03 Cultivo de linfocitos - SILADIN Oriente

PARAMETROS CITOGENÉTICOS.
PARAMETROS CITOGENÉTICOS EVALUADOS EN CROMOSOMAS
HUMANOS A PARTIR DEL CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS
MATERIALES Y MÉTODO
Ensanyo: Tinción diferencial de Cromátidas Hermanas(ICHs)
A partir de donadores clínicamente sanos, se extrae por punción venosa 5 ml de sangre periférica con una
jeringa heparinizada (PiSA, México). Posteriormente 0.5 ml de está sangre se cultiva en 4.75 ml de medio
RPMI-1640 (Sigma, USA) suplementado con 0.25 ml de fitohemaglutinina M (Sigma, USA), y se incuban
durante 72 hrs a 37°C.
Posteriormente a las 24 hrs de incubación, se adiciona 0.1 ml de la solución bromodesoxiuridina (BrdU,
Sigma, USA) en una concentración final de 5 µg/ml y a las 48 hrs se aplicó el tratamiento que consistió en
añadir: 0.33, 0.66, 1.00 µg/ml la Casiopeína IIgly. Se utilizo un control negativo (sin tratamiento) y un
positivo de Mitomicina C (200 ng/ml) (Sigma, USA).
A las 70 hrs se adiciona 0.1 ml de una solución de colcemida (IRVINE SCIENTIFIC, USA) en una
concentración final de 4 µg/ml y se deja actuar por dos horas. A las 72 hrs los cultivos se centrifugan a 1500
rpm durante 5 minutos. El paquete celular se somete a un choque hipotónico con una solución de KCl
(Beker, México) 0.075M, durante 20 mín a 37 °C. Se realiza otra centrifugación y las células se fijan en una
solución de metanol-ácido acético (Beker, México), frío y recién preparado (3:1) con tres cambios en la
mezcla fijadora 15, 10 y 5 min. En el último cambio se resuspende el botón celular en 0.5 ml de fijador.
Luego de esto se procede a realizar las preparaciones por goteo y se dejan secar al aire. Las laminillas con el
material genético se irradian con luz ultravioleta durante 20 minutos sumergidas en una solución acuosa.
Trascurrido este tiempo se incuban por 20 minutos en una solución citrato salina 2xSSC (Cloruro de sodio
0.30M (Sigme, USA) + Citrato de sodio 0.03M (Beker, México)) a 50 °C en una caja coplin. Se lavan las
preparaciones con agua destilada y luego se tiñen con Giemsa (Sigma) (1:10) durante 10 minutos. Se lavan
en agua corriente y se dejan secar al aire.
ENSAYO DE MICRONÚCLEOS (MN)
SIEMBRA
Realizar cultivos de linfocitos humanos de sangre completa proveniente de donadores clínicamente sanos (al
final de los tratamientos, se separan los linfocitos, del resto de las células, Fenech, 2000, Fenech et al.,
2003), tratados por separado a las 48 horas de iniciados, con tres concentraciones diferentes de cada una de
las Casiopeínas III-ia, IIgly y Igly. Se contará con un testigo negativo (sin tratamiento) y uno positivo con
Mitomicina C (200 ng/ml). La Citocalacina B (6 μg/ml), se adicionará 44 horas de haberse iniciados los
cultivos previamente estimulados con fitohemaglutinina.
COSECHA
Los linfocitos binucleados se cosechas después de 28 horas de haber adicionado la Citocalacina B, tiempo en
el cual se procederá a separa a los linfocitos del resto de las células, usando el gradiente de Ficoll (Fenech,
2000). Separados los linfocitos se tomará una alícuota para, evaluar la viabilidad con el ensayo de exclusión
de azul tripano. Los restantes linfocitos aislados se fijaran por 10 min., con metanol absoluto.
TINCIÓN
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Las preparaciones (tres por tubo) se elaboraron por goteo. Finalmente se realizará una tinción convencional
May Grünwald-Giemsa. Cada prueba para las diferentes concentraciones de Casiopeínas y, testigos tanto
positivo como negativo, se llevará a cabo por duplicado y con dos repeticiones más.
EVALUACIONES y ANÁLISIS ESTADÍSTICO
ICHs:
Para el análisis de la frecuencia de ICHs, se analizan 30 células en metafase bien extendidas de segundo ciclo
duplicación y se cuantifico el número y tipo de ICHs. Considerando a los intercambios terminales como uno
y a los intersticiales como dos. (Figura,1)
Para la determinación del Índice Mitótico (IM) se evaluaron 1000 células por tratamiento, incluyendo células
en interfase y metafase, de acuerdo con la siguiente fórmula:
IM= No. De células en división / No total de células X 100
Mientras que para la CDC el TPL y el IR se cuantifican 120 células en metafase, por tratamiento. Para
determinar la CDC se cuantifican las células en M1, M2 y M3.
Para calcular el TPL se utilizó la siguiente fórmula:
TPL= [48 hrs de BrdU / 1(M1)+2(M2)+3(M3)]X120
Y para el IR se utilizo la fórmula que a continuación se presenta:
IR = 1(M1) + 2(M2) + 3(M3) / 120
Donde M1, M2 y M3 son células en primera, segunda y tercera división respectivamente.
Por cada concentración se realizan tres experimentos independientes, con su respectivo duplicado. Se utilizó
un microscopio de campo claro a 100X y 40X respectivamente.
Para el análisis y evaluación de los resultados que se obtuvieron se aplicó a la frecuencia de Intercambio de
Cromátidas Hermanas (ICHs), la prueba estadística de “t” de Student, para la Cinética de División Celular
(CDC) e Índice de Replicación (IR), Ji cuadrada (X2), y para el Tiempo de Proliferación Linfocitica (TPL) y
en el Índice Mitótico (IM) se emplea la Z para proporciones. Con el valor mínimo de significancía de p<0.05.
MN:
Se obtendrá el Índice de División Nuclear (IDN) y el Índice de División Nuclear Citotóxico (ICDN) de la
siguiente forma:
IDN = (MI + 2 (M2) + 3 (M3) +4 (M4)) / N
Donde M1...M4 representan el numero de células con 1 a 4 núcleos y N es el número total de células viables
contadas. Este parámetro será evaluado en 500 células totales.
ICDN = (Ap + Nec + M1+ 2(M2) + 3(M3) + 4(M4)) / N*,
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Donde IDNC= Índice de División Nuclear Citotóxico,
Ap = número de células apoptóticas,
Nec = número de células necróticas,
M1...M4 = número de células viables con 1 a 4 núcleos y,
N* = número total de células contadas (viables y no viables).
Se contaran 1000 células, para estimar el porcentaje (%), de células tanto apoptoticas como necróticas, para
cada tratamiento.
Para el NDI y el IDNC, se utilizará la prueba de Z para proporciones con un nivel de significancia de p <
0.05.
Figura 1. Fotomicrografía, de una célula humana en metafase con tinción diferencial que se
encuentra en segundo ciclo de división celular, señalado los cromosomas que tienen ICHs. La
flecha señala el único cromosoma que presenta dos ICHs (100X).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Roldán
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(2002).
Estudio
del
mecanismo
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acción
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participación en la producción de intercambio de cromátidas hermanas, inducidas por el pentóxido de
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