Modelo dermoepidermico autologo

Servicios de Cirugía Plástica, Unidad de criobiología banco de tejidos, laboratorio de investigación y de
cirugía experimental , servicio de anatomía patológica del
C.H.U. A Coruña
OBTENCION DE UN MODELO
DERMOEPIDERMICO AUTOLOGO
ARTIFICIAL
Memoria presentada por Don Eduardo Núñez
Orduña, licenciado en medicina por la
Universidad de Valladolid, para optar al
título de máster de medicina cosmética y del
envejecimiento .
1
ABREVIATURAS
3T3: línea alimentadora. Células de ratón albino suizo, European Collection of
Animal Cell Culture 85022108.
D-MEM: Dulbecco’s modified minimal essential Medium.
DMSO: dimetil sulfóxido.
EDTA: ácido etilendiaminotetracético.
EGF: epidermal growth factor.
GAG: glicosaminoglicanos.
HAM-F 12: medio de cultivo.
HE: hematoxilina-eosina.
QC: medio de cultivo de queratinocitos, con EGF.
QN: medio de cultivo de queratinocitos, sin EGF.
SBF: suero bovino fetal.
T/E: tripsina/EDTA (ethylene diaminetetraacetic acid ).
tPA: activador tisular de plasminógeno.
2
1. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………….
4
1.1. Estructura de la piel …………………………………………………………………..
7
1.2. Estado actual de la reparación cutánea ………………………………………….
10
1.3. Cultivo de células cutáneas como cobertura definitiva ………………………
12
1.3.1. Desarrollo histórico del cultivo de células cutáneas ……………
12
1.3.2. Cultivo clásico de queratinocitos ……………………………………
14
1.4. Necesidad de un componente dérmico …………………………………………..
16
2. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS …………………………
19
3. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………………….
20
3.1. Obtención y cultivo primario de células …………………………………
20
3.1.1. Obtención de células a partir de biopsias de piel ………..
20
3.1.2. Cultivo primario y congelación de queratinocitos …………………
21
3.1.3. Cultivo primario y congelación de fibroblastos …………………….
22
3.2. Preparación de piel artificial basada en plasma humano ……………………..
23
3.2.1. Obtención de plasma humano ………………………………………..
23
3.2.2. Medición de fibrinógeno ………………………………………………..
24
3.2.3. Preparación de la dermis artificial basada en plasma
humano.....................................……………………………….
24
3.2.4. Cultivo secundario de queratinocitos sobre la dermis
artificial ………………………………………………………………
25
3.3. Trasplante de la piel artificial ……………………………………………………
26
3.3.1. Preparación de la piel para trasplante ………………………….
26
3.3.2. Trasplante experimental …………………………………………..
27
3.4. Estudio histológico ………………………………………………………………
4. RESULTADOS..................................................................................... ..........
29
31
4.1. Cultivos primarios ...................................................................………
31
4.2. Piel artificial basada en plasma humano ……………………….
33
4.2.1. Dermis basada en plasma humano …………………
33
4.3. Trasplante experimental ................... …………………………..
35
4.4. Estudios histológicos .................................................................
35
5. DISCUSIÓN
4.4.1. Histología preinjerto......................................................
35
4.4.2. Histología tras el trasplante experimental .............................
37
..................................................................................... ..........
42
5.1. Desarrollo del prototipo de piel ...............................................................
6.CONCLUSIONES
7. REFERENCIAS
..................................................................................... ..........
..................................................................................... ..........
3
42
52
53
1. INTRODUCCION
Desde hace muchos años uno de los principales retos de la medicina ha sido
el hecho de poder restaurar o mejorar la función de órganos y tejidos dañados.
La cirugía de trasplantes a partir de órganos y tejidos extraídos de donantes es
parte de esta medicina reparadora. Otra importante , se basa en la posibilidad
de “fabricar” nuevos órganos y tejidos a partir de los restos sanos del tejido
dañado. Ingeniería Tisular es la denominación actual de la tecnología que nos
acerca a ese objetivo, ya que nos permite, a partir de un pequeño fragmento de
tejido, recuperar la funcionalidad global del tejido u órgano dañado. La
ingeniería tisular es la tecnología de la futura medicina reparadora. Conviene
reseñar que la posibilidad actual de la ingeniería tisular es la recuperación de
la función perdida, ya que la formación de órganos y tejidos similares a los
naturales (por ejemplo piel con estructuras glandulares), todavía está dentro
de la ciencia ficción.
En el diseño de un tejido mediante Ingeniería Tisular se tienen que revisar dos
puntos críticos:
1.- Las células que componen este tejido.
2.- La matriz extracelular que envuelve al componente celular.
Las células son el elemento fundamental de un tejido, son la parte viva del
mismo y se encargan de todas las funciones biológicas. Para desarrollar un
tejido mediante técnicas de ingeniería tisular hay que obtener un número
suficiente de células en las mejores condiciones posibles. Dado que
normalmente se parte de pequeños fragmentos de tejido, el número inicial de
células es muy pequeño por lo que resulta necesario un período de expansión
celular. Esto se logra mediante las técnicas de cultivo celular. Hay que tener
presente, que estas técnicas de expansión celular podrían conllevar una
desdiferenciación de las células cultivadas, corriendo el riesgo de no ser
funcionales ni ser fenotípicamente iguales a las extraídas del tejido. Para
evitar este tipo de problemas es necesario el conocimiento de la biología
celular y de los factores de crecimiento y diferenciación de la estirpe celular
que nos ocupe.
4
Se pueden obtener células a partir de un fragmento de tejido adulto, para así
desarrollar un tejido semejante. Es el caso de los cultivos de queratinocitos y
condrocitos,
los
cuales
se
obtienen
a
partir
de
la
piel
y
cartílago
respectivamente. Otra opción consiste en desarrollar cualquier tipo de tejido
partir de células embrionarias pluripotenciales.
Una fuente de células que ofrece nuevas alternativas a la ingeniería tisular,
son las células madre multipotentes presentes en algunos tejidos adultos, las
cuales podrían diferenciarse hacia varias estirpes celulares. Es el caso de las
células de médula ósea o la grasa subcutánea , ya que a partir de ellas
podemos aislar células con capacidad para diferenciarse a hepatocitos ,
células del sistema nervioso , osteocitos, condorcitos, adipocitos , células
musculares , etc. La presencia de células multipotenciales en tejidos adultos,
abre un número de posibilidades ilimitado en el campo de la reparación
tisular.
El segundo punto crítico en el diseño de una estrategia de ingeniería tisular es
la matriz extracelular. Ésta es una estructura que hay que facilitar a las
células para que adopten una disposición tridimensional. Las células han de
ser capaces de crecer en esta matriz y desarrollar sus funciones fisiológicas,
han de degradar la matriz aportada y sintetizar las proteínas que conformen
una matriz extracelular similar a la del tejido natural. Esto se logra
normalmente una vez que el tejido sintetizado in vitro es trasplantado, ya que
en la degradación de la matriz intervienen no sólo las células cultivadas e
introducidas en ella, sino que también lo hace el sistema inmunitario del
receptor.
Existen otros puntos a tener en cuenta en el desarrollo de una estrategia de
ingeniería tisular como son:
ƒ
La condiciones de cultivo a las que se someten los tejidos
ingenierizados durante el período de crecimiento ex vivo. Una vez
que las células expandidas in vitro son integradas en la matriz
extracelular aportada, el conjunto requiere de un período de
maduración. Esto se logra en condiciones que imitan las
5
fisiológicas (37º C, tensión de CO2, humedad, factores de
crecimiento y diferenciación, etc.).
ƒ
La
manejabilidad
quirúrgica
del
prototipo
diseñado.
Para
desarrollar un tejido mediante ingeniería tisular no basta sólo
con “fabricar” un modelo que imite lo más posible al tejido
natural, sino que hay que considerar aspectos tales como su
transporte al quirófano y la facilidad en el manejo del prototipo.
De nada sirve un tejido sintetizado mediante técnicas de
ingeniería
tisular,
si
éste
no
puede
ser
manejado
convenientemente en quirófano para su trasplante, o pierde
viabilidad durante la manipulación y transporte.
La complejidad de estos procesos hace que la Ingeniería Tisular sea un campo
multidisciplinar donde biólogos, químicos, cirujanos, etc., intervengan para
hacer posible el desarrollo de nuevos prototipos de tejidos.
La piel ha sido el primer órgano en ser producido mediante técnicas de
ingeniería tisular. La posibilidad de fabricar in vitro grandes cantidades de piel
a partir de una pequeña muestra del paciente, ha revolucionado parcialmente
las expectativas terapéuticas.
En este trabajo se describe una aproximación a la ingeniería tisular de la piel.
En él se revisan los puntos críticos previamente descritos:
ƒ
La obtención de células a partir de pequeñas biopsias de piel.
ƒ
La expansión de los dos tipos de celulares predominantes en la piel
(fibroblastos y queratinocitos).
ƒ
Los resultados obtenidos mediante el cultivo de células de epitelio
humano, sobre una matriz dérmica basada en plasma y fibroblastos
humanos.
ƒ
El resultado del trasplante experimental de este modelo.
6
1.1
ESTRUCTURA DE LA PIEL
Anatómicamente la piel se divide en tres grandes capas: la epidermis, la
dermis y la hipodermis o tejido celular subcutáneo (Fig. 1).
Fig. 1. Representación cutánea esquemática.
LA EPIDERMIS. La epidermis (Fig. 1-1) es un epitelio plano, estratificado y
queratinizado. Los queratinocitos sufren una permanente evolución
morfológica desde la profundidad hacia la superficie y permite distinguir
cuatro estratos superpuestos:
Estrato basal o germinativo. Los queratinocitos de este estrato reposan sobre
la lámina basal que separa la epidermis de la dermis, a ella se unen mediante
hemidesmosomas.
7
La lámina basal es una lámina de matriz extracelular fina, aunque resistente.
Esta lámina está unida al tejido conectivo subyacente mediante fibras
especializadas de anclaje, formadas por colágeno tipo VII. La lámina basal es
sintetizada por las células a las cuales está asociada, y está constituida en
gran parte por un tipo de colágeno especializado (colágeno tipo IV),
proteoglicanos ricos en heparansulfato y por laminina, la cual proporciona
sitios de unión a las moléculas integrinas de la membrana plasmática de las
células basales epiteliales. La membrana basal no sólo desempeña funciones
estructurales, sino que también determina la polaridad de las células,
influencia el metabolismo celular, organiza las proteínas de membrana de las
células adyacente, induce la diferenciación celular y sirve como sustrato para
la migración de las células.
Estrato espinoso. Los queratinocitos de este estrato se disponen en varias
filas, adoptan forma poliédrica, ligeramente aplanada y paralela a la
superficie. Existen prolongaciones celulares cortas que, mediante desmosomas
, se adhieren a las prolongaciones de los queratinocitos vecinos, lo que hace
que al microscopio óptico parezcan puentes intercelulares.
Estrato
granuloso.
Este
estrato
está
constituido
por
3-5
capas
de
queratinocitos aplanados con el eje longitudinal paralelo a la superficie de la
piel. En el citoplasma aparecen abundantes gránulos de queratohialina.
Estrato córneo. Está formado por un número variable de capas de células
totalmente queratinizadas o células córneas. Estas células están totalmente
aplanadas, su membrana plasmática se vuelve muy densa con modificaciones
de los desmosomas. El núcleo y los orgánulos citoplasmáticos desaparecen
completamente, estando el citoplasma ocupado solamente por los haces de
fibras de queratina.
LA DERMIS. La dermis es una capa de tejido conjuntivo de espesor variable
según las regiones de la piel. Está separada de la epidermis por la lámina
basal. La unión dermoepidérmica habitualmente es muy contorneada,
dibujando las crestas epidérmicas y las papilas dérmicas.
8
En la dermis se distinguen dos capas: la capa papilar, más superficial y
formada por tejido conjuntivo laxo; y la capa reticular, formada por tejido
conjuntivo denso con abundantes fibras elásticas.
Las células que se encuentran con mayor frecuencia en la dermis son
fibroblastos y macrófagos. Además existen abundantes vasos sanguíneos y
linfáticos (Fig. 1-5). En la dermis también abundan nervios y terminaciones
nerviosas (Fig. 1-6). En esta capa se encuentran células musculares (Fig. 1-9)
lisas (areolas, escroto, pene , perineo) y células musculares estriadas (en
particular en la cara). Existen diversos anejos cutáneos derivados de la
epidermis y que penetran en la dermis, tales como folículos pilosos (Fig. 1-4),
glándulas sebáceas (Fig. 1-7) y glándulas sudoríparas (Fig. 1-3). Estas
estructuras epiteliales situadas en la profundidad de la dermis, tienen gran
importancia en el proceso de reparación de las heridas.
LA HIPODERMIS O TEJIDO CELULAR SUBCUTÁNEO (Fig. 1-8). Esta capa
está formada por tejido conjuntivo laxo que, según las condiciones de
nutrición y las regiones de la piel, contiene más o menos tejido adiposo.
Finalmente, es importante reseñar como peculiaridad de la piel, que sólo el
componente epidérmico genera rechazo inmunológico. El componente dérmico
de la piel es una estructura poco celular y en general bien tolerada.
9
1.2. ESTADO ACTUAL DE LA REPARACIÓN CUTÁNEA
Actualmente la piel se considera un órgano muy importante debido a sus
múltiples funciones vitales (la tabla 1.1 resume estas funciones).
Un fallo masivo en este órgano es incompatible con la vida y por ello, cualquier
tipo de lesión debe ser tratada con rapidez. La reparación de las lesiones
cutáneas es una parte importante de la terapéutica médico-quirúrgica. En su
restauración no sólo se busca el restablecimiento general de sus funciones,
sino que además se pretende recuperar sus características estéticas .
Ante una agresión externa, la piel responde con la puesta en marcha de los
mecanismos de reparación que tienden a cerrar la herida producida. Este es
un proceso dinámico en el que intervienen células sanguíneas, mediadores
solubles, matriz extracelular y células del tejido conectivo . Este proceso no
produce una reparación completa, ya que el tejido formado es levemente
distinto al original y el resultado es la producción de una cicatriz.
Tabla 1.1. Funciones de la piel.
ƒ
Contra las fuerzas mecánicas (fricción, estiramiento…)
ƒ
Contra factores químicos (cáusticos, humedad, sequedad…)
ƒ
Contra la radiación (rayos ultravioleta)
ƒ
Contra los cambios de temperatura (el cuerpo humano debe
PROTECTORA
mantener una temperatura constante)
ƒ
Contra los microorganismo (es una barrera física y “un campo de
batalla” inmunológico)
METABÓLICA
NERVIOSA
ƒ
Manifiesta signos y síntomas de enfermedades sistémicas
ƒ
Lugar de síntesis de Vitamina D
ƒ
Lugar de depósito de grasa (combustible de reserva)
ƒ
Vía de eliminación de desechos y fármacos
ƒ
Contribuye al equilibrio hidroelectrolítico
ƒ
Secuestra tóxicos, reduciendo su concentración en sangre
ƒ
Asiento de receptores nerviosos (tacto, temperatura, presión, dolor,
etc.)
PSICOLÓGICA
ƒ
Expresión de emociones
ƒ
Contacto afectivo
ƒ
Autoimagen
ƒ
Cosmética
10
La reparación cutánea es llevada a cabo de diferentes formas: si la herida es
pequeña puede cicatrizar con facilidad desde las células del borde de la
misma. Cuando la herida es más amplia su reparación se lleva a cabo desde
las células epiteliales contenidas en los anejos cutáneos. Si la herida es amplia
y profunda afectando a la totalidad de la dermis, por ejemplo en quemaduras
profundas o grandes extirpaciones, no podrá ser reparada espontáneamente ,
esto es debido a que no existen células ejecutoras de la respuesta
reparadora... queratinocitos y fibroblastos. Estas células son totalmente
eliminadas en las lesiones o extirpaciones quirúrgicas profundas. Si bien los
fibroblastos pueden ser reclutados y llegar al lecho de la herida , esta
propiedad no está descrita para los queratinocitos. Por tanto es imprescindible
aportar estas células a la herida, ya que el cierre definitivo, es decir el
restablecimiento de la función barrera frente al medio externo, sólo se realiza
cuando una capa de células epiteliales autólogas se desarrolla sobre esa
herida.
El epitelio autólogo se trasplanta sobre el lecho de la herida para proporcionar
la cobertura definitiva de la misma. Ésta es la técnica clásica de autoinjertos,
donde se toma piel de una zona sana y de forma directa o tras un sistema de
mallado que permite aumentar su superficie, se coloca en las zonas
lesionadas. Existen casos en los que la extensión del área cruenta es tan
importante que no existe suficiente epitelio autólogo para su cobertura. Es el
caso de los grandes quemados. Este problema hizo que desde hace mucho
tiempo
se
investigase
en
técnicas
que
permitan
conseguir
grandes
proporciones de epitelio autólogo partiendo de una pequeña porción de piel
sana. Esto se consiguió llevar a cabo tras la descripción del cultivo in vitro de
queratinocitos, desarrollado por Rheinwald y Green en 1975.
11
1.3.Cultivo de células cutáneas como cobertura definitiva
1.3.1. Desarrollo histórico del cultivo de células cutáneas
Históricamente el desarrollo de los cultivos celulares de la piel siguió diversos
caminos. Uno de los descubrimientos más importantes fue el de Ljunggren, en
1998 , el cual vio que pequeños fragmentos de piel o explantes, podían
mantenerse viables durante un prolongado período de tiempo en líquido
ascítico y podían ser retrasplantados con éxito a los donantes. El medio
utilizado en estos primeros experimentos consistía simplemente en soluciones
salinas con o sin glucosa, enriquecidas con fluidos biológicos como suero o
líquido ascítico, los cuales parecían ser necesarios para el mantenimiento de
la viabilidad de los fragmentos.
Medawar fue el primero en cultivar con éxito células epiteliales . A partir de
pequeños explantes de epitelio colocados sobre un lecho dérmico, los
queratinocitos podían migrar sobre la dermis de alrededor y cubrir zonas
inicialmente carentes de epitelio. De esta manera el lecho dérmico utilizado
estaba a los pocos días cubierto de epitelio. Además, fue capaz de demostrar
que
los
queratinocitos
cultivados
según
esta
técnica,
podían
ser
retrasplantados al donante original con éxito.
Los cultivos de explantes sirvieron para demostrar que el crecimiento epitelial
a partir de fragmentos de piel, depende en gran medida de la migración de los
queratinocitos, que estas células tienden a formar membranas consistentes o
cadenas
de
células
y
que
el
crecimiento
epidérmico
se
ve
influido
positivamente por la presencia de un sustrato dérmico. Estos experimentos
también demostraron que el crecimiento epitelial está solamente mediado por
las células del estrato basal, mientras que esta capacidad desaparece en las
capas más diferenciadas del epitelio. Desgraciadamente, la técnica de cultivo
de explantes no era capaz de proporcionar la superficie de epitelio necesaria
para atender las necesidades de grandes áreas cruentas. Las técnicas de
explantes no permitían el establecimiento de subcultivos (a partir de las partes
epitelizadas por migración de queratinocitos repetir el experimento para
reepitelizar zonas mucho más extensas). Además, el sobrecrecimiento de los
fibroblastos respecto a los queratinocitos limitaba el período de cultivo , por lo
12
que la utilidad terapéutica de estos cultivos era muy baja y su uso se vio
limitado a la investigación dermatológica .
En 1952, Billingham y Reynolds fueron capaces de demostrar que los
queratinocitos aislados con tripsina mantenían su viabilidad y podían ser
utilizados para cultivo celular. La diferenciación de los queratinocitos, la cual
puede verse por la poliestratificación de los mismos y mediante la aparición de
marcadores de diferenciación epidérmica, hace que sea imposible multiplicar
la población celular mediante sucesivos pases .
Bajo la asunción de que la matriz dérmica es la responsable del prendimiento
permanente de la lámina epitelial, el siguiente paso que se dio fue utilizar piel
de cerdo como soporte para obtener epidermis trasplantable (Freeman AE et
al, 1976). Aunque esta técnica no ha sido muy utilizada, debe ser considerada
como la base de los recientes avances en el campo del desarrollo de dermis
artificiales .
Una mejora en el cultivo de queratinocitos aislados mediante tripsina se llevó
a cabo cuando pudieron cultivar estas células sobre geles de colágeno
(Karasek MA, 1983). Este hecho aumentó considerablemente el pool de
queratinocitos con capacidad proliferativa, los cuales fueron entonces capaces
de alcanzar la confluencia y pudieron ser subcultivados entre dos y tres veces
. Estos resultados fueron entonces modestos, pero dieron lugar a la asunción
de que son necesarios determinados elementos dérmicos para el desarrollo de
los cultivos epiteliales.
Un hecho importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de células
epiteliales fue el descubrimiento de los diversos factores que influyen en el
crecimiento epitelial, en especial el del Factor de Crecimiento Epidérmico
(EGF) .
Finalmente, la búsqueda de un soporte adecuado para el crecimiento de los
queratinocitos, tras probar varios sustratos posibles, dio como resultado la
utilización de fibroblastos de ratón letalmente irradiados, también conocidos
como células 3T3, las cuales demostraron ser beneficiosas para el crecimiento
de los queratinocitos, mientras que al mismo tiempo inhibían el crecimiento de
los fibroblastos. La técnica publicada en 1975 por Rheinwald y Green permitía
13
el cultivo y subcultivo con éxito de queratinocitos, sobre una capa
alimentadora de fibroblastos de ratón letalmente irradiados . El trabajo
pionero de Rheinwald y Green abrió el camino a un posible uso clínico.
Gracias a esto se hizo posible multiplicar queratinocitos hasta un número
clínicamente relevante y utilizarlos con fines terapéuticos. Debido a la
importancia de esta técnica y al hecho de ser utilizada aún en casi todos los
laboratorios de cultivo de queratinocitos, la describiremos a continuación. La
posibilidad de multiplicar rápidamente un gran número de células epiteliales
bajo condiciones de cultivo controladas, con intervalos de multiplicación
menores de 24 horas, ofrece la oportunidad de sintetizar la epidermis
equivalente a toda la superficie corporal en un período de tiempo comprendido
entre tres y cuatro semanas a partir de una pequeña biopsia de piel completa.
1.3.2. CULTIVO CLÁSICO DE QUERATINOCITOS
La técnica descrita por Rheinwald y Green en 1975 (figura 2) consta de las
siguientes fases:
Se parte de una biopsia de piel que contenga epidermis, dermis y tejido celular
subcutáneo, de dimensiones variables (entre 1 y 8 cm2). La biopsia se recoge
en condiciones de esterilidad, se introduce en medio de cultivo a 4ºC y se
envía rápidamente al laboratorio. Una vez recibida la muestra, se elimina el
tejido celular subcutáneo y se fragmenta la biopsia con ayuda de unas tijeras.
Los fragmentos resultantes se digieren enzimáticamente con tripsina/EDTA
(T/E). Las células aisladas mediante T/E se cultivan junto a 3T3 (fibroblastos
de ratón) irradiados a 6000 Rads. Entre el 1% y el 3% de los queratinocitos
formarán pequeñas colonias y por crecimiento excéntrico llenarán poco a poco
la superficie del frasco de cultivo desplazando a los 3T3.
Aproximadamente
a
los
9
días
del
inicio
del
cultivo
primario,
los
queratinocitos son tratados con T/E (es un enzima proteolítico que rompe las
14
uniones proteicas que existen entre las células y la superficie del frasco,
individualizándolos). Los queratinocitos obtenidos son sembrados de nuevo en
presencia de nuevas células 3T3. De este modo, a partir de un solo frasco de
cultivo primario se pueden sembrar entre 20 y 30 frascos de cultivo
secundario, que alcanzarán la confluencia en 10-11 días. Por tanto, después
de 21-24 días del inicio del cultivo, se puede obtener una gran superficie de
piel cultivada partiendo de una pequeña biopsia. Se pueden llegar a conseguir
hasta 10.000 cm2 partiendo de 1 cm2 en un plazo de 3-4 semanas .
Cuando el cultivo secundario es confluente se despega del fondo del frasco,
empleando para ello dispasa II (enzima proteolítico que rompe las uniones
entre las células y el soporte plástico, sin romper las uniones intercelulares).
Para transportar la lámina de queratinocitos hay que fijarla a un soporte
sólido (generalmente una gasa).
Fig. 2. Esquema del cultivo clásico de queratinocitos.
15
1.4.LA NECESIDAD DE UN COMPONENTE DÉRMICO
La contrastada experiencia en la utilización clínica de las láminas de
queratinocitos humanos, ha puesto de manifiesto sus principales limitaciones.
La primera de ellas es que la lámina de tejido que se obtiene es demasiado
fina y frágil, lo que dificulta su manejo y da lugar a pérdidas de superficie
tanto en la preparación de la lámina para el trasplante, como en el transporte
a quirófano e implante de la misma (inicialmente se pierde entre un 20-25%
de la superficie sembrada al fijar la lámina sobre un soporte sólido).
La adhesión de los queratinocitos al frasco de cultivo, hace que sea necesario
un proceso de digestión enzimática para su separación, lo que dificulta la
creación de una membrana basal adecuada una vez injertado el tejido. Los
queratinocitos trasplantados al lecho de la herida deben ser capaces de
generar una nueva membrana basal, semejante a la unión dermoepidérmica
normal y así, cubrir permanentemente esta superficie . Para que los
queratinocitos lleguen a prender, es imprescindible que se genere una fuerte
unión dermoepidérmica. Esta es una estructura compleja en cuya génesis
influyen tanto los queratinocitos trasplantados como los fibroblastos de la
dermis . La síntesis de las proteínas de la membrana basal (laminina y
colágeno IV) corresponde a los queratinocitos , pero el otro componente de la
membrana basal, las fibrillas de anclaje (colágeno tipo VII), no se sintetizan en
ausencia de los fibroblastos de la dermis. Las relaciones entre las células
epiteliales y su soporte conjuntivo son esenciales para alcanzar el desarrollo
normal del tejido. Por tanto, la falta de estructura dérmica parece ser una de
las grandes limitaciones. El resultado final es la pérdida tardía de regiones
epitelizadas mediante este tipo de cultivos y la formación de lesiones
ampollosas de muy difícil corrección .
La fragilidad de las láminas las hace muy sensibles a los pequeños
traumatismos que inevitablemente sufre un paciente quemado . El estrés
mecánico tiene que ser evitado en las zonas injertadas. Aunque no hay
ninguna parte del cuerpo predominante que haya sido injertada con estos
cultivos de epitelio con éxito, estas láminas no son adecuadas para superficies
16
posteriores, cara, manos o articulaciones, ya que son zonas que soportan
mucho estrés mecánico.
Las láminas de queratinocitos cultivados son muy susceptibles tanto a la
infección de los lechos, como al uso de antisépticos tópicos . La infección de
la herida es la principal causa de fallo de los injertos. En los primeros días
tras el trasplante, el frágil epitelio no queratinizado y la débil unión
dermoepidérmica de estas láminas cultivadas, hacen que sean mucho más
susceptibles
de
sufrir
contaminación
bacteriana
que
los
autoinjertos
convencionales.
Otro de los inconvenientes son los pobres resultados clínicos que se obtienen
tras su trasplante . Incluso diversos estudios manifiestan la incapacidad de
las láminas de queratinocitos cultivados para reducir, no sólo la mortalidad de
los pacientes tratados, sino también la estancia hospitalaria de los mismos
(Munster AM et, al 1990; Rue LW et al, 1993).
Para evitar la fragilidad de las láminas, la ausencia de componente dérmico
(2,5) y mejorar los primeros resultados obtenidos mediante el cultivo de
queratinocitos, se han seguido tres vías diferentes (2,3):
1.- Continuar con el empleo del cultivo de queratinocitos, asociado al
trasplante previo de un componente dérmico, por ejemplo aloinjertos de
cadáver o imitadores dérmicos(6,7,8) .
2.- Cultivar los queratinocitos sobre un soporte.
3.- Cultivar los queratinocitos sobre una dermis artificial o equivalente
dérmico.
1).- Respecto al primer punto, la asociación sistemática de aloinjertos de
cadáver (Cuono C et al, 1986; Hickerson WL et al, 1994) o imitadores dérmicos
(Hansbrough FJ et al, 1998; Hansen SL et al, 2001), con cultivo de
queratinocitos, mejoró el índice de prendimiento y redujo las complicaciones a
largo plazo de los cultivos. Aunque los problemas inherentes a la técnica de
cultivo siguieron persistiendo (pérdida de superficie durante la preparación de
las láminas, daño causado por la dispasa a las proteínas de la membrana
basal, etc.).
17
Los otros dos puntos fueron objeto de posteriores desarrollos y aún hoy en día
siguen apareciendo nuevos modelos tanto de soportes de cultivo como de
dermis artificiales.
2).- La segunda vía que se utiliza, soportes sobre los que cultivar los
queratinocitos consiste en asociar el cultivo de la lámina de queratinocitos a
una base que le confiera solidez y facilite el transporte y el trasplante. Algunos
de los soportes empleados son:
ƒ
Colágeno (Horiguchi Y et al, 1994)
ƒ
Colágeno asociado a glicosaminoglicanos (GAG) (Yanas IV et al,
1982; Boyce ST et al, 1988-A; Boyce ST et al, 1988-B; Buttler CE et
al, 1999). Integra® (Kremer M et al, 2000).
ƒ
Dermis acelular humana (Lam PK et al, 2000; Herson MR et al,
2001) o su versión comercial: Alloderm® (Izumi K et al, 1999).
ƒ
Dermis acelular de cerdo (Matouskova E et al, 1997).
ƒ
Gel de fibrina (Ronfard V et al, 1991; Pellegrini G et al, 1999).
ƒ
Membranas derivadas del ácido hialurónico, como Laserkin® (FIDIS
advanced Biopolymer, Italy) (Lobmann R et al, 2003).
3).-
La tercera vía utilizada para solventar los problemas de cultivo clásico
de queratinocitos (cultivo de queratinocitos sobre una dermis artificial o
equivalente dérmico) consiste en obtener como producto final una estructura
que contiene los dos componentes de la piel (dermis y epidermis) (1), por lo
que se le puede denominar PIEL ARTIFICIAL COMPLETA. Se trata de cultivar
conjuntamente la lámina de queratinocitos sobre una superficie que imite y
funcione como una auténtica dermis humana. Entre los diversos modelos
descritos se encuentran:
ƒ
Gel de colágeno + fibroblastos humanos (Otto WR et al, 1995).
ƒ
Gel de colágeno y GAG + fibroblastos humanos (Cooper ML et al,
1993).
ƒ
Dermagraft® (Rennekampff HO et al, 1996).
ƒ
Gel de fibrina + fibroblastos humanos (Meana A et al, 1998; Camblor
L et al, 2003; Camblor LA et al, 2003; Llames S et al, 2004).
18
2. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
El desarrollo de un programa de Ingeniería Tisular está justificado, ya que
puede proporcionar alternativas terapéuticas que reduzcan la morbilidad de
un gran número de pacientes. Partimos de una experiencia y de un modelo
previamente desarrollado que ha demostrado grandes ventajas sobre otros
modelos de piel artificial previamente descritos.
La fibrina es una de las mejores fuentes de matriz extracelular en el desarrollo
de una piel ingenierizada. Sin embargo, el uso de crioprecipitados planea
ciertos inconvenientes que han sido comentados anteriormente. El plasma
obtenido por un simple fraccionamiento de la sangre total, es un producto
más barato y seguro que la fibrina de crioprecipitados, por lo que nos
planteamos la hipótesis que el plasma pueda ser una fuente alternativa de
fibrina, que resuelva los problemas que plantea el uso de crioprecipitados en
la terapéutica.
El objetivo general de este trabajo fue desarrollar un modelo de piel artificial
basado en plasma humano como fuente de matriz dérmica, que permita
implantar un programa clínico de Ingeniería Tisular de la piel. Para ello se
siguieron estos puntos:
1.- Valorar como fuente de fibrina el uso del derivado más sencillo, el
plasma humano obtenido mediante simple fraccionamiento primario de
la sangre.
2.- Estudiar la posible sustitución de todas las proteínas exógenas
utilizadas en el modelo de piel artificial previamente descrito.
3.- Optimizar el método de procesamiento de la biopsia, con el fin de
obtener el mayor número de células posible y reducir el período entre la
toma de la biopsia y el trasplante de la piel producida mediante
Ingeniería Tisular.
4.- Analizar el comportamiento del nuevo modelo de piel artificial en un
modelo de trasplante experimental, como paso previo a su utilización en
la clínica.
19
MATERIAL Y METODOS
3.1 OBTENCIÓN Y CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS
3.1.1. OBTENCIÓN DE CÉLULAS A PARTIR DE BIOPSIAS
DE PIEL
El objetivo es disponer del máximo número de células recogidas en las mejores
condiciones posibles. Se utiliza para la técnica un fragmento de piel de
dimensiones variables (entre 1 y 8 cm2) que contenga epidermis, dermis y
tejido celular subcutáneo, recogido de forma estéril.
Es conveniente, previo a la toma de la muestra, la desinfección de la piel con
antisépticos. Una vez obtenida se recomienda limpiar bien las muestras con
suero fisiológico para eliminar todo resto de antiséptico que podría interferir el
posterior cultivo de las células.
Esta biopsia de piel se recoge en medio de cultivo estéril (MEM, DMEM, RPMI)
o incluso para muy cortos períodos de tiempo es válido el suero fisiológico.
El medio, preferentemente, debe estar complementado con antibióticos
(penicilina, estreptomicina +/- anfotericina B), a la dosis estándar empleada
en
los
cultivos
celulares
(100
U/ml.
de
penicilina,
100
μg/ml
de
estreptomicina).
La biopsia deberá ser trasladada cuanto antes a una temperatura aproximada
de 4ºC al laboratorio. Un buen sistema es un contenedor isotermo con hielo.
La biopsia se envía en un recipiente estéril herméticamente cerrado, envuelta
en gasas y dentro de un segundo recipiente (tipo duquesa de plástico) rodeado
de hielo.
- Una vez recibida la biopsia se retira del medio de transporte, se introduce 23 segundos en alcohol 70º estéril (opcional) y posteriormente se coloca en una
placa de Petri y se lava la muestra con T/E estéril.
Con la ayuda de tijeras se elimina el tejido graso subcutáneo hasta dejar expuesta la
capa de dermis y la epidermis. Se lava nuevamente la biopsia con T/E y se pasa a una
nueva placa de Petri. Se cubre con T/E y se trocea con las tijeras estériles hasta obtener
pequeños fragmentos de piel. Con la ayuda de una pipeta, previamente empapada en
T/E, se pasa la piel a un frasco con agitador magnético (previamente esterilizado).Se
añaden unos 25-50 ml. de T/E al frasco y se incuba a 37ºC, en agitación constante
20
durante 30 min. Posteriormente se agita la piel con la ayuda de una pipeta previamente
empapada en T/E, se dejan decantar los fragmentos . Con cuidado, se recoge la tripsina
y se pasa a un cónico de 50 ml. Añadimos T/E fresca al frasco agitador que contiene
todos los fragmentos de piel y la muestra se incuba nuevamente durante 30 minutos a
37ºC. La T/E recogida se neutraliza con igual cantidad de medio de cultivo de
queratinocitos (sin EGF, QN) y se centrifuga durante 10 minutos a 1400 r.p.m. El pellet
obtenido se disuelve en 2-3 ml de medio de QN y se cuentan las células obtenidas en
cada incubación. El procedimiento de recogida de la T/E se repite hasta que no se
obtengan células de la biopsia. Cuando ya no se obtengan más células, la tripsina se
retira completamente y los restos de la biopsia se introducen en solución de colagenasa
tipo I (Sigma) 2 mg/ml disueltos en DMEM (aproximadamente 25-50 ml de solución).
La colagenasa se coloca en el baño con agitación a 37ºC hasta la completa disolución de
los restos (entre 6 y 12 horas). Al finalizar la incubación la colagenasa se filtra a través
de un filtro de células de 60 micras (Falcon ,Beckton-Dikinson, San Jose, CA), se
centrifuga y se retira el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 2-3 ml de medio
de cultivo para fibroblastos y se contaron las células obtenidas.
3.1.2 CULTIVO PRIMARIO Y CONGELACIÓN DE QUERATINOCITOS
Para el cultivo primario de queratinocitos se sembró un frasco de 75 cm2 de
superficie por cada 2 x 106 células obtenidas tras la digestión de la biopsia con
T/E, en presencia de 8 x 106 células 3T3 irradiadas. Como medio de cultivo se
utilizó DMEM y Ham-F 12 (Biochrom AG), en una proporción 3:1,
suplementado con 10% de SBF (Life Technologies), insulina (5 μg/ml, Sigma),
hidrocortisona (0.4 μg/ml, Sigma), triiodotironina (1.3 ng/ml, Sigma) y
adenina (24 μg/ml, Sigma). A este medio lo denominamos QN.
El medio se cambió cada tres días y al final del primer cambio se le añadió al
medio de cultivo factor de crecimiento epidérmico (EGF 10 ng/ml, Austral
Biologicals). Este medio se denominó QC (medio QN suplementado con EGF).
Cuando los cultivos fueron confluentes se procedió a congelar las células, para
ello los queratinocitos se trataron durante media hora aproximadamente con
T/E para despegarlos de la superficie del frasco de cultivo. Se neutralizó la
21
tripsina con igual cantidad de medio de cultivo suplementado con un 10% de
SBF y se centrifugaron las células a 1400 r.p.m. durante 10 minutos. Tras
esto las células se mantuvieron sobre hielo y se resuspendieron en medio de
congelación para queratinocitos (10% glicerol, 15% SBF y 75% D-MEM). Se
mantuvieron a – 60ºC durante 24 horas, transcurrido ese tiempo se pasaron
al tanque de nitrógeno líquido.
Generalmente, los queratinocitos fueron congelados a una densidad 1/10,
esto significa que con un frasco de cultivo celular de 75 cm2 se preparan 10
crioviales para congelar. Cada uno de estos crioviales servirá más adelante
para sembrar un frasco de cultivo de 75 cm2.
3.1.3 CULTIVO PRIMARIO Y CONGELACIÓN DE FIBROBLASTOS.
Para el cultivo primario de fibroblastos se sembraron 7 x 106 células obtenidas
tras el procesamiento de la biopsia con colagenasa, en un frasco de cultivo
celular de 75 cm2, en ausencia de 3T3 irradiados, utilizando como medio de
cultivo DMEM suplementado con un 10% de SBF. Las células se siembran en
una concentración aproximada de 100.000 células/cm2 .Los cultivos se
mantuvieron en un incubador a 37ºC con un 5% de CO2.
Cuando en el frasco de cultivo comienzan a crecer abundantes células de
aspecto fibroblástico, el frasco se lava dos veces con T/E y se incuba entre 2 y
5 minutos con T/E a 37ºC. Se recogen las células obtenidas y se neutralizan
añadiendo la misma cantidad de medio de cultivo que de T/E. Se centrifugan
10 minutos a 1400 r.p.m y se siembran las células en una superficie entre dos
y tres veces mayor que la inicial.
Cuando se considera que hay un número suficiente de fibroblastos para
montar la superficie necesaria para el trasplante, los fibroblastos son
nuevamente tripsinizados, se cuentan y se resuspenden en 10 ml del mismo
medio hasta su utilización.
En algunos casos los fibroblastos fueron congelados para ser utilizados
posteriormente. El método de congelación es similar al utilizado en
queratinocitos. El medio de congelación para fibroblastos fue: 10% DMSO,
10% SBF, y 80% D-MEM, utilizando dos crioviales por cada frasco de 75 cm2
confluente.
22
Fig. 3. Cultivos Primarios.
3.2 PREPARACIÓN DE PIEL ARTIFICIAL BASADA EN PLASMA
HUMANO
3.2.1 OBTENCIÓN DEL PLASMA HUMANO
El plasma fresco se obtiene a partir del fraccionamiento primario de sangre
completa
de
donantes
del
Banco
de
Sangre,
según
las
normas
y
recomendaciones de la Asociación Americana de Bancos de Sangre (American
Asociation of Blood Banks, 1990).
Las extracciones se realizaron usando bolsas de sangre de 450 ml de
capacidad, conteniendo una solución anticoagulante (citrato sódico). Una vez
extraída, la sangre total se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 10 minutos.
Terminada la centrifugación se separó el plasma resultante mediante el
fraccionamiento normal de la bolsa de sangre.
23
3.2.2 MEDICIÓN DE FIBRINÓGENO
La concentración de fibrinógeno presente en el plasma fue medida mediante
coagulómetro, Multifibrén® (Dade-Behring).
3.2.3 PREPARACIÓN DE LA DERMIS ARTIFICIAL BASADA EN
PLASMA HUMANO.
Un gel de plasma para un frasco de cultivo celular de 75 cm2 se prepara con:
5-12 ml de plasma (20-25 mg de fibrinógeno por lámina); entre 800-1200
fibroblastos/cm2; CaCl
2
(2 ml al 1% en suero fisiológico); Acido tranexamico
(Amchafibrin® 200 μl) y se completa con suero fisiológico hasta un volumen
total de 25 ml. Se deja en la estufa a 37ºC hasta que el gel quede
completamente solidificado (entre 30 y 60 minutos). Se cubre con 10-20 ml de
QN y se espera un mínimo de 2 horas antes de sembrar los queratinocitos en
su superficie (habitualmente se deja hasta el día siguiente).
Fig. 4. Fibroblastos en la matriz de plasma.
24
3.2.4 CULTIVO SECUNDARIO DE QUERATINOCITOS SOBRE LA
DERMIS ARTIFICIAL.
Los viales de queratinocitos se descongelaron en el baño a 37ºC, las células se
resuspendieron en un volumen apropiado de QN y se sembraron sobre los
geles de fibrina y fibroblastos. Esta fase del cultivo secundario se realizó 24 h
después de haber preparado los geles.
Los queratinocitos obtenidos a partir de un cultivo primario se siembran sobre
los geles de plasma y fibroblastos para obtener la superficie de cultivo
deseada; normalmente se siembran con una densidad 1/10-1/35, es decir,
con un frasco de cultivo primario se siembran 10 frascos de cultivo
secundario. Como norma general no es conveniente realizar expansiones
superiores a 1/35. El medio de cultivo empleado es similar al utilizado en los
cultivos primarios de queratinocitos. El seguimiento del cultivo se realiza
mediante el microscopio invertido.
Fig. 5. Colonia de queratinocitos sobre la dermis basada en plasma
humano.
25
Fig. 6. Resumen del procedimiento empleado.
3.3. TRASPLANTE DE LA PIEL ARTIFICIAL
3.3.1 PREPARACIÓN DE LA PIEL PARA EL TRASPLANTE
Cuando
los
queratinocitos
sembrados
sobre
la
dermis
alcanzaron
la
confluencia, entre 10 y 12 días, se preparó la lámina para el trasplante. Este
proceso consta de las siguientes etapas:
Se retiró el último medio de cultivo empleado y se abrió el frasco de cultivo,
con ayuda de un alambre al rojo que fundía el plástico. A continuación, el gel
se cubrió con un tul estéril de forma que éste ocupara toda la superficie del gel
(figura 7).
Una vez efectuada esta operación, el tul se fijó a la superficie superior del gel,
en la cual están los queratinocitos, mediante el empleo de un pegamento
inorgánico
(Cyanocrylato,
Histoacryl®,
Braun
u
otro
de
similares
características). El cyanoacrylato se empleó aplicando pequeñas gotas del
mismo a los bordes del gel. Una vez seco el pegamento se procedió a despegar
el gel del frasco de cultivo.
26
A continuación se levanta con cuidado la lámina unida al tul. Tras despegarla
se cubrió con medio de cultivo para facilitar su manipulación, se enrolló sobre
sí misma y se introdujo en un tubo cónico conteniendo medio de cultivo para
su transporte (figura 7).
Fig. 7.
3.3.2 TRASPLANTE EXPERIMENTAL
Los trasplantes experimentales (13) fueron llevados a cabo en condiciones de
esterilidad, usando para ello 12 ratones macho inmunodeprimidos BALCnude.
Los ratones fueron mantenidos en condiciones libres de patógenos
durante veintiún días.
Las láminas de piel artificial fueron trasplantadas en el dorso del animal como
se describe a continuación:
Se desinfectó la zona a trasplantar con betadine®. A continuación realizamos
una escisión con bisturí de una superficie de 1,5 cm2 de la piel murina dorsal.
La piel del ratón se congeló y descongeló tres veces en PBS estéril con el fin de
desvitalizarla. En lugar de la piel del ratón se colocó la piel cultivada, retirando
el tul que servía para el montaje (figura 8).La piel desvitalizada se colocó
encima de la zona injertada para proteger el injerto, suturándose con Prolene®
7/0 a los bordes de la herida (figura 8).
A los 21 días se sacrifica el animal y se hacen estudios histológicos
(hematoxilina-eosina y tricromico de Masson ) e inmunohistoquímicos.
27
28
Fig. 8.
3.4 ESTUDIOS HISTOLÓGICOS
Se realizaron estudios histológicos de las siguientes muestras:
ƒ
Piel cultivada tras su procesamiento para trasplante.
ƒ
Piel regenerada ( a los 21 días), tras el trasplante a ratón atímico.
29
Las muestras fueron fijadas en formaldehído al 10% e incluidas en parafina.
Tras la desparafinización de las muestras se procedió a la tinción convencional
o a los estudios inmunohistoquímicos mediante la aplicación de la técnica de
la inmunoperoxidasa.
Para el estudio de la histología convencional de las muestras de piel, se
utilizaron
técnicas
convencionales
de
tinción:
hematoxilina-eosina
y
tricrómico de Masson.
Para el estudio inmunohistoquímico se analizaron diversas proteínas de
interés, para el estudio de la maduración y diferenciación de la piel. Los
anticuerpos empleados y las diluciones utilizadas se pueden ver en la tabla 1.
Los estudios realizados con anticuerpos antiqueratina 5 se revelaron mediante
técnicas de fluorescencia usando como marcadores los fluorocromos Texas
Red y FITC.
ANTICUERPO
CLON
DILUCIÓN
MARCAJE
S100
4C4.9
Vimentina
(BioGenex)
V9
1:50
Fibroblastos
dérmicos
Keratina 5 (BabCo)
AF138
1:600
Epitelio basal
Citokeratina
AE1/AE3
(Chemicon
AE1/AE3
1:100
Queratinas
epidérmicas
Melanocitos
Tabla 1. anticuerpos utilizados para el estudio inmunohistoquímico.
30
4.RESULTADOS
4.1. CULTIVOS PRIMARIOS
Con las biopsias procesadas para realizar la parte experimental de nuestro
trabajo obtuvimos células que fueron capaces, a los 3-4 días de iniciado el
cultivo primario, de generar colonias típicamente epiteliales entre la capa de
células alimentadoras 3T3 irradiadas . Conforme avanzaba el tiempo de cultivo
se apreciaba cómo las colonias de queratinocitos iban creciendo y desplazando
a las células 3T3 irradiadas de la superficie del frasco de cultivo.
Los queratinocitos alcanzaron la confluencia entre el 10º y el 12º día de
cultivo, momento en el que no se apreciaban 3T3.
Fig.9. Confluencia completa de queratinocitos humanos en monocapa
(100x)
31
Durante los primeros días de cultivo primario de fibroblastos, pudieron
observarse numerosas células de aspecto epitelial (flecha en figura 10). Tras el
pase que se les dio a los 5-6 días de iniciarse el cultivo, las células de aspecto
fibroblástico comenzaron a crecer hasta representar la mayoría de la población
celular. Tras 9-12 días de iniciarse el cultivo primario de fibroblastos, éstos
estuvieron listos para su uso en la dermis artificial.
Fig. 10. Fibroblastos
Fig. 11. Fibroblastos.
32
4.2 PIEL ARTIFICIAL BASADA EN PLASMA HUMANO
4.2.1 DERMIS BASADA EN PLASMA HUMANO.
Los geles realizados a partir de plasma solidificaron y no sufrieron roturas
durante el período de cultivo. Los frascos de cultivo que contenían el prototipo
se pudieron manejar y realizar los cambios de medios necesarios para el
crecimiento celular.
Los fibroblastos sembrados en el interior del gel de plasma fueron capaces de
adherirse a las proteínas de esta matriz artificial, observándose a las pocas
horas la emisión de prolongaciones en su membrana y la adquisición de su
morfología típica. Durante el seguimiento del cultivo se pudo observar al
microscopio invertido el aumento progresivo del número de fibroblastos
presentes en la dermis (figura 12).
Fig. 12. Fibroblastos en la matriz de plasma.
33
Los queratinocitos sembrados a la densidad habitual (1/10) sobre el gel de
plasma (figura 13) formaban colonias y alcanzaban la confluencia al cabo de
10 ó 12 días de cultivo. En los casos en que se ensayó expansión superior
(densidad de cultivo: 1/20, 1/30 y 1/60) la confluencia se alcanzó entre 15 y
18 días como máximo.
Fig. 13. Colonia de queratinocitos sobre la dermis basada en plasma
humano.
El tiempo aproximado para obtener el prototipo de piel artificial completa
osciló entre 24 y 30 días. Este período comprende desde la recepción y el
procesamiento de la biopsia hasta la confluencia del cultivo de queratinocitos
sobre la dermis de plasma y fibroblastos y su preparación para el trasplante.
En ninguno de los cultivos realizados sobre gel de plasma se pudo apreciar
retracción significativa del tejido, de tal manera que la superficie inicialmente
cultivada era la obtenida como piel artificial completa.
34
4.3 TRASPLANTE EXPERIMENTAL
Todos los injertos realizados a ratón prendieron en el lecho de la herida. En los
primeros 15 días tras el injerto, la piel de ratón desvitalizada, utilizada como
cobertura, se desprendió, dejando visible la piel humana injertada. Los
injertos mostraban finas arrugas y señales clínicas de hiperqueratosis,
características típicas de la piel humana. El origen humano de los
queratinocitos de las zonas injertadas se confirmó posteriormente mediante el
análisis histológico. Aunque existía una ligera retracción en la zona de la
cicatriz, la piel humana regenerada en el dorso del ratón atímico era de
consistencia similar a la del ratón y no estaba adherida a planos profundos, se
podía elevar y mover la fascia dorsal.
4.4. ESTUDIOS HISTOLÓGICOS
4.4.1 HISTOLOGÍA PREINJERTO
Previo al trasplante, mediante la tinción convencional con hematoxilina-eosina
se pudo observar la existencia de una capa continúa de células epiteliales,
unida firmemente al tejido subyacente (figura 14).
Fig. 14. Estudio histológico de láminas de piel cultivada previo al injerto,
teñidas con hematoxilina-eosina . En muchas zonas características
fibroblásticas. En otras zonas se puede diferenciar perfectamente la
formación de un epitelio claramente estratificado.
35
Los estudios inmunohistoquímicos preinjerto mostraron la presencia de una
delgada lámina de matriz, poblada de células vimentin positivas (flechas en
figura 15). Los filamentos de vimentina son los filamentos intermedios más
abundantes de las células de origen mesenquimal, tales como los fibroblastos
dérmicos. Sobre esta lámina se observaba una capa de células epiteliales
mono o biestratificadas que reaccionaron con los anticuerpos antiqueratinas
AE1/AE3.El anticuerpo AE1 reconoce la mayor parte de las citoqueratinas de
la subfamilia ácida; el anticuerpo AE3 reconoce a todos los miembros de la
subfamilia básica. Al igual que los filamentos de viementina, los filamentos de
queratina tienen la función de conferir apoyo mecánico a las células.
Fig. 15. Estudios inmunohistoquímicos
36
4.4.1 HISTOLOGÍA TRAS EL TRASPLANTE EXPERIMENTAL.
Tras el injerto a ratón atimico , los geles de piel artificial humana fueron
capaces de restaurar el fenotipo epidérmico, incluyendo la síntesis de
proteínas estructurales ( citoqueratinas).
La arquitectura del tejido , veintiún días después del trasplante experimental
era semejante a la epidermis humana.
La tinción con Hematoxilina de Verhoeff ( Fig. 18), puso de manifiesto la
ausencia de fibras elásticas tanto en la dermis murina como en la cultivada.
Con Masson Modificado ( Fig. 23), se puso de relieve las fibras de colágeno de
la dermis del ratón y de nuestro modelo humano , así como el echo de
presentar este ultimo una incipiente neoangiogenesis dérmica.
La
inmunodeteccion
de
proteínas
humanas
en
las
zonas
injertadas
(Vimentina) revelo la barrera entre el tejido humano injertado y el de ratón
demostrando la persistencia tanto de células epiteliales como de fibroblastos
humanos en la piel regenerada ( Fig. 22) . Estos últimos presentaron una
disposición de tendencia lineal a nivel de la unión dermoepidermica.
El estudio inmunohistoquimico de las citoqueratinas epiteliales mostró una
capa de células cuboidales que se marcaban con el anticuerpo antiqueratina
k5 ( Fig. 21) .A partir de dicho estrato las células mostraban una tendencia
progresiva a adquirir formas aplanadas y a reproducir la morfología normal del
epitelio humano. Los anticuerpos anticitoqueratina AE1 –AE3 tiñeron la
epidermis del ratón de manera menos intensa que la humana. ( Figs. 16 y 19)
Un hallazgo no previsto al utilizar los anticuerpos S-100 fue la aparición de
melanocitos en la capa basal de nuestro modelo de piel artificial injertado( Fig.
20).
Fig. 16. Tinción con anticuerpos anticitoqueratina AE1 –AE3, interfase
entre piel murina y humana.
37
Fig. 17. Tinción con Hematoxilina – Eosina
Fig. 18. Tinción con Hematoxilina de Verhoeff
38
Fig. 19. Tinción con anticuerpos anticitoqueratina AE1 –AE3
Fig. 20. Tinción con anticuerpos S-100
39
Fig. 21. Tinción con anticuerpos antiqueratina 5
Fig. 22. Tinción con anticuerpos antivimentina
40
Fig. 23. Tinción con Masson Modificado
Fig. 24.
41
5. DISCUSIÓN
5.1 DESARROLLO DEL PROTOTIPO DE PIEL ARTIFICIAL
Ante una lesión epitelial o extirpación quirúrgica, la única forma de lograr el
cierre definitivo de las heridas es mediante la aportación de epitelio autólogo.
Esta aportación puede realizarse mediante dos técnicas: autoinjertos y
cultivos celulares.
Los autoinjertos son la mejor cobertura definitiva que existe, siempre y cuando
existan suficientes zonas donantes, pues en pacientes con más del 30-40% de
la superficie corporal dañada la toma de autoinjertos implica la creación de
nuevas heridas que amplían la superficie de piel total dañada y pueden
provocar un aumento en la tasa de mortalidad. Los autoinjertos pueden
utilizarse de forma laminar o mallados. Los laminares tienen un mejor
resultado estético, aunque sí son muy gruesos pueden tener dificultades para
prender en el lecho de la herida y presentan hematomas con más frecuencia.
Los autoinjertos mallados tienen la ventaja de poder cubrir mayor superficie y
presentar pocos hematomas al permitir el drenaje, pero el principal
inconveniente que tienen es el hecho de no funcionar como barrera hasta que
no se produzca la epitelización de los orificios que deja malla y el peor
resultado estético al sufrir mayores retracciones.
Con la descripción del cultivo in vitro de queratinocitos en 1975 (Rheinwald JG
et al, 1975), se puso de manifiesto la posibilidad de conseguir grandes
proporciones de epitelio autólogo partiendo de una mínima biopsia de piel
sana. En un período de tiempo comprendido entre tres y cuatro semanas se
puede obtener la cantidad de epitelio cultivado equivalente a toda la superficie
corporal. El cultivo clásico de queratinocitos representó un avance muy
importante en el desarrollo de la ingeniería tisular de la piel.
Uno de los inconvenientes que tiene este método es la utilización de
fibroblastos
de
ratón
letalmente
irradiados
como
soporte
para
la
proliferación y diferenciación de las células epiteliales. Los fibroblastos 3T3 a
través de modificaciones que introducen en el medio de cultivo, favorecen el
desarrollo de los queratinocitos en cultivo de una forma parecida a su
42
desarrollo in vivo. Este método de cultivo está ampliamente aceptado en la
bibliografía, difundiéndose su uso incluso en la práctica clínica (Gallico G et
al, 1984; López Gutiérrez JC et al, 1995), pero aún hay algunos equipos (Lauer
G, 1994; Labsky J et al, 2003) que intentan obtener sistemas alternativos que
no impliquen el uso de células heterólogas cuya genética ha sido alterada, por
la posibilidad de que estas alteraciones interfieran en el control de la
replicación celular de los queratinocitos. La amplia experiencia que en este
momento existe con este tipo de cultivos descarta esta posibilidad, puesto que
no se recoge ninguna referencia a este tipo de alteraciones. En el momento en
que los queratinocitos forman una capa continua y están listos para
subcultivar, ya no existen fibroblastos. Por otra parte, los estudios realizados
con otros sistemas de cultivo, en ausencia de 3T3 irradiadas, demuestran que
no es posible obtener una adecuada formación de colonias y la diferenciación
de los queratinocitos obtenidos es menor que con células cebadoras.
Por otro lado, la experiencia en el trasplante de las láminas de queratinocitos
cultivados ha puesto de manifiesto las limitaciones que presenta este tejido
para su utilización clínica:
ƒ
En primer lugar el tejido así obtenido es muy frágil y por tanto
difícil de manipular sin que se produzcan roturas.
ƒ
La
utilización
de
dispasa
para
separar
la
lámina
de
queratinocitos de la superficie del frasco de cultivo, provoca la
alteración de las proteínas de la membrana basal, lo que
conlleva una pobre tasa de prendimiento de los injertos.
ƒ
A medio plazo, tras ser utilizado como injerto, se observa la
formación de extensas ampollas ante traumatismo mínimos,
debido a una reconstitución anormal de las fibrillas de anclaje
ƒ
Otro inconveniente es el pobre resultado clínico que se
obtiene tras su trasplante. En los primeros días tras el
trasplante
son
contaminación
mucho
bacteriana
más
que
susceptibles
los
de
autoinjertos.
sufrir
Incluso
diversos estudios manifiestan la incapacidad de las láminas
de
queratinocitos
cultivados
para
reducir,
no
sólo
la
mortalidad de los pacientes tratados, sino también la estancia
hospitalaria de los mismos.
43
ƒ
Para finalizar, su elevado coste ha limitado mucho su uso.
La aportación innegable de los cultivos de queratinocitos ha sido el hecho de
abrir un amplio abanico de posibilidades en el mundo de la cobertura cutánea
al desarrollarse una tecnología que, posiblemente, será la base de la cobertura
definitiva futura. Las técnicas de cultivo celular son, de momento, la única
posibilidad de obtener abundante tejido autólogo de cobertura, por lo tanto se
ha seguido investigando para su mejora. Estos conocimientos han puesto de
manifiesto la necesidad de dotar a los cultivos de queratinocitos humanos, no
solamente de un soporte físico que les confiera solidez, sino de un tejido
subyacente vivo, en el que se incluyan fibroblastos que permitan el mejor
crecimiento y diferenciación de la capa de células epiteliales (10) .
Las mejoras desarrolladas se basan en general en la reparación dérmica
asociada al aporte de los queratinocitos cultivados. Para la reparación
definitiva de la piel, no basta sólo con la reposición de la epidermis, sino que
también es necesario reponer la dermis dañada. Se han seguido diversas
alternativas para proporcionarle a la lámina de epitelio una base dérmica, con
distinta valoración según los resultados obtenidos tras su utilización y el coste
del tratamiento:
ƒ
Utilización de aloinjertos previos al trasplante de la lámina
de queratinocitos. La experiencia clínica con pacientes
quemados demuestra que la excisión temprana de las
heridas y la cobertura temporal con piel de cadáver que
prende temporalmente en el lecho de la herida, mantienen
la herida limpia y vascularizada, lo cual aumenta las
posibilidades
de
prendimiento
queratinocitos
que
se
va
a
de
la
injertar.
lámina
Este
de
proceso
proporciona una remodelación de la herida más natural y
gracias a él se han logrado éxitos prometedores, aunque el
problema en este tipo de tratamientos es que se precisa
tanto de la unidad de cultivo de queratinocitos como de un
banco de piel que suministre los aloinjertos.
ƒ
Utilización de imitadores dérmicos previos al trasplante de
la
lámina
de
queratinocitos.
Varios
autores
han
trasplantado el cultivo de queratinocitos sobre imitadores
44
dérmicos sintéticos (Alloderm®, Dermagraft®, Integra®),
aunque los resultados han sido variables y sin una clara
mejoría frente a los aloinjertos de cadáver(18,21).
ƒ
Cultivo de queratinocitos sobre dermis de cadáver. El
injerto de queratinocitos cultivados sobre dermis de
cadáver congelada o liofilizada ha proporcionado mejores
resultados. No obstante, las importantes necesidades de
procesamiento y almacenamiento de este tipo de
tejido,
unido a lo impredecible que es la disponibilidad por la
dependencia de donantes, hace que sea inviable su
utilización generalizada.
ƒ
Cultivo de queratinocitos sobre soportes comerciales, tales
como
fibrina
comercial
o
membranas
semisintéticas
derivadas del ácido hialurónico (Laserkin®) .Estos soportes
biodegradables
permiten
la
proliferación
de
células
epiteliales, facilitan el transporte de las láminas y
aumentan la resistencia de las mismas cuando son
trasplantadas.
La alternativa más novedosa es la piel artificial completa. Entendemos por piel
artificial completa aquella que incluye tanto el cultivo del epitelio, como el
cultivo del componente dérmico, es decir la matriz extracelular que confiera
una estructura tridimensional con fibroblastos humanos en su interior . En
estudios previos donde se emplea piel artificial completa en la cobertura de
grandes áreas, como los realizados por Hansbrough , comenzaban a
vislumbrarse las principales ventajas de estas pieles completas: menor
fragilidad,
escasa
retracción,
mejores
porcentajes
de
prendimiento
(Hansbrough JF et al, 1998).
El objetivo inicial para la consecución de esa piel cultivada completa es el
desarrollo de una base dérmica (compuesta por una matriz extracelular
conteniendo fibroblastos dérmicos) sobre la que el cultivo clásico de
queratinocitos consiga gran expansión, diferenciación completa y posibilidades
de éxito tras el trasplante (10-13,16,20). La mayoría de esta pseudodermis se
basan en la mezcla de los componentes básicos de la auténtica dermis. Es
sabido que secuencias específicas de determinadas proteínas de la matriz
45
extracelular pueden promover la adhesión, proliferación y diferenciación de las
células epiteliales(25). De estas proteínas, una de las que mayor influencia
tienen es el colágeno tipo I, la proteína más abundante de la dermis. En este
camino están los estudios que utilizan los geles de colágeno. También se
utiliza el colágeno combinado con glicosaminoglicanos, para sintetizar la
matriz extracelular. Otro tipo de
piel artificial consiste en cultivar los
queratinocitos sobre un equivalente dérmico compuesto por láminas de
fibroblastos apiladas. También se utilizan polímeros biodegradables como
fuente de matriz extracelular, por ejemplo: ácido poliglicólico, mayas de
poliglactina o ambos polímeros juntos en su versión comercial Dermagraft® .
En nuestro laboratorio hemos utilizado fibrina como fuente de matriz
extracelular. La fibrina es una proteína derivada del fibrinógeno sanguíneo.
Aunque no es un componente natural de la dermis, es la base de la reparación
de heridas, ya que actúa como hemostático y en un primer momento es la
matriz extracelular provisional necesaria para las células que inician el
proceso reparador;
asociada a fibroblastos se utiliza como dermis artificial
(Meana A et al, 1998; Camblor LA et al, 2003; Camblor L et al, 2003; Llames S
et al, 2004).
Por otro lado, se ha demostrado que en el interior de los geles de fibrina, los
fibroblastos son capaces de realizar sus funciones fisiológicas(10), sintetizando
múltiples factores de crecimiento, similares a los que segregan los fibroblastos
in vivo y el gel mismo de fibrina podría servir como reservorio de otras
sustancias (factores de crecimiento, antibióticos, etc.) que favorecieran la
correcta cicatrización de la herida donde se aplican.
Este modelo de dermis no sólo aporta las proteínas estructurales del gel (red
tridimensional de fibrina) sino que también aporta las proteínas de adhesión
(fibronectina plasmática) necesarias para que las células dérmicas pueden
fijarse al gel e iniciar sus funciones fisiológicas.
Recientes estudios sobre la revascularizacion de los injertos cutáneos , ponen
de manifiesto que la estructura fibrilar de la neodermis elaborada con un gel
de fibrina , podría guiar la neoangeogenesis desde el lecho cruento.
46
Existen varias fuentes de fibrina humana: la fibrina obtenida a partir de
crioprecipitados de donantes y la fibrina comercial de los pegamentos tisulares
(Tissucol®, Baxter-Inmuno).
La fibrina de crioprecipitados es un producto de un banco de sangre y se
obtiene a partir de donaciones individuales. Uno de los problemas derivados
del empleo de esta fibrina es la necesidad de emplear múltiples unidades de
crioprecipitados, con lo cual el riesgo de transmisión de enfermedades víricas
aumenta.
Las fibrinas comerciales se obtienen a partir de un gran pool de donantes tras
precipitación del fibrinógeno soluble por etanol. Estas fibrinas son objeto de
un tratamiento de inactivación viral por calor, que reduce la posibilidad de
transmisión de virus convencionales, pero ningún proceso puede asegurar la
absoluta destrucción de todos los agentes infecciosos y mucho menos de los
de naturaleza priónica.
Ambos tipos de fibrina dependen de la adicción de productos procoagulantes
(trombina) de origen humano o bovino, y para su estabilidad es necesario
añadir un antifibrinolítico. Este producto es más necesario cuando se utilizan
células (fibroblastos, queratinocitos) ya que tienden a degradar aún más
rápido el gel de fibrina.
En este trabajo hemos utilizado como fuente de fibrina y origen de la matriz
dérmica, el plasma obtenido mediante fraccionamiento directo (centrifugación)
de sangre completa. Este modelo parece poseer las mismas cualidades que los
geles realizados a partir de concentrados de fibrinógeno, es decir:
ƒ
Tanto los fibroblastos como los queratinocitos son capaces
de crecer en este gel con una alta capacidad de expansión.
ƒ
Las láminas así cultivadas son trasplantables, pueden
manipularse y extraerse del frasco de cultivo manteniendo
su integridad, condición necesaria para ser utilizadas en
un trasplante.
47
Además, el uso de plasma como fuente de fibrina para la dermis artificial
presenta unas características claramente ventajosas frente al modelo de geles
realizados a partir de concentrados de fibrinógeno:
ƒ
El empleo como agente coagulante de la trombina
endógena presente en el plasma.
ƒ
La posibilidad de sustituir el antifibrinolítico de origen
bovino por otros de origen sintético.
ƒ
La posibilidad de realizar una gran superficie de dermis a
partir de una simple y única donación. El bajo volumen de
plasma necesario para la realización del gel (10 ml para 75
cm2) hace que se puedan preparar hasta 2.500 cm2 de piel
artificial a partir de un solo donante. Esta pequeña
cantidad de plasma hace que, en algunos casos, se pueda
utilizar la sangre del propio paciente, obtenida mediante
una simple venopunción, como origen de la dermis
artificial,
con
lo
que
el
riesgo
de
transmisión
de
enfermedades infecciosas se anula. Si a esto añadimos que
podemos
obtener
los
fibroblastos
y
queratinocitos
procedentes de la misma biopsia, este sistema abre la
posibilidad de desarrollar grandes superficies de piel
artificial utilizando exclusivamente material del propio
paciente. Es decir, piel artificial completamente autóloga.
En nuestro laboratorio se ha demostrado que utilizando plasma como fuente
de dermis artificial, se puede conseguir un alto nivel de expansión celular no
demostrado por otras sustancias. Esta alta capacidad de expansión, unida a
la utilización de colagenasa para optimizar la obtención de células de las
biopsias, es de gran utilidad cuando se piensa en utilizar este prototipo de piel
artificial en la clínica. Sobre todo cuando hablamos de grandes lesiones
epiteliales para las cuales no existe suficiente cobertura autóloga.
Uno de los objetivos planteados para este trabajo fue confirmar la posibilidad
de sustituir de las proteínas exógenas utilizadas para sintetizar la dermis
artificial. Esta proteínas (trombina y aprotinina) son de origen bovino y
48
conllevan
el
riesgo
de
transmitir
infecciones
que
salten
la
barrera
interespecífica (encefalopatía espongiforme bovina).
En los geles realizados a partir de plasma humano se consiguió eliminar la
trombina bovina y provocar la coagulación activando la protrombina endógena
mediante la adicción de CaCl2. La recogida de la sangre total de donante se
suele realizar en presencia de citrato sódico. El citrato sódico secuestra el
calcio presente en la sangre e impide la coagulación, este ion es fundamental
para el desarrollo completo del proceso. La concentración de cloruro cálcico
deber de ser la adecuada para neutralizar a los agentes quelantes.
Nuestros resultados indican que no es posible prescindir del antifibrinolítico,
ya que el cultivo de queratinocitos sobre la dermis de plasma y fibroblastos
humanos, no llegó a término en ausencia de esta sustancia. Es sabido que
durante la reparación cutánea se activan proteasas que digerirán las proteínas
de la matriz extracelular y permitirán la migración de las células. Estas
proteasas se dividen básicamente en dos tipos: metaloproteasas y serin
proteasas. Las metaloproteasas son necesarias para la migración de los
queratinocitos,
pero
las
serin
proteasas
han
de
ser
inhibidas.
Los
queratinocitos tienen la capacidad de sintetizar altas cantidades de activador
tisular
del
plasminógeno
(tAP)
(serin
proteasa),
el
cual
activará
el
plasminógeno (serin proteasa) y éste, a su vez, a las plasmina que actuará
digiriendo los coágulos de fibrina. La aprotinina es un inhibidor inespecífico de
las serin proteasas y no tiene ninguna acción específica sobre el tPA. Por el
contrario el ácido aminocaproico a concentraciones altas actúa inhibiendo a la
plasmina y a los activadores del plasminógeno, a concentraciones más bajas
actúa exclusivamente sobre estos últimos.
El estudio de proliferación de los queratinocitos, previo al trasplante
experimental, mostró que el epitelio continúa proliferando a pesar de haber
alcanzado la confluencia. La proliferación epitelial tras haber alcanzado la
confluencia probablemente indique que los fenómenos de diferenciación y
estratificación del epitelio están presentes en el prototipo en el momento de ser
preparadas las láminas para el trasplante. Lo que indica la capacidad de
generar un epitelio totalmente diferenciado, tal y como muestran los
49
resultados tras el trasplante experimental. También se puede observar
proliferación en los fibroblastos presentes en el interior del gel de plasma.
Con el trasplante experimental del prototipo se demostró que el modelo de piel
artificial desarrollado es válido para su manejo quirúrgico. Se decidió proteger
el injerto durante los primeros días con la piel del prototipo animal
desvitalizada, este sistema de trasplante permite proteger el injerto sin
aplicación de ningún apósito que comprima la zona trasplantada. Tras el
desprendimiento espontáneo de la piel desvitalizada, se pudo ver un epitelio de
características morfológicas diferentes a las del animal.
A las 3 semanas del injerto el análisis histológico de la piel trasplantada
mostró la existencia de un estrato córneo completo, imprescindible para que la
piel realice su importante función de barrera frente al medio externo. Este
prototipo era capaz de reconstruir la morfología normal del epitelio. Todas
estas observaciones tienen gran importancia si consideramos que partimos de
un gel de fibrina poblado por fibroblastos sobre el que están presentes células
epiteliales mono o biestratificadas y que se desarrolla un epitelio estratificado,
con estrato córneo incluido, sobre una dermis formada mayoritariamente por
colágeno y fibroblastos, vascularizada mediante pequeños capilares .
Mediante anticuerpos específicos humanos se confirmó el origen humano de
las células que epitelizaban la zona de la herida. El trasplante permaneció
estable. Si consideramos que el epitelio humano se renueva en unos 15-30
días según la zona del cuerpo(17,18), la permanencia del epitelio en el modelo
experimental indica la presencia, en el injerto, de células madre (13,16,20)
capaces de mantener la renovación del epitelio(19).
Tras 3 semanas de trasplante, se vio el programa completo de diferenciación
de los queratinocitos, al observarse el desarrollo del estrato córneo. Este
programa
de
diferenciación
fue
normal,
según
la
expresión
de
las
citoqueratinas estudiadas: la citoqueratina K5 se expresó en el estrato basal .
En la piel cada estrato epidérmico expresa un tipo distinto de queratina, en el
estrato basal los filamentos de queratina contienen dos proteínas bien
diferenciadas denominadas K5 y K14; en el estrato espinoso predominan las
queratinas K1 y K10.Un hallazgo imprevisto fue la constatación de que en la
50
capa basal se positivizaban células con S-100, demostrando la existencia de
melanocitos a dicho nivel.
El estudio histológico de la dermis trasplantada muestra varios puntos de
interés:
1. La persistencia en el lecho de la herida de los fibroblastos humanos
marcados con vimentina y una tendencia de los mismos a desplazarse
hacia la unión dermoepidermica .
2. Sustitución de las fibras de fibrina por otras de colágeno sintetizadas de
novo (Tricomico de Masson)
3. Presencia de abundantes estructuras neoangeogenicas.
En resumen , los resultados del trasplante experimental nos indican que
nuestro prototipo de piel artificial es perfectamente trasplantable , epiteliza
permanentemente las heridas , desarrolla correctamente el programa de
diferenciación de los queratinocitos y proporciona una base dérmica estable a
la herida .
51
6. CONCLUSIONES
Las conclusiones de este trabajo son:
1.- El plasma humano puede ser utilizado como fuente de matriz dérmica en el
desarrollo de un programa de ingeniería tisular de la piel.
2.- La utilización de plasma como dermis artificial permite la eliminación de
sustancias de origen animal en la fabricación de la dermis. Abre la posibilidad
de fabricar una piel artificial completamente autóloga.
3.- Este modelo de piel artificial fue capaz de epitelizar permanentemente
heridas en un modelo experimental .
4.- No se objetivaron pérdidas tardías de la epitelización, ni la aparición de
lesiones ampollosas, típicas en otros modelos de piel cultivada..
52
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