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ESTUDIO DE FACTORES QUE INCIDEN
EN LA FORMACIÓN DE LA CIANOTOXINA
MICROCISTINA POR MICROCYSTIS AERUGINOSA
Emma Sevilla, Beatriz Martín, M.ª Teresa Bes, María F. Fillat
y M.ª Luisa Peleato
91 [ I ] ■ 2006-2007 ■ PP. 137-147 ■ ISSN 0210-3524
ESTUDIO DE FACTORES QUE INCIDEN
EN LA FORMACIÓN DE LA CIANOTOXINA
MICROCISTINA POR MICROCYSTIS AERUGINOSA*
Emma Sevilla, Beatriz Martín, M.ª Teresa Bes, María F. Fillat y
M.ª Luisa Peleato**
RESUMEN
Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos de síntesis no ribosomal producidos por algunas cepas de cianobacterias, entre ellas Microcystis aeruginosa. La creciente eutrofización de nuestros acuíferos provoca proliferaciones incontroladas de fitoplancton, y el riesgo de la expresión de factores de toxicidad. Sin embargo, todavía no se conoce con exactitud las condiciones ambientales en las que la síntesis de microcistinas ocurre.
Se ha establecido metodología basada en HPLC para análisis y purificación de la cianotoxina microcistina
LR, tanto a partir de cultivos de laboratorio como de medios naturales. El cultivo de Microcystis en el laboratorio mostró que la baja disponibilidad de hierro en el medio de cultivo da lugar a un incremento de la síntesis de
microcistina. El estrés salino dio lugar asimismo a un descenso en la concentración de la toxina, mientras que el
estrés salino no altera los niveles de microcistina.
Palabras clave: cianotoxinas, Microcystis aeruginosa, microcistina.
* Trabajo realizado con una Ayuda a la Investigación del Instituto de Estudios Turolenses concedida en 2003.
** Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Facultad de Ciencias, Universidad de Zaragoza.
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ABSTRACT
Study of factors affecting the formation of microcystin cyanotoxins by Microcystis aeruginosa.
Toxic cyanobacterial blooms are increasingly common in surface waters of the earth, and a serious health
concern in many areas due to the production of several toxins, such as high levels of microcystins.
Purification and analysis of microcystin LR either from cultures or from field samples was performed using
HPLC. Microcystis cells grown under laboratory conditions synthetised more microcystine LR under iron
limitant conditions. Oxidative stress also induce an decrease in the microcystin levels, but salt stress did not
change the toxin amount in the cells.
Key words: cyanotoxins, Microcystis aeruginosa, microcystin.
INTRODUCCIÓN
Algunas cepas de cianobacterias producen en determinadas condiciones ambientales, todavía
no bien establecidas, metabolitos secundarios que pueden tener carácter tóxico para otros organismos. Estas cianotoxinas tienen distinta naturaleza química, y son fundamentalmente hepatotóxicas y neurotóxicas. Una de las cepas más virulentas es Microcystis aeruginosa, que produce las
hepatoxinas llamadas microcistinas. Las cianotoxinas provocan grandes problemas sanitarios y
medioambientales, y su presencia se está incrementando exponencialmente debido a la imparable
eutrofización de los acuíferos. La abundancia de nutrientes produce proliferaciones incontroladas
de algas y cianobacterias, y estas pueden expresar factores de toxicidad. Este problema es muy
importante en muchas zonas del planeta, y en la zona mediterránea estamos empezando a detectar
microcistinas y otras toxinas en muchos de nuestros acuíferos. En el año 2000 se produjo una proliferación tóxica en La Estanca de Alcañiz (Teruel), con alta producción de microcistina.
Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos constituidos por aminoácidos proteicos y no proteicos (-D-Ala-X-D-MeASp-Z-Adda-D-Glu-Mdha-). Existen más de 60 variantes diferentes de microcistinas en función de dos aminoácidos variables que se denominan X y Z. La variante más habitual es la microcistina LR que contiene L-leucina y L-arginina (CARMICHAEL et al., 1997). La
biosíntesis de estos pequeños péptidos no ocurre en los ribosomas, y la llevan a cabo péptido sintetasas y policétido sintasas. En Microcystis, los genes de este sistema se agrupan, junto a otros que
también intervienen en la síntesis de la microcistina, en el operón mcy (TILLET et al., 2000).
Las microcistinas son potentes inhibidores de serin-treonin fosfatasas. Entran en el hígado por
medio de receptores específicos de ácidos biliares e inhiben a la protein-fosfatasa 1 y 2, provocando
que el equilibrio polimerización-despolimerización del citoesqueleto se desplace hacia la despolimerización, lo que conlleva la pérdida de la arquitectura del hepatocito y por tanto destrucción hepática. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció hace ya bastantes años como valor provisional de referencia 1 µg/litro como nivel máximo aceptable para el consumo oral diario de
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microcistina LR, en aguas de abastecimiento público, valor que recoge la legislación española desde
2003.
Actualmente se utilizan varios métodos de detección de microcistinas, incluido el bioensayo. El
problema ético de testar en animales ha llevado a desarrollar procedimientos alternativos. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la espectrometría de masas son métodos ampliamente empleados para detectar microcistinas (MORENO et al., 2003).
La regulación de la expresión de los factores de virulencia en cianobacterias no está bien conocido (KAEBERNICK et al., 2000), únicamente se ha descrito que en el caso de Microcystis el operón
mcy está regulado por luz (KAEBERNICK et al., 2002). Otros trabajos indican que la disponibilidad de
fosfato y nitrato podrían también incidir en la expresión de microcistina.
Nuestra hipótesis es que dado que la disponibilidad de hierro regula la expresión de factores de
virulencia en bacterias patógenas (CROSA y WALSH, 2002; LITWIN y CALDERWOOD, 1993), y que el
hierro es un elemento muy limitante para el fitoplancton (IronEx, COALE et al., 1996), este metal
podría regular, mediante unión a una proteína de unión a DNA denominada Fur (Ferric Uptake
Regulator), la expresión de las cianotoxinas. Por ello hemos estudiado el efecto de la deficiencia de
hierro sobre la síntesis de microcistina en cultivos de Microcystis aeruginosa. Además se ha estudiado la producción de microcistina en otras condiciones como son el estrés oxidativo y el estrés
salino, con el fin de estudiar algunos de los factores que inducen la síntesis de microcistina.
MATERIAL Y MÉTODOS
Microcystis aeruginosa PCC7806, procedente de la colección de cianobacterias del Instituto Pasteur,
se cultivó en medio BG11 (RIPPKA et al., 1979) completo o en medio BG11 deficiente en hierro (0,5 µM).
La purificación de microcistina se llevó a cabo mediante el siguiente método: se cultivaron 30
litros de Microcystis aeruginosa y se recogieron por centrifugación. El pellet se extrajo con metanol
0,1% TFA durante 1 hora. El extracto se centrifugó y se llevó a cabo una nueva extracción de los
pellets con metanol 0,1% TFA. Tras centrifugar, se filtra el sobrenadante y se evapora a 45ºC a
sequedad. El residuo es resuspendido en agua y se precipita con sulfato de amonio. La suspensión
se deja agitando a 4ºC. Se centrifuga, y el pellet se resuspende en metanol y se filtra. El filtrado se
evapora a sequedad y se resuspende en el tampón A para cargarlo en la columna. Se utiliza una
columna de DEAE. Las microcistinas son separadas usando un gradiente lineal de 0,05% M MESKOH (pH 5,5)-20% EtOH (Tampón A) a 0,05% M MES-KOH (pH 5,5)-20% EtOH-1M NaCl (Tampón
B). La microcistina obtenida pura se cuantifica mediante el coeficiente de extinción a 238 nm
(39800 mM-1 cm-1).
Para la cuantificación de la microcistina producida por las cianobacterias bajo distintas condiciones ambientales, la extracción se realizó a partir del pellet de células resultante de la centrifugación de 20 ml de cultivo, por doble extracción con metanol 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA).
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El sobrenadante se analizó mediante HPLC tras centrifugar. Se utilizó una columna de fase
reversa de tipo C18. Los solventes fueron: agua con 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) (solvente
A) y acetonitrilo con 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) (solvente B). El gradiente empleado en la
separación de microcistina LR (la más común) fue 0-100% de B en 40 minutos, con un flujo de 1
ml/min. La detección de la microcistina se llevó a cabo en un espectrofotómetro ultravioleta-visible
a 238 nm.
La concentración de microcistina se estudió para analizar agua “bruta” e incidir en los límites de
detección de nuestros sistemas de análisis. Este método consiste en utilizar cartuchos desechables
de C18 (Waters) y pasar por ellos 2 litros de agua o sobrenadante de los cultivos. La microcistina se
extrae del cartucho utilizando metanol y posteriormente puede ser cuantificada por HPLC.
RESULTADOS
Se ha puesto a punto un método para extraer y purificar microcistinas, así como metodología
para su cuantificación en muestras naturales. Cuando las muestras pueden tener bajas concentraciones de microcistina, esta puede concentrarse mediante cartuchos de C18.
Un rendimiento típico es de 0,5 mg de microcistina LR a partir de 30 litros de cultivo de
Microcystis aeruginosa PCC7806. La toxina era necesaria para ser utilizada como patrón y como
antígeno para producir anticuerpos policlonales. La figura 1 muestra la separación de microcistinas
obtenidas con este procedimiento.
Microcistina LR
Fracción
Fig. 1. Perfil de elución de la columna DEAE-celulosa mostrando tres microcistinas. La señalada con la flecha es la microcistina-LR.
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El primer pico en la elución resultó ser la microcistina LR pura, analizado mediante HPLC (fig. 2).
Los otros picos correspondían a otras variantes de microcistina, que se utilizarán en el futuro como
patrones para identificación de otras muestras de campo.
0,60
Abs 238 nm
0,43
0,28
0,11
40
40.8
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
6
8
4
2
0,05
Tiempo (min)
Fig. 2. Perfil de elución de HPLC que muestra la microcistina obtenida, indicando que está pura. En abcisas se
indica el tiempo de retención expresado en minutos, mientras que en ordenadas, la absorbancia a 338 nm.
Con objeto de estudiar los factores que inciden en la proliferación de Microcystis y la expresión de
los factores de toxicidad, se llevó a cabo una serie de cultivos en distintas condiciones experimentales.
Se tomaron alícuotas de los cultivos y se llevó a cabo la extracción de microcistina. En el caso de cultivos sometidos a condiciones limitantes de hierro o sin limitación de hierro, se observó que la deficiencia
de hierro daba lugar a un significativo incremento de la síntesis de microcistina (fig. 3). Este incremento
se manifestaba al cabo de siete días de cultivo, probablemente el tiempo que las cianobacterias necesitan para agotar las reservas internas de hierro y pasar a una situación de deficiencia. Los cultivos con
hierro también presentaban microcistina, y se mantuvieron con niveles constantes, exceptuando una
pequeña disminución de microcistina a las 48 h, probablemente debido a la adición de medio fresco.
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Efecto de la deficiencia en hierro
160
% Microcistina
140
120
100
Control
Deficiente
80
60
40
20
0
t=0
t=48h
Control
100
99,35
99,7
Deficiente
100
99,7
140,56
t=7días
Tiempo
Fig. 3. Determinación de microcistina en cultivos de Microcystis aeruginosa PCC7806 en condiciones de
deficiencia de hierro (sin sombrear) frente a condiciones de hierro no limitante (sombreadas).
Se estudiaron otros parámetros ambientales que pudieran incidir sobre la síntesis de microcistina, como estrés oxidativo y estrés salino. El estrés oxidativo se estudió utilizando metil viológeno
(1 µM). La figura 4 muestra los resultados obtenidos al cuantificar la microcistina presente en células control y células tratadas con el agente oxidante. La presencia de metil viológeno no parece
inducir la síntesis de microcistina, al menos en las primeras 24 horas, donde se observan valores de
microcistina muy parecidos en las células tratadas y en el control. De hecho, la microcistina disminuye ostensiblemente a partir de las 48 h, siendo muy acusado a las 72 h, probablemente debido a
que el daño oxidativo ha afectado al metabolismo general de las células tratadas, o incluso a la propia microcistina.
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Efecto del estrés oxidativo
120,00
% Microcistina
100,00
Control
Metil
viológeno
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
t=0
t=24h
t=48h
t=72h
Control
100,00
103,04
101,43
107,97
Metil viológeno
100,00
105,51
86,73
49,06
Tiempo
Fig. 4. Efecto del metil viológeno (1µM) sobre la producción de microcistina en Microcystis aeruginosa.
En el caso de someter a las células a estrés salino (100 mM de NaCl), se observa que se produce
un incremento de síntesis de microcistina (fig. 5) con respecto al control no tratado.
Efecto del estrés salino
% Microcistina
150
100
Control
+ NaCl
50
0
0
6h
48h
72h
Control
100
115,2
101,48
131,34
+ NaCl
100
99,17
94,84
121,95
Tiempo
Fig. 5. Efecto del estrés salino (100 mM) sobre la producción de microcistina por Microcystis aeruginosa.
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DISCUSIÓN
El operón mcy, responsable de la síntesis de microcistina en Microcystis aeruginosa, podría
estar regulado por Fur, que actuaría como un represor clásico, utilizando hierro como correpresor.
Cuando el hierro no es limitante, la proteína Fur se encontraría unida al promotor de estos genes,
impidiendo su transcripción. Si el hierro no está disponible, la proteína Fur se separaría del DNA,
permitiendo su transcripción, y por lo tanto la síntesis de microcistina, al igual que ocurre con
otros genes inducidos como respuesta a la deficiencia (HERNÁNDEZ et al., 2002). Los resultados
obtenidos apoyan esta hipótesis, ya que la microcistina se incrementa cuando las células se ven
sometidas a limitación de hierro. El estrés oxidativo, otra señal que Fur puede sensar (ORTIZ DE
ORUE LUCANA y SCHREMPF, 2000), no produce aparentemente síntesis de microcistina, mientras
que un exceso de sal tampoco parece inducir su síntesis.
BIBLIOGRAFÍA
CARMICHAEL, W.W. (1997), «The cyanotoxins», Advances in Botanical Research, 27, pp. 211-240.
COALE, K.H.; FITZWATER, S.E.; GORDON, R.M.; TANNER; S.; CHAVEZ, F.P.; FERIOLI, L.; SAKAMOTO, C.; ROGERS, P.;
MILLERO, F.; STEINBERG, P.; NIGHTINGALE, P.; COPPER, D.; COCHLAN, W.P.; LANDRY, M.R.; CONSTANINOU, J.;
ROLLWAGEN, G.; TRASVINA, A. y Kudela, R. (1996), «A massive phytoplankton bloom induced by an
ecosystem-scale iron fertilization experiment in equatorial Pacific Ocean», Nature, 383, pp. 495-501.
CROSA, J.H. y WALSH, C.T. (2002), «Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria»,
Microbiol Mol. Biol. Rev., 66, pp. 223-249.
FULDA, S.; HUANG, F.; NILSSON, F.; HAGEMANN, M. y NORLING, B. (2000), Proteomics of Synechocystis sp. strain
PCC 6803. «Identification of periplasmic proteins in cells grown at low and high salt concentrations»,
Eur. J. Biochem., 267, pp. 5900-5907.
HERNÁNDEZ, J.A.; BES, M.T.; PELEATO, M.L. y FILLAT, M.F. (2002), «Biological control by the Fur (ferric uptake
regulation) family in prokaryotes: its role as sensor of cellular stress», Recent Research Developments in
Proteins, 1, pp. 123-140.
KAEBERNICK, M.; DITTMANN, E.; BORNER, T. y NEILAN, B.A. (2002), «Multiple alternate transcripts direct the
biosynthesis of microcystin, a cyanobacterial nonribosomal peptide», Appl. Environ. Microbiol., 68, pp.
449-455.
KAEBERNICK, M.; NEILAN, B.A.; BORNER, T. y DITTMANN, E. (2000), «Light and the transcriptional response of the
microcystin biosynthesis gene cluster», Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 3387-3392.
LITWIN, C.M. y CALDERWOOD, S.B. (1993), «Role of iron in regulation of virulence genes», Clin. Microbiol. Rev., 6,
pp. 137-149.
MORENO, I.; PICHARDO, S. y FERNÁNDEZ, A.M. (2003), «Problemática y situación actual de la determinación de
toxinas de cianobacterias: microcistinas», Tecnología del agua, 248, pp. 72-78.
ORTIZ DE ORUE LUCANA, D. y SCHREMPF, H. (2000), «The DNA-binding characteristics of the Streptomyces reticuli
regulator FurS depend on the redox state of its cysteine residues», Mol. Gen. Genet., 264, pp. 341-353.
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ESTUDIO DE FACTORES QUE INCIDEN EN LA FORMACIÓN DE LA CIANOTOXINA MICROCISTINA POR MICROCYSTIS AERUGINOSA
91 [ I ] 2006-2007
RIPPKA, R.; DERUELLES, J.B.; WATERBURY, M.; HERDMAN, M. y STANIER, R.Y. (1979), «Genetics asignments, strain
stories and properties of pure cultures of cyanobacteria», Journal General Microbiology, 11, pp. 1-61.
TILLETT, D.; DITTMANN, E.; ERHARD, M.; VON DOHREN, H.; BORNER, T. y NEILAN, B.A. (2000), «Structural organization of microcystin biosynthesis in Microcystis aeruginosa PCC7806: an integrated peptide-polyketide
synthetase system», Chem. Biol., 7, pp. 753-764.
Recibido el 2 de noviembre de 2005
Aceptado el 23 de marzo de 2006
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