Rodríguez, Ana María. 2010 - Biblioteca Digital de la Facultad de

Relevancia de la inmunidad celular subtipo
específica en el desarrollo de estrategias de
vacunación frente a VIH-1
Rodríguez, Ana María
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis
Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
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Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Universidad de Buenos Aires
Facult ad de Ciencias Exact as y Nat urales
Depart am ent o de Quím ica Biológica
Relevancia de la I nm unidad Celular Subt ipo
Específica en el Desarrollo de Est rat egias de
Vacunación frent e a VI H- 1
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el
área de Química Biológica
Licenciada Ana María Rodríguez
Direct or de t esis:
Doctora María Magdalena Gherardi
Consej ero de est udios:
Doctor Félix Coulombie
Lugar de Trabaj o: Cent ro Nacional de Referencia para el SI DA
Depart am ent o de Microbiología, Parasit ología e
I nm unología.
Facult ad de Medicina. Universidad de Buenos Aires
Buenos Aires, Marzo de 2010
Resum en
Relevancia de la I nm unidad Celular Subt ipo Específica en el Desarrollo de
Est rat egias de Vacunación frent e a VI H- 1
Han pasado casi 30 años de la det ección de los prim eros casos de VI H- 1 y aún no se ha
conseguido desarrollar una vacuna efect iva y segura. La epidem ia de VI H en Argent ina est á
caract erizada por una alt a prevalencia de infecciones causadas por virus pert enecient es al
subt ipo B y form as recom binant es circulant es BF ( CRF12_BF) . A pesar de la am plia gam a de
t rabaj os dedicados a la caract erización de la respuest a inm une y al desarrollo de vacunas
frent e a VI H, no queda claro cuál es el im pact o de la variabilidad en la elección del ant ígeno.
Nef es una de las prot eínas virales elegida com o ant ígeno en los ensayos clínicos y preclínicos para vacunas. En est e t rabaj o de Tesis, Nef fue usada com o una herram ient a para
evaluar la im port ancia de las variant es recom binant es BF de VI H en el diseño de fut uras
vacunas. Vect ores de ADN, MVA y VV que expresan NefBF y NefB fueron generados y
caract erizados. Luego de la inm unización en rat ones Balb/ c con una dosis sim ple de ADN
seguida por ot ra de MVA, se encont ró que NefBF generó una respuest a alt am ent e específica
sin det ect arse react ividad cruzada frent e a Nef del subt ipo B. Sin em bargo, luego de aplicar
un esquem a de inm unización m ás ext enso ( t res dosis de ADN m ás una dosis de MVA) se
induj o una respuest a específica m ayor, acom pañada con el aum ent o de la react ividad
cruzada frent e a B, aunque de m enor m agnit ud que frent e al ant ígeno hom ólogo NefBF. Por
ot ro lado, al aplicar el vect or VVnefBF se obt uvo una respuest a específica cerca de t res
veces m ayor que con MVA, pero con el m ism o grado de react ividad cruzada; m ient ras que
la inm unización con VVnefB generó una respuest a de m enor m agnit ud, pero con m ayor
grado de react ividad cruzada cont ra NefBF. La aplicación de I L- 12 y GM- CSF desde vect ores
de ADN ( com o m oléculas adyuvant es) aum ent ó la respuest a hast a seis veces, al aplicarse
por separado, y 14 veces al aplicarse j unt as. Est e nivel de respuest a perm it ió caract erizar
los epít opes de m ayor inm unogenicidad. Est os result ados son de crucial im port ancia para el
desarrollo de una fut ura vacuna para nuest ra región, indicando que ant ígenos de est as
variant es virales BF deberían ser considerados en el diseño de las m ism as.
2
Abst ract
Relevance of Subt ype Specific Cellular I m m unit y in t he Developm ent of
Vaccinat ion St rat egies against HI V- 1
Abst ract
I t has been alm ost 30 years since t he det ect ion of t he first HI V- 1 cases and yet an
effect ive and safe vaccine has not been developed. The HI V epidem ic in Argent ina is
charact erized by t he high prevalence of infect ions caused by subt ype B and BF variant s.
Despit e t he wide range of publicat ions on t he im m une response against HI V and t he
vaccine developm ent effort , t he im pact of variabilit y on vaccine ant igen select ion is st ill
unclear. Nef is a viral prot ein t hat has been select ed as ant igen in clinical and pre- clinical
vaccine t rials. I n t his t hesis, Nef prot ein was used as a t ool t o st udy t he im pact of HI V- 1
BF variant s on t he design of fut ure vaccines. DNA, MVA and VV vect ors expressing Nef
from t he CRF12_BF recom binant form or from subt ype B of HI V- 1 were generat ed and
charact erized. Aft er t he adm inist rat ion of single DNAprim e/ MVAboost im m unizat ion
schedules in Balb/ c m ice, it was found t hat NefBF delivered from t hese vect ors generat ed
a response of high specificit y wit hout cross- react ivit y against subt ype B. But , when a
m ore pot ent response was induced aft er 3 prim ing DNA doses and a boost er wit h MVA
recom binant virus, cross- react ivit y against NefB was det ect ed, alt hough of lower
m agnit ude t han t he NefBF specific response. Furt herm ore, t he applicat ion of VVnefBF
vect or generat ed a nearly t hree- fold enhanced im m une response t han t he schedule using
MVA, but wit h t he sam e level of low cross- react ivit y, whereas im m unizat ion wit h VVnefB
generat ed a slight ly lower response, but wit h a great er cross- react ivit y against NefBF.
The applicat ion of I L- 12 or GM- CSF as m olecular adj uvant s increased t he specific
response by six- fold, and 14- fold when t hey were applied t oget her. This level of response
allowed t he charact erizat ion of t he m ost im m unogenic epit opes. These result s will be
pivot al for HI V vaccine design in our region, indicat ing t hat ant igens from t hese viral
variant s should be considered for a fut ure vaccine.
3
Agradecim ient os
La m ayoría del t iem po, uno pasa por la vida sin decirle gracias a la gent e que siem pre
est á. Poner el t rabaj o de años sobre un papel, o m uchos papeles, da la oport unidad de
plasm ar los gracias que no se dij eron en su m om ent o.
Para em pezar, gracias a la gent e que siem pre est uvo, desde el principio de la vida:
m am á y papá, por la confianza y el respet o que siem pre hubo, por perm it irm e llegar
hast a donde llegué, porque sin ust edes no se podía. Mis herm anos ( enanos! ) y
herm anas, m om ent os com part idos de largas m esas dom ingueras. Mis abuelas, t íos,
prim s.
Am igas ent rañables que la vida dej a, las m ás viej as: Flor ( ya van casi 15! ) , Fer ( y I ara) ,
Yani; la m ás nueva: Nori.
Ot ras cosas que uno consigue en la Facu ( adem ás del t ít ulo) : Vero ( com o no, m iles de
gracias! ) , m am á Massaldi ( y Lara, porsupu) , Noe, Fa.
Los del lab: m i hij a Luli ( t e llevam os a la luna de m iel) , Ana C ( y Clarit a) , Nat y, Flor, m i
ot ra hij a Nanu, Andy R, Mauri, Sandra, Rit a, y t oda la banda que anda por los pasillos día
t ras día. Los que ya no est án en el lab, pero quedan: Rena, Gus, Lupe, Guille.
Todos los t écnicos, que facilit an día a día el t rabaj o.
Y la gent e m ás involucrada con est o… la gent e que si no hubieran est ado, yo no hubiera
llegado a t erm inar de recorrer est e largo cam ino:
Gracias Magda, por darm e un lugar y por enseñarm e gran part e de lo que hoy sé.
Gracias por confiar en m í.
Gaby, que puedo decir, has sido m ás que m i segunda aut ora, o j ust am ent e… Gracias por
t odo! Pero m ás que nada, gracias por t u am ist ad!
Fer, que va a ser de m í sin vos??! Gracias nena, vos sí sabes escuchar, com prender y
aconsej ar… y aunque t e corra, com o un cuet e en el lab, t e voy a ext rañar m ucho.
Juli,
la
m ás
pequeña… gracias
por
est os
últ im os,
pero
prim eros,
m eses
de
com pañerism o.
Horacio, gracias por perm it irm e t rabaj ar en el CNRS.
La gent e del I NTA: Gaby y Flor, Osvaldo Zabal y equipo por la preparacion de los cult ivos
de CEF.
José Luís y Mariano, que desde España siem pre est án present es.
A t odos los pacient es que colaboraron con est e t rabaj o.
Juan, gracias am or por ser m i cable a t ierra, por escucharm e ( aunque a veces pongas
off… no t e culpo) . Gracias por t odo lo que m e das. Gracias por com part ir conm igo est os
cuat ro años.
A m a m á , a pa pá …
A Jua n .
Í ndice
List a de Figuras y Tablas
10
Figuras
10
Tablas
11
Abreviat uras
12
I nt roducción
13
1 . La Epide m ia de VI H / SI D A
14
1.1. I nicios del VI H/ SI DA
14
1.2. Sit uación Epidem iológica Act ual
15
1.2.1. La Epidem ia en el Mundo
15
1.2.2. La Epidem ia en Argent ina
16
2 . El Vir u s
17
2.1. Est ruct ura
17
2.2. Genom a
18
2.3. Ciclo de Replicación Viral
19
2.4. Nef
22
2.5. Pat ogenia
23
2.6. Filogenia y Epidem iologia Molecular
25
3 . Un a va cu n a
28
3.1. Diseño Racional de Vacunas para VI H
28
3.2. I m port ancia de la Variabilidad en el Desarrollo de una Vacuna
30
3.3. Selección de Ant ígenos
31
3.4. Est rat egia “ Prim e- boost ”
33
3.5. Vect ores Poxvirus
35
3.5.1. Ciclo de Replicación
35
3.5.2. MVA: Virus Vaccinia Ankara Modificado ( Modified Vaccinia Virus Ankara)
38
3.6. Adyuvant es
39
Obj et ivos
41
Mat eriales & Mét odos
42
1 . Re a ct ivos Biológicos
43
1.1. Virus
43
1.2. Líneas Celulares y cult ivos prim arios
43
1.3. Generación de los Vect ores de ADN que Port an NefBF y NefB
44
1.4. Generación de los Virus Recom binant es
46
1.5. Cont roles de Pureza e I nt egridad de los Virus Recom binant es
48
1.5.1. PCR Diferencial
49
1.5.2. PCR Convencional
49
1.6. Caract erización
50
1.6.1. Est abilidad del Vect or Recom binant e MVAnefBF
50
1.6.2. Cinét ica de Crecim ient o de los Virus Recom binant es
51
6
Í ndice
1.6.3. Cinét ica de Expresión en el Tiem po de Nef a part ir de los Vect ores Virales
51
2 . I n m u n iz a cion e s y M a n e j o de An im a le s
51
2.1. St ocks Virales para I nm unizaciones
51
2.2. Preparación del ADN para I nm unizar
52
2.3. Prot ocolos de I nm unización
52
2.4. Tom a de Muest ra
52
2.4.1. Bazos
53
2.4.1.1. Obt ención de Esplenocit os
53
2.4.1.2. Criopreservación de Esplenocit os
53
2.4.2. Sueros
53
2.4.3. Ovarios
53
3 . M a n e j o de m u e st r a s H u m a n a s
54
3.1. Tom a de Muest ra
54
3.2. Criopreservación de PBMC
54
3.3. Análisis Filogenét ico
54
4 . Té cn ica s I n m u n ológica s
55
4.1. West ern Blot
55
4.2. I nm unofluorescencia
4.3. Cuant ificación de Células Secret oras de I FN- γ por ELI SPOT
56
4.3.1. Est ím ulos
56
4.3.2. ELI SPOT Murino
58
4.3.2.1 ELI SPOT FRESCO
59
4.3.2.2 ELI SPOT DI RECTO
59
4.3.2.3. ELI SPOT Específico para Vaccinia
59
4.3.2.4. ELI SPOT Expandido
59
4.3.3. ELI SPOT Hum ano
59
4.4. Cuant ificación de Producción de Cit oquinas por ELI SA
60
4.5. Cuant ificación de Ant icuerpos Específicos a part ir de Sueros de Rat ones I nm unizados
60
4.5.1. Tit ulación de Ant icuerpos I gG para Vaccinia
60
4.5.2. Tit ulación de Ant icuerpos I gG2a para NefBF y NefB
61
5 . Té cn ica s Vir ológica s
61
5.1. Tit ulación de los St ocks Virales
61
5.1.1. Tit ulación por Tinción con Crist al Violet a
62
5.1.2 Tit ulación por I nm unot inción
62
5.2. Tit ulación de Ant icuerpos Neut ralizant es de Vaccinia
62
6 . An á lisis de los D a t os
62
Result ados
64
Re su lt a dos I : Re a ct ivos Biológicos
65
1 . Ge n e r a ción de Re a ct ivos Biológicos
65
1.1. Const rucción de los Vect ores de Tr ansferencia para Vaccinia: pJRnefBF y pJRnefB
65
1.2. Generación y Purificación de los Virus Recom binant es
66
56
7
Í ndice
1.2.1. MVAnefBF
66
1.2.2. Virus Recom binant es Basados en la Cepa West ern Reserv e del Virus Vaccinia
67
2 . Ca r a ct e r iza ción de los Re a ct ivos Biológicos
68
2.1. Vect ores ADN
68
2.1.1. Caract erización de la Expresión de NefBF y NefB a part ir de los Vect ores de ADN
68
2.2. Vect ores Virales
69
2.2.1. Est abilidad del Vect or Recom binant e MVAnefBF
69
2.2.2. Cinét ica de Crecim ient o de los Virus Recom binant es
71
2.2.3. Cinét ica de Expresión de Nef desde los Virus Recom binant es en Diferent es Líneas
73
Celulares
Re su lt a dos I I : I n m u n oge n icida d de N e fBF
77
1 . Ca r a ct e r iz a ción de la I n m u n oge n icida d de N e fBF e n Ra t on e s
77
1.1. Respuest a Celular I nducida luego de la I nm unización con los Vect ores ADN y MVA
77
1.2. Respuest a Celular Dirigida frent e a las Prot eínas del Vect or Viral
78
1.3. Tres Dosis de ADN en el Prim e I ncrem ent a Significat ivam ent e el Efect o Boost de MVA
80
2 . Re a ct ivida d Cr u za da fr e n t e a N e fB
81
2.1. React ividad Cruzada frent e a Pépt idos de Nef Pert enecient e al Subt ipo B
81
2.2. Secreción de Ot ras Cit oquinas
82
3 . I n m u n oge n icida d de los Ve ct or e s Vir a le s Ba sa dos e n la Ce pa W R de Va ccin ia
84
3.1. I nm unogenicidad de los Vect ores VV
84
3.2. Secreción de Ot ras Cit oquinas
86
3.3. Respuest a I nm une Hum oral
86
4 . Uso de Adyu va n t e s
89
4.1. Respuest a Tot al
90
4.2. I dent ificación de Pépt idos I ndividuales
91
4.2.1. Uso de Mat rices
91
4.2.2. Confirm ación de Pépt idos
93
4.2. Modelo de I nfección Viral
96
4.2.1. Puest a a Punt o del Modelo de Desafío
96
4.2.2. Desafío
96
Re su lt a dos I I I : Re con ocim ie n t o por Pa cie nt e s VI H + de la s Se cu e n cia s Ut iliza da s
99
1 . Ca r a ct e r íst ica s de los Pa cie n t e s VI H + Ut iliz a dos e n e l En sa yo
99
1.1. Pacient es
99
1.2. Secuenciación y Filogenia
100
2 . Re spu e st a I n m u n e Ce lu la r fr e nt e a los Pé pt idos N e fBF y N e fB e n Pa cie n t e s
102
VI H +
Discusión
104
1 . Re a ct ivos Biológicos
108
2 . I n m u n oge n icida d de N e fBF
109
3 . Re spu e st a e n Pa cie n t e s
116
4 . Pr oye ccion e s
117
8
Í ndice
Conclusiones
119
Bibliografía
122
Anexos
131
Anexo 1: Aprobación del Com it é I ndependient e de Ét ica en I nvest igación ( CI EI - FM- UBA)
132
Anexo 2: Trabaj o Cient ífico Publicado a part ir de est a Tesis
133
9
List a de Figuras y Tablas
Figu r a s
I nt roducción
Figura 1: Fot o de una de las prim eras m icroscopias elect rónicas de linfocit os produciendo
14
VI H
Figura 2: Est ruct ura del virión de VI H
17
Figura 3: Genom a viral y principales funciones de las diferent es prot eínas virales
19
Figura 4: Ciclo de replicación viral de VI H
21
Figura 5: Hist oria Nat ural de la infección por VI H
24
Figura 6: Dist ribución m undial de los subt ipos y form as recom binant es
26
Figura 7: Genom a de CRF12_BF
27
Figura 8: Est rat egia de vacunación prim e- boost
34
Figura 9: Microscopia elect rónica del virus Vaccinia
35
Figura 10: Ciclo de replicación viral del virus Vaccinia
37
Mat eriales & Mét odos
Figura 11: Esquem a repr esent at ivo de las est rat egias usadas par a subclonar nefBF y nefB
45
Figura 12: Esquem a del pr ocedim ient o de obt ención de virus recom binant e
47
Figura 13: Esquem a del gen recom binant e nefBF insert o en el locus viral HA
49
Result ados
Result ados I :
Figura 14: Tam izaj e por digest ión del ADN y liberación del insert o
65
Figura 15: Análisis de Pureza y expresión del gen recom binant e en los clones de MVAnefBF,
67
VVnefBF y VVnefB
Figura 16: Expresión de NefBF y B a part ir de los vect ores de ADN
69
Figura 17: Análisis de la est abilidad del MVAnefBF
70
Figura 18: Cinét ica de crecim ient o de los vect ores virales recom binant es
71
Figura 19: Form ación de placas de lisis at ípicas en el VVnefBF
72
Figura 20: Expresión de Nef a part ir de los virus recom binant es
74
Result ados I I :
Figura 21: I nm unogenicidad los vect ores ADN NefBF y MVAnefBF
78
Figura 22: Respuest a celular y hum oral inducida frent e a ant ígenos del vect or
79
Figura 23: Tr es dosis de ADN en el prim e increm ent a significat ivam ent e el efect o boost de
80
MVA
Figura 24: React ividad Cruzada frent e al subt ipo B
82
Figura 25: Secreción de I L- 2 y TNF frent e a pépt idos hom ólogos o het erólogos
83
Figura 26: I nm unogenicidad de los vect ores VV
85
Figura 27: Secreción de TNF frent e a pépt idos hom ólogos o het erólogos
86
10
List a de Figuras y Tablas
Figura 28: Respuest a inm une hum oral frent e a la prot eína Nef en los anim ales inm unizados
87
con los dist int os esquem as cont eniendo VV recom binant es
Figura 29: Análisis de las secuencias reconocidas
88
Figura 30: Uso de I L- 12 y GM- CSF com o adyuvant es
90
Figura 31: I dent ificación de pépt idos individuales
92- 93
Figura 32: Confirm ación de pépt idos individuales
94
Figura 33: Análisis de las secuencias reconocidas
95
Figura 34: Modelo de desafío
97
Result ados I I I :
Figura 36: Filogenia de las secuencias de Nef pert enecient e a los pacient es
101- 102
Figura 37: Reconocim ient o de los pooles de pépt idos de NefBF y NefB por PBMC de
103
pacient es VI H+
Discusión
Figura 38: Hipot ét ico curso de la infección por VI H en personas vacunadas
106
Figura 39: Dom inios est ruct urales de Nef
113
Ta bla s
I nt roducción
Tabla 1: Resum en de la epidem ia de SI DA en el m undo
15
Tabla 2: Resum en de las caract eríst icas virales que dificult an el desarrollo de una vacuna
28
frent e a VI H
Tabla 3: Resum en de ensayos clínicos en curso
32
Mat eriales y Mét odos
Tabla 4: Secuencia de cebadores ut ilizados en las dist int as PCRs.
48
Tabla 5: Condiciones de ciclado de las dist int as PCRs
50
Tabla 6: Hom ología ent re las secuencias ut ilizadas en est e t rabaj o de t esis
57
Tabla 7: Diseño de m at rices para la det erm inación de pépt idos inm unogénicos
57
Result ados
Result ados I :
Tabla 8: Dat os de los porcent aj es de placas pequeñas y regulares
73
Result ados I V:
Tabla 9: Caract eríst icas de lo dadores de sangr e
100
11
Abreviat uras
aa: am inoácidos
MHC I / I I : Com plej o Mayor de Hist ocom pat ibilidad
Ac: Ant icuerpo
t ipo I y I I
AcMo: Ant icuerpo m onoclonal
MOI : Mult iplicidad de I nfección ( Mult iplicit y of
AcN: Ant icuerpo Neut ralizant e
I nfect ion)
AcPo: Ant icuerpo policlonal
MVA: Vaccinia Ankara Modificado ( Modified
Ad: Adenovirus
Vaccinia Ankara)
ADN: Ácido desoxirribonucleico
LTR: Term inaciones largas repet idas ( Long
ADNds: Ácido Desoxirribonucleico doble cadena
Term inal Repeat )
ARN: Ácido ribonucleico
PBMC: Células m ononucleares de sangre periférica
ARV: Ant irret roviral
( Peripheral Blood Mononuclear Cells)
CD: Clast er de diferenciación ( Clust er
PBS: Solución t am ponada de fosfat os ( Phosphat e
Diferent at ion)
Buffer Saline)
CEF: Cit om egalovirus hum ano, virus Epst ein Barr
PCR: Reacción en cadena de la polim erasa
y virus I nfluenza
( Polym erase Chain React ion)
CN: Cont rol Negat ivo
pi: post infección
CPA: Célula Present adora de Ant ígeno
PMA: Forbol 12- m irist at o 13- acet at o
CRF: Form as recom binant es circulant es
rpm : revoluciones por m inut o
( Circulat ing Recom binant Form s)
SFB: Suero Fet al Bovino
CTL: Linfocit os T cit ot óxicos CD8+ ( Cyt ot oxic
SFU: Unidades form adoras de spot s ( Spot
+
CD8 T Lym phocyt es)
Form ing Unit s)
DAB: 3.3- diam inobenzidine t et rahydrochloride
SI DA: Síndrom e de I nm unodeficiencia Adquirido
DMSO: Dim et ilsulfóxido
SI V: Virus de la inm unodeficiencia de sim ios
dNTP: didesoxinucleót idos t rifosfat o
( Sim ian I m m unodefiency Virus)
D.O.: Densidad Ópt ica
TA: Tem perat ura Am bient e
DS: Desvío Est ándar
TARV: Terapia Ant irret roviral
VI H: Virus de la I nm unodeficiencia Hum ana
TBS: Solución de Tris ( Tris Buffered Saline)
( Hum an I m m unodeficiency Virus)
TNF: Fact or de Necrosis Tum oral ( Tum or necrosic
hpi: horas post - infección
fact or)
hr: hora
UDI : Usuario de Drogas I nyect ables
HRP: Peroxidasa de Rabanit o ( horseradish
UFP: Unidades Form adoras de Placas
peroxidase)
URF: Form as recom binant es únicas ( Unique
HSH: Hom bres que t iene sexo con hom bres
Recom binant Form s)
I FN: I nt erfer ón
VV: Virus Vaccinia
I L: I nt erleuquina
VVr: Virus Vaccinia recom binant e
KDa: Kilodalt ons
WB: West ern Blot
Kb: Kilobases
WR: West ern Reserve
Kpb: kilo pares de bases
12
I nt roducción
I nt roducción
1 . La Epide m ia de VI H / SI D A
1.1. I nicios del VI H/ SI DA
En 1981 se observaron, en California y Nueva York, varios casos de hom bres que
t enían sexo con hom bres ( HSH) con infecciones oport unist as, com o neum onía causada
por Pneum ocyst is carinii ( hoy denom inado Pneum ocyst is j irovesi) , o Sarcom a de Kaposi,
así com o linfoadenopat ias inexplicablem ent e persist ent es. Poco t iem po después, est os
sínt om as t am bién com enzaron a det ect arse en ot ros grupos poblacionales, com o los
hem ofílicos t ransfundidos y personas het erosexuales, observándose que los individuos
que padecían est e t ipo de enferm edades m ost raban una dism inución m arcada de los
linfocit os T CD4 + . Se denom inó a est e conj unt o de sínt om as com o Síndrom e de
I nm unodeficiencia Adquirida ( SI DA) [ 1] .
En 1983, el grupo francés liderado por Luc Mont agnier y Françoise Barré- Sinoussi,
describieron, por prim era vez, la relación ent re un ret rovirus y el SI DA, descubrim ient o
que los llevó, en 2008, a recibir el m áxim o galardón de la ciencia: el Prem io Nobel de
Medicina [ 2] . Tiem po después, est e virus fue llam ado Virus de la I nm unodeficiencia
Hum ana ( VI H o en inglés: HI V, Hum an I m m unodeficiency Virus) ( Figura 1) .
Figu r a 1 : Fot o de u n a
de la s pr im e r a s
m icr oscopia s
e le ct r ón ica s de
lin focit os pr odu cie n do
VI H . En el apart ado se
m uest ran varios est ados
de part ículas virales
brot ando de la superficie
celular [ 2] .
Act ualm ent e, el VI H/ SI DA const it uye una de las m ayores problem át icas para los
países en vías de desarrollo, donde es difícil el acceso a la t erapia ant irret roviral ( TARV) .
En est os países m enos de un t ercio de la población que necesit a t erapia t iene acceso a la
m ism a.
Com o ocurre con ot ras epidem ias, para erradicar al virus exist en dos posibilidades:
- curar a los pacient es infect ados: Est o aún no se ha logrado debido a la exist encia
de células reservorio de virus, donde ni el sist em a inm une ni las drogas ant irret rovirales
( ARV) son capaces de act uar;
14
I nt roducción
- evit ar
las
nuevas
infecciones:
Est o
sería
posible
con
un
cam bio
en
el
com port am ient o en la población, es decir, la concient ización del uso de condones, la
ut ilización de TARV com o profilaxis para prevenir la t ransm isión vert ical, ent re ot ras.
Pero indudablem ent e, la m ej or opción para evit ar las nuevas infecciones sería cont ar con
una vacuna segura y efect iva [ 3] .
A pesar de los esfuerzos de t oda la com unidad cient ífica aún no se ha conseguido
est e obj et ivo. El desarrollo de una vacuna se ve dificult ado por el hecho de que el virus
se int egra al genom a de la célula huésped y posee una t asa de m ut ación elevada, lo que
le perm it e escapar const ant em ent e de la presión del sist em a inm une ( celular y hum oral)
[ 3] .
1.2. Sit uación Epidem iológica Act ual
1.2.1. La Epidem ia en el Mundo:
Luego de 29 años del inicio de la epidem ia, m ás de 60 m illones de personas se han
infect ado con el virus y m ás de la m it ad han fallecido por est a causa [ 3] . Según el últ im o
inform e de la Organización de las Naciones Unidas para la lucha cont ra el SI DA [ 4] el
núm ero est im ado de personas infect adas con VI H en el m undo alcanzó los 33,4 m illones
[ 31,1–35,8 m illones] a fines de 2008 ( Tabla 1) . Cada día, m ás de 6800 personas se
infect an con VI H y m ás de 5700 fallecen a causa del SI DA, en la m ayoría de los casos,
debido a un acceso inadecuado a los servicios de prevención y t rat am ient o.
Ta bla 1 : Re su m e n de la e pide m ia de SI D A e n e l m u n do [ 4] .
Resum en m undial de la epidem ia de SI DA - Diciem bre de 2008
Personas que vivían con el VI H en 2008
Tot al 33,4 m illones [ 31,1–35,8 m illones]
Adult os 31,3 m illones [ 29,2–33,7
m illones]
Muj eres 15,7 m illones [ 14,2–17,2
m illones]
Niños* 2,1 m illones [ 1,2–
2,9 m illones]
Nuevas infecciones por el VI H en 2008
Tot al 2,7 m illones [ 2,4–3,0 m illones]
Adult os 2,1 m illones [ 1,4–3,6 m illones]
Niños 420.000 [ 350.000–540.000]
Defunciones causadas por el SI DA en 2008
Tot al 2 m illones [ 1,7–2,4 m illones]
Adult os 1,7 m illones ( 1,4- 2,1 m illones)
Niños 280.000 ( 150.000–410.000)
* Niños m enor es de 15 años
15
I nt roducción
El núm ero t ot al de personas que viven con el VI H est á aum ent ando con el pasar de
los años, aunque la prevalencia m undial ( porcent aj e de personas infect adas por el virus)
de la infección por el VI H se m ant iene en el m ism o nivel. Est o se debe a la acum ulación
cont inua de nuevas infecciones con períodos m ás prolongados de supervivencia y al
const ant e crecim ient o de la población. De t odas form as, exist en reducciones localizadas
en la prevalencia en países específicos. En los últ im os años se ha observado una
reducción en la m ort alidad asociada al VI H, at ribuible al recient e aum ent o en el acceso al
t rat am ient o; lo que t am bién t iene com o consecuencia una reducción del núm ero de
nuevas infecciones anuales a nivel m undial.
A pesar de los dat os alent adores, la pandem ia del VI H sigue const it uyendo uno de
los desafíos m ás im port ant es en enferm edades infecciosas para la salud pública.
1.2.2. La Epidem ia en Argent ina:
La epidem ia de VI H/ SI DA sigue dos pat rones generales:
- epidem ias
generalizadas
en
las
poblaciones
de
m uchos
países
de
África
subsahariana, en especial en la part e m eridional del cont inent e.
- epidem ias en el rest o del m undo que se concent ran principalm ent e ent re las
poblaciones de m ayor riesgo, com o los hom bres que t ienen sexo con hom bres ( HSH) ,
usuarios de drogas inyect ables ( UDI ) y profesionales del sexo.
En Argent ina, la epidem ia sigue ést e últ im o pat rón, est im ándose en 120.000 el
núm ero de personas infect adas [ 80.000- 220.000] [ 5] , aunque sólo
67.245 casos se
habían not ificado hast a diciem bre de 2007 [ 6] , de las cuales 35.572 han desarrollado en
algún m om ent o una enferm edad m arcadora de SI DA. La m ayoría de las personas
infect adas con VI H se encuent ran en las provincias de Buenos Aires, Córdoba y Sant a Fe.
La razón hom bre/ m uj er de las not ificaciones a nivel nacional ha sido 1,7 en 2007,
habiendo descendido levem ent e con respect o a 2001 ( 1,9) [ 6] .
En los últ im os años, las relaciones het erosexuales no prot egidas se han convert ido
en la principal vía de t ransm isión del VI H, siendo el 48% de las not ificaciones m asculinas
y el 84,5% de las fem eninas en el período de 2005 a 2007 [ 6] . El uso de drogas
inyect ables, que había sido un fact or im port ant e en el inicio de la epidem ia en Argent ina,
ha dism inuido durant e la últ im a década, siendo el 8,5% de las not ificaciones m asculinas
y el 2,5% de las fem eninas en est e m ism o periodo [ 6] . Sin em bargo, com o en ot ros
países sudam ericanos, la prevalencia m áxim a de VI H se ha regist rado en grupos de
riesgo com o est e ( UDI s) y HSH, que alcanzaron a t ener, en Buenos Aires ent re 2000 y
2001, una prevalencia de 0.44 y 0.14, respect ivam ent e [ 7, 8] .
16
I nt roducción
2 . El vir u s
2.1. Est ruct ura:
El virus de la inm unodeficiencia hum ana pert enece a la fam ilia Re t r ovir ida e ,
subfam ilia Ort horet rovirinae, género Lent ivirus [ 9] . Los lent ivirus son virus com plej os
caract erizados por la m orfología del virión con núcleo ( core) cilíndrico o cónico [ 10] . Al
igual que el rest o de los virus de est a fam ilia, la part ícula viral m adura es una part ícula
esférica, envuelt a por una m em brana lipídica, de aproxim adam ent e 100 a 120 nm de
diám et ro ( Figura 2) . La cápside const a de 60 caras t riangulares form adas por la prot eína
est ruct ural p17 ( MA, m at riz) . Dent ro de la m ism a se encuent ra la nucleocápside,
const it uida por la prot eína p24 ( CA, cápside) , que cont iene el genom a viral. Asociadas al
m ism o se encuent ran las prot eínas p7 ( NC, nucleocápside) y la t ranscript asa reversa ( TR,
Reverse Transcript ase) . Ot ras prot eínas est ruct urales incluyen a las prot eínas accesorias
Nef y Vpr, a la prot easa ( PR) , la int egrasa ( I N) , las cuales, j unt o a la TR, son codificadas
por el gen pol. Las glicoprot eínas gp41 ( TM, t ransm em brana) y gp120 ( SU, superficie) se
hallan asociadas a la envolt ura lipídica, de origen celular. La prim era es una prot eína
t ransm em brana m ient ras que la segunda se encuent ra asociada a la prim era en la cara
ext erna de la envolt ura viral [ 9] . Am bas prot eínas se encuent ran int eraccionando ent re sí
de m anera no covalent e y form an t rím eros en la superficie viral.
Figu r a 2 : Est r u ct u r a de l vir ión de VI H [ 11]
En el genom a se encuent ran los genes gag, pol y env. El gen gag codifica para la
prot eína de la cápside y nucleocápside, m ient ras que env codifica para las glicoprot eínas
17
I nt roducción
de m em brana. El gen pol codifica para la t ranscript asa reversa, prot easa e int egrasa.
Adem ás, VI H- 1 cont iene ot ros seis genes en sus 9kpb de ARN ( vif, vpu, vpr, t at , rev y
nef) . Los genes nef, vif, vpr y vpu fueron clasificados com o accesorios, aunque son
absolut am ent e requeridos para la replicación viral in vit ro. Los genes regulat orios t at y
rev, j unt o con nef se t rascriben y expresan t em pranam ent e en el ciclo de replicación
viral. Est as prot eínas cont rolan la t ranscripción, el procesam ient o del ARN, el ensam blado
del virión, la expresión de genes de la célula huésped y varias ot ras funciones replicat ivas
[ 10, 12] .
2.2. Genom a:
El genom a viral est á form ado por dos m oléculas lineales de ácido ribonucleico
( ARN) sim ple cadena de sent ido posit ivo, cada una de 9,5 Kb. Los ARN genóm icos son de
secuencias idént icas, funcionando com o un genom a diploide. Luego de int egrarse al
genom a celular, el genom a viral es t ranscript o por la m aquinaria de la célula huésped, lo
que lleva a que t enga caract eríst icas de m ensaj ero celular: posee cap en su ext rem o 5´ y
secuencia poli( A) , de aproxim adam ent e 200 bases, en el ext rem o 3´ de la m olécula [ 10] .
Los genes gag, pol y env son com unes a t odos los ret rovirus, pero sólo los
ret rovirus com plej os poseen genes que codifican para prot eínas accesorias [ 10] .
El virus em plea los t res posibles m arcos de lect ura para codificar las dist int as
prot eínas, m ediant e el solapam ient o ent re algunos de los genes, aprovechando al
m áxim o las posibilidades del genom a [ 9] .
La región gag codifica los precursores Pr55 Gag y Pr160 Gag- Pol . Los m ism os son
procesados
post - t raduccionalm ent e
m ediant e
clivaj e
prot eolít ico
produciendo
las
prot eínas m aduras MA, CA, NC, ent re ot ras. La región pol codifica las enzim as TR ( que
posee
las
act ividades
ADN- polim erasa- ARN
dependient e,
ADN- polim erasa- ADN
dependient e y ARNasa H) , la I N y la PR. La región env codifica las glicoprot eínas gp120 y
gp41, las cuales form an el com plej o que int eracciona específicam ent e con el recept or
celular [ 13] .
Una vez int egrado al genom a celular, el ADN proviral se encuent ra flanqueado por
repet iciones t erm inales largas ( LTR, Long Term inal Repeat s) generadas durant e el
proceso de t ranscripción inversa. Los LTR est án com puest os por las regiones U3, R y U5
y son los responsables de regular, al m enos en part e, la expresión de los genes virales.
Dent ro del genom a se hallan t am bién int rones. El m ecanism o de splicing es ut ilizado
com o est rat egia para regular, de m anera t em poral, la expresión génica. En la figura 3 se
observa un esquem a del genom a y las principales funciones de las prot eínas virales [ 14,
15] .
18
I nt roducción
Figu r a 3 : Ge n om a vir a l y pr in cipa le s fu n cion e s de la s dife r e n t e s pr ot e ín a s vir a le s [ 14, 15]
2.3. Ciclo de Replicación Viral:
En la figura 4 se esquem at iza el ciclo de replicación de VI H.
1- Adsorción:
VI H se une a la célula m ediant e la int eracción de gp120 ( SU) y el recept or CD4,
present e en la m em brana de la población de linfocit os T CD4 + y de m acrófagos, células
blanco de la infección por VI H. El t rím ero de SU se une al CD4, induciendo un cam bio
conform acional, que lleva al reconocim ient o por part e de gp41 ( TM) de la m olécula
correcept ora. Varias m oléculas funcionan com o correcept ores del virus [ 16- 18] , siendo
dos de ellas las de m ayor
im port ancia:
CXCR4 y
CCR5,
am bas recept ores de
quem oquinas. A part ir del uso de correcept or, se definen dos t ipos de virus: virus
m acrófago- t rópico ( virus R5) y linfo- t rópico ( virus X4) [ 14] .
19
I nt roducción
Ot ra m olécula a la cual se puede unir el virus con alt a afinidad es DC- SI GN ( lect ina
de t ipo C) . Est a m olécula se encuent ra en la m em brana de células dendrít icas, present es
en la subm ucosa. Ést as células son capaces de int ernalizar al virus sin dañarlo, m igrar al
ganglio y present arlo a los linfocit os allí present es, act uando com o una suert e de caballo
de Troya [ 19] .
2- Desnudam ient o:
Una vez dent ro de la célula, t iene lugar el desnudam ient o del virus. Est e proceso
involucra la fosforilación de la m at riz ( MA) m ediant e la act ividad de MAP kinasa ( m it ogen
act ivat ed prot ein) , j unt o a la acción de ciclofilina A y las prot eínas virales Nef y Vif. El
desnudam ient o
del
virus
perm it e
la
form ación
de
un
com plej o
encargado
de
ret rot ranscribir el genom a viral, com puest o por el ARN viral, TR, I N, MA y varias
prot eínas celulares, ent re ot ros com ponent es [ 14] .
3- Transcripción Reversa:
La t ranscripción reversa que da origen al ácido desoxirribonucleico doble cadena
( ADNds) es la caract eríst ica que le da el nom bre a la fam ilia de los ret rovirus. Est e es un
proceso com plej o que norm alm ent e inicia poco después de la ent rada del núcleo del
virión al cit oplasm a de la célula infect ada [ 10, 20] .
4- Ent rada al núcleo e I nt egración:
Una vez sint et izado el ADN se form a el com plej o de pre- int egración ( PI C, preint egrat ion com plex) , form ado por ADNds, I N, MA, Vpr, TR y prot eínas celulares. Las
prot eínas virales MA, I N y Vpr t iene secuencias de t ranslocación al núcleo. Una vez en el
int erior del núcleo celular, I N j unt o a prot eínas celulares m edian la inserción del ADN
viral dent ro del crom osom a celular. En algunos casos el ADN viral se insert a en zonas de
het erocrom at inización, donde queda lat ent e sin act ividad t ranscripcional. De t odas
form as, com o se int egra m ás de una m olécula de ADN viral por célula, se est im a que al
m enos una es t ranscripcionalm ent e act iva [ 14] .
5- Transcripción:
En el genom a de la célula huésped, el LTR 5´ funciona com o cualquier unidad
t ranscripcional eucariot a ya que cont iene el elem ent o iniciador, TATAA Box y t res sit ios
Sp1. Est as regiones ayudan a la ubicación de la ARN polim erasa I I y al ensam blaj e del
com plej o de pre- iniciación de la t ranscripción. Durant e el proceso de t ranscripción, la
polim erasa sint et iza fragm ent os pequeños de ARN, no poli- adenilados, los que son
est ables debido a que t om an una est ruct ura t ridim ensional, form ando el elem ent o de
20
I nt roducción
respuest a al t ransact ivador o TAR. La prot eína viral Tat es responsable de aum ent ar la
expresión de los genes virales, uniéndose a TAR y reclut ando fact ores celulares. I n vivo,
en ausencia de Tat , el LTR funciona com o un prom ot or débil [ 14] .
6- Traducción:
Luego de la t ranscripción del genom a viral, m ás de una docena de t ranscript os
virales son generados. Algunos se procesan co- t ranscripcionalm ent e y son rápidam ent e
t ransport ados al cit oplasm a donde se sint et izan las prot eínas, m ediant e la m aquinaria
celular. Las prot eínas virales est ruct urales se sint et izan com o poliprot eínas [ 21] .
Figu r a 4 : Ciclo de r e plica ción de VI H [ 22] .
7- Ensam blado, liberación y m aduración:
Para t erm inar con el ciclo de replicación viral, t odos los com ponent es del virión se
reúnen en la m em brana plasm át ica donde se producirá el ensam blado y brot ación del
21
I nt roducción
virus. Est e proceso, que es dirigido principalm ent e por las prot eínas Gag- Pol y Gag, pero
t am bién por Env, im plica el reclut am ient o de dos copias del genom a viral, así com o de
Vpr. La brot ación del virión se produce a t ravés de regiones especializadas en la bicapa
lipídica, produciéndose viriones con m em branas ricas en colest erol. Est e t ipo de
m em brana favorece la liberación, est abilidad y fusión de los nuevos viriones con la fut ura
célula blanco [ 14] .
Cuando los virus brot an de la m em brana celular, Gag y Gag- Pol se encuent ran
com o poliprot eínas apt as para sufrir prot eólisis, liberando pequeñas prot eínas present es
en el virión. Est e clivaj e es m ediado por PR, present e en las poliprot eínas Gag y Gag- Pol.
En un principio, PR se cliva a sí m ism a y luego cliva el rest o de las prot eínas virales. En
est a et apa de m aduración de la part ícula viral, la m orfología de la m ism a cam bia,
adopt ando la t ípica est ruct ura esférica con una zona elect ro- densa por debaj o de la
envolt ura y con su cápside cónica ubicada en el cent ro de la m ism a. Al m ism o t iem po, el
genom a viral form a un dím ero m ás est able com o consecuencia de su unión a las
prot eínas NC, producidas por la prot eólisis de los precursores de Gag [ 10] .
2.4. Nef:
Com o se verá m ás adelant e en est e t rabaj o de t esis, la prot eína Nef t iene gran
im port ancia en el análisis de la respuest a inm une y es am pliam ent e usada en los
dist int os m odelos de vacunas para VI H. A cont inuación, se describen las funciones m ás
im port ant es de est a prot eína.
Nef regula el am bient e de la célula infect ada con el fin de opt im izar la replicación
viral. La ausencia de Nef, t ant o en m odelo de m onos com o en seres hum anos infect ados,
se asocia con una lent a progresión a SI DA. Est a función de acelerar la virulencia que
posee Nef parece est ar asociada con la capacidad de afect ar cascadas de señalización,
incluyendo las involucradas en la act ivación de células T y la expresión del recept or CD4
en la superficie celular. Nef así prom ueve el aum ent o de la producción y liberación de
viriones infecciosos [ 14] .
Una célula infect ada con VI H puede evit ar ser presa de un linfocit o T cit ot óxico
( CTL) debido a la regulación negat iva, m ediada por Nef, del com plej o m ayor de
hist ocom pat ibilidad clase I ( MHC I ) . Nef dism inuye la expresión del MHC I , dism inuyendo
la present ación de ant ígenos a los CTL. Por ot ro lado, bloquea la apopt osis en la célula
huésped por diferent es m ecanism os, prolongando la
vida de la célula infect ada y
opt im izando así, la replicación viral [ 14] .
Ot ra de las funciones de Nef es la regulación negat iva de la m olécula CD4, t area
que realiza j unt o con ot ras dos prot eínas del VI H. SU se une CD4 en el ret ículo
22
I nt roducción
endoplásm ico, frenando así su export ación a la m em brana celular, m ient ras que Vpu se
une a la cola cit oplasm át ica de CD4 y prom ueve el reclut am ient o de fact ores celulares.
Est os event os llevan a la ubiquit inación de CD4 y a su degradación en el prot eosom a [ 14,
23] .
Por ot ro lado, Nef t am bién t iene la función de act ivar, en las células T infect adas, la
expresión de FasL, que induce la apopt osis en las células vecinas que expresan Fas. Est as
células podrían ser linfocit os T cit ot óxicos ( CTL) específicos que podrían elim inar las
células infect adas. Est a función de Nef es un m ecanism o act ivo de evasión del sist em a
inm une em pleado por el VI H [ 14] .
Por últ im o, Nef alt era la expresión del MHC I I en m em brana. Est o lo logra m ediant e
la reducción de m oléculas m aduras en la superficie celular y aum ent ando la localización
en m em brana de las m oléculas inm aduras, las que no pueden cum plir su función por
t ener unida la cadena invariant e en vez de un pépt ido exógeno ( de VI H) . Est o lleva a que
la present ación ant igénica quede reducida, y las células infect adas prot egidas. Est a es
una función select iva para el MHC I I , ya que ninguna ot ra vía de endocit osis/ exocit osis se
ve alt erada [ 24] .
2.5. Pat ogenia:
Hist oria Nat ural:
La infección prim aria se define com o el t iem po que t ranscurre desde que se
ocasiona la infección con el VI H hast a que se desarrolla una respuest a hum oral, siendo
los prim eros días, incluso sem anas, luego de la exposición al virus. En algunos casos se
ve acom pañada por un conj unt o de sínt om as, que incluye fiebre, adenopat ías, rush
cut áneo, cefalea, faringit is, diarrea, m uguet oral, ent re ot ros, denom inado síndrom e de
infección ret roviral aguda. De t odas form as, los sínt om as no siem pre son visibles en los
pacient es [ 12] .
Est udios de los event os t em pranos, que ocurren luego de que el virus at ravesó la
m ucosa, sugieren que exist iría un período de vent ana, en el cual la propagación viral no
ha com enzado, en el que el sist em a inm une podría pot encialm ent e evit ar la expansión
del pat ógeno [ 25] .
Durant e la infección aguda se puede observar una alt a virem ia en sangre y un
descenso m arcado de los linfocit os T CD4 + , los que luego aum ent an, aunque no llegan a
alcanzar los niveles iniciales ( Figura 5) [ 12] . Una depleción im port ant e de células T CD4 +
act ivadas, principalm ent e de m em oria, ocurre en los ganglios linfát icos asociados al
int est ino de individuos recient em ent e infect ados [ 26, 27] . La dest rucción gradual de
23
I nt roducción
células T CD4 + vírgenes o de m em oria es la caract eríst ica principal de la infección,
llevando al desarrollo de SI DA en lo últ im os est adios [ 25] .
Luego de est a et apa, se llega a un equilibrio ent re la replicación viral y la respuest a
inm une del huésped. Est o lleva a que m uchos pacient es no t engan m anifest aciones
clínicas durant e años. El prom edio de t iem po hast a que se desarrollan los sínt om as
puede ser de hast a 8 ó 10 años, incluso en ausencia de t rat am ient o ant irret roviral. Sin
em bargo, la carga viral ( CV) en sangre se m ant iene alt a y la dest rucción de células T
CD4 + cont inúa ( Figura 5) [ 12] .
Figu r a 5 : H ist or ia N a t u r a l de la in fe cción por VI H . La et apa aguda se car act eriza por alt a
carga viral ( A) , descenso en el recuent o de células T CD4 + y ausencia de ant icuerpos específicos
( B) . El descenso del pico de virem ia ( A) est á asociado a la aparición de linfocit os T CD8 + específicos
( B) , m ient ras que los ant icuerpos específicos aparecen luego. La diversidad viral aum ent a a lo
largo del t iem po m ient ras que el riesgo de t rasm isión es m áxim o durant e la et apa aguda y hacia
las et apas finales de la infección ( B) . Luego de la infección aguda, la carga viral se est abiliza. La
depleción de células CD4 + que ocurre a nivel de m ucosas no se recupera a lo largo del t iem po ( B)
[ 25] .
24
I nt roducción
Al final de est e período de ausencia de sínt om as clínicos, una serie de pat ologías
secundarias debidas al det erioro inm unológico pueden present arse. Est os incluyen signos
derm at ológicos, hem at ológicos y neurológicos, t ant o com o fiebre, pérdida de peso,
sudoración noct urna, diarrea, ent re ot ros. En est a sit uación, el nivel de 200 células
CD4 + / μl es un punt o de cort e im port ant e, por debaj o del cual el riesgo de aparición de
enferm edades definit orias de SI DA se increm ent a. Por encim a de 200 células CD4 + / μl, la
m ayoría de las enferm edades m arcadoras de SI DA son event os raros. Sin em bargo, el
curso de la infección puede variar considerablem ent e, y en algunos casos, la progresión a
SI DA se produce rápidam ent e.
El nivel de virem ia caract eríst ico de la infección crónica, denom inado set point ,
difiere del pico de virem ia de la et apa aguda en uno o dos órdenes de m agnit ud. Est a
reducción se correlaciona con la aparición de células T CD8 + específicas para el virus, lo
que le da im port ancia a est e t ipo de inm unidad ant iviral ( Figura 5) . La población viral es
hom ogénea en el inicio de la infección, m ient ras que va adquiriendo variabilidad a
m edida que t ranscurre el t iem po [ 25] .
Algunos fact ores del huésped det erm inan la velocidad de la progresión a la
enferm edad, exist iendo un grupo de pacient es conocidos com o no progresores a largo
plazo, quienes perm anecen m uchos años sin sínt om as, a pesar de no recibir t rat am ient o,
que represent an aproxim adam ent e el 5% de t odos los pacient es infect ados [ 12, 28] .
2.6. Filogenia y Epidem iología Molecular:
Una caract eríst ica im port ant e del VI H es la am plia diversidad genét ica generada por
el hecho de que la TR no posee act ividad de prueba de lect ura o proof reading ( act ividad
que perm it e corroborar que el nucleót ido insert ado es el correct o) , llevando a que la t asa
de m ut ación sea de aproxim adam ent e 3.4x10 −5 m ut aciones por base por ciclo de
replicación. Est o le da la posibilidad de evadir al sist em a inm une y a la TARV. Ot ra form a
de adquirir variabilidad es la recom binación ent re subt ipos, lo que ocurre cuando una
persona es infect ada por subt ipos virales diferent es y ést os se m ult iplican en la m ism a
célula.
El origen del VI H- 1 se ha at ribuido a un salt o zoonót ico desde los chim pancés al
hom bre, a t ravés de cont act o sanguíneo, probablem ent e durant e la práct ica de la caza
de est os anim ales en África. Análisis filogenét icos del VI H- 1 y de dist int os virus de
prim at es no hum anos sugieren que exist ieron t res salt os independient es en el com ienzo
del siglo XX, dando origen a t res grupos de VI H- 1: M ( m aj or) , O ( out lier) y N ( nonm aj or
y nonout lier) [ 29] . Recient em ent e se ha descript o un nuevo VI H, que se encuent ra
filogenét icam ent e relacionado con el SI V de gorilas y no m uest ra evidencia de
25
I nt roducción
recom binación con ot ros linaj es del VI H. Se ha propuest o la designación de un nuevo
grupo denom inado P [ 30] .
El grupo M es el responsable de la pandem ia y se ha diversificado en al m enos 10
subt ipos, nom brados con let ras ( A, B, C, D, E, F, G, H, J y K) , y sub- subt ipos, nom brados
con let ra y num ero ( A1- A4, F1- F2) [ 29] . La dist ancia genóm ica ent re subt ipos es
aproxim adam ent e la m ism a ent re t odas, y en algunos casos com part en la dist ribución
geográfica o epidem iológica. La variación genét ica dent ro de un subt ipo puede ser ent re
un 15 o 20% de la secuencia, m ient ras que la variación ent re subt ipos puede llegar hast a
un 35% [ 29] . A part ir de la secuenciación de genom as ent eros se han podido ident ificar
las form as recom binant es circulant es ( circular recom binant form , CRF) y las form as
recom binant es únicas ( unique recom binant form s, URF) . Un virus recom binant e es
clasificado com o CRF si se lo ha ident ificado en 3 o m ás pacient es que no posean una
relación epidem iológica direct a. Si no cum plen con est a caract eríst ica se lo clasifica com o
URF. Act ualm ent e exist en 43 CRFs y m ás de una cent ena de URFs [ 29, 31] . La
dist ribución global de los subt ipos y form as recom binant es reflej an la com plej idad de la
epidem iología m olecular ( Figura 6) .
Figu r a 6 : D ist r ibu ción m u n dia l de los su bt ipos y for m a s r e com bin a n t e s [ 29] .
26
I nt roducción
En Argent ina, Brasil y Uruguay la epidem ia se caract eriza por un predom inio del
subt ipo B y form as recom binant es BF, ent re ellas, la CRF12_BF ( Figura 7) , descript a en
2001 [ 32] .
Exist en num erosos t rabaj os acerca de la epidem iología m olecular de VI H en
dist int as poblaciones argent inas. En 2006 se llevó adelant e un análisis de secuencias del
gen pol de m uest ras provenient es de Argent ina, Brasil, Baham as y México. En nuest ro
país se encont ró un 30% del subt ipo B y una alt a prevalencia de form as recom binant es
BF ( 70% ) [ 33] . Por ot ro lado, result ados del análisis de los genes pro y TR realizados
sobre una cohort e de HSH en 2007 m ost ró que un 83% de las m uest ras eran del subt ipo
B y el 17% BF [ 34] . En ot ro est udio realizado en el período 2000- 2002 en diferent es
ciudades de Argent ina, sobre una población de t rabaj adoras sexuales fem eninas, se
encont ró que, de las 17 m uest ras secuenciadas y genot ipificadas para env, 9 fueron del
subt ipo F, 6 del subt ipo B y 2 C. De las secuencia de la región pro/ TR de 16 de ést as
m uest ras, 10 eran recom binant es BF, 3 B y 2 C; y una m uest ra present aba una infección
dual ent re B y recom binant e BF. Se realizó secuenciación com plet a del genom a de 5 de
las recom binant es, m ost rando que t res eran CRF12_BF [ 35] . Por ot ro lado, analizando un
grupo de pacient es de Buenos Aires, que t enían diagnost ico previo para t uberculosis, se
encont ró que el 54.2% de las secuencias de env fueron F, el 45.8% rest ant e fueron B. La
región pro/ TR se analizó en 10 m uest ras, de las cuales 3 fueron B y 7 BF. De est as
últ im as 3 fueron CRF12_BF [ 36] .
Est os son algunos de los t rabaj os que dem uest ran que la epidem ia m olecular de
VI H en nuest ro país es t an com plej a com o en el rest o del m undo, con la co- circulación de
virus pert enecient e al subt ipo B y CRF12_BF, así com o de URFs. Sum ado a est o, en 2004
se encont ró una secuencia recom binant e A2D. A part ir de est a secuencia parcial,
sum adas a dos secuencias com plet as, una de Korea y ot ra de Kenia, se describió la
CRF16_A2D, la que t iene una dist ribución global.
Figu r a 7 : Ge n om a de CRF1 2 _ BF. En Celest e se represent a las part es del genom a con hom ología
al subt ipo B y en verde al F [ 32] .
Los dat os de la com plej idad de la epidem ia m olecular en Argent ina, sum ados al
hecho de que no queda claro la relevancia de la inm unidad subt ipo específica y el grado
27
I nt roducción
de react ividad cruzada de células T ent re diferent es subt ipo de VI H [ 37- 39] , lleva a
considerar est os pat rones de la epidem ia m olecular en los diseños de vacunas que se
usarán en est a zona de Lat inoam érica.
3 . Una Va cu n a
Han pasado 29 años del prim er caso report ado de SI DA y 27 del descubrim ient o de
su agent e et iológico y aún no se ha conseguido cont rolar la pandem ia.
El desarrollo de una am plia variedad de ant irret rovirales ha llevado a un im port ant e
descenso en la m ort alidad asociada al SI DA, sin em bargo es difícil el acceso al
t rat am ient o, sobre t odo en países en vía de desarrollo. Aunque en los últ im os años se ha
progresado en est e sent ido, la Organización de las Naciones Unidas est im ó en el año
2007 que sólo ent re el 27 y el 34%
de las personas que necesit aban t erapia
ant irret roviral en el m undo t uvieron acceso a ella [ 40] .
El desarrollo de una vacuna segura y eficaz cont ra el VI H es crít ico para el cont rol
de la pandem ia. Desde el inicio de la epidem ia se ha int ent ado generar una vacuna
efect iva sin conseguirlo, aunque los últ im os avances son alent adores. El VI H present a
ciert as caract eríst icas que dificult an la generación de una vacuna, que se resum en en la
t abla 2 [ 41] .
Ta bla 2 : Re su m e n de la s ca r a ct e r íst ica s vir a le s qu e dificu lt a n e l de sa r r ollo de u n a
va cu n a fr e n t e a VI H [ 41] .
Dificult ades en el desarrollo de una Vacuna frent e a VI H
Ant icuerpos Neut ralizant es
I nserción del ADN proviral
Variabilidad Viral
Zonas expuest as alt am ent e
variables
Event o t em pr ano en la
infección
Alt a t asa de error de la TR
Zonas const ant es alt am ent e
glicosiladas
Larga vida m edia del virus
10 subt ipos conocidos y 43
form as recom binant es
3.1. Diseño Racional de Vacunas para VI H:
Los prim eros int ent os de generar una vacuna cont ra el VI H fueron m ediant e la
ut ilización de la prot eína de la envolt ura, gp160 o gp120, que rápidam ent e se produj eron
y fueron t est eadas en ensayos clínicos de fase I . Est os ensayos fallaron en la generación
de ant icuerpos neut ralizant es ( AcN) debido a que las zonas conservadas de Env se
encuent ran alt am ent e glicosiladas. Los ant icuerpos reconocen las zonas variables pero en
pocas ocasiones reconocen el sit io de unión al recept or, que se encuent ra ocult o en el
int erior de la prot eína [ 41] . Est o facilit a el escape inm unológico y dism inuye la
28
I nt roducción
react ividad
cruzada
ent re
subt ipos.
Recient em ent e,
se
han
desarrollado
algunos
ant icuerpos con alt a capacidad neut ralizant e, capaces de prot eger m acacos de desafíos
por rut as de m ucosas. Est os ant icuerpos, denom inados 2F5 y 4E10, est án dirigidos
cont ra la región ext erna próxim a a la m em brana de la prot eína gp41, considerada de
crucial im port ancia para la fusión del virus con la célula [ 42] .
En los últ im os años se ha focalizado el diseño de vacunas en aquellas que sean
capaces de generar una respuest a inm une celular, ya que exist e evidencia de que la
respuest a celular m ediada por linfocit os T cit ot óxicos ( células T CD8 + ) j uega un rol
cent ral en el cont rol de la infección por VI H y progresión a SI DA:
- se ha observado que la aparición del pico de respuest a CD8 + correlaciona con el
descenso de la carga viral plasm át ica ( CV) en la infección aguda [ 43] ;
- en el m odelo de m acacos, se observó que la elim inación de células CD8 + lleva a
un aum ent o de la CV [ 44] ;
- se ha descript o la aparición de m ut aciones de escape a la respuest a CTL frent e a
la presión del sist em a inm une [ 45] ;
- exist e correlación ent re ciert os alelos de HLA y lent a o no progresión a SI DA y en
est os casos, no se observan m ut aciones de escape en los epít opes afines a est os HLA
[ 46- 48] .
Por ot ro lado, t res caract eríst icas de las células T CD8 + podrían est ar involucradas
en el cont rol de la virem ia: frecuencia, am plit ud de los epít opes reconocidos y la calidad
funcional de las células [ 48] .
En los últ im os años, ha ocurrido dos acont ecim ient os im port ant es en el cam po del
desarrollo de vacunas de VI H: la finalización de los dos ensayos clínicos im port ant es que
est aban en curso, uno de fase I I b “ prueba de concept o” y el segundo de fase I I I .
El prim ero de ellos, que finalizó en 2007/ 2008, const aba de 3 dosis de Adenovirus
( Ad) recom binant e para Gag, Pol y Nef. El ensayo fue finalizado ant es de lo planeado,
debido a que hubo una pequeña proporción m ayor de volunt arios infect ados en el grupo
vacunado que en aquel que recibió placebo. Análisis post eriores revelaron que el m ayor
riesgo de infección est aba relacionado a la presencia de ant icuerpos neut ralizant es para
Ad ant eriores a la vacunación, asociado a la variable hom bre no circuncidado [ 49] .
El ot ro ensayo finalizado recient em ent e se desarrolló en Tailandia con un result ado
que aparent a ser una luz de esperanza. La vacuna const a de un virus Canarypox
recom binant e que expresa Gag, Pol y Env del subt ipo B ( cepa LAI ) , aplicada en cuat ro
dosis y seguida de dos dosis de prot eína gp120 recom binant e, de la CRF01_AE
prevalent e en Tailandia. Se aplicaron vacuna y placebo a 16.402 volunt arios sanos,
hom bres y m uj eres ent re 18 y 30 años de edad. Se observó una efect ividad de la vacuna
del 31.2% , es decir que en el grupo inm unizado se infect aron un 31.2% m enos de
29
I nt roducción
personas. Sin em bargo, no se observaron diferencias en la carga viral ni el recuent o de
células T CD4 + en las personas que se infect aron, independient em ent e de que hubiesen
recibido la vacuna o el placebo. Si bien los núm eros no son alent adores, es el prim er
report e donde se observa algún grado de prot ección en hum anos, siendo est e un gran
avance en el cam ino de la búsqueda de una vacuna efect iva y segura [ 50] .
3.2. I m port ancia de la Variabilidad en el Desarrollo de una Vacuna:
En una persona infect ada, las células T CD4 + y CD8 + específicas pueden exhibir
ciert o grado de react ividad frent e a epít opes conservados de ot ro subt ipo, pero la
respuest a t iende a ser m ayor frent e al subt ipo que infect a. Así, un pacient e infect ado con
un subt ipo de VI H- 1, t iene respuest as celulares y hum orales frent e a su cepa y, aunque
se ha dem ost rado que exist en respuest as cruzadas a ot ros subt ipos virales. La fuerza y la
am plit ud de est as respuest as suelen ser lim it adas [ 37- 39, 51] .
La diversidad de epít opes ent re subt ipos hace poco probable que la ut ilización com o
inm unógeno de un aislado nat ural prot ej a frent e a ot ros subt ipos virales o variant es
dent ro del m ism o subt ipo. Hist óricam ent e, t odos los candidat os a vacunas ant i- VI H que
se ut ilizaron en ensayos clínicos cont enían inm unógenos del subt ipo B, dom inant e en
Est ados Unidos y Europa. Sin em bargo, act ualm ent e se han incluido una larga list a de
ot ros subt ipos y CRFs ( Tabla 3) [ 52, 53] . Act ualm ent e, se aplican diferent es est rat egias
para hacer frent e a est e problem a com o com binación de inm unógenos de diferent es
subt ipos ( Tabla 3) [ 50, 53- 58] . En análisis preclinicos, algunos invest igadores ut ilizan
secuencias consenso ent re varios subt ipos [ 59] , j unt o con la coadm inist ración de
cit oquinas [ 29] ; o la creación de inm unógenos m osaico, form ados por la opt im ización de
fragm ent os de
secuencias nat urales,
así com o
la
const rucción
de
inm unógenos
provenient es de regiones conservadas de secuencias consenso [ 29] . Ot ra est rat egia es la
ut ilización de ant ígenos de subt ipos o variant es circulant es del lugar donde se ut ilizará la
vacuna [ 50, 52] . En la t abla 3 se resum en los ensayos clínicos m ás im port ant es que se
est án llevando a cabo act ualm ent e, donde se puede observar la diversidad de ant ígenos
que se ut ilizan, pert enecient es a dist int os subt ipos.
Los virus pert enecient es al m ism o subt ipo pueden variar hast a un 20% en la
secuencia prot eica de la envolt ura, m ient ras que est a diferencia puede ser de hast a un
35% ent re virus pert enecient es a dist int os subt ipos. Adem ás hay que t ener en cuent a la
diversidad del VI H se encuent ra en cont inuo crecim ient o.
Un ej em plo claro del im pact o que puede t ener la variabilidad viral en la efect ividad
de una vacuna se pone de m anifiest o en la necesidad de un cam bio anual en la vacuna
frent e al virus influenza. El virus influenza sufre un 2% de cam bios am inoacídicos, los
30
I nt roducción
cuales pueden causar falla en la react ividad cruzada de la respuest a policlonal inducida
t ras la inm unización, generando la necesidad de cam biar la cepa de la vacuna cada año
[ 52] .
3.3. Selección de Ant ígenos:
Desde que el VI H fue ident ificado, se han realizado m uchos int ent os de vacunas,
sin obt ener result ados alent adores. Ut ilizando el m ism o paradigm a que dio lugar al
desarrollo de la vacuna para hepat it is B, la m ayoría de los prim eros int ent os de form ular
una vacuna fueron basados en la generación y expresión de la prot eína recom binant e de
la envolt ura, la que debería ser el blanco de los ant icuerpos neut ralizant es. A pesar de
que
los ant icuerpos generados a
part ir
de
inm unizaciones con
est as prot eínas
recom binant es eran capaces de neut ralizar cepas de VI H ut ilizadas en los laborat orios, no
result aron eficient es en la neut ralización de aislados prim arios obt enidos a part ir de
pacient es infect ados [ 60] .
Con el correr del t iem po se han com enzado a ut ilizar diferent es prot eínas com o
ant ígenos en los candidat os a vacunas. En la t abla 3 se puede observar la am plia
variedad de prot eínas ut ilizadas. Ent re las prot eínas elegidas se encuent ra Nef. Exist en
num erosos ensayos clínicos y preclínicos donde se ut iliza est a prot eína regulat oria com o
ant ígeno para generar una respuest a inm une [ 54, 61- 65] . Una de las caract eríst icas que
hacen de Nef un buen candidat o vacunal es que es una de las prim eras prot eínas que se
expresa en el ciclo viral [ 12] , convirt iéndola en un blanco t em prano en la infección.
Adem ás, en un est udio realizado con pacient es cursando la infección por VI H en
diferent es est adios, se observó que Nef, j unt o con Gag, cont ienen la m ayor densidad de
epít opes y son las prot eínas del virus m ás reconocidas por los pacient es de est e est udio.
Ot ros dat os int eresant es obt enidos de ese t rabaj o es que, los dos pépt idos reconocidos
con m ayor frecuencia pert enecían a Nef [ 66] .
De t odas form as, la caract eríst ica m ás im port ant e por la que Nef se conviert e en
un buen candidat o para ser ut ilizado com o ant ígeno vacunal, es que la respuest a celular
específica dirigida cont ra est a prot eína durant e la infección aguda y t em prana represent a
ent re el 94 y 46% del t ot al de la m agnit ud de la respuest a t ot al ant i- VI H [ 67] . En est e
t rabaj o,
se
describe
que
durant e
la
prim o- infección,
la
respuest a
T CD8 +
fue
preferencialm ent e dirigida cont ra Nef, m ient ras que en la infección crónica, est a
respuest a cam bia a Gag, Pol y Env.
31
I nt roducción
Ta bla 3 : Re su m e n de e n sa yos clín icos e n cu r so [ 53] .
Ca n dida t os pa r a Va cu n a s con t r a VI H / SI D A e n e nsa y os clínicos a ct u a le s
Fa se I I I
Fecha de
I nicio
I nst it uciones
Lugar
# de
Part icip
Oct ubr e
2003 *
MHRP, MoPH, Avent is,
Vaxgen
Tailandia
SAAVI , HVTN
Com posición de la vacuna
Subt ipo
16402
Pr im e : Canary pox con env y
gag- pol. Boost : Prot eína Env
( gp120)
B
AE
Sud África
801
Ad con gag, pol, nef
B
NI AI D, HVTN, Merck
EEUU, Canadá,
Perú, República
Dom inicana, Hait í,
Puer t o Rico y ot ros
3000
Ad con gag, pol, nef
B
GeoVax, HVTN
EEUU, Perú
225
Pr im e : ADN con gag, pol,
env, t at , rev, v pu. Boost :
MVA con gag, pol, env
B
Junio 2007
Com isión Europea, ANRS
GB, Alem ania,
Francia, Suiza
140
Pr im e : ADN con env, gag,
pol, nef
Boost : NYVAC- C
C
Diciem bre
2006
MUCHS, Karolinska
I nst it ut e, SMI , Vecura,
MHRP
60
Pr im e : ADN con env, gag,
rev, TR. Boost : MVA con env ,
gag, pol
Te st de Con ce pt o
Febrero
2007 * *
Diciem bre
2004 * *
Fa se I I
Enero
2009
Fa se I / I I
Tanzania
A, B,
C
A,E
B
A, B,
C
NI H, MHRP, VRC
Kenya, Uganda,
Tanzania
324
Pr im e : ADN con gag, pol,
env+ nef. Boost : Ad con gag,
pol, env+ nef
Fa se I
Marzo
2009
I AVI , Uni. de Rochest er
Medical Cent er
EEUU
42
Ad con gag, TR, I N y nef
Ad con env gp140
A
Marzo
2009
I AVI , I ndian Council of
Medical Research
32
Pr im e : ADN con env, gag,
pol, nef y t at
Boost : MVA con env, gag, TR,
rev, nef y t at
C
Diciem bre
2008
I AVI , St . St ephen’s AI DS
t rust , Chelsea and
West m inst er Hospit al
Gran Bret aña
32
Diciem bre
2008
HVTN, SAAVI
EEUU, Sud África
48
Oct ubr e
2007
NI AI D, HVTN,
UPenn/ Wyet h
EEUU
120
PENNVAX- B + I L- 12 o dos
dosis dist int as de I L- 15
B
Abril 2006
NI AI D, HVTN, GeoVax
EEUU
120
Pr im e : ADN con gag, pro, TR,
env, t at , rev, v pu. Boost :
MVA con gag, pol, env
B
Abril 2007
NI AI D, HVTN, Pharm exaEpim m une,Bav arian Nordic
EEUU
108
ADN + MVA recom ,
Solos o en pr im e- boost
A, B,
C, D,
E, G
Mayo
2006
I ndia
ANRS: Agence Nat ionale de Recherches sur le Sida ( France)
HVTN: HI V Vaccine Trials Net work
I AVI : I nt er nat ional AI DS Vaccine I nit iat ive
MHRP: Unit ed St at es Milit ary HI V Resear ch Program
MoPH: Minist ry of Public Healt h of Thailand
MUCHS: Muhim bili Univer sit y College of Healt h Sciences
Pr im e : ADN con env, gag,
pol, nef y t at
Boost : MVA con env, gag, TR,
rev, nef y t at
ADN- C2 MVA- c + ADN con
gag, TR, t at , nef y env
C
C
NI AI D: Nat ional I nst it ut e of Allergy and I nfect ious
Diseases
NI H: Nat ional I nst it ut es of Healt h
SAAVI : Sout h African AI DS Vaccine I nit iat iv e
SMI : Sw edish I nst it ut e for I nfect ious Disease Cont rol
VRC: Vaccine Research Cent er
* Finalizado [ 50]
* * Concluyó el enrrolam ient o en Sept iem br e 2007, pero cont inúa el seguim ient o y análisis de dat os
32
I nt roducción
Durant e la infección aguda, el 70% de los epít opes reconocidos por los dist int os
pacient es pert enecían a Nef, est ando el 94% de la m agnit ud de la respuest a concent rada
en est os epít opes. Al analizar un est adio post erior, durant e la infección t em prana, sólo el
46% de los epít opes reconocidos pert enecían a Nef. Est o m uest ra cóm o va cam biando el
blanco de la respuest a a lo largo del curso de la infección [ 67] . Est o quiere decir que,
durant e la infección t em prana, gran cant idad de la respuest a vinculada al descenso del
pico inicial de la virem ia [ 43] est á dirigida frent e a epít opes de Nef.
3.4. Est rat egia “ Prim e- Boost ” :
Las vacunas t radicionales no han sido capaces de cont ener infecciones t ales com o
las provocadas por Mycobact erium t uberculosis, Plasm odium falciparum o VI H, que
resist en la inm unidad hum oral [ 68] . Se ha observado que la adm inist ración de dosis
repet idas de un m ism o vect or lleva al aum ent o de los ant icuerpos generados ( dosis
hom ólogas) .
Est e t ipo de est rat egia es relat ivam ent e ineficient e para aum ent ar
respuest as celulares, debido a que la respuest a inm une preexist ent e frent e al vect or
evit a una eficient e present ación de los ant ígenos [ 69] . Para vencer est a lim it ación, en los
últ im os años se ha desarrollado un esquem a de inm unización capaz de generar respuest a
celular basándose en dosis seriadas, donde el ant ígeno se expresa desde dist int os
vect ores
( dosis
het erólogas) .
Est a
est rat egia
es
conocida
am pliam ent e
por
su
designación en ingles: “ prim e- boost ” y fue en un principio descript a com o generadora de
respuest a de células CD8 + frent e a m alaria, inm unizando prim eram ent e con un vect or
basado en el virus influenza y, luego, adm inist rando el ant ígeno en una segunda dosis
desde un vect or basado en el virus Vaccinia [ 70] .
En la figura 8 se puede observar el m ecanism o que opera en est a est rat egia de
vacunación. Mediant e la prim er dosis o prim e se produce la present ación t ant o del
ant ígeno de int erés ( t riángulos roj os) com o de los ant ígenos del vect or ( t riángulos
azules) por m edio de las células present adoras de ant ígeno ( CPA) , lo que lleva a la
act ivación de los linfocit os vírgenes específicos ( roj os para el ant ígeno de int erés y azul
para ant ígenos del vect or) . Mediant e la aplicación de la segunda dosis o boost desde un
vect or diferent e, se produce la present ación del ant ígeno de int erés ( t riángulos roj os) y
de los de est e segundo, t riángulos verdes, lo que llevará a la act ivación de los linfocit os
vírgenes específicos de los ant ígenos del vect or ( verdes) y la expansión de la respuest a T
de m em oria preexist ent e para el ant ígeno de int erés ( roj os) . Est o lleva a una respuest a
m ayor a la m era sum a de las respuest as individuales de cada dosis y a la selección de
células específicas para el ant ígeno de int erés con una m ayor avidez [ 68, 69] .
33
I nt roducción
Act ualm ent e ést a es una de las est rat egias m ás ut ilizadas en el cam po del
desarrollo de vacunas para VI H/ SI DA, donde se puede encont rar com binación de
vect ores de ADN, com o prim e, y refuerzos o boost de vect ores virales recom binant es. De
los ensayos en fase I , I I y I I I , 12 est án basados en esquem as de prim e- boost , que
com binan ADN y vect ores virales ( Adenovirus o Poxvirus) . Ot ros ensayos ut ilizan dos
dosis de Adenovirus,
una dosis de ADN y boost de pépt ido o una sola dosis de
Adenovirus o Poxvirus ( Tabla 3) . Dent ro de los vect ores m ás ut ilizados para la segunda
dosis se encuent ran los vect ores basados en virus de la fam ilia Poxviridae, com o el virus
Vaccinia, con su variant e at enuada MVA ( m odified Vaccinia virus Ankara) , Canarypox y
Fowlpox; de los 12 ensayos clínicos que ut ilizan ADN- Virus, 10 usan Poxvirus com o
boost , preferent em ent e MVA. Exist en un sin fin de t rabaj os cient íficos con ensayos en
m odelos anim ales [ 57, 58, 61, 63, 64, 69- 73] , así com o ensayos clínicos ( Tabla 3) , com o
el recient em ent e finalizado en Tailandia [ 50] , donde ut ilizan est e t ipo de vect ores para
expresar diferent es prot eínas de VI H.
Figu r a 8 : Est r a t e gia de va cu n a ción pr im e - boost . Mediant e la prim era dosis o prim e se produce
la present ación del ant ígeno de int erés ( t riángulos roj os) y de los ant ígenos del vect or ( t riángulos
azules) por m edio de las células present adoras de ant ígeno ( CPA) . Se act ivan los linfocit os vírgenes
específicos ( roj os para el ant ígeno de int erés y azul para ant ígenos del vect or) . Mediant e la
segunda dosis o boost desde un vect or diferent e, se produce la pr esent ación del ant ígeno de
int erés ( t riángulos roj os) y de los de est e segundo ( t riángulos verdes) lo que llevará a la act ivación
de los linfocit os específicos de los ant ígenos del vect or ( verdes) y la expansión de la respuest a T de
m em oria preexist ent e par a el ant ígeno de int erés ( roj os) [ 68] .
34
I nt roducción
3.5. Vect ores Poxvirus:
En 1796 Edward Jenner dem ost ró que inoculando e infect ando a una persona con el
virus de la viruela bovina ( cowpox) est a persona quedaba prot egida cont ra la infección
con el virus de la viruela hum ana ( sm allpox) . Llam ó al m at erial VACCI NE, del lat ín vacca,
que significa vaca, que era el origen del virus que usaba en sus inoculaciones, proceso al
que llam ó VACCI NATI ON. Past eur, en reconocim ient o a Jenner, adopt ó el t érm ino para
nom brar a las inoculaciones prevent ivas cont ra ot ros pat ógenos [ 74] . Años después,
cuando se not ó que el virus que se est aba ut ilizado en la vacuna cont ra la viruela había
dej ado de ser cowpox, el nom bre Vaccinia se t ransfirió al nuevo virus [ 75] .
Figu r a 9 : M icr oscopia
e le ct r ón ica de l vir u s
Va ccin ia [ 76] .
El 8 de m ayo de 1980, la Organización Mundial de la Salud cert ificó que la viruela
había sido erradicada. Est o fue posible gracias a la exist encia de una vacuna efect iva, a
un plan de vacunación m undial y a que no exist en reservorios en la nat uraleza, dado que
el virus se t ransm it ía de hum ano a hum ano [ 74] . El virus Vaccinia ( Figura 9) , prot ot ipo
de la fam ilia Pox vir ida e , fue ut ilizado com o vacuna a virus vivo para erradicar la viruela.
Los
Poxvirus
que
infect an
a
vert ebrados
pert eneces
a
la
subfam ilia
Chordopoxvirinae. Poseen un genom a de ADN lineal de doble cadena, que varía desde
130 a 300 kpb y t odos replican exclusivam ent e en el cit oplasm a de la célula infect ada.
3.5.1 Ciclo de Replicación:
El ciclo de replicación ha sido am pliam ent e est udiado en Vaccinia ( Figura 10) ,
prot ot ipo de la fam ilia, pero se encuent ra alt am ent e conservado ent re ot ros Poxvirus
[ 76] . Com o en la m ayoría de ot ras clases de virus, los Poxvirus coordinan los procesos de
replicación del genom a y ensam blado a t ravés de la regulación del t iem po de expresión
35
I nt roducción
de los dist int os genes [ 77] . Est e ciclo est á com puest o por una serie de event os
com plej os que t ranscurren ent eram ent e en el cit oplasm a, siendo est o posible debido a
que el virión port a las enzim as y fact ores de t ranscrición necesarios para la sínt esis de
los m ensaj eros de las prot eínas de expresión t em prana.
1- Unión y Fusión:
El ciclo com ienza con la unión a la superficie celular y la subsiguient e fusión del
virus a la m em brana.
Exist en dos t ipos de part ículas capaces de infect ar una célula, virus m aduro
int racelular
( I MV,
int racellular
m at ure virus)
y
virus ext racelular
envuelt o ( EEV,
ext racellular enveloped virus) . La diferencia ent re am bas part ículas radica en el núm ero
de m em branas que la envuelven y las glicoprot eínas present es en ellas, generando que
ut ilicen dist int os m ecanism os para ent rar a la célula [ 76] . La unión de la part ícula viral
est á det erm inada por prot eínas del virus y glicosam inoglicanos ( GAGs) present es en la
superficie de la célula huésped.
2- Transcripción de Genes t em pranos:
Una vez que el virión y la m em brana celular se fusionaron, el core viral ent ra al
cit oplasm a, m ant eniendo la int egridad de su est ruct ura. La ARN polim erasa viral y los
fact ores t ranscripcionales present es en el virión com ienzan la prim er cascada de
expresión de los genes t em pranos, los que se encuent ran regulados por prom ot ores
t em pranos, dent ro del core viral, siendo export ados a t ravés de poros en su superficie
[ 77] . Est o es posible porque t odas las enzim as y fact ores de t ranscripción necesarios
para la sínt esis de los prim eros genes est án present es en el core viral. Aproxim adam ent e
la m it ad de los genes virales pert enecen a los de expresión t em prana.
3- Desnudam ient o y replicación:
Luego, por un proceso poco conocido, se desnuda el genom a y se libera al
cit oplasm a, donde puede ser ut ilizado com o t em plado para la replicación.
4- Expresión de genes int erm edios y t ardíos:
La sínt esis de novo de la ARN polim erasa es requerida para est as segunda y t ercera
ronda de t ranscripción [ 77] .
Ent re las prot eínas generadas por los genes t em pranos se encuent ran los fact ores
de t ranscripción necesarios para sint et izar las prot eínas int erm edias. Lo m ism o ocurre en
el caso de las prot eínas t ardías, cuyos fact ores de t ranscripción son sint et izados a part ir
36
I nt roducción
de los genes int erm edios. Los fact ores de t ranscripción necesarios para los genes
t em pranos son sint et izados con las prot eínas t ardías y form an part e del virión.
Figu r a 1 0 : Ciclo de r e plica ción vir a l de l vir u s Va ccin ia . I MV: virus m aduro int racelular, EEV:
virus ext racelular envuelt o, I EV: virus int racelular envuelt o, GAGs: glicosam inoglicanos [ 76] .
5- Morfogénesis y liberación:
A m edida que se acum ula el product o de los genes t ardíos, las part ículas virales se
van ensam blando, inicialm ent e com o I MV, los que m igran por t ráfico en m icrot úbulos y
se envuelven con m em brana derivada del aparat o de Golgi para form ar virus int racelular
37
I nt roducción
envuelt o ( I EV, int racellular enveloped virus) . Est a últ im a part ícula pierde una m em brana
cuando se fusiona con la m em brana celular y form a el virus asociado a la m em brana
celular ( CEV, cell- associat ed enveloped virus) , el que se disem ina a células vecinas por
colas de act ina, o se libera com o EEV. Las I MV son liberadas al am bient e ext racelular
cuando la célula se lisa.
Los Poxvirus expresan una serie de prot eínas m oduladoras que m odifican t ant o el
ent orno int racelular com o el ext racelular de la célula infect ada. Est os prot eínas
codificadas por el virus m odulan una am plia gam a de respuest as de defensa ant iviral,
que se desencadenan por la infección viral, y que incluyen im port ant es vías, com o la
apopt osis, inducción de la respuest a a int erferón, el est rés inducido por cascadas de
señalización, rest ricción en la present ación de ant ígeno por MHC y fact ores proinflam at orios en respuest a a la infección [ 76] . Algunas de est as funciones se han perdido
en cepas at enuadas com o MVA ( Ver siguient e sección) .
A part ir de el uso ext ensivo de los Poxvirus com o vect ores vacunales se han
generado gran cant idad de plásm idos de t ransferencia, que cont ienen prom ot ores de
Vaccinia rio arriba de sit ios de rest ricción m últ iples, donde es posible insert ar diversos
genes exógenos, flanqueados por secuencias hom ólogas a diferent es loci virales. Est as
secuencias hom ólogas a genes de Vaccinia son las que m edian la recom binación
hom óloga, insert ando en el genom a viral el/ los genes de int erés, generalm ent e j unt o a
un gen m arcador para facilit ar la selección de los virus recom binant es, anulando genes
no esenciales para el virus [ 78] . De la m ism a m anera, se ha ut ilizado est a est rat egia de
recom binación hom óloga para anular genes involucrados en dist int as est rat egias de
evasión al sist em a inm une para m ej orar la inm unogenicidad del vect or [ 79, 80] .
3.5.2. MVA: Virus Vaccinia Ankara Modificado ( Modified Vaccinia Virus Ankara)
A pesar de que el prim er virus Vaccinia recom binant e para un gen de VI H, env,
[ 73] result ó seguro y fue considerado inm unogénico, la ocurrencia de efect os adversos
poco frecuent es, m ás aún en personas inm unocom prom et idas, llevó al desarrollo de
cepas at enuadas, para m ej orar la seguridad. Se realizaron diferent es cepas at enuadas,
m ediant e dist int os m ecanism os.
Act ualm ent e, la capa at enuada del virus Vaccinia m ayorm ent e usada es MVA,
avirulent a en anim ales norm ales o inm unocom prom et idos, la cual no m ost ró efect os
adversos cuando fue ut ilizada para vacunar a 120.000 personas durant e la erradicación
de la viruela [ 78] .
La cepa at enuada MVA fue generada t ras la realización de 500 pasaj es en
fibroblast os de em brión de pollo ( CEF) , durant e los cuales perdió la capacidad de replicar
38
I nt roducción
y propagarse en células m am íferas [ 81] . Com parada con la cepa parent al, MVA cont iene
seis deleciones principales en el genom a, las que result an en una pérdida de 30.000
pares de bases, o dicho de ot ra form a, el 15% de la inform ación genét ica. El bloqueo en
la replicación de MVA ocurre en el ensam blado del virión ( Figura 10, paso 5) , lo que
perm it e expresar los genes t em pranos, int erm edios y t ardíos [ 78] .
3.6. Adyuvant es
Dada la lim it ada inm unogenicidad de las vacunas de ADN per se, se han
desarrollado est rat egias para aum ent ar su eficacia. Ent re ellas se puede nom brar el uso
de codones opt im izados [ 82- 85] o m et odologías que facilit en la ent rada del ADN a la
célula com o m icroesferas o agent es lipídicos [ 86, 87] . Un área que ha t om ado
im port ancia en los últ im os años de desarrollo de vacunas, es el diseño de adyuvant es
“ racionales” , com o el uso de diferent es cit oquinas o quem oquinas, para aum ent ar la
inm unogenicidad de los ant ígenos expresados desde vect ores de ADN principalm ent e.
Ent re ellos, algunos de los m ás ut ilizados son I L- 12 ( I nt erleuquina- 12) [ 88] y GM- CSF
( Fact or est im ulador de colonias de granulocit os y m acrófagos, granulocyt e- m acrophage
colony st im ulat ing fact or) [ 89, 90] , I L- 18 [ 91] , I L- 15 [ 92, 93] , ent re ot ros.
Las cit oquinas j uegan un rol cent ral en la regulación del sist em a inm une,
cont rolando diversos aspect os de la respuest a inm une [ 94] . Est o sugiere que serían
buenos candidat os com o m oléculas para aum ent ar la respuest a inm une inducida por
prot eínas expresadas desde vect ores de ADN.
Ciert as cit oquinas ej ercen una influencia dom inant e en la polarización de los
linfocit os T CD4 + hacia un perfil Th1 ( respuest a principalm ent e celular) o Th2 ( respuest a
principalm ent e hum oral) [ 94, 95] .
I L- 12 es producida por las células present adoras de ant ígeno ( CPA) , principalm ent e
m acrófagos y células dendrít icas act ivadas. Es la principal cit oquina que induce la
diferenciación de los linfocit os T CD4 + hacia una respuest a Th1. Cum ple un rol
fundam ent al en la act ivación y diferenciación de est as, adem ás de est im ular su
proliferación de est as células y act uar com o fact or de crecim ient o para las células
asecinas nat urales ( NK, nat ural killers) [ 94, 95] .
Por ot ro lado, I FN- γ ( int erferón gam m a) t am bién es una de las cit oquinas
involucradas en la polarización de la respuest a inm une hacia el t ipo Th1. Est a cit oquina
es producida por las células CD4 + con un perfil Th1, los linfocit os CD8 + , NK y ot ras [ 94] .
Adem ás, exist en ot ras cit oquinas que cum plen funciones parecidas com o I L- 18 e I FN- α
[ 95] .
39
I nt roducción
GM- CSF fue una de las prim eras cit oquinas en ser ident ificada [ 90] . Es una de las
responsables de la at racción de m acrófagos y la inducción de su m aduración, lo que
result a en un aum ent o de la present ación ant igénica. Se ha dem ost rado que I L- 12 y GMCSF son capaces de aum ent ar la respuest a inm une cont ra el virus de la hepat it is B,
ant ígenos de leishm ania y VI H, así com o la generada frent e a ant ígenos de ot ros
pat ógenos [ 88- 91, 96, 97] . Adem ás, se ha descript o un efect o sinérgico ent re est os dos
adyuvant es [ 98, 99] .
Dada la im port ancia de la epidem ia de VI H, t ant o a nivel m undial com o regional, y
la falla de las t erapias exist ent es para erradicar la infección, es una prioridad para la
salud pública el desarrollo de una vacuna efect iva y segura que logre frenar la pandem ia.
A part ir de la com plej idad a nivel m olecular, con la coexist encia de 10 subt ipos, 43 CRFs
y cient os de URFs, es im port ant e evaluar cual es el im pact o de est a variabilidad en el
desarrollo de vacunas.
40
Obj et ivos
Considerando lo ant eriorm ent e expuest o y dent ro del m arco de un proyect o donde
se pret ende abarcar los aspect os de la problem át ica plant eada en la int roducción, el
obj e t ivo ge ne r a l de est e t rabaj o de t esis doct oral fue:
Desarrollar vect ores vacunales cont ra el VI H- 1 basados en vect ores virales
y de ADN que expresen genes del subt ipo B y de la form a recom binant e
circulant e CRF12_BF de VI H- 1, present e en Argent ina y países lim ít rofes, a fin de
cont ar con herram ient as biológicas para la evaluación de la im port ancia de la
inm unidad subt ipo específica en el desarrollo de fut uras vacunas en nuest ras
región.
Obj et ivos Específicos:
1. Const ruir vect ores de ADN y basados en el virus Vaccinia Ankara m odificado
( MVA) y en la cepa West ern Reserve ( WR) que expresen la prot eína Nef pert enecient e a
la form a recom binant e CRF12_BF del virus VI H- 1 circulant e en Argent ina y al subt ipo B.
2. Caract erizar in vit ro los vect ores generados, analizando la capacidad de los
m ism os de expresar Nef en células de dist int os orígenes, su est abilidad y su cinét ica de
crecim ient o.
3.
Evaluar
la
inm unogenicidad
de
los
vect ores,
aplicando
regím enes
de
inm unización que com binen los vect ores de ADN, MVA y VV que expresen NefBF y NefB.
4. Est udiar la im port ancia de la inm unidad celular y hum oral subt ipo específica en
regím enes de inm unización con ant ígenos de los subt ipos B y BF de VI H- 1, evaluando la
posible react ividad cruzada ent re la respuest a generada frent e a ant ígenos BF y B.
5. Pot enciar la respuest a inm une específica frent e a NefBF m ediant e el uso de
adyuvant es ( I L- 12 y GMCSF) adm inist rados desde vect ores de ADN, analizando la
react ividad cruzada frent e al ant ígeno del subt ipo B, m apeando los epít opes BF
inm unogénicos en un m odelo de rat ones Balb/ c.
6. Evaluar la represent at ividad de las secuencias expresadas desde los vect ores
dent ro de la población de virus present e en los pacient es infect ados por VI H+ de
Argent ina.
Mat eriales & Mét odos
Mat eriales & Mét odos
1 . Re a ct ivos Biológicos
1.1. Virus
En est e t rabaj o de t esis se ut ilizaron para la generación de los vect ores virales la
cepa West ern Reserve ( WR) [ 100] donada por el laborat orio del Dr. Mariano Est eban
( España) y la cepa MVA del virus Vaccinia. Ést a últ im a, fue el aislado MVA- F6 de la cepa
at enuada por 582 pasaj es en fibroblast os de em brión de pollo [ 101, 102] , cedida
gent ilm ent e por el Dr. G. Sut t er ( Alem ania) .
1.2. Líneas Celulares y cult ivos prim arios
Las líneas celulares ut ilizadas en est e t rabaj o fueron: BSC- 40, BHK- 21, CEF, 3T3,
P815, HeLa y 293- T.
Las células BSC- 40 son derivadas de epit elio de riñón de m ono verde africano
( Cercopit hecus aet hiops) y crecen adheridas a la placa. Pueden ser incubadas ent re 31º C
a 40º C. Son perm isivas para la replicación del virus Vaccinia.
Las células BHK- 21, adherent es, son fibroblast os de riñón de ham st er ( Mesocricet us
aurat us) . Son sensibles de ser infect adas por varios virus, ent re ellos adenovirus 25,
reovirus 3, virus de la est om at it is vesicuar, poliovirus 2 hum ano, así t am bién com o MVA.
Las células CEF, cult ivo prim ario de fibroblast os de em brión de pollo, fueron generadas
por la Sección de Cult ivo de Tej idos del I nst it ut o de Virología, I NTA Cast elar. Fueron
preparados a part ir de huevos em brionados de 10- 11 días cert ificados com o libres de
pat ógenos específicos ( SPF) , adquiridos en el I nst it ut o Rosenbusch.
Las células 3T3 son derivadas de fibroblast os de em brión de rat ón ( Mus m usculus) ,
t am bién crecen adheridas al sust rat o.
Las células P815 crecen en suspensión, son derivadas de m ast ocit om a m urino ( Mus
m usculus) . Se las puede usar com o CPA para det ect ar respuest a CD8 + , debido a que
expresan MHC I .
Las células HeLa son derivadas de epit elio de adenocarcinom a de cervix hum ano
( Hom o sapiens) .
La línea 293T es una línea celular de t ipo epit elial derivada de riñón hum ano y
present a una alt a eficiencia de t ransfección.
Todas las líneas celulares fueron incubadas a 37º C en at m ósfera húm eda y con 5%
CO2 ,
ut ilizando
m edio
Dulbecco's
m odified
Eagle
( DMEM,
Gibco
BRL,
EE.UU.)
suplem ent ado con 10% suero fet al bovino ( SFB, Cellgro) , 2m M L- glut am ina ( Gibco BRL) ,
100 U/ m l penicilina ( Gibco BRL) y 100 μg/ m l est rept om icina ( Gibco BRL) .
43
Mat eriales & Mét odos
1.3. Generación de los Vect ores de ADN que Port an NefBF y NefB
Las secuencias codificant es para NefBF y NefB fueron am plificadas y clonadas
dent ro
del
vect or
com ercial
pTarget
( Prom ega,
USA) ,
baj o
la
regulación
del
prom ot or/ enhancer de Cit om egalovirus Hum ano ( CMV) com o part e de la t esis de
doct orado de la Dra. Gabriela Turk. El gen que codifica para la prot eína Nef ( desde el
nucleót ido 8378 hast a 9056 de la secuencia de referencia HXB2) que pert enece a la
form a recom binant e circulant e BF ( Núm ero de acceso a la base de dat os de genes de la
secuencia ARMA185: AY037279) de VI H- 1 fue am plificado m ediant e la reacción en
cadena de la polim erasa ( PCR) con cebadores específicos ( PCRnef, NNHEI y NECORI ,
Tabla 4 y 5) . De la m ism a m anera, se clonó la secuencia codificant e para NefB, a part ir
del plásm ido pNL4.3. Est e clon m olecular fue obt enido a t ravés del program a de
provisión de react ivos del I nst it ut o Nacional de Salud de los Est ados Unidos ( NI H AI DS
Research and Reference Reagent Program [ 103] ) . Est os vect ores serán denom inados
ADN NefBF o ADN BF, y ADN NefB o ADN B, respect ivam ent e, a lo largo de est e t rabaj o.
El vect or de t ransferencia pJR101 para Virus Vaccinia ( ver sección 1.4. de M&M) fue
cedido gent ilm ent e por el Dr. Mariano Est eban, del Cent ro Nacional de Biot ecnología de la
Universidad Aut ónom a de Madrid, España, y fue descript o ant eriorm ent e [ 104] . La
const rucción de los vect ores de t ransferencia denom inados pJRnefBF o pJRnefB, se
realizó por m edio de un subclonado part iendo de los vect ores ADN BF y B, ligando est as
secuencias codificant es con el esquelet o del vect or pJR101.
La liberación de las secuencias de int erés de los vect ores de ADN se realizó, en el
caso de NefBF, m ediant e la digest ión del plásm ido ADN NefBF con la enzim a Eco RI
( I nvit rogen) , durant e 2 hs a 37º C, para luego purificar la banda pert enecient e a la
secuencia codificant e nefBF por gel de agarosa ( QI Aquick Gel Ext ract ion Kit , QUI Agen) .
Luego de cuant ificar la cant idad de insert o recuperado, se procedió al rellenado de los
ext rem os cohesivos con el fragm ent o largo de la ADN polim erasa, Klenow ( I nvit rogen) ,
20 m inut os a 25º C. Por ot ro lado, se realizó la digest ión del vect or pJR101 con Sm a I ( 2
hs a 25º C) ( I nvit rogen) , enzim a que dej a ext rem os rom os, y se purificó por gel de
agarosa. Est a preparación fue t rat ada con una desfosfat asa alcalina de cam arón
( Prom ega) , 2 horas a 37º C para rem over los 5´ fosfat os, y así evit ar que el vect or se
circularice solo ( Figura 11 A) . Est a est rat egia de subclonado generó product os de ligación
con el insert o en am bos sent idos, debido a la ut ilización de enzim as que generan
ext rem os rom os. Luego, m ediant e un t am izaj e apropiado se seleccionaron los clones que
poseían el insert o en la dirección correct a.
En el caso de NefB, se ext raj o la secuencia codificant e a part ir del vect or de ADN
NefB m ediant e una digest ión doble, con Bam HI y Not I , 2hs a 37º C, se separó el insert o
44
Mat eriales & Mét odos
del vect or por gel de agarosa, se purificó y cuant ificó la banda de 700 pb. La preparación
del vect or pJR101 se realizó de la m ism a m anera, digiriéndolo con las enzim as
m encionadas. Est a est rat egia de clonado fue direccional, es decir que el insert o solo se
ligó al vect or en la dirección deseada ( Figura 11 B) .
Figu r a 1 1 : Esqu e m a r e pr e se n t a t ivo de la s e st r a t e gia s u sa da s pa r a su bclon a r n e fBF y
n e fB. A- Est rat egia aplicada para el subclonado de la secuencia codificant e de NefBF. B- Est rat egia
aplicada para el subclonado de la secuencia codificant e de NefB. El vect or pJR101 posee un gen
report ero β- Gus baj o el prom ot or p7.5. Río abaj o del prom ot or pe/ l posee un sit io de clonado
m últ iple. Todo est e casset t e se encuent ra flanqueado por secuencas hom ólogas al gen HA viral. El
plásm ido posee un gen de resist encia a am picilina.
45
Mat eriales & Mét odos
Para am bos insert os, se ligaron el fragm ent o y el vect or pJR101 durant e 72 hs a
4º C, ut ilizando una relación insert o: vect or de 3: 1, con la ligasa T4 ( I nvit rogen) , en
presencia de 2m M de dATP ext ra al present e en la solución t am pón com ercial ( buffer) .
Con est as preparaciones se t ransform aron bact erias Escherichia coli, de la cepa
DH5−α, t erm ocom pet ent es m ediant e la t écnica de shock t érm ico [ 105] . Brevem ent e, la
m ezcla de bact erias y ligación se som et ieron a las siguient es incubaciones seriadas: 20
m inut os en hielo, 45 segundos a 46º C y 2 m inut os en hielo. Luego se incubaron las
bact erias una hora en m edio rico ( SOC: 2% t ript ona 0.5% ext ract o de levaduras, cloruro
de sodio 10 m M, cloruro de pot asio 2.5 m M, cloruro de m agnesio 10 m M, sulfat o de
m agnesio 10 m M, glucosa 20 m M) , sin presión de selección, a 37º C con agit ación. Se las
plaqueó en m edio LB- Agar ( t ript ona 1% , 0.5% ext ract o de levaduras, 1 % cloruro de
sodio, 1.2% de agar) suplem ent ado con am picilina 100 μg/ m l com o presión de selección,
incubándolas a 37º C t oda la noche. Se realizaron ext racciones de ADN a part ir de
colonias aisladas y m ediant e t am izaj e por digest ión y liberación del insert o, visualizando
el ADN por gel de agarosa, se seleccionaron los clones posit ivos. En el caso de nefBF se
realizó una digest ión capaz de discrim inar la orient ación del insert o, ut ilizando las
enzim as Bam HI y Eco RI . En el caso de nefB, se ut ilizaron las m ism as enzim as con las
que se realizó el subclonado: Bam HI y Not I .
Com o result ado de est os clonados, se obt uvieron los vect ores pJR nefBF y pJR nefB
cont eniendo las secuencias codificant es de nefBF y nefB, respect ivam ent e, baj o la
regulación del prom ot or sint ét ico t em prano/ t ardío de VV [ 106] .
1.4. Generación de los Virus Recom binant es
El vect or de t ransferencia pJR101 lleva, adem ás del gen de int erés ( sección 1.3. de
M&M) , el gen report ero β- glucuronidasa ( β- Gus) baj o el prom ot or p7.5 t em prano/ t ardío
de virus Vaccinia ( VV) . Est as secuencias se encuent ran flanqueadas por fragm ent os
hom ólogos a la secuencia de la hem aglut inina ( HA) viral ( Figura 11) . El procedim ient o
que se ut ilizó para la generación de los virus recom binant es fue la t écnica de
infección/ t ransfección [ 107] , con la subsecuent e recom binación hom óloga ent re el vect or
de t ransferencia y el genom a viral dent ro de la célula. De est a m anera se obt uvieron los
virus recom binant es, cuya presencia se pudo evidenciar m ediant e el agregado del
sust rat o de la enzim a β- Gus ( Figura 12) .
En el caso del MVAnefBF, se realizó la infección en células BHK- 21 ( células de riñón
de hám st er, perm isivas para la replicación viral) con una m ult iplicidad de infección ( MOI )
de 0.05 unidades form adoras de placa por célula ( UFP/ célula) en m edio de cult ivo
Dulbecco's m odified Eagle ( DMEM, Gibco BRL) com plem ent ado con 2m M L- glut am ina
( Gibco BRL) , 100 U/ m l penicilina ( Gibco BRL) y 100 μg/ m l est rept om icina ( Gibco BRL) .
46
Mat eriales & Mét odos
Luego de una hora de adsorción, se realizó la t ransfección con 10 μg del plásm ido
pJR nefBF ut ilizando lipofect am ina ( Lipofect am ine 2000, I nvit rogen) , siguiendo prot ocolos
ya descript os [ 106] .
Para los virus recom binant es basados en la cepa WR ( VVnefBF, VVnefB y VVHA- ,
ést e últ im o sin llevar gen de int erés, pero con la deleción en el gen HA) , la
infección/ t ransfección se realizó de la m ism a m anera, con una MOI de 0.05 UFP/ célula,
en la línea celular BSC- 40 ( Células de riñón de m ono verde africano) .
Figu r a 1 2 : Esqu e m a de l pr oce dim ie n t o de obt e n ción de vir u s r e com bin a n t e . Luego de la
infección- t ransfección se recolect an las células y se vuelve a infect ar ot ra placa en m edio
sem isólido. A las 48 hs, m ediant e el agregado de X- Gluc se revelan los focos de infección
generados por el virus recom binant e. Se seleccionan Est e procedim ient o se repit ió hast a no
observarse placas blancas.
En am bos casos, a las 48 o 72 horas, dependiendo de cuando el efect o cit opát ico
era evident e en el 80 ó 90 % de las células, se cosecharon las m ism as, se las som et ió a
3 ciclos de congelado/ descongelado, para liberar el virus int racelular, y se com enzó la
47
Mat eriales & Mét odos
purificación de los virus recom binant es, por pasaj e y selección de los focos de infección
azules ( color del sust rat o, Figura 12) . Para est o, se infect aron células CEF ( fibroblast os
de em brión de pollo) , en placas de 6 pocillos, en el caso de MVA, y células BSC- 40 en el
caso de WR, con diluciones, seriadas al décim o, de la m ezcla de la infección/ t ransfección
en DMEM. Luego de 1 hr de adsorción, se ret iró el inóculo y se agregó m edio sem isólido
( DMEM 2% Suero Fet al Bovino, SFB, con 0.55% agarosa de baj o punt o de fusión) . A las
48 hs se agregó 1 m l de m edio sem isólido cont eniendo 750 μg de sust rat o X- Gluc
( I nalco) por pocillo.
A part ir del día siguient e, se com enzaron a visualizar los punt os
azules, pert enecient es a los focos de infección con el virus recom binant e. Mediant e el uso
de una pipet a past eur de vidrio, se recogieron las células infect adas en el foco azul, se
resuspendieron en DMEM fresco ( sin suero) y, luego de 3 ciclos de congelado y
descongelado, se volvieron a ut ilizar para infect ar células. Est e proceso se repit ió ent re 7
u 8 veces, hast a que no se observaron placas de lisis blancas ( virus salvaj e) ,
obt eniéndose los clones recom binant es puros de los 4 virus recom inant es.
Ta bla 4 : Se cu e n cia de ce ba dor e s u t iliz a dos e n la s dist in t a s PCRs.
N om br e de l Ce ba dor
Se cu e n cia ( 5 ´ - 3 ´ )
NNHEI
CTTTGCTAGCAAATGGGTGGC
NECORI
CGGAAAGTCCCTTTAGAATTCTTCTGTG
HA1
GTCACGTGTTACCACGCA
HA2
GATCCGCATCATCGGTGG
HA1- I
TCCCCGCGGATGACACGATTACCAATA
HA2- I
GGGGTACCAGAATATTGCCACGGCCG
OUTGUS
CAGCCTCGGGAATTGCTAC
MVAHA
TGACACGATTACCAATAC
pE/ L
GGTGGGTTTGGAATTAG
1.5. Cont roles de Pureza e I nt egridad de los Virus Recom binant es
Para verificar la pureza de los clones seleccionados se realizaron dos reacciones de
PCR diferent es. Para est o, se ext raj o ADN viral ut ilizando un kit de ext racción de ADN
genóm ico ( QI Aam p DNA Mini Kit , QI Agen) a part ir de células BHK- 21 ( MVA) o BSC- 40
( WR) infect adas a alt a MOI . Es posible ut ilizar un kit de ext racción genóm ica porque el
genom a de vaccinia es suficient em ent e grande com o para separarse j unt o con el genom a
celular.
48
Mat eriales & Mét odos
En la t abla 4 se encuent ran la secuencia de los cebadores ut ilizados, m ient ras que
en la figura 13 se encuent ra las posiciones de los m ism os. En la t abla 5 se describen las
condiciones del ciclado.
1.5.1. PCR Diferencial:
Se realizó una PCR com pet it iva o PCR diferencial, que perm it ía am plificar una
banda de 950 pares de bases ( pb) correspondient e a la t ot alidad del gen HA salvaj e
( ident ificando el genom a salvaj e) , o una banda de 450 pb correspondient e al sect or
izquierdo de HA j unt o con el sect or Term inal derecho del gen report ero β- gus,
ident ificando el genom a recom binant e. Para est o se ut ilizaron 3 cebadores: HA1- I ( al
doble de concent ración) , HA2- I y OUTGUS.
Figu r a 1 3 : Esqu e m a de l ge n r e com bin a n t e n e fBF in se r t o e n e l locu s vir a l H A. Se m uest ran
la posición de los cebador es usados en la PCR convencional y diferencial, PCRnef y aquellos
ut ilizados para secuenciar. Se indica el t am año esperado de los fragm ent os am plificados en cada
caso.
1.5.2. PCR Convencional:
Mediant e est a reacción de PCR no sólo se verificó la pureza de los virus
recom binant es, sino t am bién su int egridad. Se ut ilizaron los cebadores HA1, que se pega
en el ext rem o izquierdo del gen HA, y HA2, que se pega en el ext rem o derecho del
m ism o gen. Est os cebadores am plifican un fragm ent o de 3500 pb, correspondient e al
casset t e de expresión com plet o del genom a recom binant e, y un fragm ent o de 950 pb,
correspondient e al gen HA salvaj e, en el genom a del virus salvaj e.
49
Mat eriales & Mét odos
Para am bas PCR se seleccionaron 2 clones del MVAnefBF que no m ost raban placas
blancas en los últ im os dos pasaj es y expresaban las prot eínas de int erés por west ern blot
( Sección 4.1. de M&M) .
Se realizó la secuenciación de la banda de 3500 pb de uno de los clones elegidos
con cebadores hom ólogos a las secuencias que flanquean a nef ( pE/ L, el que es
hom ólogo a part e de la secuencia del prom ot or, y HA2) . Los am plicones se secuenciaron
direct am ent e en un secuenciador aut om át ico ( Applied Biosyst em s DNA sequencer 3100) ,
ut ilizando el sist em a com ercial Big Dye Term inador sequencing kit ( Am ersham , Suecia)
[ 108] ( Tabla 5) .
Ta bla 5 : Con dicion e s de clicla dos de la s dist in t a s PCRs.
M ix
PCR
Buffer
Diferencial
Convencional
1X
1X
PCRnef
1X
Am plificación
para
secuenciar
BigDye
1X
Mg 2 +
2 mM
2 mM
3 mM
dNTP
200 μM
250 μM
350 μM
BigDye Cycle
Secuencing
Cebador
Sent ido
Cebador
Ant isent ido
HA- I 1
16 ng/ μl
HA- I 2 +
OUTGUS
8 ng/ μl
MVAHA
0.5 μM
HA2
0.5 μM
HA1
0.5 μM
HA2
0.5 μM
Con dicion e s
5 m in 94º C
1 m in 94 º C
1 m in 56º C
30 ciclos
1: 30 m in 72º C
10 m in 72º C
4º C
7 m in 95º C
1 m in 95 º C
30 seg 50º C
35 ciclos
7 m in 72º C
7 m in 72º C
4º C
NNHEI
0.5 μM
NECORI
0.5 μM
12 m in 94º C
45 seg 94 º C
30 seg 55º C
35 ciclos
2: 30 m in 72º C
10 m in 72º C
4º C
pE/ L
0.4 μM
HA2
0.4 μM
10 seg 96 º C
5 seg 50º C
25 ciclos
4 m in 60º C
4º C
1.6. Caract erización
1.6.1. Est abilidad del Vect or Recom binant e MVAnefBF:
Para poner a prueba la est abilidad de la const rucción en el virus recom binant e, se
realizaron 11 pasaj es ciegos. Para est o, se infect aron a baj a MOI células BHK- 21 con el
MVAnefBF. Ent re las 48 o 72 hs, cuando el efect o cit opát ico fue evident e en m ás del 80%
de la m onocapa, se recolect aron las células raspando los pocillos, luego se cent rifugaron
para quit arles el m edio y se resuspendieron en m edio fresco sin suero. Tras 3 ciclos de
50
Mat eriales & Mét odos
congelado/ descongelado, se infect aron nuevas células con est os am plificados. Est e
proceso se repit ió hast a el pasaj e núm ero 11.
A part ir de diferent es pasaj es se realizó el análisis de presencia de genom a salvaj e
y la int egridad del insert o por PCR convencional, así com o la visualización de la prot eína
por la t écnica de West ern Blot ( WB) .
1.6.2. Cinét ica de Crecim ient o de los Virus Recom binant es
Para analizar la cinét ica de crecim ient o del virus MVAnefBF se infect aron células
BHK- 21 a una MOI de 0.01 UFP/ células del virus MVAnefBF y su parent al ( MVAsalvaj e) ,
ut ilizando placas de 12 pocillos. Luego de una hora de adsorción se rem ovió el inoculo y
se les agregó m edio DMEM 2% SFB. A las dist int as horas post infección ( hpi) , 24, 48 y
72 hs, se cosecharon los sobrenadant es de dos pocillos ( duplicados) y t ras lavar las
células, ést as se resuspendieron en 1 m l de PBS ( buffer de sales de fosfat o) . Am bas
fracciones se conservaron a - 80º C hast a que se t it uló el virus infect ivo present e en ellas,
com o se describe en 5.1. de M&M.
Est e m ism o procedim ient o se realizó para los virus VVnefBF y VVnefB, com parando
el crecim ient o de los virus recom binant es con respect o al virus VVHA- . Para est os virus
se ut ilizaron células BSC- 40, m ient ras que el rest o del prot ocolo fue el m ism o.
1.6.3. Cinét ica de Expresión en el Tiem po de Nef a part ir de los Vect ores Virales
Se infect aron m onocapas de células BHK- 21 y 3T3 ( fibroblast os de rat ón) en placas
de 12 pocillos con una MOI de 5 UFP/ cél de MVAnefBF o MVAsalv. Por ot ro lado, para
evaluar la cinét ica de los VVr, se infect aron BSC- 40 y 3T3, con la m ism a MOI . Una hora
después de la adsorción, se rem ovió el inóculo y se agregó DMEM 2% SFB. A las 6, 18 y
24 hpi se descart ó el m edio y se resuspendieron las células en PBS, se cent rifugaron ( 5
m inut os, 1500 revoluciones por m inut o, rpm ) y el pellet celular se conservó a - 20º C
hast a el m om ent o del análisis.
2 . I n m u n iza cion e s y M a n e j o de An im a le s
2.1. St ocks Virales para I nm unizaciones
Los virus recom binant es se crecieron a gran escala infect ando a baj a MOI
( aproxim adam ent e 0.1) 25 placas de 150 m m de diám et ro de células BHK- 21, en el caso
de los MVA salvaj e y MVAnefBF, o BSC- 40 en el caso de los VVr. Los virus se purificaron
m ediant e un colchón de 45% de sacarosa com o se describió previam ent e [ 109] y luego
51
Mat eriales & Mét odos
se t it ularon por las t écnicas descript as en el final de la sección 5 de M&M ( 5.1.1. y
5.1.2.) .
2.2. Preparación del ADN para I nm unizar
Se purificaron los dist int os plásm idos m ediant e el kit de m axi prep libre de
endot oxinas ( EndoFree Plasm id Maxi Kit , QI Agen) , ut ilizando m at erial libre de pirógenos.
Luego de la precipit ación final con isopropanol, se resuspendió el ADN en una solución
salina TE ( 10 m M Tris- Cl, 1 m M EDTA, pH 8.0) libre de endot oxinas.
El ADN se cuant ificó por espect rom et ría ( BI ORAD) m idiendo la absorbancia a
260nm y verificando su pureza m idiendo la relación 260nm / 280 nm ( ≥1,7) . Luego se
corroboró la ident idad y calidad del product o obt enido por digest ión del ADN con las
enzim as apropiadas y visualización del pat rón por gel de agarosa.
2.3. Prot ocolos de I nm unización
Rat ones hem bra Balb/ c ( H2- d) , libres de pat ógenos específicos ( SPF) , de ent re 6 y
8 sem anas de edad fueron provist as por la Facult ad de Ciencias Vet erinarias de la
Universidad de La Plat a, Buenos Aires, y m ant enidos en el biot erio del depart am ent o de
Microbiología de la Facult ad de Medicina de la UBA. Todos los experim ent os se realizaron
siguiendo las norm as de buenas práct icas del m anej o de anim ales de laborat orio del
I nst it ut o
de
I nvest igaciones
de
Anim ales
de
Laborat orio,
Consej o
Nacional
de
I nvest igaciones, Est ados Unidos ( I nst it ut e of Laborat ory Anim al Research, Com m ission
on Life Sciences, Nat ional Research Council) [ 110] .
El ADN se adm inist ró por vía int ra m uscular en el m úsculo de la cara int erna de la
ext rem idad post erior ( m úsculo bigem ino) , diluído en un volum en final de 100 μl de PBS
est éril, con las cant idades indicadas en cada caso ( 100 o 50 μg de ADN) . Las
inm unizaciones de los virus se realizaron por rut a int ra- perit oneal en el caso de los virus,
con una dosis de 10 7 o 3 x 10 7 UFP en 200 μl de PBS. Las diferent es inm unizaciones
fueron espaciadas por int ervalos de 14 días ent re ellas.
2.4. Tom a de Muest ras
Diez días después de la últ im a inm unización se procedió a la t om a de las dist int as
m uest ras. Para ello, previam ent e se procedió a anest esiar a los anim ales con una m ezcla
de ket am ina/ xilacina ( 23 m g/ m l de ket am ina + 0.7 m g/ m l de xilacina, ent re 100 y 200 μl
por rat ón, int raperit oneal, es decir ent re 115 y 230 m g de ket am ina y ent re 3.5 y 7 m g
de xilacina/ kg rat ón) . Prim ero se obt uvo la m uest ra de sangre por punción cardíaca y,
52
Mat eriales & Mét odos
luego del sacrificio por dislocación cervical, se ext irparon los bazos. En el caso de los
rat ones desafiados con los VVr, se sacrificaron por dislocación cervical y se ext irparon
am bos ovarios, colocándolos en 1 m l de m edio DMEM.
2.4.1. Bazo:
2.4.1.1. Obt ención de Esplenocit os:
Se aislaron los esplenocit os en condiciones est ériles usando t am ices descart ables
( cell st rainers, BD) . Se lisaron los glóbulos roj os con una solución de NH4 Cl 0.1 M en
agua dest ilada, ut ilizando 4 m l por bazo, durant e 4 m inut os en hielo. Luego de 2 lavados
con RPMI c ( RPMI con 100 U/ m l penicilina y 100 μg/ m l est rept om icina ( Gibco BRL) , 2m M
L- glut am ina ( Gibco BRL) , HEPES y β- Mercapt oet anol, m ás 10% SFB) se procedió a cont ar
las células en una cám ara de neubauer con azul de t ripán.
2.4.1.2. Criopreservación de Esplenocit os:
Se
resuspendieron
las
células
a
una
concent ración
de
20
m illones
de
esplenocit os/ m l en m edio de congelación: SFB + 10% DMSO. Se alicuot ó 1 m l por
criot ubo ( Greiner) , los que se colocaron en un Mr Frost y ( disposit ivo que perm it e que la
t em perat ura descienda lent am ent e, Nalgene) a - 80º C y unos días después se los
colocaró en un t anque de N2 líquido hast a su post erior uso ( - 140º C) . En el m om ent o de
su uso, se descongelaron en m edio com plet o y se los dej ó reposar durant e una noche a
37º C. Al día siguient e se cont aron y se procedió con su uso.
2.4.2. Sueros:
Se dej ó coagular la sangre 4 hs a t em perat ura am bient e. Luego se separó el suero
y se cent rifugó 10 m inut os a 4000 rpm , para separar los erit rocit os que quedaran. Se
conservaron los sueros a - 80º C hast a su uso. Las cuant ificaciones de ant icuerpos se
realizaron individualm ent e o por grupo, form ando m ezclas con part es iguales de cada
suero de anim ales individuales.
2.4.3. Ovarios:
53
Mat eriales & Mét odos
Se disgregaron los ovarios, al igual que los bazos, en el m edio en que se
obt uvieron. Se congelaron/ descongelaron 3 veces y se procedió con la t it ulación com o se
describe en la sección 5 de M&M.
3 . M a n e j o de M u e st r a s H u m a n a s
Est e est udio cont eniendo m uest ras hum anas fue aprobado por el com it é de ét ica de
la Facult ad de Medicina de la UBA y t odos los donant es de m uest ras dieron un
consent im ient o inform ado ( ANEXO 1) .
3.1. Tom a de Muest ra
A part ir de 10 m l de sangre ent era de 11 pacient es VI H+ , cursando infección
crónica o aguda, y un donant e sano, se aislaron las células m ononucleares de sangre
periférica
( PBMC)
por
gradient e
de
densidad
Ficoll- Hypaque
( Am ersham )
y
cent rifugación. Se rem ovió la int erface celular, donde se encuent ran los PBMC. Luego de
dos lavados con PBS, el pellet celular se resuspendió en RPMI c ( en est e caso sin βMercapt oet anol) , se cont aron y se usaron en fresco o se procedió a su criopreservación.
3.2. Criopreservación de PBMC
Se resuspendieron las células a una concent ración de ent re 6 a 8 m illones de
PBMC/ m l en m edio de congelación: SFB + 10% DMSO y se alicuot aron en criot ubos
( Greiner) . Los m ism os se colocaron en un Mr Frost y a - 80º C, durant e un t iem po m enor a
un m es, para luego guadarlos en el t anque de N2 líquido hast a su uso post erior ( - 140º C) .
En el m om ent o de su uso, se descongelaron en m edio com plet o y se los dej ó reposar
durant e una noche a 37º C. Al día siguient e se cont aron y se procedió con su uso.
3.3. Análisis Filogenét ico
Se det erm inó el subt ipo viral a part ir de ADN genóm ico ext raído de 2 m illones de
PBMC, am plificando la secuencia de nef por PCR y post erior secuenciación del am plicon.
Las secuencias se alinearon con las correspondient es secuencias de referencia para nefBF
y nefB, ut ilizando el program a Clust alX [ 111] y se corrigieron visualm ent e m ediant e el
program a BioEdit versión 5.0.9 ( ht t p: / / m bio.ncsu.edu) . Las relaciones filogenét icas ent re
las secuencias obt enidas y las de referencia fueron est ablecidas por el m ét odo de
Neighbor- j oining usando el m odelo Kim ura 2- param et ros [ 112] por m edio del program a
54
Mat eriales & Mét odos
MEGA v.3.0 ( ht t p: / / m egasoft ware.net ) . La consist encia de los nodos fue det erm inada por
rem uest reo o boot st rap para 100 réplicas. La ident ificación de secuencias recom binant es
se llevó a cabo m ediant e el m ét odo de boot scanning usando el program a Sim Plot v.2.50
( Window: 300 pb St ep: 20 pb, ht t p: / / www.welch.j hu.edu) . Las secuencias de referencia
ut ilizadas para el análisis fueron aquellas recom endadas en la base de dat os Los Alam os
HI V sequence dat abase ( ht t p: / / hiv- web.lanl.gov) .
4 . Té cn ica s I n m u n ológica s
4.1. West ern Blot ( WB)
El pellet celular se lisó en buffer RI PA ( NaCl 150 m M, Tris 10 m M, EDTA 5 m M, SDS
1% , Trit on X- 100 1% , Desoxicolat o de sodio 1% m ás una m ezcla de inhibidores de
prot easa ( PI ERCE) ) , durant e 40 m inut os a 4º C. Luego se cent rifugó 20 m inut os a 13000
rpm para separar la fase soluble de la insoluble, conservándose el sobrenadant e. Se
det erm inaron las concent raciones de prot eínas t ot ales en el sobrenadant e de cada uno
de los lisados m ediant e el kit Micro BSA Prot ein Assay ( PI ERCE) .
Se sem bró la cant idad indicada en cada caso de prot eínas t ot ales en un gel de 10
% de poliacrilam ida con SDS ( condiciones desnat uralizant es) , se realizó la corrida
elect roforét ica ( ent re 75 y 100 m V, volt aj e const ant e) y luego la t ransferencia a
m em brana de nit rocelulosa ( 250 m A, am peraj e const ant e) ( Am ersham ) . Se bloqueó la
m em brana con una solución de bloqueo: TBS ( 10 m M Tris·Cl, 150 m M NaCl, pH 7.5) con
0.05 % Tween- 20 ( TBS- T) m ás 2% de BSA ( album ina bovina sérica, Sigm a- Aldrich) . La
presencia de Nef se evidenció incubando la m em brana con un ant ricuerpo policlonal
( AcPo) hecho en conej o ant i- Nef ( HI V- 1 Nef Ant iserum # cat : 2949, program a de
provisión de react ivos del I nst it ut o Nacional de Salud de los Est ados Unidos, NI H AI DS
Research and Reference Reagent Program ) , diluido 1: 4000, en solución de bloqueo.
Com o cont rol int erno de carga se reveló la m em brana con un ant icuerpo m onoclonal
( AcMo) ant i- β-act ina ( Clon AC- 15, rat ón, Sigm a- Aldrich) , 1: 2000 en el m ism o diluyent e.
Luego de 3 lavados con TBS- T, en cada caso, se incubó la m em brana con el ant icuerpo
( Ac) secundario correspondient e conj ugado a peroxidasa ( HRP) ( Kit ECL West ern
blot t ing, Am ersham ) durant e 1 hr a TA con agit ación. Al finalizar est a últ im a incubación,
se lavó t res veces y se procedió con la det ección de la expresión de las prot eínas
revelando las m em branas con el react ivo ECL West ern blot t ing ( Am ersham ) . La cant idad
relat iva de Nef en las m em branas de WB se det erm inó por densit om et ría, ut ilizando el
program a Quant it y one ( BI ORAD) .
4.2. I m m unofluorescencia
55
Mat eriales & Mét odos
Se
infect aron
células
HeLa
( células
hum anas
obt enidas
a
part ir
de
un
adenocarcinom a de cérvix) adheridas a cubreobj et os con 0.1 UFP/ célula de MVAnefBF y
MVAsalvaj e. En el caso de los vect ores de ADN, se realizaron t ransfecciones de células
293- T ( células epit eliales de riñón hum ano) t am bién adheridas a cubreobj et os, con 10 μg
de cada vect or en presencia de lipofect am ina ( Lipofect am ine 2000, I nvit rogen) . Luego de
48 horas post infección ( hpi) o post t ransfección, se lavaron las células con PBS, se
fij aron con una solución de paraform aldehido al 4% y se perm eabilizaron m ediant e el
t rat am ient o con PBS 0,1% Trit ón durant e 10 m inut os a t em perat ura am bient e. Se
lavaron nuevam ent e las células con PBS y se bloqueó con una solución de 20% de BSA
en PBS. Luego, se incubaron las células 1 hr a 37º C con un AcPo ant i- Nef de conej o
( m ism o que para WB, NI H AI DS Research & Reference Reagent Program ) y con el Ac C3,
que reconoce la prot eína de 14 kDa de VV, hecho en rat ón ( generado en el laborat orio
del Dr. Mariano Est eban y descript o en [ 113] ) . Se lavaron las células con PBS y se
incubaron con los ant icuerpos secundarios 1 hr a 37º C, ant i inm unoglobulina de conej o
conj ugado
a
Alexa488
y
ant i- inm unoglobulina
de
rat ón
conj ugado
a
Alexa647
( I nvit rogen) . Adem ás, en est e paso se agregó react ivo de To- Pro ( Molecular Probes) para
t eñir ADN o Ac para t eñir est ruct uras del aparat o de Golgi. Luego de realizar varios
lavados con PBS, se m ont aron los cubreobj et os sobre port aobj et os y las im ágenes fueron
obt enidas m ediant e el uso de un m icroscopio confocal ( Bio- Rad Radiance 2100 confocal
laser m icroscope) .
4.3. Cuant ificación de Células Secret oras de I FN- γ por ELI SPOT
En t odos los casos que se describen a cont inuación, los result ados se expresan
com o Células Secret oras de I FN- γ ( CS I FN- γ) / 10 6 PBMC o CS I FN- γ/ 10 6 esplenocit os,
dependiendo del origen de las células. Se rest aron los valores de los cont roles negat ivos,
siendo siem pre m enores a 20- 30 CS I FN- γ/ 10 6 para hum anos y ent re 20- 40 CS I FNγ/ pocillo para rat ón.
El punt o de cort e para considerar una respuest a posit iva fue 50 CS I FN- γ/ 10 6 PBMC
o esplenocit os y que superaran al m enos 2 veces el valor del cont rol negat ivo [ 114] .
4.3.1. Est ím ulos:
Los pépt idos sint ét icos de NefBF ( 13 a 15 am inoácidos ( aa) , solapados en 11 aa)
fueron diseñados por la Dra. Gabriela Turk para su t esis doct oral a part ir del program a
Pept Gen ( Los Alam os HI V dat abase, ht t p: / / hiv- web.lanl.gov) ut ilizando com o m odelo la
secuencia de referencia de las form as CRF12_BF, ARMA159 ( núm ero de acceso GenBank
AF385936) y m anufact urados por la em presa JPT Pept ide Technologies ( Alem ania) . En
56
Mat eriales & Mét odos
t ot al son 36 pépt idos num erados del 1 al 36 com o BF1, BF2, et c. Est os pépt idos t ienen
una hom ología del 98.06% con la secuencia expresada en los vect ores ADN NefBF,
MVAnefBF y VVnefBF, y un 76.55% de hom ología con los vect ores que expresan NefB
( Tabla 6) .
Ta bla 6 : H om ología e n t r e la s se cu e n cia s u t iliz a da s e n e st e
t r a ba j o de t e sis. NefBF y NefB son las secuencias expresadas
desde los vect ores de ADN y virales.
% de
H om ología
N e fBF
Pé pt idos
BF
N e fBF
-
Pé pt idos BF
98.06
-
N e fB
76.50
76.55
-
Pé pt idos B
76.32
75.84
95.67
Pé pt idos
B
N e fB
-
Los pépt idos de NefB, basados en la secuencia consenso B, fueron obt enidos a
part ir del program a de provisión de react ivos del I nst it ut o Nacional de Salud de los
Est ados Unidos ( NI H AI DS Research and Reference Reagent Program ) . Ést os son 49
pépt idos, num erados del 39 al 87 com o B39, B40, et c. Est os pépt idos t ienen un 95.67%
de hom ología con la secuencia prim aria de las prot eínas expresadas por los vect ores ADN
NefB y VVnefB, m ient ras que poseen un 75.84% de hom ología con la secuencia de los
vect ores BF ( Tabla 6) .
Ta bla 7 : D ise ñ o de m a t r ice s pa r a la de t e r m in a ción de
pé pt idos in m u n ogé n icos. A- Mat riz BF. B- Mat riz B.
A - M a t r iz BF
Poole s
PBF1
PBF2
PBF3
PBF4
PBF5
PBF6
PBF7
BF1
BF2
BF3
BF4
BF5
BF6
PBF8
BF7
BF8
BF9
BF10
BF11
BF12
PBF9
BF13
BF14
BF15
BF16
BF17
BF18
PBF10
BF19
BF20
BF21
BF22
BF23
BF24
PBF11
BF25
BF26
BF27
BF28
BF29
BF30
PBF12
BF31
BF32
BF33
BF34
BF35
BF36
Poole s
PB1
PB2
PB3
PB4
PB5
PB6
PB7
PB8
B39
B40
B41
B42
B43
B44
B45
PB9
B46
B47
B48
B49
B50
B51
B52
PB10
B53
B54
B55
B56
B57
B58
B59
PB11
B60
B61
B62
B63
B64
B65
B66
PB12
B67
B68
B69
B70
B71
B72
B73
PB13
B74
B75
B76
B77
B78
B79
B80
PB14
B81
B82
B83
B84
B85
B86
B87
B - M a t r iz B
57
Mat eriales & Mét odos
Los pépt idos liofilizados fueron resuspendidos en DMSO a 20 μg/ μl y conservados a
- 20º C hast a su uso.
Para la reest im ulación de las células in vit ro se realizaron m ezclas ( pooles) de
pépt idos BF y B, conservándose a una concent ración de 0,55 μg de cada pépt ido/ μl en el
caso de NefBF y 0,59 μg/ μl en el caso de NefB. Am bas m ezclas se ut ilizaron a una
concent ración final, en los pocillos j unt o con las células, de 2 μg/ m l de cada pépt ido.
Para la det erm inación de pépt idos individuales inm unodom inant es se realizaron
m ezclas de pépt idos, pooles, form ando una m at riz, de acuerdo a la m et odología
descript a originalm ent e por Addo y colaboradores [ 66] . Brevem ent e, los pépt idos se
dist ribuyeron de form a que cada uno se encuent ra represent ado en dos pooles. Así, de la
int ersección de los pooles posit ivos se puede inferir el/ los pépt idos inm unodom inant es
( Tabla 7 A y B) . Para los pépt idos BF se realizó una m at riz de 6x6 ( 12 pooles) , m ient ras
que para los pépt idos B se realizó una m at riz de 7x7 ( 14 pooles) .
4.3.2. ELI SPOT Murino:
Placas de 96 pocillos con fondo de nit rocelulosa ( Mult iScreen HA plat es; Millipore
Corporat ion) se incubaron con el Ac de capt ura ant i- I FN- γ de rat ón diluido en PBS, com o
indica el fabricant e ( BD Elispot m ouse I FN- γ elispot pair) , t oda la noche a 4º C.
Los esplenocit os fueron sem brados en los pocillos, por t riplicado, ent re 10 5 y 10 6
células por pocillo, j unt o con los pooles de pépt idos a una concent ración final de 2 μg/ m l
para cada pépt ido en RPMI c. Com o cont rol negat ivo se ut ilizó RPMI c m ás 0.5% de DMSO
( diluyent e de las soluciones st ock de los pépt idos) . Com o cont rol posit ivo se usó un
est ím ulo inespecífico com o es la ConA, 1 μg/ m l.
Las placas se incubaron 30 hs a 37º C 5% CO2 , se lavaron 2 veces con H2 O
t ridest ilada incubando de 3 a 5 m inut os, seguidos por 3 lavados con PBS- T ( PBS con 0.05
% Tween- 20) . Luego se incubó las placas durant e 16 hs a 4º C con el Ac de det ección
conj ugado a biot ina ( BD Elispot m ouse I FN- γ elispot pair) diluido en PBS 10% SFB. Al día
siguient e se lavó e incubó la placa durant e 1 hr con est rept avidina conj ugada a
peroxidasa diluida en PBS 10% SFB ( BD PharMingen, San Diego, CA) . Luego de 6
lavados, 4 con PBS- T y 2 con PBS, se revelaron los punt os ( spot s) con una solución de 1
μg/ m l del sust rat o t et rahidrocloruro de 3.3- diam inobenzidina ( DAB, Sigm a- Aldrich)
cont eniendo 0.015% de H2 O2 . La reacción se det uvo por lavados con agua.
Se adquirió la im agen de cada pocillo con un Lect or de placas de ELI SPOT ( Cellular
Technology Lt d.) m ediant e el program a I nm unoSpot Acquisit ion. El análisis de los dat os
se realizó con el program a I m m unoSpot ( Cellular Technology Lt d.) .
Según el t rat am ient o que hayan t enido las células ant es de sem brar la placa, se
diferencian en est e t rabaj o cuat ro variant es de la t écnica:
58
Mat eriales & Mét odos
4.3.2.1. ELI SPOT Fresco
Est e ensayo de ELI SPOT se realizó con esplenocit os frescos, recién aislados a part ir
de los rat ones.
4.3.2.2. ELI SPOT Direct o
En est e caso, se ut ilizaron esplenocit os que fueron criopreservados. Las células se
descongelaron el día ant erior al ensayo, se las dej ó durant e la noche en RPMI c a 37º C
5% CO2 . Al día siguient e se procedió a sem brar la placa.
4.3.2.3. ELI SPOT Específico para Vaccinia
Para est e ensayo se ut ilizó la línea celular P815 ( células de m ast ocit om a m urino,
H2- d, que sólo expresa MHC- I ) infect adas con VVHA- , a una MOI de 5 UFP/ célula, com o
present adoras de ant ígeno. A las 4,5 hpi las células fueron t rat adas con m it om icina C ( 30
μg/ m l, Sigm a- Aldrich) , agent e inhibidor de la replicación del ADN [ 115] , y sem bradas en
la placa de ELI SPOT ( 10 5 células por pocillo) j unt o con los esplenocit os [ 91] .
4.3.2.4. ELI SPOT Expandido
El ensayo expandido se realizó siguiendo la t écnica previam ent e descript a [ 116] . Se
ut ilizaron esplenocit os criopreservados, descongelados el día ant erior al inicio del ensayo
( día - 1) . En el día 0 se cont aron las células y se pusieron en cult ivo 2 x 10 6 células con
los pooles de pépt idos ( 2 μg/ m l de cada pépt ido) en placas de 12 pocillos, en 1 m l de
volum en final. Se incubaron durant e 10 días en est ufa gaseada ( 37 o C, 5% CO2 ) ,
recibiendo un pulso de I L- 2 m urina recom binant e a una concent ración sat urant e ( 1800
U/ m l) ( BD Biosciences) en los días 3 y 7. Al día 10, se recogieron las células y se lavaron
dos veces con PBS, se las dej ó en m edio fresco ( sin est ím ulos ni cit oquinas) . Al día
siguient e, día 11, se cont aron y se procedió con el ensayo de ELI SPOT sem brando ent re
3 x 10 4 y 10 5 células/ pocillo.
4.3.3. ELI SPOT Hum ano:
En el caso de los PBMC de pacient es, se ut ilizó un ensayo sim ilar al descript o por
Turk y colaboradores [ 51] pero con algunas m odificaciones:
59
Mat eriales & Mét odos
Para algunos pacient es, las células se ut ilizaron el m ism o día de la separación por
Ficoll Hypaque. Para ot ros se criopreservaron hast a el m om ent o de su uso. Se
plaquearon por duplicado a 10 5 células/ pocillo en placas de 96 pocillos con fondo de
m em brana de PVDF ( Mult iScreen I P plat es; Millipore) , previam ent e incubadas con un
AcMo ant i- I FN- γ hum ano ( BD) . Los pooles de NefB y NefBF se agregaron a una
concent ración final de 2 μg/ m l cada pépt ido. Com o cont rol negat ivo se ut ilizó m edio de
cult ivo m ás 0.5% de DMSO. En el caso del cont rol posit ivo, se ut ilizaron dos est ím ulos
diferent es,
un
pool
de
pépt idos
denom inado
CEF,
form ado
por
pépt idos
de
cit om egalovirus, virus Epst ein- Barr y virus influenza, 2μg/ m l cada pépt ido ( NI H AI DS
Reagent Program ) ; y PMA 5 ng/ m l + ionom icina 500 ng/ m l ( Sigm a- Aldrich) . Todos los
cont roles se realizaron para las células de cada pacient e.
Luego de una incubación de 18 hs a 37 o C 5% CO2 , se revelaron las placas usando
com o Ac de det ección un ant icuerpo m onoclonal ant i- I FN- γ hum ano biot inilado ( BD
Biosciences) . Luego de varios lavados, se incubó con est rept avidina- peroxidasa 1hr a
t em perat ura am bient e ( TA) . Luego de nuevos lavados se agregó el sust rat o AEC ( 3am ino- 9- et il- cabazol, BD) y la reacción se det uvo por lavados con agua. Las placas se
escanearon y cont aron igual que en el caso del ELI SPOT m urino.
4.4. Cuant ificación de Producción de Cit oquinas por ELI SA
Se est im ularon los esplenocit os en RPMI c a 10 6 células/ m l con los pooles B y BF ( 2
μg/ m l cada pépt ido) en placas de 96 pocillos de fondo plano. Com o cont rol posit ivo se
ut ilizó Con A, 1 μg/ m l ( Sigm a- Aldrich) y com o cont rol negat ivo RPMI c con 0.5% de
DMSO. Luego de 72 hs de cult ivo, se recogieron los sobrenadant es y se guardaron a
- 80º C hast a su post erior evaluación. Para la cuant ificación de las diferent es cit oquinas
( I FN- γ, TNF- α e I L- 2) se usaron kit s com erciales ( BD PharMingen) , siguiendo las
indicaciones del fabricant e.
4.5. Cuant ificación de Ant icuerpos Específicos a part ir de Sueros de Rat ones
I nm unizados
4.5.1. Tit ulación de Ant icuerpos I gG para Vaccinia:
Se cuant ificaron los ant icuerpos t ot ales para el virus Vaccinia com o se describió
ant eriorm ent e [ 117] . Brevem ent e, se recubrieron placas de 96 pocillos ( Maxisorp, Nunc)
con virus inact ivado por exposición a luz ult ra violet a a una concent ración de 5 μg de
prot eína/ m l en buffer carbonat o ( 0,84 g NaHC0 3 + 0,356 g Na 2 C0 3 + 100 m l agua
60
Mat eriales & Mét odos
dest ilada, pH: 9,6) . Se recubrieron las placas con 50 μl/ pocillo y se incubó a 4º C durant e
una noche. Las placas se bloquearon 1 hr a 37º C, con PBS- T + 10% SFB. Luego de 3
lavados con PBS- T se incubaron los sueros de los rat ones individuales diluidos en PBS- T
+ 10% SFB. Después de la incubación de 1 hora a 37º C, se lavo e incubó con el
ant icuerpo ( conej o) de det ección ant i- I gG de rat ón conj ugado a HRP ( ECL Kit Am ersham )
en una dilución 1: 3000 en PBS- T 10% SFB ( 1 hr a 37°C) . Después de realizar 6 lavados
con PBS- T se reveló el ensayo con el sust rat o TMB ( Sigm a- Aldrich) . Se paró la reacción
con H2 SO4 2N y se m idió la absorbancia a 450 nm en un lect or de placas de ELI SA
( Labsyst em s, Chicago, I ll.) . Las m uest ras fueron consideradas posit ivas cuando la m edia
( de duplicados o t riplicados) era m ayor a 2 veces el valor de los sueros de los anim ales
sin inm unizar m ás 3 veces su desvío est ándar.
4.5.2. Tit ulación de Ant icuerpos I gG2a para NefBF y NefB:
Se cuant ificaron los ant icuerpos específicos para NefBF y NefB, ut ilizando los
pépt idos descript os ant eriorm ent e ( M&M, 4.3.1.) y prot eína recom binant e de NefB
( obt enida a part ir del program a de provisión de react ivos del I nst it ut o Nacional de Salud
de los Est ados Unidos, NI H AI DS Research and Reference Reagent Program ) . Se
prosiguió con el prot ocolo descript o para ant ígenos de Vaccinia ( 4.5.1. M&M) , con las
siguient es m odificaciones. Se recubrieron placas de 96 pocillos ( Maxisorp, Nunc) con una
dilución de los pépt idos a 10 μg/ m l o de la prot eína recom binant e NefB 2 μg/ m l, en
solución carbonat o. Se prosiguió con el prot ocolo y se incubaron los sueros de los rat ones
m ezclados por grupo, diluidos 1: 100 en PBS- T 10% SFB. Después de la incubación 1
hora a 37º C se lavo e incubó con el ant icuerpo ( cabra) ant i- m ouse I gG2a conj ugado a
HRP ( Sant a Cruz Biot echnology) en una dilución 1: 4000 en PBS- T 10% SFB ( 1 hr a
37°C) . Se finalizó con la rea cción colorim ét rica com o se describió previam ent e en el
punt o ant erior.
5 . Té cn ica s Vir ológica s
5.1. Tit ulación de los St ocks Virales
Para las dos t écnicas descript as a cont inuación,
se cont aron las unidades
form adoras de placas ( UFP) por pocillo y se calcularon la cant idad por m l. El cálculo del
t ít ulo se realizó con la siguient e cuent a:
UFP/ m l = cant idad de placas de lisis x [ 1 m l / 0.4 m l ( volum en de infección) ] x fact or de
dilición ( 10, 100, 1000, …)
61
Mat eriales & Mét odos
5.1.1. Tit ulación por Tinción con Crist al Violet a:
En el caso de los virus de la cepa WR, la t it ulación se realizó por t inción con crist al
violet a ( CV) . Brevem ent e, se infect aron células BSC- 40 en placas de 6 pocillos, con 400
μl de diferent es diluciones, seriadas al décim o, de los st ocks. Luego de 1 hr de adsorción,
se ret iró el inoculo y se agregaron ent re 2 y 3 m l de DMEM 2% SFB. A las 48 hs, se ret iró
el m edio, se lavó con PBS y se t iñó, durant e 5 m inut os, con una solución 1% de CV en
m et anol- acet ona ( 1: 1) . Luego se lavó con agua. Las placas de lisis se evidencian por la
ausencia de color violet a.
5.1.2 Tit ulación por I nm unot inción:
En el caso de MVA, la t it ulación se realizó por inm unot inción [ 118] . Para est o, se
infect aron células BHK- 21, de la m ism a form a que ant es. A las 48 hs se lavaron y fij aron
con m et anol- acet ona ( 1: 1) . Luego de un lavado con PBS se incubó con un suero
policlonal ant i- WR ( de conej o, cedido por el Dr. Mariano Est eban, España) a una dilución
1: 2000 en PBS 3% SFB ( 1 hr, TA) . Luego de 3 lavados, se incubó con un AcPo ant iconej o conj ugado a HRP, 1: 2000 en PBS 3% SFB, 1 hr, a TA ( Sigm a- Aldrich) . Luego de 3
lavados con PBS se revelaron los punt os con una solución 0.85 μg/ m l de DAB ( Sigm a-
Aldrich) cont eniendo 0.015% de H2 O2 y 1% de Sulfat o de níquel ( 3% ) . Los focos de
infección se evidenciaron por un precipit ado color negro sobre la m onocapa celular.
5.2. Tit ulación de Ant icuerpos Neut ralizant es de Vaccinia
Los
sueros
de
los
anim ales
fueron
m ezclados
por
grupo
y
luego
se
decom plem ent aron a 56 º C por 30 m inut os. Se hicieron diluciones y se incubaron con
virus vaccinia ( cepa WR) a una concent ración final de 200 UFP/ m l, en 200 μl en DMEM
2% SFB a 37º C durant e 1 hr. Est a m ezcla se usó com o inóculo para infect ar células BSC40 en placas de 6 pocillos. A las 48 hs se t it uló por t inción con CV. Se cont ó el núm ero de
placas de lisis en cada caso y se calculó la act ividad neut ralizant e en relación al suero de
los anim ales sin inm unizar.
6 . Aná lisis de los D a t os
Todos los dat os fueron expresados com o el prom edio + su desvío est ándar ( DS) de
duplicados o t riplicados para cada det erm inación de cada grupo. En el caso de los
experim ent os realizados en rat ones, las m ediciones se hicieron sobre pool de 4 anim ales
62
Mat eriales & Mét odos
o en la m uest ra individual, según se indica en cada caso, y son represent at ivos de 2 o 3
experim ent os. El t est de St udent fue usado para com parar la diferencia ent re grupos. Un
valor de p< 0.05 fue considerado est adíst icam ent e significat ivo.
63
Result ados
Result ados I
Result ados I : React ivos Biológicos
1 . Ge n e r a ción de Re a ct ivos Biológicos
Debido a la com plej idad de la epidem ia en Argent ina y el m undo, es im port ant e evaluar
la relevancia de la inm unidad subt ipo específico en el desarrollo de pot enciales vacunas.
Para est o, se plant eó el obj et ivo de desarrollar vect ores virales que expresen la prot eína
Nef del subt ipo B y de la CRF12_BF, para, luego de su caract erización, ut ilizarlos ( j unt o
con los vect ores de ADN) en ensayos de inm unogenicidad en rat ones.
1.1. Const rucción de los Vect ores de Transferencia para Vaccinia: pJRnefBF y
pJRnefB
A part ir de los vect ores de ADN NefBF y ADN NefB se procedió al subclonado de las
secuencias codificant es para am bas prot eínas dent ro del vect or de t ransferencia pJR101
siguiendo los pasos det allados en M&M y en la figura 11.
En el caso de NefBF se eligió la secuencia pert enecient e a la m uest ra ARMA185
( núm ero de acceso en el GenBank AY037279) debido a que t iene m ás del 92% de
hom ología con ot ras variant es CRF12_BF y m ás de 90% de hom ología con ot ras
secuencias recom binant es BF descript as en Argent ina.
La secuencia de nefB ut ilizada en est e t rabaj o es la secuencia obt enida del vect or
pNL4.3. Est e clon m olecular fue obt enido a t ravés del program a de provisión de react ivos
del I nst it ut o Nacional de Salud de los Est ados Unidos ( NI H AI DS Research and Reference
Reagent Program [ 103] ) .
Figu r a 1 4 : Ta m iz a j e por dige st ión de l AD N y libe r a ción de l in se r t o. Visualización, m ediant e
elect roforesis en gel de agarosa, del product o de digest ión del ADN de diferent es colonias
t ransform adas con la m ezcla de ligación de: A- pJRnefBF digerido con las enzim as Bam HI y Eco
RI , B- pJRnefB, digerido con las enzim as Bam HI y Not I .
65
Result ados I
Luego de las digest iones y ligaciones correspondient es para cada insert o, se
t ransform aron las bact erias com pet ent es. A part ir del cult ivo de dist int as colonias
aisladas se purificó ADN y se procedió con el t am izaj e, m ediant e digest ión con las
enzim as de rest ricción Bam HI y Eco RI , en el caso de nefBF, y Bam HI y Not I , para
nefB, para localizar las bact erias que port aran el plásm ido con el insert o en la orient ación
correct a. En la figura 14 se m uest ran los geles de agarosa donde se sem braron las
digest iones del ADN provenient e de diferent es colonias de bact erias t ransform adas con la
m ezcla de ligación de NefBF ( A) o NefB ( B) . Para NefBF, se puede ver la banda
pert enecient e al insert o en el caso de las colonias 2 y 5, m ient ras que para NefB se
puede observar la liberación del insert o en t odos los casos. Se obt uvieron m ayor cant idad
de colonias posit ivas que en el caso de NefB debido a que la est rat egia de clonación
usando enzim as que dej an ext rem os cohesivos es m ás eficient e por dos m ot ivos: por un
lado, dej a com o product o m enor cant idad de vect or circularizado sin insert o, m ient ras
que por ot ro, la ligación con ext rem os rom os ( NefBF) da procuct os con la orient ación
inversa, los que no se ven en la digest ión.
A part ir de uno de los clones posit ivos para cada secuencia se generó un st ock de
bact erias para su criopreservación y su post erior uso.
1.2. Generación y Purificación de los Virus Recom binant es
1.2.1. MVAnefBF:
El virus MVAnefBF fue generado por recom binación hom óloga ent re el vect or de
t ransferencia pJRnefBF y el virus MVA salvaj e en células BHK- 21 m ediant e infecciónt ransfección. Luego, se realizaron 9 pasaj es consecut ivos en células CEF seleccionando
los focos de infección con virus recom binant e por visualización de la función del gen
report ero, que genera un product o azul luego de la adición de su sust rat o X- Gluc ( Figura
12) , hast a conseguir un st ock libre de virus salvaj e. Se consideró un clon puro cuando
luego de 2 infecciones seriadas no se observó virus salvaj e ( placas blancas) . Se
obt uvieron dos clones puros, # 28 y # 29, los cuales se chequearon por PCR diferencial
( M&M, 1.3.1.) , a part ir de ADN de células infect adas con los m ism os, obt eniéndose en
am bos casos sólo la banda de 450 pb, pert enecient e al genom a recom binant e y
observándose la ausencia de la banda de 950pb, que debería am plificarse en caso de
haber virus salvaj e ( locus HA int act o) ( Figura 15 Ai) . La posición de los cebadores
ut ilizados se m uest ra en la figura 13 y las secuencias de los m ism os en la t abla 4. Los
pasaj es en CEF y la PCR diferencial se realizaron en el laborat orio de la Dra. Calam ant e,
en el I nst it ut o de Biot ecnología, CI CVyA, de I NTA Cast elar, ya que cuent an con la
66
Result ados I
m et odología y la infraest ruct ura necesaria. Est e análisis dem uest ra que am bos clones se
encuent ran puros, es decir libres de virus salvaj e.
De la m ism a m anera, se corroboró que am bos clones expresaran correct am ent e la
prot eína de int erés. Para est o se realizó un WB a part ir de ext ract os prot eicos de células
BHK- 21 infect adas con los dos clones recom binant es y MVA salvaj e com o cont rol
negat ivo ( Figura 15 Aii) .
Para los ensayos de aquí en adelant e se ut ilizó el clon # 28, el cual se am plificó en
una placa de 60 m m de diám et ro obt eniendo un prim er st ock ( P2) .
Figu r a 1 5 : An á lisis de pu r e z a y e x pr e sión de l ge n r e com bin a n t e e n los clon e s de
M VAn e fBF, VVn e fBF y VVn e fB. A- MVAnefBF: i- PCR diferencial realizada para t est ear la posible
cont am inación de los clones 28 y 29 por virus salvaj e ( MVAsalv) , se usó 120ng de ADN ext raído de
células CEF infect adas con cada clon y MVAsalv; com o cont rol se usó ADN plasm ídico. ii- WB
realizado a part ir de ext ract o port eico t ot al de células BHK- 21 infect adas con cada clon y MVAsalv.
B- PCR convencional realizada para t est ear la posible cont am inación de los clones puros por virus
salvaj e, se usó 25ng de ADN ext raído de células BSC- 40 infect adas con los virus VVnefBF ( i) y
VVnefB ( ii) ; ADN plasm ídico, ADN ext raído de células sin infect ar o infect adas con VVsalvaj e se
usaron com o cont roles. CN reacción sin ADN.
1.2.2. Virus Recom binant es Basados en la Cepa West ern Reserve del Virus
Vaccinia:
67
Result ados I
De la m ism a m anera que para el MVA recom binant e, se generaron los virus VV
recom binant es ( VVr) basados en la cepa replicat iva de Vaccinia West ern Reserve ( WR)
que llevan la secuencia codificant e para NefBF, NefB o solo port an la deleción en el locus
HA ( VVHA- ) . En est os casos, t ant o la infección/ t ransfección com o los pasos de
purificación se hicieron en células BSC- 40. En el caso del VVHA- se realizaron 6 rondas
de purificación. Para los VVnefBF y NefB, 7 y 8 pases respect ivam ent e.
Al igual que para el MVAnefBF, se corroboró la ausencia de virus salvaj e m ediant e
PCR. El la figura 15 B se observan las bandas am plificadas por PCR convencional para
VVnefBF ( i) y para VVnefB ( ii) . En am bos casos se ve la banda de 3500 pb, pert enecient e
al genom a recom binant e, y la ausencia de la banda de 950 pb, am plificada a part ir de
genom a salvaj e.
De est os result ados se puede deducir
que am bos virus recom binant es se
encuent ran libres de virus salvaj e.
2 . Ca r a ct e r iza ción de los Re a ct ivos Biológicos
2.1. Vect ores ADN
2.1.1. Caract erización de la Expresión de NefBF y NefB a part ir de los Vect ores
de ADN:
Para analizar la correct a expresión de las prot eínas de int erés a part ir de los
vect ores de ADN se t ransfect aron líneas celulares de diferent es orígenes: hum ano y
m urino, 293- T y 3T3 respect ivam ent e, con los diferent es plásm idos. En la figura 16 A se
m uest ra el WB de células 293- T ( panel superior) o 3T3 ( panel inferior) t ransfect adas con
los plásm idos indicados. En cada panel se indica la m em brana revelada ut ilizando un
AcPo ant i- Nef y la m em brana revelada con un AcMo ant i- β−act ina, com o cont rol int erno
de carga. En el caso de las células 293- T se cargaron 10 μg de prot eínas t ot ales por calle,
m ient ras que para las células 3T3 se cargaron 50 μg. Est a diferencia se debe a la
eficiencia de t ransfección de cada línea, la cual es m enor en el caso de las 3T3.
Com o se esperaba para las células t ransfect adas con los ADN NefBF y NefB, se
observó la banda pert enecient e a Nef de 27 kDa, m ient ras que en aquellas t ransfect adas
con el plásm ido cont rol la banda est á ausent e, evidenciando la especificidad del AcPo. En
t odos los casos se reveló la banda de 40 kDa, pert enecient e a la prot eína β- act ina en
proporciones sim ilares.
68
Result ados I
Se ext endió la caract erización de la expresión de la prot eína NefBF a t ravés del
análisis de la localización subcelular, m ediant e el uso de m icroscopia confocal. En la
figura 16 B se puede observar la dist ribución uniform e de Nef a lo largo del cit oplasm a de
las células 293- T, 48 hs después de ser t ransfet adas con el plásm ido ADN NefBF. Se
evidenciaron alt os niveles de prot eína int racit oplasm át ica, m ient ras que en las células
t ransfect adas con el plásm ido cont rol, ADNc, no se observó la prot eína recom binant e.
Est os ensayos dem uest ran la capacidad de los vect ores de ADN de expresar las
prot eínas de int erés en diferent es líneas celulares hum anas y m urinas.
Figu r a 1 6 : Ex pr e sión de N e fBF y B a pa r t ir de los ve ct or e s de AD N . A- Det ección de Nef por
WB a part ir de 293- T o 3T3 t ransfect adas con 10μg de cada ADN indicado. Com o cont rol se
t ransfect aron células con ADN vacio ( ADNc) . Se cuant ificaron las prot eínas de los lisados celulares
y se sem braron en un gel de poliacrilam ida 10 μg de ext ract os prot eicos de células 293- T ( arriba) y
50 μg de ext r act os provenient es de 3T3 ( abaj o) . La expresión de β- Act ina celular se usó com o
cont rol int erno. B- Localización int racelular de NefBF por inm unoflorescencia en células 293- T 48 hs
post - t ransfección. AcPo ant i- Nef: Verde, Ac ant i ant ígenos Del aparat o de Golgi: Roj o
2.2. Vect ores Virales
2.2.1. Est abilidad del Vect or Recom binant e MVAnefBF:
Después de su generación, se evaluó si la const rucción del virus recom binant e
MVAnefBF era est able luego de varios pasaj es. Para est o, se realizó un t est de est abilidad
que consist ió en una serie de pasaj es en m edio líquido part iendo del st ock 1 ( am plificado
original del clon purificado, libre de virus salvaj e) . Se infect aron m onocapas de células
BHK- 21 sucesivam ent e hast a el pasaj e núm ero 11, usando una baj a MOI ( 0,1- 0,01) en
cada am plificación para asegurar varias rondas de replicación viral. Est o se realizó en
69
Result ados I
m edio líquido, sin ningún proceso de selección de virus recom binant e en cada pasaj e. Al
finalizar los pasaj es ciegos, se evaluó la est abilidad genóm ica por PCR diferencial a part ir
de ADN ext raído de células BHK- 21 infect adas con el virus producido en los pasaj es 4, 6,
8 y 11 ( P4, P6, P8 y P11, respect ivam ent e) .
En la figura 17 Ai se pueden observar las bandas pert enecient es a los genom as
recom binant es y ausencia de genom a salvaj e. En el pasaj e núm ero 4 se llevó a cabo una
am plificación a gran escala para generar el st ock viral que se ut ilizó en los est udios de
inm unización, luego de su purificación por colchón de sacarosa ( M&M, 2.1.) . En est e
pasaj e, se t est eó la int egridad del casset t e recom binant e por m edio de una PCR
convencional, am plificando t odo el casset t e de expresión ( Figura 17 Aii) . Est a banda fue
secuenciada y se verificó que la m ism a no t enía ningún cam bio con respect o a la
secuencia original.
Figu r a 1 7 : An á lisis de la e st a bilida d de l M VAn e fBF. A- i La est abilidad genóm ica se analizó
m ediant e PCR diferencial a part ir de células BHK- 21 infect adas con virus de diferent es pases ( P4,
P6, P8 y P11) , MVA salvaj e ( salv) , células sin infect ar y reacción sin ADN ( C- ) . ii PCR convencional
realizada a part ir de ADN de células BHK- 21 infect adas con el pase 4, P4 ( st ock para inm unizar) ,
células sin infect ar ( BHK- 21) , ADN plasm ídico de pJRnefBF ( + ) y reacción sin ADN ( C- ) . B- La
expresión de Nef fue visualizada m ediant e WB. Células sin infect ar ( BHK) , cont rol posit ivo ( C+ ) ,
células infect adas con 12 u 11 clones aislados del st ock P4 o P11, respect ivam ent e.
Para cont inuar con la evaluación de la est abilidad de la const rucción se chequeó la
expresión de la prot eína de int erés m ediant e la t écnica de WB, a part ir de placas azules
aisladas de los pases P4 ( st ock vacunal) y P11. De las 12 placas para el P4 y 11 para el
P11 que se analizaron, el 100 % de las placas expresaban Nef ( Figura 17 B) .
70
Result ados I
Ot ra t écnica por la que se corroboró la pureza y est abilidad de la expresión del gen
recom binant e fue m ediant e t it ulación por inm unot inción de la m onocapa de células BHK21 infect ada ( con el P4, st ock vacunal) , ya sea con un AcPo ant i- Nef o con un suero
policlonal ant i- WR, obt eniendo t ít ulos m uy sim ilares con am bas t inciones: 1,55 x10 9 ó
1,45 x10 9 UFP/ m l, respect ivam ent e. Est o indica que el 100% de la población del
MVAnefBF expresa la prot eína de int erés.
En conj unt o, est os ensayos dem ost raron que, luego de 11 pasos de am plificación,
la const rucción del MVAnefBF result ó est able, t ant o el casset t e insert o en el genom a,
com o la expresión de la prot eína de int erés.
Figu r a 1 8 : Cin é t ica de cr e cim ie n t o de los ve ct or e s vir a le s r e com bin a n t e s. A- Células BHK21 fueron infect adas con 0.01 UFP/ célula de MVAnefBF o salvaj e, B- Células BSC- 40 fueron
infect adas con VVnefBF, VVnefB o VVHA- . A los t iem pos indicados se recogieron las fracciones int ra
y ext racelulares y se t it uló el virus present e en cada una de ellas. Los dat os represent an el t ít ulo
prom edio de pocillos por duplicado con su desvío est ándar.
2.2.2. Cinét ica de Crecim ient o de los Virus Recom binant es:
Est udios previos realizados con vect ores VV recom binant es que expresaban
secuencias de Nef provenient es de diferent es variant es de SI V, han dem ost rado que la
prot eína Nef pert enecient e a una cepa de m ayor pat ogenicidad del virus de la
71
Result ados I
inm unodeficiencia sim iana ( SI Vm ac239) act uaba com o un fact or negat ivo para el virus
Vaccinia, generando alt eraciones en la m orfología de la placa de lisis en cult ivo y
m ost rando un ret ardo en el crecim ient o [ 119, 120] . A part ir de est os dat os previos, se
decidió analizar la cinét ica de crecim ient o de los vect ores virales recom binant es,
com parando cada uno con su progenit or salvaj e. Para est o se infect aron células BHK- 21
con el MVAnefBF o BSC- 40 con los VVr, a baj a MOI ( 0.01 UFP/ célula) . A diferent es
t iem pos pi ( 0, 24, 48 y 72 hs) se recolect aron las fracciones int ra y ext racelulares,
t it ulando el virus present e por crist al violet a o por inm unot inción, según se describió en
las secciones 5.1.1. y 5.1.2. de M&M.
En la figura 18 A se m uest ra la curva de crecim ient o del virus MVA recom binant e y
salvaj e, para am bas fracciones. No se encont ró diferencia ent re el pat rón de crecim ient o
del virus recom binant e y la cepa salvaj e. Adem ás, la cant idad final de virus obt enida,
t ant o en la fracción int ra com o ext racelular, fue com parable con est udios previos [ 54] . A
part ir de est e análisis se puede concluir que la expresión de la prot eína Nef no afect a el
crecim ient o del MVA recom binant e.
En cuant o a los vect ores basados en la cepa WR, las curvas de crecim ient o para la
fracción int racelular de los virus VVnefBF y VVnefB fueron sim ilares a las del VVHA( Figura 18) , y aunque en la fracción ext racelular se puede observar una diferencia de
aproxim adam ent e un logarit m o para el VVnefBF, nót ese que a las 24hs est a diferencia ya
exist ía, con lo cual el increm ent o t ot al es el m ism o para t odos los virus. La diferencia
inicial no puede at ribuirse a una falla en la infección, ya que no se observa en el caso de
la fracción int racelular.
Figu r a 1 9 : For m a ción de pla ca s de lisis a t ípica s e n e l VVn e fBF. A- Fot ografía de células BSC40 infect adas con VVHA- y VVnefBF, t eñidas con CV 48 hpi. B- Medida prom edio de placas de lisis
de diferent es t am años producidas por el VVnefBF y VVHA- , n= 15. * * p< 0.0001.
72
Result ados I
Por ot ro lado, se observó una alt eración en el t am año de la placa de lisis en las
células BSC- 40 infect adas con VVnefBF y VVnefB cuando se las com para con el virus
VVHA- ( virus con la m ism a deleción en el gen HA pero sin gen de int erés) . El análisis de
est e fenot ipo ( Figura 19) m uest ra que el t am año m edio de las placas de lisis del VVnefBF
se encuent ra reducido un 40% , con un rango ent re 32% y 64% , con respect o a las
generadas por el VVHA- ( p< 0.0001) . Cuando se analizó la cinét ica de crecim ient o ( Tabla
8) de est e virus discrim inando el t am año de la placa, se observó que inicialm ent e, luego
de la hora de adsorción, la proporción de placas pequeñas fue cerca del 90% en la
fracción int racelular y el 80% en el sobrenadant e luego de 24 hs de infección, m ient ras
que luego de 72 hs sólo se observó un 37 % y 43 % de placa pequeña respect ivam ent e.
Est o podría indicar una selección negat iva sobre las placas de fenot ipo alt erado. De est a
m anera, el com port am ient o del virus recom binant e parece ser sim ilar al VV que llevaba
la prot eína Nef de SI V, descript o con ant erioridad [ 120] . Por ot ro lado, al realizar un
ensayo de crecim ient o in vivo ( con el fin de poner a punt o el experim ent o de desafío, ver
Reult ados I I , 5. Y 5.1.) se observó que, luego de 5 días de inocular a los rat ones, se
recuperaban sólo placas de t am año norm al.
Ta bla 8 : D a t os de los por ce n t a j e s de pla ca pe qu e ñ a y r e gula r a las 0, 24 y 72 horas después
de la infección ( hpi) con el VVnefBF. ND: no det erm inado
M or fología de Pla ca s de lisis de VVn e fBF
Tie m po/ Fr a cción
Ex t r a ce lu la r
I n t r a ce lu la r
VVnefBF
Placa Pequeña
Placa regular
Placa Pequeña
Placa regular
0 hpi
ND
ND
87.5%
12.5%
24 hpi
81%
19%
ND
ND
72 hpi
43%
57%
37.4%
62.6%
2.2.3. Cinét ica de Expresión de Nef desde los Virus Recom binant es en Diferent es
Líneas Celulares:
Com o part e de la caract erización de los vect ores virales se decidió analizar la
capacidad de los virus recom binant es para expresar las prot eínas de int erés en diferent es
líneas celulares en función del t iem po. Para ello, se infect aron las líneas 3T3 ( m urinas) ,
no perm isivas para la replicación viral, y se com paró la cinét ica de expresión con la
obt enida en células BHK- 21, perm isivas para la replicación de MVAnefBF, y BSC- 40 en el
caso de los VVr. Para est o, se infect aron cada una de las m onocapas celulares con una
MOI de 5 UFP/ célula y, a diferent es hpi, se recogieron las células y se analizó la
expresión de Nef por WB ( Figura 20) .
73
Result ados I
Figu r a 2 0 : Ex pr e sión de N e f a pa r t ir de los vir u s r e com bin a n t e s. A- Expresión de NefBF en
las células BHK- 21 y 3T3 infect adas con MVAnefBF, a los t iem pos indicados. B- Expresión de Nef BF
y NefB en células BSC- 40 y 3T3 infect adas con VVnefBF o VVnefB, a los t iem pos indicados. En
am bos casos se ut ilizó una MOI = 5 UFP/ cél. En A se reveló β- act ina com o cont rol int erno. Las
barras indican la cant idad relat iva de Nef en cada t iem po. C- Análisis de inm unofluorescencia de
células HeLa infect adas con el MVAnefBF ( MOI = 0.1 UFP/ célula) , luego de 18 hs se fij aron e
inm unot iñeron con un Ac ant i- Nef ( verde) , Ac ant i- 14K ( roj o) , se usó react ivo de ToPro para
m arcar núcleos ( azul) .
Se puede observar que a las 4 hpi se det ect aron niveles significat ivos de Nef en las
células BHK- 21 ( 60% del nivel m áxim o) , increm ent ándose dichos niveles a las 10 hpi
( 90% ) , m ient ras que ya a las 24 hpi sólo se ve un aum ent o del 10% en los niveles de
74
Result ados I
Nef. En el caso de las células 3T3, la expresión de Nef a las 4 hs fue baj a ( 11 % del nivel
m áxim o) , increm ent ando significat ivam ent e a las 10 hpi ( 70% ) , det ect ándose cant idades
sim ilares ent re las 10 y las 24 hpi. Se ut ilizó la expresión de β- act ina com o cont rol
int erno de carga, para am bos t ipos celulares se vio una dism inución de est a prot eína a
las 24 hs, es at ribuible al efect o cit opát ico, asociado al arrest o t em prano de la sínt esis
prot eica y la m uert e de la célula hospedadora.
A las 48 hs de incubación, debido a que el efect o cit opát ico era t an alt o,
práct icam ent e no se encont ró prot eína en el caso de las células 3T3, m ient ras que en las
BHK- 21 aún se det ect ó un descenso en la prot eína det ect ada ( Figura 20 A) .
En el caso de los vect ores VVnefB y VVnefBF, la expresión de las prot eínas NefBF y
B se m uest ra en los paneles a la derecha de la figura 20 ( B) . Para est os virus t am bién se
observó expresión t em prana: a las 4 hs ya se observa ent re el 15 y el 50 % del nivel
m áxim o det ect ado, m ient ras que el pico de expresión se observa a las 24 hs. De la
m ism a form a que para el MVAnefBF,
la cant idad de prot eína present e en los lisados
celulares a las 48 hs fue m enor que en los de 24hs, nuevam ent e por el efect o cit opát ico,
m uy avanzado después de dos días de incubación.
A cont inuación, para analizar la ubicación int racelular de Nef luego de expresarse a
part ir del virus recom binant e MVAnefBF, se infect aron células HeLa ( de origen hum ano)
con una MOI de 0.1 UFP/ célula. Com o cont rol, se usaron células infect adas con el virus
MVA salvaj e. A las 24 hpi, se realizó una inm unot inción con fluorescencia con Ac
específicos para Nef ( verde) , lo que reveló que la prot eína recom binant e est aba
dist ribuida por t odo el cit oplasm a en las células infect adas con el MVAnefBF. En roj o se
t iñó la prot eína 14K, la que form a part e de la envolt ura del virus Vaccinia m aduro. Com o
se describió previam ent e para infecciones con MVA en células no perm isivas, las
prot eínas t ardías se acum ulan en el cit oplasm a, com o consecuencia del bloqueo en el
ensam blado de las prot eínas necesarias para la m aduración del virión. Debido a que la
infección con MVA no produce viriones infect ivos, la prot eína 14K aparece dist ribuida por
el cit oplasm a de la célula infect ada ( Figura 20 C) .
Est os ensayos dem uest ran la habilidad del MVAnefBF para expresar correct am ent e
prot eínas, propias y recom binant es, luego de la infección en células perm isivas ( BHK- 21)
o no, y en est e últ im o caso, de rat ón o hum anas ( 3T3 y HeLa, respect ivam ent e) . Aunque
la infección por MVA no es product iva en est os t ipos celulares, se expresan las prot eínas
virales t em pranas, int erm edias y t ardías, t ant o propias com o recom binant es, las que se
det ect an dist ribuidas por t odo el cit oplasm a. De la m ism a m anera, se dem ost ró la
capacidad de los vect ores virales basados en la cepa WR de expresar NefBF y B a part ir
de células infect adas.
75
Result ados I
A part ir de los ensayos desarrollados hast a aquí, se puede concluir que se han
generado con éxit o los prim eros vect ores vacunales, de ADN y virales, basados en MVA o
la cepa replicat iva de Vaccinia WR, que expresan la prot eína Nef provenient e de las
variant es circulant es en Argent ina y países lim ít rofes ( B y BF) . Se corroboró la est abilidad
genét ica de los vect ores virales, así com o la capacidad de expresar las prot eínas
recom binant es a part ir de células de dist int os orígenes. El siguient e paso es evaluar la
capacidad de est os vect ores para generar una respuest a inm une a part ir de su
adm inist ración a rat ones, com binándolos en diferent es esquem as de inm unización.
76
Result ados I I
Result ados I I : I nm unogenicidad de NefBF
1 . Ca r a ct e r iza ción de la I n m u n oge n icida d de N e fBF e n Ra t on e s
Luego de haber finalizado con la generación y caract erización de los vect ores que
expresan NefBF y NefB, corroborando la correct a expresión de la prot eína y observando
que no afect ara el crecim ient o de los vect ores virales para su producción en alt a escala,
se procedió a evaluar la inm unogenicidad de est os vect ores, solos o com binados, en
rat ones Balb/ c.
1.1. Respuest a Celular I nducida luego de la I nm unización con los Vect ores de
ADN y MVA
Para evaluar la inm unogenicidad de NefBF expresada desde los vect ores de ADN y
MVA, se inm unizó a los anim ales con dos dosis de los vect ores. Los esquem as de
inm unización em pleados se det allan en la figura 21 A. Ent re ést os, se ut ilizó el prot ocolo
ant eriorm ent e descript o ( I nt roducción 3.3. [ 68, 69] ) denom inado en inglés “ Prim e- Boost ”
( inm unización- refuerzo) .
Dist int os grupos de 4 rat ones, hem bras Balb/ c, fueron inm unizados con los
vect ores ADN ( 100
μg)
y
MVA ( 10 7 UFP)
por
las vías int ram uscular
( i.m .)
e
int raperit oneal ( i.p.) , respect ivam ent e. A diez días de la últ im a dosis, la respuest a celular
específica frent e a NefBF fue evaluada en células del bazo, cuant ificando las células
product oras de I FN- γ m ediant e la t écnica de ELI SPOT y los niveles de I FN- γ present e en
sobrenadant es de células en cult ivo durant e 72 hs por ELI SA.
En am bos ensayos, las
células se reest im ularon con el pool t ot al de pépt idos ( 13 a 15 aa, superpuest os en 11
aa) de la prot eína NefBF a una concent ración final de 2 μg/ m l de cada pépt ido. Com o
cont rol negat ivo se ut ilizó RPMI c con 0.5% de DMSO ( diluyent e de los pépt idos) y com o
cont rol posit ivo una solución de ConA ( 1 μg/ m l) .
Se m uest ra en la figura 21 B la respuest a obt enida m ediant e el ensayo de ELI SPOT,
t ant o fresco ( i) com o direct o ( ii) , el prim ero realizado, sólo en est e caso, con un AcMo de
m enor sensibilidad: ant i I FN- γ de rat ón R4- 6A2, 7 μg/ m l en PBS ( BD) . El único grupo en
el que se encont ró una respuest a específica significat iva fue aquel que recibió el esquem a
de inm unización het eróloga ( ADN/ MVA) . Al analizar los sobrenadant es de cult ivo ( Figura
21C) , se observó una respuest a significat iva t am bién en el caso de la doble inm unización
con el vect or de ADN. Por ot ro lado, al aplicar el vect or MVA en un esquem a hom ólogo
( dos dosis iguales de MVAnefBF) no se det ect ó una respuest a significat iva, a pesar de
haber sido capaz de generar una respuest a posit iva cuando se lo aplicó com o boost ,
77
Result ados I I
luego del ADN ( prim e) . Est a baj a respuest a luego de 2 dosis de MVAnefBF se puede
at ribuir
a la respuest a inm une generada frent e al vect or
luego de la prim era
inm unización ( inm unidad preexist ent e frent e al vect or) , la que evit aría el efect o boost al
aplicar la segunda dosis del m ism o vect or [ 68, 69] . Para corroborar est a hipót esis, se
evaluó la inm unidad específica inducida frent e a prot eínas del vect or viral en los grupos
que recibieron una o dos dosis de MVA.
Figu r a 2 1 : I n m u n oge n icida d de los ve ct or e s AD N N e fBF y M VAn e fBF. A- Esquem as de
inm unización adm inist rados a grupos de 4 rat ones Balb/ c. Las dosis de ADN se dieron
int ram uscularm ent e, m ient ras que el virus se adm inist ró por la vía int raperit oneal. B- 10 días luego
de la últ im a inm unización, se sacrificaron los anim ales y se obt uvieron las células del bazo. Se
cuant ificaron células específicas secret oras de I FN- γ m ediant e ELI SPOT fresco ( i) ( realizado con un
ant icuerpo de m enor sensibilidad) y direct o ( ii) ( realizado con ant icuerpo de m ayor sensibilidad) ,
reest im ulando las células con el pool de pépt idos de Nef BF ( barras negras) o RPMI ( barras grises) .
Las barras represent an el prom edio, + su desvío est ándar, de t riplicados de pocillos de m ezclas de
los bazos por grupo. En ii se ut ilizaron esplenocit os criopreservados y los valores con m edio cont rol
fueron rest ados. C- Las células de los m ism os anim ales fueron incubadas durant e 72 hs con los
m ism os est ím ulos y se m idió I FN- γ en el sobrenadant e de cult ivo m ediant e ELI SA. * indica
diferencia significat iva con respect o a la encont rada en el grupo cont rol, p< 0.05. Est os dat os son
represent at ivos de t res ex perim ent os.
1.2. Respuest a I nm une I nducida frent e a las Prot eínas del Vect or Viral
Debido a la falt a de efect o boost luego de la segunda dosis de MVA, se plant eó la
posibilidad de que exist iera una respuest a hum oral y celular fuert e, inducida frent e a las
prot eínas del vect or viral luego de la prim era dosis, que im pidiera o dificult ara el efect o
boost t ras una segunda dosis con el m ism o vect or. Por lo t ant o, se decidió evaluar la
78
Result ados I I
inm unidad específica frent e a las prot eínas de Vaccinia, a part ir de los grupos ant eriores,
que recibieron una o dos dosis de MVA.
Figu r a 2 2 : Re spu e st a ce lu la r y h u m or a l in du cida fr e n t e a a n t íge n os de l ve ct or vir a l. ACuant ificación de células TCD8 + secret oras de I FN- γ específicas para ant ígenos de VV. Esplenocit os
de los grupos indicados se reest im ularon con P815 infect adas con VV. Las barras indican el
prom edio de los valores hallados en pocillos por t riplicado + el desvío est ándar. Los valores frent e
al m edio cont rol fueron rest ados. B- i- I gG t ot al específica para ant ígenos VV hallados en los sueros
de los grupos indicados, se represent a los valores de absorbancias de rat ones individuales a una
dilución de 1/ 800 de los sueros. ii- Ac neut ralizant es ant i- VV, las barras represent an la dilución de
suero en la que se encont ró el 50% de act ividad neut ralizant e. * * p< 0.01 ent re los grupos 2xMVA
y ADN/ MVA.
Para est o, a 10 días de la últ im a inm unización, se evaluó la respuest a celular
m ediant e la reest im ulación de los esplenocit os con células P815 infect adas con el VVHA( según prot ocolo descript o en 4.3.2.3. de M&M) . El grupo que recibió el esquem a 2xMVA
m ost ró un increm ent o de 2 veces en la inm unidad celular frent e al vect or, evidenciando
un increm ent o de la respuest a ( boost ) , com parado con aquel grupo que recibió sólo 1
dosis del vect or viral ( ADN/ MVA) ( Figura 22 A) .
Por ot ro lado, cuando se m idieron los Ac específicos para MVA ( frent e a ant ígenos
de superficie) , el efect o boost o increm ent o fue m ayor, los niveles de I gG específicos
fueron cerca de diez veces m ás en el grupo que recibió 2 dosis de MVA con respect o al
que recibió una dosis ( Figura 22 Bi) . El efect o boost en la respuest a ant i- VV celular y
hum oral observada en el grupo de 2 dosis de MVA se explica por el hecho de que I gGs
ant i- VV y aún m ás im port ant e, Ac neut ralizant es ant i- VV, fueron encont rados en niveles
baj os después de la prim era dosis de MVA ( Figura 22 Bii) .
De est a m anera, la baj a respuest a ant i- Nef luego de las dos dosis de MVA no puede
explicarse por la presencia de Ac ant i- VV que pueden inhibir el efect o boost de la
segunda dosis de MVA, ya que, com o se observa en la figura 22 Bii, no hay una cant idad
79
Result ados I I
im port ant e de est os ant icuerpos luego de la prim era dosis. Por ot ro lado, la respuest a
celular frent e a las prot eínas del vect or sí se vio aum ent ada, siendo casi el doble luego
de la segunda dosis, evidenciando un efect o boost por lo m enos frent e a ant ígenos de VV
luego de una segunda dosis con el m ism o vect or.
Figu r a 2 3 : Tr e s dosis de AD N e n e l pr im e in cr e m e n t a sign ifica t iva m e n t e e l e fe ct o boost
de M VA. A- Esquem a de inm unización: grupos de 4 rat ones recibieron las dosis indicadas. B- Diez
días después de la últ im a dosis, la respuest a celular frent e a NefBF fue evaluada, cuant ificando
I FN- γ en el sobrenadant e de células reest im uladas durant e 72 hs. Los valores frent e al m edio
cont rol fueron ret ados. Dat os represent at ivos de t res experim ent os.
1.3. Tres Dosis de ADN en el Prim e I ncrem ent a Significat ivam ent e el Efect o
Boost de MVA
Si bien ut ilizando el esquem a clásico de prim e- boost , aplicado en la sección 1.1. de
Result ados I I , se generó una respuest a específica cont ra NefBF, ést a fue baj a. Para
evaluar si se podía generar una respuest a celular ant i- Nef de m ayor m agnit ud, se supuso
que un aum ent o en la respuest a generada en el prim e, obt enido después de m últ iples
dosis de ADN, podría pot enciar el efect o boost de la dosis de MVA. Est o es posible gracias
a que los vect ores de ADN no generan respuest a ant i- vect or, por no expresar m ás
prot eínas que la de int erés. Grupos de 4 rat ones recibieron 3 dosis de 50 μg de ADN,
espaciadas por 14 días, y luego el boost de MVA com o se m uest ra en el esquem a de la
figura 23 A. Diez días después de la últ im a dosis, se evaluaron los niveles de I FN- γ en los
sobrenadant es t ras 72 hs de reest im ulación con el ant ígeno específico ( Pool de pépt ios
NefBF) , ent re los grupos de anim ales que recibieron inm unizaciones hom ólogas, o
inm unizaciones het erólogas.
80
Result ados I I
El cam bio de dos dosis de 100 μg de ADN a t res dosis de 50 μg induj o un
increm ent o del 30% en la respuest a generada, m edida com o secreción de I FN- γ al
sobrenadant e ( 300 pg/ m l vs 400 pg/ m l) . Si bien el aum ent o en la respuest a logrado al
increm ent ar las dosis de ADN no es m uy im port ant e, luego del boost de MVA, se obt uvo
una respuest a t res veces m ayor con respect o a la obt enida cuando se adm inist ró una
dosis de ADN en el prim e seguida de MVA ( 1800 pg/ m l vs 600 pg/ m l p< 0,01, Figura 23
B) .
2 . Re a ct ivida d Cr u za da fr e n t e a N e fB
Debido a que la epidem ia de VI H en Argent ina es generada por el subt ipo B y
variant es recom binant es ent re ést e y el subt ipo F, se decidió analizar el grado de
react ividad cruzada frent e a la prot eína Nef del subt ipo B cuando se inm uniza a los
anim ales con los vect ores que expresan NefBF.
2.1. React ividad Cruzada frent e a Pépt idos de Nef Pert enecient e al Subt ipo B
A cont inuación, se analizó si la respuest a inducida luego de la inm unización con los
vect ores que expresaban NefBF era capaz de reconocer el set de pépt idos que
represent an una secuencia concenso de la prot eína NefB, com puest o por pépt idos de 15
aa, solapados en 11 aa ( NI H) . La react ividad cruzada fue analizada en los m ism os grupos
del esquem a de la figura 23 A, 10 días después de la últ im a dosis, m ediant e ELI SPOT
( fresco, direct o o expandido, Figura 24 A, B y C, respect ivam ent e) y cuant ificando I FN- γ
en el sobrenadant e de las células en cult ivo durant e 72 hs ( Figura 24 D) .
En la figura 24 A se observa que, aunque las 3 dosis de ADN seguidas de la dosis
de MVA generan una respuest a específica significat iva, no se det ect ó respuest a frent e a
los pépt idos B. Sin em bargo, al repet ir el ELI SPOT con las células descongeladas ( B) se
pudo observar reconocim ient o de los pépt idos B, aunque 2.6 veces m enor a la respuest a
encont rada frent e a los pépt idos BF, y superando por m uy poco el crit erio de posit ividad
( dos veces el CN o m ás de 50 punt os en el pocillo. Spot s en los pocillos: Pep.B: 55
versus CN: 25) .
Por ot ro lado, para expandir la respuest a generada con est os esquem as de
inm unizacón, se m ant uvieron los esplenocit os en cult ivo durant e diez días, en presencia
de los pépt idos BF o B. Al finalizar est a incubación, se realizó el enasayo de ELI SPOT, en
el cual, las células reest im uladas con los pépt idos BF se colocaron en la placa con los
pépt idos BF y, de la m ism a form a, las células reest im uladas con los pépt idos B se
incubaron en la placa con los pépt idos B. Am bos grupos de células se colocaron en la
81
Result ados I I
placa con el cont rol negat ivo ( RPMI c con DMSO, valor rest ado en los gráficos
present ados) y posit ivo ( Con A) . Luego de est e procedim ient o, la respuest a cruzada
frent e a los pépt idos B se am plificó, aunque la diferencia ent re am bas respuest as se
acent uó, siendo ahora 3.7 veces m enor que la respuest a hom óloga. Al reest im ular las
células durant e t res días con los pépt idos BF o B, por separado, y cuant ificando I FN- γ en
el sobrenadant e, est a diferencia se acent uó aún m ás, llegando a ser, en est e caso, a 6.7
veces m enor ( D) .
Figu r a 2 4 : Re a ct ivida d Cr uza da fr e n t e a N e f de l su bt ipo B. Diez días después de la últ im a
dosis, la respuest a celular frent e a NefBF ( barras negras) y NefB ( barras blancas) fue evaluada,
m ediant e ELI SPOT fresco ( A) , ELI SPOT direct o ( B) , expandido ( C) o cuant ificando I FN- γ en el
sobrenadant e de células reest im uladas durant e 72 hs ( D) . Los valores frent e al m edio cont rol
fueron rest ados, siendo para ELI SPOT ent re 5 a 30 punt os/ 10 6 en el fresco y 20 a 40 en el
expandido. Neg: Negat ivo, no cum ple crit erio de posit ividad. ND: no det erm inado. Dat os
represent at ivos de t res ex perim ent os.
2.2. Secreción de Ot ras Cit oquinas
Durant e los últ im os años se ha dado im port ancia a la evaluación
de la
polifuncionalidad de la respuest a celular T generada por los dist int os m odelos de vacunas
[ 55, 88, 121, 122] . No sólo se considera im port ant e la secreción de I FN- γ, si no t am bién
ot ras funciones celulares com o secreción de dist int as cit oquinas t ales com o I L- 2 y TNF,
82
Result ados I I
así com o la presencia de m arcadores de cit ot oxicidad y proliferación. Teniendo en cuent a
est e ant ecedent e, se plant eó el obj et ivo de analizar la polifuncionalidad de la respuest a
generada por los vect ores aquí descript os por cit om et ría de fluj o. Desafort unadam ent e,
no se pudo cum plir dicho obj et ivo, debido a que est a t écnica es m enos sensible y se
necesit a una respuest a específica de m ayor m agnit ud a la observada con los dist int os
esquem as hast a aquí ut ilizados. Por est o, se plant eó la posibilidad de m edir la secreción
de I L- 2 y TNF por ELI SA en los sobrenadant es de las células en cult ivo.
Así, se evaluó si las células de los rat ones inm unizados que secret an I FN- γ eran
capaces de secret ar ot ras cit oquinas t ales com o I L- 2 o TNF. Para est o, la presencia de
est as m oléculas se cuant ificó en los sobrenadant es de los esplenocit os reest im ulados con
los pépt idos BF o B, durant e 72 hs. En la figura 25 se puede observar que células
provenient es de los rat ones inm unizados con 3xADN/ MVAnefBF secret an t ant o TNF com o
I L- 2 frent e a los pépt idos BF y B, aunque se det ect ó una m enor cant idad de TNF e I L- 2
frent e
a
los pépt idos het erólogos ( 1,6
y
3,2
veces m enos para
TNF e
I L- 2,
respect ivam ent e, p< 0,01) .
Figu r a 2 5 : Se cr e ción de I L- 2 y TN F fr e n t e a pé pt idos h om ólogos o h e t e r ólogos. Se
cuant ificó por ELI SA I L- 2 y TNF en los sobrenadant es de esplenocit os de los rat ones inm unizados
com o se indica en la figura, que fueron reest im ulados durant e 72 con los pépt idos BF, B o con
RPMI ( valores rest ados) . Las barras indican los pg/ m l de cada cit oquina secret ada. Diferencias
significat ivas ent re los valores frent e a BF y B est án indicadas.
En Resum en, t odos est os experim ent os dem uest ran que NefBF adm inist rada desde
un vect or de ADN y el vect or viral MVA, genera una respuest a alt am ent e específica, sin
poder det ect arse react ividad cruzada frent e al subt ipo B cuando se adm inist ra com o dos
dosis hom ólogas de ADN o ut ilizando el esquem a prim e- boost con una dosis de ADN
j unt o con una dosis de MVA ( ADN/ MVA) . De t odas form as, al lograr una m ayor respuest a
específica frent e a la prot eína BF, increm ent ando las dosis de ADN en el prim e, se
encont ró un ciert o nivel de respuest a cruzada frent e a los pépt idos B, aunque est a
respuest a fue de una m agnit ud m enor que la hom óloga, evaluada t ant o por secreción de
I FN- γ, TNF e I L- 2.
83
Result ados I I
3 . I n m u n oge n icida d de los Ve ct or e s Vir a le s Ba sa dos e n la Ce pa
W R de Va ccin ia
3.1. I nm unogenicidad de los Vect ores VV
A
cont inuación
se
plant earon
dos
obj et ivos
relacionados
con
los
vect ores
replicat ivos. Por un lado, se propuso analizar si un boost con el vect or replicat ivo
VVnefBF podía aum ent ar la inm unogenicidad observada luego de la dosis de MVA.
Mient ras que, por ot ro lado, se plant eó analizar la respuest a inducida cont ra la prot eína
NefB, com parándola con la generada por NefBF, am bas expresadas desde los vect ores
VV generados y caract erizados ant eriorm ent e.
En un prim er m om ent o, con el m ot ivo de realizar un experim ent o de desafío, se
inm unizaron grupos de 4 rat ones con t res dosis de los vect ores de ADN BF o ADN cont rol
( plásm ido vacío) . Diez días despues de la últ im a dosis se desafiaron los anim ales con 3 x
10 7 UFP/ rat ón de los vect ores VVnefBF y VVnefB ( Figura 26 A i) . A los 5 días del desafío
se ext raj eron los bazos y se cuant ificaron las células secret oras de I FN- γ por ELI SPOT. En
la figura 26 B se m uest ra la respuest a inm une generada en aquellos anim ales que
recibieron com o inm unización el vect or cont rol, y luego el desafío de VVnefBF o VVnefB,
es decir que recibieron una única dosis de ant ígeno aplicada desde los vect ores VV. Se
puede observar que en el caso de VVnefBF la respuest a obt enida con una única dosis del
virus fue de sim ilar m agnit ud que la obt enida con 3xADNBF/ MVABF ( 97+ 14 vs 79.7+ 19.8
CS I FN- γ, respect ivam ent e, p= 0.29) , sin poder det ect arse una respuest a significat iva
frent e a los pépt idos del subt ipo B. Llam at ivam ent e, en los rat ones inm unizados con el
VVnefB, si bien la respuest a det ect ada fue de aproxim adam ent e la m it ad de la m agnit ud
a la generada por VVnefBF, se encont ró el m ism o nivel de respuest a en el reconocim ient o
de los pépt idos de NefB versus BF ( Figura 26 B) .
Con el fin de am pliar el análisis de la inm unogenicidad de los vect ores replicat ivos,
grupos de 4 rat ones recibieron 3 dosis de 50 μg de ADN BF, B o cont rol, en el prim e, y
luego una dosis de VVnefBF, VVnefB o VVc, respect ivam ent e ( 10 7 UFP/ rat ón, i.p.) , com o
boost ( Figura 26 A ii) . A los 10 días de la últ im a dosis, la respuest a inm une celular fue
evaluada en las células del bazo. En la figura 26 C se m uest ran los result ados obt enidos
del ELI SPOT fresco ( i) y del ELI SPOT expandido ( ii) . En el caso de los rat ones que
recibieron el esquem a 3xADNBF/ VVBF se obt uvo una respuest a celular específica frent e a
los pépt idos BF 2.5 veces m ayor que con el esquem a que involucra al vect or MVAnefBF
( Ver figura 24 A, 228+ 15 vs 78.7+ 18.9 CS I FN- γ, respect ivam ent e, p= 0.0026) . En est e
esquem a de inm unización sí se logró det ect ar una respuest a frent e a los pépt idos B
m ediant e el ELI SPOT fresco, aunque est a respuest a fue 3.3 veces m enor a la det ect ada
frent e a los pépt idos hom ólogos, diferencia sim ilar a la obt enida con MVAnefBF ( 2.6
84
Result ados I I
veces) . En el caso de los anim ales inm unizados con los vect ores B ( 3xADNB/ VVB) se
puede observar que la respuest a frent e a los pépt idos hom ólogos fue sim ilar a la
encont rada con el esquem a BF ( Respuest as Hom ólogas: p= 0.2) ; m ient ras que la
react ividad cruzada fue levem ent e m ayor, siendo el núm ero de células secret oras de I FN-
γ dos veces m enor frent e a los pépt idos BF que frent e a los B, aunque no se encont raron
diferencias significat ivas ent re la respuest a het eróloga de am bos grupos ( p= 0.1) .
Figu r a 2 6 : I n m u n oge n icida d de los ve ct or e s VV . A- Grupos de 4 rat ones fueron inm unizados
com o se indica en las t ablas. Cinco ( Ai) o diez ( Aii) días después de la últ im a dosis, se evaluó la
respuest a frent e a los pépt idos B y BF en bazo. B- ELI SPOT fresco de esplenocit os de anim ales
inm unizados con una dosis de VVBF o B. C- ELI SPOT fresco ( i) y expandido ( ii) . D- Cuant ificación
de I FN- γ en sobrenandant e de células reest im uladas durant e 72 hs. Los dat os de los grupos
especificados en Ai pert enecen a un experim ent o, m ient ras que los de Aii son represent at ivos de
dos exprerim ent os. NS: No Significat ivo.
Para expandir la respuest a generada con est os esquem as de inm unizacón, se
realizó un ELI SPOT expandido ( siguiendo la m et odología descript a en M&M 4.3.2.4. y RI I
2.1.) . Las diferencias encont radas ant eriorm ent e se m ant uvieron en el caso de BF,
m ient ras que la diferencia se hizo m enor en el grupo inm unizado con los vect ores B,
result ando sim ilar a la relación encont rada con una dosis del vect or VVnefB.
85
Result ados I I
Para concluir con el análisis de la inm unogenicidad de est os vect ores, se evaluó la
presencia de I FN- γ a part ir del sobrenadant e de los esplenocit os, en cult ivo, durant e 72
hs, con los set de pépt idos. En est e caso, los niveles fueron levem ent e m enores en el
caso del esquem a con VVnefB que con VVnefBF ( p= 0,036) , siendo la react ividad cruzada
sim ilar en am bos esquem as ( Figura 26 D) .
De est a m anera, a diferencia de los esquem as que involucran la prot eína BF, al
inm unizar
a
los
anim ales
con
los
vect ores
que
expresan
la
prot eína
NefB
( 3xADNB/ VVnefB) se obt uvo una respuest a específica frent e a los pépt idos hom ólogos
levem ent e m enor que la generada por el esquem a BF. En cuanro a la react ividad cruzada
se obt uvieron result ados variables, det ect ándose una respuest a sim ilar frent e a los
pépt idos B y BF en algunos casos y en ot ros una m enor respuest a frent e a los pépt idos
BF, sim ilar a lo encont rado en los esquem as donde se aplican los vect ores BF.
3.2. Secreción de Ot ras Cit oquinas
Para finalizar con la caract erización de la respuest a inm une celular generada con
est os esquem as, se evaluó si las células de los rat ones de est os grupos secret aban TNF.
Al igual que en el apart ado 2.2, la presencia TNF se cuant ificó en los sobrenadant es de
los esplenocit os en cult ivo durant e 72 hs en presencia de los pépt idos BF o B. En la figura
27 se puede observar que células provenient es de los rat ones inm unizados con
3xADNBF/ VVnefBF o 3xADNB/ VVnefB secret an TNF frent e a los pépt idos hom ólogos,
m ient ras que no se det ect ó secresión
de est a cit oquina frent e a los pépt idos
het erólogos..
Figu r a 2 7 : Se cr e ción de TN F fr e n t e a
pé pt idos h om ólogos o h e t e r ólogos. Se
cuant ificó TNF por ELI SA en los
sobrenadant es de esplenocit os, inm unizados
com o se indica en la figura 26 A, que fueron
reest im ulados durant e 72 con los pépt idos
BF, B o RPMI ( valores rest ados) . Las barras
indican los pg/ m l de cit oquina en el
sobrenadant e.
3.3. Respuest a I nm une Hum oral:
Se ha dem ost rado que la respuest a hum oral no t iene gran im plicancia en la
respuest a inm une prot ect ora frent e a VI H. Est o se debe, principalm ent e, a que es m uy
86
Result ados I I
difícil generar ant icuerpos neut ralizant es [ 41, 123] . De t odas form as, no dej a de ser un
aspect o im port ant e para evaluar en la respuest a inm une generada.
Figu r a 2 8 : Re spu e st a in m u n e h u m or a l fr e n t e a la pr ot e ín a N e f e n los a n im a le s
in m u n iza dos con los dist in t os e squ e m a s con t e n ie n do VV r e com bin a n t e s. Diez días después
de la últ im a dosis, se obt uvieron los sueros ( n= 4) y se analizó la presencia de I gG2a para los
pépt idos pert enecient es a la prot eína NefBF ( A) y NefB ( B) y frent e a la prot eína t ot al ( PT) del
subt ipo B ( est a últ im a sólo para el grupo 3xADNB/ VVB) . Las barras negras r epresent an la
respuest a de los anim ales inm unizados con 3xADNBF/ VVBF, m ient ras que las barras blancas
represent an la respuest a de los anim ales inm unizados con 3xADNB/ VVB. Se m uest ran las
absorbancias de duplicados ( dilución 1: 100) . Las flechas indican los valores que se consider aron
posit ivos, las líneas azules y roj as indican el crit erio de posit ividad para cada caso: dos veces el
cont rol negat ivo. ND: no det erm inado
Con la idea de cuant ificar la respuest a hum oral de est os anim ales, se realizó un
ensayo de ELI SA para cuant ificar I gG2a ( por disponibilidad del ant icuerpo conj ugado) ,
donde se recubrieron las placas con los pépt idos individuales de cada variant e de la
prot eína o con la prot eína recom binant e NefB ( NI H) . Lo que se observó fue que los
sueros pert enecient es a los rat ones inm unizados con los vect ores BF, reconocieron los
pépt idos BF25, BF26 y BF30, ( D.O.: 0.088, 0.1135 y 0.0885, respect ivam ent e, CN:
0.038 x 2= 0.076, punt o de cort e, Figura 28 A) m ient ras que no reconocieron pépt idos
87
Result ados I I
de la secuencia pert enecient e al subt ipo B ( CN: 0.07 x 2= 0.14, Figura 28 B) . En el caso
de los rat ones inm unizados con los vect ores B, se encont raron ant icuerpos que
reconocían los pépt idos B53 y B79 ( D.O.: 0.226 y 0.840, CN: 0.0695 x 2= 0.139, Figura
28 B) de la secuencia de Nef B, m ient ras que reconocían varios pépt idos del dom inio Nt erm inal
de
la
prot eína
NefBF:
BF9,
BF11
y
BF12
( 0.068,
0.212
y
0.0835,
respect ivam ent e, CN= 0.027 x 2= 0.054, Figura 28 A) . Al usar la prot eína recom binant e
hom óloga para el grupo inm unizado con los vect ores B ( no se det erm inó para
3xADNBF/ VVBF por falt a de disponibilidad de la m ism a) la absorbancia obt enida fue
levem ent e m ayor a la sum at oria de la absorbancia de los pépt idos individuales
considerados posit ivos ( 1,4 vs 1,05) , lo que indicaría que ést a form a de m edir
ant icuerpos
específicos,
si
bien
no
es
ópt im a
porque
se
pierden
los
epít opes
conform acionales, aparent em ent e, en est e caso, no dist a dem asiado de lo que se
det ect aría con prot eína ent era.
Nuevam ent e, se observa que la inm unización con los vect ores B generó una
respuest a inm une con m ayor react ividad cruzada frent e al int ersubt ipo BF, m ient ras que
los vect ores BF generaron una respuest a específica pero sin o con baj a react ividad
cruzada frent e a los pépt idos B, inclusive cuando se t rat a de respuest a hum oral.
Figu r a 2 9 : An á lisis de la s se cu e n cia s r e con ocida s. En azul se m uest ran las secuencias
ut ilizadas para inm unizar desde los vect ores de ADN y virales. Marcado en colores se encuent ran
los pépt idos reconocidos por los sueros de los anim ales inm unizados, m ient ras que recuadr ados en
color los pépt idos solapant es. Debaj o de la secuencia principal, se encuent ra en negro los pépt idos
het erólogos, con las diferencias m arcadas en roj o.
88
Result ados I I
Al analizar la secuencia de los pépt idos individuales reconocidos por los diferent es
esquem as se observa que el pépt ido BF11 y el B53, que fueron reconocidos por los
sueros de los anim ales inm unizados con NefB, incluso con igual m aganit ud ( 0.212 y
0.226, respect ivam ent e) , son idént icos. Am bos difirieren en un aa de la secuencia NefBF
ut ilizada para inm unizar a los anim ales, cam biando un ácido aspárt ico, D, en la secuencia
NefBF, por ácido glut ám ico, E, en la secuencia de am bos pépt idos ( subrayada en la
secuencia de NefBF y m arcada en roj o en el pépt ido, W LEAQEEEEVGFPVR, figura 29) .
Est e podría ser el m ot ivo por el cual los anim ales inm unizados con NefBF no reconocen
est e pépt ido, m ient ras que los anim ales inm unizados con NefB reconocen am bos
pépt idos, incluso con la m ism a m agnit ud ( Figura 28 y 29) .
La región del loop fue reconocida por los dos grupos de anim ales, sin em bargo no
se onbservó react ividad cruzada. El pépt ido B79, reconocido en el esquem a de los
vect ores NefB, difiere del pépt ido BF30, reconocido por los anim ales inm unizados con
NefBF, en varios am inoácidos ( BF30- N CLLH PM SQH GLED GD R vs B79- N N SLLH PM SLH G
M D D ) . Est o explica la falt a de react ividad cruzada en est a región de la prot eína, incluso
siendo inm unogénico en am bos casos ( Figura 28 y 29) . Por ot ro lado, los pépt idos BF26 y
BF25 ( GW CFKLVPVEPEEVEK y YPLTFGW CFKLVPVE, respect ivam ent e) no t ienen
diferencias en sus secuencias con los pépt idos B73 ( LTFGW CFKLVPVEPE) y B74,
except o por un aa en el final del pépt ido B74 ( W CFKLVPVEPEKVEE) , sin em bargo, se
encuent ran desfasados ent re sí, lo que probablem ent e evit e el reconocim ient o por part e
de los ant icuerpos. De t odas form as, si bien el valor de absorbancia superó el crit erio de
posit ividad para est os pépt idos, am bos valores se encuent ran cerca de 0.1 ( 0.088 y
0.1135, respect ivam ent e) , por lo que est án m uy cerca del lím it e de det ección.
4 . Uso de Adyu va n t e s
En vist a de los result ados obt enidos hast a el m om ent o, se decidió incluir
adyuvant es durant e las inm unizaciones con los vect ores de ADN para aum ent ar la
respuest a generada t ras el prim e, de m anera de obt ener una m ayor respuest a final,
evaluando si con est e esquem a se puede inducir un aum ent o en la react ividad cruzada.
Para est o se ut ilizaron dos plásm idos de ADN que llevan la secuencia codificant e
para I L- 12 [ 96, 124] y GM- CSF, cedidos gent ilm ent e por el Dr. Mariano Est eban, del
Cent ro Nacional de Biot ecnología de la Universidad Aut ónom a de Madrid, España. Est as
cit oquinas est án alt am ent e involucradas en el m ont aj e inicial de la respuest a inm une del
t ipo Th1 [ 94] y ya han sido previam ent e ut ilizadas para aum ent ar respuest as inm unes
generadas, principalm ent e, desde vect ores de ADN [ 89, 90, 98, 99] .
En el caso del vect or de GM- CSF, el cual no ha sido descript o ant eriorm ent e, se
realizó un ensayo para cuant ificar la cant idad de cit oquina liberada al sobrenadant e por
89
Result ados I I
células t ransfect adas. Para est o, se t ransfect aron células 293- T con 10 μg del ADN GMCSF. A las 48 hs se cuant ificó la cant idad de cit oquina en el sobrenadant e por ELI SA ( Kit
de ELI SA, Peprot ech) , encont rándose 150 μg/ m l de GM- CSF ( células sin t ransfect ar 0.2
μg/ m l) , verificando la capacidad del vect or de expresar dicha m olécula.
4.1. Respuest a t ot al:
Figu r a 3 0 : Uso de I L- 1 2 y GM - CSF com o a dyu va n t e s. A- Esquem a de los grupos inm unizados.
B- Diez días después de la últ im a inm unización, la respuest a específica fue evaluada en el bazo
m ediant e ELI SPOT. Est os dat os fueron obt enidos de t res experim ent os independient es par a los
grupos con I L- 12 y GM- CSF, m ient ras que se realizó dos veces para el grupo con las dos cit oquinas
Para analizar la capacidad de est as cit oquinas de funcionar com o m oléculas
adyuvant es frent e a NefBF, se inm unizaron anim ales aplicando los plásm idos adyuvant es
j unt o con el prim e, cada uno por separado o en com binación. Com o grupo cont rol, se
ut ilizó al grupo de los anim ales inm unizados con los vect ores de NefBF sin adyuvant es
( Figura 30 A) . Diez días después de la últ im a inm unización, se evaluó la respuest a
inm une a part ir de las células del bazo. Se puede observar que la adm inist ración t ant o de
I L- 12 com o de GM- CSF aum ent ó la respuest a específica frent e a los pépt idos BF ( 6.5 y 6
90
Result ados I I
veces respect ivam ent e) , así com o la react ividad cruzada frent e a los pépt idos B. La coadm inist ración de am bos vect ores adyuvant es llevó a un aum ent o de 14 veces en la
respuest a específica con respect o a la generada sin adyuvant es, m ient ras que fue poco
m ás que el doble de la generada por las inm unizaciones con cada adyuvant e por
separado. Sin em bargo, la react ividad cruzada no se increm ent ó en est e últ im o grupo
con respect o a los grupos que recibieron un solo plásm ido adyuvant e.
4.2. I dent ificación de Pépt idos I ndividuales
4.2.1. Uso de Mat rices:
Con el propósit o de ident ificar los pépt idos inm unodom inant es en la prot eína NefBF,
se ut ilizó el esquem a de m at rices descript o en la t abla 6 de M&M ( Sección 4.3.1.) . Para
ello, los esplenocit os pert enecient es a los grupos descript os en la figura 30 A, se
reest im ularon, durant e 72 hs, con los pooles de am bas m at rices, B y BF, para luego
m edir I FN- γ en el sobrenadant e de est os cult ivos. Tam bién se m idieron las células
secret oras de I FN- γ por ELI SPOT, aunque en est e caso, no se analizaron las células del
grupo que no recibió adyuvant e en las inm unizaciones ( 3xADN BF/ MVABF) ya que no se
logró det ect ar una respuest a posit iva al separar los pépt idos en los pooles de las
m at rices.
En la figura 31 se m uest ran los esquem as de las m at rices, con los pooles posit ivos
m arcados en color, para ELI SA ( A) y para ELI SPOT ( B) . De su int ersección se infieren los
pépt idos inm unodom inant es, m arcados con color m ás oscuro. Se puede observar que
para casi t odos los esquem as analizados, los pépt idos BF2, BF3, BF26, BF27, BF32 y
BF33 de la m at riz BF;
B83 y B84 de la m at riz B, son inm unogénicos. Con m enor
frecuencia, result an posit ivos los pépt idos B48, B49. Sólo en el caso del grupo que recibió
los dos adyuvant es se reconocen m ayor cant idad de pépt idos BF cuando se cuant ifica
I FN- γ en el sobrenadant e. De t odas form as, est e dat o no se vio respaldado por el
result ado m edido por ELI SPOT. Para la m at riz B, el grupo inm unizado con I L- 12 reconoce
m ás cant idad de pépt idos cuando se m ide la respuest a por ELI SPOT. Al observar la
m agnit ud de las respuest as a los pooles de las m at rices, se puede ver que los pooles
pert enecient es a la m at riz B son reconocidos con m enor m agnit ud ( ELI SPOT, Figura 31 B,
det allados en los m árgenes superior e izquierdo de cada t abla) , lo que se correlaciona
con la baj a react ividad cruzada descript a ant eriorm ent e en est e t rabaj o de t esis.
91
Result ados I I
Figu r a 3 1 : I de n t ifica ción de pé pt idos in dividu a le s. Esquem as de m at rices B y BF para los
grupos indicados. A- Los casilleros som breados repr esent an los pooles posit ivos para cada caso,
m idiendo I FN- γ en el sobrenadant e de células en cult ivo durant e 72 hs. Est os dat os fueron
obt enidos a part ir de 2 experim ent os independient es.
92
Result ados I I
Figu r a 3 1 : I de n t ifica ción de pé pt idos in dividu a le s ( con t in u a ción ) . Esquem as de m at rices B
y BF para los grupos indicados. B- Los casilleros som breados r epresent an los pooles posit ivos para
cada caso, m edida com o células secret oras de I FN-γ por ELI SPOT. A los lados se encuent ran los
valores prom edios de los pocillos en cada caso posit ivo, y uno negat ivo represent at ivo del rest o.
Est os dat os fueron obt enidos de 3 ex perim ent os independient es para los grupos con I L- 12 y GMCSF, m ient ras que se realizó 2 veces para el grupo con las dos cit oquinas.
4.2.2. Confirm ación de Pépt idos:
A part ir de los result ados obt enidos con las m at rices se procedió a la confirm ación
de algunos de los pépt idos inm unogénicos. Para est o, las células pert enecient es a los
93
Result ados I I
grupos descript os en la figura 30 fueron reest im uladas con los pépt idos individuales por
separado. Se seleccionaron los pépt idos BF3, BF26, BF33, B48, B49, B83 y B84 debido a
que eran los que m ayorm ent e se repet ían en am bos t ipos de ensayos. En el caso de
pépt idos consecut ivos, se ensayó sólo uno de ellos, considerando que son solapant es, y
probablem ent e sea el m ism o epít ope inm unodom inant e represent ado en am bos. En est os
casos se eligió el pépt ido que result ó posit ivo en la m ayoría de los casos. Por ot ro lado,
del m ism o m odo que para el ELI SPOT de las m at rices, no se incluyó el grupo sin
adyuvant es en est e análisis.
Se puede observar en la figura 32 que los pépt idos cont ra los cuales se dirige la
m ayor respuest a son el pépt ido BF3 y el BF33. I nt eresant em ent e, sólo el pépt ido BF33 se
ve aum ent ado al aplicar am bos adyuvant es j unt os, no encont randose diferencia en el
pépt ido BF3. Probablem ent e, a est e aum ent o se deba la m ayor respuest a frent e al pool
BF, por lo que la react ividad cruzada frent e a B no aum ent a.
Figu r a 3 2 : Con fir m a ción de pé pt idos in dividu a le s. Diez días después de la últ im a dosis la
respuest a se evaluó en los esplenocit os m ediant e la t écnica de ELI SPOT, reest im ulando las células
con los pépt idos individuales indicados en la figura. Los valores obt enidos frent e a RPMI fueron
rest ados. Est a evaluación se realizó en un solo experim ent o.
En cuant o a los pépt idos B, en el grupo que recibió los dos adyuvant es no se
encont ró reconocim ient o del pépt ido B83, m ient ras que sí en aquellos rat ones que
recibieron un solo adyuvant e. Est o lleva a concluir que la aplicación de am bos
adyuvant es j unt os, llevaría a una m enor am plit ud de la respuest a, sólo aum ent ando el
reconocim ient o del pépt ido BF33.
En la figura 33 se encuent ra represent ada la secuencia de la prot eína NefBF
expresada desde los vect ores de ADN y virales, j unt o con los pépt idos BF, m arcados
sobre la secuencia, y B, indicados debaj o de la m ism a. Los pépt idos BF32, BF33, B83 y
B84 represent an el m ism o fragm ent o de la prot eína Nef ( loop) . El pépt ido B83 t iene t res
cam bios am inoacídicos con respect o a la secuencia BF, dos en los ext rem os y uno en el
94
Result ados I I
sext o aa. Est e últ im o cam bio podría est ar im pidiendo su int eracción con el MHC de los
anim ales.
Los pépt idos inm unodom inant es BF2, BF3, B41 y B42 se encuent ran en la región
del dom inio N- t erm inal de la prot eína. Nuevam ent e se observan diferencias ent re los
pépt idos B y la secuencia BF. Es est e caso, los cam bios am inoacídicos son 5 en cada
caso, est ando 3 de ellos en la sección de la secuencia solapada ent re los pépt idos BF2 y
BF3, siendo est a probablem ent e la secuencia reconocida por los linfocit os T.
Los pépt idos BF26, B73 y B74 ( GW CFKLVPVEPEEVEK, LTFGW CFKLVPVEPE y
W CFKLVPVEPEKVEE respect ivam ent e) no t ienen diferencias en sus secuencias, sin
em bargo, se encuent ran desfasados ent re ellos ( B73 y B74 son solapant es) . De t odas
form as, a pesar de que el pépt ido BF26 es reconocido, aunque con baj a m agnit ud, los
pépt idos B73 o B74 no fueron reconocidos en ninguno de los análisis realizados con el
esquem a de m at rices.
Figu r a 3 3 : An á lisis de la s se cu e n cia s r e con ocida s. En azul secuencias ut ilizadas para
inm unizar desde los vect ores de ADN y virales. Marcado en colores se encuent r an los pépt idos
reconocidos por los sueros de los anim ales inm unizados, m ient ras que recuadrados en color los
pépt idos solapant es. Debaj o de la secuencia principal, se encuent ra en negro los pépt idos
het erólogos, con las diferencias m arcadas en roj o.
Por ot ro lado, a pesar de que los pépt idos B48 y B49 result aron posit ivos en varias
m at rices ( 3xADNBF+ I L- 12+ GM- CSF/ MVABF m ediant e ELI SA, 3xADNBF+ I L- 12/ MVABF
m ediant e ELI SPOT) , no se obt uvo una respuest a posit iva al reest im ular las células con
est os pépt idos individuales.
95
Result ados I I
4.2. Modelo de I nfección Viral
Por últ im o, para poder est ablecer si la respuest a celular generada es capaz de
prot eger frent e a una infección viral, se propuso com o obj et ivo poner a punt o en el
laborat orio un m odelo de desafío evaluando la prot ección generada.
Tradicionalm ent e, los m odelos m urinos para infecciones de VI H involucran el desafío con
ot ros virus t ales com o VV y ot ros que infect an rat ones [ 125- 127] . Para est o, y t om ando
vent aj a de las herram ient as generadas en est e t rabaj o, se opt ó por ut ilizar los vect ores
basados en la cepa replicat iva del virus vaccinia, m odelo de desafío viral am pliam ent e
usado [ 126- 128] . El m odelo consist e en la inoculación int raperit oneal del virus replicat ivo
y su recuperación a part ir de los ovarios ( uno de los sit ios donde replica el virus en
rat ón) . Luego se t it ulan las UFP present es en el par de ovarios. De haber una respuest a
inm une efect iva preexist ent e, la cant idad de virus recuperado sería m enor que si dicha
respuest a no exist iese. Para est os experim ent os se ut ilizaron inm unizaciones sólo con los
vect ores de ADN, debido a que si se ut ilizara el vect or MVA la respuest a a las prot eínas
del vect or no perm it iría observar las diferencias debidas a la respuest a ant i- Nef.
4.2.1. Puest a a Punt o del Modelo de Desafío
Para realizar la puest a a punt o de la m et odología, se desafiaron grupos de 6
rat ones hem bra, con dist int as dosis de virus replicat ivos VVnefBF y VVHA- ( 2 x 10 7 y 0.5
10 7 UFP/ rat ón) , y con una dosis de VVnefB ( 0.5 10 7 UFP/ rat ón) . A los 5 días del desafío,
se sacrificaron los anim ales, se ext irparon los dos ovarios y se cuant ificó el virus present e
en ellos m ediant e t inción con crist al violet a ( M&M, 5.1.1.) . Se puede observar ( Figura 34
A) que no exist e diferencia significat iva ent re la cant idad de virus que se recupera con las
dos dosis de VVnefBF, com o t am poco exist e diferencias ent re el virus recuperado a part ir
del desafio con las dos dosis de VVHA- . Sin em bargo, exist e diferencia significat iva ent re
el virus recuperado de rat ones inm unizados con VVnefBF y VVnefB con respect o a las dos
dosis de HA- .
A part ir de est os result ados, se decidió usar, en los consecut ivos experim ent os, la
dosis m ás baj a ( 0.5 x 10 7 ) , para no sobre- exigir el sist em a y poder observar la
diferencia, aún en el caso de que sea baj a.
4.2.2. Desafío
Para el experim ent o de desafío se diseñó un esquem a sin la ut ilización del VVHA- ,
para independizarse de la diferencia que se observa en la recuperación del virus, aunque
no haya una respuest a inm une ant erior. Se inm unizaron dos grupos, de 5 rat ones
96
Result ados I I
( hem bras) , con 3 dosis de ADNBF solo o j unt o con 50μg del plásm ido que expresa I L- 12.
Diez días después de la t ercer dosis de ADN se realizó el desafío con 0.5 x 10 7 UFP de
VVnefBF. Cinco días después del desafío, se sacrificaron los anim ales y se t it uló el virus
present e en los ovarios.
Figu r a 3 4 : M ode lo de de sa fío. A- Puest a a punt o de la m et odología: se inm unizaron grupos de 6
rat ones com o se indica en el ej e, con las dosis indicadas ent re parént esis. B- Desafío a rat ones
inm unizados con 3xADNBF o 3x ADNBF+ I L- 12 y desafiados con VVnefBF. En am bos casos, se
indican los valores de p en los casos de diferencias significat ivas. P: prot egidos, NP: no prot egdos.
Est e experim ent o se realizó una única vez.
En la figura 34 B se observan los t ít ulos virales obt enidos en los ovarios de cada
rat ón individual. Se encont raron dos grupos con diferent e respuest a en el caso de los
rat ones inm unizados con I L- 12. Por un lado hubo dos rat ones ( 3xADNBF+ I L- 12 NP, no
prot egidos) en los que se recuperó la m ism a cant idad de virus que en los rat ones cont rol
( 3xADNBF) , p= 0.633, m ient ras que se encont raron t res rat ones en los que se recuperó
una cant idad significat ivam ent e m enor
de virus ( 3xADNBF+ I L- 12
P,
prot egidos) ,
p= 0.015. Est os result ados se asem ej an con un report e ant erior, donde inm unizaban
grupos de rat ones con pépt idos y adyuvant es, luego evaluaban la prot ección de est os
rat ones frent e a un desafío de un VV recom binant e de m anera sim ilar ( m ism a dosis,
m ism o día) . En ese t rabaj o, encuent ran un panoram a sim ilar a est e, ya que, en el caso
de los anim ales inm unizados con I L- 12 obt enían una prot ección sólo en algunos pocos
rat ones, 2 de los 13 rat ones inm unizados se prot egían t ot alm ent e, m ient ras que en el
rest o no había diferencia con respect o al grupo sin adyuvant e [ 126] .
En conj unt o, los result ados present ados hast a aquí dem uest ran que los vect ores de
ADN y virales: MVA y VV, adm inist rados a rat ones de la cepa Balb/ c, en diferent es
esquem as,
generan
una
respuest a
alt am ent e
específica
cont ra
NefBF,
con
baj a
react ividad cruzada frent e al subt ipo B.
97
Result ados I I
La aplicación del vect or de MVA luego de 3 dosis del vect or de ADN logró generar
una respuest a 3 veces m ayor que al ser aplicado luego de una dosis de ADN, pero est a
respuest a se vió increm ent ada en m ás de 10 veces al aplicar I L- 12 y GM- CSF com o
m oléculas adyuvant es j unt o con el vect or de ADN, sin em bargo no se increm ent aron los
niveles en la react ividad cruzada frent e a la prot eína NefB. Se lograron det erm inar 2
pépt idos inm unodom inant es para la secuencia NefBF en est e m odelo: BF3 y BF33.
Por ot ro lado, el esquem a de inm unización que involucra los vect ores que expresan
NefB generaró una respuest a de m enor m agnit ud, aunque con m ayor react ividad cruzada
frent e al subt ipo het erólogo.
Por últ im o, al aplicar un m odelo de infección viral, se vio ciert o grado de prot ección
en los rat ones que recibieron I L- 12 durant e la inm unización.
98
Result ados I I I
Result ados I I I : Reconocim ient o por Pacient es VI H+
de las
Secuencias Ut ilizadas
En un t rabaj o previo, realizado en el m ism o laborat orio que est a t esis, se describió
la respuest a inm une dirigida frent e a NefB o BF ( evaluada con los m ism os pépt idos aquí
ut ilizados) durant e la seroconversión y el prim er año de curso de la infección, donde la
respuest a inm une dirigida frent e a Nef es dom inant e [ 51] . El principal obj et ivo del
t rabaj o de la Dra Turk fue m apear la respuest a celular en pacient es infect ados con virus
recom binant es BF y com pararla con la de aquellos infect ados con el subt ipo B. Se
encont ró una respuest a específica de cada clado, así com o respuest a cruzada. El análisis
det allado dem ost ró que los pacient es infect ados con variant es BF t enian una respuest a
m enos am plia, con reconocim ient o de m enos epít opes, pero de m ayor m agnit ud. En
part icular, el reconocim ient o de la secuencia del loop de la prot eína, fue m ayor al
report ado previam ent e. La polifuncionalidad de las células que reconocían los epít opes
descript os fue det erm inada por cit om et ría, encont rándose una asociación ent re la m ayor
polifuncionalidad celular y una m ej or cont ención de la carga viral. Debido a que en aquel
t rabaj o se observó que exist e ciert o grado de react ividad cruzada en la respuest a a
am bas prot eínas, encont rándose respuest as subt ipo específicas, así com o react ividad
cruzada, en pacient es recient em ent e infect ados, el obj et ivo de est a últ im a part e de la
t esis fue am pliar est e est udio, corroborando que células de pacient es cursando diferent es
est adios de la infección por VI H ( agudos o crónicos) fueran capaces de reconocer
eficient em ent e los pépt idos de NefBF y NefB en los pooles com plet os ut ilizados en est e
t rabaj o, los que t ienen alt a hom ología con las prot eínas expresadas desde los vect ores
vacunales aquí generados y caract erizados. Ést a sería una m edida indirect a de la
represent at ividad dent ro de la población de las secuencias elegidas en est a t esis y
ut ilizadas en los experim ent os en rat ones.
1 . Ca r a ct e r íst ica s de los Pa cie n t e s VI H + Ut iliza dos e n e l En sa yo
1.1. Pacient es
Para llevar adelant e est a propuest a, se reclut aron 11 pacient es VI H+ , cursando
diferent es est adios de la infección, y un dador sano. En la t abla 9 se m uest ran las
principales caract eríst icas de los dadores de los PBMCs ut ilizados en el ensayo de
ELI SPOT.
La relación hom bre: m uj er fue 6: 4, sin t ener el dat o del género de uno de los
pacient es y del donant e no infect ado. Se analizaron 3 pacient es con infección aguda y 8
99
Result ados I I I
con infección crónica. De los 8 pacient es crónicos, 5 t enian carga viral indet ect able
( pacient es probablem ent e en t rat am ient o, aunque no se cuent a con est e dat o) ; m ient ras
t odos los pacient es con infección aguda t enían ent re 4 y 5 logarit m os decim al de carga
viral. En cuant o al recuent o de células T CD4 + , sólo un pacient e, el núm ero 466 t enia
m enos de 200 CD4 + / μl, m ient ras que el 257 t enía un recuent o de CD4 + un poco por
encim a de est e punt o, 234 CD4 + / μl; el rest o est aba dent ro de los valores norm ales para
pacient es VI H+ ( > 400 CD4 + / μl) . La m edia result o ser 449 CD4 + / μl y la m ediana 457
CD4 + / μl.
Ta bla 9 : Ca r a ct e r íst ica s de los da dor e s de sa n gr e u t iliz a dos lu e go pa r a e l
e n sa yo de ELI SPOT.
D a dor
N
o
Gé n e r o
Est a dio de
la in fe cción
Ca r ga vir a l ( CV) a
CD 4 +
( cel./ μl)
log 10
CD 8 +
Nef
b
Subt ipo
485
Fem enino
Crónica
4,97
480
835
B
546
Masculino
Aguda
4,28
865
865
B
244
Masculino
Crónica
< 1,7
401
1225
B
466
Masculino
Crónica
< 1,7
133
649
B
252
Masculino
Crónica
< 1,7
315
814
B
258
Fem enino
Crónica
3,81
457
1490
BF
259
Masculino
Crónica
4,77
576
1919
BF
267
Fem enino
Crónica
< 1,7
483
541
BF
257
Masculino
Crónica
< 1,7
234
1007
BF
121
Fem enino
Aguda
4,16
597
751
BF
310
-
Aguda
4,97
400
1965
BF
933
-
-
-
-
-
NI
a
Carga v iral ( CV) calculada por el m ét odo Versant HI V- 1 RNA 3.0 ( Bayer AG) . El um bral de
det ección fue 50 copias de ARN/ m l ( 1.7 log10) .
b
Cit om et ría de Fluj o doble plat aform a ( Epics XL; Coult er ) .
NI : no infect ado
1.2. Secuenciación y Filogenia
En
un
principio,
se
realizó
la
ident ificación
del
subt ipo
viral
m ediant e
la
secuenciación de Nef, a part ir de ADN ext raído de los PBMCs. Se realizó el análisis
filogenét ico m ediant e la const rucción del árbol filogenét ico, m ediant e el m ét odo de
Neighbor- j oining, ut ilizando secuencias de referencia, j unt o con las secuencias que se
encuent ran en los vect ores ( Figura 35 A) . Se puede observar, que 5 de ellos agrupan
dent ro del clado de secuencias F, j unt o con las secuencias ARMA185 y ARMA159,
secuencias
prot ot ipo
de
la
CRF12_BF,
infiriendo
que
se
t rat a
de
secuencias
recom binant es BF. A est o se sum a el hecho de que en Argent ina la prevalencia de
subt ipo F es m uy baj a, m ient ras que la m ayoría de las recom binant es BF poseen la
secuencia de Nef filogenét icam ent e cercana al subt ipo F. Por ot ro lado, 5 secuencias
agruparon con las secuencias de referencia del subt ipo B. La secuencia del pacient e 257,
no agrupó en ninguno de los clust ers, quedando en el m edio de los nodos de B, D y F.
100
Result ados I I I
Figu r a 3 5 : Filoge n ia de la s
se cu e n cia s de N e f
pe r t e ne cie nt e a los
pa cie n t e s. A- Árbol
filogenét ico m ost rando las
relaciones ent re las secuencias
de los pacient es, las secuencias
expresadas desde los vect ores
y secuencias de referencia.
101
Result ados I I I
Figu r a 3 5 : Filoge n ia de la s se cu e n cia s de N e f pe r t e n e cie n t e a los pa cie n t e s
( con t in u a ción ) . B- Análisis de boot scanning para la secuencia del pacient e 257.
Para est e caso, se analizó la secuencia con el m ét odo de boot scanning ( usando el
program a Sim Plot ) . En la figura 35 B se m uest ra el gráfico obt enido por est a
m et odología, donde cada color indica el porcent aj e de sim ilit ud con el subt ipo indicado.
De est a m anera, se puede observar que hast a, aproxim adam ent e, la base 250, la m ayor
hom ología de la secuencia es con el subt ipo B ( linea azul) . En est e punt o ocurre un
cam bio, pasando a ser el subt ipo de m ayor sim ilit ud el F ( línea roj a) , hast a la base 500
aproxim adam ent e, donde vuelve a ser el subt ipo B el m ás sim ilar a la secuencia
analizada ( línea azul) . Así, est a secuencia de Nef t iene dos punt os de recom binación.
2 . Re spu e st a I n m u n e Ce lu la r fr e n t e a los Pé pt idos N e fBF y N e fB e n
Pa cie n t e s VI H +
Luego, se analizó la respuest a inm une en est os pacient es ( Figura 36) , m ediant e el
reconocim ient o de los pépt idos que represent an la prot eína NefBF y B, ut ilizados a lo
largo de est e t rabaj o. Com o cont rol negat ivo se incubó las células de cada pacient e con
RPMI c+ DMSO y com o cont rol posit ico se usó PMA + ionom icina y el pool de pépt idos
denom inado CEF ( ver M&M 4.3.3.) .
Todas las personas evaluadas respondieron a los pooles de pépt idos NefBF y NefB,
con m agnit udes que variaban ent re 89 a 5240 en el caso de los pépt idos NefBF y 165 a
8280 CS I FN- γ/ 10 6 PBMC para NefB ( Figura 36) . Por ot ro lado, los pacient es que est aban
infect ados con el subt ipo B t uvieron, en general, una respuest a de m enor m agnit ud
frent e a los pépt idos B o BF ( Pépt idos Nef BF: 89 a 665 CS I FN- γ/ 10 6 PBMC, pépt idos Nef
B: de 289 a 1780 CS I FN- γ/ 10 6 PBMC) con respect o a aquellos infect ados con variant es
102
Result ados I I I
recom binant es BF ( Pépt idos Nef BF: 210 a 5240 CS I FN- γ/ 10 6 PBMC y Pépt idos Nef B:
165 a 8280 CS I FN- γ/ 10 6 PBMC) . En t odos los casos se encont raron respuest as frent e a
am bos pooles except o, siendo el pacient e 466 el de m enor respuest a frent e a los
pépt idos BF, pacient e que t uvo el m enor recuent o de células CD4+
y respondió
pobrem ent e frent e al est ím ulo posit ivo de los pépt idos CEF. A pesar de est o, un dat o
int eresant e es que en los casos donde hubo diferencias significat ivas ent re la respuest a
frent e a B y BF ( en 3 de 5 de los pacient es infect ados con B y uno de los 6 pacient es
infect ados con BF) la m ayor respuest a est uvo dirigida cont ra los pépt idos hom ólogos al
subt ipo viral con el que se encuent ra infect ado el pacient e ( pacient es 546, 244, 466 y
121) .
Figu r a 3 6 : Re con ocim ie n t o de los poole s de pé pt idos de N e fBF y N e fB por PBM C de
pa cie n t e s VI H + . Respuest a inm une m ediada por células dirigida frent e a la prot eína Nef
det ect ada por la reest im ulación de las células con pépt idos derivados de la secuencia de NefBF o B,
m ediant e ELI SPOT. Las barras represent an el prom edio de células secret oras de I FN-γ por 10 6
células + su desvío est ándar para cada pacient e, por duplicado. Los valores con m edio cont rol
fueron rest ados. Las diferencias significat ivas ent re BF y B est án señalizadas con * p< 0.05.
Est os ensayos dem uest ran
que
am bos pooles de
pépt idos usados en
los
experim ent os m urinos fueron reconocidos por PBMCs de pacient es infect ados con las
variant es virales que circulan en Argent ina. Ya que las secuencias expresadas desde los
vect ores vacunales, aquí generados y caract erizados, t ienen 98,06% de sim ilit ud en el
cadso de NefBF y 95,67 % de sim ilit ud ent re los pépt idos B y los vect ores B ( Tabla 6) ,
ést a es una m edida indirect a de la represent ividad de est as secuencias virales en la
población est udiada. En general, se encont ró react ividad cruzada ent re BF y B, pero con
la salvedad, de que en los pacient es donde exist ían diferencias ent re las respuest as
encont radas, la m ayor m agnit ud era frent e al subt ipo del virus del pacient e.
103
Discusión
Discusión
Desde el inicio de la pandem ia de VI H/ SI DA, el desarrollo de m ás de una docena de
ant irret rovirales ha llevado a un im port ant e descenso en la m ort alidad asociada al SI DA,
j unt o con un aum ent o en la calidad de vida de las personas infect adas con el virus de la
inm unodeficiencia hum ana [ 60,
129] .
Est o ha ocurrido especialm ent e en
países
desarrollados, donde el acceso a las t erapias est á al alcance de t odos los individuos
VI H+ , aunque últ im am ent e, se est á am pliando en países en vía de desarrollo [ 60] . A
pesar de los int ent os de concient izar a la población, m ediant e la educación y el cam bio
de com port am ient o, y de los esfuerzos de la com unidad cient ífica por generar nuevos
ant irret rovirales, el VI H sigue esparciéndose por el m undo, con una t asa est im ada en
6.800 nuevas infecciones diarias [ 129] . Una vacuna efect iva y segura sería una de las
herram ient as m ás im port ant es para det ener la pandem ia.
El avance del conocim ient o sobre la pat ogénesis de VI H y sobre cóm o la respuest a
inm une cont ribuye al cont rol de la replicación viral, ha llevado la at ención de las nuevas
invest igaciones a la inm unidad celular [ 60] . Exist en num erosos t rabaj os que dem uest ran
la im port ancia de la respuest a celular en el cont rol del VI H, así com o de SI V [ 43- 48] .
El obj et ivo principal de una vacuna para VI H- 1 debería ser prevenir la infección o
bien, si est o no puede lograrse, reducir la carga viral y la progresión a SI DA. Una vacuna
ideal debería bloquear com plet am ent e la infección m ediant e inm unidad est erilizant e,
pero la realidad es que la m ayoría de las vacunas ant ivirales que exist en en el m ercado
funcionan cont rolando la replicación viral sub- clínicam ent e y previniendo la enferm edad
[ 130] .
I nm unizaciones en prim at es no hum anos con vacunas que inducen principalm ent e
respuest a celular, producen una reducción de la virem ia inicial, generando un m enor set
point y una reducción en los niveles t ot ales de virus producidos durant e los est adios
t em pranos de la infección [ 60, 131- 133] . La progresión a la enferm edad ocurrió m ás
t ardíam ent e en est os casos y est e ret raso se correlacionó con los niveles de la respuest a
celular inducida.
A part ir de est o surge la pregunt a de si una vacuna que no prevenga la infección,
pero que dism inuya la virem ia y ret rase la progresión a SI DA, sería beneficiosa, y al
m ism o t iem po, m ás realist a de generarse [ 130] . Est udios de cohort es para analizar la
hist oria nat ural de la infección han m ost rado que los niveles de la carga viral en el
m om ent o del set point correlacionan inversam ent e con la progresión a la enferm edad
[ 60, 134] .
Ent onces, si los m odelos anim ales y el curso nat ural de la infección pueden ser
predict ores del desarrollo de la enferm edad, quizá las personas que reciban vacunas que
generen una respuest a inm une celular efect iva, al ser post eriorm ent e infect adas, puedan
perm anecer sin enferm edad por m ás t iem po, o incluso no desarrollarla, aún en ausencia
de t erapia ant irret roviral [ 60, 134] ( Figura 37) . De t odas form as, los result ados
105
Discusión
provenient es del últ im o ensayo clínico de fase I I I no coinciden con est a t eoría, ya que se
observó que la inm unización previa no generó un m ej or cont rol de la virem ia inicial ni
una m enor pérdida de linfocit os T CD4 + . Sin em bargo, sí hubo diferencia en el porcent aj e
de individuos infect ados al com parar el grupo inm unizado versus el grupo que recibió
placebo [ 50] .
Figu r a 3 7 : H ipot é t ico cu r so de la in fe cción por VI H e n pe r son a s va cu n a da s. Una vacuna
que genere respuest a inm une celular podría dism inuir la virem ia inicial y en consecuencia reducir la
disem inación que ocurre durant e la infección prim aria ( barra am arilla) , preservando el t ej ido
linfoide asociado a int est ino, dism inuyendo los reservorios virales y con m enores valores de set
point , aum ent ando el periodo de carga viral cont rola ( azul) [ 11, 60] .
Un obst áculo crít ico en el desarrollo de vacunas para VI H- 1 es cóm o inducir una
respuest a com andada por células T capaces de sort ear la variabilidad int ra- e int ersubt ipos o form as recom binant es. Una m anera de lograr est o podría ser el diseño de
vacunas basadas en form ulaciones m ult ivalent es, que incluyan ant ígenos de varios
subt ipos circulant es en det erm inadas áreas. Así, el últ im o ensayo clínico de fase I I I
desarrollado en
Tailandia,
incluía ant ígenos del subt ipo B ( subt ipo am pliam ent e
dist ribuido en el m undo, principalm ent e en países desarrollados) y CRF01_AE, prevalent e
en el país donde se realizó el ensayo [ 50] . Adem ás exist en t rabaj os preclínicos donde se
describen vect ores que expresan prot eínas de diferent es clados [ 54- 58] . Ot ra de las
est rat egias
ut ilizadas
es
la
aplicación
de
inm unógenos
form ados
por
epít opes
conservados [ 59] .
A
excepción
de
África
Sub- Sahariana,
donde
se
encuent ran
represent ados
práct icam ent e t odos los subt ipos de VI H- 1, CRFs y URFs, est udios de epidem iología
m olecular m uest ran que en el rest o del m undo las variant es de VI H han sido det ect adas
con una dist ribución geográfica específica [ 135] . La epidem ia de VI H en Argent ina es
106
Discusión
principalm ent e
dom inada
por
infecciones
causadas
por
el
subt ipo
B
y
form as
recom binant es BF relacionadas con la CRF12_BF ( ver I nt roducción, 2.6.) . La presencia de
est a variant e viral fue report ada por ot ros países lat inoam ericanos t ales com o Uruguay
[ 32] donde son relat ivam ent e com unes, m ient ras una m enor proporción de casos de
virus recom binant es BF fueron report ados en Bolivia [ 32] , Venezuela [ 136, 137] , Chile y
España [ 137] . Report es recient es indican nuevos casos de infecciones con CRF12_BF en
España
[ 138]
y
Paraguay
[ 139] .
Aunque
los
ext ensivos
dat os
epidem iológicos
dem uest ran la im port ancia de la CRF12_BF y variant es recom binant es relacionadas con
ést a, no exist en t rabaj os relacionados con la inm unogenicidad de ant ígenos BF salvo el
realizado en 2008 por colaboradores de est e t rabaj o, donde se analizó el im pact o de las
secuencias B o BF de Nef en la respuest a inm une celular en pacient es recient em ent e
infect ados en Argent ina [ 51] . En ese est udio, se encont ró una respuest a específica frent e
a cada clado, así com o react ividad cruzada en las respuest as ant e la prot eína Nef. Para
ext ender y cont inuar con el análisis de la inm unogenicidad de NefBF, en el present e
est udio se evaluó la respuest a inm une celular inducida, en rat ones, cont ra est a prot eína
expresada desde vect ores de ADN y virales: MVA y VV.
Teniendo en cuent a la com plej idad de la epidem iología m olecular en Argent ina,
surge la incógnit a de si una vacuna desarrollada para com bat ir la epidem ia en el prim er
m undo sería út il en Argent ina y ot ros países de Lat inoam érica. A part ir de est e
int errogant e, se plant eó com o obj et ivo general de est e t rabaj o de t esis “ Desarrollar
vect ores vacunales cont ra el VI H- 1 basados en vect ores virales y de ADN que expresen
genes del subt ipo B y de la form a recom binant e circulant e CRF12_BF de VI H- 1, present e
en Argent ina y países lim ít rofes, a fin de cont ar con herram ient as biológicas para la
evaluación de la im port ancia de la inm unidad subt ipo específica en el desarrollo de
vacunas” .
Se han ut ilizado diferent es ant ígenos en los cient os de candidat os a vacunas que se
han desarrollado. Las prot eínas m ás ut ilizadas han sido Env, Gag, Pol y Nef; y, en m enor
m edida, Tat , Vpu, Rev y TR ( Tabla 3) . Las prot eínas se han expresado individualm ent e
[ 63, 64, 140] , o com o prot eínas de fusión [ 58, 88] . En est e t rabaj o se decidió t rabaj ar
con Nef debido a que, j unt o con Env, son las dos prot eínas m ás variables del genom a
viral, llegando a variar hast a un 30% en la secuencia am inoacídica [ 52] . En el caso de
NefBF y NefB exist e un 24% de diferencia ent re sus secuencias prim arias. Por ot ro lado,
es una de las prim eras prot eínas que se expresa en el ciclo viral [ 12] . Una de las
caract eríst icas m ás im port ant es que hacen de Nef un buen candidat o para ser ut ilizado
com o ant ígeno vacunal es que, durant e la prim o- infección, la respuest a celular específica
para Nef represent a ent re el 46 y 94% del t ot al de la m agnit ud de la respuest a ant i- VI H
[ 67] ; adem ás, Nef y Gag son las prot eínas de VI H con la m ayor densidad de epít opes
[ 66] .
107
Discusión
1 . Re a ct ivos Biológicos
En est e t rabaj o se generaron y caract erizaron vect ores vacunales que expresan las
prot eínas de la CRF12_BF, NefBF, y del subt ipo B, NefB. Para expresar las prot eínas se
eligieron vect ores cuya adm inist ración genere, principalm ent e, una respuest a inm une
celular, com o son los vect ores de ADN, MVA y VV. Est os vect ores se encuent ran ent re los
m ás ut ilizados en los act uales ensayos clínicos y preclínicos ( ver I nt roducción, Tabla 3)
[ 64, 141, 142] .
Com o part e de la caract erización de los vect ores se corroboró la correct a expresión
de las prot eínas NefBF y NefB a part ir de líneas celulares de dist int os orígenes, t ales
com o BHK- 21 ( hám st er) , BSC- 40 ( m ono) , 3T3 ( rat ón) , HeLa y 293- T ( hum anas) . Los
niveles de prot eína sint et izada a part ir de los vect ores de ADN, analizados por WB,
fueron com parables con aquellos descript os en ot ros est udios donde la secuencia de Nef
no fue alt erada para el uso de codones opt im izados y es expresada desde el m ism o
prom ot or de CMV [ 140] . Por ot ro lado, se det ect aron niveles alt os de expresión de NefBF
a part ir de células infect adas con MVAnefBF y VVnefBF, de la m ism a m anera que se
det ect aron alt os niveles de NefB a part ir de células infect adas con VVnefB. De est a
m anera, los niveles y la cinét ica de la expresión de NefBF y NefB fueron sim ilares a
aquellos report ados para ot ros genes de VI H- 1, expresados baj o la regulación del m ism o
prom ot or sint ét ico de Vaccinia ( pe/ l) en MVA y NYVAC recom binant es ( insert os en el
locus viral TK) . Al igual que en los ensayos realizados com o part e de est a t esis, en est os
t rabaj os encuent ran alt a expresión de las prot eínas de VI H- 1 a las pocas horas de la
infección [ 54, 61] .
Report es previos han indicado que, cuando Nef de SI Vm ac239 es expresado desde
un virus Vaccinia, el crecim ient o del m ism o, así com o la form ación de las placas de lisis,
se ven alt erados [ 119, 120] . Para corroborar que la expresión de NefBF y B no afect ara
el crecim ient o de MVA y VV se analizó la cinét ica de crecim ient o de los t res virus
recom binant es. Se dem ost ró que la producción de virus int racelular o ext racelular fue
sim ilar para MVAnefBF y MVA salvaj e. Adem ás, la producción final de virus t am bién fue
de m agnit ud com parable con ot ros descript os ant eriorm ent e, llegando a 10 7 UFP/ m l [ 54] .
Por ot ro lado, el análisis de la cinét ica de los VV recom binant es t am poco m ost ró
diferencias en la cant idad de virus final en la fracción int racelular. Sin em bargo, se
observó una alt eración en el fenot ipo de la placa de lisis, observándose placas de
pequeño t am año, 60% m enores que las originadas por el virus VVHA- , sin observarse
diferencias en el crecim ient o viral, fenóm eno sim ilar al observado ant eriorm ent e por
Chan y colaboradores [ 120] , los que observaron un 30% de reducción del t am año de la
placa. I nt eresant em ent e, así com o la placa pequeña desaparece luego de 3 días de
108
Discusión
infección ( Tabla 8) , al recuperar virus a part ir de los ovarios en los rat ones desafiados
( Result ados I I , 5.1 y 5.2, Figura 36) no se encuent ra, durant e la t it ulación, placas con
fenot ipo de t am año pequeño. Est o sugiere la exist encia de una selección in vivo del virus
que genera placas norm ales. El fenot ipo de placa del virus VVnefB, generado aquí, fue
sim ilar al de VVnefBF. Sin em bargo, al analizar el t am año de placa de un virus Vaccinia
recom binant e para nef del subt ipo B ( MN) , adquirido m ediant e el program a de provisión
de react ivos del I nst it ut o Nacional de Salud de los Est ados Unidos ( NI H) , no se
observaron diferencias con respect o a la placa del virus salvaj e. Est o podría at ribuirse a
la diferencia en los niveles de expresión de la prot eína. En est e t rabaj o, am bas
secuencias de Nef est án reguladas por el prom ot or sínt ét ico pe/ l, el cual es un prom ot or
fuert e, m ient ras que le virus obt enido de NI H expresa Nef desde el prom ot or I 3L,
t em prano/ int erm edio, el que es un prom ot or nat ural de Vaccinia [ 143] . Cabe dest acar,
que cuando se realizó el análisis de la est abilidad en la expresión de Nef a part ir del pase
4 ( sección 2.2.1. de Result ados I , Figura 17 B) se seleccionaron t ant o placas pequeñas
com o grandes, encont rándose que el 100% de las placas, sin im port ar el t am año,
expresaba Nef.
A part ir de est e análisis se puede concluir que la expresión de NefBF no alt era el
crecim ient o de MVA, aunque sí el del vect or basado en la cepa WR. De t odas form as,
est os virus recuperan el fenot ipo norm al al cabo de algunas rondas de replicación.
Un aspect o im port ant e del virus recom binant e MVAnefBF es su est abilidad. La
am plificación a gran escala del virus y una serie de pasaj es ciegos no afect aron su
int egridad genóm ica, ni la expresión de la prot eína recom binant e. Est e dat o es de sum a
im port ancia, ya que garant iza su correct a am plificación sin que corra riesgo la int egridad
del genom a recom binant e.
2 . I n m u n oge n icida d de N e fBF
A pesar de la alt a prevalencia de variant es recom binant es BF en Argent ina y ot ros
países de Lat inoam érica [ 33- 36] , la inm unogenicidad de las prot eínas de est os virus no
ha sido est udiada m ás que en el t rabaj o de la Dra. Turk y colaboradores [ 51] . Com o
cont inuación de la caract erización de la inm unogenicidad de NefBF, se llevó adelant e el
present e t rabaj o de t esis.
A part ir de los vect ores generados y caract erizados ant eriorm ent e ( Result ados I ) , y
m ediant e la aplicación de diferent es esquem as de inm unización, se analizó la capacidad
de NefBF de generar una respuest a inm une celular y hum oral en rat ones Balb/ c.
Luego de la aplicación de los vect ores ut ilizando el esquem a de inm unización
prim e/ boost , con una dosis de ADN, seguida por una de MVA, se obt uvo una respuest a
específica para NefBF. La m agnit ud de est a respuest a fue baj a com parada con la
109
Discusión
obt enida, con el m ism o esquem a de inm unización, frent e al epít ope inm unodom inant e V3
de la envolt ura viral [ 104, 144] o cont ra pépt idos de Gag [ 54, 56, 58] . Sin am bargo, los
result ados present ados aquí no difieren significat ivam ent e de ot ros t rabaj os en donde se
usa
Nef
com o
inm unógeno.
Así,
aplicando
un
esquem a
colaboradores det ect an 40 CS I FN- γ/ 10 6 esplenocit os [ 54] .
prim e/ boost
Góm ez
y
Por ot ro lado, la aplicación de dos dosis de ADN generó una respuest a m enor a la
generada por el esquem a com binado, que no se pudo det ect ar por ELI SPOT. Est o no fue
diferent e a lo esperado, ya que, sum ado al hecho de que Nef result ó t ener una baj a
inm unogenicidad en est e m odelo, ha sido report ado previam ent e que las vacunas
basadas en ADN no generan una alt a inm unogenicidad sin el uso de adyuvant es [ 90,
145] .
Del m ism o m odo, la respuest a generada por la aplicación de dos dosis del vect or
MVA fue indet ect able por la m et odología ut ilizada en est e t rabaj o. Sin em bargo, la
respuest a inm une celular y hum oral generada frent e a las prot eínas de MVA fue
considerable, incluso viéndose un aum ent o luego de la segunda aplicación, asegurando
que la inm unización en est e grupo de anim ales fue efect iva pero no suficient e para
generar una respuest a det ect able frent e a Nef. Una posible explicación para est o es que,
las células T específicas com pit en por el acceso a las células present adoras de ant ígeno,
fenóm eno conocido com o com pet ición cruzada de células T o T cell cross- com pet it ion.
Est o t iene alt a relevancia en el boost , configurando la j erarquía de im m unodom inancia en
el reclut am ient o de las células. Se ha dem ost rado que la cross- com pet it ion no t iene
relevancia durant e el prim e, depende fuert em ent e del m om ent o de la expresión del los
ant ígenos virales en las CPA y se caract eriza por la pobre proliferación de las células T
que reconocen epít opes derivados de prot eínas virales de expresión t ardía [ 146] . Est o
llevaría a que, durant e el boost , se veo un aum ent o en la respuest a frent e a algunos
epít opes, los inm unodom inant es, sin aum ent ar la respuest a frent e a t odos los ant ígenos
expresados. De t odas form as, Nef se expresa aquí desde un prom ot or t em prano/ t ardío.
La aplicación de m últ iples dosis de ADN y luego una dosis de MVA, produj o un
increm ent o significat ivo en la m agnit ud de la respuest a cont ra los pépt idos hom ólogos y
react ividad cruzada frent e a los pépt idos del subt ipo B. Dat os de est udios recient es de
Brave y colaboradores, m uest ran que inoculando los anim ales con dosis m ayores a las
ut ilizadas en est a t esis, dos dosis de ADN ( 100 μg/ rat ón) y una de MVA ( 10 8 UFP/ rat ón) ,
am bos expresando Nef de la cepa LAI ( subt ipo B) , obt ienen una respuest a de 150 CS
I FN- γ/ 10 6 esplenocit os [ 63] . En ot ro est udio recient e, donde se describió un MVA
recom binant e con m últ iples genes del subt ipo C/ B, Nef se expresaba com o una prot eína
de fusión j unt o con Tat ( Nef- Tat ) , unidas a una secuencia líder act ivadora de t ej ido que
aum ent a la expresión prot eíca, la respuest a celular ant i- Nef det ect ada fue alt a y,
sorpresivam ent e, com parable con la ant i- Env y ant i- Gag [ 56] .
110
Discusión
Seguram ent e, la act ividad de Nef de regular negat ivam ent e la expresión en
m em brana del com plej o m ayor de hist ocom pat ibilidad clase I ( MHC I ) [ 24, 147] podría
influenciar negat ivam ent e la inm unogenicidad del vect or. En est e sent ido, es im port ant e
not ar que, en est e t rabaj o, la secuencia de Nef no ha sido m odificada ni para obt ener
m ayores niveles de expresión, ni para inact ivar su conocida función com o regulador
negat ivo del MHC I y la m olécula CD4, las que han sido m odificados en ot ros est udios
[ 56, 83] . Recient em ent e se ha publicado un t rabaj o de la Dra. Gabriela Turk [ 147] donde
se ha descript o que la act ividad reguladora negat iva de NefBF no difiere de la de NefB
sobre las m oléculas MHC I , MHC clase I I , CD4 y regulación posit iva sobre la expresión en
m em brana de la cadena invariant e ( I i) asociada al MHC I I , afect ando la capacidad de la
células que expresan Nef para present ar ant ígenos. La m ism a secuencia de NefBF
est udiada en ese t rabaj o es la ut ilizada aquí, de m anera que, est as funciones pueden
int erferir con la present ación de ant ígeno y desarrollo de la respuest a inm une in vivo.
En est e t rabaj o, no se det ect ó react ividad cruzada frent e al subt ipo B en los grupos
que recibieron una dosis de ADN y una de MVA, m ient ras que en los grupos que
recibieron 3 dosis de ADN seguidas por la de MVA, se encont ró una respuest a
significat iva frent e al subt ipo het erólogo, aunque m enor a la encont rada frent e a los
pépt idos hom ólogos. Diferent es razones pueden explicar la baj a react ividad cruzada
ent re est as prot eínas. Una de ellas puede ser la diferencia de secuencia ent re los
subt ipos: la com paración de secuencias NefBF y NefB arroj a una diferencia de 24% en
sus secuencias am inoacídicas. En concordancia con est os result ados, est udios recient es
han dem ost rado t ant o dist int os grados de inm unogenicidad ent re ant ígenos de diferent es
subt ipos virales, com o baj a prot ección frent e al desafío con subt ipos het erólogos. Así, en
est udios com parat ivos ent re el subt ipo AE y B, donde se analizan regím enes de
inm unización en m acacos de ADN/ FPV ( fowlpoxvirus) con genes de VI H AE, prevalent e
en Tailandia y el Sudest e de Asia, la respuest a encont rada frent e al consenso del subt ipo
A fue sim ilar a la encont rada frent e a los subt ipos B y C, siendo m ayor la respuest a
hallada frent e a los pépt idos hom ólogos a los de la vacuna, AE [ 148] .
En ot ro est udio, donde se aplica un m odelo de prot ección en rat ones frent e al
pseudovirus de la leucem ia m urina/ VI H- 1 [ 125] , anim ales desafiados con el subt ipo A de
VI H- 1, que habían sido inm unizados previam ent e con el subt ipo B, result aron m enos
prot egidos que aquellos desafiados son el subt ipo hom ólogo al de la inm unización. Los
m ism os aut ores, t am bién han descript o una m enor respuest a frent e a las prot eínas Gag
y Env het erólogas que frent e a las hom ólogas [ 125] . Est os t rabaj os, sum ados a los dat os
aquí expuest os, dem uest ra el grado de dificult ad de inducir una respuest a que prot ej a
frent e a subt ipos het erólogos de VI H.
Un im port ant e avance generado a part ir de est a t esis, fue haber encont rado
react ividad cruzada frent e a NefB luego de inm unizar con 3xADNBF/ MVAnefBF o VVnefBF,
111
Discusión
aunque est a respuest a haya sido aproxim adam ent e 3 veces m enor a la encont rada frent e
a NefBF, aum ent ando est a diferencia al reest im ular las células durant e un período de 10
días, m ediant e la am plificación los clones react ivos. Adem ás, es im port ant e recalcar que,
al inm unizar con los vect ores que expresan la prot eína del subt ipo B, a pesar de
obt enerse una respuest a levem ent e m enor en cuant o a m agnit ud, se observó una m ayor
react ividad cruzada con el subt ipo het erólogo en relación a la obt enida frent e al
hom ólogo. Una posible causa para haberse det ect ado una m enor respuest a con los
vect ores B es que la hom ología ent re los pépt idos B y la secuencia expresada por los
vect ores B es m enor a la hom ología ent re los pépt idos BF y la secuencia expresada desde
los vect ores NefBF. En el caso de los pépt idos B, la hom ología con la secuencia de los
vect ores es del 95.67 % , m ient ras que en el caso de los pépt idos BF es del 98.06 % . Al
evaluar la secreción de TNF se vió que las células de los dist int os grupos secret aron
am bas cit oquinas, frent e a los pépt idos hom ólogos, m ient ras que las células del grupo
que recibió la dosis de MVAnefBF secret aron t ant o TNF com o I L- 2 frent e a los pépt idos B,
pero no fue así en el caso del vect or VVnefBF.
Al m edir la respuest a inm une hum oral se encont ró que, al igual que en la respuest a
celular,
el
esquem a
de
inm unización
que
involucra
la
prot eína
NefB
generó
reconocim ient o de los pépt idos B y BF, m ient ras que los sueros de los anim ales
inm unizados con los vect ores BF sólo reconocieron los pépt idos hom ólogos. En cuant o a
la respuest a hum oral generada luego del esquem a 3xADNBF/ MVABF, no se logró det ect ar
ant icuerpos que reconocieran alguno de los pépt idos de am bos set s. Est o es com parable
con dos parám et ros de la respuest a inm une m edidos ant eriorm ent e:
- por un lado, la respuest a celular de m enor m agnit ud generada por el boost con el
vect or
MVA:
la
respuest a
celular
frent e a
Nef
fue m enor
con
est e
esquem a,
com parándola con la respuest a generada por 3xADN/ VVBF ( Figura 24 y 26) ;
- se puede observar que los ant icuerpos t ot ales generados frent e a prot eínas de
Vaccinia son m ucho m enores cuando se adm inist ra una sola dosis de MVA ( ADN/ MVA)
con respect o a una dosis de VV ( Figura 22 B) .
A lo largo de la prot eína Nef, se reconocen 6 dom inios est ruct urales ( Figura 38) : el
dom inio
N- t erm inal
( aa
1- 83) ,
el
core
N- t erm inal
( aa
84- 115) ,
el
dom inio
de
oligom erización ( aa 116- 122) , el core cent ral ( aa 123- 159) , el loop ( aa 160- 182) y el
dom inio C- t erm inal ( aa 183- 205) [ 149] . Cuando se analizaron las secuencias de los
pépt idos reconocidos por los diferent es anim ales se observó que los ant icuerpos de los
anim ales inm unizados con BF reconocieron el core cent ral y el loop de la prot eína,
m ient ras que los anim ales inm unizados con B reconocieron el dom inio N- t erm inal y el
loop ( Figura 38) . Los pépt idos BF11 y B53 son reconocidos por los anim ales inm unizados
con los vect ores NefB, pero no por aquellos que recibieron los vect ores BF. Am bos
pépt idos difieren de la secuencia BF ut ilizada en los vect ores en un aa, encont rándose un
112
Discusión
ácido aspárt ico ( D) en la secuencia del vect or y un ácido glut ám ico ( E) en la secuencia de
los pépt idos y de la secuencia NefB expresada en los vect ores. La int eracción ent re el
MHC I I , o el TCR podrían verse afect ada en el caso de los anim ales inm unizados con
NefBF, dism inuyendo la colaboración Th2 para generar ant icuerpos, aunque al ser los dos
am inoácidos de caráct er ácido pareciera poco probable. Sin em bargo, podría est ar
afect ando el procesam ient o de la prot eína NefBF y la posibilidad de generar ciert os
pépt idos para su present ación. Para poder evauar est o se debería cont ar con un pépt ido
que t enga el cam bio present e en la secuencia de los vect ores de NefBF ( ácido aspárt ico) .
La respuest a generada por un inm unógeno de cualquier origen, inclusive la
generada por un vect or de ADN, puede ser aum ent ada con la co- adm inist ración de una
m olécula adyuvant e, com o pueden ser ciert as cit oquinas o quem oquinas [ 90] . Exist en
num erosos report es donde se ut ilizan m oléculas adyuvant es t ales com o CpG, que
int eracciona con TLR- 9 pot enciando la respuest a inm une generada [ 127] , o cit oquinas
recom binant es, aplicadas j unt o con el inm unógeno direct am ent e com o prot eína [ 126] , o
com o plásm ido de ADN [ 88, 150] , solos o en com binación.
Figu r a 3 8 : D om in ios e st r u ct u r a le s de N e f. En el esquem a se indican los am inoácidos que
definen el inicio y fin de cada dom inio, los pépt idos que los represent an y los pépt idos frent e a los
cuales se generó algún t ipo de respuest a inm une con los diferent es esquem as ut ilizados.
En est e t rabaj o se ut ilizaron plásm idos de ADN que expresan I L- 12 y GM- CSF
m urinas com o posibles m oléculas adyuvant es para aum ent ar la respuest a inm une
generada por la aplicación de los vect ores de ADN. Se consiguió increm ent ar la respuest a
inm une específica 6 veces, aplicando cada adyuvant e por separado, con respect o a la
generada por la inm unización con el plásm ido de NefBF sin adyuvant es, m ient ras que la
respuest a se increm ent ó en 14 veces al adm inist rar I L- 12 y GM- CSF en form a conj unt a.
113
Discusión
Est e leve efect o sinérgico ent re am bas cit oquinas se observó con ot ros inm unógenos,
com o pépt idos de Pol, donde se report ó que, con la aplicación conj unt a de I L- 12 + GM-
CSF + TNF- α ( adm inist radas com o prot eínas recom binant es j unt o con los pépt idos) se
obt enía una m ayor respuest a que con solo una cit oquina o la com binación de dos de
est os adyuvant es por separado [ 126] . Por el cont rario, en ot ro t rabaj o, se ve que
aplicando GM- CSF + I L- 12 ( com o plásm ido) j unt o a un plásm ido que expresaba la
prot eína de la envolt ura de VI H, se obt iene una respuest a levem ent e m ayor, pero con
diferencia no significat iva con respect o a los rat ones que recibieron solo I L- 12. En est e
m ism o report e, se observa que al aplicar a est a com binación de adyuvant es, I L- 12 +
GM- CSF, un t ercer plásm ido que expresa Flt - 3L ( Fact or hem at opoyét ico t irosin- quinasa
3- ligando, el que reclut a y expande células dendrít icas, pot enciando la respuest a
inm une) , produce un efect o inverso, reduciendo la respuest a a un cuart o de la respuest a
obt enida con los dos prim eros [ 88] . En un t rabaj o de Moore y colaboradores se inocula a
los anim ales con plásm idos que expresan Nef o Env solos o con diferent es cit oquinas,
com o I L- 12, GM- CSF y I L- 15[ 85] . I nt eresant em ent e, observan una baj a respuest a
celular para Nef, pero con alt o t ít ulo de ant icuerpos, m ient ras que para Env describen el
com port am ient o inverso, con alt a respuest a celular y sin det ect ar ant icuerpos. Al aplicar
los diferent es adyuvant es con el vect or que expresa Nef, el m ayor aum ent o es con la
aplicación de I L- 12 para la respuest a celular, y GM- CSF para la hum oral [ 85] . En est e
sent ido, un aspect o pendient e para evaluar en un fut uro cercano, son los niveles de
ant icuerpos ant i- Nef en los sueros de los rat ones que recibieron las cit oquinas en las
inm unizaciones.
A part ir del uso de los adyuvant es, que aum ent aron la respuest a not ablem ent e, se
lograron det erm inar los pépt idos inm unogénicos de la respuest a celular ( Figura 38) . Por
un lado, el pépt ido BF33 result ó ser el m ás inm unogénico, represent ando práct icam ent e
el 50% de la respuest a t ot al frent e a los pépt idos BF. En el caso de la inm unización con
GM- CSF, el pépt ido BF3 generó una respuest a de la m ism a m agnit ud que el BF33, sin
em bargo, al aplicarse las dos cit oquinas j unt as solo se increm ent ó la respuest a del
pépt ido BF33. Con respect o a la respuest a frent e a los pépt idos B, los pépt idos que
represent an la m ism a part e de la prot eína que el BF33, son el B83 y B84, los que difieren
en algunos aa relat ivam ent e cercanos a los ext rem os ( Ver Result ados I I , Figura 33) .
Probablem ent e est o sea lo que genere una m enor int eracción ent re el pépt ido y el MHC,
fallando en la act ivación de los linfocit os T. Por ot ro lado, los pépt idos B que represent an
la part e de la prot eína equivalent e al pépt ido BF3 son el B41 y el B42, los que t ienen
cam bios am inoacídicos en la part e cent ral de la secuencia pert enecient e al pépt ido BF3,
lo que posiblem ent e evit e el reconocim ient o del epít ope por part e del TCR. Est os cam bios
ent re las secuencias de NefBF y B serían los que generan la falt a de react ividad cruzada
al inm unizar con los vect ores BF. Un pépt ido frent e al cual se generó una m enor
114
Discusión
respuest a fue el pépt ido BF26. Sin em bargo, su cont rapart e B, el pépt ido B73, que no
posee ningún cam bio con respect o a la secuencia de NefBF, pero se encuent ra desfasado
con respect o al BF26, no fue reconocido por est as células. De t odas form as, la respuest a
generada frent e al pépt ido BF26 apenas supera el crit erio de posit ividad.
En rat ones y part icularm ent e en Balb/ c, Nef no es una prot eína m uy inm unogénica
com parada con ot ras com o Gag o Env. En un t rabaj o realizado donde describen los
pépt idos de Nef blanco de la respuest a luego de inm unizaciones con ADN, sólo
encuent ran una respuest a específica en el 20 % de los anim ales [ 62] . En est e caso, los
pépt idos m ás reconocidos por los anim ales inm unizados son los que abarcan los aa 166 a
185 ( H PM SQH GLED GD REVLKW KF) y 181 a 205 ( LKW KFD SRLALRH I AKEKPEFYQN ) .
I nt esesant em ent e, los cinco aa solapados de est os dos pépt idos ( LKW KF) se encuent ran
represent ados, en el set de pépt idos BF ut ilizado en est a t esis, por el pépt ido BF33,
coincident em ent e, uno de los pépt idos de m ayor inm unogenicidad. Est a m ism a zona
result ó inm unodom inant e en la cepa híbrida ( C57BL/ 6 x DBA/ 2) F1 analizada en dicho
t rabaj o [ 62] .
Se realizó un análisis em pleando las herram ient as inm unológicas de la base de
dat os de Los Álam os para predecir afinidad al MHC de Balb/ c ( haplot ipo H2- d, MHCI ) de
los posibles pépt idos de la secuencia de aa de NefBF [ 151] . Se encont ró que para H2- Kd
( MHC I ) solo 1 pépt ido de 9 aa t uvo un valor de alt a afinidad ( posición: 8- 16, secuencia:
SSSI VGW TSI ) . Est e epít ope se encuent ra represent ado en los pépt idos BF2 y BF3 ( BF2:
KSSI VGW TSI RERM R y BF3: GW TSI RERM RRTPPA) . Not ablem ent e exist en 4 cam bios
en los pépt idos B que represent an est e fragm ent o de la prot eína. En el caso del H2- Dd
los pépt idos fueron t odos de baj a afinidad.
Los diferent es pépt idos reconocidos por las respuest as inm unes generadas a part ir
de los dist int os esquem as se encuent ran localizados principalm ent e en el dom inio Nt erm inal, core cent ral y en el loop. Est os result ados coinciden con est udios realizados en
pacient es, que dem ost raron que la región inm unodom inant e, reconocida por las células T
CD8 + , com prende la sección que va del aa núm ero 66 al 148 ( N- t erm inal y core cent ral)
[ 51, 67, 152, 153] . Por ot ro lado, en el t rabaj o realizado por la Dra. Turk con pacient es
de Argent ina, se ident ificaron pépt idos inm unogénicos en el loop de la prot eína Nef, t ant o
en pacent es infect ados con el subt ipo B o BF [ 51] , dom inio prot eíco donde se encuent ra
uno de los pépt idos de m ayor inm unogenicidad en el m odelo aquí usado.
Para concluir con el análisis de la respuest a en rat ones, se puso a punt o un m odelo
de desafío viral ut ilizando un VV recom binant e para un ant ígeno frent e al cual se induj o
una respuest a inm une previam ent e [ 125- 127] . Ést e es un m odelo efect ivo para evaluar
si la respuest a celular generada frent e al ant ígeno recom binant e es capaz de cont ener
una infección viral, producida por un virus que exprese la prot eína recom binant e de
int erés. Al evaluar la act ividad celular ant iviral específica de la respuest a generada con 3
115
Discusión
dosis de ADN BF+ ADN I L- 12, se puede observar dos respuest as en los rat ones respect o
al nivel de prot ección obt enido. En el prim ero no se det ect aron diferencias significat ivas
ent re los grupos inm unizados con o sin adyuvantes, pero en el segundo grupo, se det ect ó
un descenso de m edio log 10 en la cant idad de virus recuperado a part ir de los ovarios,
siendo est a diferencia significat iva. En ot ros t rabaj os, donde usan un m odelo de
prot ección sim ilar al ut ilizado aquí, com o el de Ahlers y colaboradores, no encuent ran
diferencia ent re los rat ones inm unizados con I L- 12 respect o al grupo sin adyuvant es,
salvo en 2 de los 13, donde no det ect an virus en ovarios [ 126] . Por ot ro lado, exist en
ot ros report es donde encuent ran prot ección en algunos anim ales solam ent e [ 127, 154] .
Tam bién se ha repot ado una correlacón inversa ent re la cant idad de células secret oras de
I FN- γ específicas para un ant ígeno y la cant idad de virus recuperado en ovarios luego del
desafío, con un virus que expresa est a prot eína [ 88] .
3 . Re spu e st a e n Pa cie n t e s
Finalm ent e, com o una m edida indirect a de la represent at ividad de las secuencias
ut ilizadas dent ro de la población de pacient es infect ados de Argent ina, se evaluó la
respuest a ant i- Nef a part ir de PBMC, ut ilizando los pooles de pépt idos B y BF. Se
det erm inó el subt ipo viral de cada pacient e m ediant e secuenciación de nef. El análisis
filogenét ico reveló que el 55% de los pacient es analizados est aban infect ados con
variant es recom binant es BF, m ient ras que el 45% rest ant e est aban infect ados con virus
correspondient es al subt ipo B. Uno de los pacient es ( 257) present ó dos punt os de
recom binación en la secuencia de nef. Est os porcent aj es coinciden con los ant eriorm ent e
report ados por t rabaj os realizados en Argent ina [ 34, 36, 51] .
Se encont ró una fuert e respuest a inm une al evaluar la respuest a ant i- Nef en el
grupo de est os 11 pacient es VI H+ . La m ayoría de los pacient es reconoció am bos pooles
de pépt idos. De t odas form as, int eresant em ent e, en aquellos casos en donde se
encont raron diferencias significat ivas en la m agnit ud det ect ada frent e a uno u ot ro pool,
la m ayor respuest a se det ect ó frent e a los pépt idos represent at ivos del subt ipo viral que
infect a al pacient e. Com o se vio en ot ros t rabaj os, si bien exist e ciert o grado de
react ividad cruzada, la respuest a frent e al subt ipo hom ólogo es m ayor [ 37- 39, 51, 153] .
De m anera análoga a lo encont rado en rat ones, se ve que los pacient es infect ados con
las variant es recom binant es BF t ienen una m ayor respuest a, en m agnit ud, que los
pacient es infect ados por el subt ipo B. Sin em bargo, al analizar la react ividad cruzada se
puede observar que los pacient es BF t ienen una m ayor react ividad cruzada, es decir
m ayor reconocim ient o de los pépt idos B ( com parando con los pacient es B) , en est e caso,
de m anera cont raria a lo vist o en rat ones. De t odas form as, el núm ero de pacient es es
pequeño, con lo cual, para sacar alguna conclusión con m ás fundam ent o habría que
116
Discusión
aum ent ar el t am año de la m uest ra. Un análisis im port ant e de hacer en est e caso sería el
HLA y su relación con los epít opes reconocidos por los pacient es.
4 . Pr oye ccion e s
La necesidad de cerrar et apas, lleva a darle form a a los result ados de cuat ro años y
m edio de t rabaj o, para poder cont ar una hist oria que surge a part ir del esfuerzo diario,
no sólo del t esist a, si no t am bién de m ucha gent e en el laborat orio. Quedan m uchos
punt os para seguir desarrollando.
Por un lado, la am pliación del m apeo fino de los epít opes inm unodom inat es,
confirm ando aquellos pépt idos que aún no han sido analizados, así com o ident ificar
pépt idos inm unodom inant es de la secuencia B. Aún no se ha evaluado si se m odifica el
reconocim ient o de epít opes a part ir del esquem a que involucra el vect or VVnefBF.
En el laborat orio se dispone de un cit óm et ro de fluj o de seis colores y de los
ant icuerpos necesarios para la m arcación de m em brana e int racelular que se ut iliza, para
caract erizar polifuncionalidad de los linfocit os T CD4 + y CD8 + específicos. Est e es un
análisis int eresant e que, a pesar de varios int ent os, no fue posible realizar en el esquem a
3xADNBF/ MVABF, debido a que la respuest a inm une era de relat ivam ent e baj a m agnit ud
para est a t écnica. A part ir de la respuest a inm une generada t ras las inm unizaciones que
incluyen las m oléculas adyuvant es será posible analizar la polifuncionalidad de las células
específicas para los diversos pépt idos BF y B. De la m ism a m anera, recient em ent e se
adquirieron los ant icuerpos necesarios para m arcar los diferent es subset s de linfocit os de
m em oria ( cent ral, efect ora) . Sería int eresant e evaluar en los dist int os esquem as la
capacidad de generar respuest a de m em oria, siendo est a una caract eríst ica crucial de la
respuest a generada por un candidat o a vacuna.
Con respect o a la respuest a hum oral, es un deseo evaluar los epít opes reconocidos
por los anim ales inm unizados con los esquem as que llevan las m oléculas adyuvant es. Así
m ism o, se cuent a en el laborat orio con las herram ient as y la m et odología necesaria para
desarrollar las prot eínas recom binant es NefBF y NefB, expresándolas desde sist em as
bact erianos, para obt enerlas puras y en cantidades suficient es para realizar ELI SAs. El
obj et ivo sería poder evaluar ant icuerpos a part ir de sueros de los anim ales inm unizados
con los diferent es esquem as. El clonado de dichas prot eínas se encuent ra a m it ad de su
proceso.
Est e t rabaj o de t esis es part e de un proyect o m ás am plio, donde se pret ende
evaluar la im port ancia de la react ividad cruzada ent re el subt ipo B y las form as
recom binant es BF, con respect o a varias prot eínas de VI H. El grupo ya cuent a con
algunos result ados para Env BF y B, donde se encont ró respuest a subt ipo específica, así
117
Discusión
com o ciert o grado de react ividad cruzada ( dat os no publicados) . Queda m ucho por
est udiar aún en cuant o a ot ras prot eínas com o Gag, Pol o Tat .
En resum en, en est e t rabaj o de t esis se describe la generación, caract erización e
inm unogenicidad de los vect ores de ADN y virales ( MVA y VV) que expresan la prot eína
Nef de CRF12_BF y del subt ipo B de VI H- 1. La inm unización en rat ones con una dosis
sim ple de ADN y MVA generó una respuest a alt am ent e específica con baj a react ividad
cruzada frent e al subt ipo B, pero un esquem a con 3 dosis de ADN y una dosis de MVA o
VVnefBF produj o una respuest a inm une m ás pot ent e frent e a los pépt idos hom ólogos con
una react ividad cruzada significat iva, aunque de m enor m agnit ud. Por ot ro lado, la
inm unización con los vect ores de ADN y VV que expresan la prot eína NefB generaron una
respuest a de sim ilar m agnit ud, pero con m ayor react ividad cruzada que los vect ores BF.
La adm inist ración de m oléculas adyuvant es en el prim e logró aum ent ar la m agnit ud de la
respuest a, llevando a la ident ificación de los pépt idos inm unodom inant es.
Est os result ados serán de considerable im port ancia en el diseño de fut uras vacunas
para nuest ra región donde circulan variant es virales recom binant es BF indicando que la
inclusión de est os ant ígenos virales en fut uras vacunas podría facilit ar la generación de
una respuest a inm une efect iva.
118
Conclusiones
Conclusiones
En est e t rabaj o de t esis se describen y caract erizan por prim era vez vect ores
vacunales ( ADN y de virus Vaccinia) que expresan el ant ígeno de la CRF12_BF,
circulant es en Argent ina y ot ros países de Lat inoam érica.
Se caract erizaron los vect ores de ADN previam ent e generados por la Dra.
Gabriela Turk: Est os vect ores fueron capaces de expresar la prot eína a part ir de
células t ransfect adas, t ant o m urinas com o hum anas.
Se caract erizaron los vect ores virales aquí generados:
• La expresión de Nef no alt eró la replicación de los virus recom binant es, no
present ando inconvenient es al m om ent o de generar st ocks vacunales.
• Todos los virus recom binant es fueron capaces de expresar las prot eínas
exógenas al infect ar diferent es líneas celulares, con diversos orígenes com o
hum ano, rat ón, m ono o hám st er.
• Se dem ost ró la est abilidad del vect or viral MVAnefBF t ant o a nivel genóm ico
com o de expresión, t ras m ás de 10 pasaj es de am plificación.
Todos los vect ores const ruídos result aron inm unogénicos en el m odelo m urino
em pleado ( cepa Balb/ c) .
El vect or MVA generó una respuest a m ayor al adm inist rarse luego de una dosis
de ADN ( esquem a ADN/ MVA) que com o dos dosis de MVA, sin present ar react ividad
cruzada frent e a Nef B.
La falt a de react ividad cruzada frent e a la prot eína Nef B indicaría una respuest a
subt ipo específica en los anim ales inm unizados con los diferent es esquem as.
Se logró increm ent ar t res veces la respuest a inm une celular generada al
aum ent ar la cant idad de dosis en el prim e, observándose react ividad cruzada frent e a la
prot eína del subt ipo B, aunque m enor que la respuest a frent e al subt ipo hom ólogo.
La inm unogenicidad del vect or VVnefBF, al ut ilizarse com o boost , fue casi t res
veces m ayor que la generada por MVAnefBF.
En los anim ales inm unizados con el vect or VVnefB se observó una m ayor
react ividad cruzada que en los inm unizados con el vect or VVnefBF.
Se caract erizó la respuest a hum oral a part ir de los esquem as con los vect ores
WR, ident ificándose los pépt idos inm unodom inant es: La react ividad cruzada de la
respuest a hum oral fue m ayor en el caso de los vect ores que expresan NefB
En los esquem as evaluados t am bién se observó secreción específica de I L- 2 y
TNF, observándose en est e caso t am bién que la react ividad cruzada con el vect or VVnefB
es m ayor.
Mediant e el uso I L- 12 o GM- CSF com o adyuvant es se logró pot enciar m ás de 6
veces la respuest a.
Se observó un leve sinergism o al aplicar los I L- 12 y GM- CSF com o adyuvant es
en un m ism o esquem a de inm unización.
120
Conclusiones
A part ir
de los anim ales inm unizados con
los diferent es esquem as con
adyuvant es se pudieron definir los pépt idos inm unodom inant es para la respuest a celular.
Las regiones inm unogénicas de Nef, en el m odelo ut ilizado en est e t rabaj o, t ant o
para respuest a hum oral com o celular, fueron el dom inio N- t erm inal, el core cent ral y el
loop.
Mediant e el m odelo de desafío, ut ilizando la cepa replicat iva del virus Vaccinia
( WR) , se pudo evaluar la efect ividad de la respuest a inm une generada luego de la
aplicación de t res dosis de los vect ores de ADN que expresan NefBF, com o inm unógeno,
e I L- 12, com o adyuvant e: La respuest a generada por t res dosis de ADN NefBF+ ADN I L12 fue parcialm ent e prot ect ora en 3 de los 5 rat ones inm unizados.
Las frecuencias de los subt ipos encont radas en los pacient es VI H+ analizados en
est e t rabaj o se corresponden con los dat os epidem iológicos report ados ant eriorm ent e.
Se encont ró respuest a subt ipo específica, así com o react ividad cruzada en t odos
los pacient es analizados.
En cuat ro de los once pacient es se observó una diferencia significat iva ent re el
reconocim ient o de pépt idos B y BF: en est os últ im os casos, la m ayor respuest a se
encont ró frent e a los pépt idos hom ólogos al subt ipo que infect a al pacient e.
Com o
conclusión
general
est os
result ados sugieren considerar la inclusión de
est os ant ígenos virales en fut uras vacunas
para nuest ra región.
Vacuna para VI H
Una vacuna descubiert a m ediant e la
innovación cient ífica, det erm inación y
colaboración t iene el poder de salvar
m illones.
121
Bibliografía
Bibliografía
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Fauci, A.S., HI V and AI DS: 20 years of science. Nat Med, 2003. 9 ( 7) : p. 839- 43.
Barre- Sinoussi, F., et al., I solat ion of a T- lym phot ropic ret rovirus from a pat ient at
risk for acquired im m une deficiency syndrom e ( AI DS) . Science, 1983. 2 2 0 ( 4599) :
p. 868- 71.
Fauci, A.S., 25 years of HI V. Nat ure, 2008. 4 5 3 ( 7193) : p. 289- 90.
ONUSI DA, Sit uación de la epidem ia de sida. Diciem bre 2008.
ONUSI DA, Am érica Lat ina, Sit uación de la epidem ia de SI DA, Resum en regional.
Diciem bre de 2007.
Minist erio de Salud, P.d.l.N., Bolet ín sobre el VI H- SI DA en la Argent ina. 2008.
Vignoles, M., et al., HI V seroincidence est im at es am ong at - risk populat ions in
Buenos Aires and Mont evideo: use of t he serologic t est ing algorit hm for recent
HI V seroconversion. J Acquir I m m une Defic Syndr, 2006. 4 2 ( 4) : p. 494- 500.
Pando, M.A., et al., Epidem iology of hum an im m unodeficiency virus, viral hepat it is
( B and C) , t reponem a pallidum , and hum an T- cell lym phot ropic I / I I virus am ong
m en who have sex wit h m en in Buenos Aires, Argent ina. Sex Transm Dis, 2006.
3 3 ( 5) : p. 307- 13.
Flint SJ, E.L., Krug RM, Racaniello RM, Skalka AM, Principles of Virology: Molecular
Biology, Pat hogenesis and Cont rol. 2000, Washingt on, D. C: ASM Press.
Fields, Virology. 4t h Edit ion ed. August 2001: Lippincot t William s & Wilkins
Publishers.
I nit iat ive, I .A.V., AI DS VACCI NE BLUEPRI NT: A Challenge t o t he Field A Roadm ap
for Progress ht t p: / / wwwiaviorg/ blueprint , 2008.
Christ ian Hoffm ann, J.K.R.y.B.S.K., HI V Medicine. 15t h Edit ion ed. 2007:
ht t p: / / www.hivm edicine.com / hivm edicine2006.pdf.
Coffin JM, H.S., Varm us HE, Ret roviruses. 1997: Cold Spring Harbor Cold Spring
Harbor Laborat ory Press.
Greene, W.C. and B.M. Pet erlin, Chart ing HI V's rem arkable voyage t hrough t he
cell: Basic science as a passport t o fut ure t herapy. Nat Med, 2002. 8 ( 7) : p. 67380.
Em erm an, M., HI V- 1, Vpr and t he cell cycle. Curr Biol, 1996. 6 ( 9) : p. 1096- 103.
Choe, H., et al., The bet a- chem okine recept ors CCR3 and CCR5 facilit at e infect ion
by prim ary HI V- 1 isolat es. Cell, 1996. 8 5 ( 7) : p. 1135- 48.
Dragic, T., et al., HI V- 1 ent ry int o CD4+ cells is m ediat ed by t he chem okine
recept or CC- CKR- 5. Nat ure, 1996. 3 8 1 ( 6584) : p. 667- 73.
Deng, H., et al., I dent ificat ion of a m aj or co- recept or for prim ary isolat es of HI V1. Nat ure, 1996. 3 8 1 ( 6584) : p. 661- 6.
Kwon, D.S., et al., DC- SI GN- m ediat ed int ernalizat ion of HI V is required for t ransenhancem ent of T cell infect ion. I m m unit y, 2002. 1 6 ( 1) : p. 135- 44.
Basu, V.P., et al., St rand t ransfer event s during HI V- 1 reverse t ranscript ion. Virus
Res, 2008. 1 3 4 ( 1- 2) : p. 19- 38.
Haselt ine, W.A., Molecular biology of t he hum an im m unodeficiency virus t ype 1.
Faseb J, 1991. 5 ( 10) : p. 2349- 60.
I nit iat ive, I .A.V., AI DS Vaccine Blueprint 2006: Act ions t o St rengt hen Global
Research and Developm ent . ht t p: / / wwwiaviorg/ blueprint , 2006.
Hanna, Z., et al., HI V- 1 Nef m ut at ions abrogat ing downregulat ion of CD4 affect
ot her Nef funct ions and show reduced pat hogenicit y in t ransgenic m ice. Virology,
2006. 3 4 6 ( 1) : p. 40- 52.
St um pt ner- Cuvelet t e, P., et al., HI V- 1 Nef im pairs MHC class I I ant igen
present at ion and surface expression. Proc Nat l Acad Sci U S A, 2001. 9 8 ( 21) : p.
12144- 9.
Sim on, V., D.D. Ho, and Q. Abdool Karim , HI V/ AI DS epidem iology, pat hogenesis,
prevent ion, and t reat m ent . Lancet , 2006. 3 6 8 ( 9534) : p. 489- 504.
Mehandru, S., et al., Prim ary HI V- 1 infect ion is associat ed wit h preferent ial
deplet ion of CD4+ T lym phocyt es from effect or sit es in t he gast roint est inal t ract . J
Exp Med, 2004. 2 0 0 ( 6) : p. 761- 70.
123
Bibliografía
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
Brenchley, J.M., et al., CD4+ T cell deplet ion during all st ages of HI V disease
occurs predom inant ly in t he gast roint est inal t ract . J Exp Med, 2004. 2 0 0 ( 6) : p.
749- 59.
Deeks, S.G. and B.D. Walker, Hum an im m unodeficiency virus cont rollers:
m echanism s of durable virus cont rol in t he absence of ant iret roviral t herapy.
I m m unit y, 2007. 2 7 ( 3) : p. 406- 16.
Taylor, B.S., et al., The challenge of HI V- 1 subt ype diversit y. N Engl J Med, 2008.
3 5 8 ( 15) : p. 1590- 602.
Plant ier, J.C., et al., A new hum an im m unodeficiency virus derived from gorillas.
Nat Med, 2009. 1 5 ( 8) : p. 871- 2.
Alam os, L., HI V Dat abase. 2009.
Carr, J.K., et al., Diverse BF recom binant s have spread widely since t he
int roduct ion of HI V- 1 int o Sout h Am erica. Aids, 2001. 1 5 ( 15) : p. F41- 7.
Gom ez- Carrillo, M., et al., Analysis of HI V t ype 1 diversit y in pregnant wom en
from four Lat in Am erican and Caribbean count ries. AI DS Res Hum Ret roviruses,
2006. 2 2 ( 11) : p. 1186- 91.
Segura, M., et al., Buenos Aires cohort of m en who have sex wit h m en:
prevalence, incidence, risk fact ors, and m olecular genot yping of HI V t ype 1. AI DS
Res Hum Ret roviruses, 2007. 2 3 ( 11) : p. 1322- 9.
Pando, M.A., et al., High genet ic variabilit y of HI V- 1 in fem ale sex workers from
Argent ina. Ret rovirology, 2007. 4 : p. 58.
Pando, M.A., et al., Hum an im m unodeficiency virus and t uberculosis in Argent ina:
prevalence, genot ypes and risk fact ors. J Med Microbiol, 2008. 5 7 ( Pt 2) : p. 190- 7.
Geldm acher, C., et al., I n a m ixed subt ype epidem ic, t he HI V- 1 Gag- specific T- cell
response is biased t owards t he infect ing subt ype. Aids, 2007. 2 1 ( 2) : p. 135- 43.
Currier, J.R., et al., Det ect ion of high frequencies of HI V- 1 cross- subt ype react ive
CD8 T lym phocyt es in t he peripheral blood of HI V- 1- infect ed Kenyans. Aids, 2003.
1 7 ( 15) : p. 2149- 57.
Currier, J.R., et al., Com prehensive screening for hum an im m unodeficiency virus
t ype 1 subt ype- specific CD8 cyt ot oxic T lym phocyt es and definit ion of degenerat e
epit opes rest rict ed by HLA- A0207 and - C( W) 0304 alleles. J Virol, 2002. 7 6 ( 10) : p.
4971- 86.
Bart let t , J.A. and J.F. Shao, Successes, challenges, and lim it at ions of current
ant iret roviral t herapy in low- incom e and m iddle- incom e count ries. Lancet I nfect
Dis, 2009. 9 ( 10) : p. 637- 49.
Robinson, H.L., New hope for an AI DS vaccine. Nat Rev I m m unol, 2002. 2 ( 4) : p.
239- 50.
Hessell, A.J., et al., Broadly neut ralizing m onoclonal ant ibodies 2F5 and 4E10
direct ed against t he hum an im m unodeficiency virus t ype 1 gp41 m em braneproxim al ext ernal region prot ect against m ucosal challenge by sim ian- hum an
im m unodeficiency virus SHI VBa- L. J Virol. 8 4 ( 3) : p. 1302- 13.
Koup, R.A., et al., Tem poral associat ion of cellular im m une responses wit h t he
init ial cont rol of virem ia in prim ary hum an im m unodeficiency virus t ype 1
syndrom e. J Virol, 1994. 6 8 ( 7) : p. 4650- 5.
Jin, X., et al., Dram at ic rise in plasm a virem ia aft er CD8( + ) T cell deplet ion in
sim ian im m unodeficiency virus- infect ed m acaques. J Exp Med, 1999. 1 8 9 ( 6) : p.
991- 8.
Borrow, P., et al., Ant iviral pressure exert ed by HI V- 1- specific cyt ot oxic T
lym phocyt es ( CTLs) during prim ary infect ion dem onst rat ed by rapid select ion of
CTL escape virus. Nat Med, 1997. 3 ( 2) : p. 205- 11.
Goulder, P.J., et al., Lat e escape from an im m unodom inant cyt ot oxic Tlym phocyt e response associat ed wit h progression t o AI DS. Nat Med, 1997. 3 ( 2) :
p. 212- 7.
Kaslow, R.A., et al., I nfluence of com binat ions of hum an m aj or hist ocom pat ibilit y
com plex genes on t he course of HI V- 1 infect ion. Nat Med, 1996. 2 ( 4) : p. 405- 11.
124
Bibliografía
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
Scherer, A., et al., Quant ifiable cyt ot oxic T lym phocyt e responses and HLA- relat ed
risk of progression t o AI DS. Proc Nat l Acad Sci U S A, 2004. 1 0 1 ( 33) : p. 1226670.
McElrat h, M.J., et al., HI V- 1 vaccine- induced im m unit y in t he t est - of- concept St ep
St udy: a case- cohort analysis. Lancet , 2008. 3 7 2 ( 9653) : p. 1894- 905.
Rerks- Ngarm , S., et al., Vaccinat ion wit h ALVAC and AI DSVAX t o Prevent HI V- 1
I nfect ion in Thailand. N Engl J Med, 2009. 3 6 1 ( 23) : p. 2209- 2220.
Turk, G., et al., Magnit ude, breadt h, and funct ional profile of T- cell responses
during hum an im m unodeficiency virus prim ary infect ion wit h B and BF viral
variant s. J Virol, 2008. 8 2 ( 6) : p. 2853- 66.
Gaschen, B., et al., Diversit y considerat ions in HI V- 1 vaccine select ion. Science,
2002. 2 9 6 ( 5577) : p. 2354- 60.
AVAC- Global Advovavy for HI V Prevent ion.
[ cit ed; Available from :
www.avac.org/ t rials_t able.ht m .
Gom ez, C.E., et al., Generat ion and im m unogenicit y of novel HI V/ AI DS vaccine
candidat es t arget ing HI V- 1 Env/ Gag- Pol- Nef ant igens of clade C. Vaccine, 2007.
2 5 ( 11) : p. 1969- 92.
Earl, P.L., et al., Design and evaluat ion of m ult i- gene, m ult i- clade HI V- 1 MVA
vaccines. Vaccine, 2009. 2 7 ( 42) : p. 5885- 95.
Chen, Z., et al., Design, const ruct ion, and charact erizat ion of a m ult igenic
m odified vaccinia Ankara candidat e vaccine against hum an im m unodeficiency
virus t ype 1 subt ype C/ B'. J Acquir I m m une Defic Syndr, 2008. 4 7 ( 4) : p. 412- 21.
Shephard, E., et al., A m ult igene HI V t ype 1 subt ype C m odified vaccinia Ankara
( MVA) vaccine efficient ly boost s im m une responses t o a DNA vaccine in m ice.
AI DS Res Hum Ret roviruses, 2008. 2 4 ( 2) : p. 207- 17.
Burgers, W.A., et al., Const ruct ion, charact erizat ion, and im m unogenicit y of a
m ult igene m odified vaccinia Ankara ( MVA) vaccine based on HI V t ype 1 subt ype
C. AI DS Res Hum Ret roviruses, 2008. 2 4 ( 2) : p. 195- 206.
Let ourneau, S., et al., Design and pre- clinical evaluat ion of a universal HI V- 1
vaccine. PLoS One, 2007. 2 ( 10) : p. e984.
Johnst on, M.I . and A.S. Fauci, An HI V vaccine- - evolving concept s. N Engl J Med,
2007. 3 5 6 ( 20) : p. 2073- 81.
Gom ez, C.E., et al., Head- t o- head com parison on t he im m unogenicit y of t wo
HI V/ AI DS vaccine candidat es based on t he at t enuat ed poxvirus st rains MVA and
NYVAC co- expressing in a single locus t he HI V- 1BX08 gp120 and HI V- 1( I I I B) GagPol- Nef prot eins of clade B. Vaccine, 2007. 2 5 ( 15) : p. 2863- 85.
Hinkula, J., et al., Recognit ion of prom inent viral epit opes induced by
im m unizat ion wit h hum an im m unodeficiency virus t ype 1 regulat ory genes. J
Virol, 1997. 7 1 ( 7) : p. 5528- 39.
Brave, A., et al., I m m unizat ion of m ice wit h t he nef gene from Hum an
I m m unodeficiency Virus t ype 1: St udy of im m unological m em ory and long- t erm
t oxicology. I nfect Agent Cancer, 2007. 2 : p. 14.
Cosm a, A., et al., Therapeut ic vaccinat ion wit h MVA- HI V- 1 nef elicit s Nef- specific
T- helper cell responses in chronically HI V- 1 infect ed individuals. Vaccine, 2003.
2 2 ( 1) : p. 21- 9.
Erfle, V., et al., Vaccines based on Nef and on Nef/ Delt aV2 Env. Microbes I nfect ,
2005. 7 ( 14) : p. 1400- 4.
Addo, M.M., et al., Com prehensive epit ope analysis of hum an im m unodeficiency
virus t ype 1 ( HI V- 1) - specific T- cell responses direct ed against t he ent ire
expressed HI V- 1 genom e dem onst rat e broadly direct ed responses, but no
correlat ion t o viral load. J Virol, 2003. 7 7 ( 3) : p. 2081- 92.
Licht erfeld, M., et al., HI V- 1 Nef is preferent ially recognized by CD8 T cells in
prim ary HI V- 1 infect ion despit e a relat ively high degree of genet ic diversit y. Aids,
2004. 1 8 ( 10) : p. 1383- 92.
Woodland, D.L., Jum p- st art ing t he im m une syst em : prim e- boost ing com es of age.
Trends I m m unol, 2004. 2 5 ( 2) : p. 98- 104.
125
Bibliografía
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
Gherardi, M.M. and M. Est eban, Recom binant poxviruses as m ucosal vaccine
vect ors. J Gen Virol, 2005. 8 6 ( Pt 11) : p. 2925- 36.
Li, S., et al., Prim ing wit h recom binant influenza virus followed by adm inist rat ion
of recom binant vaccinia virus induces CD8+ T- cell- m ediat ed prot ect ive im m unit y
against m alaria. Proc Nat l Acad Sci U S A, 1993. 9 0 ( 11) : p. 5214- 8.
Gherardi, M.M., et al., I nduct ion of HI V im m unit y in t he genit al t ract aft er
int ranasal delivery of a MVA vect or: enhanced im m unogenicit y aft er DNA prim em odified vaccinia virus Ankara boost im m unizat ion schedule. J I m m unol, 2004.
1 7 2 ( 10) : p. 6209- 20.
Gherardi, M.M., et al., Prim e- boost im m unizat ion schedules based on influenza
virus and vaccinia virus vect ors pot ent iat e cellular im m une responses against
hum an im m unodeficiency virus Env prot ein syst em ically and in t he genit orect al
draining lym ph nodes. J Virol, 2003. 7 7 ( 12) : p. 7048- 57.
Cooney, E.L., et al., Safet y of and im m unological response t o a recom binant
vaccinia virus vaccine expressing HI V envelope glycoprot ein. Lancet , 1991.
3 3 7 ( 8741) : p. 567- 72.
St anley A. Plot kin, W.A.O., Vaccines, ed. 3. 1999: W.B. SAUNDERS COMPANY.
Huygelen, C., [ Jenner's cowpox vaccine in light of current vaccinology] . Verh K
Acad Geneeskd Belg, 1996. 5 8 ( 5) : p. 479- 536; discussion 537- 8.
McFadden, G., Poxvirus t ropism . Nat Rev Microbiol, 2005. 3 ( 3) : p. 201- 13.
Broyles, S.S., Vaccinia virus t ranscript ion. J Gen Virol, 2003. 8 4 ( Pt 9) : p. 2293303.
Moss, B., et al., Host range rest rict ed, non- replicat ing vaccinia virus vect ors as
vaccine candidat es. Adv Exp Med Biol, 1996. 3 9 7 : p. 7- 13.
St aib, C., et al., I nact ivat ion of t he viral int erleukin 1bet a recept or im proves CD8+
T- cell m em ory responses elicit ed upon im m unizat ion wit h m odified vaccinia virus
Ankara. J Gen Virol, 2005. 8 6 ( Pt 7) : p. 1997- 2006.
Sym ons, J.A., et al., The vaccinia virus C12L prot ein inhibit s m ouse I L- 18 and
prom ot es virus virulence in t he m urine int ranasal m odel. J Gen Virol, 2002. 8 3 ( Pt
11) : p. 2833- 44.
Hochst ein- Mint zel V, H.H., St ickl H, Virulenz und im m unogenit at eines
m odift ziert en vaccinia- virus ( St am m MVA) . Z I m m un- Forsch, 1972( 144) : p. 140145.
Wang, S., et al., Relat ive cont ribut ions of codon usage, prom ot er efficiency and
leader sequence t o t he ant igen expression and im m unogenicit y of HI V- 1 Env DNA
vaccine. Vaccine, 2006. 2 4 ( 21) : p. 4531- 40.
Huang, Y., et al., Design, const ruct ion, and charact erizat ion of a dual- prom ot er
m ult igenic DNA vaccine direct ed against an HI V- 1 subt ype C/ B' recom binant . J
Acquir I m m une Defic Syndr, 2008. 4 7 ( 4) : p. 403- 11.
Andre, S., et al., I ncreased im m une response elicit ed by DNA vaccinat ion wit h a
synt het ic gp120 sequence wit h opt im ized codon usage. J Virol, 1998. 7 2 ( 2) : p.
1497- 503.
Moore, A.C., et al., Effect s of ant igen and genet ic adj uvant s on im m une responses
t o hum an im m unodeficiency virus DNA vaccines in m ice. J Virol, 2002. 7 6 ( 1) : p.
243- 50.
Schwendener, R.A., et al., Liposom e- based vaccines. Met hods Mol Biol. 6 0 5 : p.
163- 75.
Shrivast ava, S., et al., Developm ent of candidat e com binat ion vaccine for
hepat it is E and hepat it is B: a liposom e encapsulat ion approach. Vaccine, 2009.
2 7 ( 47) : p. 6582- 8.
Xu, R., et al., Com parat ive abilit y of various plasm id- based cyt okines and
chem okines t o adj uvant t he act ivit y of HI V plasm id DNA vaccines. Vaccine, 2008.
2 6 ( 37) : p. 4819- 29.
Spearm an, P., et al., Safet y and im m unogenicit y of a CTL m ult iepit ope pept ide
vaccine for HI V wit h or wit hout GM- CSF in a phase I t rial. Vaccine, 2009. 2 7 ( 2) :
p. 243- 9.
126
Bibliografía
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
Egan, M.A.a.I ., Zim ra R, The use of cyt okines and chem okines as genet ic
adj uvant s for plasm id DNA vaccines. Clinical and Applied I m m unology 2002. 2 : p.
32.
Gherardi, M.M., J.C. Ram irez, and M. Est eban, I L- 12 and I L- 18 act in synergy t o
clear vaccinia virus infect ion: involvem ent of innat e and adapt ive com ponent s of
t he im m une syst em . J Gen Virol, 2003. 8 4 ( Pt 8) : p. 1961- 72.
Melchionda, F., et al., Adj uvant I L- 7 or I L- 15 overcom es im m unodom inance and
im proves survival of t he CD8+ m em ory cell pool. J Clin I nvest , 2005. 1 1 5 ( 5) : p.
1177- 87.
Hu, X.D., et al., An I L- 15 adj uvant enhances t he efficacy of a com bined DNA
vaccine against Brucella by increasing t he CD8( + ) cyt ot oxic T cell response.
Vaccine, 2010.
Geffner, L.F.y.J., I nt roducción a la I nm unología Hum ana. 5ª ed. 2005, Buenos
Aires: Edit orial Medica Panam ericana.
Barouch, D.H., N.L. Let vin, and R.A. Seder, The role of cyt okine DNAs as vaccine
adj uvant s for opt im izing cellular im m une responses. I m m unol Rev, 2004. 2 0 2 : p.
266- 74.
Tapia, E., et al., The com binat ion of DNA vect ors expressing I L- 12 + I L- 18 elicit s
high prot ect ive im m une response against cut aneous leishm aniasis aft er prim ing
wit h DNA- p36/ LACK and t he cyt okines, followed by a boost er wit h a vaccinia virus
recom binant expressing p36/ LACK. Microbes I nfect , 2003. 5 ( 2) : p. 73- 84.
Gherardi, M.M., J.C. Ram irez, and M. Est eban, Towards a new generat ion of
vaccines: t he cyt okine I L- 12 as an adj uvant t o enhance cellular im m une
responses t o pat hogens during prim e- boost er vaccinat ion regim ens. Hist ol
Hist opat hol, 2001. 1 6 ( 2) : p. 655- 67.
Okada, E., et al., I nt ranasal im m unizat ion of a DNA vaccine wit h I L- 12- and
granulocyt e- m acrophage colony- st im ulat ing fact or ( GM- CSF) - expressing plasm ids
in liposom es induces st rong m ucosal and cell- m ediat ed im m une responses against
HI V- 1 ant igens. J I m m unol, 1997. 1 5 9 ( 7) : p. 3638- 47.
Ahlers, J.D., et al., Cyt okine- in- adj uvant st eering of t he im m une response
phenot ype t o HI V- 1 vaccine const ruct s: granulocyt e- m acrophage colonyst im ulat ing fact or and TNF- alpha synergize wit h I L- 12 t o enhance induct ion of
cyt ot oxic T lym phocyt es. J I m m unol, 1997. 1 5 8 ( 8) : p. 3947- 58.
Parker, R.F., L.H. Bronson, and R.H. Green, Furt her St udies of t he I nfect ious Unit
of Vaccinia. J Exp Med, 1941. 7 4 ( 3) : p. 263- 281.
Meyer, H., G. Sut t er, and A. Mayr, Mapping of delet ions in t he genom e of t he
highly at t enuat ed vaccinia virus MVA and t heir influence on virulence. J Gen Virol,
1991. 7 2 ( Pt 5 ) : p. 1031- 8.
Sut t er, G. and B. Moss, Nonreplicat ing vaccinia vect or efficient ly expresses
recom binant genes. Proc Nat l Acad Sci U S A, 1992. 8 9 ( 22) : p. 10847- 51.
Adachi, A., et al., Product ion of acquired im m unodeficiency syndrom e- associat ed
ret rovirus in hum an and nonhum an cells t ransfect ed wit h an infect ious m olecular
clone. J Virol, 1986. 5 9 ( 2) : p. 284- 91.
Gherardi, M.M., et al., I L- 12 delivery from recom binant vaccinia virus at t enuat es
t he vect or and enhances t he cellular im m une response against HI V- 1 Env in a
dose- dependent m anner. J I m m unol, 1999. 1 6 2 ( 11) : p. 6724- 33.
Ausubel MF, B.R., Kingst on RE, Moore DD, Seidm an JG, Sm it h JA, St ruhl K,
Current Prot ocols in Molecular Biology, W. I nt erscience, Edit or. 1994:
Massachuset t s.
Chakrabart i, S., J.R. Sisler, and B. Moss, Com pact , synt het ic, vaccinia virus
early/ lat e prom ot er for prot ein expression. Biot echniques, 1997. 2 3 ( 6) : p. 10947.
Earl, P.L., Moss, B., Wyat t , L.S. and Carroll, M.W., Generat ion of recom binant
vaccinia viruses. Curr. Prot oc. Mol Biol. Chapt er 16, Unit 16 17. 2001.
Turk, G., et al., Higher t ransact ivat ion act ivit y associat ed wit h LTR and Tat
elem ent s from HI V- 1 BF int ersubt ype recom binant variant s. Ret rovirology, 2006.
3 : p. 14.
127
Bibliografía
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
Dallo, S. and M. Est eban, I solat ion and charact erizat ion of at t enuat ed m ut ant s of
vaccinia virus. Virology, 1987. 1 5 9 ( 2) : p. 408- 22.
Guide for t he Care and Use of Laborat ory Anim als 1996: I nst it ut e of Laborat ory
Anim al Research, Com m ission on Life Sciences, Nat ional Research Council.
Est ados Unidos
Thom pson, J.D., D.G. Higgins, and T.J. Gibson, CLUSTAL W: im proving t he
sensit ivit y of progressive m ult iple sequence alignm ent t hrough sequence
weight ing, posit ion- specific gap penalt ies and weight m at rix choice. Nucleic Acids
Res, 1994. 2 2 ( 22) : p. 4673- 80.
Kim ura, M., A sim ple m et hod for est im at ing evolut ionary rat es of base
subst it ut ions t hrough com parat ive st udies of nucleot ide sequences. J Mol Evol,
1980. 1 6 ( 2) : p. 111- 20.
Risco, C., et al., The vaccinia virus 39- kDa prot ein form s a st able com plex wit h
t he p4a/ 4a m aj or core prot ein early in m orphogenesis. Virology, 1999. 2 6 5 ( 2) : p.
375- 86.
Janet zki, S., et al., St andardizat ion and validat ion issues of t he ELI SPOT assay.
Met hods Mol Biol, 2005. 3 0 2 : p. 51- 86.
Tom asz, M., Mit om ycin C: sm all, fast and deadly ( but very select ive) . Chem Biol,
1995. 2 ( 9) : p. 575- 9.
Goonet illeke, N., et al., I nduct ion of m ult ifunct ional hum an im m unodeficiency
virus t ype 1 ( HI V- 1) - specific T cells capable of proliferat ion in healt hy subj ect s by
using a prim e- boost regim en of DNA- and m odified vaccinia virus Ankara- vect ored
vaccines expressing HI V- 1 Gag coupled t o CD8+ T- cell epit opes. J Virol, 2006.
8 0 ( 10) : p. 4717- 28.
Ram irez, J.C., M.M. Gherardi, and M. Est eban, Biology of at t enuat ed m odified
vaccinia virus Ankara recom binant vect or in m ice: virus fat e and act ivat ion of Band T- cell im m une responses in com parison wit h t he West ern Reserve st rain and
advant ages as a vaccine. J Virol, 2000. 7 4 ( 2) : p. 923- 33.
Earl PL, C.N., Wyat t LS, Moss B and Carroll MW, Preparat ion of Cell Cult ures and
Vaccinia Virus St ocks, 16.16.9. 1998.
Yam anaka, M.K. and T. Yilm a, Alt ered plaque form at ion by recom binant vaccinia
virus expressing sim ian im m unodeficiency virus Nef. J Virol, 1998. 7 2 ( 6) : p.
5291- 5.
Chan, K.S., et al., Nef from pat hogenic sim ian im m unodeficiency virus is a
negat ive fact or for vaccinia virus. Proc Nat l Acad Sci U S A, 2005. 1 0 2 ( 24) : p.
8734- 9.
Koup, R.A., et al., Prim ing I m m unizat ion wit h DNA Augm ent s I m m unogenicit y of
Recom binant Adenoviral Vect ors for Bot h HI V- 1 Specific Ant ibody and T- Cell
Responses. PLoS One. 5 ( 2) : p. e9015.
Arrode- Bruses, G., et al., Charact erizat ion of T- cell responses in m acaques
im m unized wit h a single dose of HI V DNA vaccine. J Virol. 8 4 ( 3) : p. 1243- 53.
St am at at os, L., et al., Neut ralizing ant ibodies generat ed during nat ural HI V- 1
infect ion: good news for an HI V- 1 vaccine? Nat Med, 2009. 1 5 ( 8) : p. 866- 70.
Gherardi, M.M., J.C. Ram irez, and M. Est eban, I nt erleukin- 12 ( I L- 12)
enhancem ent of t he cellular im m une response against hum an im m unodeficiency
virus t ype 1 env ant igen in a DNA prim e/ vaccinia virus boost vaccine regim en is
t im e and dose dependent : suppressive effect s of I L- 12 boost are m ediat ed by
nit ric oxide. J Virol, 2000. 7 4 ( 14) : p. 6278- 86.
Rollm an, E., et al., Evaluat ion of im m unogenicit y and efficacy of com bined DNA
and adj uvant ed prot ein vaccinat ion in a hum an im m unodeficiency virus t ype
1/ m urine leukem ia virus pseudot ype challenge m odel. Vaccine, 2007. 2 5 ( 11) : p.
2145- 54.
Ahlers, J.D., et al., Mechanism s of cyt okine synergy essent ial for vaccine
prot ect ion against viral challenge. I nt I m m unol, 2001. 1 3 ( 7) : p. 897- 908.
Daft arian, P., et al., I m m unizat ion wit h Th- CTL fusion pept ide and cyt osinephosphat e- guanine DNA in t ransgenic HLA- A2 m ice induces recognit ion of HI V-
128
Bibliografía
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
infect ed T cells and clears vaccinia virus challenge. J I m m unol, 2003. 1 7 1 ( 8) : p.
4028- 39.
Braxt on, C.L., et al., Prot ect ion against let hal vaccinia virus challenge using an
at t enuat ed m at rix prot ein m ut ant vesicular st om at it is virus vaccine vect or
expressing poxvirus ant igens. J Virol.
ONUSI DA, Sit uación de la epidem ia de sida. Diciem bre 2007.
Barouch, D.H., Challenges in t he developm ent of an HI V- 1 vaccine. Nat ure, 2008.
4 5 5 ( 7213) : p. 613- 9.
Let vin, N.L., et al., Preserved CD4+ cent ral m em ory T cells and survival in
vaccinat ed SI V- challenged m onkeys. Science, 2006. 3 1 2 ( 5779) : p. 1530- 3.
Polacino, P.S., et al., Role of im m une responses against t he envelope and t he core
ant igens of sim ian im m unodeficiency virus SI Vm ne in prot ect ion against
hom ologous cloned and uncloned virus challenge in Macaques. J Virol, 1999.
7 3 ( 10) : p. 8201- 15.
Am ara, R.R., et al., Cont rol of a m ucosal challenge and prevent ion of AI DS by a
m ult iprot ein DNA/ MVA vaccine. Science, 2001. 2 9 2 ( 5514) : p. 69- 74.
Gupt a, S.B., et al., Est im at ing t he benefit of an HI V- 1 vaccine t hat reduces viral
load set point . J I nfect Dis, 2007. 1 9 5 ( 4) : p. 546- 50.
Hem elaar, J., et al., Global and regional dist ribut ion of HI V- 1 genet ic subt ypes
and recom binant s in 2004. Aids, 2006. 2 0 ( 16) : p. W13- 23.
Cast ro, E., et al., Molecular epidem iology of HI V- 1 in Venezuela: high prevalence
of HI V- 1 subt ype B and ident ificat ion of a B/ F recom binant infect ion. J Acquir
I m m une Defic Syndr, 2003. 3 2 ( 3) : p. 338- 44.
Sierra, M., et al., The analysis of near full- lengt h genom e sequences of hum an
im m unodeficiency virus t ype 1 BF int ersubt ype recom binant viruses from Chile,
Venezuela and Spain reveals t heir relat ionship t o diverse lineages of recom binant
viruses relat ed t o CRF12_BF. I nfect Genet Evol, 2005. 5 ( 3) : p. 209- 17.
Holguin, A., et al., I ncrease of non- B subt ypes and recom binant s am ong newly
diagnosed HI V- 1 nat ive Spaniards and im m igrant s in Spain. Curr HI V Res, 2008.
6 ( 4) : p. 327- 34.
Aguayo, N., et al., Epidem iological and m olecular charact erist ics of HI V- 1 infect ion
am ong fem ale com m ercial sex workers, m en who have sex wit h m en and people
living wit h AI DS in Paraguay. Rev Soc Bras Med Trop, 2008. 4 1 ( 3) : p. 225- 31.
Cazeaux, N., et al., Com parat ive st udy of im m une responses induced aft er
im m unizat ion wit h plasm ids encoding t he HI V- 1 Nef prot ein under t he cont rol of
t he CMV- I E or t he m uscle- specific desm in prom ot er. Vaccine, 2002. 2 0 ( 27- 28) : p.
3322- 31.
Gudm undsdot t er, L., et al., Recom binant Modified Vaccinia Ankara ( MVA)
effect ively boost s DNA- prim ed HI V- specific im m une responses in hum ans despit e
pre- exist ing vaccinia im m unit y. Vaccine, 2009. 2 7 ( 33) : p. 4468- 74.
Sandst rom , E., et al., Broad im m unogenicit y of a m ult igene, m ult iclade HI V- 1
DNA vaccine boost ed wit h het erologous HI V- 1 recom binant m odified vaccinia virus
Ankara. J I nfect Dis, 2008. 1 9 8 ( 10) : p. 1482- 90.
Beaud, G., Vaccinia virus DNA replicat ion: a short review. Biochim ie, 1995.
7 7 ( 10) : p. 774- 9.
Gom ez, C.E., et al., Efficient CD8+ T cell response t o t he HI V- env V3 loop epit ope
from m ult iple virus isolat es by a DNA prim e/ vaccinia virus boost ( rWR and rMVA
st rains) im m unizat ion regim e and enhancem ent by t he cyt okine I FN- gam m a.
Virus Res, 2004. 1 0 5 ( 1) : p. 11- 22.
Brave, A., et al., I nduct ion of HI V- 1- specific cellular and hum oral im m une
responses following im m unizat ion wit h HI V- DNA adj uvant ed wit h act ivat ed
apopt ot ic lym phocyt es. Vaccine, 2009.
Kast enm uller, W., et al., Cross- com pet it ion of CD8+ T cells shapes t he
im m unodom inance hierarchy during boost vaccinat ion. J Exp Med, 2007. 2 0 4 ( 9) :
p. 2187- 98.
129
Bibliografía
147.
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
Turk, G., et al., Single Nef prot eins from HI V t ype 1 subt ypes C and F fail t o
upregulat e invariant chain cell surface expression but are act ive for ot her
funct ions. AI DS Res Hum Ret roviruses, 2009. 2 5 ( 3) : p. 285- 96.
De Rose, R., et al., Subt ype AE HI V- 1 DNA and recom binant Fowlpoxvirus
vaccines encoding five shared HI V- 1 genes: safet y and T cell im m unogenicit y in
m acaques. Vaccine, 2005. 2 3 ( 16) : p. 1949- 56.
Arold, S.T. and A.S. Baur, Dynam ic Nef and Nef dynam ics: how st ruct ure could
explain t he com plex act ivit ies of t his sm all HI V prot ein. Trends Biochem Sci, 2001.
2 6 ( 6) : p. 356- 63.
Sin, J.I ., et al., Prot ect ive im m unit y against het erologous challenge wit h
encephalom yocardit is virus by VP1 DNA vaccinat ion: effect of coinj ect ion wit h a
granulocyt e- m acrophage colony st im ulat ing fact or gene. Vaccine, 1997. 1 5 ( 1718) : p. 1827- 33.
Los
Alam os
HI V
Dat abase.
[ cit ed;
Available
from :
ht t p: / / t ools.im m uneepit ope.org/ analyze/ ht m l/ reference_m hc_I _binding.ht m l.
Frahm ,
N.,
et
al.,
Consist ent
cyt ot oxic- T- lym phocyt e
t arget ing
of
im m unodom inant regions in hum an im m unodeficiency virus across m ult iple
et hnicit ies. J Virol, 2004. 7 8 ( 5) : p. 2187- 200.
I nwoley, A., et al., Cross- clade conservat ion of HI V t ype 1 Nef im m unodom inant
regions recognized by CD8+ T cells of HI V t ype 1 CRF02_AG- infect ed I vorian
( West Africa) . AI DS Res Hum Ret roviruses, 2005. 2 1 ( 7) : p. 620- 8.
Gupt a, S., et al., Charact erizat ion of hum an im m unodeficiency virus Gag- specific
gam m a int erferon- expressing cells following prot ect ive m ucosal im m unizat ion wit h
alphavirus replicon part icles. J Virol, 2005. 7 9 ( 11) : p. 7135- 45.
130
Anexos
Anexo
Anexo 1: Aprobación del Com it é I ndependient e de Ét ica en I nvest igación ( CI EI - FM- UBA)
132
Anexo
Anexo 2: Trabaj o Cient ífico Publicado a part ir de est a Tesis
133
Anexo
134
Anexo
135
Anexo
136
Anexo
137
Anexo
138
Anexo
139
Anexo
140
Anexo
141
Anexo
142
Anexo
143
Anexo
144