Morelos y Pavón

Instituto Tecnológicode Morelia
“José Ma. Morelos y Pavón”
“ Análisis de la Diversidad Genética en Cruzas de Agave
tequilana var. azul”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
INGENIERO BIOQUIMICO
PRESENTA
ERIKA MARTINEZ GARCIA
DIRECTOR DE TESIS
DRA. JUNE SIMPSON WILLIAMSON
Irapuato Guanajuato, Septiembre del 2005
Dedicatoria
A mis Papás Eloisa García Suárez y José Benjamín
Martínez Ramos,
gracias por su amor, comprensión y
cuidados, pero sobre todo por esa inmensa paciencia demostrada
durante toda mi vida, a mis hermanos Viole, Wendy, Mely,
Manuel, Benja, y a bebe Michelle.
Gracias por su ayuda incondicional, quiero decirles lo mucho que
significan para mí y darles las gracias por su tiempo, su amor
incondicional que me han dado siempre, por su apoyo y sus
consejos y sobre todo por estar siempre conmigo, a todos ustedes
les debo lo que ahora soy.
Agradecimientos
A DIOS Por darme la vida, salud, amigos.
A mis papas que son mi mayor motivo de superación
gracias por darme la oportunidad de vivir, y por orientar
con sabiduría mis pasos.
A mis hermanos y a mi bebe Michelle por su amistad
compañía y sobre todo por el apoyo que me han dado
siempre.
A la Dra. June por haberme aceptado a formar parte de
su equipo de laboratorio, por sus consejos, enseñanzas,
ayuda, paciencia y comentarios.
A Katia por haberme aceptado como su tesista por todas
sus enseñanzas, consejos, ayuda y por su paciencia a lo
largo del tiempo que estuve en el laboratorio, y sobre
todo por su amistad que me dio durante este tiempo.
A Emy
A SIHGO No. 2002020609 por la beca otorgada para la
realización de esta tesis.
El presente trabajo fue realizado en el Centro de
Investigación y de estudios avanzados del Instituto
Politécnico Nacional, Unidad Irapuato, en el
departamento de Ingeniería Genética bajo la
dirección de la Dra. June Simpson Williamson y la
M.C. Katia del Carmen Gil Vega.
INDICE
Índice
Página
Dedicatoria…………………………………………………………………………
i
Agradecimientos………………………………………………………...................
ii
Índice de figuras………………………………………………................................
iii
Índice de tablas……………………………………………….................................
v
I. Resumen …………………………………………………………………………
1
II. Introducción…………………………………………………………………….
3
III. Antecedentes…………………………………………………………………...
5
3.1. Género Agave…………………………………………………………….
5
3.2. Historia……………………………………………………………………
6
3.3. Elaboración del tequila…………………………………………………...
7
3.4. Agave L. americana var. americana……………………………………...
10
3.4.1. Descripción biológica de la planta……………………………………...
10
3.4.2. Reproducción y ciclo de vida de Agave americana……………………... 11
3.4.3. Usos de Agave americana……………………...…………………...…… 11
3.5. Agave tequilana Weber var. azul…………………………………………
12
3.5.1. Descripción biológica de la planta……………………………………..
12
3.5.2. Reproducción de Agave tequilana Weber var azul…………………...…
13
3.6. Propagación de Agave tequilana ………………………………………….
14
3.7. Polinización………………………………………………………………..
15
3.8. Información genética y algunas herramientas para su análisis……….
17
3.8.1. El ácido desoxirribonucleico (ADN)………………………………...
17
3.9. Marcadores moleculares………………………………………………….
17
3.9.1. Reacción en cadena de la polimerasa……………………………….
19
3.9.2. AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos
amplificados)……………………………………………………………………....... 20
3.9.3. Usos…………………………………………………………………… 22
3.10. Métodos de análisis……………………………………………………...
23
IV. Justificación…………………………………………………………………….
25
V. Objetivos………………………………………………………………………...
26
5.1. Objetivo general…………………………………………………………..
26
5.2. Objetivos específicos……………………………………………………...
26
VI. Materiales y Métodos………………………………………………………….
27
6.1. Material……………………………………………………………………
27
6.1.1. Cruzas intraespecíficas…………………………………………….
27
6.1.2. Cruzas interespecíficas…………………………………………….
28
6.2. Métodos……………………………………………………………………
30
6.2.1. Extracción de ADN………………………………………………...
30
6.2.2. Técnica de AFLP……………………………………………………
31
6.2.2.1. Restricción del ADN………………………………………
31
6.2.2.2. Ligación de
32
adaptadores……………………………………
6.2.2.3. Primera amplificación……………………………………
32
6.2.2.4. Amplificación selectiva……………………………………
33
6.2.2.5. Desnaturalización…………………………………………
34
6.2.2.6. Electroforesis en gel de poliacrilamida……………………
35
6.3. Análisis de datos…………………………………………………………..
35
6.3.1. Cálculo de la distancia genética y análisis de agrupamiento……
35
6.3.2. Cálculo de la distancia genética…………………………………...
36
6.3.3. Cálculo de similaridad genética…………………………………...
36
VII. Resultados y Discusión..……………………………………………………..
37
7.1. ADN obtenido de plantas provenientes de cruzas intraespecíficas e
interespecíficas en Agave sp………………………………………….......................
37
7.2. Digestión de ADN…………………………………………………………. 38
7.3. Preamplificación de ADN…………………………………………………. 40
7.4. Bandas monomórficas y
41
polimórficas……………………………………...
7.5. Electroforesis en gel de poliacrilamida…………………………………… 42
7.6. Porcentaje de polimorfismo encontrado en la progenie de cruzas………... 43
7.7. Análisis estadístico de resultados…………………………………………. 45
VIII. Conclusiones…………………………………………………………………
56
IX.
58
Referencias………………………………………………………………………
X. Apéndice ………………………………………………………………………...
63
Indice de Figuras
Figura 1: Mayahuel diosa del maguey………………………………………………
6
Figura 2: Territorio de denominación de origen de Agave tequilana……………….
9
Figura 3: Agave americana var. americana……………………………………….
10
Figura 4: Agave tequilana Weber var. Azul............................................................... 13
Figura 5: Formas de reproducción de Agave………………………………………..
14
Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa……………………………………..
19
Figura 7: Esquema de la técnica de AFLP……………………………………………………………….
21
Figura 8: Agave tequilana con inflorescencia o quiote…………………………….. 27
Figura 9: Frutos y bulbilos de Agave tequilana………………………………………………………………………..
28
Figura 10: Semillas formadas de Agave tequilana..................................................... 28
Figura 10: Semillas germinadas de Agave………………………………………….
28
Figura 12: ADN ajustado a 100 ng/µl………………………………………………. 38
Figura 13: Ejemplo de ADN digerido (carril 2)…………………………………….. 39
Figura 14: ADN parcialmente digerido (carril 3)…………………………………...
40
Figura 15: ADN preamplificado…………………………………………………….
41
Figura 16: Bandas monomórficas y bandas polimórficas…………………………...
41
Figura 17: AFLP fluorescente ……………………………………………………… 42
Figura 18: Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice de 49
Nei y Li (1979)…………………………………………………………………...
Figura 19: Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice de 50
Jaccard (1908)……………………………………………………………………
Figura 20: Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice de 51
Simple Matching (opción Sokal y Sneath 1)……………………………………..
Figura 21: Dendrograma utilizando el programa de NTSYS utilizando el índice de
Nei y Li (1979)…………………………………………………………………........ 52
Figura 22: Dendrograma utilizando el programa de NTSYS utilizando el índice de
Jaccard (1908)......................................……………………………………………...
53
Figura 23: Dendrograma utilizando el programa de NTSYS utilizando el índice de
Simple Matching (Skroch et al.,
1992)......................................……………………………………………................
Figura 24: Dendrograma FreeTree utilizando el índice de similaridad de Simple
Matching (Skroch, et al, 1992) (Sokal y Sneath 1) y un análisis de remuestreo
54
bootstrap………………………………………………………………….. 55
Indice de Tablas
Tabla 1. Secuencia de adaptadores y oligonucleótidos usados para los AFLP ……………..
32
Tabla 2. Combinaciones de oligonucleótidos utilizados para los análisis AFLP…...
33
Tabla 3: porcentaje de polimorfismos de las cruzas por separado………………….. 42
I. Resumen
Agave americana fue la primera especie del género Agave descrita por
Linneo en 1753, tomándola como la especie “tipo”. Agave tequilana var. azul,
es miembro del mismo género y es una especie de gran importancia
económica ya que es la única con la que según la Norma Oficial Mexicana
puede elaborarse legalmente el tequila (Valenzuela, 1994).
En Agave una forma de propagación muy utilizada para establecer nuevas
plantaciones es la asexual aprovechando la formación de hijuelos de rizoma
de la planta madre, también existe la propagación asexual por bulbilos que
son pequeños hijuelos de la inflorescencia conocida como quiote, los cuales
nacen cuando la producción de frutos es nula o mala. Otro tipo de
reproducción es la forma sexual por medio de semillas, la cual es la
alternativa para generar variabilidad genética, existen muy pocos estudios
acerca de este tipo de reproducción en Agave, esto es, entre varias causas,
por el largo ciclo de vida de la planta, por que solo tiene una floración al
final de su vida, por la inaccesibilidad al eje floral y por las prácticas
agronómicas de cortar la inflorescencia. En el presente trabajo se estudió
la variabilidad genética de las
obtuvieron
de
interespecíficas).
las
cruzas
Para
este
plantas germinadas de semillas que se
realizadas
análisis
de
(cruzas
progenie
intraespecíficas
resultado
de
e
la
reproducción sexual, se utilizaron tres plantas de Agave tequilana Weber
var. azul. y una planta de Agave americana L. var. americana.
Se analizó la diversidad genética obtenida de estas cruzas para lo cual se
utilizaron marcadores moleculares los cuales nos permiten examinar las
diferencias en el material genético de diferentes organismos, también
conocidos como marcadores de ADN, ya que detectan diferencias en la
secuencia del ácido desoxirribonucleico (ADN) y son abundantes y aplicables
en todos los organismos (Nelson, 1986, citado en, Abraham J, 2004).
Para este trabajo se utilizaron marcadores moleculares tipo
AFLP
(Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos Amplificados), por su
rapidez, consistencia y número de loci revelados, empleando un método de
detección de fragmentos de ADN (bandas) con fluorescencia, y utilizando
cuatro combinaciones de oligonucleótidos para cada grupo.
Los fragmentos resultantes de la técnica de AFLP, fueron leídos con el
software SAGA, los cuales indican la presencia de un fragmento de ADN
con un signo (+) o un signo (-) para indicar la presencia o ausencia respectiva
de fragmentos. Estos se convirtieron en datos numéricos (1 y 0
respectivamente) para tener una base de datos de manera cuantitava.
Estos resultados fueron analizados utilizando distintos coeficientes de
similaridad genética para obtener una matriz de similaridad genética. Para
la construcción del
dendograma, se utilizó un método de promedio
aritmético de grupos de pares no ponderados (UPGMA) con los software
FreeTree (Hampl et al., 2001) y NTSYSpc 2.0.
El porcentaje de polimorfismo se calculó con base en un total de 253
marcadores (fragmentos amplificados en las combinaciones), analizando las
imágenes de los geles desde 50 hasta 300 pares de bases, se analizaron en
total 34 individuos incluyendo los 4 progenitores y 30 descendientes de las
cruzas que se realizaron, el polimorfismo global encontrado fue alto (79 %),
y el porcentaje de polimorfismo de cada cruza también fue alto P5 X P3 (64
%), P3 X P5 (62 %), P5 X P4 (56 %), P5 X Aa (62 %), P3 X Aa (69 %). Estos
resultados son similares a los previos reportados por Zamudio en el 2004 y
son aceptables ya que son resultados que provienen de análisis de progenie
de reproducción sexual.
En todos los dendrogramas generados se observó una clara separación entre
dos grupos, uno que contiene a la progenie de las cruzas intraespecíficas y
el otro a la de las cruzas interespecíficas independientemente del software
utilizado o del coeficiente de similitud genética.
II. INTRODUCCIÓN
Los agaves o magueyes como se les conoce comúnmente pertenecen a la
familia Agavaceae, son herencia de la cultura prehispánica y son plantas que
tienen la cualidad de adaptarse a climas de excesivo calor y sobrevivir a
temperaturas extremas, sequía prolongada y suelos muy ácidos o alcalinos
(Stefanis y Langhans, 1980, citado en: Díaz, 2004).
En México los agaves tienen gran importancia económica y cultural para
numerosos grupos indígenas y mestizos, quienes los han aprovechado
durante siglos como fuente de alimento, bebida, medicina, combustible,
cobijo, ornato, abono, construcción de viviendas y obtención de implementos
agrícolas entre otros usos (García-Mendoza, 2004).
El nombre Agave proviene del griego y significa admirable (Gentry, 1982).
Este género fue descrito por Carlos Linneo en 1753, quien nombró a la
primera especie Agave americana que a su vez fue denominada la planta del
siglo XX (Nobel, 1994).
Este tipo de plantas se caracterizan por un tallo corto y hojas (pencas)
gruesas y en forma de roseta, una espina terminal y comúnmente espinas en
los bordes, florecen solo una vez en la vida para después morir (Gentry,
1982).
Son plantas con metabolismo fotosintético tipo CAM (Metabolismo ácido
crasuláceo) lo que permite a sus células con cloroplastos la capacidad de
fijar cantidades significativas de CO2 en la oscuridad, lo que conduce a la
síntesis y acumulación de ácido málico en la vacuola (Nobel, 1994).
El producto de agave más importante es el tequila el cual se elabora de
Agave tequilana Weber var. azul, este agave es una especie que esta
cultivada en las regiones con denominación de origen y es la única planta
permitida según la norma oficial mexicana para la producción de tequila, una
de las bebidas alcohólicas más consumidas a nivel mundial.
El agave tiene dos formas de reproducción, en la forma asexual se
aprovechan los hijuelos de rizoma de la planta madre para establecer nuevas
plantaciones y esta práctica agronómica se utilizó al menos durante 200
años y esta puede ser una de las razones por las que en un estudio hecho en
Jalisco en Agave tequilana Weber var. azul no se presentó variabilidad
genética significativa (Gil-Vega et al., 2001), lo que conlleva a que todas las
plantas puedan presentar
la misma susceptibilidad a plagas
y
enfermedades.
Está reportado que la reproducción en forma asexual por bulbilos y sexual
por semillas en razón de producciones industriales no son utilizadas ya que
sería económicamente incosteable por el tiempo de desarrollo tan largo que
presentan (Granados, 1993) y que la reproducción de agave por medio de
semillas tiene un bajo porcentaje de germinación, su crecimiento es lento y
las plántulas resultantes son genéticamente heterogéneas, debido a que
poseen características de ambos progenitores (Valenzuela, 1997), pero no
ha habido investigaciones a fondo de estas opciones de reproducción.
III. ANTECEDENTES
3.1. Género Agave
El género más diverso de la familia Agavaceae es Agave; de sus aproximadamente 200
especies en América 150 (75%) se distribuyen en México, con un 69% de endemismo.
Agave es también el género con la mayor distribución en la familia, crece del sur de
Estados Unidos a Colombia y Venezuela, incluyendo las islas del Caribe (GarcíaMendoza, 2004).
El genero Agave se divide en dos subgéneros según el tipo de floración que presenta, el
subgénero Agave que presenta una inflorescencia en panícula, con umbelas en ramas
laterales en el cual se encuentran las especies de importancia económica tales como
Agave tequilana, Agave fourcroydes, Agave Angustifolia y el subgénero Littaea que
presenta inflorescencias en espiga con flores unidas al eje floral en pares, agrupadas y
rara vez en racimos, en pequeños grupos distintos, un ejemplo es Agave obscura
(Granados, 1993).
Los agaves son plantas suculentas capaces de resistir condiciones difíciles, sequías,
suelos pobres o rocosos y temperaturas elevadas. Son plantas perennes, rizomatosas, de
tallos acaudales, hojas grandes dispuestas en roseta y suculentas-fibrosas que terminan
en una espina; los márgenes de las hojas presentan pequeñas espinas ganchudas o
rectas; inflorescencia en espiga o panoja con escapo largo semileñoso; las flores son de
color amarillo verdoso, protándricas con perianto infundiliforme de tubo de longitud
variable y seis segmentos casi iguales; anteras amarillentas; fruto capsular leñoso
alargado (Granados, 1993).
Los agaves son monocárpicos semélparos esto es que solo tienen una floración al cabo
de la cual la planta muere. Aún cuando exista alta producción de semilla en la
reproducción sexual, debido a su gran depredación y también a que las condiciones de
germinación no son siempre muy adecuadas, por esta razón su reproducción es
principalmente en forma asexual (por hijuelos de rizoma) (Granados, 1993).
3.2. Historia.
Los agaves o magueyes como se les conoce comúnmente, pertenecen a la familia
Agavaceae y representan un grupo de plantas suculentas típicas de zonas semiáridas de
México con gran importancia biológica, ecológica, y económica para el país (GarcíaMendoza, 1992).
Los nahuas conocen a los magueyes con el nombre genérico de metl: en 1753 Linneo,
designa con el nombre genérico de Agave a este tipo de plantas. La palabra maguey
proviene de la raíz griega que significa “admirable “ y describe no solo su rara
apariencia sino también su longitud y floración que ocurre solo una vez en la vida para
después morir, los magueyes se utilizaron desde las raíces hasta las semillas recibiendo
cada órgano de la planta un nombre especial. Llegaron incluso a deidificarla como la
diosa Mayahuel (Figura 1), la diosa del maguey (García-Mendoza, 1992).
Figura 1: Mayahuel diosa del maguey
Durante el florecimiento de las culturas mesoamericanas las especies de la familia
Agavaceae jugaron un papel muy importante proporcionándole al hombre alimento,
calor, techo, vestido, medicina, bebida, uso religioso, etc. Existen diversas formas de
emplear los magueyes entre las que podemos mencionar las pencas que se utilizaron
para la elaboración de hilos, cordeles, mantas, tapetes, morrales, los tallos o quiotes
como vigas para construcción de casas, las puntas de las pencas como clavos, punzones
o agujas, la planta para delimitar terreno, las pencas como tejado, las raíces y pencas
para jabón, las raíces como cepillos para lavar y escobas, además de usos importantes
como la obtención de bebidas frescas, fermentadas, y destiladas (García-Mendoza,
1992).
El aguamiel es importante como bebida alimenticia ya que contiene una gran
variedad de aminoácidos, lo que la hace necesaria para los habitantes de las
zonas donde el agua potable es escasa (Granados, 1993).
El pulque es un jugo dulce (aguamiel) fermentado de agave, ha sido
tradicionalmente una bebida alcohólica importante entre indígenas y
mestizos de la Meseta Central (Granados, 1993).
El mezcal: Es una bebida alcohólica que se obtiene por la destilación y rectificación de
los mostos (o jugos) preparados con los azúcares extraídos de agaves, los cuales son
cocidos y sometidos a fermentación alcohólica, es una bebida popular de México
(Granados, 1993).
El tequila es una bebida de gran importancia económica para Jalisco y para México y
Agave tequilana Weber var. azul es la única especie con la que puede elaborarse
legalmente el tequila, el cual es una de las bebidas más conocidas a nivel mundial
(Valenzuela, 1994).
3.3. Elaboración de tequila
El proceso de elaboración del tequila comienza con la selección de hijuelos para ser
plantado en el Territorio de Denominación de Origen (www.crt.org.com).
La obtención inicia cuando los agaves han alcanzado su madurez fisiológica, es decir,
cuando son capaces de aportar las mejores mieles y comienza a crecer la inflorescencia.
En ese momento se desquiota (corte de la inflorescencia), lo que quiere decir que está
listo para la jima, técnica que consiste en cortar las hojas de la planta al ras de la base
para dejar únicamente la cabeza o corazón de agave (www.crt.org.com).
Una vez jimado el agave se transporta a las fabricas tequileras donde las cabezas se
desgarran y se conducen a autoclaves, donde la materia prima se cuece con vapor de
agua a presión. La finalidad de esta etapa es convertir la inulina (azúcar de agave), en
azúcares como fructosa y sacarosa, que son fácilmente fermentables (García-Mendoza,
1992).
Las cabezas cocidas se transportan a unas desgarradoras con el objetivo de disminuir su
tamaño. La cabeza cocida se corta en pequeños pedazos, los cuales se pasan a través de
molinos donde se exprime y se agrega agua a presión al bagazo. De esta manera se
obtienen las mieles o mostos que se fermentarán, los cuales se reciben en depósitos y se
transportan a través de tuberías a las tinas de formulación o fermentación para la
elaboración del tequila (García-Mendoza, 1992).
La formulación consiste en mezclar las mieles de las cuales un mínimo de 51% proviene
de Agave tequilana Weber var. azul con un preparado de otras mieles (azúcar estándar,
piloncillo, melaza, etc.). La fermentación es una de las etapas más importantes del
proceso, ya que aquí es donde se lleva a cabo la transformación de los azucares en
alcohol etílico, y otros productos en menores proporciones. La fermentación se lleva a
cabo en grandes tinas de acero inoxidable, las cuales son cargadas con las mieles
también llamadas mostos. A estos se les agrega agua, levaduras (Saccharomyces
cerevisiae), que transforman los azúcares en alcohol, bióxido de carbono y agua
(www.crt.org.com).
La destilación es el procedimiento por el cual los fermentos son separados, mediante
calor y presión, en productos de riqueza alcohólica (tequila) y vinazas; estas últimas
constituyen un producto de desecho. En la destilación los fermentos son transportados
por tuberías a los alambiques de destilación, donde se calientan a altas temperaturas. La
destilación se efectúa en alambiques de cobre o acero inoxidable, e incluso en torres de
destilación continua (www.crt.org.com).
En la elaboración del tequila son necesarias dos destilaciones, la primera llamada
destrozamiento y la segunda rectificación. Con la rectificación se incrementa la riqueza
alcohólica y se eliminan los productos indeseables, obteniendo un producto de mayor
pureza (García-Mendoza, 1992).
Existen 4 tipos de tequila según la Norma Oficial Mexicana NOM-006-SCFI-1994.
El tipo I: producto de la rectificación y ajustado con agua de dilución a su graduación
comercial.
El tipo II: tequila blanco adicionado con uno o más saborizantes y colorantes inocuos
para suavizar el sabor.
El tipo III: producto que se deja al menos 2 meses en recipientes de roble o encino,
susceptible de ser abocado
El tipo IV: producto sometido a maduración por lo menos de un año en barricas de
roble o encino, susceptible de ser avocado y ajustado con agua de dilución a su
graduación comercial.
El tequila original se extrae de Agave tequilero (Agave tequilana Weber var. azul) y se
produce solo en un territorio protegido por la denominación de origen, el cual fue
otorgado el 22 de noviembre de 1974, por la entonces Secretaría de industria y
Comercio, el cual fue modificado por última vez el 26 junio del 2000. Este territorio
protegido por la denominación de origen abarca 180 municipios en total, todos los
municipios del estado de Jalisco y 30 municipios de Michoacán, 7 municipios de
Guanajuato y 8 municipios de Nayarit y 11 de Tamaulipas (Figura 2) (García-Mendoza,
1992).
Figura 2: Territorio de denominación de origen de Agave tequilana.
3.4. Agave americana L. var. americana
Agave americana es cultivado en distintos climas alrededor del mundo,
responde bien al clima del Mediterráneo, y al hábitat regional del noreste
de México donde hay precipitaciones en el verano-otoño, y es relativamente
seco en el invierno-primavera (Gentry, 1982).
3.4.1. Descripción Biológica
Agave americana es una planta de tamaño mediano a grande, tallo corto, con
roseta que mide de 1 a 2 m de alto por 2 a 3.7 m de ancho, la mayoría de las
hojas miden de 10 a 20 x 1.5 a 2.5 dm, lanceoladas, angostas hacía arriba,
usualmente acuminadas, de color gris claro de cutícula lisa a áspera, con
márgenes ondulados, dientes variables de 5 a 10 mm de largo, las espinas de
3 a 5 cm de largo cónicas acanaladas de abajo, las panículas son
generalmente de contorno alargado (Figura 3) (Gentry, 1982).
Las flores de Agave
americana, en forma típica y en sus numerosas
variantes cultivadas en el noreste de México, son caracterizadas por un
ovario corto
afilado; los
tépalos externos son gruesos, carnudos y
alargados; y los tépalos internos más pequeños (Gentry, 1982).
Figura 3: Agave americana var. americana
3.4.2. Reproducción y ciclo de vida de Agave americana
El tipo de reproducción que presenta esta especie es libre por medio de
hijuelos de rizoma de la planta madre y algunas veces por semillas, no
existen reportes de bulbilos (Gentry, 1982; Granados, 1993; Arizaga 2002).
Agave americana florece después de 10 años de crecimiento en tierras con
climas cálidos y puede tardar hasta 35 años o más en florecer si se
encuentran en climas fríos (Irish e Irish, 2000).
3.4.3. Usos de Agave americana
La planta de Agave americana tiene usos ornamentales y se utiliza también
para la obtención de fibras, esta planta fue llevada con estos fines por los
españoles y los portugueses (a los Azures y las Islas Canarias). Para el siglo
XVIII Agave americana fue establecida en las costas del Mediterráneo.
Entre las principales fuentes de pulque en México (datos observados entre
1940 a 1970) se encuentra Agave americana (Gentry, 1982).
Agave americana debido a su mejor comestibilidad y fibras ha sido
extendido geográficamente por el hombre. Las variedades horticulturales
de Agave americana son ampliamente distribuidas alrededor del mundo
(Gentry, 1982)..
3.5. Agave tequilana Weber var. azul
La
planta
de
Agave tequilana Weber var. azul goza de ciertas
características que la hacen diferente de otros agaves, ya que es una planta
carnosa en forma de roseta, fibrosa, de color azul o verde grisáceo
originado por un alto contenido de ceras que impiden que la planta pierda
agua. Sus hojas son rígidas, con espinas marginales y apicales; almacena
inulina en el tallo y es productora de fructuosa (Granados, 1993).
Agave tequilana Weber var. azul pertenece al subgénero Agave, cuya inflorescencia es
una panícula. Se incluye en la sección Rigidae a la cual pertenecen gran variedad de
especies mezcaleras de México y Centroamérica. Es fácilmente reconocible por sus
hojas angostas y muy rígidas (http://www.crt.org.mx/esp/teq_acerca1.asp).
3.5.1. Descripción Biológica de la planta.
Agave tequilana Weber var. azul, es descrita, como una planta surculosa, extendida
radialmente, con una altura de 1.2 a 1.8m, con tallos gruesos y cortos de 30 a 50 cm de
altura en su madurez. Las hojas son de 90 a 120 x 8 a 12 cm, lanceoladas, acuminadas,
de fibras firmes, la mayoría de ellas rígidamente estiradas, cóncavas ascendiendo a
horizontal, donde lo más ancho de las hojas se encuentra a la mitad, disminuyendo y
engrosando hacia la base, generalmente de azulado a verde grisáceo, algunas veces con
zonas de coloración cruzada, con un margen recto a ondulado o pando; los dientes son
de color café claro a oscuro, generalmente regulares en tamaño y espaciamientos y en
pocos casos irregulares, en su mayoría de 3 a 6 mm de largo a través de la parte media
de la hoja, se encuentran separados de 1 a 2 cm de longitud, rara vez son más largas,
achatadas o surcadas, abiertamente arriba, con base ancha, de color café oscuro,
decurrente; la panícula tiene 5 a 6 m de altura con gran densidad de ramas con 20 a 25
umbelas grandes difusas de flores verdes y estambres rosados, las flores tienen de 68 a
75 mm de largo en pequeños pedicelios, bracteolados de 3 a 8 mm de longitud; el ovario
es de 32 a 38 mm de largo, cilíndrico, con cuello corto terminado ligeramente en punta
sobre la base; el tubo floral es de 10 mm de profundidad de 12 mm de ancho,
funeliforme y surcado; los pétalos son desiguales de 25 a 28 mm de longitud con 4 mm
de ancho, lineares, erectos, pero rápidamente flojos en antesis tornándose en cafés y
secos: los filamentos son de 45 a 50 mm de longitud dobladas hacia adentro contra el
pistilo, insertados a 7 y 5 mm arriba de la base del tubo, las anteras miden 25 mm de
largo; el fruto es una cápsula ovada a brevemente cuspidada (Figura 4) (Gentry, 1982).
Figura 4: Agave tequilana var.
azul
3.5.2. Reproducción de Agave tequilana Weber. var. azul
El tipo de reproducción de Agave tequilana Weber var. azul que se realiza comúnmente
es por hijuelos de rizoma, que consiste en transplantar los hijuelos que brotan de los
rizomas de la planta. Esto es recomendable cuando alcanzan una altura de 50 cm, ya que
después de cierto tiempo la perjudican debido a que la circulación de las sustancias
nutritivas se efectúa más efectivamente hacia las partes nuevas de la planta, en éste
caso, a los hijuelos (Granados, 1993).
Una vez alcanzada la madurez, el agave comienza a reducir el tamaño de sus hojas en el
cogollo o centro, haciéndose más pequeñas y numerosas por el crecimiento de una
inflorescencia llamada quiote. Este quiote crece rápidamente y consume todos los
azúcares que se acumularon durante años, es por esta razón que es cortado, a esta
operación se le llama desquiote.
(http://www.acamextequila.com.mx/noflash/elagave.html).
3.6. Propagación de A. tequilana
El agave tiene tres formas de propagarse, por vía sexual en forma de semillas y la vía
asexual por hijuelos de rizoma y bulbilos (pequeños hijuelos de la inflorescencia o
quiote) (Valenzuela, 1997).
La vía asexual es por hijuelos de rizoma (Figura 5a) que son usados para el
establecimiento de nuevas plantaciones, la cual, se ha practicado desde hace mucho
tiempo en Jalisco (200 años), la ventaja es la rapidez con que se obtienen plántulas de
buen tamaño y la cantidad de estos que produce la planta. Los bulbilos (Figura 5b), son
hijuelos que emergen en el quiote junto con las flores no fecundadas que caen
posteriormente sin formar frutos (Valenzuela, 1997).
La reproducción sexual (Figura. 5c), por semillas no es utilizada y pocas veces se ve ya
que se suprime la floración del cultivo. Las semillas tienen un bajo porcentaje de
germinación, su crecimiento es lento y las plantas resultantes son muy heterogéneas,
generan individuos con características de ambos progenitores con la recombinación de
genes, además, requieren un periodo casi de 3 años para convertirse en plantas de
tamaño adecuado para poder plantarse (Valenzuela, 1997).
5a.Hijuelos de
rizoma
5b.Bulbilos
5c. Reproducción sexual
Figura 5: Formas de reproducción de Agave.
3.7. Polinización
La polinización es el paso del polen desde el aparato masculino de las plantas
al aparato femenino. Este proceso se puede realizar fundamentalmente de
diferentes maneras como:
Polinización zoófila: Cuando esta es realizada por animales diversos como
insectos (polinización entomófila) o pájaros (polinización ornitófila), entre
otros, que transportan el polen en su propio cuerpo.
Polinización anemófila: Cuando es el viento es el encargado de transportar el polen.
Tiene lugar en plantas de flores poco vistosas pero que producen gran cantidad de
polen.
Polinización autopolinizante: Cuando el polen de los estambres de una planta cae
sobre el estigma de la misma planta
Cruzas intraespecíficas: Es cuando el polen de una flor fecunda sobre el estigma de
otra planta de la misma especie, en estas cruzas, el producto es más variable
genéticamente que en la auto polinización.
Cruzas interespecíficas: Es cuando el polen de una flor fecunda sobre el
estigma de otra planta de diferente especie, de este tipo de cruzas al
producto se le denomina híbrido, el cual presenta características de ambos
progenitores y se espera que presente una variabilidad mayor que los casos
descritos previamente. En Agave sp. no se han desarrollado híbridos
artificiales, el único programa exitoso de híbridos para obtener agaves
productores de fibras duras fue iniciado por Doughty en Tanzania en 1931
(Doughty, 1936) y culminó en la liberación del híbrido 11648 (A. angustifolia
X A. amaniensis) X A. amaniensis (Lock, 1962) (ambos trabajos citados en:
Piven et al., 2001).
Los Agaves en contraste con otros géneros de la familia Agavaceae, reciben beneficios
de una amplia variedad de polinizadores animales que se alimentan de polen y néctar.
Los visitantes de las flores de varios agaves incluyen colibríes, abejas carpinteras,
abejorros, abejas domésticas, abejas silvestres, avispas, moscos, entre otros, todos estos
visitantes son esencialmente crepúsculosos, con excepción de las abejas, esto prueba
que algunos agaves producen polen y néctar principalmente de noche, los polinizadores
acuden principalmente por la mañana o antes del crepúsculo. También se observa la
categorización por tamaño de los tallos florales ya que las abejas y abejorros acuden
primero a las más grandes, enseguida a las medianas y por último a las pequeñas
inflorescencias (Granados, 1993).
El pequeño tamaño de la mayoría de los insectos que visitan a los agaves permite robar
el néctar entrando a las flores arriba de los tépalos evitando los estigmas receptivos
(Slauson, 2000).
Los agaves son monocárpicos y cuando comienza la floración el agave desarrolla una
inflorescencia conocida como quiote en la cual hay un rápido alargamiento del
meristemo. Las flores producen abundante néctar con el cual atraen a sus polinizadores
naturales los cuales de acuerdo con estudios realizados acuden principalmente de noche
ya que se ha demostrado que hay una mayor secreción de néctar por la noche, mientras
que los visitadores diurnos comienzan a visitar la inflorescencia en la mañana y decrece
su presencia durante el transcurso del día (Arizaga et al., 2000).
Para la reproducción de las flores, los granos de polen deben ser removidos del
estambre de una flor al estigma de la misma o de diferente flor, los granos de polen son
apenas discernibles al ojo humano, su pequeño tamaño permite que sean transportados
por el viento, pero esta polinización es ineficiente y probablemente no es importante
para la reproducción de agaves. El fruto de agave generalmente contiene muchas
semillas (Nobel, 1994).
La costumbre obligatoria de los agricultores de truncar el eje floral, hace casi imposible
la colecta de variedades en condiciones no controladas, es esta una razón de que la
diversidad genética de agaves haya disminuido, probablemente esta reducción inició
con el uso de estas plantas para obtener los azúcares almacenados en el tallo, para lo
cual la flor se elimina, otra causa es el uso específico de propagación por la vía asexual.
El maguey cuyo eje floral ha sido cortado continua el proceso de madurez sin la flor,
bajo tales circunstancias la reproducción sexual y por lo tanto los entrecruzamientos no
se presentan y como consecuencia la diversidad en agave tiende a reducirse
(Valenzuela, 1994).
3.8. Información genética y algunas herramientas para su análisis
3.8.1. El ácido desoxirribonucleico (ADN)
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es una molécula que contiene la información
necesaria para determinar la estructura y la función de las células. Dicha información se
codifica en la secuencia de las cuatro bases nitrogenadas: las purinas, adenina (A) y
guanina (G) y las pirimidinas timina (T) y citosina (C) (Arredondo-Peter, 1991).
El ADN es una molécula que se forma por dos cadenas complementarias entre sí ya que
las bases púricas se aparean con las pirimídicas (Arredondo-Peter, 1991).
El desarrollo de una serie de técnicas ha facilitado el análisis del ADN y conocer con
detalle la secuencia de las bases del ADN (Arredondo-Peter, 1991).
3.9. Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares son entidades heredables que siguen las leyes mendelianas
y que están asociados con características económicamente importantes que pueden ser
usadas exitosamente por los fitomejoradores como herramientas de selección. La
selección asistida de marcadores provee un potencial para incrementar la eficacia de
selección permitiendo una selección temprana y reduciendo el tamaño de la población
en plantas utilizadas durante la selección (Staub y Serquen, 1996, citada en: Gil Vega,
1997).
El desarrollo de marcadores moleculares ha facilitado la investigación en disciplinas
como taxonomía, ecología y genética (Weising et al., 1995, citada en: González, 1998).
Estos detectan a través de una serie de métodos o técnicas que exploran la variación de
los organismos a nivel de proteínas o ADN (Otero et al., 1997, citada en: González,
1998).
El uso de técnicas moleculares permite la estimación de diversidad genética dentro de
especies y entre ellas para estudios poblacionales, clasificación de germoplasma,
mejoramiento e identificación de genes de caracteres cualitativos y cuantitativos
mediante la detección de polimorfismos directamente del ADN (Cornide et al., 2002).
Los marcadores identificados por amplificación basados en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), abren nuevas posibilidades para la detección del polimorfismo
(Cornide et al., 2002). El cual surge como consecuencia de alteraciones en el ADN ya
sea a nivel de nucleótidos (substitución de una base por otra), al nivel de segmentos
(deleción, adición, inversión y transferencia de ADN de una posición a otra) o como
consecuencia de la recombinación (Hoezel y Dover, 1991, citada en: González, 1998).
Permitiendo la generación de un gran número de marcadores (Cornide et al., 2002).
Los marcadores moleculares tienen varias ventajas sobre otros tipos de marcadores
entre los cuales destacan.
•
No son afectados por el medio ambiente.
•
Se pueden identificar en gran número.
•
Pueden ser codominantes.
•
Permiten la identificación de todos los genotipos posibles.
•
Usualmente no tienen efectos deleterios o epistáticos lo que permite que muchos
marcadores sean considerados simultáneamente. La mayoría de las veces se
pueden determinar los genotipos de cualquier tejido y pueden existir numerosos
alelos para algunos marcadores.
(Michelmore y Hulbert, 1987, citada en: Gil-Vega, 1997).
Existen diferentes tipos de marcadores genéticos, entre ellos los morfológicos, los
bioquímicos y los moleculares, entre los últimos podemos destacar RAPD
(Polimorfismo del ADN amplificado al azar), RFLP (Polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción), y AFLP (Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos
Amplificados) entre otros (Rodríguez y Arencibia, 2002).
3.9.1 Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento para la síntesis
enzimática de secuencias específicas de ADN, es requerida la existencia de dos
oligonucleótidos iniciadores que hibriden las cadenas opuestas del ADN blanco y que
flanqueen la región que se desea amplificar. El procedimiento consiste en realizar ciclos
repetitivos de desnaturalización del ADN molde, el alineamiento de dos
oligonucleótidos (primers) con las secuencias complementarias al ADN de interés y la
extensión mediante la actividad de una ADN polimerasa, ambos oligonucleótidos se
alinean en los extremos del fragmento que se desea amplificar (Arredondo-Peter, 1991).
El ADN se desnaturaliza al calentarlo a 94º C para separar las dos hebras, al enfriar los
oligonucleótidos se alinean con las secuencias complementarias lo que permite que se
inicie la síntesis de la cadena complementaria por la ADN polimerasa, cuando la
temperatura se eleva a 72º C y se mantiene así durante 1 minuto, a este ciclo se le llama
amplificación. La amplificación está precedida por una etapa de desnaturalización a 94º
C por 3 ó 5 minutos, al final de los ciclos de amplificación la solución se mantiene a
72º C durante unos 5 min. para permitir que los fragmentos que se amplificaron se
encuentren como cadenas dobles (Figura 6) (Arredondo-Peter, 1991).
Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa.
3.9.2. AFLP: Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos Amplificados
(Amplified Fragment Length Polymorphism):
La técnica de AFLP fue desarrollada desde 1995 por Keygene. N. V, en Holanda en
1995. Está basada en digestión y en la amplificación selectiva usando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
La técnica de AFLP, es la más usada para evaluar la diversidad genética, desarrollar un
mapa genético y analizar perfiles en varios genomas.
Un análisis típico de AFLP (Figura 7), consiste en cinco pasos (LI-COR, 2001).
Primer paso: Es la digestión en la cual el ADN genómico es cortado por dos enzimas de
restricción (una de corte raro EcoR1 y otra de corte frecuente Mse1) para generar
pequeños fragmentos de ADN.
Segundo paso: Es la ligación en la cual los adaptadores son ligados a los extremos de
los fragmentos de ADN generados por la digestión.
Tercer paso: Es la pre-amplificación en el cual dos oligonucleótidos (primers)
complementarios a los extremos de los adaptadores-ligados con un nucleótido
preseleccionado en el extremo 3’ es empleado para amplificar regiones flanqueadas que
contienen el sitio de unión al oligonucleótido (primer) y al sitio de restricción.
Cuarto paso: Es la amplificación selectiva en el cual los primers selectivos con tres
nucleótidos extra en el extremo 3’ de los oligonucleótidos (primers) de preamplificación, son empleados para amplificar subgrupos de los templados
preamplificados.
Quinto paso: Los fragmentos resultantes de la segunda amplificación, se desnaturalizan
para que puedan ser visualizados por electroforesis, en geles de poliacrilamida. (M.
Rodríguez y A. Arencibia, citada en: Cornide, et al, 2002).
Se pueden usar varios métodos para revelar el patrón de bandas, como el empleo de
isótopos radioactivos, fragmentos biotilinados, marcaje fluorescente y tinción de plata.
El polimorfismo detectado por la presencia o ausencia de bandas es debido a las
mutaciones en los sitios de restricción o en las secuencias adyacentes al sitio de
restricción y por inserciones o deleciones dentro del fragmento amplificado (Sevelkoul
et al., 1999, citado en: Cornide et al., 2002).
Figura 7: Esquema de la técnica de AFLP.
La idea de la técnica de AFLP es la obtención de información de muchos fragmentos
polimórficos. Aunque la digestión inicial, la ligación y las reacciones de amplificación
involucran todo el genoma, varios pasos dentro del protocolo nos llevan a analizar solo
una pequeña porción del genoma. Esta selección se logra en diferentes niveles en la
digestión original donde tres fragmentos diferentes son producidos EcoR1/ EcoR1,
EcoR1/Mse1, Mse1/ Mse1. La posibilidad de usar diferentes combinaciones de
oligonucleótidos en los sitios de restricción hace que esta técnica sea rápida, consistente
y genere grandes cantidades de datos polimórficos a través del genoma (Simpson,
1997).
Cuando se comparan los sistemas tradicionales de AFLP con los sistemas
automatizados se observaron cuatro ventajas (LI-COR, 2001):
1. Los oligonucleótidos marcados con fluorescencia son mucho más seguros que los
marcados radiactivamente.
2. La información de la imagen puede ser obtenida del sistema automatizado en varias
horas y no en 2 a 4 días como los procedimientos radiactivos o teñidos con plata.
3. La sensibilidad de los sistemas automatizados y disponibilidad de los
oligonucleótidos marcados con florescencia del AFLP reduce costos y elimina pasos
de marcaje.
4. Finalmente los datos AFLP pueden ser analizados rápidamente con el software
comercial disponible SAGAMX (LI-COR), ya que permite analizar el ADN de
plantas con genomas con rango de 5x108 o 6x109 pb.
3.9.3. Usos.
Sus aplicaciones más importantes son en la identificación y en la caracterización de la
diversidad genética con fines mejoradores. El notable adelanto logrado en los últimos
años mediante el empleo en la confección de mapas genéticos. En las plantas han
brindado valiosa información sobre la estructura geonómica de algunas especies (Coto y
Cornide, 2002).
Se detecta un alto grado de polimorfismo, un mayor número de marcadores por gel
analizado, no requiere de conocimiento de la secuencia del ADN, genera una gran
cantidad de marcadores. El mapeo genético puede realizarse más rápido y más
fácilmente (Becker et al., 1995). Es una técnica poderosa para la detección y evaluación
de variaciones genéticas en colecciones de germoplasma y en el estudio de la
biodiversidad. El AFLP revela el polimorfismo dominante que puede ser por la
presencia o ausencia del sitio de restricción o por una simple variación del nucleótido en
el germoplasma (Van Eck et al., 1995, Breyne et al., 1997, citado en: Cornide et al.,
2002).
3.10. Métodos de análisis:
El análisis de la diversidad genética está fuertemente apoyado por el surgimiento de
técnicas moleculares que permiten su estimación directamente del material hereditario
del ADN (Sigarroa y Cornide, 2002).
Una de las medidas de diversidad es la distancia genética, la cual se basa en las
diferentes frecuencias de alelos en las poblaciones; es decir, es una función de las
frecuencias génicas en cada población (Avise, 1994). Esta puede expresarse como la
probabilidad de que dos variantes tomadas al azar en una población sean diferentes
(diversidad genética), o como la proporción de variantes del total de variantes presentes
entre dos poblaciones, individuos, o grupos (Índice de similitud) (Sigarroa y Cornide,
2002).
Hay distintos métodos para estimar la distancia genética en los diferentes tipos de datos
moleculares, como la distancia de Rogers (1972) (citado en Gil Vega, 1997), distancia
genética estándar de de Nei (1972), modelo de Upholt (1977) de Nei y Li (1979). Todos
los métodos son útiles dependiendo del tipo de la información obtenida y generan
matrices que contienen las distancias entre todos los posibles pares de individuos (Gil
Vega, 1997).
Uno de los métodos más utilizados es el coeficiente de Nei y Li (1979), que depende
solamente de las bandas presentes en los individuos que se están analizando y no de las
bandas que están presentes en cualquier otro individuo del grupo analizado (Martínez
de la Vega, 2002).
Existen métodos estadísticos que agrupan técnicas multivariadas que se conocen como
“análisis de conglomerados” o “análisis de grupos” (Cluster Análisis) esta información
se representa un sistema de reconstrucción de filogenia, llamados dendrogramas o
árboles que son representaciones gráficas que consisten en nodos (unidades
taxonómicas) y ramas (rutas conectando a los nodos), que describen las relaciones
genéticas entre organismos (Avise, 1994).
Los dendrogramas pueden ser obtenidos por diferentes estrategias: la más común
comprende los métodos de matriz de distancia, también referido como análisis clusters o
de grupo. En el primer paso, se crea una matriz de distancia de pares de datos, los dos
individuos con la mínima distancia se agrupan y la matriz es reducida en un renglón y
una columna. Después de una segunda ronda de agrupamiento se lleva acabo
nuevamente agrupando juntos los dos individuos más cercanos. Este proceso se repite
hasta que se mantiene un solo individuo. El algoritmo más elemental y más utilizado en
este tipo de estudios a partir de la matriz de distancia es el UPGMA (Promedio
Aritmético de Grupos de Pares no Ponderados) (Valadez, 1994, citado en: Abraham,
2004).
El método Bootstrap es un análisis para aproximar las distribuciones de los
estadísticos de interés; el cual implica un remuestreo de los datos
obtenidos en una muestra, con reemplazamiento, muchas veces para generar
una estimación empírica de la distribución muestral completa de un
estadístico (Martínez de la Vega, 2002).
IV. Justificación:
El género Agave se distribuye en las áreas tropicales y subtropicales y
representa un grupo de plantas suculentas, su centro de origen es México.
El género Agave es semélparo, esto es, que florea solo una vez al final de su
ciclo de vida. Agave tequilana Weber. var. azul es la variedad permitida por
la ley federal para la producción de tequila, la cual es la bebida alcohólica
más popular hecha de Agave y reconocida a nivel mundial.
Se ha reportado que la propagación por hijuelos de rizoma de la planta
madre, ha propiciado a una disminución en la variabilidad genética en Agave
tequilana Weber var. azul, lo cual es perjudicial para el cultivo, debido a que
las plantas son genéticamente muy parecidas, y como consecuencia todas
serán susceptibles de ser afectadas por plagas y enfermedades y por tanto,
esto conlleva a una disminución drástica de la población, además de limitar
las posibilidades para mejoramiento genético. En un estudio hecho por GilVega et al. (1997) sobre variabilidad genética en Agave tequilana Weber
var. azul de campos comerciales en el estado de Jalisco se reportó un grado
de variabilidad muy bajo, este análisis se realizó utilizando marcadores
moleculares tipo AFLP y RAPD.
No existen estudios realizados sobre el proceso de reproducción sexual,
debido a que es muy difícil tener acceso a las flores ya que la inflorescencia
es muy alta, además que los Agaves tienen un ciclo de vida muy largo, y otra
razón es que la floración es un proceso que se impide en el cultivo.
Por este motivo, en este trabajo se consideró de gran importancia
establecer la variabilidad genética existente entre individuos progenie de
dos diferentes tipos de cruzas: intraespecíficas (entre la misma especie, A.
tequilana var. azul) e interespecífica (cruza entre dos especies diferentes,
A. tequilana por A. americana). Este estudio se llevó acabo con plantas
resultado de estas cruzas y se utilizaron marcadores moleculares tipo AFLP,
ya que este tipo de marcadores tiene ventajas en comparación con otros
como: ser altamente reproducibles, consistentes, rápidos y presentan un
mayor número de información genética.
V. Objetivos.
5.1. Objetivo general:
Estudiar la variabilidad genética de las cruzas intraespecíficas realizadas con
plantas de Agave tequilana var. azul por Agave tequilana var. azul y cruzas
interespecíficas realizadas con plantas de
Agave tequilana var. azul
por Agave
americana var americana.
5.2. Objetivos específicos
•
Realizar la extracción de ADN de las plantas germinadas de las semillas
que se obtuvieron de las cruzas de Agave tequilana var. azul por Agave
tequilana var. azul y de Agave tequilana var. azul por Agave americana
var. americana.
•
Estudiar el ADN utilizando la técnica de AFLP (Polimorfismo de la
longitud de fragmentos amplificados).
•
Determinar la variabilidad genética obtenida de las cruzas realizadas y
hacer un análisis estadístico.
VI. Materiales y Métodos.
6.1. Material.
El material que se utilizó son plantas que fueron germinadas a partir de las
cruzas de Agave tequilana Weber var. azul por Agave tequilana Weber var. azul y de
Agave tequilana Weber var. azul por Agave americana L. var. americana.
Las plantas con las que se trabajó la reproducción sexual, son plantas de Agave
tequilana Weber var. azul, a las cuales se denominaron P3, P4, y P5 respectivamente y a
la planta de Agave americana L. var. americana se le denominó Aa.
Las plantas de Agave Weber tequilana var. Azul y Agave americana L.var. americana
se encontraban floreciendo en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del
IPN, Unidad, Irapuato.
Para poder realizar el estudio de la variabilidad genética existente en plantas generadas
a partir de semillas, se realizaron:
6.1.1. Cruzas intraespecíficas:
Cruza P5 X P3: Para este caso se tomó como progenitor masculino, polen de la
planta P3 y como progenitor femenino se tomó la planta P5.
P5 x P3
Semilla
(1)
Semilla
(2)
Semilla
(3)
Semilla
(4)
Semilla
(5)
Semilla
(6)
Semilla
(7)
Semilla
(8)
Semilla
(9)
Semilla
(10)
Figura 8: Agave tequilana con inflorescencia o
Cruza P3 X P5: Para este caso se tomó como progenitor masculino polen de la
planta P5 y como progenitor femenino se tomó la planta P3.
P3 x P5
Semilla
(1)
Semilla
(2)
Semilla
(3)
Semilla
(4)
Semilla
(5)
Figura 9: Frutos y bulbilos de Agave tequilana.
Cruza P5 X P4: Para este caso se tomó como progenitor masculino polen de la
planta P4 y como progenitor femenino la planta P5.
P5
X
P4
Semilla (1)
Semilla (2)
Semilla
(3)
Semilla
(4)
Semilla
(5)
Figura 10: Semillas formadas de Agave tequilana
6.1.2.Cruzas interespecíficas
Cruza P5 X Aa: Para este caso se tomó como progenitor masculino polen de la
planta Aa y como progenitor femenino P5.
P5
X
Aa
Semilla
(1)
Semilla
(2)
Semilla
(3)
Semilla
(3)
Semilla
(4)
Semilla
(5)
Figura 11: Semillas germinadas de
Agave.
Cruza P3 X Aa Para este caso se tomó como progenitor masculino polen de la
planta Aa, y como progenitor femenino la planta P3.
P3 x Aa
Semilla
(1)
Semilla
(2)
Semilla
(3)
Semilla
(4)
Semilla
(5)
Semilla
(6)
Semilla
(7)
Semilla
(8)
Semilla
(9)
6.2. Métodos.
6.2.1. Extracción de ADN
Este método se estandarizó en el laboratorio por Díaz en el 2004, siguiendo el
protocolo descrito por Edwards en el 2001.
Pesar aproximadamente 0.05 gr de tejido congelado de agave.
Moler el tejido congelado en un mortero (previamente esterilizado y
precongelado a una temperatura de –20º C).
Colocarlo en un tubo que contiene 500 µl de buffer CTAB (Tris HCl 50mM,
EDTA 10Mm, NaCl 0.7 M, 2.5% CTAB (Cetil Trimetil bromuro de amonio, βmercaptoetanol 0.1 %) precalentado a una temperatura de 60 a 65º C.
Incubarlos por un periodo de 15 min y mezclar ocasionalmente cada 5 min.
Adicionar 500 µl de cloroformo y mezclar invirtiendo 20 veces para
homogenizar la mezcla.
Centrifugar a 12000 rpm por un periodo de 10 min.
Transferir
con la ayuda de una pipeta la fase superior a un tubo limpio
eppendorf.
Adicionar 2.5 µl de RNAasa A, mezclar e incubar a 37° C durante un periodo de
30 min.
Adicionar 500 µl de cloroformo y mezclar invirtiendo 20 veces.
Centrifugar a 12000 rpm por un periodo de 10 min.
Transferir la fase superior a un tubo limpio eppendorf.
Adicionar 300 µl de isopropanol, mezclar invirtiendo 20 veces.
Centrifugar a 12000 rpm por un periodo de 5 a 10 min y decantar.
Agregar 200 µl de etanol al 70%.
Centrifugar a 12000 rpm por un periodo de 5 min y decantar.
Dejar evaporar el etanol a temperatura ambiente.
Adicionar 25 µl de TE 1X (Tris-HCl pH 8.0, EDTA 1mM) para que el ADN se
resuspenda.
Guardar a 4° C.
Es importante visualizar el ADN, esto se lleva a cabo al realizar una electroforesis en un
gel de agarosa al 1% el cual, es usado para una separación efectiva de fragmentos de
ADN, el gel se tiñe con bromuro de etidio y
se observa en una cámara de luz
ultravioleta. El ADN es cargado para verificar la concentración o presencia de este, es
importante no observar barridos por degradación y estimar la concentración
comparando con una referencia.
Como el ADN que se utiliza para la realización de las técnicas a emplear requiere que
tenga una concentración de 100 ng/ µl, y debido que la concentración de ADN que
generalmente se obtiene, es mayor, se realizan diluciones con agua destilada
desionizada o con TE 1X, estas diluciones dependen de la concentración que tenga el
ADN, puede ser 1:10, 1:20, 1:30 y se carga posteriormente en un gel de agarosa para
verificar la concentración, se realizan diluciones hasta llegar a la concentración deseada.
6.2.2. Técnica de AFLP
La
técnica
AFLP
se
lleva
a
cabo
siguiendo
el
protocolo
descrito por
Vos et al. (1995), con la modificación de utilizar primers marcados con fluorescencia y
se describe a continuación:
6.2.2.1. Restricción del ADN
X 1 (µl) (para una reacción)
Enzima EcoR1 (10 U/µl)
0.5
Buffer 10X RL
1.5
Enzima Tru 91
0.5
H2O dd (destilada desionizada)
9.0
ADN (100 ng/µl)
1.0
Mezclar y centrifugar brevemente e incubar
a 37° C por un periodo de 2 hrs.,
transcurrido este tiempo incubar la mezcla ya digerida a una temperatura de 70° C por
un periodo de 15 min. para inactivar la enzima.
6.2.2.2. Ligación de adaptadores
x1 (µl)
Adaptador EcoR1 (5 pM)
0.3
Adaptador Mse1 (50 pM)
0.3
ATP (10 mM, pH 7.0)
1.2
Buffer 10X RL
1.0
T4 DNA ligasa (10 U/µl)
1.0
H2O dd (destilada desionizada)
6.2
Agregar esta mezcla al tubo que contiene el ADN digerido, mezclar suavemente y
centrifugar brevemente e incubar a 16° C por un periodo de 2 horas y guardar a -20° C.
Hacer una dilución de la mezcla de ligación 1:10 y colocarlo en un tubo Eppendorf
nuevo.
6.2.2.3. Primera amplificación
x1 (µl)
Oligo EcoR1 + 1 (50 pM)
1.15
Oligo Mse1 + 1 (5 pM)
1.15
dNTPs (10mM)
0.5
Taq ADN polimerasa (10 U/µl)
0.2
Buffer 10X PCR
1.0
MgCl2
0.75
H2O dd (destilada desionizada)
17.25
ADN
2.0 (digerido, ligado y diluido 1:10).
Mezclar y centrifugar brevemente y colocarlo en un tubo de PCR, meterlos a un
termociclador el cual realizará 20 ciclos a 94° C por 30 segundos, 56° C por 1 minuto y
72° C por un minuto y enfriar a 4° C.
Hacer una dilución de la pre-amplificación 1:40 y colocarlo en un tubo Eppendorf
nuevo.
Nombre
EcoR1
Secuencia
5’- CTCGTAGACTGCGTACC-3’ /
3’-CTGACGCATGGTTAA-5’
Adaptadores
Mse1
EcoR1 + A
Oligonucleótidos + 1
Oligonucleotidos +3 (marcados
con fluorescencia)
Oligonucleótidos (sin marca)
Mse1 + A
5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’ /
3’-TACTCAGGACTCAT-5’
5’- AGACTGCGTACCAATTC / A- 3’
5’- GACGATGAGTCCTGAGTAA / A 3’
EcoR1 700 + ACA
5’-GACTGCGTACCAATTC/ ACA – 3’
EcoR1 800 + AGC
5’-GACTGCGTACCAATTC/ ACA – 3’
Mse1 + AGT
5’-GATGAGTCCTGAGTAA/AGT -3
Mse1 + ACC
5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ACC -3
Tabla 1. Secuencia de adaptadores y oligonucleótidos usados para los AFLP
6.2.2.4. Amplificación selectiva
x1 (µl)
Taq ADN polimerasa (10 U/µl)
0.5
Buffer 10X polimerasa
1.1
MgCl2
0.3
Oligo Mse1 + 3
1.0
dNTPs (10 mM)
0.2
Oligo 700 EcoR1 + 3
0.5
Oligo 800 EcoR1 + 3
0.5
H2O dd (destilada desionizada)
4.9
ADN
2.0 (pre-amplificado, diluido 1:40)
Se utilizaron cuatro combinaciones de oligonucleótidos (Tabla 2), cada combinación
tiene un oligonucleótido marcado con fluorescencia (EcoR1) y un oligonucleótido sin
marca (Mse1).
Combinación
Oligonucleótido sin marca
1
2
Mse1 + AGT
Oligonucleótido marcado con
fluorescencia
EcoR1 + ACA (700nm)
EcoR1 + AGC (800nm)
EcoR1 + ACA (700nm)
3
Mse1 + ACC
4
EcoR1 + AGC (800nm)
Tabla 2. Combinaciones de oligonucleótidos utilizados para los análisis AFLP.
Hecha las mezclas se centrifugan y se lleva a cabo el siguiente programa de PCR:
Un ciclo de 94º C por 30 segundos 65º C por 30 segundos y 72º C por 1 minuto:
Doce ciclos subsecuentes bajando la temperatura de alineamiento (65º C) por 0.7º C por
ciclo a 94º C por 30segundos (desnaturalización) y 72º C por 1 minuto (extensión).
Veintitrés ciclos de 94º C por 30 segundos, 56º C por 30 segundos, y 72º C por un
minuto, enfriar a 4º C.
6.2.2.5. Desnaturalización
Antes de la electroforesis en el gel de poliacrilamida, se desnaturalizó para que pudiera
entrar en el gel de acrilamida, para esto, se mezclaron 3 µl de ADN con 2µl de colorante
Blue stop del kit para AFLP de LI-COR, y se puso en el termociclador programado para
un ciclo a 94° C durante tres minutos y debe estar a 4° C para mantenerlo
desnaturalizado.
6.2.2.6. Electroforesis en gel de acrilamida
Se preparó un gel de acrilamida al 6.5 %, con urea 8 M y TBE 1X (Tris 1 M, ácido
bórico 1 M, EDTA 20 Mm, pH 7.0).
La separación en el gel se hizo en la cámara de electroforesis del analizador de ADN
marca LI-COR. El gel se precorrió a 2000 V con amortiguador TBE 0.5 X hasta que se
alcanzaron 30 mA o menos. Se cargó 0.8 µl de cada muestra desnaturalizada en cada
pozo, en los carriles de los extremos se cargo un marcador de peso molecular de 50 a
700 pares de bases.
El gel de acrilamida se dejó correr alrededor de 3 horas a 1500 V, 40 W, y 40 mA, para
poder visualizar fragmentos hasta de 700 pb.
Los datos fueron captados automáticamente por el analizador de ADN LI-COR durante
la electroforesis. La relación entre el tamaño de los fragmentos y su migración en el gel
es casi lineal.
Los datos proporcionados por las imágenes fueron analizados y convertidos a datos
numéricos usando el software SAGAMX de AFLP Quantar, el cual identifica la
presencia de bandas con un signo (+) y la ausencia con un signo menos(-).
6.3. Análisis de datos.
6.3.1. Cálculo de la distancia genética y análisis de agrupamiento
Los fragmentos amplificados con la técnica de AFLP, fueron leídos con el Sofware
SAGA el cual proporcionó una matriz de datos de signos (+) y signos (-), la cual fue
convertida en una matriz de (1) para los signos (+) y (0) para los signos (-). Del
programa de Word los datos se pasaron a excel para hacer el formato que requiere el
programa NTSYSpc 2.0 (Exeter Software, New York). El cual determinó la matriz de
distancia genética utilizando el coeficiente de Simple Matching (Skroch et al., 1992)
mediante la comparación entre cada individuo utilizando el método de promedio
aritmético de grupos de pares no ponderados (UPGMA). Alternativamente se utilizó el
software FreeTree (Hampl et al., 2001) para llevar a cabo un análisis comparativo, se
utilizaron tres diferentes coeficientes de similaridad genética (Nei y Li, 1979; Jaccard,
1901; Simple Matching: Skroch, 1992) y el método UPGMA con lo que se generaron
tres dendrogramas y utilizando el coeficiente de Simple Matching se llevó a cabo un
análisis de bootstrap con 1000 réplicas.
6.3.2. Cálculos de la Distancia Genética
Ej. Índice de Simple Matching. (Skroch et al., 1992).
1,1
a
1,0
b
0,1
c
0,0
d
Dg A,B= (a+d)/(a+b+c+d)
Dg A,B= (3+1)/(3+1+2+1) = 0.57
A
Toma en cuenta ausencias compartidas (d)
B
1
1
6.3.3.Cálculos de Similaridad Genética
1
1
Indice de Nei y Li, 1979
0
1
1
0
0
1
b
c
1
1
a
0
0
d
S A,B = 2a/(2a+b+c)
S A,B = 2(3)/(6+1+2)=6/9=0.67
Indice de Jaccard (1901)
S A,B= a/(a+b+c)
S A,B= 3/(3+1+2)=3/6=0.50
a
a
c
VII. Resultados y discusión.
En este trabajo se estudió la variabilidad de plantas propagadas por la vía
sexual, este tipo de reproducción se realizó de 2 formas:
1. Cruzas realizadas de manera interespecíficas utilizando dos especies
diferentes de Agave (Agave tequilana Weber var. Azul por Agave americana
L. var. americana)
2. De manera intraespecífica utilizando dos plantas de la misma especie
(Agave tequilana Weber var. azul).
7.1. ADN obtenido de plantas provenientes de cruzas intraespecíficas e
interespecíficas en Agave sp.
A partir de plantas obtenidas de semillas germinadas provenientes de las
cruzas previamente mencionadas se extrajo ADN con el método descrito
por Edwards en el 2001, el cual fue estandarizado por Díaz en el 2004.
La estimación del ADN se realizó de una manera visual utilizando
electroforesis en gel de agarosa corriendo a la par un marcador de peso
molecular (λ / Hind III) y un ADN patrón de maíz con la concentración de
100 ng/µl, en la figura 12, se muestra un gel de agarosa al 1%, con el
marcador de peso molecular (λ / Hind III) en el carril 1 y algunos ADN
extraídos del tejido de las plantas. Para llegar a la concentración deseada
se realizaron diluciones con H2O destilada, desionizada y estéril.
En esta figura el ADN se encuentra ajustado a una concentración de 100
ng/µl, se observa también un ADN de buena calidad y en cantidad suficiente
para llevar acabo la digestión con enzimas de restricción.
pb
Figura 12: ADN ajustado a 100 ng/µl.
7.2 Digestión de ADN
La calidad del ADN es clave para un análisis posterior como es el caso de los
AFLP donde el primer paso es la digestión del ADN utilizando enzimas de
restricción, las cuales no podrán llevar a cabo una digestión completa si
existen contaminantes, por lo que es necesario y muy importante verificar
que este paso se lleve a cabo de manera satisfactoria. Esto se puede revisar
en un gel de agarosa cargando un volumen del ADN digerido y a la par el
ADN antes de digerir para observar la diferencia del evento ocurrido.
En la figura 13 se muestra un gel de agarosa al 1 %, en el carril 1 se
encuentra el marcador de peso molecular λ /Hind III, en el carril 2 se
encuentra el ADN digerido, el cual fue cortado con enzimas de restricción
EcoR1 y Mse1, como se puede apreciar fácilmente, el ADN digerido no se
alcanza a observar por que hay una gran cantidad de fragmentos resultado
del corte con las enzimas de restricción, hay que tomar en cuenta que hay
poca cantidad (100 ng) y es difícil verlo, pero al comparar con el carril 3,
donde está el ADN previo a la digestión (a una concentración de 100 ng), en
esta figura se muestra un diferencia muy clara entre ADN digerido y ADN
integro (antes del proceso de digestión). Cabe mencionar que en algunas
ocasiones en que se maneja mayores cantidades de ADN se alcanza a
preciar un leve barrido, que son los fragmentos digeridos.
1
2
Figura 13: Ejemplo de ADN digerido (carril
2).
Hay algunas veces que las enzimas no realizan el corte de ADN de manera
adecuada como puede observarse en la figura 14, donde se observa un ADN
completamente digerido (carril 2) y un ADN que no fue digerido
completamente en el carril 3, esto se debe probablemente a que este
ejemplo se realizó con plantas adultas (las plantas progenitoras) de agaves,
las cuales son plantas muy fibrosas, y cuando son plantas mayores
incrementa el contenido de fibras (carbohidratos) y otros componentes y
desde que se extrae el ADN es muy difícil quitarlos, y como consecuencia de
esta falta de calidad en el ADN, las enzimas no realizan el corte
correctamente. En al carril 1 se muestra el marcador de peso molecular λ
/Hind III en el carril 2 es un ADN que fue digerido completamente y en el
carril 3 un ADN que no fue digerido completamente (se realizó una
digestión parcial y con estos ADN no se continua el proceso de AFLP).
Los ADN que no eran digeridos como en este caso el del carril 3, se
regresaba a hacer limpiezas extras con fenol o se reextraían hasta que
estuvieran lo suficientemente limpios para que se llevara a cabo la digestión
completa para realizar el siguiente paso de la técnica.
1
2
3
Figura 14: ADN parcialmente
digerido (carril 3)
7.3. Preamplificación de ADN
Otro paso de la técnica de AFLP que se puede verificar para saber si se
llevó a cabo correctamente y para evitar en la medida de lo posible carriles
fallidos en los resultados finales es la preamplificación, de la cual se carga
un volumen aproximado de 20 microlitros en un gel de agarosa.
En la figura 15 se observa ADN preamplificado en los carriles del 2 al 18, el
cual se observa como un pequeño barrido (menor de 1000 pares de bases),
que nos indican fragmentos amplificados a partir de ADN digerido, ligado y
diluido 1:10, esta es un amplificación selectiva por la temperatura de
alineamiento (56° C), y por la longitud de los primers (17 pares de bases),
también por que se amplifica solo un grupo del total de los fragmentos
digeridos y ligados al añadir una base selectiva en los extremos de los
primers (al usarse los primers EcoRI+A y MseI + A). En esta fotografía es
importante observar el carril 1, donde se colocó la cantidad de ADN
digerido, ligado y diluido 1:10 (2 µL) antes de preamplificar para observar la
diferencia entre lo que sucede después (la preamplificación), también es
importante observar el carril 15, donde se observa que no hay amplificación,
este ADN ya no se toma en cuenta para realizar la amplificación selectiva,
sino que se vuelve a realizar la preamplificación hasta que salga positiva y si
esto no fuera posible, se saca este individuo del análisis. Cabe mencionar
que también se observan amplificaciones tenues, como en los carriles 2 y 16
los cuales si fueron incluidos y dan un buen patrón de fragmentos AFLP
(siguiente paso).
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Figura 15: ADN
preamplificado
En el carril 1 se muestra un ADN digerido, ligado y diluido 1:10 (condiciones
antes de preamplificar), en el carril 2 al 18 se encuentra ADN digerido,
ligado, diluido 1:10, y preamplificado, y en el carril 19 marcador de peso
molecular λ /Hind III.
7.4. Bandas monomórficas y polimórficas
En los patrones de bandas AFLP podemos encontrar dos tipos de
fragmentos: bandas monomórficas y polimórficas, las monomórficas son
aquellas en las que se observa la presencia de bandas en todos los carriles,
mientras que las bandas polimórficas muestran presencia de bandas en unos
carriles y en otros la ausencia. En la figura 16 se muestra el polimorfismo y
el monomorfismo en un gel de poliacrilamida al 6.2 %.
banda monomórfica
banda polimórfica
Figura 16: Bandas monomórficas y bandas
7.5. Electroforesis en gel de poliacrilamida
En la figura 17 se muestran los fragmentos amplificados de la progenie de
los grupos de cruzas analizadas, la combinación utilizada en esta figura es
Mse1 + AGT y el oligonucleótido marcado es EcoR1 + ACA, en este caso el
fluoróforo emite luz a 700 nm.
460
400
360
350
300
255
204,20
145
100
50
1 2
3
4 5 6 7
8
9 1011121314 15 16 171819 2021222324 2526
Figura 17: AFLP fluorescente
Analizando la figura 17 e observa un buen patrón de fragmentos AFLP, con
bandas fáciles de leer, consistentes a lo largo del carril y con pocos
individuos que fallaron (carriles 6, 12 y 34), los cuales si fallaron en más de
una combinación normalmente se eliminan del análisis.
En general se observaron más marcadores moleculares en la combinación de
Mse1 + AGT ya que en esta combinación se obtuvieron 174 marcadores, y en
la combinación Mse1 + ACC se obtuvieron 79 marcadores.
7.6. Porcentajes de polimorfismo encontrado en la progenie de cruzas
Los fragmentos se analizaron para calcular el polimorfismo global, se
obtuvieron en total 253 fragmentos (bandas) con un rango de 50 a 300
pares de bases, analizado en los geles, de los cuales 200 fragmentos fueron
polimórficos lo que representa un 79 % de polimorfismo. En la tabla 3 se
muestra el porcentaje de polimorfismo de cada cruza en forma individual,
para este análisis no se tomaron en cuenta las bandas que se observaron
ausentes, las cuales se indicaban con (ceros), calculándose el porcentaje de
polimorfismo en relación al total de bandas presentes.
Bandas
% de
Cruzas
Total de bandas
polimórficas
polimorfismo
P5 X P3
234
149
64
P3 X P5
234
144
62
P5 X P4
247
138
56
P5 X Aa
252
157
62
P3 X Aa
251
172
69
Global
253
200
79
Tabla 3. Porcentaje de polimorfismos de las cruzas por separado
El polimorfismo que se obtuvo en las cruzas realizadas es alto, variando de
56 a 69 %, donde las cruzas intraespecíficas presentan 56 y 62 %, mientras
en las interespecíficas se presentó de 62 y 69 %, siendo igual o mayor las
interespecíficas como se esperaría (tabla 3), al compararlo con otros
estudios realizados en reproducción sexual, es muy similar al reportado por
Zamudio-Hernández (2004), donde se reportó que el polimorfismo de cruzas
intraespecíficas de Agave tequilana Weber var. azul fue de 73%, mientras
que en cruzas interespecíficas (también con A. tequilana por A. americana)
se reportó un polimorfismo de 78 %. En este mismo trabajo se reportó el
análisis de autofecundaciones en donde el polimorfismo encontrado fue de
88 %, este mismo autor realizó un análisis de reproducción asexual en donde
obtuvo un polimorfismo de 10 % en bulbilos y un 14 % en reproducción por
medio de hijuelos de rizoma de la planta madre, en donde se esperaría que
no hubiera polimorfismo o este fuera casi nulo, como en el estudio realizado
por Gil-Vega et al. (2001). En este último trabajo realizaron un estudio de
diversidad genética en campos comerciales en el estado de Jalisco, donde el
dendrograma mostró que las plantas eran idénticas genéticamente, lo cual,
es lógico ya que se trata de reproducción asexual por medio de hijuelos de
rizoma que se ha llevado a cabo en Jalisco durante 200 años o más.
Comparando con otros estudios realizados en plantas que fueron propagadas
asexualmente, Infante et al. (2003), reportaron en Agave fourcroydes un
83 % de polimorfismo en plantas muestreadas de diferentes localidades y
un 20.67% de polimorfismo en dos plantas madre y sus hijuelos de rizoma, lo
que muestra diferencias a nivel de ADN durante la reproducción asexual. En
otro estudio realizado por González et al. (2003), ellos encontraron un
19.99% de polimorfismo en plantas propagadas por embriogénesis somática.
El porcentaje de polimorfismo encontrado en este estudio es alto en forma
general y dentro de las cruzas y es muy similar entre las cruzas lo que
resulta lógico ya que es reproducción sexual en condiciones controladas, en
la tabla 3 se observa que los porcentajes de polimorfismos van desde 56 %
a 69 % de polimorfismo, observándose que no hay diferencias muy grandes
entre las cruzas analizadas.
En estos resultados se observa que la reproducción sexual en condiciones
controladas, es una alternativa para el mejoramiento genético, ya que al
realizar este análisis se observa que las plantas resultantes (de cruzas) en
su mayoría, presentan diferencias entre ellas, que posteriormente sería
interesante evaluar a nivel agronómico, esto se debe a la combinación
genética que se dió entre los progenitores.
Estos análisis se realizaron utilizando marcadores moleculares AFLP, que
como ya se ha mencionado, se eligieron por las ventajas que tienen sobre
otros marcadores.
7.7. Análisis estadístico de resultados
Para leer los resultados se cuantificó con 0 la ausencia de bandas y con 1 la
presencia, a partir de estos datos se trabajó en el programa FreeTree
(Hampl et al., 2001),
se obtuvieron matrices de similaridad genética
utilizando tres índices: el de Nei y Li (1979), el índice de Jaccard (1901), y
el índice de Simple Matching (Skroch et al, 1992) (opción Sokal y Sneath 3).
También se realizó un análisis de agrupamiento utilizando el método de
promedio aritmético de grupos de pares no ponderados UPGMA, con ello se
obtienen dendrogramas donde se observan las relaciones genéticas entre
los individuos analizados. En la figura 18 se muestra el análisis con el
programa de FreeTree utilizando el índice de similaridad de Nei y Li (1979).
En este dendrograma se observa un agrupamiento muy marcado de cruzas
intraespecíficas, marcado como A y otro agrupamiento de cruzas
interespecíficas, marcado como B. Dentro del grupo A se observa que hay
subgrupos formados por la cruza P5 X P3 (grupo 1), esto significa que en
esta cruza la combinación generó individuos similares entre ellos, lo que los
agrupa y además que ningún individuo descendiente de estos progenitores se
sale fuera. Hay otro subgrupo 2 de plantas en el cual se agrupan los
individuos provenientes de la cruza P3XP5 con excepción de individuo
P3XP5(4), y también están los descendientes de la cruza P5XP4 con
excepción de dos individuos( P5XP4(5) y P5XP4(3)) que están fuera.
Dentro del grupo de cruzas interespecíficas, agrupadas en su mayoría en el
nodo marcado como B, se observa un nodo (grupo 3) que contiene a la
mayoría de las plantas generadas de las cruzas P3 X Aa, con excepción de
dos individuos (P3 X Aa (5) y P3 X Aa (3)). Dentro del grupo B, pero fuera
del grupo 3 se encuentran los descendientes de la cruza P5 X Aa y existe
otros que está afuera de todos estos grupos que es P5 X Aa (3) y P3 X Aa
(5).
En este dendrograma se observa a los progenitores P3, P5, P4 y Aa, fuera de
los agrupamientos formados, notando que el más alejado es el progenitor P5.
Es importante mencionar que este progenitor tuvo una gran cantidad de
datos perdidos (fragmentos que no se pudieron leer).
Este agrupamiento de cruzas intraespecíficas por un lado y cruzas
interespecíficas por otro, es un buen indicio de que el presente trabajo está
bien realizado, ya que la separación de estos dos eventos resulta lógico.
En la figura 19 se muestra el análisis con el programa de FreeTree
utilizando el índice de similaridad de Jaccard (1901). En este dendrograma
se observa el mismo comportamiento que en el dendrograma de la figura 18
utilizando el índice de Nei y Li (1979), esta agrupación nos indica que los
resultados son iguales independientemente del índice de similaridad que se
utilice para su análisis, también hay que recordar que estos dos índices
toman en cuenta básicamente la presencia de fragmentos para las fórmulas
que generan los índices de similaridad.
La figura 20 muestra el análisis con el programa de FreeTree utilizando el
índice de similaridad de Simple Matching (Skroch et al, 1992) (opción Sokal
y Sneath 1), en este dendrograma se observa que el nodo A se divide en dos
grupos (B y C*): el grupo C* a su vez se subdivide en C*1 y C*2, en C*2 se
agrupan P3XP5 y los P5XP4 a excepción de P3XP5(4), P5XP4(5), y P5XP4(3)
los cuales se encuentran totalmente fuera de su subgrupo. Mientras que en
el nodo C*1 se encuentra agrupada la cruza P5XP3, los cuales se encuentran
formando un grupo muy unido entre ellos. En el nodo B se encuentra
agrupada la mayoría de la progenie P3XAa y P5XAa con excepción P3XAa(5)
y P5XAa(3).
En la figura 21 se muestra un análisis realizado con el programa FreeTree
utilizando el índice de similaridad de Simple Matching (Skroch, et al, 1992)
(Sokal y Sneath 1), además de un análisis de remuestreo bootstrap en el
cual se realizaron 1000 réplicas. Esta figura es exactamente la misma a la
figura 20, sólo que tiene la ventaja de presentar valores bootstrap, que nos
dicen la confiabilidad o certeza de un nodo o agrupación. Los valores arriba
de 50 son buenos y aceptables, y en este análisis hay una buena cantidad de
valores bootstrap altos.
En la figura 22 muestra el análisis con el programa de NTSYSpc 2.0
utilizando el índice de similaridad de Nei y Li (1979), en donde comparando
con el dendrograma obtenido con el mismo coeficiente de similaridad pero
utilizando el programa de FreeTree se observa que la agrupación de las
progenies es muy similar, sólo que en este dendrograma se observa que los
individuos P3XP5(4) y P5XP4(5) se encuentran en este dendrograma
generado con el programa NTSYSpc 2.0 dentro del grupo de cruzas
intraespecíficas (nodo A), que es donde se esperaría que estuvieran.
En la figura 23 se muestra el dendrograma utilizando el programa de
NTSYSpc 2.0 utilizando el índice de similaridad Jaccard (1908) en este
dendrograma comparado con el dendrograma obtenido en la figura 19
utilizando el mismo índice de similaridad y el programa de FreeTree, dentro
del grupo A hay una agrupación casi igual a excepción de los individuos
P5XP4(5) y P3XP5(4), que en esta ocasión se encuentran dentro del grupo
de cruzas intraespecíficas, lo cual se ajusta mas a lo esperado. Mientras que
con el otro programa estos individuos se encontraban totalmente afuera de
su agrupación. Mientras que en el grupo B se observa una agrupación muy
marcada de P3XAa (Grupo 3) a excepción de P3XAa(5) la cual se encuentra
dentro del grupo B pero un poco alejada de este subgrupo 3. Comparando
con la figura 19 (mismo índice, programa Freetree), también se observó el
subgrupo 3 con una excepción adicional (individuo P3XAa2). Estas
diferencias mínimas de agrupación probablemente se deben al programa que
se esta utilizando ya que el coeficiente de similaridad prácticamente es el
mismo y muy seguramente depende del diseño del programa en sí.
En la figura 24 se muestra el análisis con el programa de NTSYSpc 2.0
utilizando el índice de similaridad de Simple Matching (Skroch et al., 1992),
en este dendrograma hay un nodo A el cual se subdivide en dos subgrupos
los cuales representan la división en agrupación de cruzas intraespecíficas
(grupo C) e interespecíficas (grupo B) como en los dendrogramas anteriores,
en el grupo C, se observa la formación de un nodo (1) en donde se encuentra
la progenie de la cruza P5 X P3, a un lado se observa el agrupamiento (nodo
2) de la progenie de la cruza P3 X P5 y junto a estas se encuentran dos
individuos de la cruza P5 X P4 más otros dos descendientes de esta cruza
que están dentro del grupo C pero fuera de los subgrupos mencionados (1 y
2).
En el grupo B (que contiene las cruzas interespecíficas) hay un subgrupo (3)
muy marcado que contiene a la progenie de la cruza P3 X Aa, a excepción de
los individuos P3 X Aa (2) y
P3 X Aa (5), quienes están inmediatamente
afuera del subgrupo 3 y afuera respectivamente.
En este dendrograma se observa con los progenitores P3, P5, P4 y Aa, algo
similar a lo observado anteriormente, fuera de los agrupamientos formados,
notando que el más alejado es el progenitor P5.
Otra observación importante es que en los dendrogramas realizados
utilizando el programa de NTSYS2.0 (Fig. 22, 23 y 24) mostraron una
agrupación mejor, conforme a lo esperado, ya que dentro del grupo de
cruzas intraespecíficas no están fuera los individuos P3XP5(4) y P5XP4(5).
En estas agrupaciones interespecificas se encuentra una agrupación muy
marcada de la progenie de la cruza P3XAa (nodo 3 en todas las figuras), lo
cual es muy bueno ya que se esperaba que hubiera agrupaciones entre los
descendientes de una misma cruza, y esto nos indica que hay una mayor
similaridad entre la progenie de esta cruza con respecto de las otras.
En cuanto al comportamiento de las plantas progenitoras es esperado y es
lógico que queden afuera, ya que es claro que la progenie tiene
características de ambos progenitores, son similares entre sí lo que hace
que haya una buena cantidad de fragmentos compartidos entre ellas y eso
las hace agruparse y los progenitores queden afuera de este grupo porque
aunque de ellos provengan estas características, ellos no comparten ambas.
En el dendrograma (Fig. 21) que se realizó con el análisis de remuestreo
realizando 1000 réplicas, en el cual los valores altos mostrados nos indican
que nuestros datos son confiables. Enfocándonos a algunos de los nodos más
importantes obtenidos, se observa que el nodo A tiene un valor bootstrap de
56, el nodo B tiene un valor bootstrap de 90, el subgrupo C tiene un valor
bootstrap de 97 y el nodo 1 tiene un valor bootstrap de 80, estos valores
altos como el caso de 56 y muy altos en todos los demás nodos previamente
mencionados nos dan la certeza de que estas asociaciones o grupos son
reales y confiables, lo que por supuesto proviene de un buen trabajo
realizado en todas las etapas de este estudio.
Todos los dendrogramas analizados mostraron resultados muy consistentes,
independientemente del índice de similaridad o programa que se
utilice,
todos los dendrogramas nos dieron resultados muy similares, por ejemplo,
las agrupaciones más marcadas observadas en los dendrogramas es que las
cruzas
intraespecíficas
se
agruparon por
separado
de
las
cruzas
interespecíficas, lo cual es muy bueno, por que esto nos da a entender que
nuestros datos son de buena calidad y confiables y que los marcadores AFLP
nos pueden diferenciar fácilmente los distintos tipos de cruzas (eventos)
realizados.
Es importante mencionar que el hecho de poder analizar y realizar este tipo
de cruzas en cultivos como Agave donde sólo existe un reporte de un
híbrido (Piven et al., 2001) es de gran importancia y representa un gran paso
para los fitomejoradores y para evitar la perdida de la diversidad genética y
por lo tanto hacer que estas plantas puedan ser más resistentes a plagas y
enfermedades lo que no ocurre cuando las plantas son propagadas por vía
asexual, principalmente por medio de hijuelos de rizoma de la planta madre
(forma de reproducción más utilizada), donde las plantas resultantes son
genéticamente idénticas e igualmente susceptibles.
A
1
2
B
0.7
0.8
0.9
3
P5
P5 X P4 (3)
P3
P3 X Aa (5)
P5 X Aa (3)
P3 X P5 (1)
P5 X P4 (1)
P5 X P4 (2)
P3 X P5 (2)
P3 X P5 (3)
P5 X P3 (1)
P5 X P3 (2)
P5 X P3 (4)
P5 X P3 (3)
P5 X P3 (5)
P5 X Aa (1)
P3 X Aa (3)
P3 X Aa (1)
P3 X Aa (8)
P3 X Aa (4)
P3 X Aa (6)
P3 X Aa (7)
P3 X Aa (2)
P5 X Aa (2)
Aa
P4
P3 X P5 (4)
P5 X P4 (5)
1.0
Figura 18: Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice de Nei y Li
(1979).
65
A
1
2
B
0.7
0.
0.
3
P5
P5 X P4 (3)
P3
P3 X Aa (5)
P5 X Aa (3)
P3 X P5 (1)
P5 X P4 (1)
P5 X P4 (2)
P3 X P5 (2)
P3 X P5 (3)
P5 X P3 (1)
P5 X P3 (2)
P5 X P3 (4)
P5 X P3 (3)
P5 X P3 (5)
P5 X Aa (1)
P3 X Aa (3)
P3 X Aa (1)
P3 X Aa (8)
P3 X Aa (4)
P3 X Aa (6)
P3 X Aa (7)
P3 X Aa (2)
P5 X Aa (2)
Aa
P4
P3 X P5 (4)
P5 X P4 (5)
1.0
Figura 19: Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice de Jaccard
(1901).
66
P5
P5XP43
P3
P3XAa5
P5XAa3
P3XP51
P5XP41
P5XP42
P3XP52
P3XP53
P5XP31
P5XP32
P5XP34
P5XP33
P5XP35
P5XAa1
P3XAa3
P3XAa1
P3XAa8
P3XAa4
P3XAa6
P3XAa7
P3XAa2
P5XAa2
Aa
P4
P3XP54
P5XP45
0.1
Figura 20 : Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice de Sokal y Sneath Sokal 1
67
P5
P5XP43
P3
P3XAa5
P5XAa3
7
2
P3XP51
1
7
9
1
3
1
100
P5XP41
3
3
P5XP42
P3XP52
94
7
9
2
7
97
P3XP53
P5XP31
P5XP32
3
9
56
P5XP34
80
P5XP33
56
29
P5XP35
P5XAa1
48
9
1
P3XAa3
20
P3XAa1
60
90
P3XAa8
32
P3XAa4
2
7
39
P3XAa6
3
0
P3XAa7
P3XAa2
3
3
P5XAa2
Aa
89
P4
P3XP54
10
0
P5XP45
0.1
Figura 21: Dendrograma utilizando el programa de FreeTree utilizando el índice
de sokal and Sneath (1908) con un analisis de Bootstrap.
68
1
2
A
3
B
P5 X P3 (1)
P5 X P3
P5 X P3
(2)
P5 X P3
(4)
P5 X P3
(3)
P3 X P5 (1)
(5)
P5 X P4 (1)
P5 X P4
P3 X P5
(2)
P3 X P5
(2)
P3 X P5
(3)
P5 X P4
(4)
P5 X P4
(3)
P5
(5) X Aa (1)
P5 X Aa (2)
P3 X Aa (2)
P3 X Aa (1)
P3 X Aa (8)
P3 X Aa (3)
P3 X Aa (4)
P3 X Aa (6)
P3 X Aa (7)
P4
P5 X Aa (3)
P3XAa5
Aa
P3
P5
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
Coefficient
Figura 22: Dendrograma con el programa Ntsys utilizando el indice de similaridad de Nei
y Li, UPGMA
69
P5 X
P5 X
P5 X
(2)
P5 X
(4)
P5 X
(3)
P3 X
(5)
P5 X
P5 X
P3 X
(2)
P3 X
(2)
P3 X
P5 X
(4)
P5 X
(3)
P5 X
(5)
P5 X
P3 X
P3 X
P3 X
P3 X
P3 X
P3 X
P3 X
1
A
A
2
A
P3 (1)
P3
P3
P3
P3
P5 (1)
P4 (1)
P4
P5
P5 (39
P5
P4
P4
Aa (1)
Aa (2)
Aa (2)
Aa (1)
Aa (8)
Aa (3)
Aa (4)
Aa (6)
Aa (7)
P5 X Aa (3)
P4
P3 X Aa (5)
Aa
0.43
0.57
0.7
Coefficien
2
t
0.8
6
P3
P5
1.00
Figura 23: Dendrograma con el programa Ntsys utilizando el indice de similaridad de
Jaccard.
70
P5 X P3 (1)
P5 X P3 (2)
P5 X P3 (4)
P5 XP3 (3)
P5 X P3 (5)
P3 X P5 (1)
P3 X P5 (4)
P3 X P5 (2)
P3 X P5 (3)
P5 X P4 (1)
P5 X P4 (2)
P5 X P4 (3)
P5 X P4 (5)
P5 X Aa (1)
P5 X Aa (2)
P3 X Aa (2)
P3 X Aa (1)
P3 X Aa (8)
P3 X Aa (3)
P3 X Aa (4)
P3 X Aa (6)
P3 X Aa (7)
P5 X Aa (3)
P4
P3 X Aa (5)
P3
Aa
1
2
A
B
3
P5
0.51
0.63
0.76
0.88
1.00
Figura 24: Dendrograma utilizando el programa de NTSYS utilizando el índice de Simple Matching (Skroch
et al., 1992).
71
P3
P5 X
P5 X
P5 X
P3 X
P3 X
P3 X
P5 X
P5 X
P5 X
P5 X
P5 X
P3 X
P5 X
P3 X
P3 X
P3 X
P3 X
P5 X
P3 X
P5 X
P3 X
P3 X
P5
P3 X
P5 X
Aa
P4
58
37
11
73
17
98
4
0
98
46
72
36
20
26
100
67
21
51
20
48
14
14
21
46
98
100
98
93
0.70
0.8
0.9
P4 (3)
P4 (2)
P4 (1)
P5 (1)
P5 (2)
P5 (3)
P3 (1)
P3 (5)
P3 (3)
P3 (2)
P3 (4)
Aa (5)
Aa (1)
Aa (4)
Aa (6)
Aa (7)
Aa (2)
Aa (2)
Aa (3)
Aa (3)
Aa (1)
Aa (8)
P5 (4)
P4 (5)
1.00
Figura 22: Dendrograma FreeTree utilizando el índice de similaridad de Simple
Matching (Skroch et al., 1992) (Sokal y Sneath 3) y un análisis de remuestreo
bootstrap.
VIII. Conclusiones:
Se extrajo ADN del tejido de las plantas germinadas, y este fue de
buena calidad y en cantidad suficiente para llevar acabo el análisis AFLP.
Se realizó un análisis con marcadores moleculares AFLP en el cual se
obtuvo una buena calidad de fragmentos amplificados, utilizando cuatro
combinaciones de oligonucleótidos se obtuvieron 253 bandas, de las
cuales a nivel global 79 % fueron polimórficas.
Analizando cada cruza por separado, el porcentaje varió de 56 a 69 %, el
cual es alto y está acorde un estudio similar reportado por Zamudio en el
2004. Se observó un alto porcentaje de variabilidad entre la progenie de
las cruzas ya que este es el medio por el cual se genera mayor cantidad
de diversidad genética
Se obtuvieron 5 dendrogramas utilizando 2 diferentes programas, los
cuales mostraron agrupaciones muy semejantes. Las agrupaciones más
marcadas en los dendrogramas fueron la agrupación por separado de los
dos tipos de cruzas analizadas (cruzas intraespecíficas y cruzas
interespecíficas).
Independientemente
del
programa
utilizado
(NTSYSpc o FreeTree) o del índice de similaridad elegido, los
resultados obtenidos son consistentes, siempre hay una clara separación
entre la progenie de las cruzas intraespecíficas y la de las cruzas
interespecíficas.
El dendrograma analizado con el índice de Simple Matching es el que se
observa un poco más distinto a los generados con los índices de Nei y Li
y de Jaccard, y seguramente estas diferencias se deben a que el índice
de Simple Matching toma en cuenta el hecho de compartir ausencias
entre dos individuos.
Este es uno de los primeros trabajos de investigación científica en
progenie de cruzas intraespecíficas en Agave tequilana Weber var azul
por Agave tequilana Weber var. azul y de cruzas interespecíficas entre
Agave tequilana Weber var azul por Agave americana L. var americana.
IX. REFERENCIAS
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Glosario:
ADN: Material genético de eucariontes y procariontes que consta de
nucleótidos, cada uno de los cuales incluye una molécula de azúcar
desoxirribosa, un grupo fosfato, y una purina (adenina y guanina) o pirimidina
(citosina y timina).
Ácido nucleico: Polímero de nucleótidos; cada uno de los monómeros de
nucleótido consta de un residuo azúcar, un grupo fosfato y una base púrica o
pirimídica.
Adaptador: Es un oligonucleótido sintético corto con un extremo cohesivo que
puede ser usado para unirse a un extremo romo o un ADN con un extremo
cohesivo.
AFLP: Amplificación de la longitud de fragmentos polimórficos, método
sensible para detectar polimorfismos en el ADN. Permitiendo la digestión de
ADN mediante el empleo de enzimas de restricción en la cual juegos de
fragmentos de ADN son seleccionados por amplificación (PCR).
Alineamiento: Está basado en la formación de puentes de hidrogeno entre
pares de bases complementarios en las hebras de manera individual formando
una doble hélice.
Amplificación: Incremento en el número de copias de un fragmento de ADN,
resultando una replicación de un ADN plantilla.
Autoradiografía: Técnica donde los niveles radiactivos de moléculas son
visualizados a través de exposición en películas de rayos X.
Agave: Del griego, magnífico, admirable, se utiliza para designar a las plantas de la familia
agavaceae (fanerógamas) que a su vez, forman parte del orden de las Asparagales. Del
género Agave (descrito por Carlos Linneo en 1753) se han registrado 136 especies, 26
subespecies, 29 variedades y 7 formas. El tequila se elabora únicamente con Agave
tequilana Weber var. azul (Subgénero Agave, incluido en la sección Rigidae (Gentry,
1982)).
Alelo: Una de las dos o más formas opcionales de un gen.
Agavaceae: Familia de plantas que comparten las características de tener hojas fibrosas
formando una densa roseta, con dientes laterales y una espina terminal picuda, e
inflorescencias en el tallo con flores con estructuras paniculadas o espigadas (Bogler y
Simpson, 1996).
Base: Unidad característica de un nucleótido. En ADN las bases encontradas
son adenina, timina, guanina y citosina. En ARN las bases son adenina, guanina,
uracilo o citosina.
Bootstrap: Técnica estadística usada frecuentemente en análisis genéticos y
filogenéticos. La idea básica es realizar un muestreo (con reemplazo) a partir
de una muestra original, se puede usar la varianza entre un gran número de
pseudoréplicas (desde 1000 a 5000) para estimar varianzas e inferir intervalos
de confianza.
Codominantes: Situación en la que los efectos fenotípicos de los alelos de un
gen se expresan total y simultáneamente en el heterocigoto.
Deleción: Se refiere a la eliminación de un nucleótido o un segmento de ADN.
DNA Polimerasa: Enzima que cataliza la síntesis de ADN a partir de
desoxinucleótidos utilizando una hebra de DNA complementaria como molde.
DNA Ligasa: Enzima que cataliza la formación de un enlace covalente entre
nucleótidos adyacentes que tienen un grupo 5’ fosfato y un grupo 3’ hidroxilo
libres
Deleterios: Se refiere a los efectos ocasionados por la eliminación de un
nucleótido o un segmento de ADN.
Desnaturalización: Pérdida de la estructura secundaria o terciaria de las
proteínas o los ácidos nucleicos. En el ADN implica el rompimiento de los
puentes de hidrógeno que mantienen el apareamiento de bases entre las hebras
del ADN.
Digestión:
Es la hidrólisis enzimática de enlaces covalentes en una
macromolécula, una digestión completa de ADN se refiere a un corte
endonucleotídico de ácidos nucleicos mediante el empleo de endonucleasas de
restricción.
dNTPs: Abreviación para los 2’- desoxinucleótidos-5’ trifosfato.
Enzimas
de
restricción
(ER). Enzimas que reconocen y catalizan el
rompimiento de secuencias de ADN de doble hebra en sitios específicos de
cada hebra, generando extremos romos o “pegajosos” (cohesivos). Aisladas
por lo general de bacterias.
Endonucleasa: Enzima que cataliza el rompimiento de algún punto de cada
molécula dentro del ADN o RNA.
Extremos romos: Extremos de los fragmentos de ADN que producen las
endonucleasas de restricción cuando cortan en ADN en la misma posición sobre
ambas hebras.
Extremos pegajosos (cohesivos): Extremos prominentes 5’ o 3’ de una hebra
sencilla de fragmentos de ADN producidos por la actividad de enzimas de
restricción. El término de dos moléculas de ADN dúplex capaces de alinearse
mutuamente.
Epistáticos: Modo de interacción del gen donde la expresión de un gen influye
la expresión de otro en otra localización del genoma por ejemplo: Los genes de
nonodulación en soya epistáticamente suprimen la supernodulación.
Gel: Matriz que se utiliza para separar ácidos nucleicos o proteínas mediante
electroforesis. El ADN, el RNA y las proteínas pueden separarse en geles de
poliacrilamida, aunque los ácidos nucleicos se separan con más frecuencia
mediante el método de electroforesis en gel de agarosa.
Gel de agarosa: Carbohidrato polimérico inerte que forma un gel cuando se
hierve en agua y se deja enfriar. Los ácidos nucleicos pueden separarse en
agarosa con base en su tamaño y conformación al aplicar una corriente
eléctrica a través del gel (un ejemplo de electroforesis).
Genes: (del griego genos = nacimiento, raza; del latín genus = raza, origen): Segmentos
específicos de ADN que controlan las estructuras y funciones celulares; la unidad funcional
de la herencia. Secuencia de bases de ADN que usualmente codifican para una secuencia
polipeptídica de aminoácidos.
Genoma: Conjunto haploide de cromosomas. Término que a veces se utiliza de
manera indeterminada para referirse al contenido genético total de un
organismo, organelo o virus.
Genotipo: Constitución genética de un organismo.
Híbrido: Individuo producido por el cruce de 2 padres de especies diferentes.
Inversión: Se refiere al hecho de que se invierte la secuencia del ADN en un
punto determinado de las hebras del ADN, es uno de los posibles eventos de
mutación.
Ligación: Proceso en el que una ADN Ligasa une dos o más fragmentos de ADN
(un ejemplo es la ligación de los adaptadores a los extremos de fragmentos
digeridos).
Monocárpicos semélparos: Que florecen una sola vez en la vida, para después morir.
Maguey: Este nombre proviene de las Antillas y llegó a tierras mexicanas por medio de los
conquistadores. En las lenguas nativas se le nombra: metl en náhuatl, tocamba en
purépecha y guanda en otomí.
Mezcal: Se usa para designar al aguardiente obtenido del maguey o agave. Proviene del
náhuatl, maguey cocido: metl, maguey y calli, cocido.
Pares de bases: Dos bases nucleotídicas en diferentes cadenas de un ácido nucleico, unidos
a un hidrógeno, estas bases solo se pueden unir por un camino adenina con timina (ADN) o
uracilo (ARN) y guanina con citosina (ADN).
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Un método para amplificación de la secuencia
de ADN en grandes cantidades usando una polimerasa termoestable y utlizando primer para
la amplificación directa de regiones deseadas del ADN.
Primer: Es un oligonucleótido usado en los métodos de PCR para iniciar la síntesis de
ADN que se alinea con su secuencia complementaria en la otra hebra del ADN.
Progenie: Descendientes producidos en un cruce.
Polimerasa: Término general para enzimas, las cuales llevan a la síntesis de ácidos
nucleicos usando una hebra preexistente como templado.
Tequila: Puede significar varias cosas, desde el punto de vista etimológico son varias las
connotaciones asignadas. Pero parece que predomina la idea que proviene del náhuatl. Por
un lado, lugar donde se realiza un cierto tipo de labor; téquitl: trabajo, oficio, encargo y
tlan: lugar. Por otro lado, lugar en que se corta; tequi: cortar, trabajar, tomar fatiga.
Actualmente se usa para designar a la bebida denominada "Tequila" producida
exclusivamente en la región de Jalisco y algunos municipios colindantes, de acuerdo a la
"Denominación de Origen" y normas establecidas. También se usa para designar a la
ciudad, al valle y a un cerro al noroeste de Guadalajara, donde mayormente se produce esta
bebida.
Oligonucleótido: Molécula pequeña de ácidos nucleicos usado en los métodos de PCR
para iniciar la síntesis de ADN que se alinea con su secuencia complementaria en la otra
hebra del ADN.