Primera Reunión de la Rama de Bioquímica y Biología Molecular de

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Rev Biomed 1998; 9:126-144.
Primera Reunión de la Rama de Bioquímica y Biología Molecular de virus
de la Sociedad Mexicana de Bioquímica, A.C.* Resúmenes de Trabajos
Libres (Segunda Parte).
Organizadores:
Carlos F. Arias-Ortiz1, Patricio Gariglio2, Beatriz Gómez3.
1
Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos,
Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados, IPN, México, D.F., 3Facultad de Medicina,
Universidad Nacional Autónoma de México.
2
INDUCCIÓN O BLOQUEO DE LA APOPTOSIS EN
DIFERENTES ESTIRPES CELULARES DURANTE LA
INFECCIÓN POR EL CITOMEGALOVIRUS HUMANO.
Suárez-Souto, M:A., Sánchez-Cruz, P., Alba-Sandoval,
M., Chacón-Salinas, R., Valdés-Espinosa, R.A. Área de
Inmunología Laboratorio, Multidisciplinario de
Investigación, Escuela Militar de Graduados de Sanidad,
S. D. N., México.
La apoptosis es un mecanismo esencial para la supervivencia
de un organismo multicelular, su desregulación parece estar
detrás de muchas patologías, como las de etiología vírica.
Por otra parte el citomegalovirus humano (HCMV), el cual
es un patógeno ubicuo, ha desarrollado estrategias para
inhibir la apoptosis de las células que infectan; tal evento
les permite completar su ciclo viral y asegurar su progenie.
Además el HCMV provoca inmunosupresión en el huésped
por varios mecanismos, entre ellos la disminución de la
población de linfocitos T. El HCMV infecta in vitro
productivamente varias estirpes celulares entre ellas los
fibroblastos, células endoteliales y astrocitos, sin embargo,
en otras la infección es abortiva, por ejemplo en monocitos
y linfocitos donde la infección es limitada a un pequeño
porcentaje de ellos. Por tal motivo es muy relevante el
estudio del bloqueo o inducción de la apoptosis por el HCMV
en las células donde el virus cumple el ciclo replicativo
(fibroblastos y astrocitos) y en aquellas donde la infección
es abortiva (monocitos y linfocitos).
En el presente estudio se utilizan las líneas celulares MRC5 (fibroblastos de pulmón fetal), U-373MG (astrocitoma
humano), U-937 (linfoma histiocítico humano) y Jurkat
(hibridoma de células T), además células mononucleares
de sangre periférica de individuos seronegativos y
seropositivos al virus. La infección se realiza con 1 y 10
MOI del HCMV AD-169 a diferentes tiempos pre y postinfección empleándose dexametasona como agente inductor
de apoptosis, la cual es evaluada a tres niveles: a) eventos
iniciales del proceso apoptótico, tal como daño a la
membrana detectado por tinción con merocianina 540; b)
determinación de la morfología nuclear y estructura de la
cromatina usando los colorantes fluorescentes naranja de
acridina y bromuro de etidio y c) eventos tardíos de la
apoptosis como la degradación del DNA en fragmentos de
180 a 200 pb visualizado por tinción con bromuro de etidio
en un corrimiento electroforético. Además se determinará
el porcentaje de células apoptóticas por tinción del DNA
con yoduro de propidio analizado por citometría de flujo.
En nuestros resultados, hemos observamos que la
dexametasona 10-6 M induce apoptosis en células U-937,
visualizando el patrón característico en escalera en un corrimiento electroforético a las 72 h. Además la infección
con 1 y 10 MOI del HCMV de dichas células es capaz de
bloquear la apoptosis cuando la dexametasona es adicionada 24 y 48 h post-infección, no así cuando se agrega 24 h
pre-infección.
MECANISMOS MOLECULARES DE CITOTOXICIDAD DE CTL’S A CÉLULAS INFECTADAS CON
HCMV. Chacón-Salinas, R., Sánchez-Cruz, P., Gil-Pérez, J., Valdés-Espinosa, R.A. Área de Inmunología.
Laboratorio Multidisciplinario de Investigación, Escuela
Militar de Graduados de Sanidad, S. D. N., México.
* Realizada en Oaxtepec, Morelos, México, del 22 a 24 de Enero de 1998.
Solicitud de sobretiros: Dr. Carlos F. Arias-Ortiz. Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México. Av. Universidad 2001, Col.
Chamilpa, C.P. 62210, Cuernavaca, Morelos, México.
Este artículo esta disponible en http://www.uady.mx/~biomedic/rb989210.html
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
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El citomegalovirus humano (HCMV) es un patógeno frecuente en la población humana, generalmente cursa con
una infección primaria asintómatica seguida por un estado de persistencia o latencia viral. En pacientes con
inmunodeficiencias congénitas o adquiridas y aquellos
que sufren transplantes de órganos, la infección primaria y la reactivación del HCMV latente se ha asociado
con un importante aumento en la morbilidad y mortalidad.
Diversos estudios han demostrado que el desarrollo de
la inmunidad mediada por células, y en particular los
linfocitos T citotóxicos (CTL’s) específicos al HCMV,
representan un factor esencial en el control de las infecciones persistentes y en la recuperación de la enfermedad provocada por el virus. A nivel molecular se sabe
que al reconocer el CTL a su antígeno en asociación con
una molécula del complejo principal de histocompatibilidad sufre una activación que provoca la muerte de la
célula presentadora del antígeno. Hasta el momento se
han identificado dos mecanismos por las cuales los CTL’s
matan a las células blanco: a) exocitosis granular, que
involucra la desgranulación de los CTL’s liberándose
proteínas que provocan la muerte de la célula blanco por
necrosis, b) apoptosis a través de la interacción de las
moléculas Fas (CD95) de las células blanco con las molécula Fas ligando (Fas-L) de los CTL’s provocando la
muerte de las primeras.
En nuestro Laboratorio estudiamos el mecanismo por el
cual los CTL’s específicos destruyen a células infectadas
por el HCMV. Para ello utilizamos como células blanco
a fibroblastos obtenidos de voluntarios sanos e infectados in vitro con el HCMV AD169 y como células efectoras a CTL’s específicos obtenidos de donadores seropositivos y reactivados in vitro. La citotoxicidad es determinada mediante la determinación de la actividad de la
enzima lactato deshidrogenasa liberada de las células lisadas. Finalmente bloquearemos selectivamente cada uno
de los dos mecanismos conocidos de citotoxicidad. Para
evitar la exocitosis granular utilizaremos 100 ng/mL de
concanamicina A o 1 mM de EGTA, y para bloquear la
muerte por apoptosis emplearemos el anticuerpo monoclonal anti-Fas. Actualmente se evalúa la funcionalidad
y las condiciones en las cuales ocurre la muerte por apoptosis de células infectadas por la vía de la molécula CD95.
PARTICIPACIÓN DE LAS CÉLULAS NK EN EL
CONTROL DE LA INFECCIÓN POR CITOMEGALOVIRUS HUMANO. Gil-Pérez, J.A., SánchezCruz, P., Chacón-Salinas, R., AIba-Sandoval, M., Cabriales-Macias, M.M., Valdés-Espinosa, R.A. Área
de Inmunología, Laboratorio Multidisciplinario de
Investigación, Escuela Militar de Graduados de Sanidad, S. D. N., México.
Revista Biomédica
En la respuesta inmune contra las infecciones virales participan protagónicamente las células NK y los linfocitos T
citotóxicos CD8+ (CTL’s). Ambos comparten mecanismos
moleculares similares de citotoxicidad, sin embargo, su activación es diferente. Para los CTL’s su activación depende
de que las células infectadas les presenten antígenos virales
en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad de
clase I (MHC-I), evento que antecede su función lítica sobre las células infectadas, lo que evita la diseminación del
virus. En contraste, las células NK son activadas y destruyen células diana que han perdido la expresión de las moléculas del MHC-I. Algunos virus han desarrollado mecanismos para evadir la función de los CTL’s principalmente
por disminución de expresión de moléculas del MHC-I. El
citomegalovirus humano (HCMV), patógeno oportunista
con distribución mundial, es capaz de disminuir la expresión de las moléculas de MHC-I por mecanismos que
involucran a las proteínas virales US2, US3, US6 y US 11.
La disminución de las moléculas del MHC-I en células infectadas por HCMV, teóricamente haría susceptible a dichas células de lisis por acción de las células NK. Sin embargo, aún no se conocen completamente las funciones
antivirales de las células NK en la infección por HCMV.
Por tal motivo, en nuestro Laboratorio estudiamos dicho
evento en un modelo in vivo utilizando células NK y
monocitos aislados de sangre periférica de donadores sanos del Hospital Central Militar. El aislamiento de los
monocitos se realizará por un gradiente de ficoll y por adherencia, las células NK se obtendrán por selección negativa eliminando los linfocitos T por formación de rosetas. La
pureza de las poblaciones es evaluada por expresión de
moléculas CD14 para los monocitos y CD16, CD56 para
las células NK. También se ensayará la actividad de las
células NK utilizando células monocíticas U-937 y
fibroblastos MRC-5. Resultados iniciales muestran una
marcada reducción de las moléculas MHC clase I desde las
doce horas post-infección, tanto en monocitos U-937 como
en los fibroblastos. Los monocitos son infectados con 10
MOI de HCMV detectándose la infección por expresión de
la proteína inmediata temprana IE-1. La disminución de la
expresión de moléculas del MHC es evidenciada utilizando
el anticuerpo monoclonal W6/32 por citoflourometría de
flujo. Finalmente analizaremos la acción de las células NK
sobre los monocitos infectados, midiendo su actividad
citotóxica por liberación de la enzima lactato deshidrogenasa
de las células lisadas.
ESTUDIO DE LA INFECCIÓN POR HCMV EN CÉLULAS U-937 DIFERENCIADAS A MACRÓFAGOS
Y SU EFECTO SOBRE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS DEL MHC. Cabriales-Macías, M.M., SánchezCruz, P., Chavarría-Bernal, M, Arellano-Galindo, J.,
Gil-Pérez, J.A., Valdés-Espinosa, R.A. Área de
Inmunología. Laboratorio Multidisciplinario de Inves-
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tigación, Escuela Militar de Graduados de Sanidad, S.
D. N., México.
Virología, IPN. Carpio y Plan de Ayala s/n, Casco de
Santo Tomás. CP 11340, México, D.F.
El citomegalovirus humano (HCMV) causa infecciones benignas pero persistentes en individuos inmunocompetentes,
sin embargo, es un patógeno importante en individuos
inmunosuprimidos, implicando la existencia de un balance
de la respuesta inmune en el control del HCMV y la evasión del sistema inmune por el virus. El HCMV ha desarrollado múltiples estrategias de escape hacia la respuesta
inmune, entre las que destaca la modulación de la expresión de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC). El HCMV causa disminución
de la expresión de las moléculas del MHC de clase I, evento que presumiblemente contribuye a la permanencia viral
en el huésped. No obstante, el efecto que tiene el virus sobre las moléculas de clase II en células profesionales presentadoras de antígeno (como los macrófagos) es desconocido. De modo que, una posible disminución en su expresión, evitaría la presentación de los antígenos virales por
dichas células a los linfocitos T CD4+ y con ello, el establecimiento de una respuesta inmune contra el virus.
En nuestro laboratorio se realiza el estudio de la infección
por HCMV en células U-937 que tienen características
monocíticas y pueden ser diferenciadas a macrófagos por
estímulos con éster de forbol miristato (PMA) o ácido
retinoico (RA) y vitamina D3 (VD3). En macrófagos así
obtenidos infectados por HCMV AD-169, se estudia el efecto
del virus en la expresión de moléculas del MHC por
citofluorometría de flujo utilizando los anticuerpos
monoclonales (mAb) W6/32 (anti MHC clase I); 9.3FI0 y
2.06 (anti MHC clase II).y L-14 (anti IE-1), C-41 (anti gB)
para detectar la presencia del virus.
En células monocíticas U-937 infectadas hemos observado
una franca disminución sobre la expresión de MHC clase I
y MHC clase II tanto en superficie como intracelularmente
durante los primeros 5 días post-infección. Por otra parte,
las células U-937 se han diferenciado a macrófagos con estímulos de PMA (160 nM) o RA/VD3 (1 µM/0.1 µM ). Las
células tratadas presentan características de diferenciación:
a) adherencia, desde las primeras 5 h post-estímulo siendo
total hacia las 48 h; b) expresión de CD14, se observa un
aumento en la expresión de dicha molécula de un 300 a un
400 % a las 48 h post estímulo y c) positividad de la enzima esterasa no específica. Por último, actualmente se evalúa en las células diferenciadas, el efecto que tiene la infección por el citomegalovirus humano en la expresión de
moléculas MHC de clase I y clase II.
Los virus herpes simplex (HSV) establecen infecciones que
persisten por largos períodos en su huésped, en un estado
no replicativo o latente.
El virus llega hasta el núcleo de las células neuronales de
los ganglios sensoriales en donde la expresión de genes
virales y la replicación del DNA se reprimen, estableciendo un estado de latencia que se caracteriza por la persistencia del genoma viral completo pero sin producción de partículas virales.
HSV-1 establece una infección de lenta progresión y con
escasos focos de efecto citopático en células N1E-115 clona
noradrenérgica de neuroblastoma C-1300 de ratón no diferenciadas. Estas células, por lo tanto, ofrecen un modelo
para analizar el tipo de infección que produce HSV-1, y
sobre todo determinar si establece una infección latente.
Para el desarrollo de este proyecto se determinará si dicha
infección es dependiente de la multiplicidad de infección
y/o de la diferenciación; así mismo se realizará el cocultivo
de las células N1E-115 infectadas y que no presenten efecto citopático, con células permisivas (VERO), así como extracción de DNA viral y transfección en células VERO.
CARACTERÍSTICAS DE LA INFECCIÓN POR
HSV-1 EN CÉLULAS NEURONALES DE RATÓN.
Marisela Morales & Blanca L. Barrón. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Laboratorio de
PARTICIPACIÓN DE LAS GLICOPROTEÍNAS DE
ENVOLTURA DE HSV-1 EN LA INFECCIÓN RECURRENTE. Gloria Martínez y Blanca L. Barrón. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Laboratorio de
Virología, IPN, Carpio y Plan de Ayala s/n Casco de
Santo Tomás, México D.F. 11340.
Los virus herpes simplex (HSV) se caracterizan por su capacidad para causar una gran variedad de infecciones, permanecer en estado latente en su huésped y reactivarse generando infección recurrente. Estos virus emplean múltiples estrategias que les permiten evadir la respuesta inmune del huésped, sin embargo, ésta es generalmente efectiva
para limitar la infección. La reactivación se produce por
una gran variedad de estímulos y no necesariamente produce manifestaciones clínicas (recurrencia); la participación efectiva de macrófagos, células NK e interferón a/b
pueden evitar la infección recurrente. Los HSV producen
alteraciones en los mecanismos efectores de la respuesta
inmune que pueden llevar a frecuentes recurrencias pero
aún no se conoce con certeza cuales se encuentran
involucradas.
En el Laboratorio de Virología de la ENCB se está realizando un estudio comparativo de algunos mecanismos
efectores de la respuesta inmune (anticuerpos, actividad
antiviral de interferón, niveles de IL-12) contra los componentes membranales de HSV-1 en individuos de la misma
familia que padezcan y no de recurrencias herpéticas.
Con este propósito se determinará el título de anticuerpos
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neutralizantes en muestras de suero y se analizará la respuesta específica contra las glicoproteínas de HSV-1 cepa
Macintyre por inmunoelectrotransferencia; por otro lado
también se determinará la actividad antiviral del interferón
y los niveles de IL-12 en sobrenadantes de cultivo de células mononucleares de sangre periférica estimuladas con
HSV-1 inactivado con UV.
FRECUENCIA HOSPITALARIA DE VIRUS AISLADOS DE PACIENTES MENORES DE DIEZ AÑOS
DE EDAD CON ENFERMEDAD AGUDA DEL
TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR (EATRI).
Vázquez-López, R. 1; Iguala, V.M. 2 ; López, M.I. 2 y
Gomez-Gracía, B2 . 1Depto. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina, U.N.A.M. 2INDRE,
S.S., México, D.F.
Los agentes etiológicos de las enfermedades respiratorias
son de origen bacteriano, por micoplasma o viral, siendo
estas últimas las de mayor importancia. Virus de diferentes
familias se han identificado como responsables de dichas
enfermedades, sin embargo, por sintomatología no es posible identificarlos, por lo tanto su identificación requiere de
estudios de laboratorio.
En el presente trabajo se estudió la frecuencia hospitalaria
de diferentes virus respiratorios en infantes menores de diez
años de edad y con historia clínica de enfermedad aguda
del tracto respiratorio inferior (EATRI). La población estudiada fue de noventa y un pacientes, proveniendo de varios
niveles socioeconómicos, ambos sexos y de edades de cero
a diez años. Los resultados obtenidos no tuvieron sesgo de
estrato económico, sexo o edad. Las muestras tomadas fueron aspirados y exudados nasofaríngeos. El tiempo que
transcurrió entre el ingreso del paciente al hospital y la toma
de muestra, fue en promedio no mayor a un día, con una
desviación estándar de 3.32 días. Colateralmente a la toma
de las muestras se aplicó un cuestionario a la madre del
paciente.
Para la detección de RSV se realizaron las pruebas de ensayo inmunoenzimático y aislamiento viral en células MRC5. Para el VIRUS DE PARAINFLUENZA se utilizó aislamiento en células VERO e inmunofluorescencia con
anticuerpos monoclonales (dirigidos contra los subtipos 1,
2 y 3). Para el ADENOVIRUS también se utilizó aislamiento
en células VERO e inmunofluorescencia con anticuerpos
monoclonales (contra la proteína de hexón). Y finalmente
para detectar al VIRUS DE INFLUENZA se procedió al
aislamiento en embrión de pollo.
Los resultados obtenidos: 1.- En la población estudiada el
cuadro clínico principal fue bronquitis, 2.- El grupo de sujetos menores de un año de edad y con manifestaciones clínicas de EATRI correspondieron al mayor número de casos
positivos a RSV. 3- En ningún sujeto de los tres grupos
etarios se pudo aislar Virus de Influenza. 4- Se detectó la
Revista Biomédica
presencia de Virus de Parainfluenza y Adenovirus en la
población estudiada, principalmente en muestras que presentaron muerte celular y un caso de Adenovirus y tres de
RSV en muestras con efecto citopático. 5- En el 69% de
toda la población estudiada se detectó efecto citopático o
muerte celular. 6- El 66% de las muestras con muerte celular y el 33% de las muestras con efecto citopático fueron
negativas a todos los virus probados.
ALTERACIÓN EN LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO POR EL
ANTICUERPO ANTIVIRAL. Enrique Hernández
Hernández*, Enrique Ortega Soto** y Beatríz GómezGarcía*. *Facultad de Medicina, **Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma
de México, 04510 México D.F. México.
El virus sincitial respiratorio (RSV) es el agente etiológico
más importante a nivel mundial de enfermedades del tracto
respiratorio bajo en infantes y niños, ocasionándoles bronquitis y neumonía en los primeros años de vida. El RSV
pertenece a la familia paramixoviridae y su genoma codifica para diez proteínas, tres de las cuales son glicoproteínas
que forman parte de la envoltura del virus (F, G y SH). En
este trabajo estamos interesados en analizar el afecto que
tiene el anti-RSV en la síntesis de proteínas virales, debido
a que al anticuerpo se le han atribuido diferentes efectos en
infecciones de origen viral, existiendo reportes en los cuales se asocia al anticuerpo como un factor que favorece o
induce infecciones virales persistentes, además también se
le menciona como un modulador de la expresión de proteínas virales en células infectadas por medio de un mecanismo conocido como inmunomodulación o modulación
antigénica inducida por el anticuerpo. Los resultados preliminares obtenidos por inmunoblot indican que existe un
aumento gradual y progresivo en la detección de las
glicoproteínas F y G a las 24, 48 y 72 hrs postinfección en
las células tratadas con el anti-RSV, además mediante la
técnica del FACS se ha podido detectar un aumento en la
intensidad de fluorescencia en las células infectadas con el
RSV y crecidas en presencia de anti-RSV, en comparación
con aquellas infectadas con el RSV y crecidas en ausencia
de anticuerpo.
PERSISTENCIA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C
EN UNA POBLACIÓN DE INDIVIDUOS SINTOMÁTICOS SEROPOSITIVOS PARA EL VIRUS. Laura
Trejo-Avila 1-2 , Rocío Méndez-Martínez 1 , Rosario
Frias-Mendivil 1, Mauricio Frias-Mendivil1, Patricia
Baz-Gutiérrez 1, Guadalupe Alvarez-Flores 1, Reyes
Tamez-Guerra2. Instituto Nacional de Cancerología1,
Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL2.
El virus de la hepatitis C (HCV) está asociado con infec-
130
ciones del hígado con un riesgo muy elevado de cronicidad
y de evolución a cirrosis y cáncer hepático. En base a variaciones en secuencias nucleotídicas se han identificados varios genotipos del virus, existen muchas evidencias de la
asociación de ciertos genotipos especialmente el lb, con
progresión, severidad de la enfermedad y resistencia a la
terapia. No se tiene información sobre el grado de viremia,
genotipos infectantes y daño hepático en individuos
asintomáticos en nuestro país, nuestro objetivo en este estudio fue conocer los genotipos infectantes y su prevalencia
en un grupo de donadores seropositivos para el virus (por
una prueba de ELISA de 2a generación) e investigar la asociación entre seropositividad para anti-HCV, viremia,
genotipo de HCV infectante y los niveles de ALT (enzima
indicadora de daño hepático). METODOLOGÍA. Se determino viremia en muestras de plasma de 60 donadores por
RT-PCR de un fragmento de la región "core" y un segundo
PCR interno, los genotipos fueron determinados con un segundo PCR con "primers" específicos para cada genotipo,
fueron evaluados los niveles de ALT con un Spectrum
Abbott. RESULTADOS Y CONCLUSIONES. Treinta
(50%) de los donadores seropositivos fueron positivos por
doble PCR, los genotipos encontrados en este grupo fueron
la (I), lb (II) y 3a (V), con una alta prevalencia del genotipo
lb (36.7%) mayor en hombres que en mujeres (41.7%/
16.7%), una prevalencia de 16.7% para el genotipo 3a (V)
mayor en mujeres que en hombres (33.3%/12.0%) y una
muy elevada frecuencia de coinfecciones (46.6%) principalmente lb3a (33.3%). Se detectaron niveles normales de
ALT en el 90% de los donadores con viremia. Lo más relevante del estudio fue la alta prevalencia global encontrada
del genotipo lb (solo y en coinfección) en donadores
asintomáticos, estos resultados son importantes en vista de
la asociación potencial de este genotipo con padecimientos
severos del hígado.
RFLP, HERRAMIENTA MOLECULAR PARA IDENTIFICAR NUEVAS VARIANTES DE VIRUS DE RABIA EN FAUNA SILVESTRE MEXICANA. Loza-Rubio E1, Bahioul C2, Aguilar SA1,3, Tordo N2. 1CENID
Microbiología. INIFAP-SAGAR, Carretera México Toluca Km. 15.5, Col. Palo Alto CP 051 10. C.e.
[email protected] , 2Laboratorio de Lyssavirus. Instituto Pasteur, París, Francia, 3IMSS.
El diseño de medidas eficientes para el control de la rabia
en una región geográfica supone de un perfecto conocimiento de las variantes de esta enfermedad. Estas variantes a su
vez constituyen ciclos epidemiológicos los cuales se presentan: 1) en el murciélago hemátofago o vampiro D. rotundos (ciclo aéreo) que constituye el principal vector de la
rabia silvestre, siendo el mayor transmisor para la especie
bovina, y el segundo para la humana, y 2) en el perro (ciclo
terrestre) que es el vector que más problemas causa como
transmisor a la especie humana. Con el propósito de contar
con una herramienta molecular para diferenciar ambos ciclos o variantes se desarrolló un análisis del polimorfismo
del largo de los fragmentos de restricción (RFLP) empleando
un amplicón de 600 pb del gene G del virus de la rabia que
permite diferenciar entre las variantes de vampiro (ciclo
aéreo) y perro (ciclo terrestre), empleando un panel de cuatro endonucleasas: BsaWI y BsrGI que cortan
específicamente cuando el ciclo corresponde a vampiro;
mientras que BamHI y Stul actúan cuando el ciclo es de
perro. Esta herramienta molecular (RFLP) se ha empleado
en 60 muestras de cerebros positivos a rabia, que provenían de diferentes especies y regiones geográficas de México. Los resultados fueron que el 93% de ellas correspondieron claramente a alguno de los dos ciclos, y alrededor del
7% (3 zorrillos y un bovino) no perteneció a ningún perfil.
La secuencia de estas cuatro muestras reveló que dos nuevas variantes del virus rábico circulan en zorrillos provenientes del Noroeste (Baja California Sur) y del Centro
(Aguascalientes) del país, las cuales son potencialmente
transmisibles a las especies domésticas. Asimismo estas
variantes son diferentes a las de perro y vampiro, así como
de las que circulan en zorrillos de los Estados Unidos. Se
concluye que RFLP es un método sencillo que permite una
rápida determinación del ciclo a que pertenece cierta muestra en particular, además de constituir un elemento de alerta para identificar nuevas variantes del virus de la rabia en
México.
LA PROTEÍNA "N" DEL VIRUS DE LA RABIA PROMUEVE EL CRECIMIENTO DE LOS RATONES
LACTANTES. Mata-Villegas A E1, Montaño G A2, Rivera C C V3, Villagrán V C1, Romo G S1, Montaño-Hirose
J W1. 1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
UNAM. 2UAM-Iztapalapa. 3Instituto de Fisiología Celular, UNAM.
Wíktor (1985) y Torres-Anjel (1988) describieron una pérdida de 40% en el peso corporal de ratones adultos rabiosos. En las gráficas de Wiktor se aprecia un aumento de
aproximadamente 9% de peso en los animales inoculados
con cepas apatógenas. Montaño-Hirose (1993, no publicado) observó consistentemente un aumento de tamaño y peso
en ratones inoculados con la proteína N del virus rábico.
En nuestro laboratorio se demostró anteriormente un aumento en el peso de ratones lactantes inoculados con vacuna antirrábica tipo Fuenzalida para uso canino. A partir de
cultivos de células BHK-21 infectados con la cepa CVS-11
se purificó la proteína N del virus rábico (1.5 mg/mL); 0.04
mL de esta preparación fueron inoculados a ratones lactantes
de las líneas BALB/c y C3H. Solamente ratones BALB/c
fueron inoculados con vacuna antirrábica tipo Fuenzalida.
Las dos líneas fueron inoculadas con la cepa CVS-11. El
peso y longitud se midieron cada tercer día durante 21 días.
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
131
Al finalizar el período de observación, se obtuvieron muestras de suero de los ratones para determinar los niveles de
proteína total y glucosa. Los ratones inoculados con proteína N aumentaron significativamente (p<0.05) en longitud,
más no en peso. Los ratones BALB/c inoculados con vacuna Fuenzalida aumentaron tanto en peso como en longitud
(p<0.05) con respecto a sus controles inoculados con una
suspensión de cerebro normal. Dos camadas de la línea C3H
aumentaron significativamente (p<0.05) en peso y longitud con respecto al control (PBS); sin embargo, la tercera
sólo mostró diferencia en cuanto a longitud. Los niveles
séricos de glucosa y proteína en todos los ratones inoculados en esta investigación no fueron estadísticamente diferentes (p<0.05). Ratones lactantes de ambas líneas inoculadas con CVS mostraron pérdidas significativas (p<0.05)
en el peso corporal y se comprobó estadísticamente (p<0.05)
una diferencia entre la susceptibilidad de las hembras y
machos.
Investigación financiada por PAPIIT, DGAPA, UNAM.
Proyecto No. IN218596.
PREDOMINANCIA DE ANTICUERPOS CONTRA
LA GLICOPROTEÍNA HN EN LA RESPUESTA A
LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON RUBULAVIRUS PORCINO. Hernández J, Ramírez H, García
0, Sánchez ME, Vallejo V, Zenteno E y Reyes-Leyva J.
Depto. Bioquímica, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, SS; Lab. inmunología, Depto. Bioquímica, Fac. Medicina, UNAM; Lab. Virología, Depto. Producción Animal Cerdos, Fac. Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM; Lab. Virología, Centro de
investigación Biomédica de Oriente, IMSS. 2 norte
2004, Puebla, Puebla 72000
El rubulavirus porcino es el causante de la enfermedad del
ojo azul, que provoca alteraciones neurológicas, respiratorias, reproductivas y opacidad corneal en cerdos de diversas edades. En este estudio se analizó la respuesta inmune
humoral contra el rubulavirus en cerdos infectados experimentalmente. Títulos elevados de anticuerpos neutralizantes
e inhibidores de la hemaglutinación se identificaron durante el estudio. Con la finalidad de caracterizar la especificidad de los anticuerpos producidos en respuesta a la infección y el tiempo en el cual cada antígeno es reconocido,
las proteínas virales fueron separadas por SDS-PAGE, transferidas a membranas de nitrocelulosa e incubadas con los
sueros que se tomaron a diferentes tiempos de infección.
Estos ensayos revelaron que la respuesta de anticuerpos fue
dirigida hacia los antígenos de 66, 40 y 68 KDa, que corresponden a las proteínas HN, M y NP, respectivamente.
La proteína HN fue reconocida por 6 de los 7 cerdos infectados en la segunda semana pi, y por todos los cerdos a
partir de la tercera semana pi. La respuesta contra la proteína de matriz fue identificada a partir de la cuarta sema-
Revista Biomédica
na pi, pero sólo 3 de los 7 cerdos infectados reconocieron a
esta proteína demostrando su pobre inmunogenicidad. Los
anticuerpos contra la proteína NP se identificaron en 4 cerdos a la quinta semana y en 6 a partir de la 6 semana pi. El
reconocimiento de la proteína NP presentó una correlación
directa con el incremento en los títulos de anticuerpos
neutralizantes. En las condiciones en que se realizó este
estudio no fue posible identificar anticuerpos contra las proteínas F, P o L. Este trabajo demuestra la importancia de la
glicoproteína HN en la respuesta inmune contra el
rubulavirus porcino.
Proyecto financiado por CONACYT 3228PB y PAPIIT,
PADEP, UNAM IN209295.
DETECCIÓN MOLECULAR DEL VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO EN TEJIDO PULMONAR DE
NIÑOS QUE FALLECIERON CON NEUMONÍA O
BRONQUIOLITIS. 1Bustamante-Calvillo ME, ‘Velázquez-Castillo FR, ‘Peña-Argüelles AL, ‘Cabrera-Muñoz ML, ‘Enciso-Moreno JA, ‘Goniez-Delgado A, ‘Torres-López FJ, y ‘Muñoz-Hernández 0. 1Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Infecciosas y Parasitarias, Hospital de Pediatría, ‘Servicio de Anatomía Patológica Hospital de Especialidades, C.M.N. Siglo XXI-IMSS, México, D.F.
Antecedente: El virus sincicial respiratorio (VSR) es el principal agente viral que causa infecciones graves de vías respiratorias en niños < 2 años de edad. Objetivo: Evaluar la
capacidad que tiene el método de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) para detectar la infección por VSR en
tejido pulmonar de niños que fallecieron con neumonía o
bronquiolitis. Material y Método: En el desarrollo de la PCR
para la detección de VSR se aplicaron dos estrategias: en la
primera se utilizaron células VERO que fueron infectadas
por VSR, control positivo (P) y no infectadas, control negativo (N). Ambos controles fueron incluidos y no incluidos en parafina; en estos últimos, se realizó la extracción
del ARN total directamente con Trizol® (Gibco) y en los
controles incluidos en parafina, la extracción del ARN se
realizó en cortes de 10 µ de espesor, desparafinados con
xileno. Con el ARN total obtenido de los controles P y N,
incluidos y no incluidos en parafina, se efectuó transcripción reversa, para obtener ADNc que se amplificó en la
PCR, usando oligonucleótidos específicos que codifican para
la glicoproteína F de VSR, con un segundo PCR anidado.
En la segunda estrategia, se aplicó ésta metodología a muestras de pulmón incluidas en parafina de 30 niños < 2 años
de edad. Se consideraron 10 niños con diagnóstico
anatomopatológico de neumonía viral (Grupo I), con una
alta probabilidad de infección por VSR, otro grupo de 10
niños con neumonía bacteriana o por otros agentes
etiológicos (Grupo II), en el cual la probabilidad de infección por VSR fuese indeterminada y 10 muestras de pul-
132
món de niños sin infección (Grupo III) que tuviesen muy
baja probabilidad de estar infectados por VSR. En las muestras negativas para VSR por PCR se demostró la ausencia
de inhibidores inespecíficos, empleando un control interno
de VSR para después realizar la PCR. En estas muestras
negativas se comprobó además la integridad del ADNc por
medio de la PCR, usando oligonucleótidos específicos ( Frax
-3 y Frax -4) que codifican para una región del gen FMR-1
del cromosoma X humano. Resultados: Del ARN total obtenido a partir de los controles P y N de las células VERO,
incluidas o no en parafina, se obtuvo el ADNc mediante
transcripción reversa, que fue amplificado en la PCR-1 y
PCR-2, observando en los controles P las bandas características de VSR de 390 pb y de 207 pb respectivamente, en
geles de agarosa al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio.
En las muestras de tejido pulmonar incluido en parafina
correspondientes al Grupo I, 7/10 (70%) fueron positivas a
VSR; 3/10 (30%) fueron positivas del Grupo II y ninguna
muestra fue positiva (0%) del Grupo III. Al comparar el
grupo I que presentaba una alta probabilidad de infección
por VSR contra el Grupo III que presentaba una mínima
probabilidad de infección por VSR, se observó una diferencia significativa (P =0.0015). En las muestras de pulmón
negativas a VSR por PCR se demostró la ausencia de
inhibidores inespecíficos cuando se observó la banda de 207
pb característica al agregar el control positivo de VSR, así
como la integridad del ADNc con la amplificación de la
banda de 148 pb característica de una región del gen FMR1 del cromosoma X humano. Conclusión: El método de la
PCR desarrollado para la detección de VSR se evaluó en
células VERO y en muestras de tejido pulmonar postmortem. Esta prueba permitirá determinar la frecuencia de
letalidad por neumonía o bronquiolitis debida a VSR en
niños < 2 años hospitalizados con estos padecimientos
UNA MUTANTE PUNTUAL EN EL GEN DE MOVIMIENTO BL1 DEL VIRUS HUASTECO DEL CHILE,
INTERFIERE LA INFECTIVIDAD DEL VIRUS SILVESTRE. Bonilla-Ramírez, G.M., Calderón-Alanis, E.,
y Rivera-Bustamante, R.F. Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados-Unidad Irapuato. Km. 9.6 Carretera Irapuato-León, Irapuato, Gto.
El virus huasteco del chile (PHV) es un geminivirus bipartita
recientemente aislado en el laboratorio de virología del
CINVESTAV-IPN-Unidad Irapuato. Como parte de la caracterización molecular de los genes del componente B,
generamos una serie de mutaciones en ambos genes. En
particular obtuvimos una mutación puntual cerca del extremo amino del gen de movimiento BLI que resultó en
una pérdida de la infectividad del virus ha ser inoculado
mediante biobalística ya sea en forma monomérica o
dimérica junto con su contraparte genómica (PHV-A) en
plantas de chile (Capsicum annuuni, var. Sonora Anaheim),
o de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi-nc y var.
Bruley). Como parte de la caracterización de esta mutante,
hicimos ensayos de interacción de la misma con el virus
silvestre. Para ello coinoculamos ambos virus (silvestre y
mutante) mediante biobalística en plantas de chile. Encontramos un retraso en la expresión de síntomas en relación a
las plantas infectadas solo con el virus silvestre. Para observar el efecto que esta mutante podría tener en la liberación de componentes genómicos infectivos a partir de plantas transgénicas para dicho componente, se bombardearon
dichas plantas con clonas diméricas del componente A y
clonas monoméricas del componente B mutante, y en relación a los controles con el virus silvestre observarnos un
retraso en la manifestación de síntomas y una disminución
en la eficiencia de infección. Estos resultados sugieren una
interferencia del virus mutante al silvestre mediada por la
proteína BLI mutante. Estos datos pueden ser relevantes
para la obtención de plantas transgénicas expresando la
proteína BLI mutante como una posibilidad para generar
resistencia al virus.
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PARTÍCULAS PSEUDOVIRALES DEL ROTAVIRUS YM
EXPRESADAS EN EL SISTEMA DE BACULOVIRUS. Fernando Hernández Terán, Carlos F. Arias y
Susana López. Departamento de Genética y Fisiología
Molecular. Instituto de Biotecnología, UNAM. Cuernavaca, Mor. 62210.
Los rotavirus del grupo A son la causa principal de
gastroenteritis deshidrataste en la población infantil, produciendo un alto índice de morbilidad y mortalidad a nivel
mundial. Los viriones maduros tienen un diámetro de 75
nm y están formados por tres capas concéntricas de proteínas y un genoma de 11 segmentos de RNA de doble cadena. La proteína VP2 forma el core viral, que envuelve al
genoma y a pequeñas cantidades de las proteínas VP1 y
VP3. La capa intermedia está formada por 260 trímeros de
VP6, que representa la proteína más abundante del virión.
Las proteínas VP4 y VP7 forman la capa más externa del
virus, VP7 interactúa directamente con los trímeros de VP6;
y la proteína VP4 forma espículas que se proyectan desde
la superficie del virus.
Se ha demostrado que la coexpresión de cada una de las
proteínas de la cápside de rotavirus (VP2, VP4, VP6 y VP7)
dirigida por baculovirus recombinantes, en células de insecto, resulta en la formación espontánea de partículas
pseudovirales (VLPS) estables.
En nuestro laboratorio, hemos clonado cada uno de los genes
del rotavirus YM que codifican para las proteínas VP2, VP4,
VP6 y VP7 en el sistema de baculovirus, para ser expresados en células de insecto de Spodoptera frujiperda (Sf9).
La coexpresión de estas proteínas resultó en la formación
de VLPs similares a las partículas de rotavirus de capa triple. Las propiedades estructurales y funcionales de las VLPs
se analizaron mediante técnicas inmunológicas (ELISA,
Western blot) con un panel de anticuerpos mono y
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
133
policlonales antirotavirus, ensayos de unión a células
MA104, hemaglutinación y microscopía electrónica.
Los resultados mostraron que las VLPs conservan algunas
de las propiedades estructurales y funcionales de los
rotavirus nativos. Este sistema nos permitirá estudiar las
interacciones moleculares que existen entre las proteínas
de la cápside de rotavirus, que son esenciales para su estructura y función; también ofrece la posibilidad de obtener
inmunógenos potenciales contra estos virus.
CARACTERIZACIÓN GENÓMICA Y ANTIGÉNICA
DE CEPAS NO SEROTIPIFICABLES DE ROTAVIRUS DE HUMANO. P, Romero-Guido; S, López; C.F,
Arias y L, Padilla-Noriega. Departamento de Genética y Fisiología Molecular del Instituto de Biotecnología U.N.A.M. Cuernavaca, Morelos. México.
La superficie de los rotavirus está constituida por dos proteínas, VP4 y VP7, capaces de inducir anticuerpos
neutralizantes, mientras que en su parte interna el principal componente proteico es VP6. Los rotavirus de humano
(RVH) han sido clasificados por métodos antigénicos en
dos subgrupos de VP6 (1 y 11) y por métodos antigénicos y
genómicos en cuatro serotipos principales de VP7 (G1-G4)
que corresponden a los tipos genómicos del mismo nombre. En cuanto a VP4 tres serotipos principales (PlA, PlB y
P2) han sido descritos, los cuales correlacionan con los tipos genómicos P[8], P[4] y P[6], respectivamente. De un
estudio a nivel nacional se obtuvieron cepas de RVH que
no fueron reconocidas por anticuerpos monoclonales
neutralizantes (AcM-N) anti-VP4 serotipo-específicos. Con
el fin de identificar posibles nuevas variedades de VP4 se
inició la caracterización genómica y antigénica de estas
cepas consideradas como no serotipificables (CNS). Se
demostró la presencia de VP4 en cinco CNS usando un AcM
que reconoce VP4 independientemente del serotipo y se
determinó por RT-PCR el tipo genómico de VP4. Una cepa
fue P[4] y presentó patrones de restricción característicos
de este tipo genómico y cuatro cepas fueron P[8] pero con
patrones de restricción diferentes a los de las cepas control
de este tipo genómico. En dos de las cuatro cepas en que se
observó esta inconsistencia genómica se secuenció un fragmento de VP4 (1-887 nt) encontrándose cambios puntuales que las diferenciaron de las cepas control, pero conservando el tipo genómico, lo que sugiere que cambios puntuales en el gene que codifica para VP4 pueden provocar
cambios conformacionales en la proteína explicando así las
diferencias antigénicas como la falta de reactividad con
ACM-N. Se determinó por ELISA el subgrupo y el serotipo
G. Tres cepas P[8] fueron serotipo GI, subgrupo II, una
cepa P[8] fue G3, subgrupo II y la cepa P[4] fue G2,
subgrupo I. Estos resultados correlacionaron con la
genotipificación de VP7 por RT-PCR, excepto en la cepa
P[4] G2, I que amplificó un fragmento tipo Gl. Es importante entender la ocurrencia de cambios genómicos y
Revista Biomédica
antigénicos en VP4 y VP7 para el diseño de vacunas contra
RVH.
AISLAMIENTO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA UNA VARIANTE DEL ROTAVIRUS DE SIMIO RRV QUE NO REQUIERE DE ÁCIDO SIÁLICO PARA INFECTAR LA CÉLULA. Jimena Pérez-Vargas, Rafaela Espinosa. Ernesto Méndez,
Susana López y Carlos F. Arias. Departamento de Genética y Fisiología Molecular. Instituto de Biotecnología U.N.A.M. Cuernavaca Morelos.
Los rotavirus se unen a la célula huésped a través de su
proteína de superficie VP4. En el caso de los rotavirus aislados de animales, como el rotavirus de simio RRV, esta
proteína tiene al menos dos dominios que interaccionan con
receptores de la célula. El primer dominio interacciona
con una molécula que contiene ácido siálico (AS), mientras que el segundo interacciona con un receptor ¡dependiente de AS. Los datos existentes sugieren que la
interacción que no depende de AS pudiera ser la responsable de determinar la susceptibilidad de la célula a ser infectada por rotavirus. Con el fin de identificar el dominio de
VP4 que interacciona con el receptor independiente de AS,
hemos aislado anticuerpos monoclonales (AcM)
neutralizantes contra una cepa mutante del rotavirus RRV
(Nar) que no depende de AS (no necesita de la primera
interacción), con el propósito de posteriormente mapear el
sitio de unión de estos anticuerpos.
Para obtener los hibridomas, se fusionaron células de bazo
de un ratón inmunizado con el rotavirus Nar, con células
del mieloma Fox. Los hibridomas de interés se seleccionaron por un ensayo de ELISA, utilizando el virus Nar como
antígeno, y por ensayos de neutralización y de inhibición
de la hemaglutinación viral. De aproximadamente 500
hibridomas probados se aislaron 13 dirigidos contra el virus: ocho tienen actividad neutralizante (dos de ellos reaccionan también por ELISA); uno inhibe la hemaglutinación;
y cuatro reconocen al virus exclusivamente en el ensayo de
ELISA. Estos anticuerpos están siendo analizados para determinar su isotipo, la proteína que reconocen y su actividad neutralizante contra diferentes cepas de rotavirus.
MAPEO DE LOS DOMINIOS DE DIMERIZACIÓN
DE LA NSP5 Y DE INTERACCIÓN CON LA NSP6
DEL ROTAVIRUS YM. M.A.Torres-Vega, R.A. González, S.López y C.F. Arias. Instituto de Biotecnología,
UNAM. Cuernavaca, Mor.
Los rotavirus son los principales agentes etiológicos de la
diarrea en niños y animales jóvenes. Estos virus tienen un
genoma segmentado de RNA de doble cadena, envuelto por
tres capas concéntricas de proteína. Su genoma codifica por
seis proteínas estructurales y seis proteínas no estructurales. Por estudios bioquímicos se ha sugerido que la proteí-
134
na no estructural NSP5 forma dímeros, lo que ha sido confirmado por nuestro grupo utilizando el "sistema de dos
híbridos" de levadura. En este trabajo mapeamos el dominio de dimerización de la NSP5, e identificamos la
interacción de esta proteína con otra proteína no estructural, la NSP6. La NSP5 es una glicoproteína con actividad
de cinasa, codificada por el gene 11, que es fosforilada en
residuos de serina y de treonina, lo que produce especies
con un peso de 26, 28 y 32-34 Kda. La NSP5 se une a poly
U-Sepharosa, y se ha identificado en partículas subvirales
con actividad de replicasa. A partir del nucleótido 80 del
gene 11, en el segundo marco de lectura, se sintetiza la
NSP6. Esta proteína tiene un peso molecular de 12 Kda y,
al igual que la NSP5, se localiza en el viroplasma. Por
medio de mutantes de deleción del gene 11 del rotavirus
YM, que fueron analizadas utilizando el sistema de dos
híbridos, determinamos que el dominio de dimerización de
la NSP5 está dentro de una región que abarca los últimos
34 aminoácidos (163-197), que ha sido propuesta como el
dominio de cinasa. Empleando este sistema también identificamos la asociación entre la NSP5 y la NSP6. Esta
interacción es de menor magnitud, pero específica, ya que
no se obtuvo señal positiva cuando se sustituyó alguna de
éstas con proteínas irrelevantes (p. ej. vimentina). Utilizando una nueva versión del sistema de los dos híbridos,
que incremento la señal de las interacciones débiles, confirmamos dicha asociación. El dominio de interacción
NSP5-NSP6 mapeó en la misma región que el dominio de
dimerización de la NSP5. Actualmente estamos investigando si la NSP6 participa en la regulación de la
dimerización de la NSP5 o en su actividad de cinasa.
Este trabajo fue apoyado por CONACYT y DGAPA-PADEP.
ANÁLISIS DE LA FUNCIÓN DE LAS CÉLULAS Th
ESPECIFICAS PARA LA PROTEÍNA INTERNA DE
ROTAVIRUS VP6 EN LA INDUCCIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES. F. Esquivel, S. López, N. Campos y C. Arias. Departamento de Genética y Fisiología Celular, Instituto de Biotecnología/
UNAM, Cuernavaca, Morelos.
La infección por rotavirus es una de las principales causas
de gastroenteritis en infantes y un gran número de animales neonatos de importancia económica, tanto en países
desarrollados como subdesarrollados. Las proteínas VP4 y
VP7, que conforman la capa externa del virión y que definen los serotipos P y G respectivamente, son los blancos de
anticuerpos neutralizantes, que muy probablemente juegan
un papel preponderante en protección y depuración de la
infección. Nosotros hemos demostrado que células T cooperadoras (Th) específicas para la proteína interna del
rotavirus VP6 son capaces de, auxiliar a las células B específicas para VP4 o VP7 o a ambas a producir anticuerpos
neutralizantes a través del fenómeno llamado "ayuda
intermolecular". En este trabajo extendemos este resultado
analizando la naturaleza homotípica/heterotípica de esta
ayuda y determinando si las células Th secundarias inducidas con VP6 inducen una respuesta de tipo secundaria en
las células B vírgenes específicas para las proteínas externas del virus. Así, ratones BALB/c fueron inoculados s.c.
y reinoculados 15 días después i.p. con un lisado de bacterias que expresan VP6 del rotavirus porcino YM (Po/G11P9)
fusionado a GST (GST-VP6). Como control, se inocularon
ratones con un lisado de bacterias que producen GST solo.
Después de 15 días, los ratones fueron retados i.p. con un
lisado del rotavirus YM o del rotavirus bovino UK (Bo/
G6P7). A partir del reto, se obtuvo el suero de los ratones
en los días 7 y 15 y los niveles de anticuerpos neutralizantes
contra YM y UK se determinaron en un ensayo in vitro de
reducción de focos de infección. Se encontró que los ratones inoculados con GST-VP6 montaron una respuesta de
anticuerpos neutralizantes de entre 4 y 8 veces con respecto al control contra ambos virus. Este resultado demuestra
que las células Th específicas para VP6 son capaces de ayudar a las células B de manera tanto homotípica como
heterotípica. Por otro lado, al tratar los sueros con 2mercaptoetanol (50 mM) antes del ensayo de neutralización para eliminar la actividad de anticuerpos neutralizantes
del isotipo IgM, se encontró que el aumento de los títulos
de neutralización no se deben a un corrimiento del isotipo
IgM a IgG ya que tanto a los 7 como a los 15 días se mantuvo la proporción IgM/IgG con respecto al control. Estos
resultados tienen implicaciones importantes en el desarrollo de una vacuna contra rotavirus.
ESPECIFICIDAD DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES INDUCIDOS POR ROTAVIRUS EN UNA
INFECCIÓN NATURAL Griselda Menchaca Rodríguez, Luis Padilla-Noriega, Susana Lopéz, Carlos F.
Arias, Reyes S. Taméz y Juan F. Contreras. Facultad
de Ciencias Biológicas/UANL. Av. Dr. Pedro de Alba
y Manuel Barragán s/n Ciudad Universitaria; Instituto de Biotecnología/UNAM. Av. Universidad 2001
Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos.
El adecuado estudio del estado inmunológico de pacientes
infectados por rotavirus, podría permitir diseñar mejores
estrategias para la producción y/o evaluación de vacunas
encaminadas a prevenir la gravedad de las infecciones. El
objetivo del presente trabajo fue: determinar la especificidad de los anticuerpos neutralizantes inducidos por las proteínas de superficie VP4 y VP7 de rotavirus. Para lograr lo
anterior, utilizamos anticuerpos monocionales específicos
para los serotipos G y P, así como cepas de rotavirus
rearregiantes. Con lo cual realizamos ensayos
inmunoenzimáticos y neutralización de focos infecciosos
en un total de 71 pacientes.
Los resultados mostraron clara predominancia de infecciones de naturaleza primaria. La especificidad de los
anticuerpos neutralizantes hacia las proteínas VP4 y VP7
mostró mayor frecuencia de seroconversión hacia VP4 que
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
135
para VP7. Aunque, los títulos de seroconversión fueron más
altos para VP7. Ambas proteínas indujeron la producción
de anticuerpos neutralizantes tanto de naturaleza homotípica
como heterotípica, donde el serotipo Gl VP7 indujo con
mayor frecuencia respuesta tanto para Gl VP7 como para
G3 VP7, mientras que G3 VP7 indujo preferentemente una
respuesta homotípica.
Howard Huhes médical Institute (75197-527106)
CONACYT (3270-N9308)
PREVALENCIA DE ASTROVIRUS Y ADENOVIRUS DE SEROTIPO 40 Y 41 EN NIÑOS MEXICANOS CON GASTROENTERITIS. D.D. Griffin, M.
Méndez-Toss, J.F. Contreras, H. Guiscafré, R. Cedillo, F. I. Puerto, I. Herrera, F. Mota, O. Muñoz, S.
López, C.F. Arias. Grupo Mexicano para el Estudio
de las Enfermedades Gastrointestinales. Depto de
Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, UNAM Cuernavaca, Morelos 62210.
Las epidemias de gastroenteritis virales agudas ocurren en
todo el mundo afectando principalmente a infantes. El agente etiológico más importante de dichas infecciones son los
rotavirus de humano, seguidos al parecer por los astrovirus
(H-Ast) y los adenovirus (Ad40/41). A través de ensayos
inmunoenzimáticos (ELISA) con anticuerpos específicos,
ya sea contra H-Ast o bien contra Ad40/41, es posible identificar la presencia de estos virus en muestras de heces.
En México no se han reportado hasta la fecha estudios donde
se determine la prevalencia de estos agentes virales, por lo
que con este trabajo pretendemos empezar a entender la
epidemiología de estos virus en nuestro país. Durante el
período comprendido de Octubre de 1994 a Marzo de 1995
se colectaron en tres regiones diferentes de México muestras de heces provenientes de niños menores de dos años.
710 de estas muestras, las cuales habían resultado negativas para rotavirus: 355 diarreicas (casos) y 355 no diarreicas
(controles), se analizaron por ensayo de ELISA específico
para detectar la presencia tanto de H-Ast como de Ad40/
41. Los resultados de estas pruebas muestran que 26 (7.3%)
casos y 18 (5.1 %) controles resultaron positivos para
astrovirus. Asimismo, 10 (2.8%) casos y 4 (1.1%) controles fueron positivos para Ad40/41. Los datos obtenidos
muestran que la prevalencia de astrovirus en México en
niños con gastroenteritis es similar a la reportada (7.3-8.6%)
en otras regiones del mundo, mientras que su prevalencia
en los controles es mayor al 2% observado en otros estudios. En lo referente a la prevalencia de adenovirus, esta
resultó ser del 2.8% para los casos y del 1.1 % para los
controles. Así, los resultados obtenidos en este estudio indican que los astrovirus son un agente etiológico importante de gastroenteritis virales en México. En el período estudiado, los adenovirus fueron encontrados en una proporción baja, sin que esto quiera decir que no son importantes.
Revista Biomédica
Estudios futuros al respecto son necesarios para determinar la prevalencia de estos agentes virales en México.
INTERACCIÓN DE FACTORES CELULARES CON
LAS REGIONES NO TRADUCIDAS 5’ y 3’ DEL
VIRUS DEL DENGUE SEROTIPO 4. Mónica A. de
Nova Ocampo 1 y Rosa Ma. del Angel 2. 1Programa
Multidisciplinario en Biomedicina Molecular y 2Departamento de Patología Experimental.CINVESTAVIPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco. C.P
07360. México, D. F.
RESUMEN
Las regiones no traducidas 5’ y 3’ de diversos virus de RNA
se consideran regiones regulatorias de eventos como Traducción, Replicación.
Algunos estudios han revelado que deleciones en la región
que comprende los nucléotidos 82-87 de la RNT 5’ del virus del dengue genera virus deficientes en traducción. Las
mutaciones en la RNT 3’, generan virus deficientes a nivel
de la replicación. En ambos casos se sugiere que estas modificaciones se podrían deber a alteraciones en la interacción
de factores celulares con estas regiones regulatorias. Con
esto en mente se decidió analizar la participación de las
RNTs 5’ y 3’ de D4 en la formación de complejos RNAproteínas provenientes de 3 líneas celulares (VERO, LLCMK2 y C6/36), que pudieran indicar su posible participación en la replicación y/o traducción. Los ensayos de retardamiento mostraron un comportamiento diferencial entre
las 3 líneas celulares y las 2 RNTs estudiadas. La interacción
de proteínas provenientes de células infectadas de Vero y
LLC-MK2 unida a la RNT 3’ mostraron la formación de
complejos específicos. Por otra parte la RNT 5’ fue capaz
de formar complejos específicos tanto con extractos de LLCMK2 y C6/36 infectadas y no infectadas.
Los ensayos realizados en presencia de RNasas (A y T1)
mejoraron la resolución de los complejos. El origen y naturaleza de las proteínas asociadas a ambas regiones está por
definirse.
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PARCIAL DE
MOLÉCULA(S) DE SUPERFICIE DE CÉLULAS
VERO QUE INTERACCIONA(N) CON EL VIRUS
DEL DENGUE 4. Martínez Barragán José de Jesús y
Núñez de Cáceres Rosa María del Angel. Laboratorio de Virología del Departamento de Patología Experimental. Centro de Investigación y De Estudios
Avanzados del I. P. N. Avenida Instituto Politécnico
No. 2508 México, D. F.
La adsorción de la partícula viral a la superficie de la célula huésped constituye el inicio de un ciclo viral el cual concluye con la producción de nuevos virus. En ésta primera
etapa de la infección viral (la adsorción) se hace indispensable la interacción de moléculas de superficie tanto de ori-
136
gen celular (Receptor viral) como de origen viral (Proteína
de unión viral). La naturaleza de las moléculas de superficie o los receptores es variada donde para otros virus se han
descrito proteínas (CD4, ICAM-1), residuos carbohidrato
de glicoproteínas (sialiloligosacáridos), y lípidos. Para el
caso del virus del dengue se sugiere que la molécula
involucrada en el proceso de adsorción es la proteína de
envoltura o E y más específicamente el dominio B de ésta.
Su contraparte en las células es en sí el propósito de este
trabajo.
Mediante ensayos de interacción virus célula (binding) y
virus proteína (overlay) se ha podido determinar parcialmente la probable naturaleza proteica de 2 moléculas de la
superficie de las células Vero cuyos pesos moleculares rondan los 72 kDa y 45 kDa. La naturaleza proteica de estas
moléculas fue determinada en experimentos tipo overlay y
de binding empleando virus del dengue tipo 4 marcado
radioactivamente. Cuando las proteínas de membrana de
células Vero se trataron con proteasas tales como tripsina,
proteinasa K y pronasa E, observamos que la unión del virus disminuye considerablemente. Por otro lado los residuos carbohidrato también parecen jugar un papel importante en la unión del virus a las moléculas de superficie de
las células Vero, ya que cuando las células son tratadas con
Periodato de sodio la unión se redujo en un 35% mientras
que la interacción con las proteínas de 72 y 45 kDa se perdió casi por completo. Por ensayos preliminares se puede
sugerir que los residuos de ácido siálico no participan en la
interacción con el virus.
DIAGNOSTICO DE ENTEROVIRUS POR RT-PCR.
Sánchez, l., *Reyes, M., *Saldaña, N., Ruíz, B. Depto.
Biología Molecular, Instituto de Investigaciones
Biomédicas U.N.A.M.; *Laboratorio de Virología, Instituto Nacional de Pediatría. SSA.
Los enterovirus causan meningitis que son clínicamente
difíciles de diagnosticar de otro tipo de meningitis causadas por bacterias, hongos u otros virus, teniendo como resultado hospitalizaciones innecesarias y tratamientos
inapropiados. Los intentos por aislar el virus de líquido
cefalorraquideo (LCR) son muy laboriosos, y generalmente
es necesario observar el cultivo por 3 semanas antes de ser
considerado negativo. Por tal razón, un diagnóstico rápido
y específico para este tipo de meningitis es de gran importancia en el manejo del paciente.
Nosotros hemos utilizado la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de enterovirus de niños con meningitis a partir de
LCR. Los LCR son recolectados de pacientes con manifestaciones compatibles a enterovirus, los cuales son admitidos en el Instituto Nacional de Pediatría. El RNA de
enterovirus es purificado a partir de 250 µl de LCR y con
este se lleva a cabo el ensayo de RT-PCR utilizando primers
que reconocen la región 5’ no traducible del genoma, las
muestras son consideradas positivas cuando se obtiene un
producto de amplificación de 479 pb (Polio 1) o uno de 500
pb (CoxBs).
Los resultados han demostrado que el ensayo es muy sensible y específico, ya que no se obtienen productos de amplificación en LCR de pacientes con meningitis causadas por:
Candida albincans, Cryptococcus neoformans, virus
Epstein-Barr, Escherichia coli, Haemophilus influenzae,
virus de hepatitis C, herpes simplex tipo 1 y 2,
cytomegalovirus, Lysteria monocytogenes, Mycobacterium
tuberculosis, Neisseria meningitidis. El ensayo es rápido y
reproducible, de tal manera que en 2 días se obtienen resultados.
DETECCIÓN DEL SITIO NFAT-1 EN EL GENOMA
DE UNA CEPA PATOGÉNICA DEL HIV-1 INCAPAZ DE REPLICARSE IN VITRO. Gómez-Román
VR, Basualdo-Sigales MC y Soler-Claudin Carmen.
Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos. Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, SSA. Facultad de Química, UNAM. Instituto
de Investigaciones Biomédicas, UNAM.
Introducción. Las interacciones entre los factores celulares
de transcripción y la secuencia larga terminal repetida
(LTR,) del HIV-1 son capaces de modular la replicación
viral en una célula infectada. A pesar de que estas
interacciones han sido definidas ampliamente utilizando
mutantes del LTR generadas in vitro, aún existen pocos estudios que involucren cepas naturales del HIV-1 con
deleciones no inducidas artificialmente en esta región.
Objetivos. Identificar cepas naturales del HIV-1 incapaces
de replicarse en células mononucleares periféricas (PBMC)
in vitro y demostrar que estas cepas no se replican porque
presentan mutaciones en la región LTR in vivo.
Métodos. Se tomó sangre periférica de tres pacientes HIV1 seropostivos y se midieron niveles de linfocitos T CD4+
y CD8+. Asimismo, se cultivaron 2 X 106 PBMC de cada
paciente con 6-10 X 106 de PBMC de donadores sanos. Para
determinar la capacidad de replicación viral en PBMCs, se
midieron los niveles de antígeno p24 liberado en el
sobrenadante y se hicieron observaciones microscópicas de
efecto citopático o de la formación de sincicios. Además,
se realizó PCR anidado de la región LTR a partir de sangre
periférica. El amplicon de cada paciente se purificó y se
clonó en pUC18 para generar clonas recombimantes. Las
clonas se secuenciaron utilizando el método convencional
de Sanger.
Resultados. En los tres pacientes se detectó el genoma
proviral HIV-1 en sangre periférica. Sin embargo, las quasiespecies virales de uno de los pacientes (Mex.LTS11) fueron incapaces de aislarse o replicarse en PBMC in vitro.
Estas quasi-especies presentaron mutaciones puntuales y
una deleción de 18 pb correspondientes al sitio de unión
del factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT-1). Además, el paciente Mex.LTS 11 cuenta con niveles bajos de
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
137
linfocitos T CD4+ (169 céls/µL).
Conclusiones. La quasi-especie mexicana HIV1.Mex.LTS11 presenta una deleción en NFAT-1 y es incapaz de replicarse in vitro; sin embargo, esta quasi-especie
es patogénica ya que proviene de un paciente que progresa
hacia SIDA. La presencia o ausencia natural del sitio NFAT1 en el genoma proviral influye en la replicación del HIV-1
in vitro pero no in vivo.
CLONACIÓN Y ANÁLISIS DE SECUENCIAS DEL
HIV-1 LTR DERIVADAS DE DONADORES MEXICANOS EN DIFERENTES ETAPAS DE INFECCIÓN. Gómez-Román VR 1, Emery VC2 y Soler-Claudin Carmen 1. 1Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos. Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, SSA. Facultad de Química, UNAM. 2Division of Communicable Diseases.
Royal Free Hospital School of Medicine. University
of London, UK.
El tiempo medio que ocurre entre seroconversión al HIV-1
y el desarrollo de SIDA es de aproximadamente 10 años.
No obstante, existen casos raros de “progresores lentos”
quienes, a pesar de estar infectados por mas de 10 años,
permanecen asintomáticos y con niveles normales de
linfocitos T CD4+ aún sin recibir tratamiento antiviral. Los
factores precisos que conducen a esta progresión lenta pueden ser varios y aún se desconocen en su totalidad; sin embargo, se cuenta con el antecedente de un grupo de
progresores lentos australianos infectados con quasi-especies del HIV-1 que presentan deleciones en las regiones nef
y LTR, lo cual sugiere que la lenta progresión en algunos
casos es el resultado de una infección con cepas atenuadas
del HIV-1.
Con tales antecedentes en mente, y con el fin de detectar
casos similares de HIV-1 atenuados en México,
implementamos la metodología para amplificar, clonar y
analizar la secuencia larga terminal repetida (LTR) del HIV1 existente en sangre periférica de donadores mexicanos en
distintas etapas de infección y enfermedad. Se generaron
diversos fragmentos del HIV-1 LTR por medio de PCR anidado a partir de células mononucleares periféricas de 17
pacientes. Los fragmentos amplificados se clonaron en
pUC18 y de tal modo se generaron 115 clonas en forma de
plásmidos denominados pUC18.HIV-I.LTR.Mex. De cuatro clonas que hemos secuenciado a la fecha, hemos ya detectado una deleción de 226pb en el LTR, derivado de un
paciente asintomático (conteo CD4 > 500 cels/µL). Este
tipo o tamaño de deleción no se ha reportado anteriormente y elimina sitios de unión al factor nuclear kappa B (NFkB). Ya que esta deleción no se presenta ni en secuencias
del LTR de cepas prototipo de referencia global ni en secuencias del LTR derivadas de otros pacientes mexicanos,
concluimos que podría tratarse de una cepa atenuada del
HIV-1 circulante en progresores lentos mexicanos. El se-
Revista Biomédica
guimiento de éste paciente y la secuenciación del resto de
nuestras clonas serán necesarios para corroborar nuestra
hipótesis.
ESTANDARIZACIÓN DE UN ELISA PARA DETECCIÓN DE IgA ESPECÍFICA DE VIH EN NIÑOS
MENORES DE 36 MESES NACIDOS DE MADRES
SEROPOSITIVAS. Basualdo, M.C. y Soler C. Unidad
de Investigación en Retrovirus Humanos. Fac. Química UNAM/INDRE SSA.
Objetivo: Desarrollar una prueba de ELISA que detecte
IgA específica de HIV con buena sensibilidad y especificidad, que no requiera previa adsorción de IgGs y que pueda
emplearse confiada y eficazmente como auxiliar diagnóstico de infección perinatal de HIV en laboratorios con pocos
recursos.
Metodología: Para la estandarización de la prueba de ELISA
se buscaron los parámetros óptimos en la preparación y el
pegado del antígeno, la dilución de la muestra y el conjugado, los tiempos de incubación y la concentración y tiempo de exposición del substrato. El lnmunoblot se hizo según metodología reportada
Resultados: Una vez establecidas las condiciones del ensayo se corrieron en total 112 muestras de plasma, de las cuales 64 correspondieron a 54 niños infectados y 48 a 29 niños no infectados, Se contó con 1, 2 ó 3 muestras
secuenciales de 7 niños infectados y 13 no infectados. El
criterio de infección fue el aislamiento viral y el de no infección la serorreversión en las pruebas de ELISA e
lnmunoblot de IgG. Se calcularon los parámetros de sensibilidad, especificidad y valores predictivos del método para
uso en diagnóstico
Sensibilidad (%)
Especificidad (%)
Eficiencia (%)
Valor predictivo positivo
Valor predictivo negativo
Total
77
88
78
89
76
Mayores de 2 meses
84
85
84
90
81
Para demostrar la reproducibilidad del método se corrió una
misma muestra 18 veces en 3 diferentes ocasiones obteniendo desviación estándar de 0.0398. La curva de distribución de los valores de D.O./ L.C. de las muestras positivas tiene tendencia normal.
Discusión: Los datos obtenidos en este estudio indican que
la detección de IgA al igual que el aislamiento viral y el
PCR tienen baja sensibilidad los primeros 2 meses de la
vida., Se diagnosticaron correctamente 93 (83 %) de los
112 niños estudiados El método es simple y no caro, sin
embargo, no es recomendable por ahora, utilizarlo como
única metodología de diagnóstico en niños menores de 24
meses, sino como un buen parámetro de apoyo a otras
138
metodologías como detección de antígeno en plasma, cultivo viral o PCR.
CARGA VIRAL PLASMÁTICA DEL VIH-1 EN INDIVIDUOS INFECTADOS. José Carmen Gudiño,
Octavio Díaz y Carmen Soler. Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos. Facultad de Química,
UNAM e Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, SSA.
Introducción. La evaluación de los niveles de viremia del
VIH en personas infectadas aparte de ser un marcador de
progresión, es un parámetro importante de apoyo en la clínica, ya sea como criterio para decidir iniciar un tratamiento
con antirretrovirales, o para monitorear la respuesta a la
terapia.
Objetivo: Analizar los valores de carga viral encontrados
en la población solicitante del servicio en el INDRE.
Métodos: Se determinó la carga viral del VIH-1 en muestras de plasma de 227
individuos infectados con VIH-1 colectadas entre Junio y
Octubre de 1997. Se utilizó el ensayo comercial Hybrid
Capture® II (DIGENE Corporation).
Resultados: Veintidós individuos (9.7%) tuvieron niveles
no detectables de virus (bajo el nivel de detección del ensayo, de 500 copias de RNA/mL) y en 205 (90.3%) los valores de carga van desde 501 hasta >1,000,000 de copias de
RNA/mL de plasma. La carga viral en estas 205 muestras
sigue una distribución normal, con una media (en valores
logarítmicos) de 4.29 +/-0.78 copias de RNA/mL. En Seis
individuos reclutados para un protocolo de pacientes con
larga sobrevida se determinó la carga viral en muestras
secuenciales tomadas cada 4 meses. Solamente en uno de
ellos se observa un aumento en los niveles de viremia en
las muestras 3 y 4, mientras que el resto de ellos permanecen con menos de 20,000 copias de RNA/mL. También se
ha realizado el seguimiento de la respuesta a la terapia en 2
mujeres detectadas como positivas y tratadas con AZT durante el embarazo. Se observaron disminuciones importantes en la carga viral durante el tratamiento, aunque no se
pudo evitar la transmisión del virus al producto. Se realizó
la determinación de carga viral en 16 plasmas de niños,
nacidos de madres seropositivas, sin un diagnóstico definitivo usando las metodologías regulares para el diagnóstico
perinatal. Once tuvieron entre 702 y >1,000,000 de copias
de RNA/mL y 5 tuvieron niveles no detectables de virus.
Conclusiones: La carga viral en la población infectada por
el VIH sigue una distribución normal. Nuestros datos apoyan
el que la población de sobrevivientes a largo plazo tienen
niveles bajos de virus circulante por períodos prolongados
de tiempo. Además, hay que tomar en consideración que la
determinación de la carga viral en muestras de menores de
24 meses podría ser de utilidad para definir el diagnóstico
perinatal en casos conflictivos.
INMUNOMODULACIÓN CELULAR LOCAL EN
UN MODELO TUMORAL MURINO. 1Villalba Magdaleno J.D. 2Figueroa Corona M.P 2Casas Avila L.,
2
Ordoñez Pazo R.M. y 2Berumen Campos J. Área de
Inmunología1 y Biología Molecular2 del Laboratorio
Multidisciplinario de Investigación de la Escuela Militar de Graduados de Sanidad (E.M.G.S.) S. D. N.
En muchos tumores humanos incluyendo el carcinoma cervical, la respuesta inmune contra ellos consiste en una serie de eventos complejos que implican interacciones célula-célula y factores solubles (citocinas). La presencia de
linfocitos infiltrados localmente refleja el reconocimiento
de células tumorales por el sistema inmunológico del
huesped. Varios grupos han mostrado la presencia de infiltrados celulares sobre y alrededor del tumor en diferentes
tipos histológicos Estos hallazgos sugieren que los mecanismos inmunes locales tienen un papel protector en retardar o inhibir el crecimiento tumoral y expansión de células
malignas. Sin embargo, también existe una supresión o disminución de la capacidad citolítica de células NK y
macrófagos infiltrados en la zona de desarrollo tumoral.
En los análisis de inmunohistoquímica empleando
anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de superficie celular han mostrado que los principales tipos celulares en los infiltrados son células T, variando el número
entre células CD4+ y CD8+, células NK y abundantes
granulocitos.
Los papilomavirus humanos (HPVS) de alto riesgo estan
asociados etiológicamente con la mayoría de carcinomas
cervicales. Estos HPVs codifican dos oncoproteínas virales,
E6 y E7, que son expresadas consistentemente e
interactuando con p53 y pRb, respectivamente, alterando
la función biológica de replicación celular. Nuestro trabajo
tiene como interés explorar la inmunomodulación celular
local en un modelo tumoral murino mediante ensayos de
transfección, que será llevado a cabo con la expresión de la
proteína viral quimérica E6E7d en su forma tridimensional
en la superficie de la célula tumoral, la cual será reconocida por los anticuerpos sistémicos generados contra la misma, y de esta forma, "marcar" a la célula tumoral que será
reconocida por los receptores Fc de las inmunoglobulinas
(CD16) presentes en las células NK y macrófagos que infiltran el tumor. Además, este mecanismo será apoyado de
manera parácrina por las diferentes citocinas liberadas en
el microambiente.
PREVALENCIA DE PAPILOMAVIRUS HUMANO
EN LESIONES CERVICALES DE MUJERES INFECTADAS CON EL VIRUS DE, INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA. Adela Carrillo, Sara Rubí,
Marcela Lizano, Alejandro García-Carrancá, Diana
Vilar, Rita Sotelo, Víctor Pérez, Juan Sierra, Gilberto Solorza, Alejandro Mohar, Patricia Volkow. Insti-
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
139
tuto Nacional de Cancerología, San Fernando
No.22.Tlalpan, México D.F.
El virus del papiloma humano (VPH) ha sido vinculado
con la génesis del cáncer cérvico-uterina (CaCU) y lesiones cervicales intraepiteliales por diferentes autores. Varios estudios indican que las lesiones neoplásicas
precancerosas e invasoras del tracto genital femenino contienen secuencias de ADN de VPH. Por otro lado, las mujeres infectadas con el virus de la inmudeficiencia humana
(VIH), presentan con alta frecuencia, lesiones
intraepiteliales del cérvix, vagina y vulva, donde probablemente intervienen los virus del papiloma humano.
El objetivo de este estudio es conocer la prevalencia de infección por VPH en mujeres mexicanas infectadas por VIH
en relación al grado de lesión cervical. La detección de VPH
a nivel genital se realizó de muestras de raspado
endocervical. Las muestras fueron amplificadas por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el gene E6-E7
de los VPH-16 y 18 y el gene de b-globina. Para la detección de otros tipos virales se amplificó una región del gene
Ll con primers universales, cuyos productos de PCR fueron
secuenciados directamente.
El análisis de 40 mujeres VIH positivas y 30 controles mostró una alta prevalencia de tipos de VPH "raros", además
de VPHs de alto riesgo, sólo en el grupo infectado por VIH.
Los resultados muestran que la infección con VIH aumenta
la expresión de VPH asociado al grado de inmunosupresión.
Se sugiere que las pacientes inmunosuprimidas, con alta
prevalencia de VPH, están en mayor riesgo de desarrollar
cáncer de cérvix.
DETERMINACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE
HUMORAL CONTRA PROTEÍNAS TEMPRANAS
DE HPV16 (E4 Y E7) EN SUEROS DE PACIENTES
CON LESIONES CERVICALES. Ramírez, AL1, Trejo, BC2, Solorza, LG2, Vázquez, EL3, Juárez, PL1, Pedroza, SA1, Gutiérrez, XL1. 1 Departamento de Virus
y Cáncer del CISEI, INSP, Cuernavaca, Morelos; 2Inv.
Básica y Serv. Ginecología del lnst. Nal. de Cancerología, México D.F.; 3Hospital Gral. Dr. Manuel Gea
González, México D.F.
Los papilomavirus humano (HPV) es el factor de riesgo
más importante asociado a cáncer cérvico uterino (CaCU)
siendo los tipos 16 y 18 los más frecuentes. Hasta ahora,
poco se conoce sobre la respuesta inmune humoral generada por HPV. Recientemente se demostró que anticuerpos
anti-E6 pueden ser un marcador para cáncer invasor y que
anticuerpos anti-E7 están asociados con CaCU. Los
anticuerpos anti-E4 están presentes tanto en lesiones premalignas como en cánceres avanzados y se sugiere que E4
puede ser un marcador de replicación viral. El análisis de
la respuesta por anticuerpos contra proteínas de HPV en
pacientes con lesiones de cérvix, es importante para eva-
Revista Biomédica
luar la respuesta inmune y el uso potencial de ésta como
sistema de diagnóstico en la detección oportuna del cáncer.
Hasta la fecha hemos trabajado con 70 muestras de mujeres
diagnosticadas con CaCU de las que se obtuvieron muestras de biopsias y sueros. De los tejidos se obtuvo DNA
para la identificación de HPV por el método de PCR y se
tipificó con enzimas de restricción. Los resultados mostraron que 92% de las muestras fueron positivas para DNA de
HPV, de éstas 72% fueron HPV16, 11 % fueron HPV18,
7% fueron positivas para otros tipos de HPV (31, 39 y 45) y
solo el 8% resultaron negativas para el virus. Por otra parte, se determinó la presencia de anticuerpos anti- E7 y -E4
de HPV16 por western blot en los sueros de los mismos
pacientes. Los resultados mostraron que el 89% de los sueros presentaron anticuerpos contra al menos una de las proteínas de HPV16. De éstos el 81% fueron positivos para
anticuerpos anti-E7, 38% presentaron anticuerpos anti-E4
y 9% fueron negativos para anticuerpos antiHPV. La correlación entre el ensayo de PCR y el western blot fue de
95%, tal vez con un poco menos de sensibilidad en el western
blot, pero con menos probabilidad de error en la toma de
muestra en este último. En los sueros de mujeres sanas que
hemos estudiado hasta ahora se ha observado que la prevalencia de anticuerpos anti-E7 disminuye considerablemente, pero no así la presencia de anticuerpos anti-E4. Estamos en el proceso de analizar un mayor número de muestras controles para identificar si nuestros resultados son significativos, para la presencia de anticuerpos anti-E4 en lesiones tempranas.
PAPILOMATOSIS LARINGEA Y VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. 1,3Manjarrez ME, 2Zamorano R,
4
De la Torre C, 1Viliaiba J, 1Selman M, 2,3 Gariglio P.
1
INER, 2CINVESTAV, 3CICATA , 4 Hospital Infantil
de México.
La papilomatosis laríngea es un tumor benigno de vías respiratorias, que se presenta de manera crónica y recurrente.
Si bien es cierto que es más frecuente en niños menores de
7 años, puede persistir en edad adulta e incluso inducir en
algunos casos el desarrollo de una neoplasia. Los síntomas
pueden ir desde molestias respiratorias leves hasta obstrucción total de vías respiratorias. Por el momento no hay tratamiento efectivo, La etiología se ha relacionado con el virus del papiloma humano (HPV), en particular con los tipos 6 y 11. En algunos tipos de HPV los genes E6 y E7
pueden actuar como oncogenes; por ejemplo en los HPV de
alto riesgo para cáncer de cérvix, E6 puede unirse e inactivar
a p53 y E7 puede asociarse e inactivar a varias proteínas,
incluyendo a pRb, la cual tiene un papel importante en la
regulación del ciclo celular. En HPV de bajo riesgo, E6 no
se une a p53, pero E7 si tiene afinidad por pRb aunque
menor que la de los de alto riesgo. También se sabe que los
HPV de bajo riesgo pueden aumentar la expresión de genes
celulares como c-jun, lo cual depende en gran parte del tipo
140
celular infectado. En México no se cuenta con estudios previos de papilomatosis laríngea, de tal manera que se desconoce la etiología y no se sabe si algunos genes celulares
participan en dicha enfermedad. Por tal motivo, los objetivos de esta línea de trabajo son: a) detectar la presencia así
como el tipo de HPV en muestras de papilomas laríngeos
de niños; b) estudiar la expresión de los genes celulares: cjun, c-myc, bcl-2, Rb y p53; c) estudiar la expresión de genes
virales E6 y E7.
Se estudiaron 14 niños a los que se les realizó disección de
los papilomas por cirugía. La presencia del HPV se efectuó
por medio de la técnica de la reacción en cadena de la
polimeras (PCR); la tipificación se realizó por medio de
patrones de restricción y la expresión de los oncogenes y
antioncogenes celulares se valoró inicialmente por
inmunohistoquímica; la expresión de E6 y E7 se mide por
RT-PCR. En 10 de las muestras se identificó el ADN viral
y en siete de ellas se pudo tipificar el virus, cuatro con HPV6,
tres con HPV11.La proteína pRb se expresó en la mayoría
de las muestras, pero en algunas de ellas su expresión se
encuentra disminuida. Respecto a la expresión de p53 y de
genes celulares y virales se presentarán y discutirán resultados recientes.
EFECTO DE LOS ESTRÓGENOS SOBRE LA EXPRESIÓN IN VIVO DE LA LCR DEL VIRUS DEL
PAPILOMA HUMANO TIPO 18 (HPV18). Néstor
Morales-Peza1, Angel Cid-Arregui 2, y Alejandro García. 1Depto. Biología Molecular, Instituto Investigaciones Biomédicas, UNAM, MÉXICO. 2Neurobiologie, Universitat Heidelberg, 69120- Heidelberg, ALEMANIA.
Es sabido que la mayoría de los cánceres cervicales están
infectados por ciertos tipos oncogénicos de HPVs, en particular HPV 16 y 18, que expresan activamente genes
transformantes controlados desde su región larga de control (LCR). Se ha observado in vitro que ciertos receptores
de hormonas esteroides activan a la LCR de los HPVS. Por
ello, es concebible que las hormonas sexuales intervengan
en el desarrollo del cáncer cervical si, a niveles fisiológicos, pudieran estimular la expresión de los oncogenes
virales. Para probar esta hipótesis in vivo hemos utilizado
ratones transgénicos que obtuvimos previamente, los cuales expresan el gen reportero lacZ (b-galactosidasa) bajo
control de la LCR del HPV 18 específicamente en los
epitelios del tracto genital y la lengua. En estos ratones hemos estudiado el efecto de estrógenos y sus inhibidores sobre la LCR del HPV 18.
La cuantificación de la actividad b-galactosidasa en extractos de tejidos de ratonas transgénicas HPV 1 8LacZ reveló
un incremento de la expresión reportera en el tracto genital
al final del embarazo, cuando los niveles de hormonas
esteroides circulantes son más altos. Además, la actividad
reportera correlacionaba con los niveles fluctuantes de hor-
monas sexuales durante el ciclo estral, siendo máxima en
estro. La ovariectomía suprimía la actividad b-galactosidasa
en el tracto genital. El tratamiento con 17b-estradiol en
animales ovariectomizados restauró la actividad reportera,
mientras que la inyección simultánea de 17b-estradiol y
tamoxifén disminuyó significativamente tal recuperación.
Puesto que el 17b-estradiol induce la expresión del receptor de progesterona en órganos blanco, el cual podría mediar el efecto sobre el promotor viral, en otra serie de experimentos los animales fueron tratados secuencialmente con
estradiol y progesterona. Sin embargo, no se observó mayor incremento en la actividad reportera. Por otro lado,
ratonas ovariectomizadas y tratadas con 17b-estradiol seguido de una combinación de progesterona y su antagonista RU486 mostraron una recuperación reducida de la expresión del transgene. Ya que se ha reportado que el RU486 tiene también actividad antiestrogénica, se probó el efecto de una combinación de 17b-estradiol y RU-486 encontrándose que el inhibidor reduce la recuperación de la actividad reportera en aproximadamente un 50%. Idénticos
resultados se observaron en vagina y útero, ambos órganos
blanco de las hormonas esteroides. La actividad reportera,
sin embargo, permaneció inalterada en el epitelio de la lengua, que está libre de la influencia de las hormonas sexuales. Estos resultados demuestran que los estrógenos activan
a la LCR del HPV 18 in vivo y que los antiestrógenos pueden resultar útiles en el tratamiento del cáncer cervical infectado por HPV al abolir la expresión de los oncogenes
virales.
Este trabajo ha sido parcialmente apoyado por donativos
del CONACYT y PADEP
(México) y del BMBF (Alemania). NM-P recibe beca de
CONACYT y de DGAPA.
PCR in situ CON NUCLEOTIDOS FLUORESCEINADOS: UNA NUEVA TECNICA PARA DETECCION DIRECTA DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN MUESTRAS DE CANCER CERVICOUTERINO EMBEBIDAS EN PARAFINA. Astudillo
H.1,2, Monarres Al, Jiménez R3, Zenteno Z4, Luna J5,
Rangel L.M1,Marroquín Al, Gariglio P1,2. 1Depto. de
Genética y Biología Molecular. CINVESTAV-IPN.
2
CICATA-IPN. 3Depto. de Biología Celular. CINVESTAV-IPN. 4Servicio de Patología del Hospital de la
Mujer. 5Unidad de Microscopía Confocal del Depto
de Fisiología y Neurociencias. CINVESTAV-IPN.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) in situ es
una nueva técnica que permite la amplificación de
secuencias blanco presentes en 1-2 copias dentro de células
intactas y constituye el avance más importante desde el
descubrimiento de la PCR. Entre otras cosas, hace posible
correlacionar el resultado de la amplificación de genomas
virales presentes en bajo número de copias, con las
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
141
características morfo-patológicas del tejido. Sin embargo,
los métodos actualmente utilizados para la detección del
producto amplificado in situ son indirectos; por ejemplo, la
detección de nucleótidos marcados con digoxigenina
(DUTP) seguida de inmunodetección enzimática o por
amplificación con nucleótidos sin marca seguida de una
hibridación in situ. Presentamos un nuevo método de
detección directa del producto amplificado por medio de la
incorporación de desoxinucleótidos marcados con los
"cyanine fluors" (CyDye, Amersham) que en su forma
monorreactiva contienen un grupo carboxilo y un éster único
activo con estrechas bandas de emisión que permiten la
detección de múltiples colores en una sola muestra, con alta
sensibilidad y fotoestabilidad. Analizamos 10 muestras de
Cáncer Cérvico-Uterino (CaCU) embebidas en parafina, en
las cuales previamente se realizó la detección de
Papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo por PCR in
vitro. Dichos HPVs participan en la etiología del CaCU a
través de la infección e integración de su genoma en células
del epitelio cervical con la posterior expresión de las
proteínas oncogénicas E6 y E7 que inactivan las proteínas
supresoras tumorales p53 y Rb, respectivamente. Se
utilizaron oligonucleótidos para amplificar regiones tanto
de expresión tardía (L1) como temprana (E6/E7) del genoma
del HPV. En el primer caso se utilizaron los oligonucleótidos
MY09 [CGTCC(A/C)A(A/G)(A/G)GGA(A/T)ACTGATC]
y MY11 [GC(A/C)CAGGG(A/T)CATAA(C/T)AATGG]
que amplifican un fragmento de 450pb de la región Ll de
HPV. (Manos,1988). También se utilizaron los oligos pU1M [TGTCAAAAACCGTTGTGTCC] y pU-2R
[GAGCTGTCGCTTAATTGCT] que amplifican
fragmentos de 238 a 244pb de E6/E7 de HPV de alto riesgo
(16,18,31,33,52b y 58).(Fujinaga, 1991). Previa digestión
con proteasas, se cubrió el espécimen con la mezcla de
reacción conteniendo dCTP-Cy3 y se introdujeron las
laminillas selladas al termociclador GeneAmp In Situ PCR
1000 de Perkin Elmer. Al finalizar la reacción, se analizaron
las muestras directamente por medio de microscopía
confocal. Se observó en todos los casos la presencia de
HPV en células de CaCU corroborando la detección previa
realizada in vitro con los mismos oligonucleótidos. Estos
resultados sugieren que la incorporación directa de
nucleótidos fluoresceínados al producto amplificado en la
PCR in situ, ofrece un nuevo método de detección con la
sensibilidad y especificidad de la técnica in vitro,
permitiendo a diferencia del estudio tradicional, un análisis
directo, más rápido y a nivel de cada célula en los
especímenes estudiados.
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL
PAPILOMA HUMANO POR PCR, EN MUESTRAS
DE EXUDADO CERVICAL. Zafra G, García E,
Mallet A, Saad A, Pedraza L, Villalobos S, Quintero
P, Aguirre X y Gariglio P. Genética Médica, Hospital
Español y Depto. de Genética y Biología Molecular,
Revista Biomédica
CINVESTAV, IPN. México,D.F.
Diversos estudios epidemiológicos han mostrado la presencia del Virus del Papiloma Humano (HPV en inglés) de
alto riesgo (tipos 16, 18, 31, 33 y otros menos frecuentes)
en aproximadamente el 90% de los casos de cáncer cérvicouterino (CaCu). La prevalencia de HPV de alto riesgo en
mujeres clínicamente normales (sin sintomatología) muestra gran variación en distintos reportes. En México existe
una alta incidencia de CaCu por lo que la identificación de
HPV de alto riesgo es importante y la persistencia de estos
genomas virales en mujeres asintomáticas constituye un
indicador confiable del pronóstico de la paciente. Uno de
los procedimientos más empleados en la tipificación del
HPV es la técnica de PCR; nuestro grupo de trabajo la ha
utilizado desde 1995 para estudiar muestras de exudado
cervical en más de 900 pacientes, tipificando a los HPV, 6,
11,16, 18, 31, 33, 42, 52 y 58.
Se conformaron dos grupos de pacientes: el grupo I corresponde a pacientes con lesión cervical que acuden a consulta por tener manifestaciones clínicas sugestivas de infección por HPV y el grupo II es de mujeres sin sintomatología,
que acudieron a consulta para revisión médica de rutina.
En el grupo 1 (n=542) se identificó la presencia de] HPV
en el 52% de las muestras y en el grupo II (n=386) en el
21%. En ambos grupos el HPV más frecuente fue el tipo
16, presente en el 84% de las muestras positivas del grupo
I y en el 80% de las muestras positivas del grupo II.
Esta información permite observar que la frecuencia del
HPV de alto riesgo es alta incluso en mujeres asintomáticas
y fundamenta la necesidad de un estudio profundo de las
características inherentes a la población y su medio ambiente. En particular, es importante el estudio de la prevalencia de los HPV de alto riesgo en los grupos I y II, y su
relación con el desarrollo de lesiones precursoras de CaCu.
IMPACTO DE LA INFECCIÓN POR ROTAVIRUS
EN MÉXICO. 1994-1997. Herlinda García-Lozano,
Ernesto Ramírez González, Elvira Mayén Pimentel,
Araceli Rodríguez Castillo, Benita Díaz de Jesús, Martín Melo Munguía, Miguel Suárez Velázquez y Fernando González Domínguez. Laboratorio de Rotavirus
y RED del Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. (INDRE).Carpio 470. Col. Sto
Tomás. México D. F.
INTRODUCCIÓN: Los rotavirus son el agente etiológico
más importante de la diarrea severa en infantes y niños en
todo el mundo. La enfermedad es universal, afecta al 95%
de los humanos alrededor de los tres años de edad, en ciudades desarrolladas como en desarrollo, sin importar el nivel de saneamiento y socioeconómico. Sin embargo, las
consecuencias de la enfermedad por rotavirus en países en
desarrollo son diferentes de lo que acontece en los países
desarrollados. La incidencia de la morbilidad relacionada
142
con la infección por rotavirus en niños de este grupo edad,
es similar en ambas ciudades, pero el curso de la enfermedad es a menudo más severa y fatal en la población infantil
de los países en desarrrollo.
OBJETIVO: Determinar el panorama epidemiológico de
la infección por rotavirus en niños con gastroenteritis severa en nuestro país
MATERIAL Y MÉTODOS, Se procesaron 5,769 muestras clínicas de niños con diarrea aguda procedentes de diferentes estados de la República Mexicana en el Laboratorio de Rotavirus, INDRE (1994-1997). La técnica de PAGE
al 10% con la tinción de nitrato de plata permitió identificar el genoma viral y analizar la diversidad de
electroferotipos. La tipificación de grupos A, B, C y serotipos
1-4, se realizó por RT-PCR previa a la extracción y purificación del RNA viral de muestras fecales. Se utilizaron
oligonudeótidos específicos para cada uno de los grupos y
serotipos.
RESULTADOS: De un total de 5,769 muestras analizadas
2,684 (46.52%) fueron positivas a rotavirus y 3,085 (53.47%
) negativas. La presencia de ”electroferotipos largos”’ fue
mayor con respecto a los de . electroferotipo corto. De 389
muestras tipificadas, 379 (97.42%) correspondieron al grupo
A, 2 muestras (0.5%) al grupo B y 8 muestras clínicas
(2.05%) al grupo C. La determinación de los serotipos durante este período fueron Gl (36.76%), G3 (23.96%), G2
(15.42%) y G4 (0.25%) de mayor a menor frecuencia respectivamente. La presencia del Grupo C sólo se determinó
en un brote (6 muestras) de BCS y en 2 casos esporádicos
de Monterrey. Además, de observar la circulación de los
tres serotipos del grupo A (l3) con la misma frecuencia. El
período estacional de la infección por rotavirus fue en invierno (sep-mar) y el grupo de edad más afectado fue de 712 meses.
CONCLUSIONES, Los resultados obtenidos revelan a los
RVH como el agente etiológico más importante de la diarrea severa en la población infantil mexicana en sus primeras etapas de vida durante la época invernal. La circulación
de los serotipos de grupo A con la misma frecuencia, infiere que puedan existir, un mayor número de rearreglos
genéticos entre las cepas de rotavirus de humanos y animal; dando lugar a la presencia de nuevos serotipos de
rotavirus. Además, la presencia de otros grupos No-A de
rotavirus y la gran diversidad de electroferotipos, podrían
tener grandes implicaciones epidemiológicas en la valoración de una vacuna en nuestro país.
INTRODUCCIÓN: Los rotavirus son agentes importantes
de la gastroenteritis aguda en humanos y animales en sus
primeras etapas de vida. Los grupos A, B y C infectan principalmente a humanos. Los rotavirus del grupo B, también
conocidos como rotavirus de la diarrea en adultos (RVDA)
se han asociado de manera importante con brotes de diarrea severa en la población adulta de la República Popular
de China y representan un serio problema de salud pública
en ese país. Estudios seroepidemiológicos, realizados fuera
de esta población, geográfica, muestran que la prevalencia
de anticuerpos específicos a grupo B son muy pocos frecuentes.
En México, es incierto el panorama de la infección por
rotavirus del Grupo B, ya que se desconoce, si existen factores que determinen la baja prevalencia de la enfermedad,
o bien refleje la infrecuencia con que son utilizados los
métodos de laboratorio disponibles para su detección.
OBJETIVO: Detectar la presencia del RVDA en porcinos
con diarrea severa por la técnica de RT-PCR y demostrar
que la circulación de este agente viral, no es poco frecuente
en nuestro país.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se analizaron 8 muestras clínicas de lechones con diarrea severa procedentes de
Tehuacán, Puebla (1997). Por la técnica de electroforesis
en geles de PAGE al 7.5% teñidos con nitrato de plata se
determinó la presencia de su genoma viral característico de
estos virus. La confirmación se realizó mediante la técnica
de RT-PCR con oligonucleótidos específicos para el grupo
B, previa a la extracción y purificación del RNA viral a
partir de heces.Se descartó la presencia de grupo A y C con
sus respectivos oligonudeótidos.
RESULTADOS: De un total de 8 muestras clínicas, 2 (25%)
mostraron por PAGE un electroferotipo de 11 segmentos
de RNA característico de este Grupo B (4,2,2,2,1). Por RTPCR fue posible demostrar la presencia de productos de
cDNA de 489 pb en geles de agarosa teñidos con bromuro
de etidio correspondientes al grupo B de rotavirus. Ninguna de las muestras positivas pertenecieron a los grupos A ó
C.
CONCLUSIONES: La sensibilidad, especificidad y disponibilidad que tiene la RT-PCR permitió detectar la presencia de grupo B en lechones con diarrea aguda . Esta técnica, es de gran valor diagnóstico en la detección, transmisión, epidemiología y vigilancia de estos agentes virales
que muy probablemente circulan con una mayor frecuencia
de lo esperado en nuestro país.
DETECCION DEL GRUPO B DE ROTAVIRUS EN
PORCINOS CON DIARREA. Benita Díaz de Jesús,
Martín Melo Munguía, Elvira Mayén Pimentel, Araceli Rodríguez Castillo, Ernesto Ramírez González y
Hedinda García-Lozano. Laboratorio de Rotavirus del
Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia
Epidemiológicos.(INDRE).Carpio 470. Col. Sto.
Tomás.México D. F.
CIRCULACIÓN DE LOS GRUPOS A, B y C DE
ROTAVIRUS EN MÉXICO. Martín Melo Munquía,
Benita Díaz de Jesús, Elvira Mayén Pimentel, Araceli Rodríguez Castillo, Ernesto Ramírez González y
Herlinda García-Lozano. Laboratorio de Rotavirus
del Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia
Epidemiológicos. (INDRE).Carpio-470. Col. Sto.
Tomás.México D.F.
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998
143
INTRODUCCIÓN: Los rotavirus del grupo A, son responsables de un gran porcentaje de hospitalizaciones pediátricas
por diarrea aguda con deshidratación en infantes y niños
alrededor de los tres años de edad en todo el mundo. A
diferencia de lo que acontece con los rotavirus del grupo B
y C que infectan principalmente a preescolares y adultos.
Los rotavirus del grupo B y C son responsables de grandes
brotes y casos esporádicos de diarrea severa principalmente en Japón y China. La presencia de la infección por estos
virus en humanos, fuera de ambas regiones geográficas, ha
sido reportada en un bajo porcentaje: menos de 30 casos en
otros países,
En México, se desconoce la prevalencia de las infecciones
de los Grupos B y C en humanos y sus implicaciones
epidemiológicas que puedan presentar la presencia de los
tres Grupos A, B y C de rotavirus.
OBJETIVO: Demostrar que existe la circulación de los tres
grupos de rotavirus que infectan principalmente a humanos, los cuales pueden presentar grandes implicaciones en
el panorama epidemiológico de la infección por rotavirus y
valoración de una vacuna en nuestro país.
MATERIAL Y MÉTODOS: El desarrollo de los métodos
moleculares como la transcriptasa reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR); permitió determinar el grupo A, B y C con oligos específicos. La previa extracción del RNA viral y purificación con fibra de
celulosa a partir de heces, permitió tipificar en su totalidad
las muestras clínicas y aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR. La técnica de rotaforesis se realizó para
determinar la migración electroforática de los genomas
virales característicos de cada uno de los grupos.
RESULTADOS: Mediante la RT-PCR fue posible demostrar la presencia de los productos de cDNA en geles de
agarosa al 1.8 % teñidos con bromuro de etidio. De un total
de 200 muestras 172 mostraron un fragmento de 1072 pb
al grupo A , 2 muestras al grupo B de 489 pb y 8 muestras
al grupo C con un fragmento de 356 pb. El análisis de
electroferotipos reveló la presencia de los perfiles genómicos
característicos de cada uno de los grupos de rotavirus-, los
cuales a su vez correlacionaron con los datos obtenidos en
la PCR.
CONCLUSIONES: En este estudio, la técnica de RT-PCR
permitió el diagnóstico de otros grupos No-A de rotavirus,
la cual presenta gran valor diagnóstico en cepas no
tipificables con anticuerpos monodonales y muestras
diarreicas, donde el número de partículas virales excretadas
es menor, como sucede muy probablemente en la infección
por el grupo B y C en humanos. La utilización de la RTPCR en el diagnóstico- de estos agentes permitió tener un
panorama epidemiológico de la infección por rotavirus en
humanos por grupos A, B y C en nuestro país.
DETERMINACIÓN DE GENOTIPOS G (VP7) y P
(VP4) DE ROTAVIRUS EN NEONATOS CON DIARREA AGUDA EN MÉXICO. Elvira Mayén Pimen-
Revista Biomédica
tel, Araceli Rodríguez Castillo, Martín Melo Munguía,
Benita Díaz de Jesús, Ernesto Ramírez González y
Hedinda García-Lozano. Laboratorio de Rotavirus del
Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia
Epidemiológicos.(INDRE).Carpio-470. Col. Sto,
Tomás.México D. F.
INTRODUCCIÓN: Los estudios de genotipificación a G
(VP7) y P (VP4), han revelado importante información sobre la diversidad genética de las cepas de rotavirus. Además, que los serotipos G (1-4) son los más comunes en la
población infantil con diarrea aguda en todo el mundo. Se
ha descrito que la infección asintomática en neonatos por
algunas cepas de rotavirus induce inmunidad parcial a infecciones subsecuentes o bien a la disminución de la severidad de la diarrea aguda. En México, no se conocen los
genotipos P y G de rotavirus que se presentan en neonatos
con diarrea o si existe la presencia de otros genotipos raros; los cuales pueden presentar grandes implicaciones
epidemiológicas en la valoración de una vacuna en nuestro
país.
OBJETIVO: Determinar los genotipos G y P en recién nacidos que presentan, diarrea aguda y su posible asociación
con la sintomatología clínica.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se analizaron 25 muestras clínicas de neonatos que presentaron diarrea severa, procedentes de diferentes estados de la República Mexicana y
correspondientes al cepario de rotavirus del Laboratorio de
Rotavirus. INDRE. Por la técnica de electroforesis en geles
de PAGE al 10% y teñidos con nitrato de plata se identificó
el genoma viral. La determinación de genotipos P(Pl,P2,
P3) y G (Gl,G2,G3,G4) se realizó por RT-PCR previa a la
extracción y purificación del RNA viral a partir de materia
fecal. Los olígonudeótidos que se utilizaron fueron específicos para los genotipos G (VP7) y P (VP4)
RESULTADOS: De un total de 25 muestras analizadas, 11
correspondieron a Pl (Gl,G3), 9 muestras a P2 (G2), 1 muestra con la combinación Pl (Gl y G3) y 4 muestras con
genotipos poco frecuentes: Pl y P2 (G1), P2 (G3), Pl (G2),
Pl y P2 (G2).
CONCLUSIONES: Los datos obtenidos muestran la presencia de cepas de rotavirus P y G que se asocian de manera importante con cuadros diarreicos severos en neonatos.
Además, de destacar la importancia de la realización de
estudios de epidemiología molecular que permiten tener un
panorama más amplio de las combinaciones de los genotipos
P y G de las cepas de rotavirus que circulan con mayor
frecuencia en nuestro país, las cuales deben considerarse
antes de la valoración de una vacuna.
COINFECCIÓN DE GENOTIPOS P Y G DE ROTAVIRUS GRUPO A. José Ernesto Ramírez González,
Araceli Rodríguez Castillo, Elvira Mayén Pimentel,
Martín Melo Munguía, Benita Díaz de Jesús y Herlinda García Lozano. Laboratorio de Rotavirus del
144
Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE). Carpio # 470, Col. Sto. Tomás,
México D.F.
Diversos estudios han demostrado la presencia de infecciones duales por rotavirus las cuales son poco comunes.
KIM y col., reportaron en un estudio en los Estados Unidos la presencia de sólo el 1% de niños infectados por
dos cepas de rotavirus diferentes mediante la electroforesis del genoma viral. Por otra parte, Bishop y col., en
Australia, demostraron la presencia de coinfecciones de
rotavirus en un 3.2% de niños con diarrea. Ahmed y col.,
reportaron casos de infecciones por rotavirus serotipo 1
y 4 simultáneamente.
La infección por rotavirus de uno o más genotipos (P y
G) entre hospederos de una misma o diferente especie,
puede provocar mutaciones puntuales o rearreglos genéticos resultando nuevos serotipos y posiblemente cepas
más virulentas y resistentes que las cepas progenitoras.
La coexistencia de diferentes cepas circulantes en una
comunidad en un determinado tiempo y en ocasiones la
presencia de varias cepas en un mismo individuo son
factores determinantes en la epidemiología de RGA.
El objetivo de este estudio es determinar la presencia de
coinfecciones por dos genotipos diferentes en un sólo
individuo.
En el presente trabajó se realizó la genotipificación de
VP4 y VP7 en 8 muestras de rotavirus procedentes de
Cancún y Veracruz mediante la técnica de retrotranscripción acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) utilizando oligonucleótidos específicos para
genotipos P (VP4) y G (VP7).
Los resultados muestran la presencia en 7 de las muestras analizadas coinfecciones con genotipos Gl y G3, las
cuales fueron genotipo Pl. En la muestra restante se encontró el genotipo Gl asociada a los genotipos Pl y P2.
Lo anterior indica la posibilidad de encontrar simultáneamente más de un genotipo de rotavirus en un mismo
paciente.
La frecuencia con la que se presentan este tipos de infecciones es baja, sin embargo, la probabilidad de que puedan surgir recombinaciones genéticas puede ser significativa. Lo anterior implica a las coinfecciones como factores importantes en la evolución de los rotavirus y en la
valoración de una vacuna efectiva. La aplicación de técnicas moleculares como la RT-PCR permite demostrar
la presencia de coinfecciones por rotavirus de distintos
genotipos (G y P) lo cual sugiere una alta probabilidad
de recombinaciones genéticas durante infecciones naturales. Se estima que este tipo de infecciones son más comunes en países en vías de desarrollo donde hay higiene
deficiente y mala nutrición.
DE MATERIA FECAL. Araceli Rodríguez Castillo,
Ernesto Ramírez González, Elvira Mayén Pimentel,
Martín Melo Munguía, Benita Díaz de Jesús y Herlinda García Lozano. Laboratorio de Rotavirus del
Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE). Carpio # 470, Col. Sto. Tomás,
México D.F.
La tipificación completa de rotavirus con fines
epidemiológicos comprende la caracterización tanto
genética como inmunológica de VP4 y VP7. La
información sobre la epidemiología molecular de
rotavirus en México es escasa por lo que se tiene sólo
un panorama parcial de lo que acontece con la infección
por este agente.
Con este trabajo se pretende la tipificación completa de
las cepas de rotavirus implicadas en gastroenteritis
aguda en México mediante la transcripción reversa
acoplada a la reacción en cadena de la, polimerasa (RTPCR), así como la correlación entre los genotipos G
(VP7) y P (VP4) de rotavirus.
El estudio se realizó con un total de 158 muestras
clínicas las cuales se seleccionaron del banco de cepas
del laboratorio de rotavirus del INDRE. Dichas muestras
fueron obtenidas de diferentes entidades de la República
Mexicana (Morelia, Monterrey, Cancún, Mérida,
Veracruz, Colima y Puebla).
La extracción de RNA viral se realizó a partir de materia fecal con fenolcloroformo, alcohol isoamílico, trizol, y se purificó con fibra de celulosa (CF-11). Posteriormente, para la genotipificación de las cepas, se procedió a realizar la RT-PCR utilizando oligonucleótidos
específicos para genotipos G (VP7) y P (VP4). Los productos se verificaron en geles de agarosa teñidos con
bromuro de etidio.
Los datos registrados en este estudio demuestran la
circulación de genotipos Gl Y Pl con mayor frecuencia,
sin embargo en dos de los entidades los genotipos que
predominaron son los G2 y P2.
La correlación que hay en la caracterización de ambas
proteínas se presentó por lo general entre los genotipos
Gl-Pl y G2-P2, coincidiendo con los resultados
reportados en estudios anteriores, además de encontrar
correlaciones Gl -P2 y G2Pl generalmente poco
frecuentes.
Consideramos que la genotipificación de VP4 y VP7 es
necesaria para la caracterización completa de cepas de
rotavirus humano con fines epidemiológicos y para la
valoración de una vacuna efectiva en nuestro país.
GENOTIPIFICACIÓN DE VP7 Y VP4 DE ROTAVIRUS HUMANOS MEDIANTE RT-PCR A PARTIR
Vol. 9/No. 2/Abril-Junio, 1998