hidrólisis.
OH
Lipasa
OH + AG-COOEt
OH
Glicerina
Ésteres etílicos
inespecífica
AG1
AG2 + EtOH
AG3
Triglicéridos
Destilación molecular:
concentración de ésteres de
EPA y DHA
Equipado con un condensador
interno.
Es útil para aislar componentes de
líquidos sensibles al calor o para
separar sustancias con un punto de
ebullición muy alto.
En la destilación molecular, el material se destila bajo alto vacío;
la distancia recorrida por las moléculas entre la evaporación y la
condensación es corto
•La mezcla es destilada a presión
reducida, de 1 a 0001 mbar, por lo que
disminuye Tª de ebullición.
•El tiempo es disminuido exponiendo las
sustancias al calor.
•El proceso de enfriamiento es acelerado.
La degradación térmica de etil-EPA comienza a 159 °C
y alcanza un máximo a 206 °C; etil-DHA comienza a
166 °C y es máxima a 217 °C
Métodos enzimáticos concentración y
purificación de EPA y/o DHA
Hidrólisis selectiva de los TAGs
AG1
Lipasa
sn-1,3 específica
DHA + 2H2O
AG2
OH
DHA + AG1 +AG2
OH
2-MAGs
El efecto de torsión de EPA y DHA, debido a la
presencia de los dobles enlaces, aumenta el efecto
de impedimento estérico, por lo tanto, las lipasas no
pueden actuar en la unión éster entre estos ácidos
grasos y glicerol.
DHA
OH
DHA
OH
2-MAGs
Lipasa
sn-1,3 específica
OH
DHA
OH
+ CA
CA
DHA
+
H2O
CA
Posibilidad de obtención de triglicéridos estructurados
Wanasundara, U.N. and Shahidi, F.
(1997) ‘Lipase Assisted Concentration
of ω3-Polyunsaturated Fatty Acids in
Acylglycerols Form from Marine Oils’
in J. Am. Oil Chem. Soc. 75, 945–951
hidrólisis
Saponificación suave
Fracción enriquecida en ω3
Grasa de foca
Aceite de lacha
Candida cylindracea
Rhizopus oryzae
“… all lipases were effective in
increasing the n-3 PUFA
content of the remaining
acylglycerols…
Enriquecimiento de ω3 total, EPA y DHA de grasa de foca y aceite de lacha
después de 75 h de hidrólisis mediante diferentes lipasas microbianas
Extracción-saponificación-concentración
simultáneas
Procesos de máxima seguridad se
desarrollan con la ayuda de
biocompatible etanol
Residuo
EtOH
Filtración
EtOH
EtOH + EFAs
NaOH
(sales sódicas)
Biomasa
Enfriamiento a T programada
(deshidratada)
Reactor, 60 ºC
Guil-Guerrero, Jose Luis; Campra-Madrid, Pablo; López-Martínez, Juan Carlos. MÉTODO RÁPIDO Y
BIOCOMPATIBLE DE EXTRACCIÓN, SAPONIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE ÁCIDOS
GRASOS POLIINSATURADOS (PUFAS) POR DIFERENCIAS DE SOLUBILIDAD A PARTIR DE
BIOMASA. Fecha de publicación 28/12/2007
AGUA
RESIDUO
EtOH
EtOH
HCl
BIOMASA
(1)
NaOH
EtOH +
PUFAs(SAL)
ENFRIAMIENTO
FILTRACIÓN A T programada
REACTOR
MEZCLADOR
CONDENSADOR
HEXANO
MEZCLADOR
SONICAR
DESTILADOR
(2)
HEXANO
+ PUFA
FILTRACIÓN A-70 ºC
(3 )
CENTRIFUGACIÓN
EXTRACTOR
OPCIONAL
ENFRIAMIENTO A - 70 ºC ºC
OPCIONAL
PUFA
(4 )
RESIDUO
Se superan las
concentraciones
alcanzadas por
la destilación
molecular
Fraccionamiento de ésteres etílicos mediante cromatografía en columna
Fractionation of Shortfin Mako (Isurus oxyrinchus) Liver Oil
Ésteres etílicos
Cromatografía
Fase estacionaria: (SiO2-AgNO3)
95%
90A%
90B%
90C%
Eluyentes
% Hex:Acet (v/v)
Variables a optimizar
EPA
Pureza (%)
Rendimiento (%)
DHA
Pureza (%)
Rendimiento (%)
89
60
75
38
1
1
-
8
3
25
8
99
57
100
29
• Polaridad de eluyentes
• Carga de la columna
• Tipo de éster
Isolation of some PUFA from edible oils by argentated silica gel chromatography
By J.L. Guil-Guerrero*, P. Campra-Madrid and R. Navarro-Juárez. Grasas y Aceites
116 Vol. 54. (2003), 116-121.
Concentración mediante FSC
Válvula reductora
Columnas de Extracción
Cambiadores
de calor
Refrigerante
Separadores
Extracto
Tanque de CO2
Bomba
Intercambiador de calor
Temp-A.ppt 11/10/2013 25
Extracto
CO2
Product Overview
Package Description:
60 Softgels
Serving Size:
2 Softgels
Number of Servings:
30 (30 day supply)
Potency per Serving:
1,000 mg of Super Critical Fish Oil
Recommended Dosage:
Take 2 Softgels daily
Country of Manufacturer:
United States of America
Customer Ratings:
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Omega Select Fish Oil
Each Serving Provides:
View Supplement Facts
Aislamiento de fracciones
funcionales de aceites
Interesterificación química
Interesterificación enzimática
Triglicéridos
complejos
Aislamiento de
fracciones funcionales
de aceite rico en ácido
araquidónico
AAA ALO
HPLC cromatograma
PLO Aceite: triacil gliceroles
Fraccionamiento e
identificación de picos por
GLC
Araquidónico
puro en forma de
triglicérido
AAA
Fracción remanente
Fracción funcional
Tridocosahexaenoil glycerol purification
Tri-DHA
Fracción remanente
TriDHAA
Tri-DHA
Aceite: triacil gliceroles
Fraccionamiento e identificación de
picos por GLC
in press
Importante: escalamiento eficaz
Factor de escalamiento (f) mediante la expresión:
f = (D2)2L2 / (D1)2L1
Donde D1 y L1 son, respectivamente, el diámetro y la longitud del reactor de menor
tamaño y D2 y L2 el diámetro y la longitud del reactor de mayor tamaño.
Importante: control de calidad
Espectro UV-visible
Espectrometría de masas
Espectro obtenido
1,2
Absorbancia
1
0,8
0,6
Dienos Trienos
0,4
Espectro del patrón
0,2
0
185
210
235
260
285
310
l (nm)
1000
Índice de peróxidos
LØvaas, (1992).
Espectrofotometría con Triyoduro
PV = 5-10 mEq O2/kg
(I-3)
PV (mEq/kg)
800
600
Ff,Aa,H
FAh
400
Fah
fAh
fah
200
0
0
4
8
12
16
días
20
24
28
Tecnologías para el enriquecimiento de
aceites de pescado en EPA y DHA
José Luis Guil Guerrero
Área de Tecnología de Alimentos
Universidad de Almería