Facultad de Medicina Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas . IDENTIFICACION MOLECULAR DE Trypanosoma cruzi en triatominos de tres ecotopos del estado de Colima ≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡ TESIS ≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡≡ Que para obtener el grado de: MAESTRIA EN CIENCIAS MEDICAS PRESENTA El Químico Bacteriólogo y Parasitólogo Arcadio Maldonado Rodríguez Asesores M en C. Pompilio Torres Ornelas M en C. J. Salvador Velarde Félix INDICE RESUMEN..........................................................................................................................................1 INTRODUCCION................................................................................................................................3 CONTEXTO HISTORICO...................................................................................................................5 ANTECEDENTES...............................................................................................................................8 I. Epidemiología de la enfermedad de Chagas.........................................................................8 1.1. Incidencia y prevalencia de la infección humana.................................................................8 1.2. La enfermedad de Chagas en México................................................................................12 1.3. Historia natural, morbilidad y mortalidad............................................................................13 1.4 Aspectos clínicos de la enfermedad de Chagas................................................................14 II. Vías de transmisión de Trypanosoma cruzi.........................................................................17 2.1. Transmisión vectorial..........................................................................................................17 2.2. Transmisión por transfusión sanguínea..............................................................................19 2.3. Transmisión transplacentaria..............................................................................................19 2.4 Formas excepcionales de transmisión................................................................................20 III. Trypanosoma cruzi...............................................................................................................22 3.1. Ciclo biológico......................................................................................................................23 3.2.Variaciones intraespecíficas.................................................................................................24 3.3.Genoma de Trypanosoma cruzi...........................................................................................25 IV. Diagnóstico tradicional de la enfermedad de Chagas..........................................................27 4.1. Xenodiagnóstico....................................................................................................................27 4.2. Hemocultivo...........................................................................................................................28 4.3. Métodos serológicos..............................................................................................................28 V. Participación de la biología molecular en la caracterización y detección de Trypanosoma cruzi.......................................................................................................................................30 5.1. La reacción en cadena de la polimerasa (RCP).................................................................30 5.1.1 La RCP en la detección molecular de T. cruzi...................................................................31 VI. JUSTIFICACION..................................................................................................................33 VII ORIGINALIDAD....................................................................................................................35 VIII. OBJETIVOS.........................................................................................................................36 IX. MATERIAL Y METODOS....................................................................................................37 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 Universo de estudio...........................................................................................................37 Tipo de estudio..................................................................................................................39 Tipo de variable.................................................................................................................39 Unidad última de muestra..................................................................................................39 Estadísticos de medición...................................................................................................39 Colecta de triatominos.......................................................................................................40 Obtención de las deyecciones y observación microscópica..............................................40 9.8 Procedimiento para la extracción de ADN.........................................................................41 9.9 Reacción en cadena de la polimerasa...............................................................................49 9.10 Capacidad de transmisión vectorial...................................................................................50 X. XI. RESULTADOS.....................................................................................................................52 DISCUSION.........................................................................................................................69 XII. CONCLUSIONES.................................................................................................................74 XIII. UTILIDAD, PERSPECTIVAS e IMPACTO ..........................................................................76 XIV. BIBLIOGRAFIA.....................................................................................................................78 XV. GLOSARIO...........................................................................................................................91 RESUMEN En el estado de Colima, se realizó esta investigación en tres diferentes ecotopos: alto, medio, y bajo o costero. El estudio consistió en la observación microscópica de protozoarios flagelados en 187 deyecciones fecales en dos especies de triatominos capturados (Triatoma pallidipennis y Triatoma longipennis y ninfas de diferentes estadios Triatoma spp), obteniendo un 32,1% (60/187) de positividad; a estos se les realizó amplificación mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) empleando iniciadores TCZ’s específicos para Trypanosoma cruzi, resultando confirmatoria el 81.67% para la especie cruzi (49/60 deyecciones), el cual corresponde al 26.2% (49/187) de positividad del total de las deyecciones estudiadas. El análisis estadístico mediante la X2 y la prueba exacta de Fisher no mostraron diferencias estadísticas para las frecuencias obtenidas en los estudios microscópicos y de Reacción en Cadena de la Polimerasa en las especies de triatominos de los tres ecotopos estudiados. En este estudio se analizan los resultados de microscopías y la RCP, en combinación con el tiempo de defecación posprandial natural, mediante una escala nominal propuesta para medir la Capacidad de Transmisión Vectorial de los triatominos. Al hacer este análisis se observó que las poblaciones que presentan mayor riesgo de transmisión vesctorial son Cuauhtémoc y Nogueras, el trazo de una línea longitudinal imaginaria en sentido Este – Oeste que a traviese estas poblaciones, al alejarse de esta línea en sentido Norte o Sur la capacidad de transmisión vectorial disminuye. SUMMARYThis investigation was carried in the state of Colima, México, in three different ecotopos: high, moddle, and lower or coastal. The study consisted on the microscopic observation of 187 fecal deyecciones of flagellated protozoa in two species triatomines collected, Triatoma pallidipennis and Triatoma longipennis and nymphs in different phases T. spp. Of these, 32,1% (60/187) tested positive and were further amplified by means of Polimerase Chain Reaction (PCR) using TCZ's specific primers for Trypanosoma cruzi, Tests were positive in 81.67% of the cruzi specie (49/60), These results corresponds to 26.2% (49/187) of all the dejection that were tested and found to be positive. The statistical analysis using X2 and using the exact Fisher test did not show any significant statistical difference for the frequencies obtained in the microscopic studies and the Reaction in Chain of the Polimerasa. In this study, the results of microscopies and RCP studies are analyzed, synchronized with the time of natural postprandial defecation and using the proposed nominal scale to measure the Vector Transmission Capacity of the triatominos. During the analysis, a higher vector transmission risk was seen in the populations of Cuautémoc and Nogueras, located by tracing and imaginary line in an East-West direction that passes through these populations. Moving away from this imaginary line, the risk decreases. INTRODUCCION La enfermedad de Chagas es causada por el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. El parásito pertenece al grupo estercoraria, (parásitos que se desarrollan en el intestino del insecto), a diferencia del grupo salivaria (como el Trypanosoma brucei, agente de la enfermedad del sueño y que son transmitidos por la picadura del vector), mientras que T. cruzi no es inoculado directamente por picadura, sino que son depositados junto con las heces sobre la piel y penetran al torrente sanguíneo a través de la picadura del insecto, excoriaciones o mucosas (WHO, 1978). Sin embargo, el parásito también puede transmitirse por medio de transfusiones de sangre que contenga al parásito, por vía transplacentaria o transplante de órganos infectados (WHO, 1991). La enfermedad pasa por tres etapas clínicas, siendo de carácter agudo la primera, que se caracteriza por ser breve (de 4 a 8 semanas), con sintomatología no patognomónica o inexistente . Después 8 a 10 semanas de transcurrida la etapa aguda, se presenta la etapa indeterminada que puede persistir durante años o indefinidamente sin que el individuo manifieste la enfermedad. Por último la etapa crónica, en la que más del 30% de los individuos entrarán a ella de 10 a 40 años después del contacto inicial con el parásito. En esta etapa se presentan afecciones cardiacas, digestivas y con menor frecuencia, neurológicas (Pinto -Dias, 1997). Esta enfermedad constituye un problema de salud pública en el continente americano, se ha reportado desde el sur de los Estados Unidos hasta el sur de Chile y Argentina, está incluida dentro de las 6 enfermedades parasitarias más importantes, y de acuerdo con la OMS en 1991 existían de 16 a 18 millones de personas afectadas y 80 a 100 millones de personas en riesgo de ser infectadas. Se estima que esta enfermedad presenta cada año 1 millón de casos nuevos y es causa de muerte para 45 mil personas, principalmente de estratos sociales bajos (Moncayo, 1993). Sin embargo, la distribución de vectores y reservorios es mayor a la de la enfermedad humana (WHO, 1991). La detección directa o indirecta del parásito tiene importancia clínica y epidemiológica. En ese sentido los métodos diagnósticos se dividen en parasitológicos y serológicos. Los primeros se basan en la observación del parásito y requieren de experiencia suficiente para no confundirlo con otros hemoflagelados (ejemplos T. brucei y Leishmania spp). De éstos, el procedimiento más relevante es el xenodiagnóstico, ya que se considera el método parasitológico estándar y cuando se aplica, generalmente se combina con estudios serológicos. La principal desventaja es que presenta baja sensibilidad en la etapa crónica. Por otra parte los métodos serológicos se basan en la detección de anticuerpos IgM contra Trypanosoma cruzi presentes en infecciones recientes o recaídas; pero presentan algunas desventajas ya que al detectar anticuerpos IgM, es un inconveniente en inmunodeprimidos o neonatos, además de la factibilidad de presentar reacciones cruzadas con Leishmania spp. y T. rangeli (positivas falsas), por lo que la OMS recomienda positividad en dos de tres pruebas serológicas y de ser posible, corroborada con el xenodiagnóstico para considerar a un individuo como infectado (WHO, 1991) Por otra parte, desde que se utilizó por primera vez la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) y otras técnicas moleculares para la detección e identificación del parásito (Sturm, 1989), se logró un gran avance en el diagnóstico de la enfermedad y en la tipificación de los diferentes aislados del parásito. El primer blanco de amplificación del genoma de este parásito y uno de los más usados actualmente es el ADN del cinetoplasto. La principal virtud de esta secuencia en el ADN del cinetoplasto es que se encuentra en gran abundancia; aproximadamente 30,000 copias por parásito, y de allí que se estime que la RCP sea capaz de detectar un parásito en 20 ml de sangre, constituyéndose la detección molecular un procedimiento singular, con alta sensibilidad y especificidad muy prometedora para darle solución al problema del diagnóstico (Avila, 1991). CONTEXTO HISTORICO En 1908, el gobierno brasileño mandó construir un ferrocarril entre las ciudades de Belem y Río de Janeiro, pero la obra se vio interrumpida en Minas Gerais debido a un brote severo de malaria en Lassance, del cual salieron afectados varios trabajadores (Pinto-Dias, 1997), comisionándose al Dr. Carlos Chagas para estudiar el problema. Después de trabajar durante un año, se observó la existencia de insectos hematófagos que llamaron la atención por su singular forma de picar, por lo que se les conoció como barbeiros o “insectos besucones” (Pinto-Dias, 1997). El Dr. Chagas consideró la posibilidad que tales insectos pudiesen transmitir algún tipo de agente patógeno al humano o a otros vertebrados, e investigando encontró parásitos flagelados parecidos a Crithidiae en el intestino. Intrigado por el hecho de que el parásito constituyese una etapa evolutiva de Trypanosoma minasense (descrito un año antes), aisló dichos parásitos y los inoculó en marmosetas (PintoDias, 1997). Una vez analizados los flagelados pudo determinarse con sorpresa que se trataba de una nueva especie diferente a T. minasense. El parásito recién descubierto fue llamado Schyzotrypanum cruzi (en honor a Oswaldo Cruz, y posteriormente sería renombrado T. cruzi). Chagas regresó a Lassance con el interés de conocer los posibles huéspedes del parásito, y después de estudiar a humanos y animales vertebrados, encontró un gato con parásitos en la sangre. Tres semanas después se le encomendó investigar un posible caso agudo de “malaria” en una niña de 2 años de edad, que vivía en la misma casa donde se había encontrado aquel gato. Él había examinado a la niña previamente sin encontrarle parásitos, pero en esa ocasión sí los encontró, sugiriendo la posibilidad de una fase aguda de la nueva enfermedad (Pinto-Dias, 1997). En estudios seriados, encontró que los flagelados desaparecían conforme los síntomas disminuían, con lo que propuso la existencia de una fase crónica. Sus hallazgos fueron publicados en Brazil Médico y en Archives für Schiffs und Tropen Hygiene. En 1909, en el primer volumen de Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, publicó su clásico documento denominado “Nova Tripanosomiaze Humana”, en el cual describió la morfología del parásito en sangre, ciclo vital en el tracto digestivo del insecto, comportamiento en cultivo en agar-sangre, transmisión vectorial y la infección humana. En 1913 se avanzaría en el diagnóstico de la enfermedad, al introducir la prueba de fijación de complemento (conocida posteriormente como “Prueba de Machado”) como método de diagnóstico serológico (Guerreiro, 1913), y al año siguiente empezaría a practicarse el xenodiagnóstico (Pinto-Dias, 1997). El éxito de los hallazgos del Dr. Chagas despertó envidias en una gran cantidad de colegas (por ejemplo el Dr. Krause, uno de los microbiólogos alemanes más prominentes de la época, que rechazó sus hallazgos por no haber encontrado casos de la enfermedad en regiones como Chaco, Argentina) y como consecuencia los estudios de la enfermedad de Chagas permanecieron en la obscuridad durante casi 20 años (Wendel, 1992). Entre 1931 y 1936, Johnson y Rivas diagnosticaron 19 casos humanos (Pessoa, 1988), mientras que el Dr. Mazza en 1934 en Argentina hallaría más de 1000 casos humanos en regiones donde el Dr. Krause hubo negado la existencia de la enfermedad 20 años antes. La posibilidad de que la enfermedad de Chagas pudiera transmitirse por transfusión sanguínea fue sugerida por primera vez por el Dr. Mazza en 1936 y el primero en comprobarlo fue Freitas en 1952 en Sao Paolo, Brazil. Las pruebas de hemaglutinación y ELISA aplicadas a la infección chagásica, por Neal y Miles en 1970 y por Voller en 1975 respectivamente, fueron de gran utilidad en zonas con brotes epidemiológicos. Posteriormente se llegó a la conclusión que T. cruzi constituye una población bastante heterogénea de parásitos, que pueden o no existir en una misma área geográfica, por lo que se consiguió caracterizar a nivel bioquímico las cepas de T. cruzi que se aislaron de animales y humanos, por medio del análisis de isoenzimas, llamada también zimodemos (Miles, 1977); este análisis junto con la caracterización genética en esquizodemos (Mattei, 1977 y Morel, 1980) constituyeron herramientas muy importantes, no solamente para conocer las variaciones intraespecíficas del parásito, sino también para estudios epidemiológicos y diagnósticos. Durante los últimos 30 años se han obtenido grandes logros en el conocimiento de la bioquímica y ultraestructura del parásito, así como en la inmunología, diagnóstico, tratamiento y control de la enfermedad. Sin embargo, la década de los 80`s marcó el inicio de una nueva etapa en el campo de la biología molecular. Destaca la clonación del (http://www.who.int/ctd/html/chagdat.html), material detección genético de de parásitos los T. cruzi por amplificación de ADN del cinetoplasto (Sturm, 1989 y Avila, 1991) y de secuencias repetitivas de T. cruzi (Moser, 1989). ANTECEDENTES 1. Epidemiología de la enfermedad de Chagas 1.1 Incidencia y prevalencia de la infección humana La enfermedad de Chagas es un fenómeno permanente en casi el 25% de la población latinoamericana. Existe una amplia variedad en las de tasas de prevalencia, vías de transmisión, características de los parásitos (con respecto a tropismo tisular, curvas de parasitemia, etc.), patología clínica y reservorios entre una región endémica y otra. No obstante los adelantos en los estudios epidemiológicos de la enfermedad, es difícil determinar con exactitud su incidencia y prevalencia. La enfermedad puede encontrarse desde la latitud 42ºN (Norte de California) a la latitud 46ºS (Sur de Argentina y Chile), sin embargo la distribución de vectores silvestres y reservorios es mayor a la de la enfermedad humana (WHO, 1991). Los cambios económicos y sociales en las cuatro últimas décadas han estimulado la migración humana desde las áreas rurales hacia las ciudades, lo que favorece que las tasas de incidencia, mortalidad y prevalencia, estén en constante cambio. Los datos de los países que se presentan a continuación tienen distintas coberturas y se basan en reportes de diferentes años de la Organización Panamericana de la Salud (WHO, 1991): Argentina. El área de transmisión incluye el 59.5% del territorio del país. En áreas de alta transmisión la tasa de prevalencia alcanza el 30% y las manifestaciones clínicas se encuentran en más del 30% de los infectados. La prevalencia de seropositividad en hemodonadores varía desde 5% hasta más del 20%. Bolivia. El área endémica cubre el 80% del territorio boliviano, involucrando siete de nueve departamentos. En 1985 se estimó que en 4 departamentos del país 1 133 000 personas estaban infectadas y el 26% de las mismas tenían alteraciones electrocardiográficas. Se reportó una seropositividad mayor del 60% en donadores de bancos de sangre en el departamento de Santa Cruz. Brasil. El área endémica abarca el 44.5% del territorio brasileño. En el país más grande del continente americano, el porcentaje de individuos infectados que desarrollan alguna condición patológica varía, pero los electrocardiogramas anormales se encuentran en el 15-30% de los individuos seropositivos. En el TDR news No. 62 de junio del año 2000, se declara a Brasil libre de la enfermedad de Chagas, ya que se ha demostrado en todo el país la interrupción de la transmisión en niños de RN a7 años con las siguientes tasas: en 1980 del 5% y en 1999 del 0,28%. Así como tambien la captura en todo el país de sólo 562 triatominos domiciliados (programa nacional para el control de la transmisión vectorial), lo que equivale a 1 triatomino por 10 000 casas muestreadas, lo cual es una tasa de infestación muy por debajo de el mínimo requerido para la transmisión vectorial 0efectiva del parásito. Chile. La transmisión se presenta en áreas urbanas y suburbanas de la parte norte, abarcando la mitad del país. Se estima que el área endémica cubre el 46% del territorio nacional. Durante el período de 1981 a 1986 la proporción de personas infectadas fue del 20%. La seropositividad en hemodonadores varía del 0% en el sur del país a más del 15% en el norte. Recientemente la OMS a través del subprograma conocido como TDR (Tropical Disease Research), en el comunicado (TDRnews.61 1999) declara y certifica que Chile se encuentra libre de Chagas en virtud de: • La disminución de nuevos casos por transmisión vectorial del parásito en niños de hasta 4 años de edad [TI = 0,016% (1999) Versus TI = 1,12% (1995)]. • La disminución del 99.8% en la tasa de infección en todas las regiones del país incluido la metrópoli de Santiago [TI = 0,14% (1999) Versus TI = 1,39% (1996)]. • 100% de cobertura de estudios para tamizaje en los donantes de sangre (bancos de sangre de las regiones endémicas): Colombia. Estimada la incidencia anual en 39 mil casos nuevos, la mayor transmisión se encuentra en los valles de los ríos Magdalena y Catatumbo, Macarena y Meta. En el norte del departamento de Santander el 30% de los individuos fueron seropositivos en 1985 y el 9% de ellos tenían hallazgos electrocardiográficos. Costa Rica. En 1984 la seropositividad en hemodonadores fue 1%. Ecuador. Se estima que actualmente existen de 120 000 a 200 000 personas afectadas, y de 2,2 a 3,8 millones de personas en riesgo de adquirir la infección (Aguilar, 1999). Estados Unidos de América. Se han reportado solamente cinco casos autóctonos de la enfermedad (Herwaldt, 1999). Se considera que un gran número de inmigrantes latinoamericanos están infectados, por lo que es necesario monitorear a los donadores de sangre y órganos. En 1990 se estimó que existían más de 100 000 personas infectadas residentes en este país (Hagar, 1991). El Salvador. Existen indicadores que aproximan a un 20% de la población rural infectada. Guatemala. Se reporta una seropositividad del 13% en bancos de sangre y se registran 30 000 casos nuevos por año. Honduras. Se ha encontrado como seropositivos al 11% de la población. La incidencia es de 9 800 casos nuevos por año y se estima que dos terceras partes de la población total se encuentra en riesgo de infectarse. Paraguay. La enfermedad de Chagas se considera endémica en todas las áreas rurales del país. Hay estudios que afirman que la prevale ncia varía del 10% en la región Misiones, 53% en la Cordillera, hasta 72% en el Chaco Paraguayo. Se estima una incidencia de 15 mil casos nuevos por año. Perú. La prevalencia mayor de infección humana (12%) se encontró en los departamentos de Arequipa, Moquegua y Tacna. Se reporta una incidencia anual de 24 mil casos nuevos. Uruguay. El área endémica cubre aproximadamente el 70% del territorio nacional. Se ha estimado que 132 mil personas están infectadas. En 1997 se declara libre de transmisión vectorial y transfusional (http://www.who.int/ctd/html/chagadat.html). Venezuela. El área endémica comprende 591 municipios, lo que equivale aproximadamente al 76% del territorio nacional. 1.2 La enfermedad de Chagas en México Descrita por primera vez en 1949, esta enfermedad se distribuye en prácticamente todos los estados de nuestro país, aunque los de importancia epidemiológica, como lo indica la Encuesta Nacional Seroepidemiológica (ENSE) realizada en 1990, parecen estar situados en el sureste mexicano, particularmente en Chiapas, Oaxaca, Veracruz y Guerrero, sin embargo, la detección de casos agudos no corresponde exactamente con la distribución serológica antes mencionada, ya que estados como Jalisco, Yucatán y Zacatecas, que son algunos de los estados que poseen el mayor número de casos descritos, mostraron seroprevalencias muy bajas. Hasta 1990 se tenían identificados aproximadamente 300 casos agudos y un número similar de sujetos con cardiopatía chagásica crónica, así como una docena de pacientes con megavísceras digestivas causadas por T. cruzi, detectados en los estados de Oaxaca, Chiapas, Tabasco, Jalisco y Guerrero (Velasco, 1992). Respecto a la transmisión, además de existir en nuestro país más de 32 especies de chinches vectores pertenecientes a siete géneros (Velasco, 1992), siendo los principales Triatoma longipennis, T. dimidiata, T. phyllosoma, T. pallidipennis, T. picturata, T. rubida y Rhodnius prolixus (Zarate, 1985), la hemotransfusión puede tener un papel importante. Al respecto, Rangel y cols. en 1998, usando ELISA reportan una seropositividad del 17% en 318 hemodonadores de un banco de sangre del estado de Morelos, prevalencia muy cercana a la que reportan una gran cantidad de encuestas seroepidemiológicas pequeñas en diversas partes del país, de aproximadamente 20% (Velasco, 1992). Los datos anteriormente expuestos corroboran la existencia de la enfermedad de Chagas en nuestro país y en el estado de Colima con tasas muy bajas (HAI / IFI dilución 1:32 – 0.0%. HAI a las siguientes diluciones 1:32 – 0.1%; 1:16 – 0.3%; 1:8 0.4% en 1653 muestras de suero(Velasco, 1992), la seroprevalencia y la presencia de enfermedad de Chagas depende de un conjunto de factores, a decir, de la abundancia de triatominos vectores el grado de infección natural, el tipo de vivienda, higiene, las condiciones ambientales, las necesidades de transfusiones de sangre en las diferentes poblaciones, etc., y que sin duda ponen de manifiesto la necesidad de continuar las investigaciones en este campo de esta enfermedad parasitaria. 1.3. Historia natural, morbilidad y mortalidad Desde el punto de vista epidemiológico, la historia natural de la enfermedad chagásica humana tiene importancia médica y social. Primero, la infección por T. cruzi depende de varios factores, tales como la densidad de triatominos domiciliarios, las especies de vectores prevalentes y su tasa de infección, el número de donadores de sangre infectados y la calidad del sistema de transfusión (Pinto-Dias, 1997). El periodo de incubación es de 8 a 10 días para la transmisión vectorial y puede llegar a ser mucho más largo (100 días o más) para los casos transfusionales (Schmunis, 1991). En Brasil, Emmanuel Días, de 313 casos agudos, reportó una letalidad del 19.8% en el grupo de 0-2 años, 6.7% en el grupo de 3-5 años y 3.5% en el grupo de 6-10. En el mismo estudio, la tasa de mayor mortalidad ocurrió en negros, en comparación con individuos blancos, y la mortalidad dependió de la miocardiopatía aguda y/o meningoencefalitis (Wendel, 1992). La enfermedad aguda no tratada tiene una duración de 4 a 12 semanas aproximadamente (Pinto -Dias, 1985). Después de esto, la fiebre y otros síntomas empiezan a desaparecer, paralelamente hay un decremento progresivo de la parasitemia y aumento gradual de anticuerpos IgG específicos (Wendel, 1992). Desde el punto de vista epidemiológico, la cardiopatía crónica es el más importante de todos síntomas crónicos, debido a su morbimortalidad y el consecuente impacto social y médico. La mortalidad por la enfermedad de Chagas es significativa en Brasil, Argentina, Bolivia, Venezuela y Norte de Chile, y depende básicamente de la cardiomiopatía severa (WHO, 1991). En Brasil, al menos 20 mil muertes por año se deben a esta complicación, principalmente en individuos de 30 - 49 años, eso sin contar las muertes en regiones rurales, donde no existe asistencia médica (Wendel, 1992). El impacto económico y social de esta enfermedad es alto. Por ejemplo, se estima que cerca de 752 mil empleos por año se pierden debido a muertes prematuras causadas por esta enfermedad en los 7 países localizados más al sur de América, lo cual corresponde a 1 208 millones de dólares por año (Schofield, 1991). Por otra parte, sólo en Brasil, considerando que al menos el 10% de las personas infectadas desarrollan problemas cardiacos o digestivos, los costos médicos para el tratamiento obligatorio alcanzan los 250 millones de dólares. Así mismo, el ausentismo de aproximadamente 75 mil trabajadores brasileños con problemas cardiacos pueden representar pérdidas de hasta 5 625 000 dólares por año (Wendel, 1992). Esta enfermedad a diferencia de otras enfermedades parasitarias, se relaciona con el desarrollo socio-económico del país y frecuentemente se asocia a enfermedades “sociales típicas”, tales como desnutrición, diarrea, tuberculosis y otras enfermedades parasitarias (Pinto-Dias, 1997). 1.4. Aspectos clínicos de la enfermedad de Chagas. Las manifestaciones clínicas que sufre el huésped vertebrado pueden clasificarse en tres etapas. Una etapa aguda de corta duración, una crónica bastante duradera, ambas separadas por una fase clínicamente asintomática, llamada etapa indeterminada. Diferentes órganos pueden verse involucrados en cualquier momento de cualquier etapa y cualquiera de éstas puede ser fatal. Etapa aguda. La etapa aguda de la enfermedad puede ser aparente o no. Los casos agudos por vía vectorial se observan principalmente en niños menores de 10 años independientemente del sexo; con una morbimortalidad mayor entre 0 y 2 años de edad. En los casos transfusionales la incidencia es mayor en adultos de 20 a 40 años. La fiebre es el signo más importante de esta etapa, observándose en el 95% de los casos. El periodo febril, que guarda relación con el nivel de parasitemia y con la gravedad de la infección, persiste de 2 a 4 semanas después del contacto inicial con el parásito y generalmente se acompaña de cefalea, astenia, mialgias y artralgias. El edema subcutáneo se observa en más del 50% de los casos, inicialmente se presenta en cara y avanza hacia tronco y extremidades. Sin embargo, la cardiopatía parece ser la lesión anatomopatológica más constante; el electrocardiograma suele ser normal en más de la mitad de estos casos, presentando taquicardia sinusal, pero pueden observarse bloqueos de rama derecha del haz de His. La hepatoesplenomegalia se presenta del 30 al 40% de los casos con repercusiones, principalmente en lactantes. La cura espontánea de la enfermedad aguda se ha observado en casos experimentales y no se excluye la posibilidad en humanos, sin embargo no se ha reportado. El tratamiento con Nifurtimox y Benznidazol es capaz de curar del 30 al 70% de los pacientes con esta etapa (Filardi, 1987). Etapa indeterminada Muchos casos agudos no tratados evolucionan a la forma clínica indeterminada. Esta se define por la presencia de la infección y ausencia de síntomas y anormalidades electrocardiográficas y radiológicas, por lo que muchas veces al paciente se le considera sano. Esta es la forma clínica más común en áreas endémicas y puede persistir por el resto de la vida en el 40% o más de los individuos infectados, y gran parte de ellos (30%) sufrirán daños cardiacos o digestivos después de 10 a 25 años, aunque un número de pacientes no inferior al 25% permanecen en esta etapa. Etapa crónica Forma cardiaca. Esta consecuencia es la más estudiada y fácil de diagnosticar. Las manifestaciones clínicas dependen del grado del daño al miocardio, la presencia de arritmias y el grado de falla cardiaca. Los síntomas más frecuentes son palpitaciones, mareo, síncope, disnea, edema y dolor de pecho, pero las complicaciones más importantes son el embolismo pulmonar y sistémico y la muerte repentina. Los defectos de conducción más frecuentes son los bloqueos de la rama derecha y el hemibloqueo anterior izquierdo. También se presentan una gran variedad de arritmias; de las arritmias ventriculares la fibrilación ventricular es la más importante y probablemente sea el mecanismo más común de muerte repentina en pacientes con enfermedad crónica. Forma digestiva. Cualquier porción del tracto digestivo puede verse involucrado en la etapa crónica, pero los segmentos más afectados son esófago y colon. Las lesiones significantes en el nervio o plexus intramural se asocian con disturbios peristálticos. Puede existir dilatación progresiva del esófago, acompañado con regurgitación y disfagia. La coordinación del movimiento del colon se pierde, lo que conduce a una constipación y dilatación severa. Las complicaciones más importantes del megacolon son el fecaloma y vólvulos agudo. El megaesófago y el megacolon pueden coexistir con la lesión cardiaca. Forma neurológica. Esta puede involucrar al sistema nervioso central, autónomo o periférico. Estos daños son los más desconocidos de la forma crónica de la enfermedad. En ciertas áreas endémicas se ha observado paresia, alteración funcional del cerebro, convulsiones y lesiones secundarias a episodios de meningoencefalitis (Wendel, 1992). II. VIAS DE TRANSMISION DE Trypanosoma cruzi. Considerando la historia natural de la enfermedad, los mecanismos de transmisión de T. cruzi son los siguientes: 2.1 Transmisión vectorial El mecanismo más importante de transmisión de T. cruzi hacia los humanos y otros mamíferos es a través de las heces de triatominos infectados. Los vectores son insectos del orden Hemíptera, familia Reduviidae y subfamilia Triatominae. De las 118 especies de triatominos conocidos sólo un número relativamente pequeño son epidemiológicamente importantes como vectores de T. cruzi y colonizan casas de pobre calidad, otras especies habitan estrictamente en ecotopos silvestres y nunca invaden las casas, sin embargo algunas especies selváticas salen de sus hábitats naturales e invaden el espacio doméstico y eventualmente transmiten el parásito al humano y los mamíferos domésticos. A las especies domiciliarias se les atribuye más del 80% de los casos humanos en áreas endémicas. Estas especies (T. infestans, T. brasiliensis, T. dimidiata, T. sordida, Panstrongylus megistus y Rhodnius prolixus) son muy comunes de los espacios llamados “abiertos” de América del Sur y Central (Schofield. 1994). La transmisión vectorial de T. cruzi al hombre y a otros mamíferos se debe básicamente al contacto de estos vertebrados con las heces de vectores infectados. Sin embargo, en el ciclo selvático es común que mamíferos insectívoros tales como monos y marsupiales se infecten por la ingesta de triatominos infectados (Wendel, 1992). Generalmente los niños y los mamíferos más jóvenes son los más susceptibles a la transmisión vectorial. Por otra parte, existen también condiciones ambientales: la mayoría de los casos agudos en humanos se detectan durante el verano, los triatominos que comúnmente se encuentran por abajo de los 3000 m snm. Ver Figura 1. Que muestra la distribución geográfica de los principales vectores de la enfermedad humana. Desde México hasta Chile y Argentina, en donde Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata son los principales vectores, mientras que Triatoma infestans indudablemente es el principal vector abajo de la línea del Ecuador (WHO, 1991). Fig.1.- Distribución de los principales vectores de la enfermedad de Chagas en América Muchas personas adquieren la enfermedad cuando las heces de triatominos infectados entran en contacto con mucosa o piel. En diferentes especies de triatominos, la susceptibilidad a diferentes cepas del parásito varía, así como la capacidad del parásito para diferenciarse a formas metacíclicas(Pinto-Dias, 1997). 2.2 Transmisión por transfusión sanguínea. En el humano, este es el segundo mecanismo de transmisión más importante. Recientemente el problema se limitaba solo a Latinoamérica, pero debido al alto número de inmigrantes hacia países desarrollados, existe la posibilidad de encontrar casos humanos en lugares donde la enfermedad no es común, extendiéndose así su distribución y transformando la enfermedad en un problema mundial. Factores relacionados al parásito, el individuo receptor, el número de transfusiones recibidas y la prevalencia de la infección en el área estudiada pueden estar asociados con el riesgo de adquirir T. cruzi por esta vía. Un grupo de alto riesgo para adquirir la infección son los pacientes hemofílicos, ya que requieren de transfusiones frecuentes (WHO, 1991). 2.3 Transmisión transplacentaria. El riesgo de transmisión transplacentaria oscila entre 0 y 9%, según diversos autores, donde la mediana está cerca del 1%, es decir, el 1% de las gestantes chagásicas corren el riesgo de transmitir la infección al producto (PintoDias, 1997). Este tipo de transmisión puede ocurrir tanto en el ciclo selvático, como en el doméstico y su incidencia parece variar de acuerdo a diferentes circunstancias y situaciones geográficas. Estudios en Argentina indican una incidencia de 0,75% a 3,5% de transmisión congénita de T. cruzi entre niños de madres chagásicas, mientras que en Uruguay la incidencia oscila del 0,13 al 4,1%. En humanos, el mecanismo congénito parece ocurrir del 3er al 5to mes de embarazo, dependiendo de la colonización y daño de la placenta por el parásito, desde donde es capaz de infectar al feto (Wendel, 1992). La mayoría de las madres de niños recién nacidos infectados congénitamente no muestran síntomas de la enfermedad de Chagas crónica. La infección parece no afectar la fertilidad ni tampoco el curso del embarazo. La infección transplacentaria puede ocurrir en los subsecuentes embarazos de la misma madre. En gemelos nacidos vivos, la infección puede ser posible en uno o en ambos (WHO, 1991). Los niños recién nacidos de madres infectadas generalmente presentan la forma típica de la enfermedad aguda asociada con prematurez, hepatoesplenomegalia, parasitemia alta y la presencia de anticuerpos IgM específicos (Wendel, 1992). Por otra parte, dado que existe una transmisión de inmunoglobulinas IgG de la madre infectada al feto, la prueba serológica convencional positiva no necesariamente indica la enfermedad en el bebé, particularmente durante los primeros 4 o 5 meses de vida. El diagnóstico de la enfermedad de Chagas congénito se realiza por métodos parasitológicos y la detección de anticuerpos IgM específicos. Lo relevante acerca de la transmisión congénita consiste en el diagnóstico temprano y terapia específica a los infantes infectados. Si los métodos parasitológicos y la prueba para detección de IgM no están disponibles, una prueba serológica convencional positiva a los 6 o 12 meses es una indicación para el tratamiento urgente del bebé (Wendel, 1992). 2.4 Formas excepcionales de transmisión 2.4.1 Transmisión accidental Esta ocurre en laboratorios o en hospitales, por el manejo inadecuado de material biológico contaminado por parte de los mismos investigadores, o del personal colaborador y auxiliar que no acata las medidas de seguridad en el laboratorio. Por ejemplo: manejo de triatominos, cultivos, animales de experimentación infectados, manejo de sangre de pacientes etc., Por lo menos 60 de estos casos se han reportado, por lo que esta enfermedad debe ser considerada una de las enfermedades parasitarias de transmisión en el laboratorio más importante, con un riesgo mayor con respecto a las enfermedades infecciosas, incluyendo a las infecciones virales y bacterianas (Pinto-Dias, 1997). 2.4.2 Transmisión oral. Este modo de transmisión no tiene importancia epidemiológica, más es posible a través de la ingestión de triatominos o mamíferos infectados y por la alimentación con leche materna al bebe de mujeres infectadas. Se comenta que algunos pueblos de Sudamérica ingieren triatominos con fines afrodisíacos. 2.4.3 Transmisión por transplante de órganos. El transplante de órganos de donadores infectados es un modo de transmisión de T. cruzi que ha recibido poca atención, dada la poca documentación de tales casos. Los pacientes que han recibido órganos de donadores con la enfermedad crónica desarrollan episodios agudos de la enfermedad y el parásito se puede aislar de sangre periférica. Algunos casos fatales se han reportado, en los cuales los parásitos se han identificado y aislados de diferentes órganos. Como los individuos receptores están bajo terapia inmunosupresora, su susceptibilidad a la infección aumenta considerablemente (Wendel, 1992). Recientemente se publicó que en un hospital de Argentina, durante el periodo de 1989-1996, de 238 individuos sometidos a transplante de riñón, en 41 de ellos se detecto la infección por T. cruzi, ya sea en donadores o en receptores (Riarte, 1999). III. Trypanosoma cruzi Este parásito es un flagelado del orden Kinetoplastida, familia Trypanosomidae, y se caracteriza por la presencia de un flagelo y una sola mitocondria donde se sitúa el cinetoplasto, que es un organelo especializado que contiene ADN. Este presenta cuatro estadios morfológicos: tripomastigote metacíclico, promastigote o tripomastigote sanguíneo, epimastigote y amastigote, que se identifican por la posición del cinetoplasto con respecto al núcleo y la forma redondeada del amastigote. Ver figura 2. Fig. 2- Esquemas representativos de los diferentes estadios de Trypanosoma cruzi. En la etapa de tripomastigote metacíclico, el parásito es flagelado, alargado con un gran núcleo central, cinetoplasto de gran tamaño y el blefaroplasto posterior de donde surge el flagelo que contornea una membrana ondulante, que le confiere movimiento. Este estadio carece de capacidad de reproducción y es la forma que penetra e infecta al hospedero. El tripomastigote sanguíneo es flagelado, alargado, con cinetoplasto grande que está alejado del núcleo hacia la parte extrema posterior del parásito. Se parece al estadio anterior. Este estadio se encuentra en la sangre y no tiene la capacidad para dividirse, pero si la de invadir células. El epimastigote es fusiforme, con un flagelo que forma una membrana ondulante que nace del blefaroplasto. El cinetoplasto se encuentra cercano a la parte anterior del núcleo que se encuentra en posición central. Este estadio se reproduce por división binaria. Finalmente, la etapa de amastigote que es de forma redondeada, también llamada leishmanoide y carece de flagelo. El parásito en esta etapa se multiplica intracelularmente en el huésped (Goldsmith, 1995). 3.1 Ciclo Biológico El ciclo de vida de T. cruzi se desarrolla en organismos diferentes (insecto vector y mamífero hospedero), presentando en cada uno de ellos, dos estadios (Guzmán-Marín, 1992). En el vector se encuentran los epimastigotes y los tripomastigotes metacíclicos y en el hospedero mamífero se encuentran los amastigotes y los tripomastigotes sanguíneos. El vector ingiere los tripomastigotes sanguíneos al alimentarse de los mamíferos infectados, transformándose en formas cortas en el estómago del insecto, de donde migran hacia el intestino medio, donde continúan desarrollándose al encontrar un ambiente adecuado para transformarse en epimastigotes. Estos llegan a la porción posterior del intestino del vector donde evolucionan a tripomastigotes metacíclicos, que son eliminados en las heces. En esta forma el parásito penetra e infecta al hospedero mamífero, donde madura a tripomastigote sanguíneo, y en cuyas células se transforma a amastigote; en el interior de las mismas evolucionan nuevamente a tripomastigotes, los cuales se liberan al torrente sanguíneo. Ver figura 3. Fig. 3- Ciclo Biológico de Trypanosoma cruzi. A: vector; 1: tripomastigote sanguíneo en el hombre, mamíferos silvestres y domésticos; 2: epimastigote en el intestino vector; 3: tripomastigote metacíclico en el intestino del vector; 4: amastigotes en órganos parasitado. 3.2 Variaciones Intraespecíficas Este parásito constituye una población altamente heterogénea y agrupa a diferentes cepas que circulan en vectores, animales domésticos y silvestres y en el humano. Dichas poblaciones se comportan de manera diferente en cuanto a curvas de parasitemia, interacción con células hospederas y respuesta inmune del huésped. Estudios experimentales han mostrado la existencia de cepas resistentes y sensibles a drogas nitroheterocíclicas (Benznidazol y Nifurtimox) que se usan para el tratamiento específico de la enfermedad de Chagas (Filardi, 1987). Con la necesidad de conocer las bases biológicas de tal variación se han aplicado métodos que permiten identificar las diferentes cepas de T. cruzi a nivel molecular, entre ellos destacan los basados en lectinas, la caracterización de isoenzimas y la restricción del ADN de los minicírculos del cinetoplasto (PintoDias, 1997). 3.3 El Genoma de Trypanosoma cruzi Aunque T. cruzi es el agente causal de una de las enfermedades de mayor morbi-mortalidad en Latinoamérica (WHO, 1991) su estudio a nivel molecular es muy limitado. A pesar de ello los esfuerzos para conocerlo en detalle no cesan y prueba de ello es el proyecto del genoma que lleva su nombre. Este a diferencia de otros proyectos de otros parásitos posee una cepa de referencia: la CL Brener, seleccionada durante la reunión para la planeación de los Genomas de los Tripanosómidos, en abril de 1994 (Río de Janeiro). Las características de esta cepa por las cuales fue seleccionada como el organismo de referencia son: 1) Que fue aislada de Triatoma infestans, que es un vector estrictamente domiciliario (Brener, 1963). 2) Se diferencia en medio líquido (Alcantara, 1978). 3) Infecta células en monocapa y posee tropismo hacia células musculares y cardiacas (Malo, 1978). 4) Presenta curvas definidas de parasitemia y mortalidad en ratones (Brener, 1977). 5) Es altamente susceptible a drogas usadas clínicamente en la enfermedad de Chagas (Filardi, 1987). En cuanto al análisis de su cariotipo, producción de bandas cromosómicas y análisis de ligamiento, bajo diferentes estrategias muestran de 20 a 42 bandas cromosómicas que van de 0,45 a 3,5 Mb (Hernández-Rivas, 1997) y que pueden distinguirse numerándolas de I a XX (resolución baja), ó de 1 a 42 (resolución media) [Henrikson, 1995]. Sin embargo, considerando que el contenido genómico total es de 87 Mb, es muy probable que el número real de bandas cromosómicas sea más grande (http://www.dbbm.fiocruz.br/genome/tcruzi/invitro.html). Se han identificado varios grupos de ligamiento y se cree que T. cruzi sea diploide ya que se han observado cromosomas aparentemente homólogos (http://www.dbbm.fiocruz.br/genome/tcruzi/clcharac.html). Por último, se estima que el número de genes necesarios para mantener el ciclo de vida del parásito sea mayor de 6 000 (Cano, 1995), desafortunadamente se han identificado solamente 71 genes (http://www.dbbm.fiocruz.br/genome/tcruzi/statisti.html). IV. DIAGNOSTICO TRADICIONAL DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS. El diagnóstico en la fase aguda, en la cual un gran número de parásitos circulan en el torrente sanguíneo (tripomastigotes), se basa en la detección de los mismos mediante observación microscópica; mientras que en la fase crónica, por el contrario, hay escasez de parásitos en sangre y altos títulos de anticuerpos dirigidos contra antígenos de T. cruzi, el diagnóstico radica en detectar estos anticuerpos mediante pruebas serológicas que suelen ser muy sensibles, sin embargo la ocurrencia de falsos positivos y falsos negativos puede ser común. En esta fase los tripomastigotes pueden detectarse por métodos indirectos tales como el xenodiagnóstico y el hemocultivo, mismos que son altamente específicos, pero involucran procedimientos laboriosos y requieren de mucho tiempo. 4.1 Xenodiagnóstico Este es un método parasitológico indirecto usado sobre todo en la fase crónica, y requiere de triatominos de laboratorio para asegurar que estos no contengan parásitos. Se realiza con 30 a 40 triatominos colocados en 4 u 8 cajas que se disponen sobre el brazo del paciente para que éstos se alimenten; 30 y 60 días después las heces de los insectos se analizan bajo el microscopio para la presencia de T.cruzi. Mediante este procedimiento los parásitos se detectan aproximadamente en el 49.3% de los pacientes crónicos, por lo que la sensibilidad es muy baja. Ahora en la actualidad gracias a la disponibilidad de pruebas rápidas tales como las inmunológicas, el xenodiagnóstico empieza a quedar en desuso (Pinto-Dias, 1997). 4.2 Hemocultivo Son pocos los laboratorios que realizan técnicas específicas para cultivar parásitos debido a que los métodos de cultivo in vitro son complejos, aunado a la dificultad de establecer un buen sistema de control y calidad. Sin embargo algunos laboratorios cuentan con técnicas ya estandarizadas, particularmente donde se ofrecen servicios a la comunidad y para fines de investigación. Realmente es pequeño el número de parásitos que se cultivan rutinariamente; los procedimientos más usados van dirigidos a Entamoeba histolytica, Naegleria fowleri, Acanthamoeba spp., Trichomonas vaginalis, Toxoplasma gondii, Mycobacterium tuberculosis, T. cruzi y leishmanias, y usualmente se realizan por solicitud especial y consulta con el parasitólogo o el investigador de laboratorio (Murray,1999). T. cruzi es un protozoario que se cultiva fácilmente en medios que contengan componentes derivados de la hemina. Durante muchos años el hemocultivo no fue utilizado para el diagnóstico parasitológico porque autores como Freitas (1952) obtuviera resultados negativos o positividad baja. Sin embargo, Chiari y Brener en 1966 obtuvieron un 31.8% de positividad usando medio LIT, y a partir de esa época el hemocultivo inició a ganar credibilidad, llegando hasta el punto de que Mourao en 1975 introdujera un procedimiento para eliminar anticuerpos, plasma y otros factores que pudieran limitar el crecimiento del parásito y así lograr aumentar la sensibilidad de esta técnica diagnóstica. Posteriormente Luz y cols. en 1994 obtuvieron un 94% de positividad en pacientes chagásicos haciendo cultivos seriados. 4.3 Métodos Serológicos Durante la infección temprana los anticuerpos contra T. cruzi son de la clase IgM, y conforme la enfermedad progresa estos anticuerpos son sustituidos por los IgG. La concentración total de los primeros es mayor en personas con la enfermedad aguda que en personas sanas. Por otra parte, se encuentran disponibles en el mercado varias pruebas serológicas, las más usadas son las de fijación de complemento (conocida también como prueba de GuerreiroMachado), hemaglutinación indirecta, inmunofluorescencia indirecta, ELISA y aglutinación en látex, esta última se usa en algunos bancos de sangre. En individuos crónicamente infectados y con parasitemia comprobada, se reportado más de 95% de positividad para ha las pruebas anteriormente mencionadas; sin embargo, pueden obtenerse falsos positivos cuando se utilizan sueros de pacientes con leishmaniasis o infectadas con Trypansoma rangeli. Debido a la variación en la especificidad de las pruebas serológicas, la OMS da dos recomendaciones: (1) La positividad debe ser definida localmente , usando un panel de sueros estándar, y de preferencia que los antígenos sean locales, (2) La confirmación de un resultado debe estar basado en dos de tres pruebas como mínimo (WHO, 1991). VI. PARTICIPACION DE LA BIOLOGIA MOLECULAR EN LA DETECCION Y CARACTERIZACION DE Trypanosoma cruzi. 5.1 La reacción en cadena de la polimerasa (RCP) Esta técnica de Biología Molecular constituye un sistema de amplificación in vitro que en pocas horas puede generar de un segmento específico de ADN numerosas copias, en el cual las cadenas sencillas del ADN se duplican por la acción de la ADN polimerasa en cada uno de los ciclos (que generalmente son de 20 a 35) que integran el procedimiento de reacción, y que al final de cada ciclo las nuevas cadenas vuelven a ser duplicadas por la misma enzima, logrando así una producción exponencial de millones de copias del gen o segmento de ADN sometido a la reacción. Cada uno de los ciclos de la reacción consta de tres pasos, determinados por temperaturas y tiempos específicos, que son: Desnaturalización (de 91 a 98°C durante 30 a 120 seg.). En el cual las dos cadenas complementarias del ADN blanco son separadas. Alineamiento (de 40 a 65°C durante 30 a 120 seg.). En el que se realiza el apareamiento entre los iniciadores y las cadenas sencillas del segmento de ADN molde desnaturalizado. Extensión (de 70 a 74°C durante 30 a 120 seg.). En el que la ADN polimerasa extiende la longitud de los iniciadores apareados al ADN molde, al ir las dos cadenas sencillas presentes al inicio de la reacción. El ciclo siguiente ocurre en el mismo tubo, con los mismos componentes de la mezcla de reacción, pero ahora contiene el doble de cadenas sencillas de ADN molde que el anterior y finaliza convirtiendo éstas cadenas sencillas en cadenas dobles. La longitud del segmento amplificado es igual a la suma de la longitud de los dos iniciadores más la distancia del ADN flanqueado por éstos. Un aparato denominado termociclador y una ADN polimerasa estable a altas temperaturas hacen que el procedimiento sea sumamente sencillo y rápido (Mullis, 1987. y Guhl, F, 1999). La amplificación del ADN por RCP tiene las siguientes cualidades: especificidad, sensibilidad, sencillez y versatilidad. La especificidad se refiere al procedimiento que sirve para amplificar una porción preseleccionada del ADN. Lo anterior se logra usando un par de iniciadores sintéticos que, a la vez de servir como iniciadores para la síntesis de ADN, delimitan la región que se va a amplificar. Esto es posible debido a que en condiciones de incubación adecuadas los iniciadores sólo se unen a los sitios correspondientes de secuencia complementaria. La sensibilidad es inmejorable ya que puede amplificar a partir de una molécula de ADN, logrando que el número de copias de la región amplificada se incremente considerablemente. La sencillez es notable, dado que la reacción normalmente se realiza de dos a tres horas en un laboratorio equipado modestamente y con el personal capacitado. La versatilidad indica que la técnica puede aplicarse a todo tipo de muestra biológica, en cualquier estadio del desarrollo, en organismos vivos, muertos, momificados o restos fósiles (Mullis, 1994). 5.1.1 La RCP en la detección molecular de Trypanosoma cruzi. El diagnóstico de la enfermedad de Chagas se basa actualmente en técnicas serológicas, que son muy sensibles, pero su uso presenta dos problemas principales. Primero, la existencia de epitopes que producen reacción cruzada entre T. cruzi y otros parásitos que están presentes en una misma área geográfica pudiendo generarse falsos positivos. Segundo, el estatus clínico de un paciente no puede estar ligado a su respuesta humoral, principalmente en las primeras semanas de la infección (cuando no existe reacción serológica) o después de un tratamiento exitoso (ya que la respuesta inmune puede persistir por años) (Winker, 1994). Lo anterior, aunado a los casos crónicos, donde el número de parásitos circulantes es considerablemente bajo, justifican la necesidad de aplicar un método más eficiente para la detección del parásito. Una importante técnica, ya probada en muestras sanguíneas, es la Reacción en Cadena de la Polimerasa, cuyos principales blancos de amplificación son el minicírculo de ADN del cinetoplasto (Sturm, 1989 y Avila, 1991) y secuencias nucleares repetitivas (Moser, 1989 y Russomando, 1992). El diagnóstico mediante RCP ha mostrado diferentes grados de variabilidad en la eficiencia. En ese sentido, existen reportes que refieren sensibilidad del 96% (Wincker, 1994a) al 100% (Avila, 1993) comparado con el serológico, sin embargo, algunos autores han observado niveles de sensibilidad más bajos; del 94.1% (Guevara, 1996) hasta 90% (Britto, 1995), usando los iniciadores S35 y S36, que pertenecen al ADN del minicírculo del cinetoplasto. La RCP se ha usado además para el diagnóstico, para determinar si existe persistencia del parásito en miocardio de individuos con Chagas crónico después del tratamiento con quimioterapia (Añes, 1999), así como en la detección de T. cruzi en vectores silvestres. Al respecto se sabe que al menos en Rhodnius prolixus procedentes de Guatemala resulta significantemente más sensible que la microscopía (Dorn, 1999). Por otra parte, Centurion-Lara y cols. (1994) encontraron una sensibilidad y especificidad del 100% e implementaron una RCP que por primera vez genera una estimación cuantitativa de la parasitemia durante la infección crónica en humanos, comprobando que esta técnica es útil para estudiar la historia natural de la enfermedad, para conocer la respuesta a la terapia y para estudios relacionados con la patofisiología de la enfermedad de Chagas. VI. JUSTIFICACION El estudio y conocimiento de los vectores que pueden transmitir el T. cruzi en una población, constituye un importante avance epidemiológico y representa una de las principales estrategias para el control de la enfermedad. Por otra parte, el poder conocer si los vectores de una población contienen al T. cruzi, habla del riesgo en que se encuentra dicha población a infectarse si no se toman medidas eficaces y oportunas de control (Catala, 1997). Tradicionalmente se realizan exámenes microscópicos para buscar T. cruzi en deyecciones fecales de triatominos, sin embargo, carecen de sensibilidad y no permiten afirmar fehacientemente que sea precisamente la especie T. cruzi, es decir tampoco son específicas (Balbir, 1997., Shikanai, 1996., Gomes, 1999). Actualmente se cuenta con la reacción en cadena de la polimerasa que tiene alta sensibilidad y especificidad para identificar la especie T. cruzi (Moser, 1989). Especificidad (RCP) Con relación a la especificidad se conoce ahora que estudios realizados con iniciadores diseñados para T. cruzi han demostrado alta especificidad, al no amplificar secuencias de Leishmania spp (L. mexicana mexicana y L. major), éstos parásitos son miembros de la misma familia (Tripanosomatidae) e infectan también a humanos en áreas endémicas para T. cruzi. Además los iniciadores tampoco amplifican tripanosomas africanos como T. brucei brucei, T. brucei rhodesiense, T. brucei gambiense y T. congolense, (Moser, 1989) a diferencia del gran número de falsos positivos y reacciones cruzadas que presentan las pruebas serológicas, en especial con Leishmania spp y Trypanosoma rangeli presentes en zonas endémicas para T. cruzi ( Avila, 1991) Sensibilidad (RCP) La RCP tiene un alto grado de sensibilidad, pudiendo llegar a detectar una sola célula de T. cruzi en 20 ml de sangre, por lo cual éste método, puede ser usado en él diagnóstico de enfermedad de Chagas crónico, en donde el nivel de parásitos en sangre es muy bajo (Avila, 1991) y el diagnostico parasitológico directo suele ser negativo, e incluso el Xenodiagnostico es positivo solo en el 17 a 70% de los casos (Rosales, 1995), las pruebas serológicas tienen una sensibilidad del 95 al 100% en la fase crónica de la enfermedad (Avila, 1993). La alta especificidad y sensibilidad de la RCP en la identificación de T. cruzi, convierte a este método en un excelente candidato para el seguimiento de pacientes con enfermedad de Chagas en la fase aguda con tratamiento quimioterapéutico. También puede ser usado con un mayor potencial en el diagnostico en casos de pacientes inmunodeprimidos y para el estudio de la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas (Russomando, 1992) VII. ORIGINALIDAD La enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias que afecta a una población significativa en América Latina, y la OMS la considera una de las cuatro principales afecciones por parásitos en el mundo. Actualmente múltiples investigadores de distintos países en el mundo realizan investigaciones en los vectores, hospederos y la biología del parásito, de manera especial se realizan estudios de su biología molecular, así como, sus mecanismos patofisiológicos. Sin embargo, no existe una forma práctica y sencilla para medir en su conjunto la capacidad de transmisión vectorial (CTV/triatominos) de Trypanosoma cruzi. El presente trabajo propone una escala nominal convencional para medir de cierta manera la CTV asignando cruces al tiempo de defecación posprandial espontáneo de los vectores (tal como sucede en la naturaleza), el resultado de la RCP para la identificación de la especie cruzi (positivo o negativo), y el resultado de la observación microscópica del flagelado (positivo o negativo) en las deyecciones fecales de triatominos en estudio. Lo anterior nos permitirá contar con una herramienta que permita medir y comparar los resultados obtenidos en este tipo de investigaciones. VIII. OBJETIVO GENERAL Identificar Trypanosoma cruzi en triatominos de tres ecotopos del Estado de Colima mediante la reacción en cadena de la Polimerasa. OBJETIVOS ESPECIFICOS • Confirmar la presencia de Tripanosoma cruzi en las deyecciones de triatominos del estado de Colima que hayan sido positivas a la microscopia mediante la RCP. • Determinar por ecotopos la incidencia de triatominos infectados con Trypanosoma cruzi. • Conocer la distribución de las especies de triatominos. • Conocer la frecuencia de infección natural en las especies de triatominos colectados. • Determinar la capacidad de transmisión vectorial (riesgo de transmisión). • Determinar donde hay mayor riesgo de transmisión vectorial. IX. MATERIAL Y METODOS 9.1 Universo de Estudio El estado de Colima cubre 5 540 Km2, distribuidos en 10 municipios y se localiza en la costa del Pacífico Occidental de la República Mexicana, entre los 18°41' y 19°31' latitud norte, 103°29' y 104°41' longitud oeste, colinda al norte con el estado de Jalisco, al sur con Michoacán y al oeste con el Océano Pacífico (INEGI, 1997). En primer término se seleccionó un transecto que va desde las faldas del Volcán de Colima al Norte, hasta las playas de Tecomán y Armería al Sur, siguiendo el trayecto de la ruta Comercial y Turística del estado,(Ver figura 4 ) en donde se asientan la mayoría de las poblaciones. En seguida se hizo una división de este transecto en tres regiones de acuerdo a sus condiciones ecológicas y climatológicas, siguiendo los criterios de Köepen modificados (CGSNEGI, 1992) y a su altitud sobre el nivel del mar. Dichas divisiones se consideraron como ecotopos, entendiendo a este como un ecosistema delimitado, (Avila-Pires, 1985). Fig. 4.- Universo de Estudio Los ecotopos fueron seleccionados de manera convencional y se delinearon de la siguiente manera: Ecotopo 1 (Bajo ó Costero). Desde el nivel del mar hasta 300 m snm. Comprende una planicie costera poco accidentada, en donde la región predominante es de selva baja caducifolia y sobre todo, grandes extensiones de palmar con cultivos de limón y papaya. Esta zona es calurosa y seca correspondiendo al tipo BS1(h´)w(w) de Köepen o también denominada "Trópico Seco", con una precipitación anual de 777 mm y temperatura promedio de 26.5°C y comprende aproximadamente 690 Km2 (poblaciones de Tecomán, Armería, Periquillos, Cofradía de Juárez y Flor de Coco) con 86 307 habitantes. Ecotopo 2 (Medio). Arriba de los 300 hasta los 800 m snm, y que corresponde a los tipos Aw1(w) y Aw0(w) de Köepen, un poco más cálido y seco que el ecotopo alto, en donde se hace más extensa la superficie cultivada y comienza a aparecer vegetación xerofítica con abundantes mezquiteras, pastizales, matorral espinoso, huertas de mango, mamey, cítricos y palmeras de coco, persisten los cultivos de maíz y aparecen sembradíos de hortaliza y melón. La precipitación anual en 1997 fue de 1026 mm y la temperatura promedio de 25.2°C y abarca aproximadamente 615 Km2 (poblaciones de Villa de Álvarez, Colima, el Trapiche, Piscila, Los Ortices y Zacualpan) con 178 491 habitantes. Ecotopo 3 (Alto). Arriba de los 800 m snm y que corresponde al tipo climatológico Aw2(w) de Köepen, semicálido y húmedo donde predomina la vegetación de tipo selva baja subcaducifolia y pastizales con amplias zonas de cultivo, principalmente caña de azúcar y maíz. Los árboles típicos son parota, higuera, cuajiote y primavera. La precipitación anual en 1997 fue de 1226 mm, con una temperatura promedio de 22.3°C y comprende aproximadamente 550 Km2 (poblaciones de Cómala, Cuauhtémoc, Nogueras, Joyitas, Ocotillo, Quesería, Alcaráces, Montitlán y Cofradía de Suchitlán) con 27 859 habitantes. (Datos de la CNA 1997) El rango y tipo de localidades estudiadas correspondieron a poblaciones a - Urbana. b - Rurales concentradas. c - Rurales dispersas, d - Construcciones diversas, a base de lámina, madera, adobe, ladrillo, con ó sin enjarre. 9.2 Tipo de Estudio Descriptivo transversal no probabilístico basado en un muestreo intencionado en casas de poblaciones rurales, de la periferia de las ciudades o en su caso cuando fuimos solicitados en domicilios urbanos y en la que los habitantes de las casas referían haber sido picados por triatominos, en estas casas invariablemente se colectaron triatominos. 9.3 Tipo de Variable Datos Nominales. 9.4 Unidad última de muestra Deyecciones de triatominos. 9.5 Estadísticos de Medición Frecuencias y porcentajes, para la comparación de los resultados de microscopia y RCP en las especies capturadas en las poblaciones y ecotopos examinados se utilizó X 2 con una á = 5% 9.6 Colecta de triatominos Esta se realizó por las tardes de manera manual, para lo cual se capacitaron alumnos de las Facultades de Ciencias Químicas y de Medicina de la Universidad de Colima, y un alumno del Instituto Tecnológico Regional de Colima. De manera arbitraria y para que fuera similar él numero de casas de cada uno de los ecotopos se revisaron 50 casas en cada uno, empleando las mismas horas hombre, únicamente hubo variación del tiempo empleado para la colecta de triatominos en las casas que tenían más habitaciones o presentaban mayor acumulación de objetos y desorden en general, después de la colecta los triatominos se llevaron al laboratorio de Ecología Médica de la Facultad de Medicina para continuar con la investigación 9.7 Obtención de las deyecciones y observación microscópica Los triatominos se transportaron al laboratorio en contenedores de plástico con tapa perforada e inserto de papel periódico doblado con el fin de que pudieran respirar y no se lastimaran. En el laboratorio fueron alimentadas con ratones de bioterio, y se cronometró el tiempo de la que defecación espontánea; cabe mencionar que dichos ratones fueron analizados microscópicamente y se cultivo su sangre (Luz. 1994) para probar la ausencia del parásito. Las deyecciones empleadas para el estudio fueron colectadas con jeringa estéril exclusivamente de la primera alimentación en el laboratorio, e inmediatamente se colocó entre porta y cubreobjeto una alícuota de la deyección fecal con solución salina fisiológica estéril (aproximadamente 50 µl) para la observación microscópica a 100 y 400 aumentos ((WisnivesKy, 1982). Las deyecciones negativas (ausencia visual del parásito) se revisaron por un tiempo mínimo de 5 minutos, mientras que las positivas se depositaron en tubos Eppendorff estériles (volúmenes promedio entre 150 y 300 µl), rotulando las muestras con números progresivos, ecotopo y resultado microscópico, y se conservaron a -76°C hasta la extracción de ADN. 9.8 Procedimiento para la extracción de ADN Preparación de reactivos para la extracción de ADN Solución de Lisis A EDTA (PM 372,2) 100 mM (3,72 g /100 ml) NaCl (PM 58,44) 150 mM (0,876 g /100 ml) Esterilizar en autoclave Buffer DTAB Bromuro de Duodeciltrimetilamonio (DTAB) 8 % (8 g /100 ml) Tris 100 mM pH 8 (1,21 g /100 ml) NaCl (PM 58,44) 1,2 M (7 g /100 ml) EDTA (PM 372,2) 50 mM (1,86 g /100 ml) (PM 121,1) Disolver el Tris y ajustar el pH 8,6 en tres cuartos del volumen final, adicionar el DTAB, el NaCl y el EDTA, aforar al volumen final. Buffer CTAB Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio (CTAB) NaCl (58,44) 5% 400 mM (5 g /100 ml) (2,34 g /100 ml) Disolver ambas sales en agua desionizada y esterilizar. Solución de Acetato de Sodio 3 M (CH3.COO.Na ) Acetato de sodio (PM 82,03). Para preparar 100 ml 3 M (disolver 24,609 g de acetato de sodio en 100 ml de agua desionizada). Ajustar el pH a 4,8 y esterilizar. Soluciónes de Duodecilsulfato de sodio (SDS) al (0,5 %) y (10 %) SDS al 0,5%, disolver 0,25 g de SDS en 50 ml de H2 O desionizada. SDS al 10%, disolver 5,0 g de SDS en 50 ml de H2O desionizada. Solución de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico en una relación 25:24:1 Fenol 25 volúmenes Cloroformo 24 volúmenes Alcohol isoamílico 1 volumen Mezclar ambos reactivos en un frasco ámbar y agitar (de preferencia preparar inmediatamente antes de usarlo). Solución de cloroformo-alcohol isoamílico en una relación 24:1 Cloroformo 24 volúmenes Alcohol isoamílico 1 volumen Mezclar ambos reactivos en un frasco ámbar y agitar (de preferencia preparar al momento) Solución de NaCl (1,2 M) NaCl (PM 58,44) 1.2 M (7,01 g /100 ml) Esterilizar. Buffer TE Tris (PM 121,1) EDTA (PM 372,2) 100 mM (1,211 g /100 ml) 1 mM (0,0372 g /100 ml) Disolver en agua desionizada, ajustar a pH 7,5 con HCl (1 N) y esterilizar. A. Cuantificación del ADN y determinación de su pureza mediante espectrofotometría (Maniatis, 1989). C.1 Cuantificación de ADN • Colocar 5 µl de la muestra de ADN en una celdilla de cuarzo que contenga 1 ml de H2O destilada. • Determinar la absorbancia a 260 nm (luz ultravioleta) y 280 nm. • Cuantificar la concentración de ADN a partir de dicha lectura mediante la fórmula siguiente: [ADN ng/µl = absorbancia a 260 nm x dilución (1005 / 5 µl) x 50]. ∗ El valor de 50 es constante, y representa el coeficiente de extinción molar de 50 ng/µl de ADN, que tiene la máxima absorbancia de 1 a esa longitud de onda (260 nm). Sin embargo, este valor puede variar según el contenido de G + C del ADN. Determinación de la pureza del ADN La pureza del ADN en solución se determina calculando la tasa de absorbancia a 260 nm/ absorbancia a 280. Para considerar un ADN altamente puro la tasa debe fluctuar entre 1,6 a 1,8. Las relaciones mayores a 1,8 pueden ser causadas por contaminación con ARN y las inferiores a 1,6 indican la presencia de sales o proteínas en la preparación del ADN. Reactivos para electroforésis Buffer TBE 10X EDTA (PM 372,2) 0,25 M (9,3 g /l) Tris (PM 121,1) 890 mM (107,77 g /l) Ácido bórico (PM 61,84) 890 mM (55,03 g /l) Se mezclan los tres reactivos en un volumen cercano al deseado, se agita, ya diluido, se afora al volumen final. La concentración de este buffer es 10 veces mayor al usado en el corrimiento de los geles (1X). Para obtener el buffer 1X se diluye el primero a una relación 10:1 Buffer de carga (jugo azul 6X) Azul de bromofenol 0,25 % (0,25 g/10 ml) Xilencianol 0,25 % (0,25 g /10 ml) Glicerol 30,00 % (3,00 ml/10 ml) Mezclar ambos colorantes con el glicerol y aforar a 10 ml con agua desionizada. Persulfato de Amonio (PSA) al 10 % Disolver 5 g de persulfato de amonio en 50 ml de H2O desionizada. Poliacrilamida al 30 % Agregar y disolver en un frasco ámbar 29 g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida y llevar a 100 ml con agua desionizada. Gel de Poliacrilamida al 6 % de un stock 29:1 (para 40 ml) H2O_______________________________ 27,56 ml TBE 10X ___________________________ 4,00 ml Persulfato de amonio (PSA)10 % ________ 0,40 ml Acrilamida:Bisacrilamida al 30 %_________ 8,00 ml TEMED_____________________________ 0,04 ml Agregar los reactivos en este orden en un tubo graduado y mezclar por inversión. NOTAS: (1) El TEMED es un catalizador, por lo que se debe vaciar la mezcla lo más pronto posible para evitar que la poliacrilamida polimerize antes de agregarla al molde de vidrio. (2) Dejar polimerizar (en el molde) por lo menos 10 minutos y dar un precorrimiento de 5 a 10 minuntos con buffer TBE 1X a 200 V antes de agregar las muestras de interés. (3) La acrilamida y bisacrilamida son NEUROTÓXICAS. Solamente polimerizadas son inertes por lo que se deben de manejar y pesar extracción, guantes y cubreboca. Reactivos para la fijación y revelado de geles Solución Fijadora Etanol absoluto al 10,0 % __________________ Ácido acético al 0,5 % __________________ 100 ml 5 ml Aforar a 1 litro con H2O desionizada Solución de nitrato de p lata AgNO3 al 0,2 % ____________________________ 0,2 g. Aforar a 100 ml con solución fijadora y disolver. Solución Reveladora NaOH al 3,0 % ___________________________ 30,0 g Formaldehído al 0,5 % _______________________ Aforar a 1litro con H20 desionizada 5 ml en campana de Fijación y revelado de los geles de poliacrilamida (modificado de Sanguinetti, 1994) Tinción rápida con nitrato de plata • Agregar al gel 100 ml de solución fijadora y agitar suavemente durante 20 minutos con agitación suave. • Disolver 0,2 g de nitrato de palta en 100 ml de solución fijadora. Bañar al gel con esta solución durante 5 minutos con agitación suave. • Lavar el gel con H2 O desionizada durante 30 segundos, tirar y repetir el lavado durante 1 minuto. • Agregar solución reve ladora, dejar que aparezcan las bandas y tirar la solución. • Lavar el gel con agua desionizada durante 1 minuto. • Deshidratar el gel sobre un soporte, que puede ser papel filtro o plástico. Protocolos para extracción de material genético Existen diferentes protocolos para el aislamiento de ácidos nucleicos, sin embargo todos coinciden en el objetivo de lograr aislar ADN o ARN con alto grado de pureza, tal como lo ameritan las técnicas de Biología Molecular, y la técnica de amplificación por RCP no es la excepción. El método de extracción utilizado en el presente trabajo fue el modificado por Maniatis. Procedimiento para la extracción de ADN a partir de materia fecal de triatominos (modificado de Maniatis, 1988) 1) Se rotulan por triplicado los tubos Eppendorff de 1,5 ml necesarios para el total de muestras que se van a procesar. 2) Adicionar a cada tubo con muestra 300 µl de solución salina estéril agitar por inversión y centrifugar a 5’ a 4 mil rpm a 4°C, retirar el sobrenadante. 3) Adicionar a cada tubo 50 µl del buffer de lisis (EDTA 0.1 M y NaCl 0.15 M) agitar por inversión. 4) Adicionar a cada tubo 100 µl de Proteínasa “K” a [0.1 mg/ml] y 50 µl de SDS (0,5%), mezclar por inversión. 5) Incubar a 56°C durante 2 a 3 horas agitando los tubos por inversión cada hora. 6) Adicionar a cada tubo un volumen igual de fenol pH 8 (calentado previamente a 60°C en baño María o 10” a 15” en microondas, agitar con vórtex). 7) Centrifugar a 10 mil rpm durante 10’ a 4°C. 8) Transferir el sobrenadante (fase acuosa) a otro tubo Eppendorff (previamente rotulados) agregarle, un volumen igual de fenol – cloroformo - alcohol isoamílico (25:24:1), y agitar con vórtex. 9) Repetir el paso 7. 10) Transferir el sobrenadante (fase acuosa) a otro tubo (previamente rotulado) y agregarle un volumen igual de cloroformo - alcohol isoamílico (24:1), mezclar por inversión con la mano (sin vórtex). 11) Centrifugar a 10 mil rpm durante 10' y separar el sobrenadante (fase acuosa). 12) Adicionar a cada tubo 0.1 volumen de acetato de sodio pH 4,8 y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío. Mezclar lenta y suavemente hasta que la madeja formada por el DNA se haga evidente y dejar precipitar a –20°C durante toda la noche. 13) Al día siguiente centrifugar a 10 mil rpm durante 20’ a 4°C y retirar el sobrandante. 14) Agregar 300 µl de etanol al 70% frío, mezclar lentamente por inversión y centrifugar durante 20` a 10 mil rpm a 4°C. 15) Retirar todo el alcohol que sea posible y dejar secar. 16) Ya seco el botón (de ADN) se le adiciona 250 µl de buffer TE 1X, y 50 µl de RNA(sa) a [20 µg/ml) y se deja incubar a 37°C durante 60’ mezclando por inversión continuamente. 17) Extraer el ADN con un volumen de fenol – cloroformo - alcohol isoamílico (25:24:1) mezclar por inversión (sin vórtex). 18) Repetir el paso 7. 19) Retirar el sobrenadante (fase acuosa) y adicionar 0.1 del volumen de acetato de sodio 3M pH 4,8 frío, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío, mezclar lentamente por inversión hasta que la madeja de DNA se haga evidente, dejar los tubos en reposo durante toda la noche a –20°C. 20) Repetir paso 7. 21) Retirar el sobrenadante y agregar 250 µl de etanol al 70% frío, mezclar por inversión. 22) Repetir paso 7, decantar y dejar secar al aire. 23) Adicionar al tubo que contiene el botón de DNA seco 25 µl de buffer TE 1X e incubar a 37°C para que se disuelva el ADN. 9.9 Reacción en cadena de la polimerasa. REACTIVOS Y CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN CONDICIONES TEMPERATURA TIEMPO CICLOS DESNAT. INICIAL 94°C 5 minutos DESNATURALIZACIÓN 94°C 1 minuto ALINEAMIENTO 55°C 1 min 30 seg. EXTENCIÓN 72°C 2 minutos EXTENCIÓN FINAL 72°C 5 minutos 1 25 1 Secuencia de los iniciadores TCZ1 5’ - CGA- GCT- CTT- GCC –CAC- ACG- GGT- GCT – 3’ TCZ2 5’ - CCT –CCA- AGC- AGC- GGA- TAG –TTC- AGG- 3’ Los cuales amplifican específicamente una región altamente repetitiva de 188 pb del ADN genómico de Trypanosoma cruzi (Moser,1989). Observaciones del procedimiento: Es importante señalar que por cada reacción de amplificación se incluyeron, además de las muestras de interés, 4 controles: 2 positivos (uno a base de ADN de Trypanosoma cruzi cultivado axénicamente y otro de un paciente con megaesófago); y 2 negativos (uno con agua en lugar de ADN y el otro, ADN de un niño del cual se sabe no está infectado). La mezcla de reacción para las muestras de interés incluye 2,5 µl de ADN molde (obtenido de la deyección fecal de triatomino) más 22,5 µl de una mezcla que contiene los siguientes reactantes: MEZCLA DE REACCIÓN REACTIVO CONCENTRACIÓN FINAL Solución amortiguadora Tris-HCl pH 8.3 10 mM (1X) (10X) Solución de MgCl2 1.5 mM Solución de dNTP’s (cada uno) 200 µM Iniciadores (TCZ1 y TCZ2) 60 nM Taq Polimerasa 1U 9.10 Capacidad de transmisión vectorial “CTV” Tiempo de defecación posprandial espontáneo. Es el lapso de tiempo que transcurre desde que el triatomino termina de alimentarse hasta que defeca, se mide en minutos. Representa el principal parámetro de importancia epidemiológica dado el mecanismo de transmisión del parásito, ya que existe una relación inversa entre este tiempo y el grado de transmisibilidad de Tripanosoma cruzi La prueba para la identificación de Trypanosoma cruzi. Otro factor epidemiológico importante es conocer si el triatomino está infectado o no está infectado con Trypanosoma cruzi. Por lo tanto es primordial la especificidad de la prueba de identificación, en esta investigación las pruebas empleadas en orden decreciente de especificidad son la reacción en cadena de la polimerasa y el resultado de la observación microscópica. CTV. Se diseño una escala cualitativa como una forma practica y convencional para medir el grado de transmisión vectorial de Trypanosoma cruzi. En esta escala se pondera mediante cruces (+) el tiempo de defecación posprandial, el resultado de la reacción en cadena de la polimerasa y el de la observación microscópica en las deyecciones de los triatominos. En este sentido se asignan las siguientes escalas de cruces: Tiempo de defecación posprandial (natural) Inmediato TDPI = (++++) Retrasado TDPR = (+) ( 1’) Resultado de Microscopía Positiva Negativa MP MN = (+++) = (+) Resultado de RCP (reacción en cadena de la polimerasa) Positiva RCPP = (++++) Negativa RCPN = + Cuadro 1 Escala Convencional Nominal Cualitativa (cruces) Para medir el riesgo de Transmisión Vectorial (CTV) CONDICIONES TDPI MP RCPP TDPI MP RCPN TDPI MN RCPP TDPI MN RCPN TDPR MP RCPP TDPR MN RCPP TDPR MP RCPN TDPR MN RCPN NUMERO DE CRUCES ++++ +++ ++++ ++++ +++ + ++++ + ++++ ++++ + + + +++ ++++ + + ++++ + +++ + + + + CATEGORÍA DE RIESGO ALTO (11) MEDIANO (8) ALTO (9) BAJO (6) MEDIANO (8) BAJO (6) BAJO (5) BAJO (3) RANGO DE RIESGO NUMERO DE CRUCES NIVEL DE RIESGO (O DE CTV) 9 ALTO 8 MEDIANO <8 BAJO X. RESULTADOS En la tabla 1 y en la gráfica 1 se aprecia que en los ecotopos se estudiaron 187 triatominos distribuidos de la siguiente manera. Del ecotopo 1, los 11 triatominos resultaron microscópicamente negativos a la presencia de flagelados intestinales; del ecotopo 2 se estudiaron 35 triatominos, de los cuales a 14 (40%) se les encontró el flagelado intestinal por microscopía, y de estos a 10 (28,6%) se les identificó T. cruzi mediante RCP (electroforésis 1); finalmente del ecotopo 3 se estudiaron 141 triatominos, de los cuales a 46 (32,6%) se les encontró el parásito por microscopía y 39 (27,7%) fueron identificados como T. cruzi mediante RCP (electroforésis 1). La X2 para los resultados de microscopía en los 187 triatominos estudiados, muestra que la infección natural en los triatominos es diferente en cada uno de los ecotopos (p = 0,045), y los resultados de la RCP en triatominos positivos a microscopía de los ecotopos 2 y 3 muestra que no hay diferencia entre ambos ecotopos (p = 0,264) con la prueba exacta de Fisher. Microscopia (+ y -) Ecotopo 1 Vs Ecotopo 2 Vs Ecotopo 3 X2 = 6,222 p = 0,045 2 gl RCP (+ y -) Ecotopo 2 Vs Ecotopo 3 p = 0,4615 Fisher 1 gl Cuando la microscopía de las deyecciones fue positiva, en más del 70% de los casos se reporto mediante RCP que el flagelado observado es Trypanosoma cruzi: para el ecotopo 2 (10/14 = 71%); para el ecotopo 3 (39/46 = 84%); para ambos ecotopos (49/60 = 81%). Gráfico 1 Triatominos Microscopía y RCP (TCZ's) 160 141 140 120 95 Frecuencia 100 80 46 60 39 35 40 21 14 20 7 11 10 Ecotopo 3 11 0 4 0 Ecotopo 2 1 0 2 0 3 4 12345- Triatominos estudiados por ecotopo Triatominos positivos a Microscopía Triatominos negativos a Microscopía Triatominos positivos a RCP Triatominos negativos a RCP 5 Ecotopo 1 En la gráfica 2 se aprecian los resultados de microscopía, para cada especie o ninfa estudiada de todo el universo. Obteniendo los siguientes porcentajes de positividad: T. pallidipennis 36.6%; T. longipennis el 34.1%, y las ninfas (T. spp) el 26.6%. La X2 muestra que no hay diferencia en la presencia de flagelado intestinal en las especies y ninfas estudiadas (grado de infección natural). (X 2 = 1.76 p = 0.415 1 gl). Gráfico No. 2 Microscopia (Infección Natural) Imagos (triatominos adultos) y Ninfas (Triatoma. spp ) Tres Ecotopos 97 55 60 45 50 27 40 20 0 26 20 14 10 Microscopia 0 0 NInfas Triatom Microscopia + Triatom Triatom a pallid ip ennis a longip en nis a dimid ia ta Frecuencia 30 En la gráfica 3 y la tabla 2, se aprecian los resultados de microscopía (infección natural) de las especies estudiadas, por ecotopo. La X2 muestra que no hay diferencias en el grado de infección natural para las especies de triatominos estudiadas. X2 Triatomino (especie) p gl T. pallidipennis 4.822 0.8960 2 T longipennis 1.582 0.4520 2 Ninfas (T. spp) 1.762 0.4142 2 Gráfica 3 Resultados Microscopía Por ecotopo y por especie de Triatomino 50 47 45 40 35 Frecuencia 27 30 25 21 17 20 16 13 15 9 10 10 8 5 5 1 0 0 Ecotopo 3 0 1 6 4 2 1 4 Ecotopo 2 2 0 3 Ecotopo 1 5 6 Triatoma pallidipennis..... Abscisas 1 y 2 Barras Rojas........Microscopía positiva. Triatoma longipennis...... Abscisas 3 y 4 Barras Azules......Microscopía negativa. Ninfas (Triatoma spp)..... Abscisas 5 y 6 En la gráfica 4, se aprecian los resultados de la Reacción en Cadena de la Polimerasa realizada en las deyecciones de triatominos de los ecotopos 2 y 3 que resultaron positivos a microscopía (identificación T. cruzi). La prueba exacta de Fisher muestra que no hay diferencias en la frecuencia de infección por T. cruzi para cada una de las especies en los dos ecotopos. Especie de triatomino p T. pallidipennis 0,5906 T longipennis 1,0000 Ninfas (T. spp) 0.2487 Gráfica 4 Resultados RCP Por ecotopo y por especie de Triatomino 16 15 14 13 12 11 Frecuencia 10 8 7 6 4 2 3 2 2 2 1 2 0 2 1 Ecotopo 3 0 2 3 Ecotopo 2 4 5 6 Triatoma pallidipennis..... Abscisas 1 y 2 Barras Rojas........Microscopía positiva. Triatoma longipennis...... Abscisas 3 y 4 Barras Azules......Microscopía negativa. Ninfas (Triatoma spp)..... Abscisas 5 y 6 No obstante que el análisis estadístico para comparar los resultados microscópicos de las especies estudiadas en los tres ecotopos no muestra que sean diferentes; es importante hacer incapié lo siguiente: en el ecotopo 1 la colecta de triatominos fue mínima; la captura de triatominos se ve incrementada conforme se avanzó hacia el norte del estado (ecotopos medio y alto), alcanzando el máximo de colectas de triatominos en las poblaciones de Nogueras y Cuauhtémoc del ecotopo 3. Continuando hacia el norte de estas dos últimas poblaciones para la colecta de triatominos, aumenta la altitud sobre el nivel del mar, y en sentido inverso, disminuyó la colecta de triatominos. Es particularmente interesante la colecta mínima de triatominos en el ecotopo 1, lo cual es contradictoria con la captura de triatominos que se reporta en zonas costeras de Centro y Sudamérica donde la mayor densidad de triatominos se da precisamente en las zonas costeras (Zeledón, 1981). Siendo el ecotopo 3 (el más alto) donde además de colectarse la mayor cantidad de triatominos, en el que se encontró la mayor positividad a microscopia y RCP, de manera particular en las poblaciones de Nogueras y Cuauhtémoc. En la tabla 3 se aprecian los resultados del tiempo de defecación posprandial espontáneo de los triatominos (inmediato y tardío), por población y especie, que en combinación con los resultados microscópicos de las deyecciones y de RCP practicados en las deyecciones positivas a microscopías, miden la CTV por especie, población y ecotopo (tablas 6, 7 y 8). Los resultados del riesgo de transmisión vectorial obtenidos por ecotopo, población y especie, se describen en las siguientes líneas: Ecotopo 1 (tabla 6) v La CTV para Triatoma pallidipennis, Triatoma longipennis y ninfas (Triatoma spp) es baja, y se mostró únicamente en la población de Armería. Ecotopo 2 (tablas 7 y 8) v La CTV para Triatoma pallidipenis fue alta en 3 vectores; mediana en 4 y baja en 2 (Colima). v La CTV Triatoma longipennis fue baja en un sólo 1 vector (Colima). v La CTV para las Ninfas (Triatoma spp) fue alta en 2 vectores y mediana en 2 (Colima y Villa de Álvarez). Ecotopo 3 (tablas 7 y 8) v La CTV para Triatoma pallidipenis fue alta en 10 vectores, mediana en 5 y baja en 2 (Cuauhtémoc y Nogueras). v La CTV Triatoma longipennis fue alta en 4 vectores, mediana en 7 y baja en 2 (Cuauhtémoc y Nogueras). v La CTV para las ninfas (Triatoma spp) fue alta en 4 vectores, mediana en 9 y baja en 3 (Cuautémoc y Nogueras). Con relación a Triatoma dimidiata únicamente fue capturado un vector en el ecotopo 3, el cual murió antes de ser estudiado, por lo tanto, la presencia del vector por si misma indica capacidad de transmisión vectorial baja, aun cuando no haya sido estudiado el triatomino. Respecto al comportamiento de los triatominos capturados es importante hacer algunas observaciones: 1) Un hecho curioso y que llama la atención es que los triatominos domiciliados generalmente presentan predilección para alimentarse de alguno de los residentes que bien pudiera ser el papá, la mamá o alguno de los hijos, mientras que los demás residentes no son picados por los triatominos, fue menos frecuente que se dijera que todos los residentes de la casa eran picados por los triatominos 2) Otra característica interesante fue la relativa facilidad y rapidez (menos de 24 horas) con la que los triatominos mueren en presencia de humedad, aun cuando esta es mínima (cabe mencionar que llegaron a fallecer con la presencia de sus propias deyecciones fecales y urinarias). XI. Discusión La colecta, identificación, y estudio de T. cruzi en los triatominos de los tres ecotopos previamente asignados para esta investigación, muestra la presencia de tres especies de triatominos (Espinoza, 1998). 40.2% correspondieron a Triatoma pallidipennis (Stal); 21.8% correspondieron a Triatoma longipennis (Usinger); 0.43% correspondieron a Triatoma dimidiata (Latreille); y 37.6% correspondieron a Ninfas (T. spp). Estos triatominos fueron colectados en el 60% de las poblaciones muestreadas, lo cual habla de la dispersión de los triatominos. Un estudio similar en el estado de Jalisco (Magallon-Gastelum, 1998) mostró la presencia de 8 especies de triatominos en 51 municipios, colectaron 1029 triatominos, correspondiendo el 5.54% para Triatoma barberi; 0.097% para Triatoma brailosvskyi; 0.097% para Triatoma dimidiata; 40.04% para Triatoma longipennis; 0.39% para Triatoma mazzotti; 22.16% para Triatoma pallidipennis; 0.58% para Triatoma phylosoma; y 2.62% para Triatoma picturata . En el universo estudiado en Colima sólo se encontraron tres especies (T. pallidipennis, T. longipennis y T. dimidiata) y el porcentaje de infección natural (micrsocopía) es diferente, 36.6% Vs 14% para Triatoma pallidipennis, 34% Vs 18.4% para Triatoma longipennis, y 26.6% Vs 10.2% para las ninfas (Triatoma spp) entre Colima/Jalisco respectivamente. Lo anterior reafirma el hecho de que la distribución de los vectores y la tasa de infección natural es muy diversa y se presenta de manera focalizada en cada región. Otro hecho importante son las variaciones en la cantidad de parásitos intestinales y el porcenta je de infección natural en triatominos que da con la estacionalidad (Giojolas, 1990), quién mostrado que en la primavera se encuentra la mayor el mayor grado y tasa de infección en los triatominos y de manera inversa sucede en invierno; lo anterior podría hacer variar los resultados de este trabajo, ya que no se tomó en cuenta este factor en el estudio. Respecto a Triatoma dimidiata de manera similar únicamente se colectó un solo espécimen en los estudios de ambos estados (Colima/Jalisco). El escaso hallazgo de esta especie no es congruente con lo reportado en la literatura, ya que particularmente se considera su presencia endémica en México, centro y Sudamérica (Schofield, 1994). Estudios realizados por investigadores en otros estados, también muestran resultados diferentes, tanto en las especies encontradas, así como, en el grado de infección natural por flagelados, tal como puede apreciarse en los párrafos siguientes. En la ciudad de Cuernavaca Morelos, México (Cortes-Jiménez, 1996) encontraron que de 1060 triatominos colectados, el 97.6% correspondieron a Tritoma pallidipennis, y de estos el 88% presentaron protozoarios flagelados; el 2.4% restante correspondieron a Triatoma barberi, y de estos el 70% presentaron protozoarios flagelados intestinales. En 1999 Bautista, N. L, realiza otro estudio en el estado de Morelos donde mostró la presencia de triatominos, los tipos de ecotopos donde se encontraron, señalando el tipo de construcción, la presencia de grietas en las paredes de las casas y la iluminación como condiciones que favorecen la colonización, la infestación, la densidad, el hacinamiento y la dispersión de los vectores; estas variables las emplearon para calcular el riesgo de transmisión vectorial, obteniendo una cifra de 0.51%, siendo el ecotopo predominante cúmulos de piedras. Y los índices de infección natural encontrados fueron los siguientes: 29% en triatominos domiciliados, 4% para triatominos peridomiciliados y 20% para triatominos selváticos. En 1996 Tay, identifica nuevas localidades con triatominos en la República Mexicana identificando 8 especies y observó que la mayor parte estaban infectadas con Trypanosoma cruzi. En 1993 Alejandre-Aguilar R, realiza un estudio comparativo para mostrar la susceptibilidad de 5 especies de triatominos encontrando que las ninfas de tercer estadio son más susceptibles que las de cuarto estadio y el orden de susceptibilidad por especies fue T. pallidipennis > T. barberi > T. phylosoma > T. infestans > Rhodnius prolixus. Todos los estudios mencionados anteriormente (y otros no mencionados), señalan lo heterogeneo que es la distribución de triatominos, las frecuencias de infección que se presentan, el estadio en que el vector es más susceptible de infectarse, y que debe ser tomado en cuenta para estudios posteriores. También ha sido demostrado que para la identificación de Trypanosoma cruzi la RCP es más sensible y específica que los estudios de microscopia (Kirchhoff, 1996; Moser, 1989; Russomando, 1992; Shikanai-Yasuda, 199; Wincker, 1994). Por lo tanto se esperaba que el total de las pruebas positivas a microscopia, también lo fuera para la RCP, lo cual no se muestra en los resultados de esta tesis. Al respecto se hacen las siguientes consideraciones: 1. Es posible que se haya perdido el ADN del parásito durante el proceso de extracción, y por lo tanto esos resultados de RCP sean falsos negativos. 2. Que no se tratara de Trypanosoma cruzi, lo cual es poco probable y que será motivo de otro estudio. 3. Finalmente para medir en su exacta dimensión la sensibilidad y la especificidad tendrían que realizarse la RCP en las deyecciones de triatominos positivas y negativas a la microscopía, o sea el 100% de las muestras, así como la cantidad mínima detectable de ADN de Trypanosoma cruzi que amplifica con la RCP; el cual no es el objetivo de este trabajo, y que también será motivo de otro estudio adicional. Con base a lo mencionado anteriormente se puede inferir que: 1. La distribución y número de especies son diferentes en cada estado, zona o región donde han sido estudiados. 2. El porcentaje de triatominos infectados es variable para cada zona o región y para cada especie estudiada. 3. El hábitat de los triatominos es muy similar, y no respeta el tipo de casa, sea buena o de mala calidad, sino su ubicación en la periferia de las poblaciones, o en el ámbito silvestre. En Honduras Avila -Montes y cols., 1998 señalaron que la educación para la salud debe ser incluida como un componente importante en la planeación de los programas para el control de la enfermedad de Chagas, lo cual se considera importante en nuestro entorno, sobre todo toda el riesgo de transmisión es mayor. Se estima que existe un gran número un gran número de géneros (7) y especies (32) de triatominos en la República Mexicana, por lo que la transmisión vectorial de Trypanosoma cruzi debe ser estudiada de forma particularizada en cada una de las regiones geográficas (Velasco-Castrejón, 1986), el autor hace énfasis que sólo Brasil se compara con México en el número de vectores potenciales del agente etiológico de la enfermedad de Chagas, de ahí la importancia de los estudios de realizar estudios en cada región geográfica del país. LA PARTICIPACION DIRECTA DE LA COMUNIDAD (sobre todo la que se encuentra directamente en riesgo) juega un papel muy importante en el control del vector, y por lo tanto de la transmisión de Trypanosoma cruzi causante de la enfermedad de Chagas. Estudios diversos tendientes a controlar la enfermedad de Chagas, todos ellos destacan la importancia de que la comunidad participe directamente. (Schofield, 1991Jul-sep; 1991 suppl; Bar, 1996; Cecere, 1999; Gürtler, 1999; Silveira, 1999; Moncayo, 1992; y Bryan, 1994). He ahí la la importancia que tiene el iniciar con campañas de educación para que la población y en especial la que se encuentra en mayor riesgo conozcan los vectores y el como combatirlos (saneamiento, limpieza, el empleo de agua para el control del vector, la aplicación de insecticidas, tapar grietas y el aplanado de paredes) y el realizar estudios serológicos para detectar anticuerpos en donadores de sangre (Leiby, 1997; Carriazo, 1998;, Dias, 1991; Wanderley, 1991; García-Zapata, 1993; González, 1996; Schofield., 1999; Marsden, 1994; Williams-Blangero, 1999; Rojas de Arias, 1999; Aguilera, 1994; Lorca, 1996; Schmunis, 1996; y la OMS report 61 1999., Proyecto 3-P-87-0342 1994). XII. CONCLUSIONES Los resultados de este estudio muestran que la presencia y distribución de los triatominos vectores de Trypanosoma cruzi se dan de una manera muy particular para cada área geográfica o región estudiada, mostrando distintos grados de infección natural para Trypanosoma cruzi; por lo tanto se concluye que es necesario que de manera inmediata se continúe con los trabajos de investigación para conocer más acerca del riesgo de transmisión de Trypanosoma cruzi al humano en nuestro estado, ya que es posible que haya individuos infectados no diagnosticados. La distribución y presencia de triatominos se presenta en áreas geográficas focalizadas y bien delimitadas. En cada área geográfica tienen que estudiarse y caracterizarse el comportamiento y la infección natural de los vectores y de ésta manera conocer el riesgo de infectarse (capacidad de transmisión vectorial). La presencia de triatominos infectados con Trypanosoma cruzi hacen posible la existencia de la enfermedad de Chagas en humanos y en reservorios domésticos y silvestres. Se abren tres grandes vertientes de estudio para conocer mejor la enfermedad de Chagas en nuestro estado y áreas geográficas circunvecinas: 1. Caracterizar las cepas de Trypanosoma cruzi desde varias perspectivas: bioquímica (zimodemos), polimorfismos (simodemos), biodemos y tropismos, con el fin de conocer particularmente su virulencia (Guzmán-Marín, 1999). 2. Estudios de susceptibilidad a la infección en las personas que habitan las áreas geográficas con alto riesgo, y así en conjunción con el inciso anterior conocer nuestra realidad con respecto a la enfermedad de Chagas. 3. Estudiar la Infección Natural y de estacionalidad en reservorios de Trypanosoma cruzi en las áreas geográficas con mayor riesgo de CTV y también en el ecotopo 1 donde se especula que la infección se esté presentando en animales silvestres y domésticos. XIII. UTILIDAD Y PERSPECTIVAS • Reconocer que el Trypanosoma cruzi no sólo está presente en sur de México, sino también en todo México, y en el estado de Colima. • Crear inquietud para que se involucren investigadores y alumnos en el diseño de nuevos proyectos que involucren no solamente la identificación del parásito, sino también la educación y la promoción de la salud en la población en general. • Implementar estrategias específicas que permitan reducir y mantener bajo control epidemiológico el riesgo de infectarse mediante: • El conocimiento de la enfermedad de Chagas. • La identificación y estratificación de las regiones con base en criterios de riesgo epidemiológico, ecológicos y socioeconómicos. • La promoción y capacitación de sobre las acciones de autocuidado que la población puede realizar a nivel individual y familiar, para disminuir el contacto con los insectos vectores. • Disminución de las poblaciones de insectos vectores, mediante la aplicación de agentes físicos y químicos. • Promoción del mejoramiento de viviendas y del saneamiento básico entre la población, para disminuir el contacto intradomiciliario con los insectos vectores. XIV. IMPACTO • Enfermedad de Chagas. Fortalecer el diagnóstico de individuos infectados con T. cruzi, sobre todo en regiones que presentan CTV alta . • Control del vector. • El estudio obligado y permanente de los donadores de sangre. • La educación de la población. XV. BIBLIOGRAFÍA Aguilar, VH., Abad-Franch, F., Racives, VJ., (1999) Epidemiology of Chagas’ disease in Ecuador. A brief review. Mem Inst Oswaldo Cruz 94 Suppll 1: 387-393. Aguilera, X., Apt, W., Rodríguez, J., Correa, V., Valdes, J., Zulantay, I., Sandoval, J., Apt, P. (1994) Efficacy of Chagas’ disease vector control demonstrated through human infection. Rev Med Chil 122(3):259-264. Alcánta ra, A. and Brener, Z. (1978) The in vitro interaction of Trypanosoma cruzi blood stream forms and mouse peritoneal macrophages. Acta Tropica 35: 209219. 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Ocurrencia habitual de hechos particulares dentro de una población. Epidemiología. Estudio de la distribución y determinantes de enfermedad en poblaciones humanas. Especificidad. Probabilidad de que una persona que en realidad no padece la enfermedad de interés tenga un resultado negativo (normal) en su prueba. Esquizodemo. Población de organismos que presentan un patrón electroforético común de fragmentos de restricción del ADN de los minícirculos del cinetoplasto. Hibridación. Proceso mediante el cual dos cadenas sencillas de ácidos nucleicos se unen por complementariedad de bases. Imago. Insecto adulto que se forma del huevo después de pasar por los estados de larva y ninfa. Iniciadores. Oligonucleótidos sintéticos de secuencia corta (no más de 30 bases), que delimitan la región que se desea amplificar mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa. Neártico. Lo que corresponde a la región septentrional de América (reino zoogeográfico que comprende América del norte; excepto la parte sur de México). Neotropical. Reino zoogeográfico que incluye América del Sur y Central, parte meridional de México y las Antillas Ninfa. Forma de desarrollo de los insectos comprendida entre el estadio larvario y el adulto o imago. Reservorio. Huésped o habitat que garantiza la supervivencia del parásito en la naturaleza Reacción en Cadena de la Polimerasa. Método de Biología Molecular que permite amplificar exponencialmente una secuencia génica. Sensibilidad. Probabilidad de que una persona que en realidad padece la enfermedad de interés tenga un resultado positivo (anormal) en su prueba. Signo de Romaña. Reacción inflamatoria que se forma si el parásito entra por la conjuntiva. Simodemo. Población de organismos que presentan un patrón de fragmentos de ADN obtenidos por enzimas de restricción específicas. Triatomino. Insecto vector del agente causal de la enfermedad de Chagas. Tripanosómidos. Protozoarios de la familia Trypanosomatidae que incluye 8 géneros, divididos en dos grupos: Stecoraria (T. cruzi) y Salivaria (T. brucei, agente de la enfermedad del sueño) Tropismo. Movimiento de un organismo en una dirección, determinado por un estímulo externo (luz, calor, alimento). Vector. Nombre que se asigna a todo aquello que sea capaz de portar un agente causante de enfermedad, sin afectarse. Zimodemo. Población de organismos que presentan un patrón electroforético común de enzimas específicas.