Aislamiento e identificación de Mycoplasma pullorum como cepa de

Rev. Cubana de Ciencia Avícola, 2002, 26: 103-109
Aislamiento e identificación de Mycoplasma
pullorum como cepa de nuevo reporte en Cuba
EVELYN LOBO, YLEANA CHAVEZ, J. A. AGÜERO Y SIOMARA MARTÍNEZ
Departamento de Biología Molecular
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria,
Carretera Tapaste y 8 Vías Km 3
San José de las Lajas. La Habana, Cuba
E-mail: [email protected]
H. MOSCOSO, MARICARMEN GARCÍA Y STANLEY KLEVEN
Centro de Diagnóstico e Investigaciones Aviares (PDRC),
Universidad de Georgia, Atlanta, Estados Unidos.
E-mail: [email protected]
RESUMEN. El Síndrome Respiratorio Crónico (SRC) ha alcanzado una gran
importancia por las pérdidas económicas que produce. Su etiología es un complejo
multifactorial, donde los micoplasmas, en particular M. gallisepticum y M. synoviae
son reconocidos como los de mayor importancia en la participación de la
etiopatogenia de esta entidad. Sin embargo, se plantea que en la etiología del
SRC puede participar más de una especie de micoplasma. En el caso particular de
M. pullorum, fue aislado por primera vez en 1985, caracterizado desde entonces,
como un micoplasma saprófito del tracto respiratorio de las aves y contaminante
frecuente en cultivos, sin embargo, estudios posteriores comienzan a vincularlo
como posible agente patógeno. El objetivo de este trabajo fue determinar y
caracterizar la presencia de M. pullorum en gallinas ponedoras comerciales con
síntomas clínicos respiratorios ubicadas en diferentes zonas geográficas de la Isla.
Para esto se trabajaron un total de ochenta muestras procedentes de animales
enfermos y los aislados fueron caracterizados por pruebas serológicas, bioquímicas
y moleculares. Como resultado se determinó la presencia de M.pullorum en el 70%
del total de las muestras analizadas.
Palabras claves: Mycoplasma pullorum, diagnóstico, Síndrome Respiratorio Crónico, gallina ponedora.
En la industria avícola, la Micoplasmosis o
Síndrome Respiratorio Crónico (SRC) ha
alcanzado una gran importancia por las pérdidas económicas que produce tanto de
manera indirecta como directa. Su etiología
es un complejo multifactorial, donde los
micoplasmas, en particular M. gallisepticum
y M. synoviae son reconocidos como los de
mayor importancia en la participación de la
etiopatogenia de esta entidad. Sin embargo,
Kleven en 1996, plantea que en la etiología
del SRC puede participar más de una especie
de micoplasma.
Citti y Rosengarten, en 1997 plantean que,
entre otros factores, la patogenicidad de
determinadas cepas de micoplasma puede
estar relacionada con algún cambio fenotípico
durante el curso de la infección. Este cambio
brinda la capacidad a estos microorganismos
de colonizar las superficies mucosales y
entonces propagarse dentro del hospedero,
aumentando su capacidad de citoadherencia
y virulencia debido quizás a mutaciones de la
cepa. De aquí que la búsqueda de otras especies de micoplasmas que puedan participar
en la etiología del SRC resulte de interès.
En el caso particular de M. pullorum, fue
aislado por primera vez, por Jordan, en 1985,
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Evelyn Lobo,Yleana Chavéz, J. A. Agüero, Siomara Martínez y otros
caracterizado desde entonces, como un micoplasma saprófito del tracto respiratorio de
las aves y contaminante frecuente en cultivos
(Tully, 1992; Glisson, 1993; Kleven y
Levinshon, 1996). Sin embargo, estudios
posteriores comienzan a vincularlo como
posible agente patógeno.El aislamiento de M.
pullorum reportado por Bencina et al., en 1995
a partir de gallinas y embriones de pollos, los
trabajos de Kempf et al, en 1997b, quienes
informaron en Francia el aislamiento de dos
nuevas cepas de M. pullorum con características de patogenicidad y el primer informe
en Cuba en 1997 a partir de exudados
traqueales realizados a pollos con síntomas
clínicos similares al SRC (Lobo et al, 1998)
son evidencias que sustentan la participación
de M. pullorum en el SRC de las aves en
Cuba. Para esclarecer este planteamiento se
hace necesario desarrollar una metodología
diagnóstica que incluya, tanto aspectos
serológicos y bioquímicos como moleculares. Por lo que el objetivo de este trabajo fue
determinar la presencia de M. pullorum en
gallinas ponedoras comerciales con síntomas
clínicos respiratorios y caracterizar dichos
aislados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Examen clínico
El examen se realizó mediante la observación
clínica de los animales afectados, estudiando
como parámetro clínico la presencia de
síntomas clínicos de tipo respiratorio,
temperatura y aspecto del plumaje.
Examen anatomopatológico
Se realizó el examen macroscópico teniendo
en cuenta alteraciones en los órganos del
tracto respiratorio, como la presencia de
edema, hemorragias en pulmón y tráquea,
aerosaculitis, acúmulo de exudado y focos
neumónicos. En el examen histopatológico
se tuvo en cuenta la presencia de infiltración
de linfocitos, hiperplasia epitelial y glandular,
decamación epitelial, hemorragia y
congestión, parámetros relacionados con la
presencia de un cuadro respiratorio agudo.
Aislamiento
Se trabajaron un total de ochenta muestras,
procedentes de diferentes granjas de una
región del occidente del país, las mismas
fueron procesadas mediante la siembra de hi-
2002
sopos traqueales en tubos con medio líquido
Frey. El medio utilizado contuvo Mycoplasma
base caldo, 20% de suero equino, 1.5% de
glucosa, suplementado con hidrocloruro de
cisteína, acetato de talium, rojo fenol y penicilina.
Los tubos fueron inoculados e incubados a
370C por espacio de 3 a 4 días, en los tubos
donde se observaron cambios de pH se realizó
un pase a placa con agar (1% w7v) de composición similar excepto el rojo fenol que fue
omitido. Las placas fueron incubadas en
atmósfera de microaerofilia por espacio de 1
a 5 días, observando la aparición de colonias
en el transcurso de este tiempo.
Cepas y antisueros controles
Las cepas utilizadas como controles fueron
las siguientes: Mycoplasma gallisepticum 17/
90; 23/88; 278/89 (aislamiento de campo);
cepas de referencia Mycoplasma pullorum R63
y Mycoplasma gallinaceum R64. Se utilizó
además un anticuerpo monoclonal de M.
gallisepticum A9, antisuero policlonal de M.
gallisepticum R30; antisuero policlonal de M.
pullorum R63, donadas todas por el Laboratorio BgVV de Alemania.
Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas efectuadas se
realizaron de acuerdo con los procedimientos
descritos por Martínez, 1996. Los caracteres
estudiados fueron la sensibilidad a la digitonina, fermentación de la glucosa, hidrólisis
de la arginina, producción de films y spots.
Pruebas serológicas
Se realizó la Inmunofluorescencia directa de
las colonias según lo descrito por Martínez,
1996, y la electroforesis SDS-PAGE y
Westernblot, según los procedimientos
descritos (Veliz, 1997).
Amplificación in vitro por PCR
Para la realización de esta técnica se trabajó
con DNA purificado de los aislados según la
metodología descrita (Chávez et al, 2000). La
reacción se realizó con los cebadores
específicos para M. pullorum M C F
5’GGC TAA CTA TGT GCA GCA GC 3’ 7 y
MCR 5’CCT TAG CGA TTG TCT CCG TG 3’
según lo reportado por Kempf et al, 1993. La
amplificación se llevó a cabo en un volumen
total de 50 uL de la reacción, dntp 2mM,
cebadores específicos, enzima Taq polimerasa
y DNA purificado tanto de los aislamientos
Vol. 26
Aislamiento e identificación de Mycoplasma pullorum
como de los controles positivos. La corrida
se efectuó en Buffer TBE 0.5% a 100V y
50mA. La visualización se realizó en gel de
agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio
en un transluminador de luz ultravioleta (UV),
Pharmacia LKB.Macro Vue.
RESULTADOS
Examen clínico y anatomopatológico
El 75% de los animales estudiados
presentaban un cuadro respiratorio agudo,
caracterizado por descargas nasales y
oculares de tipo serosa y mucopurulentas,
disnea, ruidos traqueales y estornudos,
anorexia, plumaje erizado, disminución
considerable de la puesta de huevo, edema
facial y craneal, esto se corresponde con el
examen anatomopatológico del sistema
respiratorio, realizado a los animales necropsados en los que se observó fundamentalmente opacidad de los sacos aéreos, secreciones serosas y mucopurulentas, hemorragias
petequiales en tráquea, congestión y edema
pulmonar, coincidiendo este cuadro clínico lesional con lo descrito en la literatura para el
Síndrome Crónico Respiratorio (SCR) de las
aves (Kleven, 1998ª).
Características del cultivo
Los aislados en estudio fueron cultivados en
medio Frey, presentaban características
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morfológicas similares, relacionada con la
presencia de colonias en forma de «huevo
frito» entre las 24 y 48 horas de incubados,
coincidiendo esta morfología con lo informado
para el género Mycoplasma (Kleven, 1995)
Caracteres bioquímicos
Frente a las diferentes pruebas bioquímicas
los aislados (3; 7; 24; 35; 41; 45; 55; 65 y
77), mostraron sensibilidad a la digitonina,
utilización de la glucosa, no hidrolizaron la
arginina, presentando actividad de la fosfatasa
y no se observó la presencia de film y sport.
Pruebas serológicas
En la Inmunofluorescencia directa de las colonias realizada a los aislados anteriores se observó la presencia de colonias fluorescentes
frente al conjugado de M. pullorum C/UGA.
Resultando negativas al resto de los conjugados utilizados específicos para otras especies de micoplasmas aviares.
Electroforesis SDS-PAGE:
En el estudio electroforético de las proteínas totales se observó un comportamiento
similar entre los nueve aislados, en correspondencia con las presentadas por la cepa
de referencia de M. pullorum R 63, lo que
hace suponer que se trata de un mismo tipo de cepa que está circulando en la región estudiada.
FIG 1 . Electroforesis SDS-PAGE de los diferentes aislados Línea 1, Patrón de peso molecular;
Línea 2, cepa 17/90 procedente de Alemania; Línea 3, cepa 23/88, procedente de Alemania;
Línea 4, cepa 278/89, procedente de Alemania; Línea 5 a 8, aislados cubanos; Línea 9, cepa
de referencia M. bovis (R9, PG45); Línea 10, cepa de referencia M. pullorum (R63), Línea 11,
Patrón de peso molecular; Línea 12 – 17, aislamiento de campo cubanos; Línea 18, cepa
referencia de M. gallisepticum; Línea 19, asilamiento de campo de M. bovis; Línea 20, cepa de
referencia de M. galinaceum, frente al antisuero policlonal de M. pullorum (anti-R63) de manera
independiente.
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Evelyn Lobo, Yleana Chavéz, J. A. Agüero, Siomara Martínez y otros
Western blot
En el estudio de los diferentes aislados frente
al antisuero policlonal de M.gallisepticum R30
y el anticuerpo monoclonal A9 dirigido contra
un epitope de la proteína de 67 kDa de dicho
microorganismo, no se obtuvo ninguna reacción específica y sí una fuerte señal de las
cepas alemanas de M. gallisepticum, así
como de la cepa de referencia R30, por el
contrario, cuando se analizó el comportamiento
de estos aislados frente al antisuero policlonal
de M. pullorum R63 se observó una fuerte
señal en estos aislados en correspondencia
con la cepa de referencia R63, resultado que
2002
corrobora los obtenidos por inmunofluorescencia
y electroforesis con relación a la identificación
de estos aislados como M. pullorum.
Amplificación in vitro por reacción en
cadena de la polimerasa (PCR)
Con la reacción de PCR con cebadores
específicos para M. pullorum se obtuvo la
amplificación de una banda de 938pb en los
aislados estudiados la cual se corresponde
con la obtenida de la cepa de referencia M.
pullorum R63. Estos resultados se
corresponden con los obtenidos anteriormente
por las diferentes técnicas en relación con la
identificación de las cepas como M. pullorum
FIG 2. Comportamiento de los diferentes aislados frente al antisuero policlonal de M.
pullorum R63. Línea 1, patrón de peso molecular; Línea 2, cepa 17/90; Línea 3, cepa
23/88; Línea 4, cepa 278/89; Línea 5-8, aislados cubanos; Línea 9, cepa de referencia
M. bovis (R9, PG45); Línea 10, cepa de referencia M. pullorum (R63), Línea 11, patrón
de peso molecular; Línea 12 – 17, aislamiento de campo cubanos; Línea 18, cepa
referencia de M. gallisepticum; Línea 19, asilamiento de campo de M. bovis; Línea 20,
cepa de referencia de M. galinaceum, frente al antisuero policlonal de M. pullorum
(anti-R63) de manera independiente
938 pb
FIG 3. Gel de agarosa al 2% que muestra los resultados
del PCR con los cebadores específicos para M.
pullorum,. Linea 1, marcador de peso molecular, 100pb
(BioLabs); Linea 2, control negativo (H2O); Línea del 312 aislados 3, 7, 17, 24, 35, 41, 45, 55, 65 y 77
respectivamente; Línea 13, control positivo (cepa
referencia R30)
Vol.26
Aislamiento e identificación de Mycoplasma pullorum
DISCUSIÓN
Diferentes autores han informado el aislamiento de Mollicutes a partir de las aves. La
primera caracterización de micoplasmas
aviares data de 1905, cuando Dodel describió
el comportamiento de una cepa de micoplasma, responsable de la sinositis en pavos,
frente a las diferentes pruebas bioquímicas.
En 1907, Grahame-Smith también describieron un comportamiento similar de dicho
agente frente a estas pruebas (35). Van Roekel
y Olesiuk mostraron en 1953 que perdices y
faisanes pudieron estar infectados con el
agente del Síndrome Crónico Respiratorio,
presentando síntomas similares a los descritos en pollos. En 1958, Adler y Fabricant
cultivaron un mycoplasma serotipo C no patógeno a partir de perdices.
En 1978, Tiong, informó el aislamiento de
Mycoplasma gallisepticum de codornices
(Coturnix coturnix japonica) que presentaban
sinusitis contagiosa purulenta. Kuksa y
Hanak, 1990 describieron el aislamiento de
diferentes especies (M. gallisepticum, M.
pullorum, M. gallinarum, M. gallopavonis y
diferentes cepas no identificadas) a partir de
faisanes, perdices y pavos salvajes. Kempf
et al, en 1991 aislaron y caracterizaron una
cepa de M. pullorum a partir de faisanes en
producción y Moalic y Kempf, 1997 informaron el aislamiento de dos nuevas cepas
de M. pullorum patógenas para embriones de
pavos.
Los cultivos realizados a partir de muestras
de exudados traquéales realizados a pollos
afectados con el síndrome crónico respiratorio,
permitieron el aislamiento de diez micoplásmicas con características culturales, bioquímicas y serológicas similares a la de M.
pullorum R63. Los nueve aislados, mostraron
sensibilidad a la digitonina, utilización de la
glucosa, no hidrolizaron la arginina, actividad
de la fosfatasa y no se observó la presencia
de films y sport.Los análisis serológicos
efectuados como la inmunofluorescencia, las
colonias, electroforesis y westerngblot
indicaron que las cepas 3; 7;24; 35; 41; 45;
55; 65 y 77 no reaccionaron positivamente
frente a los antisueros de las diferentes
especies de micoplasmas aviares, excepto
frente al antisuero policlonal de M. pullorum
R63, lo que sugiere la identificación de estas
cepas como M. pullorum.
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La cepa de referencia R63 donada por el
BgVV de Alemania, presentaba características
morfológicas similares a la descrita para el
genero Mycoplasmas donde se aprecia un
centro oscuro y denso introducido en el agar
rodeado por una zona más clara que da una
forma similar a «huevo frito», fermentación de
la glucosa comportándose con una disminución del pH del medio de cultivo donde se
observó un cambio de coloración de rojo a
amarillo, no hidrolizó la arginina, siendo no
patógena en embriones y pollos SPF (maestria).
El aislamiento de M. pullorum informado por
(Bencina et al. 1995) a partir de gallinas y
embriones de pollos, sugirió la posibilidad de
la transmisión vertical de este micoplasma.
Moalic y Kempf, 1997 en estudio de patogenicidad de dos nuevas cepas de M. pullorum
realizados en embriones de pollos y pavos
SPF, observaron que estas cepas fueron capaces de provocar la muerte en los embriones
a los 15 y 18 días postinoculación respectivamente (Kempf et al. 1997)
El análisis de proteínas totales de la membrana de micoplasmas utilizado por Kempf,
1991 para diferenciar aislados de M. pullorum
provenientes de faisanes sirvió para la
comparación de los aislados del presente
trabajo que presentaban características
similares a la cepa de referencia de M.
pullorum R63. En la electroforesis SDS-PAGE
en gel de poliacrilamida realizada a estos
aislados se observó la similitud entre los
aislados 3; 7; 24; 35; 41; 45; 55; 65 y 77, lo
que hace suponer que se trata de una misma
cepa que esta circulando en esa región.
Como evidenciaron los resultados de las
pruebas bioquímicas, la inmunofluorescencia,
electroforesis en SDS-PAGE, y el
Westernblot, la identificación de estos
aislados se corresponde con M. pullorum. En
estudios preliminares de patogenicidad
realizados con la cepa 24, se observaron
alteraciones en embriones y en pollos
(Leghorn y Broilers) SPF, lo que indica la
patogenicidad de este aislado.
El PCR como método para la detección de
especies de micoplasmas aviares ha sido
aplicado con una muy alta sensibilidad y
especificidad (Chávez et al. 2000) los
cebadores son diseñados sobrea base de la
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Evelyn Lobo, Yleana Chavéz, J. A. Agüero, Siomara Martínez
secuencia del RNAr 16S para garantizar la
especificidad de la especie (37). En estas
muestras fueron utilizados cebadores específicos para M. pullorum y se obtuvo la amplificación de una banda de 938pb en los aislados estudiados la cual se corresponde con la
obtenida de la cepa de referencia M. pullorum
R63.
CONCLUSIÓN
Las diferentes pruebas realizadas a los aislados permitieron caracterizarlos como cepas
de Mycoplasma pullorum. procedente de
Alemania. Si se tienen en cuenta las pro-
2002
piedades de los micoplasmas como inmunosupresores del sistema inmunológicos (38),
además de su capacidad de provocar infecciones en animales cuando están sometidos
estos a presiones epidemiológicas, y se analizaron los resultados obtenidos por diferentes autores acerca del aislamiento de cepas
de Mycoplasma pullorum a partir de aves enfermas se puede pensar su posible implicación en el Síndrome Crónico Respiratorio como un agente más que en determinadas
circunstancia forma parte activa de este Síndrome y que en determinado momento puede
desencadenar la infección.
Isolation and identification of Mycoplasma
pullorum like strain of new report in Cuba
ABSTRACT. Respiratory Chronic Syndrome (RCS) has reached a great importance
by the economical losses that produces. Their is a complex where the mycoplasms,
more important is M. gallisepticum and M. synoviae are recognized like the of higher
than importance in the participation of the etiopatogenic of this entity. However it
are expounded that it in the cause of the SRC could participate more than a
species of mycoplasm. In the particular case of M.pullorum, it is was isolated by first
time in 1985, characterized since then, as a mycoplasm not pathogenic of the
respiratory tract of the birds and frequent pollutant in cultivations. However, posterior
studies begin to link it as possible pathogen agent. The objective of this work was
determine and characterize the presence of M. pullorum in hen commercial poultry
with respiratory clinical symptoms been located in several geographical zones of
the Island. They for this were worked a total of 80 samples from of sick animals and the
isolated were characterized by serological tests, biochemical and molecular test. It
as result an determined the presence of M.pullorum in the 70% of the total of the
analyzed samples.
Key words: Mycoplasma pullorum, diagnostic, Respiratory Chronic Syndrome
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