Resumen

 Gorrini, C. (2014). Discovery of a p53 variant that controls metastasis.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(32), 11576-11577.]
Ester Díaz Mora Resumen de investigación basado también en el artículo principal: p53Ψ is a transcriptionally inactive p53 isoform able to reprogram cells toward a metastatic-­‐like state Senturk, S., Yao, Z., Camiolo, M., Stiles, B., Rathod, T., Walsh, A. M., ... &
Sordella, R. (2014). p53Ψ is a transcriptionally inactive p53 isoform able to
reprogram cells toward a metastatic-like state. Proceedings of the National
Academy of Sciences, 111(32), E3287-E3296
1. Introducción
procesos nucleares de importación/exportación.
Pero estas variantes proteicas no se deben
únicamente a mutaciones en el gen sino que otras
se deben a modificaciones post-traduccionales
inducidas
por
daños
genotóxicos:
fosforilaciones/defosforilaciones
así
como
acetilaciones/desacetilaciones en las regiones Cterminal y N-terminal que provocan estos cambios
en la función y/o localización de la variante
proteica [1].
El gen que codifica para la proteína p53 es uno
de los más estudiados desde su descubrimiento en
1979 por su papel fundamental en la supresión de
tumores [3]. No obstante, cada vez son más los
papeles que se le atribuyen, tales como: regulación
del metabolismo, diferenciación, desarrollo celular
y otros como la capacidad de autorrenovación [5].
Aunque muchas de estas funciones y algunas de
sus vías reguladoras están muy claras a día de hoy,
todavía queda mucho por investigar, sobre todo en
lo que concierne a los mecanismos regulatorios
(convergencia de vías de señalización) [2].
La capacidad de p53 para activar la transcripción
de determinados genes, implicados en el ciclo
celular, senescencia y apoptosis, reside en sus
dominios funcionales de unión a DNA [5].
Hay unas 13 isoformas de p53 descritas hasta el
momento, con distintos patrones de localización
celular y distintas actividades biológicas [3]. Así
mismo, el equipo de Senturk et all descubrió en
2014 una isoforma no descrita hasta el momento
(denominada p53ψ), mientras observaban el
desequilibrio de los genes regulados por p53 en
células CD44high/CD24low.
A partir de su descubrimiento plantearon una
serie de experimentos para la caracterización
funcional y biológica de chicha isoforma.
La expresión de p53 se activa por diversas
señales de estrés, tales como el daño genotóxico en
las células, es decir, daños en el DNA producidos
por luz UV, radiación ionizante, activación de
oncogenes, hipoxia, alteraciones metabólicas, y
pérdida de contactos de las células normales entre
otros… [2,3]. No obstante, no es necesario un
estrés agudo para que se active su expresión , sino
que, en condiciones normales hay niveles basales
de expresión de dicha proteína, pues ésta es
requerida para en múltiples rutas de señalización,
incluida su auto-renovación. [2].
Normalmente, la proteína p53 se acumula en
bajas concentraciones en el núcleo en células
sanas, y se activa, por las distintas vías descritas
anteriormente, como un factor de transcripción.
Esto implica inhibir o activar la expresión de más
de 150 genes [1]. Evitando así la acumulación de
mutaciones y contrarrestando la acción de
oncogenes, lo cual genera una fuerte presión
selectiva durante la tumorogénesis para eliminar
este regulador. Consecuentemente, p53 es el gen
supresor de tumor más comúnmente mutado en la
mayoría de los cánceres o células tumorales [3,2].
Muchas de las mutaciones en el gen, dan lugar a
proteínas (variantes) no funcionales, e incluso,
algunas descritas con función antagónica,
contribuyendo a la tumorogénesis como es el caso
de la nueva isoforma descrita: p53ψ [3]. Un 1%
aproximadamente [4] de estas mutaciones afectan
al Splicing que sufre la proteína (Splicing
alternativo por mutaciones en sitios clave ) (5). Se
crean así variantes que carecen de los residuos
críticos necesarios para la oligomerización, unión
al DNA en sitios específicos e incluso hacen variar
su localización intracelular, interfiriendo en los
2.RESULTADOS
2.1 Descubrimiento: P53psi es la única isoforma
generada por splicing alternativo (uso de un
sitio críptico de splicing 3´alternativo).
En ratones con lesiones:
Una de las funciones de P53 descritas
recientemente, es que reprime la expresión de
CD44, que es una glicoproteína transmembrana
que regula el crecimiento celular y la motilidad de
ciertos tipos de células. Hay una relación directa
entre el aumento de proteína p53 en el núcleo y
el descenso de CD44. Se había observado que un
descenso de CD44 suele venir acompañado de un
aumento de CD24 (y viceversa) en células no
hematopoyéticas procedentes de tejidos lesionados.
Esto llevó al equipo de Senturk et all a
cuestionarse si la actividad de p53 estaba
desregulada en las células con el fenotipo
CD44high/CD24low.
Para comprobar esta hipótesis se indujeron
lesiones con naftaleno en tejidos pulmonares
sanos de ratón. El naftaleno induce necrosis en las
células pulmonares debido a la conversión del
fármaco, por la enzima microsomal Cyp2F2, en
una toxina.
2 Mediante técnicas de citometría de flujo, y
clasificando las poblaciones celulares por FACS,
comprobaron que, tras la inyección con naftaleno,
se
produce
expansión
de
células
CD44high/CD24low. (Figura 1A). Al analizar en
estas células la expresión de los genes que
normalmente están regulados por p53, se observó
que la cantidad de transcritos disminuía
considerablemente en comparación con las células
CD44low/CD24high, es decir, su expresión estaba
desregulada. Si estos genes no estaban siendo
regulados, la hipótesis sobre la desregulación de
p53 en este tipo celular se confirmaba.
Tras confirmar la desregulación de p53 en
células con fenotipo CD44high/CD24low , quisieron
ver cómo variaba la expresión de p53 en estos
ratones a tiempo 0 (sin exposición a naftaleno) y
días después de la primera inyección. Para ello
hicieron RT-PCR con oligos específicos para la
proteína en cuestión. Los resultados obtenidos se
midieron por electroforesis en gel. (Figura 1B)
A tiempo 0, el resultado fue el esperado, había
niveles basales de p53 en ratones sanos, pero en
cambio a los 14 días tras la inyección, se veían dos
bandas en el gel. No sólo había amplificado el
cDNA de p53, sino que también lo había hecho un
cDNA de mayor tamaño que el anterior, es decir,
había amplificación de dos cDNAs diferentes en
los ratones a los que se les había inducido lesión.
En éstas células se estaban transcribiendo dos tipos
de RNAs mensajeros distintos (con distinto
tamaños), ambos, transcritos a partir del mismo
gen.
El análisis de esas secuencias, sugirió que no
había mutaciones en los exones 6, 7 y 8.
Estudiando este resultado se comprobó que hay un
sitio aceptor de splicing alternativo en el intron 6
(Figura 1C). Por lo que esta banda estaba
reflejando una variante de p53, desconocida hasta
el momento, a la que denominaron p53 ψ, y ésta se
generaba a partir de este sitio críptico (alternativo)
de splicing. Además, cuando se comparó la
secuencia del cDNA de p53 entre especies se vio
que este lugar de splicing alternativo está
codificado por una secuencia intrónica altamente
conservada. Esto llamó mucho la atención dado
que lo normal es que las secuencias intrónicas sean
divergentes entre especies.
El siguiente paso era verificar si en las células
con fenotipo CD44high/CD24low, que tenían
desregulada la actividad de p53 y que expresaban
p53psi, diferían o no de las células con fenotipo
CD44 low /CD24high. Es decir, querían comprobar si
había una diferencia significativa en cuanto a la
expresión de p53psi en células cuya actividad de
p53 estuviera desregulada. Para ello hicieron el
mismo experimento anterior (RT-PCR de ratones
sanos-no sanos) pero esta vez con oligos
específicos para p53 psi 460-ex8 (Figura 1D).
Se confirmaron las sospechas; la expresión
high
de p53ψ está aumentada en las células CD44
low
/CD24 respecto a las CD44low/CD24high.
Mediante experimentos, realizados con el
objetivo de ver expresión de p53ψ en otros tejidos,
se llegó a la conclusión de que no solo se da
expresión de esta isoforma en los tejidos dañados
del pulmón sino que también se da en hígados
dañados (tratados con CCI4). No obstante, había
una clara ausencia de expresión en los tejidos
sanos.
En tumores humanos:
Como se ha mencionado anteriormente, p53
aparecía mutado en la mayoría de los tumores,
sobretodo en aquellos en fases más avanzadas o
metastásicos. Luego… había indicios de que p53Ψ
pudiera aparecer en estos tumores y pudiera tener
un papel alternativo a p53 en tumorogénesis.
Para poder demostrarlo se evaluó la expresión
de p53 y p53 Ψ usando ARN-FISH en microarrays
de tejido humano. Para ello se utilizaron 233
pacientes, con cáncer de pulmón no micrótico
(CPNM), principalmente con adenocarcinomas en
fase inicial.
El 22 % de los tumores expresaban la isoforma
p53Ψ, pero lo más interesante fue, que la mayoría
de los núcleos celulares positivos para esta
isoforma,
eran
células
con
fenotipo
CD44high/CD24low al igual que ocurría en ratones
(Figura 1E) Es decir, en humanos, vemos que
aunque p53psi no es exclusivo de este tipo celular,
son éstas células las que lo expresan en una
proporción significativamente mayor.
3 C A E B D Figura 1: A) Seleccionamos células por FACS que no sean endoepiteliales (CD31- ) gráfico izquierdo 1. De esas
poblaciones seleccionamos aquellas que no sean derivadas de la médula ósea (CD45-) gráfico izquierdo 2. Éstas
últimas son clasificadas por sus niveles de CD24, gráfico 3 izquierdo. Si nos fijamos en las poblaciones de células
con CD24 bajo, y CD44 alto (gráfico derecho), respecto al tiempo transcurrido tras la inyección con naftaleno,
vemos un aumento del porcentaje de los tipos celulares con el fenotipo CD44high/CD24low respecto al resto de
células CD31-/CD45-, llegando al 6% a los 21 días. B) análisis de RT-PCR de células de ratón de tejidos
pulmonares sanos y de aquellos a los que se les a inducido lesión por medio de naftaleno. (Dia 0: sanos; Días 7 y
14 tras administración de naftaleno). Usando cebadores de los exones 6 y 8 (para observar el RNAm que
codificaría para p53) y actina para normalizar. C) El gen p53 mutado tiene un sitio de splicing alternativo 3´en el
intrón 6. (en rojo). Esto produce un RNAm de mayor tamaño en p53 ψ , pero una proteína de menor (243 aa frente
a 393 aa). D) Representa la expresión de p53ψ usando como controles E-caherinas, CD24 y CD44 en células con
los fenotipos CD44high/CD24low y CD44low/CD24high. Usando actina para normalizar. E) Porcentajes de
células que expresan p53psi, y porcentaje que no expresan en el estudio realizado con tumores humanos.
Clasificación de CD44high/CD24low respecto al total de células analizadas.
Mediante el estimador de supervivencia (no
paramétrico) de Kaplan–Meier, se comprobó que
los pacientes cuyas células expresaban altos
niveles de p53psi, tenían una supervivencia más
reducida, ya que presentaban a menudo tumores
más agresivos.
2.2 Splicing alternativo en tumores:
La toma de decisiones ligada al splicing, se
debe a factores de splicing que actúan en CIS y
otros que actúan en TRANS (proteínas).
En células tumorales no solo hay una gran
desregulación en cuanto a la abundancia de estos
factores que actúan en trans, sino que hay una gran
cantidad de mutaciones que van a afectar a los
factores que actúan en cis. Generalmente, el sitio
aceptor de splicing 3´ contiene secuencia AG
intrónica conservada (en el límite intron 6/ exón 7),
por lo tanto mutaciones que provoquen el cambio
de -1G a A / T / C o -2A a G / T / C con respecto a
la unión de empalme, podrían favorecer al uso de
otro sitio aceptor críptico en el intrón 6. Dando
lugar al pre-RNA de la isoforma p53psi.
Para demostrar ese hecho teórico, estudiaron las
mutaciones más frecuentes en el gen TP53,
concretamente en el límite del intrón 6 /exón 7.
4 El análisis demostró que efectivamente las
mutaciones de -2A a G / T / C, eran las mutaciones
intrónicas más frecuentes para el gen (en posición
c.673-2A).
Para determinar la distribución celular de dicha
isoforma, se realizaron inmunofluorescencias
usando células HOP62 (con la composición del
minigen mencionada anteriormente) que generaban
p53psi y otras células (H1299) que expresan p53 y
p53psi ectópicamente, se detectaron diferencias
notables. ( Figura 3B) Hay una clara distribución
diferencial de p53psi (en el citoplasma) respecto a
p53 (en el núcleo).
Además para verificar que realmente la
mutación en posición c.673-2A era capaz de alterar
el splicing, generaron un minigén (Figura 2A) con
los fragmentos genómicos de los exones del 5 al 8
bajo el promotor de citomegalovirus (CMV).
Mediante RT-PCR se observan los derivados de la
transcripción del minigen (tras la transfección de
las células).
Todas estas evidencias son suficientes para
determinar que, la isoforma, no tiene actividad
transcripcional. (Aún así se realizaron otros
ensayos funcionales que determinaron que no
ejercía ninguna regulación en la expresión de otros
genes en los que p53FL sí influía).
Las células con la composición WT expresaban
el gen con normalidad, dando lugar a un RNAm
p53FL, sin embargo, cuando se variaba el residuo
A por otro G el resultado fue el esperado, se creaba
un RNAm de mayor tamaño (correspondiente al de
p53psi) (Figura 2B)
En definitiva, aunque p53psi no tiene actividad
transcripcional, cuando éste se expresa, como lo
hace en detrimento del RNAm de p53FL, (splicing
alternativo del mismo pre-RNAm) veremos que
limita la función fisiológica de p53, ya que muchos
de los genes reprimidos por p53 aumentan su
expresión y muchos de los genes activados por p53
disminuyen su expresión cuando tenemos p53psi.
(Hablamos de dominancia negativa).
2.3 p53ψ carece de actividad transcripcional:
Debido a un codón de stop temprano, dicha
isoforma es más pequeña (27 KDa) frente a la WT,
(Figura 3A), además debido a esta circunstancia,
carece de los residuos necesarios para unirse al
DNA, oligomerizar y su localización no es nuclear.
A B Figura 2: A) Construcción recombinante “minigen”. Bajo el promotor de CMV se encuentran los exones del 5 al
ocho con sus respectivas secuencias intrónicas. La figura muestra el splicing alternativo que surge al colocar una
mutación en la posición c.673-2A>G y el splicing del tipo WT. B) Electroforesis del producto de RT-PCR referente a
la expresión del minigen wt y la expresión del minigen con la mutación en el intrón (c.673-2A>G). Muestra el
tamaño de cada RNAm producido por splicing alternativo.
A B Figura 3: A) Gel que muestra el tamaño de la proteína p53 respecto a p53psi. B) Posición celular de p53 en núcleo
y p53psi en citoplasma.
5 2.4 Ganancia de función:
Adquisición de
características prometastáticas.
En los tumores la inhibición mediada por p53
(anti-proliferación y apoptosis en respuesta a
estrés) está “bloqueada”. Eso es lo que llamamos
un estado celular nulo de p53.
La baja supervivencia de personas con tumores
que expresan p53psi, da lugar a la hipótesis de que
en estas células se genera algo más que un estado
celular de p53 nulo.
Para probar esta hipótesis, se silenció la
expresión de p53Ψ en las células HOP62
(homocigóticas). Inmediatamente se observaron
cambios a nivel fenotípico (pérdida de forma
alargada mesenquimal) y molecular (aumento de
expresión de E-cadherina, y disminución de
vimentina y marcadores típicos de EMT: Zeb1,
twist, slug…). Todos estos cambios son distintivos
de células en transición mesénquima-epitelio.
Para
ver
que
este
cambio
ocurría
independientemente del estado de expresión de
p53, se indujo expresión de p53psi en células p53
nulas y p53 normales. Ocurría en ambas lo
contrario, cuando se expresaba p53psi, se
inducían
los
cambios
morfológicos
y
moleculares típicos de EMT. De este modo se
pudo asociar la expresión de marcadores de
EMT y el refuerzo de la capacidad invasiva a la
expresión de p53psi. Estas células tendrán mayor
motilidad e invadirán tejidos más fácilmente.
de p53psi desde el citoplasma a la matriz
mitocondrial, y esto en condiciones naturales es
un proceso dependiente de Tdt1.
Para averiguar qué papel ejercía p53psi en la
mitocondria, siguieron los pasos de p53, regulador
de la vía intrínseca de apoptosis.
P53 interacciona en la mitocondria con las
proteínas de la familia Bcl2 antiapoptóticas Bcl-xL
y Bcl-2) y proapoptóticas (BAK/BAX). Además
interacciona con MnSOD (enzima antioxidante) y
con CypD, un activador del poro de transición de
permeabilidad mitocondrial (mPTP). Éste en
condiciones normales está cerrado, ya que
comunica la matriz mitocondrial directamente con
el citoplasma. Pero se abre tanto por aumentos de
ión calcio como de especies reactivas de oxígeno
(ROS) en situaciones de estrés.
Por inmunoprecipitación descubrieron que,
p53psi no es capaz de unirse a estas proteínas de la
familia Bcl2, pero si que es capaz de unirse a
CypD de un modo directo al igual que p53.
Aun así se vieron respuestas muy diferentes
para p53 y p53psi ya que, aunque ambas en eran
capaces de inducir la apertura de mPTP, el destino
final de célula era totalmente diferente en los dos
casos. Mientras que P53 promovía muerte
celular, p53psi promovía EMT y motilidad
celular.
Se descubrió que la proteína p53psi se
encontraba a niveles basales en la matriz
mitocondrial. Además se sabía que Tdt1
(chaperona) era el encargado de translocar p53 a la
mitocondria en condiciones de estrés. Para ver si
éste también se encargaba de translocar p33psi, se
silenció el gen de Tdt1. Éstas células no mostraban
p53psi en la mitocondria, lo cual sugería que
efectivamente Tdt1 es también su translocador.
Otra particularidad de las células con Tdt1
silenciado era que, aunque expresaban p53psi,
dejaban de tener las características de una
célula EMT.
Tras múltiples experimentos, sugirieron que,
será la cantidad de los radicales libres de oxígeno
(ROS) acumulados en la célula los que determinen
si la célula muere o se promueve la motilidad.
Altos niveles de ROS inducirán muerte mientras
que niveles más bajos permitirán a la célula
aumentar su motilidad y le conferían competencia
metastásica. Cuanto más tiempo esté el mPTP
abierto, más flujo de electrones al exterior y mayor
acumulación de radicales libes de oxigeno dentro
de la mitocondria. En la generación de ROS no
solo influye el tiempo de apertura de mPTP, sino
que, p53 es capaz de activar la expresión de ciertos
genes que a su vez generan directa o
indirentamente ROS.
Para descartar la posible actuación de Tdt1 en la
EMT, consiguieron translocar mediante otro
método la proteína p53psi a la mitocondria,
manteniendo silenciado el Tdt1. Éstas células si
que mostraban características EMT. Se confirmó
de este modo que, para la transición epitelio
mesénquima es indispensable la translocación
Está claro que para la transición EMT se
requiere ROS, pero en menor medida que para los
procesos apoptóticos. Se hicieron experimentos de
silenciamiento de Cyp D e inhibición de ROS
(experimentos independientes), los resultados
fueron los esperados, en ambos casos disminuía la
motilidad y el carácter invasivo, es decir, se
6 bloqueaba el EMT inducido por p53psi.
Por lo tanto la interacción de p53 psi con
CypD era capaz de incrementar la
permeabilidad mitocondrial (mPTP) de modo
que, aumentaba la concentración de ROS
suficiente para que se iniciara la transición
epiteio mesénquima.
3. Discusión
p53-psi se produce por splicing alternativo del
gen TP53. Concretamente por el uso de un sitio de
splicing criptico 3´en el intrón 6. Se trata de una
isoforma de 27 kDa, más pequeña que la
denominada p53FL “wildtipe”, que carece de los
residuos críticos para unirse al DNA y para
translocarse al núcleo, por consiguiente, no tiene
actividad como regulador transcripcional, no
oligomeriza y se encuentra localizada en el
citoplasma. Mediante experimentos realizados in
vitro, demostraron que p53ψ no interfiere con el
modo de acción de p53FL (otras isoformas sí lo
hacen), pero sí se ha observado que la baja
regulación de la transcripción (por parte de p53FL)
en células que expresan p53ψ se debe únicamente a
que dicha proteína se produce a expensas de los
transcritos del mRNA de p53FL.
Las células que expresan p53ψ, tienen un
acelerado envejecimiento, corto periodo de vida y
en algunos casos se ve favorecida la producción de
tumores. Además p53ψ está implicada en la
adquisición de características metastásicas, a
través de una interacción con ciclofilina D en la
matriz de la mitocondria, en la transición eptileiomesénquima (EMT), induciendo la expresión de
marcadores propios de EMT, en el refuerzo de la
capacidad invasiva de las células y el
favorecimiento de la motilidad de las mismas.
Desde mi perspectiva, hay todo un mundo detrás
de p53, su inducción, su regulación y la
funcionalidad de sus mutaciones, obviamente mi
comprensión y conocimiento sobre el tema es muy
limitado, pero creo que el descubrimiento de esta
nueva isoforma rompe un poco los esquemas sobre
lo establecido anteriormente, por lo menos lo que
concierne a “mis esquemas”, ya que, considero
muy paradógico que se puedan crear a partir del
mismo pre-RNAm una de las proteínas supresoras
de tumores más importantes del genoma y a su vez,
una proteína inductora de tumorogénesis, todo ello
a partir de una única mutación (un cambio de
nucleótido) en un solo gen.
4. Bibliografía
[1] Appella, E., & Anderson, C. W. (2001). Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic
stresses. European Journal of Biochemistry, 268(10), 2764-2772.
[2] Espinosa, J. M., Verdun, R. E., & Emerson, B. M. (2003). p53 functions through stress-and promoter-specific
recruitment of transcription initiation components before and after DNA damage. Molecular cell, 12(4), 1015-1027.
[3] Gorrini, C. (2014). Discovery of a p53 variant that controls metastasis. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 111(32), 11576-11577.
[4] Holmila, R., Fouquet, C., Cadranel, J., Zalcman, G., & Soussi, T. (2003). Splice mutations in the p53 gene: case
report and review of the literature. Human mutation, 21(1), 101-102.
[5] Venables, J. P. (2004). Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer research, 64(21), 7647-7654.
[6] Vousden, K. H., & Prives, C. (2009). Blinded by the light: the growing complexity of p53. Cell, 137(3), 413-431.
Artículo principal: resultados y conclusión.
Senturk, S., Yao, Z., Camiolo, M., Stiles, B., Rathod, T., Walsh, A. M., ... & Sordella, R. (2014). p53Ψ is
a transcriptionally inactive p53 isoform able to reprogram cells toward a metastatic-like state.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(32), E3287-E3296
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