Universidad Tecnològica de Querètaro
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Universidad Tecnològica de Querètaro Firmado digitalmente por Universidad Tecnològica de Querètaro Nombre de reconocimiento (DN): cn=Universidad Tecnològica de Querètaro, o=UTEQ, ou=UTEQ, [email protected], c=MX Fecha: 2013.11.04 16:34:19 -06'00' UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE QUERÉTARO Nombre del Proyecto: ¨DESARROLLO EXPERIMENTAL PARA LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL NÚMERO MAS PROBABLE¨ Empresa: KURIMEXICANA SA DE CV Memoria que como parte de los requisitos para obtener el título de: INGENIERO AMBIENTAL Presenta: NUÑEZ RICO ELVIA Asesor de la UTEQ Asesor de la Organización M.en I. José Ramón Pérez Contreras Química Carlota Martínez Lara Santiago de Querétaro, Qro. Octubre del 2013 Resumen El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Análisis de aguas de la empresa KURIMEXICANA, teniendo como objetivo el desarrollo experimental para la validación del método de Coliformes Totales y Fecales por la técnica del número más probable, utilizando como medio de cultivo un Caldo Lactosado. Se analizaron: una muestra de agua proveniente de una planta de tratamiento de aguas y una muestra control de una cepa certificada.Para el desarrollo del proyecto se empleó una metodología analítica que se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo líquido conteniendo lactosa. Los tubos se examinaron a las 24 y 48 horas de incubación a 310 K (37°C);cada uno de los tubos que mostró turbidez con producción de gas se resembró en un medio confirmativo más selectivo. Para E.Coli se resembró en agua de Triptonapara demostrar la producción de Indol; paraColiformesTermotolerantesse utilizó el Bilis Verde Brillante y para Coliformes Totales se utilizó caldo EC y Bilis Verde Brillante. Se llevóa cabo la incubación de estos medios confirmativospor 48 horas a 310 K (37°C) para la detección de organismos Coliformes y a 317 K (44°C) para organismos Termotolerantes y E. Coli. Mediante tablas estadísticas se determinó el número más probable (NMP) de organismos Coliformes, es decir, el número de organismos Coliformes Totales,Termotolerantes y E. Coli que puede estar presente en 100 ml de muestra, a partir de los números de los tubos que dan resultados confirmativos positivos. Los datos obtenidos fueron sometidos a la evaluación de parámetros de validación para determinar la precisión, inclusividad y límite de detección.En base a los % de Coeficientes de Variación obtenidos de los diferentes ensayos, se considera que no existe variación entre los ensayos realizados a diferentes condiciones, por lo que el método posee precisión e inclusividad; por lo tanto, se confirma que el método cumple con los requerimientos para los cuales fue diseñado y se da como Validado. . (Palabras clave: desarrollo, experimental, validación, Coliformes Totales y Fecales, númeromás probable) 2 Summary The purpose of this work was to make all the experimental part for the validation of the quantification method of total coliforms and fecal coliforms with the Entidad Mexicana De Acreditación. The tests were conducted in the water analysis laboratory of KURIMEXICANA SA DE CV. We did a literature review to have all the necessary information for the project’s development further test were made with a certifiedE- coli strain and with a water sample from a water treatment plant. For presumptive tests, a Lactose Broth was used as a cultivation medium and for confirmatory tests was usedEC broth with Mug, Tryptone Water and Brilante Green Bile. Through statistical analysis the validation parameters (repeatability, reproducibility, detection limit, and inclusiveness) were determined. Based on the variation coefficients is considered, that there is no variation between the tests conducted under different conditions so that the method has a precision and inclusivity. 3 Dedicatorias Dedico esta tesis a DIOS quien inspiro mi espíritu para la conclusión de este trabajo, por haberme acompañado y guido a lo largo no solo de mi carrera sino de mi vida, por ser mi fortaleza en los momentos de debilidad, por darme una vida llena de aprendizajes y sobre todo de felicidad. A mis padres quienes me dieron vida, educación, apoyo, consejos y quienes me apoyaronen todo momento y alentaron para continuar, cuando parecía que me iba a rendir. A mis hermanos Blanquita y Heriy a mi sobrina Naomi quienes fueron un gran apoyo emocional durante mi carrera y quienes llenaron mi vida de alegrías y amor. A mis compañeros de estudio, a mis maestros y amigos quienes siempre estuvieron ahí cuando los necesite y quienes hicieron de mi etapa universitaria una de las mejores en mi vida. Al Profesor José Ramón Pérez Contreras por la confianza, apoyo, dedicación y por haber compartido conmigo sus conocimientos y sobre todo su amistad. A la Química Carlota Martínez Lara, por haberme brindado la oportunidad de desarrollar esta tesis en KURIMEXICANA, por el apoyo y facilidades otorgadas 4 en la empresa. Por darme la oportunidad de crecer profesionalmente y aprender cosas nuevas. A Maricela Barona por haberme tenido la paciencia necesaria para el desarrollo de mí proyecto. A todos ellos se los agradezco desde el fondo de mi alma. 5 índice Página RESUMEN .......................................................................................................... 2 SUMMARY.......................................................................................................... 3 DEDICATORIAS ................................................................................................. 4 ÍNDICE ................................................................................................................ 6 I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 7 II. ANTECEDENTES ...................................................................................... 12 III. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 16 IV. OBJETIVOS .............................................................................................. 17 V. ALCANCE ................................................................................................. 18 VI. ANÁLISIS DE RIESGOS ........................................................................... 19 VII. FUNDAMENTACIÓNTEÓRICA ................................................................ 20 VIII. PLAN DEACTIVIDADES .......................................................................... 41 IX. RECURSOS MATERIALES Y HUMANOS............................................... 42 X. DESARROLLO DEL PROYECTO ............................................................ 44 XI. RESULTADOS OBTENIDOS ................................................................... 58 XII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................... 74 XIII. BIBLIOGRAFÍA XIV. ANEXOS 6 I. Introducción La detección y enumeración de bacterias indicadoras son de primordial importancia para el monitoreo de la calidad microbiológica del agua. Los Coliformes Fecales (Termotolerantes) y EscherichiaColi son empleados como indicadores de contaminación fecal. El uso del método del número más probable (NMP), descrito por la Organización Internacional de Estandarización (ISO), involucra una prueba presuntiva seguida por una prueba confirmativa para la enumeración de Coliformes Totales y Fecales. Este ensayo está basado en las propiedades de producción de ácido o gas por la fermentación de la lactosa. Para demostrar que el método de ensayo es adecuado para su uso, es necesario desarrollar un proceso de validación, ya que durante esta secuencia de ensayos es donde el analista se da cuenta si el estudio, el cual estásiendo evaluado, cumple con los propósitos para los cuales fue diseñado. Este trabajo incluye una validación concurrente para la evaluación del método microbiológico del número más probable, realizada según las guías de: la AOAC Internacional para la validación de métodos microbiológicos cualitativos y cuantitativos, la norma NMX-AA-042-1987 y la norma ISO 16140 que recomienda la evaluación de los parámetros: Precisión (repetibilidad y reproducibilidad), límite de detección e inclusividad. 7 El presente trabajo de validación se llevó a cabo dentro de las instalaciones del laboratorio de análisis de aguas de la empresa KURIMEXICANA, S.A. DE C.V;y en base al modelo académico de la Universidad Tecnológica de Querétaro que se basa en un modelo 70/30, es decir 70% practica y 30% teoría; mediante ensayos repetitivos, utilizando diferentes variables para cada parámetro de validación. I.1 Datos Generales de la empresa Kurimexicana es una empresa 100% mexicana con acceso a la mejor tecnología parael tratamiento y reusodel agua industrial. Fue fundada en 1988 y cuenta con más de 20 años en el mercado mexicano. Anteriormente el nombre de la empresa fue el de Kurita de México y antes de este Kaxyni Mexicana. La tecnología que se dispone en KURIMEXICANA para el análisis de aguas y para la fabricación de sus productoses de origen japonés, americano y europeo que buscan adecuarse a las necesidades particulares de la industria en México. Kurimexicana está dentro de las principales empresas en México en su campo y es pionera en varios procesos con productos químicos para la industria termoeléctrica, automotriz, siderúrgica, química, plantas de tratamiento de efluentes industriales, etc. A nivel internacional cuenta con presencia a nivel Latinoamérica a través de distribuidores locales. 8 Kurimexicana ha provisto tratamientos de aguas que han soportado el avance industrial y contribuido a la protección ambiental y sigue ofreciendo tratamientos químicos para un amplio rango de tipos de aguas, dispositivos para control ambiental y servicios de consultoría. (“KURIMEXICANA”, 16 de junio de 2013) I.2 Misión Todos los que trabajamos en KURIMEXICANA , contribuimos a optimizar el uso y reuso del agua, preservando el medio ambiente a través de soluciones tecnológicamente diferentes, utilizando programas de tratamiento químico, equipos y servicios para los diferentes sectores industriales. (Manual de calidad, KURIMEXICANA 15 de junio de 2013) I.3 Visión Posicionarnos como una de las empresas más importantes en México que ofrece soluciones integrales en la conservación del agua. (Manual de calidad, KURIMEXICANA 15 de junio de 2013) 9 I.4Valores Ética: Nos conducimos con integridad en todo momento de acuerdo a los valores morales y prácticas profesionales, respetando las políticas organizacionales internas y externas. Responsabilidad y Compromiso: Sentimos como propios los objetivos de la organización y los adoptamos con convicción para así coadyuvar al logro de los mismos. Trabajo en Equipo: Trabajamos de manera abierta, amable y cooperativa para lograr nuestros objetivos. Actitud de Servicio: Deseamos ayudar y servir a los clientes internos y externos, esforzándonos por conocer y resolver los problemas, comprendiendo y satisfaciendo sus necesidades. Perseverancia: Buscamos el logro de los objetivos con firmeza, constancia y actitud emprendedora, promoviendo la participación de todo el personal. (Manual de calidad, KURIMEXICANA 15 de junio de 2013) 10 I.5Política de Calidad En Kurimexicana estamos comprometidos en cumplir los objetivos de calidad, así como los requerimientos de nuestros clientes externos, internos y de las partes interesadas, mejorando continuamente el Sistema de Gestión de Calidad. (Manual de calidad, KURIMEXICANA 15 de junio de 2013) En lo que va del año 2013 en KURIMEXICANA S.A DE CV se está trabajando en base a la norma ISO IEC 17025 para cumplir con todos los requerimientos necesarios para obtener la acreditación ante la Entidad Mexicana de Acreditación de su laboratorio de análisis de aguas. Uno de los requerimientos que menciona la norma ISO IEC 17025 es que todos los 19 métodos de análisis de aguas con los que cuenta el laboratorio deben ser validados por la EMA, para comprobar que cada método de pruebapuede proporcionar resultados confiables. Uno de los métodos en los que falta trabajar para su validación es el método de Coliformes Totales y Fecales. 11 II. Antecedentes La Entidad Mexicana de Acreditación, A.C., es la primera entidad de gestión privada en nuestro país que tiene como objetivo acreditar a los Organismos de la Evaluación de la Conformidad que son los laboratorios de ensayo, laboratorios de calibración, laboratorios clínicos, unidades de verificación (organismos de inspección) y organismos de certificación, Proveedores de Ensayos de Aptitud y a los Organismos Verificadores/Validadores de Emisión de Gases Efecto Invernadero (OVV GEI). Su creación se impulsó al detectar los retos que presenta el intercambio de productos, bienes y servicios en el mundo globalizado; para dotar a la industria y comercio herramientas para competir equitativamente e insertarse ampliamente al comercio internacional. Desde enero de 2006, la EMA cumple con la norma vigente para organismos de acreditación en el ámbito mundial, la Norma NMX-EC-17011-IMNC-2005 “Evaluación de la Conformidad – Requisitos Generales para los Organismos que realizan la acreditación de Organismos de Evaluación de la Conformidad”. (¨ËMA¨, 28 de mayo de 2013) 12 II.1 Acreditación Acto por el cual una entidad de acreditación reconoce la competencia técnica y confiabilidad de los laboratorios de ensayo, laboratorios de calibración, laboratorios clínicos, unidades de verificación (organismos de inspección) y organismos de certificación para la Evaluación de la Conformidad Beneficios para: Dependencias: Poner en vigor las regulaciones que son responsables de proteger la seguridad y la salud de la población. Consumidores:Tienen la certeza de la seguridad sobre lo que compran o consumen. Trabajadores: Cuentan con las instalaciones adecuadas yel personal está debidamente capacitado. Empresarios: Una estructura de evaluación de la Conformidad significa una gran ventaja competitiva para los empresarios mexicanos. Hoy pueden emplear los servicios confiables de laboratorio, unidades de verificación (organismos de inspección), y organismos de certificación acreditados en territorio nacional. 13 Los laboratorios de ensayo y/o prueba realizan su actividad a través de la prueba de una muestra representativa y, como resultado de su actividad, emiten un informe de resultados. Los laboratorios de ensayo y/o prueba demuestran su competencia técnica, asegurando la calidad de los informes de resultados que emiten a través la comprobación del cumplimiento con los requisitos sobre estructura y organización, ética e imparcialidad, sistema de gestión de la calidad, personal, equipo, procedimientos técnicos, validación de métodos, calibración, trazabilidad, etc., establecidos en la norma NMX-EC-17025-IMNC-2006/ISO 17025:2005. (¨EMA¨, 28 de mayo de 2013) Como ya se mencionó anteriormente uno de los objetivos de KURIMEXICANA para este año es obtener la acreditación del laboratorio de aguas ante la EMA para poder ofrecer un mejor servicio a sus clientes y con ello incrementar sus ventas. Y como parte de los requisitos de la EMA en base a la norma ISO IEC 17025 es que todos los métodos de análisis de aguas sean validados. KURIMEXICANA cuenta con 19 métodos de acreditación de los cuales ya se tiene toda la evidencia de sus parámetros de validación de 18 solo falta hacer 14 pruebas del método de cuantificación de Coliformes Totales y Fecales por la técnica del número más probable. Los parámetros de validación que aplican para el método de Coliformes Totales y Fecales son: límite de detección, precisión (repetibilidad y reproducibilidad) e Inclusividad (sensibilidad). 15 III. Justificación KURIMEXICANA es una empresa mexicana dedicada a la fabricación y distribución de químicos para el tratamiento y reuso del agua industrial y con ello eficientar su uso en los sistemas de enfriamiento, en las calderas e intercambiadores de calor, en los chillers y sistemas cerrados, así como también provee químicos para las plantas de tratamiento de aguas residuales. Para satisfacer las necesidades de sus clientes en KURIMEXICANA se ha propuesto obtener la acreditación ante la EMA (Entidad Mexicana de Acreditación) conforme a la norma ISO/IEC 17025 que establece los requisitos de gestión para la acreditación de laboratorios de ensayo y calibración, en este caso aplica al laboratorio de análisis de aguas ubicado dentro de las instalaciones de Kurimexicana. Como parte de los requerimientos de esta norma se deben validar ante la EMA los métodos de análisis de aguas, para demostrar estadísticamente que estos proporcionan resultados confiables y adecuados para su finalidad y con ello asegurar la calidad, ofrecer mejores productos y un mejor servicio a sus clientes. KURIMEXICANA cuenta con 19 métodos de análisis de aguas de los cuales ya se cuenta con evidencia necesaria para su validación ante la EMA de 18 solo falta trabajar con el método microbiológico de Coliformes Fecales y Totales para poder determinar los parámetros de mencionados,por ello se decidió trabajar con estemétodo. 16 validación antes IV. Objetivos IV.1 Objetivo General Desarrollar la evidencia experimental para la validación del método de cuantificación de Coliformes Totales y Fecales por la técnica del Número más Probable (NMP). IV.2 Objetivos Particulares Elaborar el marco teórico sobre losColiformes Totales y Fecales y lascaracterísticas de la técnica de cuantificación por el Número más Probable, así como sobre el proceso de validación de un método. Evaluar los parámetros de validación mediante las pruebas de cuantificación de Coliformes Fecales y Totales por la técnica del Número más Probable. 17 V. Alcance El presente trabajo es de aplicación para cualquier tipo de agua proveniente de fuentes naturales, aguas residuales y aguas residuales tratadas que se analicen en el laboratorio de análisis de aguas de la empresa KURIMEXICANA. El proyecto se desarrollará en un período de cuatro meses, la primera etapa consistirá en reunir la información bibliográfica necesaria para el desarrollo del proyecto, esto incluye información sobre Coliformes Totales y Fecales, sobre la técnica de cuantificación del Número más Probable, sobre acreditación y sobre validación de métodos microbiológicos. La segunda en hacer las pruebas necesarias de cuantificación de Coliformes Totales y Fecales por el Número más Probable, esto incluye, una prueba con cepa Certificada de E.COLI y otra prueba con agua proveniente de una planta de tratamiento de aguas en donde es seguro que contiene Coliformes Totales y Fecales. Y la tercera etapa consiste en determinar los valores para cada parámetro de validación, mediante tablas y cálculos estadísticos. 18 VI. Análisis de riesgos Un factor que determinara en gran medida el avance de este proyecto será el tiempo programado por mi asesora de la empresa para la revisión de los avances; ya que constantemente se encuentra ocupada en preparar todo lo necesario para la certificación ante EMA; y otro factor será el tiempo programado por la Entidad Mexicana de Acreditación para realizar la validación del método. Otro factor importante que podría retrasar el proyecto es la disponibilidad de todo el material y reactivos, por lo que será necesario asegurar la existencia en stock de cada uno de estos. 19 VII. FundamentaciónTeórica VII.1 Fermentadores de la Lactosa Según los métodos normalizados para el análisis de aguas potables y residuales de Díaz Santos hay los siguientes grupos de Coliformesfermentadores de lactosa (p 79-95). VII.1.1 Grupo Coliforme total: El grupo Coliforme está formado por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, gramnegativas, no formadoras de esporas y con forma de bastón que fermentan la lactosa, produciendo gas y ácido en 48 horas a 35º C. Pertenecen a este grupo los géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobactery Klebsiella. Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales. En general, las bacterias Coliformes Totales se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Los Coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo, suele deducirse que la mayoría de los 20 Coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal, sin embargo, existen muchos Coliformes que no lo son. Tradicionalmente se les ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano, debido a que en los medios acuáticos, los Coliformes totales son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura. Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más Coliformes se aíslan del agua, mayor es la cantidad de la descarga de heces. No todos los Coliformes son de origen fecal, por lo que es necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los Coliformes totales que comprende la totalidad del grupo y los Coliformes fecales, aquellos de origen intestinal. Desde el punto de vista de la salud pública, esta diferenciación es importante, puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que la contaminación que presenta el agua es de origen fecal. 21 VII.1.2 Grupo Coliforme Fecal Son bacterias que forman parte del grupo Coliforme Total y son definidas como bacilos gramnegativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44 ± 0.2 °C, dentro de las 48 ± 2 horas. Este grupo también es denominado termo tolerante y la especie más predominante es la EscherichiaColi, que constituye una gran proporción de la población intestinal humana. EscherichiaColi: Es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, móvil por flagelos perítricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y descarboxila la lisina generalmente. Fuente: Elmer, W. y otros. 2003. Diagnóstico Microbiológico. 2 ed. Buenos Aires. Argentina. p. 197. 22 El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de contaminación de origen fecal (alrededor del 99%). No es absoluta, porque se han aislado cepas de E. coli que no tienen origen fecal, pero es un grado de certeza más que razonable para suponer contaminación con ese origen. Sin embargo, el aislamiento de este microorganismo no permite distinguir si la contaminación proviene de excretas humanas o animales, debido a que la Escherichiacoli de origen animal y la de origen humano son idénticas, lo cual puede ser importante,puesto que la contaminación que se desea habitualmente controlar es la de origen humano. Se distinguen cinco cepas de E. colisegún su poder patógeno: 1. E. colienteropatogénica (ECEP) 2. E. colienterotoxigénica (ECET) 3. E. colienteroínvasiva (ECEI) 4. E. colientero hemorrágica o verotoxigénica (ECEH) 5. E. colientéroagregativa (ECEA) Cada grupo produce enfermedad por un mecanismo diferente y los síndromes resultantes suelen diferir desde los puntos de vista clínico y epidemiológico. Por ejemplo, las cepas ECET y ECEI sólo infectan al ser humano. Los alimentos y 23 el agua contaminada por desechos humanos son los medios principales de transmisión del proceso infeccioso. La Escherichiacoli 0157:H7es una de cientos de cepas de la E. coli, aunque la mayoría de las cepas son inocuas y viven en los intestinos de los seres humanos y animales saludables, esta cepa produce una potente toxina y puede ocasionar una enfermedad grave. Se diferencia de las otras E. colien que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y no produce ß-glucoronidasa. VII.2 Fermentación en tubos múltiples del grupo de los Coliformes La prueba para el grupo Coliforme puede realizarse mediante una técnica de fermentación en tubos múltiples o por la técnica de filtración por membrana.Son aplicables ambos métodos. En el caso de la técnica de fermentación en tubos múltiples, los resultados del estudio de los tubos y diluciones replicados se reportan en término de número más probable (NMP) de microorganismos existentes por 100 ml de agua. Este número se basa en determinadas fórmulas de probabilidad y es un cálculo de la densidad media de coliformes en la muestra. 24 La precisión de cada prueba depende del número de tubos utilizados. Se obtienenresultados más satisfactorios cuando el tubo con la mayor concentración de inóculo de la muestra estudiada,presenta gas en todos los tubos. La densidad bacteriana puede determinarse mediante la tabla que utiliza el número de tubos positivos en las diluciones múltiples. Las tablas de NMP se basan en la hipótesis de una distribución dePoisson (dispersión aleatoria), sin embargo, si la muestra no se ha agitado adecuadamente antes de hacer las diluciones o si existe agrupamiento de bacterias, el valor del NMP podrá resultar menor que el número real de densidad bacteriana. VII.3 Determinación de Coliformes Totales y Fecales por el método de fermentación en tubos múltiples utilizando medios tradicionales. VII.3.1 Caldo Lactosado Es el medio de cultivo que se utiliza en las pruebas presuntivas para investigar la presencia de bacterias del grupo Coliforme en agua, productos lácteos, etc. Actualmente también se usa para el pre enriquecimiento no selectivo en la búsqueda de Salmonella spp, a partir de alimentos. Se caracteriza por ser un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento bacteriano. 25 El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la lactosa es el hidrato de carbono. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas, y éste último se demuestra al usar las campanas Durham. Su apariencia al ser preparado es ámbar claro, transparente sin precipitado. VII.3.2 Diluyente Para hacer las diluciones necesarias, con el fin de correr la prueba de Coliformes, se debe utilizar un diluyente adecuado que no produzca modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la flora de la muestra que va a ser analizada, es decir, que mantenga lo más fielmente posible la flora de la muestra, sin suprimirla ni favorecer su desarrollo; normalmente se utilizan los siguientes diluyentes: Agua de Triptona Solución de Ringer 1/4 Agua de Peptona Este último se utilizará en las pruebas. VII.3.3 Medios de cultivo para las pruebas confirmativas VII.3.3.1 Caldo Verde Brillante Bilis 26 Medio selectivo recomendado para la prueba confirmatoria en la detección del grupo Coliforme en aguas, leche, derivados lácteos y otros productos de importancia sanitaria, mediante la determinación del NMP. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de Coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Una propiedad del grupo Coliforme es la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. La presencia de gas después de incubar de 24 a 48 h a 35ºC, se considera como prueba positiva para la presencia del grupo Coli– Enterobacter. VII.3.3.2 Caldo EC MUG Medio utilizado para el recuento de Coliformes totales, Coliformes fecales y Escherichiacoli en agua, alimentos y otros materiales.Este medio está recomendado por Hajna y Perry y por el Standard MethodsfortheExamination of Water and Wastewater para el recuento de Coliformes en alimentos. 27 En el medio de cultivo la Triptona es la fuente de péptidos, aminoácidos y nitrógeno. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece el desarrollo de bacterias Coliformes, las sales biliares inhiben el crecimiento de la flora acompañante Gram positiva, las sales fosfato constituyen un sistema buffer que impide que los productos ácidos originados por la fermentación de lactosa afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano.Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima Triptofanasa. VII.3.3.3 Triptona Medio de cultivo recomendado para el enriquecimiento de diversos microorganismos y también puede ser utilizado para la realización de la prueba de indol. Su base nutritiva permite el desarrollo de diversas especies bacterianas. La Triptona presenta alto contenido en Triptofano, el cual es el sustrato utilizado por los microorganismos para la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. 28 El indol generado puede ser revelado por el agregado del reactivo de Ehrlich (Indol Reactivo) o el reactivo de Kovac´s, debido a que se forma un complejo color rojo al reaccionar el indol con el grupo aldehído del p-dimetilamino benzaldehído presente en cualquiera de los dos reactivos reveladores; en las pruebas se utilizará el reactivo de Kovacs. La bacteria se cultiva durante 24 a 48 horas en un caldo deTriptona con NaCl al 0,5% (la Triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al agregar al medio cinco gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. VII.3.4 NMP para Coliformes Totales. VII.3.4.1 Fase presuntiva: Agitar la muestra de agua y hacer diluciones de 10, 1 y 0.1 ml y por cada dilución se deben hacer 5 tubos.Para diluciones a 10 veces, poner 90 ó 9 ml del diluyente de peptona (0,1%) en tubos ya esterilizados. Se inoculan tubos en el Caldo Lactosado doble concentración para muestra directa y concentración sencilla para diluciones. En la fase presuntiva, el número de tubos y volumen de muestra seleccionada depende de la cantidad y de las características del agua que se estudiará. 29 Utilizar 5 tubos conteniendo cada uno 10 ml de muestra, antes de esterilizar el medio, colocar en tubos de fermentación un vial invertido para detectar la producción de gas. VII.3.4.2 Fase confirmativa: En esta fase se utilizan tubos de fermentación con vial invertido conteniendo el medio líquido bilis verde brillante y el medio de caldo EC para la determinación de Coliformes totales; el pH del medio debe de ser de 7.2 ± 0.2 después de la esterilización. Para la determinación de ColiformesTermotolerantes se incuban los tubos en bilis verde brillante y para la determinación de E-Coli se incuban tubos en agua de Triptona. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los tubos en 48 ± 3 horas, lo que demuestra la presencia del grupo Coliforme Total. Para confirmar la presencia de E. colidebe comprobarse la producción de Indol en los tubos que presentan fluorescencia, utilizando el reactivo de Kovacsindol (solución de p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico); por medio del desarrollo de un anillo color rosado que indica una reacción positiva. 30 VII.3.5Cálculo y registro del NMP Calcular y registrar el número de hallazgos positivos de microorganismos del grupo Coliforme en términos del número más probable (NMP). Las tablas(ver anexo 1) indican los valores del NMP para distintas series de siembras y resultados. En ellas se contemplan límites de confianza del 95 % para cada valor del NMP; el valor del número de tubos positivos y negativos se reporta en forma de NMP/100mL. VII.4 Validación Debido a la necesidad de validar este tipo de método microbiológico, se plantean a continuación términos y definiciones referentes a procedimientos de validación VII.4.1 Validación En la práctica, validar un método es realizar un conjunto de pruebas de manera de comprobar varios aspectos del comportamiento del mismo, con el fin de establecer que sirve para el fin previsto . Al término validación se le han dado diferentes definiciones de acuerdo al ámbito de aplicación en la cual se implementa, entre las cuales se mencionan: 31 Validación [USP 29]: es el proceso que establece, mediante estudios en laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas. Validación primaria [ISO 9000: 2000]: confirmación, mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista. Validación secundaria [ISO 9000:2000]: demostración, por experimento, que un método establecido funciona de acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario. Verificación[ISO 9000:2000]:confirmación, mediante la aportación de evidencia objetiva, de que se han cumplido los requisitos especificados. Validación de un Método Alternativo [AOAC]: es la validación de un método de análisis que demuestra o estima un analito (un microorganismo, sus componentes o su producto), como lo hace su correspondiente método de referencia. 32 VII.4.2Principios básicos de Validación Para validar un método es necesario comprobar que los elementos y operaciones involucradas en el método sean aptos para poder dar los resultados esperados. Para ello se deben tomar en cuenta las siguientes variables: • Materiales: se debe contar con proveedores certificados. • Equipos e instalaciones: incluye instrumentos y aparatos que se utilizan en el proceso. Evaluando las variaciones que puedan ocurrir durante el mismo. En cuanto a las instalaciones se deben evaluar aspectos como temperatura, humedad, aire, etc. • Métodos: es necesario contar con procedimientos escritos para todas las operaciones. • Personal: incluye un programa de adiestramiento inicial documentado. VII.4.3Tipo de procesos de Validación Según el libro de Castro, G. y otros. 1998. Validación de Métodos Analíticos. Asociación.Española de Farmacéuticos de la Industria. 1 ed. España. p. 4 – 55 en el enfoque experimental los tipos de validación a realizar son: 33 Validación prospectiva: es aquel estudio que se lleva a cabo para demostrar y establecer una evidencia documentada de que un proceso hace lo que está previsto, basado en un protocolo planificado. Validación concurrente: aplicada a pequeños cambios, revalidaciones o en procesos que no han sido validados pero son utilizados normalmente como técnica de análisis. También se aplica en los casos de nuevos fabricantes de principios activos. Basándose en un análisis de datos históricos, se pueden aplicar los siguientes tipos de validación: Validación retrospectiva: es aquel estudio que se lleva a cabo para demostrar y establecer una evidencia documentada de que un proceso hace lo que estaba previsto, sobre la base de una revisión y análisis de una revisión histórica. Revalidación: la revalidación está fraccionada en dos categorías, la primera es la revalidación después de algún cambio y la segunda es la revalidación periódica. 34 Los cambios característicos que requieren revalidación incluyen, por ejemplo, los cambios en una materia prima, los cambios en los parámetros del proceso, los cambios en el equipo, incluidas reparaciones mayores y los cambios en los locales. La revalidación periódica ofrece la oportunidad de verificar que los sistemas están todavía operando como cuando fueron originalmente validados y que ningún cambio no intencional se ha efectuado en el proceso, el sistema o la unidad de equipo y el resultado final. VII.4.4 Validación de método microbiológico cuantitativo Los parámetros de validación para métodos microbiológicos definidos por ISO 16140 incluyen los siguientes: Límite de detección. Precisión (repetibilidad y reproducibilidad) Exactitud Inclusividad (sensibilidad) Exclusividad (especificidad) 35 VII.4.4.1 Límite de detección Es la cantidad mínima de analito (microorganismo) que puede ser detectada e identificada, en las condiciones experimentales indicadas. Para procedimientos no instrumentales, el límite de detección se determina generalmente mediante el análisis de muestras, con concentraciones conocidas de analitos, estableciendo el nivel mínimo del analito que puede detectarse confiablemente. VII.4.4.2. Exactitud Indica la capacidad del método analítico de dar un resultado lo más próximo posible al valor verdadero. Es decir, que expresa la cercanía de un resultado al valor verdadero y la capacidad del método analítico parar dar los resultados lo más próximos posibles a dicho valor. Si la diferencia entre el valor encontrado y el valor verdadero es pequeña, la exactitud es buena. En cambio una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y refleja la existencia de errores que deben corregirse. Matemáticamente, se expresa como la diferencia entre el valor hallado y el verdadero. Estadísticamente suele expresarse por el resultado de realizar una 36 prueba t de Student para determinar si el valor hallado y el valor considerado como verdadero no difieren significativamente para un grado de probabilidad determinado. Si t experimental es menor a t de tablas para el riesgo escogido, significa que ambos valores no son estadísticamente diferentes, comprobándose que el método analítico tiene la exactitud requerida. En cambio sí t experimental es mayor a t de tablas significa que el método analítico no es exacto y existe un error sistémico. Se recomienda que se valúe la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración (alto, medio y bajo), cubriendo el intervalo especificado (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración). VII.4.4.3 Precisión La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales, cuando se aplica el procedimiento repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. Es decir, mide que tan cerca se encuentran los resultados uno del otro. 37 La precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones, donde la media aritmética es el valor central y la desviación estándar es la dispersión de los resultados. La precisión puede ser una medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad del procedimiento analítico en condiciones normales de operación. La reproducibilidad es la medida de la precisión de los resultados de un método analítico efectuado sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes. El ensayo debe estudiar las principales condiciones de variabilidad del método analítico: tiempo (días diferentes), analistas e instrumentos. La reproducibilidad global se determina por el coeficiente de variación. Si se desea estudiar el efecto de cada una de las tres variables por separado (tiempo, analistas e instrumentos) deberá realizarse un análisis de varianza. Muchas veces sólo es suficiente realizar un ensayo de reproducibilidad teniendo en cuenta únicamente el tiempo. La repetibilidad se refiere a la utilización de un procedimiento analítico en un laboratorio durante un periodo de tiempo corto realizado por el mismo analista, con el mismo equipo. 38 Se recomienda que se evalué la repetibilidad utilizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración, o un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba). La precisión de un procedimiento analítico se determina mediante el análisis de un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea, que permita calcular estadísticamente estimaciones válidas de la desviación estándar o de la desviación estándar relativa (coeficiente de variación). Los análisis en este contexto son análisis independientes de muestras que se han llevado a cabo mediante el procedimiento analítico completo, desde la preparación de las muestras hasta resultado final de las pruebas. VII.4.4.4 Inclusividad y exclusividad Las guías de la AOAC INTERNATIONAL para la validación de métodos Vol. 85 (p. 13) definen inclusividad como la ¨habilidad de un método alternativo para detectar el analito de interés de un amplio rango de cepas o también se puede definir como la capacidad del método para detectar diferentes microorganismos pertenecientes al grupo (sensibilidad)¨. 39 La exclusividad es la ausencia de cepas que no son de interés en el estudio, o sea, que se basa en la especificidad del método en la cual diferentes microorganismos que no pertenecen al grupo no deben ser detectados. 40 VIII. Plan deActividades La siguiente tabla muestra la secuencia de actividades que se llevarán a cabo conforme a tiempos programados de inicio y término, las tareas que se pueden realizar simultáneamente y también nos permite comparar el tiempo programado vs el tiempo real en que se llevaron a cabo las actividades. Actividades Revisión Bibliográfica sobre Coliformes Totales y Fecales Revisión Bibliográfica sobre Validación de Métodos Revisión Bibliográfica sobre la Técnica de Cuantificación por el número más probable Realizar las pruebas de cuantificación de Coliformes Totales y Fecales Determinación estadística de los parámetros de validación Análisis de los resultados Obtenidos Prog/Real Programación Mayo 06 10 13 17 20 24 Junio 27 31 03 07 10 14 P R P R P R P R P R P R 41 17 21 Julio 24 28 01 05 08 12 15 19 Agosto 22 26 29 02 05 09 12 16 19 23 IX. Recursos materiales y humanos IX.1 Instrumentos de Laboratorio Balanza Analítica Autoclave Incubadora o baño de agua, controlado termostáticamente a 35°C – 37°C Incubadora o baño de agua, controlado termostáticamente a 44°C±0,1°C Medidor de pH Campana de flujo laminar Material Común de laboratorio Tubos de fermentación tipo Durham IX.2Reactivos: Caldo Lactosado marca Dibico Caldo Verde Brillante Bilis marca Dibico Caldo EC con MUG marca Dibico Triptona Cloruro de Sodio 1,4 dimetilaminobenzaldehido Alcohol Amílico Ácido Clorhídrico concentrado Peptona 42 IX.3 Equipo de Seguridad Bata de laboratorio Lentes de seguridad Zapatos de seguridad Cofia Guantes de látex Cubre boca IX.4 Recursos humanos Las personas que intervinieron en el desarrollo del proyecto son: Química Carlota Martínez Lara I.Q Maricela Barona M. en I. José Ramón Pérez Contreras T.S.U. Elvia Nuñez Rico 43 X. Desarrollo del proyecto X.1 Ensayo de la técnica de tubos múltiples (NMP) X.1.1 Preparación del inóculo El inóculo se preparó usando una cepa de EscherichiaColi; se transfirió la bacteria por medio de estriado a una placa con agar nutritivo y se incubó a 37 °C por 24 horas.Posteriormente se tomaron colonias aisladas con un asa estéril, se sembraron en un tubo con agar nutritivo inclinado y se incubaron a 37 °C por 24 horas. X.1.2 Preparación del Diluyente de Peptona (0,1%) El procedimiento utilizado para la preparación del diluyente es el siguiente: Pesar con precisión 2,0g de peptona de caseína y disolver en 2 L de agua semidestilada. Ajustar el pH a 7,0 ±0,1 UpH con NaOH 1N y con HCL 1N. Distribuir en frascos en volúmenes de 90 ml 44 Fig. 1. Frascos para diluciones. Esterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C). Ver anexo 2. Fig. 2. Autoclave X.1.3 Preparación del medio de doble concentración (Caldo Lactosado) El procedimiento utilizado para la preparación del medio es el siguiente: Pesar 26 g de Caldo Lactosado y disolver en 1 L de agua semidestilada. 45 Fig. 3. Caldo Lactosado Distribuir el medio de doble concentración en volúmenes de 10 ml (5 tubos por muestra) y cada tubo debe contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Esterilizar en autoclave a 394 ± 1k (121±1 °C) durante 15 minutos. Ver anexo 3. X.1.4 Preparación del medio de cultivo de concentración sencilla (Caldo Lactosado). El procedimiento utilizado para la preparación del medio es el siguiente: 46 Pesar 13 g de Caldo Lactosado y disolver en 1 L de agua semidestilada. Distribuir el medio de concentración sencilla en volúmenes de 10 ml (5 tubos por muestra) y cada tubo debe tener un tubo de fermentación invertido (Durham). Esterilizar en autoclave a 394 ± 1k (121±1 °C) durante 15 minutos. Ver anexo 4. X.1.5 Preparación de las diluciones del inóculo de Cepa. El procedimiento utilizado para la preparación del inóculo es el siguiente: Del inóculo de Escherichiacoli, tomar colonias aisladas con un asa estéril y adicionar en un frasco de diluyente de peptona con 90 ml, agitar en ángulos de 45°, 40 veces; esta será la muestra concentrada. Fig. 4. Siembra de Inoculo para diluciones 47 Posteriormente transferir con una pipeta 10 ml de esta dilución a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona y agitar en ángulos de 45° 40 veces; esta será la primera dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45°, 40 veces y esta será la segunda dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45°, 40 veces y esta será la tercer dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45°, 40 veces y esta será la cuarta dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45°, 40 veces y esta será la quinta dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45°, 40 veces y esta será la sexta dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45°, 40 veces y esta será la séptima dilución. X.1.6 Siembra de pruebas presuntivas de la muestra Cepa. El procedimiento utilizado para la siembra es el siguiente: 48 Poner en una gradilla 5 tubos con Caldo Lactosado doble concentración previamente esterilizados y sin burbujas en la campana de Durham. Inocular cada tubo con 10 ml de la muestra concentrada. Poner en una gradilla 30 tubos con caldo lactosado concentración sencilla previamente esterilizados y sin burbujas en la campana de Durham. Inocular 5 tubos con 5 ml de la primer dilución, 5 tubos con 5 ml de la segunda dilución, 5 tubos con 5 ml de la tercer dilución, 5 tubos con 5 ml de la cuarta dilución, 5 tubos con 5 ml de la quinta dilución, 5 tubos con 5 ml de la sexta dilución y 5 tubos con 5 ml de la séptima dilución. Incubar todos los tubos inoculados en incubadora a 35 ±1°C durante 48 horas. Fig.5. Tubos inoculados en incubadora 49 Examinar los tubos una vez transcurridas las 48 horas de incubación y considerar como resultados positivos aquellos que muestren turbidez debida al crecimiento bacteriano y formación de gas en las campanas de Durham. X.1.7Preparación de las diluciones del inoculo de la muestra de agua de PTA. El procedimiento utilizado para la preparación de las diluciones es el siguiente: La muestra concentrada será el agua de la planta de tratamiento de aguas sin ninguna dilución. Posteriormente transferir con una pipeta 10 ml de agua concentrada a un frasco con 90 ml de diluyente de peptona y agitar en ángulos de 45° 40 veces, esta será la primera dilución. De esta dilución transferir 10 ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45° 40 veces y esta será la segunda dilución. De esta dilución transferir 10 Ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45° 40 veces y esta será la tercer dilución. De esta dilución transferir 10 Ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45° 40 veces y esta será la cuarta dilución. 50 De esta dilución transferir 10 Ml a otro frasco con 90 ml de diluyente de peptona, agitar en ángulos de 45° 40 veces y esta será la quinta dilución X.1.8 Siembra de pruebas presuntivas de las dos muestras de agua de PTA. El procedimiento utilizado para la siembra es el siguiente: Poner en una gradilla 5 tubos con Caldo Lactosado doble concentración previamente esterilizados y sin burbujas en la campana de Durham. Inocular cada tubo con 10 ml de la muestra concentrada. Poner en la misma gradilla 10 tubos con Caldo Lactosado concentración sencilla previamente esterilizados y sin burbujas en la campana de Durham. Inocular 5 tubos con 5 ml de la primera dilución y 5 tubos con 5 ml de la segunda dilución. Poner en otra gradilla 15 tubos con Caldo Lactosado concentración sencilla previamente esterilizados y sin burbujas en la campana de Durham. Inocular 5 tubos con 5 ml de la tercera dilución, 5 tubos con 5 ml de la cuarta dilución y 5 tubos con 5 ml de la quinta dilución. Incubar todos los tubos inoculados en incubadora a 35 ±1°C durante 48 horas. 51 Examinar los tubos una vez transcurridas las 48 horas de incubación y considerar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez debida al crecimiento bacteriano y formación de gas en las campanas de Durham. X.1.9Preparación del Caldo Verde Brillante Bilis. El procedimiento utilizado para la preparación del caldo es el siguiente: Pesar con precisión 40,0g de Verde Brillante Bilis y disolver en 1 L de agua semidestilada. Fig. 6. Caldo Verde Brillante Bilis Ajustar el pH a 7,2 ±0,2 UpH con NaOH 1N y con HCL 1N. 52 Distribuir en tubos en volúmenes de 5 ml (2 tubos por tubo positivo en las pruebas presuntivas), cada tubo debe contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Esterilizar en autoclave a 388 ± 1K (115±1°C) durante 10 min. Ver anexo 5. X.1.10 Preparación de Agua de Triptona. El procedimiento utilizado para la preparación del agua es el siguiente: Pesar con precisión 20 g de Triptona y 5 g de Cloruro de Sodio (NaCl). Fig. 7. Triptona Disolver los componentes en 1 L de agua semidestilada y ajustar el pH a 7,5 ± 0,02 UpH. Distribuir en volúmenes de 5 ml (1 tubo por tubo positivo en las pruebas presuntivas). 53 Esterilizar en Autoclave a 388 ± 1K (115±1°C) durante 10 min. Ver anexo 6. X.1.12 Preparación del Reactivo de KOVACS para Indol. El procedimiento utilizado para la preparación del reactivo es el siguiente: Pesar con precisión 5,0 g de 1,4 Dimetilaminobenzaldehído Disolver poco a poco en 75 ml de Alcohol Amílico Agregar cuidadosamente 6,5 ml de Ácido Clorhídrico concentrado (HCl). Ver anexo 7. X.1.13 Preparación del medio de cultivo EC MUG. El procedimiento utilizado para la preparación del medio es el siguiente: Pesar con precisión 37 g del medio de cultivo caldo EC CON MUG. Fig.8. Caldo EC con MUG Disolverlos en 1 litro de agua semidestilada. 54 Ajustar pH a 6,9 ± 0,02 UpH. Distribuir en volúmenes de 5 ml (1 tubo por tubo positivo en las pruebas presuntivas), cada tubo debe contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Esterilizar en Autoclave a 388 ± 1K (115±1°C) durante 10 min. Ver anexo 8. X.1.14 Siembra de pruebas confirmativas para la determinación de Coliformes Totales. Se resembró a partir de cada tubo que dioresultado positivo en las pruebas presuntivas, bajo el siguiente procedimiento: Agitar muy bien cada tubo positivo de las pruebas presuntivas para asegurar la homogenización. Transferir un ml de cada tubo positivo en un tubo de Agua de Triptona para detectar la presencia de Indol y determinar E-Coli, Transferir un ml de cada tubo positivo en un tubo de caldo EC CON MUG y un ml en un tubo de Verde Brillante Bilis para determinar la presencia de Coliformes Totales Transferir un ml de cada tubo positivo en otro tubo Verde Brillante Bilis para la determinación de ColiformesTermotolerantes. 55 Incubar un tubo de Bilis Verde Brillante y un tubo de caldo EC a 37°C por un periodo de 48 horas para la determinación de Coliformes Totales. Incubar un tubo de Bilis Verde Brillante y un tubo de Agua de Triptona a 44°C por 24 horas, para la determinación de ColiformesTermotolerantes y E-Coli respectivamente. Fig. 9. Tubos con Bilis Verde Brillante y Caldo EC Considerar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez debida al crecimiento bacteriano y formación de gas en los tubos internos invertidos (Durham). Fig. 10. Tubos con Bilis Verde Brillante y Caldo EC con crecimiento bacteriano. 56 En el caso del Agua de Triptona, una vez transcurridas las 24 horas de incubación, añadir a cada tubo de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovacs, el desarrollo de un anillo color rojo después de agitar vigorosamente denota la presencia de Indol; si el anillo es amarillo se considera negativo. Fig. 11. Tubos con Agua de Triptona con presencia de Indol. A partir de los tubos que dieron reacciones positivas en los medios de aislamiento y confirmativo, determinar, por medio de tablas estadísticas (anexo 1) o en su defecto con la siguiente formula, el númeromás probable (NMP) de organismos Coliformes Totales, organismos ColiformesTermotolerantes y E-coli presuntiva. 57 XI.Resultados obtenidos A continuación se presenta un conjunto de tablas que muestran los resultados obtenidos en cada una de las pruebas realizadas y para cada parámetro de validación. XI.1 Límite de detección El límite de detección se determinó utilizando la cepa certificada concentrada y haciendo 7 diluciones obteniéndose los siguientes resultados. Tabla 2. Resultados de la prueba presuntiva con la cepa certificada. MUESTRA DILUCIÓN 1 Doble Conc. 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª + + + + + + + - Doble Conc. 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª + + + + + + + - CEPA TUBO 2 3 GRADILLA 1 + + + + + + + + + + + + + + GRADILLA 2 + + + + + + + + + + + + + + GRADILLA 3 58 4 5 + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - Doble Conc. 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - Tabla 3. Resumen de la tabla de resultados de la prueba presuntiva con la Cepa Certificada Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 Dilución Número de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivos Doble Conc. 5 5 5 1ª 5 5 5 2ª 5 5 5 3ª 5 5 5 4ª 5 5 5 5ª 5 5 5 6ª 5 5 5 7ª 0 0 0 59 El método se sometió a prueba utilizando diferentes niveles de concentraciónpartiendo de un tubo de doble concentración,el cual se diluyó hasta obtener el mínimo nivel detectable en la sexta dilución.El NMP por 100 cm3 con un 95% de confianza es de 240 000 000 Unidades Formadoras de Colonias. El límite de detección inferior se presentará cuando en las pruebas presuntivas no se obtenga ningún tubo positivo ni en doble concentración ni en diluciones; en este caso, el NMP por 100 cm3 con un 95% de confianza será < 2 UFC. XI.2 Precisión XI.2.1 Repetibilidad Resultados del ensayo para Repetibilidad del método. Tabla 4. NMP de la prueba presuntiva con la Cepa Certificada. MUESTRA CEPA DILUCIÓN Doble Conc. 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª TUBO 1 2 3 GRADILLA 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 60 4 5 + + + + + + + - + + + + + + + - NMP por 100 cm3 240000000 Concentrada 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª Concentrada 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª GRADILLA 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + GRADILLA 3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Promedio=240 000 000 Desviación Estándar= 0 Coeficiente de Variación (CV %) = 0 61 + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - 240000000 240000000 Gráfica 1. NMP de tres repeticiones. NMP 400000000 300000000 NMP NMP 200000000 100000000 1 2 REPETICIÓN 62 3 Tabla 4. Resultados de las pruebas presuntivas con agua de PTA. TUBO NMP por 100 cm3 Dilución 1 2 3 4 5 Gradilla 1 Doble Conc. + + + + + 1ª + + + + + 2ª + + + + + 3ª + + + + + 4ª + + - - + 5ª + + - - + 1 800 000 Gradilla 2 Doble Conc. + + + + + 1ª + + + + + 2ª + + + + + 3ª + + + + + 4ª + + - + + 5ª - - - - + 1700 000 Gradilla 3 Doble Conc. + + + + + 1ª + + + + + 2ª + + + + + 3ª + + + + + 4ª + - + + - 1800000 63 5ª + - + + - Promedio=1 766 666.667 Desviación Estándar=57 735.027 Coeficiente de Variación (CV %) = 3,26 Gráfica 2. NMP de tres repeticiones NMP 2000000 1900000 1800000 1700000 1600000 NMP 1500000 1400000 NMP 1300000 1200000 1100000 1000000 1 2 3 REPETICIÓN Se obtuvo un coeficiente de variación promedio para la Repetibilidad de 0.0 % para la Cepa y de 3,26% para la muestra de agua se PTAR,esto como resultados de tres ensayos repetidos efectuado en las mismas condiciones por un solo analista, por lo que no hay variación en los resultados en la Cepa y la 64 Variación del agua de PTAR no es significativa pues es menor del 5% por lo tanto el método es repetible. XI.2.2 Reproducibilidad Tabla 5. Reproducibilidad en tres días diferentes Muestra CEPA Día 1 Tubo 1 2 3 4 GRADILLA 1 Doble + + + + Conc. 1ª + + + + 2ª + + + + 3ª + + + + 4ª + + + + 5ª + + + + 6ª + + + + 7ª - - - GRADILLA 2 Doble + + + + Conc. 1ª + + + + 2ª + + + + 3ª + + + + 4ª + + + + 5ª + + + + 6ª + + + + 7ª - - - GRADILLA 3 Doble + + + + Conc. 1ª + + + + 2ª + + + + 3ª + + + + Dilución NMP por 100 cm3 5 Promedio Desv. Est. 240000000 0 + + + + + + + - 240000000 + + + + + + + - 240000000 + + + + 65 240000000 4ª 5ª 6ª 7ª 2 + + + + + + + + + - - GRADILLA 1 Doble + + + Conc. 1ª + + + 2ª + + + 3ª + + + 4ª + + + 5ª + + + 6ª + + + 7ª - - GRADILLA 2 Doble + + + Conc. 1ª + + + 2ª + + + 3ª + + + 4ª + + + 5ª + + + 6ª + + + 7ª - - GRADILLA 3 Doble + + + Conc. 1ª + + + 2ª + + + 3ª + + + 4ª + + + 5ª + + + 6ª + + + 7ª 3 - - - + + + - + + + - + + + + + + + + - + + + + + + - 240000000 + + + + + + + + - + + + + + + - 240000000 240000000 0 240000000 0 + + + + + + + + + + + + + + - - GRADILLA 1 Doble + + + + + Conc. 66 240000000 240000000 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - GRADILLA 2 Doble + + + Conc. 1ª + + + 2ª + + + 3ª + + + 4ª + + + 5ª + + + 6ª + + + 7ª - - GRADILLA 3 Doble + + + Conc. 1ª + + + 2ª + + + 3ª + + + 4ª + + + 5ª + + + 6ª + + + 7ª - - - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + - 240000000 + + + + + + + + - + + + + + + - Promedio de promedio = 240000000 Promedio de desviación estándar=0 Coeficiente de Varianza (%CV)= 0 67 240000000 Discusión de resultados reproducibilidad: Este parámetro se evaluó para determinar la variabilidad de los resultados de la misma prueba realizada en diferentes días por un solo analista, obteniéndose un coeficiente de variación promedio de 0,0%, por lo que no hay variabilidad del método en diferentes días. 68 XI.2.3 INCLUSIVIDAD Resultados de las pruebas confirmativas de agua de PTA Tabla 5. Resultados de las pruebas confirmativas Verde bilis a 44°c Verde bilis a 44°c 1er gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 - - - - - 5 - - - - - Original + + + + + 2 + + + + + 3 - + + + + 4 - - - - - 5 - - - - - Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 - - - - - 5 - - - - - 2ª gradilla 3er gradilla 69 Tabla 6. Resultados de las pruebas confirmativas Verde Bilis a 37°c Verde Bilis a 37°C 1er gradilla 1 2 3 4 5 Orig + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 2ª gradilla 1 2 3 4 5 Orig + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 3er gradilla 1 2 3 4 5 Orig + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 70 Tabla 7. Resultados Pruebas Confirmativas Caldo EC CON MUG A 37°C Caldo ec con mug a 37°c 1er gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 2ª gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 3er gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 71 Tabla 8. Resultados de Agua deTriptona 1 er gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + - + + + 5 - - - - - 2ª gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 - - - - - 3er gradilla 1 2 3 4 5 Original + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + - + + + 5 - - - - - 72 Tabla 9. Número de tubos positivos en pruebas presuntivas y confirmativas en tres repeticiones. Número de tubos positivos Repetición 1 Repetición 2 P. Confirmativas P. Confirmativas E-coli C. Termotolera ntes C. Totales P. Presuntiva E-coli C. Termotolera ntes C. Totales P. Presuntiva E-coli C. Termotolera ntes C.Totales P. Presuntiva Concentración % P. Confirmativas Repetición 3 Doble Conc 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1ª 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2ª 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3ª 5 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5 4ª 5 5 0 4 5 5 0 5 4 4 0 4 5ª 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 La Inclusividad del método fue determinada por medio de las pruebas confirmativas para Coliformes Totales, Termotolerantes, y E coli.La tabla anterior muestra que del total de tubos positivos que resultan de las pruebas presuntivas, casi todos dan positivos también para Coliformes Totales, Termotolerantes, y E coli, obteniéndose una buena sensibilidad para detectar estos microorganismos. 73 XII. Conclusiones y recomendaciones XII.1 Conclusiones En base a los límites de detección definidos se determinaron como rangos de concentración de trabajo de < 2 a 240 000 000 UFC/100 ml, con un límite de confianza del 95%. Los resultados de las pruebas presuntivas y confirmativas indican que el método es eficiente para la detección de Coliformes Totales, Termotolerantesy E. coli en análisis rutinarios de aguas,de manera que se comprobó que el procedimiento funciona confiablemente; ya que modificaciones pequeñas afectan poco o nada el resultado final del análisis. Los resultados del Coeficiente de Variación (CV %) promedio en la Repetibilidad del método para los diferentes niveles de concentración se encuentra dentro del criterio de aceptación, por lo que el método cumple con el parámetro de Repetibilidad de la precisión del método. Para la reproducibilidad del método microbiológico no se observaron cambios significativos en la variabilidad, manteniéndose dentro del criterio de aceptación. El método se encuentra conforme al criterio de variación en los diferentes niveles de concentración en los que se evaluó, por lo que se considera que cumple con la reproducibilidad de la precisión del método. 74 El objetivo particular de elaborar el marco teórico sobre losColiformes Totales y Fecales y lascaracterísticas de la técnica de cuantificación por el número más probable, así como sobre el proceso de validación de un método, se cumplió en su totalidad. El objetivo particular de evaluar los parámetros de validación mediante las pruebas de cuantificación de Coliformes Fecales y Totales por la técnica del número más probable se cumplió para las dos muestras (cepa y agua de PTA). De acuerdo a los resultados obtenidos durante todo el proceso de validación, se concluye que el método del número más probable por la técnica de fermentación en tubos múltiples como herramienta de análisis para el análisis microbiológicos de Coliformes Totales, Fecales y Escherichiacoli en aguas, posee precisión, Inclusividad y exclusividad, por la tanto, se confirma que el método cumple con los requerimientos particulares para su uso y se da como Validado XII.2 Recomendaciones Que el número de repeticiones para determinar precisión sea de al menos cinco,para obtener una comportamiento de los resultados. 75 gráfica más representativa del Que los analistas que realicen el método alternativo del número más probable deben ser personas capacitadas en el manejo y análisis de muestras de agua, para minimizar las variaciones que puedan afectar los resultados. Tomar en cuenta que al realizar las diluciones de las concentraciones del inóculo de microorganismo, se debe utilizar material debidamente esterilizado y exclusivo para cada dilución, evitando la contaminación cruzada entre una dilución y otra, además se debe asegurar una distribución homogénea de cada una de las diluciones,así como de la cepa y de la muestra, para la obtención de resultados satisfactorios. Se debe tener una especial precaución en la manipulación de cepas bacterianas que son potencialmente patógenas,con el fin de reduciral mínimo los niveles de contaminación para el analista (s), el material, el equipo y el medio ambiente; de igual forma, tratar los desechos de forma adecuada con la respectiva esterilización y destrucción de cultivos bacterianos. 76 XIII.BIBLIOGRAFÍA Procedimientos de la empresa. (Impreso) Procedimiento para la determinación de Coliformes 2012. Kurimexicana SA. DE CV. Manuales Manual de Practicas de Laboratorio de Microbiología i y II: Diversidad y Estructura de los Microorganismos 2009. Universidad Autónoma de Guerrero. Normas NMX-AA-042-1987.Calidad de Agua- Determinación del Numero más Probable (NMP) de Coliformes Totales, Coliformes Fecales (Termo tolerantes) y Escherichiacoli presuntiva. Libros Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Cuarta Edición: Mc Graw Hill. Campbell, R. Ecología Microbiana. Primera Edición: Limusa. Freud, J y Simon, Estadística Elemental. Octava Edición: Prentice Hall. Ronald, M. Bartha, R. (2002) Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental.Addison-Wesley Iberoamericana. Internet http://www.nata.asn.au/phocadownload/publications/Guidance_informatio n/tech-notes-information-papers/technical_note_17.pdf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC238768/?page=1 http://www.conagua.gob.mx/CONAGUA07/Noticias/NMX-AA-0421987.pdf http://www.ema.org.mx/portal/index.php 77 XIV.ANEXOS 78 Anexo 1. Índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con porciones de 1cm3 y con 5 porciones de 0.1 cm3. Límite Límite No. de tubos con No. de tubos con Indice reacciones positivas Indice confiable de reacciones positivas del confiable de NMP 95% NMP 95% por por 100 5 tubos 5 tubos 5 tubos 5 tubos 5 tubos 5 tubos con 10 con con con con con cm3 1cm3 0,1cm3 10cm3 1cm3 0.1cm3 0 0 0 <2 0 0 1 2 <0,5 7 4 2 1 0 1 0 2 <0,5 7 4 3 0 2 0 4 <0,5 11 4 100 cm3 del Interi or cm3 Interi Supe or rior 26 9 78 0 27 9 80 3 1 33 11 93 4 4 0 34 12 93 Super ior 1 0 0 2 <0,5 7 1 0 1 4 <0,5 11 5 0 0 23 7 70 1 1 0 4 <0,5 11 5 0 1 31 11 89 79 1 1 1 6 <0,5 15 5 0 2 43 15 110 12 2 0 6 <0,5 15 5 1 0 33 11 93 5 1 1 46 16 120 5 1 2 63 21 150 2 0 0 5 <0,5 13 2 0 1 7 1 17 2 1 0 7 1 17 5 2 0 49 17 130 2 1 1 9 2 21 5 2 1 70 23 170 2 2 0 9 2 21 5 2 2 94 28 220 2 3 0 12 3 28 5 3 0 79 25 170 5 3 1 110 31 250 5 3 2 140 3 340 3 0 0 8 1 19 3 0 1 11 2 25 3 1 0 11 2 25 5 3 3 180 44 500 3 1 1 14 4 34 5 4 0 130 35 300 3 2 0 14 4 34 5 4 1 170 43 490 3 2 1 17 5 46 5 4 2 220 57 700 3 3 0 17 5 46 5 4 3 280 90 850 80 1000 4 0 0 13 3 31 5 4 4 350 120 0 4 0 1 17 5 46 5 5 0 240 68 750 4 1 0 17 5 46 5 5 1 350 120 1000 4 1 1 21 7 63 5 5 2 540 180 1400 4 1 2 26 9 78 5 5 3 920 300 3200 4 0 0 22 7 67 5 5 4 640 5800 160 0 81 Anexo 2 Preparación de Diluyente de Peptona Pesar 2,0 g de Peptona de Caseina Disolver en 2 L de agua semidestilada Ajustar pH a 7,0 ±0,1 UpH con NaOH 1N y con HCL 1N. Distribuir en frascos en volúmenes de 90 ml Esterilizar en autoclave a 394 ± 1K (121 ± 1°C) por 15 min. 82 Anexo 3 Preparación del medio de doble concentración (Caldo Lactosado) Pesar 26 g de Caldo Lactosado Disolver en 1 L de agua semidestilada Distribuir en volúmenes de 10 ml contubo Durham. Esterilizar en autoclave a 394 ± 1K (121 ± 1 °C) por 15 min. 83 Anexo 4 Preparación del medio de cultivo de concentración sencilla (Caldo Lactosado) Pesar 13 g de Caldo Lactosado Disolver en 1 L de agua semidestilada Distribuir en volúmenes de 10 ml contubo (Durham). Esterilizar en autoclave a 394 ± 1K (121 ± 1 °C) por 15 min popo durante 15 minutos. 84 Anexo 5 Preparación del Caldo Verde Brillante Bilis. Pesar 40 g de Verde Brillante Bilis Disolver en 1 L de agua semidestilada Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 UpH con NaOH 1N y con HCL 1N. Distribuir en volúmenes de 5 ml contubo Durham. Esterilizar en autoclave a 388 ± 1K (115 ± 1 °C) por 10 min. 85 Anexo 6 Preparación de Agua de Triptona Pesar 20 g de Triptona y 5 g de NaCl Disolver en 1 L de agua semidestilada Ajustar el pH a 7,5 ± 0,02 UpH con NaOH 1N y con HCL 1N. Distribuir en volúmenes de 5 ml. Esterilizar en autoclave a 388 ± 1K (115 ± 1 °C) por 10 min. 86 Anexo 7 Preparación del Reactivo de KOVACS para Indol Pesar 5,0 g de 1,4 Dimetilaminobenzaldehído Disolver en 75 ml de Alcohol Amílico Agregar cuidadosamente 6,5 ml de Ácido Clorhídrico (HCl) 87 Anexo 8 Preparación del medio de cultivo EC MUG. Pesar 37 g de caldo EC con MUG. Disolver en 1 L de agua semidestilada Ajustar el pH a 6,9 ± 0,02 UpH con NaOH 1N y con HCL 1N. Distribuir en volúmenes de 5 ml con un tubo Durham Esterilizar en autoclave a 388 ± 1K (115 ± 1 °C) por 10 min. 88 89
