Manual de prácticas de química analítica II José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado Alberto Reyes Dorantes • Frida Malpica Sánchez Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Ramón Verde Calvo es egresado de la Facultad de Química de la UNAM, en donde obtuvo su título de químico farmacéutico biólogo, tecnólogo en alimentos. Posteriormente realizó sus estudios de maestría en la Facultad de Ciencias de la UNAM. Actualmente trabaja en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enología y Alimentos Fermentados, en donde lleva a cabo investigaciones sobre el cambio en el color del vino tinto durante el añejamiento. María de Lourdes Escamilla Hurtado realizó sus estudios de licenciatura en la Facultad de Química de la UNAM, obteniendo el título de química farmacéutica bióloga, orientación en Tecnología de Alimentos. Posteriormente obtuvo su grado de maestría en la Universidad de Hiroshima, Japón, en el área de Tecnología de Fermentaciones. Posteriormente se ha desarrollado profesionalmente como profesora-investigadora en la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermentaciones lácticas en alimentos indígenas tradicionales, producción de aromas por fermentación y enología, de los cuales surgieron diversas publicaciones nacionales e internacionales. También ha ejercido la docencia, tanto en la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Química de la UNAM, formando recursos humanos en los campos de microbiología y biotecnología alimentaria. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA Dr. José Luis Gázquez Mateos Rector General Lic. Edmundo Jacobo Molina Secretario General UNIDAD IZTAPALAPA Dr. Luis Mier y Terán Casanueva Rector Dr. Eduardo Carrillo Hoyo Secretario Dr. José Luis Arredondo Figueroa Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud Dr. Gerardo Saucedo Jefe del Departamento de Biotecnología Ma. del Rosario Hoyos Alea Jefa de la Sección de Producción Editorial DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II José Ramón Verde Calvo Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado Alberto Reyes Dorantes Frida Malpica Sánchez guc i DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cuidado de la edición y corrección de estilo: Ma. Guadalupe Olvera Arellano Primera impresión: 1999 © UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purísima Iztapalapa, 09340, México, D.F. ISBN: 970-654-363-5 Impreso y hecho en México / Printed in México DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo índice Presentación Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 9 11 Práctica 1. Análisis cualitativo de cromatografía de gases (dos columnas) 33 Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37 Bibliografía 40 Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN Práctica 3. Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído (método del patrón interno) 43 63 Práctica 4. Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas (método del patrón externo) 69 Bibliografía 74 Capítulo 3. ESPECTROFOTOMETRÍ A 75 I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77 Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85 Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de la concentración de cobalto y níquel en una mezcla 91 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo II. TURBIDIMETRÍA 95 Práctica 7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97 Bibliografía 101 Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103 Práctica 8. Determinación potenciométnca de constantes de ionización 113 Práctica 9, Titulación potenciométnca del ferrocianuro con ceno 117 Bibliografía 125 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Presentación El presente manual tiene como meta apoyar de la manera más amplia el curso teórico-práctico de Química Analítica II, materia que se imparte en el sexto trimestre de las carreras de ingeniería en alimentos e ingeniería bioquímica industrial. El material está elaborado pensando en el sistema trimestral de la Universidad Autónoma Metropolitana, hecho que no restringe que cualquier curso de química analítica impartido en otra escuela pueda utilizar este material. En el manual se abordan temas como: cromatografía de gases y de líquidos de alta resolución, espectrofotometría y potenciometría. Cada capítulo está estructurado con una introducción (los fundamentos teóricos necesarios para comprender los temas incluidos en la parte práctica), y presenta la descripción de los aparatos a utilizar, así como la forma correcta de operarlos. El texto se compone de nueve prácticas, estructuradas con objetivos, introducción, material y reactivos, normas y reglas de seguridad, técnicas, tratamiento de datos experimentales, cuestionario y bibliografía. Esta última se presenta al final de cada capítulo e incluye textos de autores reconocidos, así como revistas con artículos actualizados de apoyo a los experimentos. Para la obtención de mejores resultados, se recomienda relacionar ampliamente los conceptos teóricos con las actividades experimentales. Los autores DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Capítulo 1 CROMATOGRAFÍA DE GASES DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Introducción Este capítulo tiene como objetivo mostrar al alumno los fundamentos prácticos de la cromatografía de gases: cómo funciona un cromatógrafo con detector de conductividad térmica y cómo se obtiene e interpreta el cromatograma, incluyendo una explicación sobre los cálculos para cuantificar muestras a partir de compuestos puros. La cromatografía de gases es la técnica más utilizada entre los métodos instrumentales de separación, ya que identifica de manera sencilla y rápida el número de componentes de una mezcla. El único requisito para su implementación es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura necesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979). Clasificación de la cromatografía Por sus características analíticas la cromatografía puede ser: a) b) Cromatografía cualitativa, que consiste solamente en la separación de los componentes de una mezcla. Cromatografía cuantitativa o analítica, que permite identificar y cuantificar cada uno de los componentes de la mezcla. De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de gases se divide en dos: a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como cromatografía de adsorción, en donde la fase estacionaria cuenta con un material sólido como el sílice granular, la alúmina o el carbón. El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas. Las separaciones se llevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrio entre el adsorbente y las moléculas de la fase móvil. Si las moléculas de un componente están estrechamente ligadas al adsorbente, la sustancia DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si las moléculas tienen una baja atracción por el adsorbente, tenderán a moverse con rapidez junto con la fase móvil (figura 1.1). Soluto absorbido en la superficie de la fase estacionaria Figura 1.1 Cromatografía de adsorción. La tabla siguiente muestra algunos ejemplos de columnas capilares comerciales, utilizadas en cromatografía gas sólido, mencionando su aplicación y la temperatura máxima de trabajo. Tabla 1.1 Columnas capilares comerciales. Temperatura Máxima Aplicación HPSoM 200 °C Hidrocarburos, gas natural Poraplot Q 250 °C Alcoholes volátiles en agua,gases Poraplot U 190°C Compuestos volátiles polares, aldehidos Columna HP Hewlett Packard Columnas capilares, soporte; A12O3 14 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, en donde la fase estacionaria es una capa delgada de un líquido no volátil, colocada sobre un soporte sólido (figura 1.2). La fase estacionaria forma una película delgada en la superficie de un soporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y una fase móvil gaseosa. La cromatografía de reparto o de partición presenta grandes ventajas, comparada con la cromatografía de adsorción: es mucho más reproducible y, gracias a que el coeficiente de partición se hace constante en un margen más amplio de concentraciones, permite que las bandas sean más definidas y mucho más simétricas. Soluto disuelto en la fase líquida que recubre la superficie del soporte sólido Figura 1.2 Cromatografía de reparto. El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el proceso cromatográfico, sólo debe servir como matriz mecánica para la fase líquida. El soporte más común es la tierra de diatomeas, también conocida como kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos grupos oxidrilo libres en su superficie. 15 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Componentes importantes de un cromatógrafo de gases Uno de los puntos más importantes a considerar en la cromatografía de gases, es el grado de separación que puede lograrse entre diferentes componentes en una columna dada. Son varios los factores que pueden influir en la separación deseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad de flujo del gas acarreador, volumen de la muestra y caída de presión en la columna. Existen dos diferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares. En las primeras el soporte se encuentra empacado en tubos de acero inoxidable o vidrio, que comúnmente tienen un diámetro de 3 a 6 mm y de uno a cinco metros de longitud. Las columnas con mayor diámetro son utilizadas en trabajos de preparación para obtener una mayor cantidad de compuestos separados. En las columnas capilares la longitud es mucho mayor, pudiendo llegar hasta 100 metros con un diámetro de 0.1 a 0.3 mm. Estas últimas se caracterizan por tener un mayor número de platos teóricos, lo que implica mejor resolución, menor tiempo de análisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidad de muestra por correr debe ser menor (Harris, 1992). Se pueden emplear muy diversos soportes sólidos y fases líquidas estacionarias. La elección depende básicamente de la naturaleza de los compuestos que se desean separar (tabla 1.2). La literatura informa acerca de gran cantidad de soportes sólidos que han resultado satisfactorios, y de un número aun mayor de líquidos para la fase estacionaria. El líquido estacionario debe producir un reparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensayo, y poseer suficiente poder de disolución sobre los componentes en estado vapor. Por supuesto, el líquido estacionario no ha de ser volátil a las temperaturas de trabajo, pues de otra manera se evaporaría abandonando la columna. Si se tiene interés por profundizar en este tema, se pueden consultar los trabajos de Bens (1961), donde describe algunas propiedades y características de los soportes ordinarios. Rohrschneider (1971) reportó una clasificación de las fases líquidas en función de su polaridad, y propuso una escala de 0 a 100 en la que el escualeno es tomado como cero y el oxidipropionitrilo como cien. La temperatura necesaria para efectuar la separación de una mezcla está determinada por dos factores: el grado de separación que se considere suficiente y el tiempo razonable para el análisis. En general, cuanto más baja es la temperatura mayor es la separación de los componentes, y mayor también el tiempo 16 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases de retención de estos últimos en la columna. Rowan (1961), al igual que Desty (1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de la temperatura en la cromatografía de gases. La velocidad de flujo del gas portador varía con cada análisis y puede cambiar para diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en la cuantificación de la altura equivalente de un plato teórico (AEPT). Para las columnas empacadas de 0.63 cm de diámetro, se recomiendan flujos de 40 a 100 ml/min, que deberán regularse con una precisión mayor de 1 ml/min. Los gases portadores que se utilizan con más frecuencia son: nitrógeno, helio, argón y dióxido de carbono. Su elección se basa, al menos en parte, en el factor económico, pero un criterio más importante es el tipo de detector empleado. Para un detector de conductividad térmica, los gases adecuados son: nitrógeno, hidrógeno, argón y helio. El hidrógeno presenta altos valores de conductividad térmica, factor muy importante en la detección de compuestos, pero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El helio también tiene un alto valor de conductividad térmica, pero es un recurso no renovable y de costo elevado. En cambio, el nitrógeno se utiliza ampliamente por ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividad térmica. 17 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común en cromatografía de gases. Nombre Comercial Descripción Polaridad* Temperatura Iíquido/°C Escualeno Escualeno I 20/100 Apienzon L Apienzon L I 50/300 SE-30 100% goma de silicona I 50/300 OV-1 100% goma de silicona I 50/300 UCW-982 goma del 99% metil, 1% vinil II 0/300 DC-200 100% de metil silicona líquida II 0/250 OV-101 100% de metil silicona líquida II 0/350 SP-2100 100% de metil silicona líquida II 0/350 SE-52 0 SE-54 fenilo al 5% II 50/300 Dexsii 300 Metil carbonato de silicona II 50/450 OV-17 Metil fenil silicona al 50% II 0/375 OV-25 Metil fenil silicona al 75% III 0/350 OV-210 3,3,3-trifluoropropilo al 50% III 0/275 Carbowax20M polietilen glicol IV 60/225 Carbowax20M TPA polietilen glicol modificado con ácido tereftálico IV 60/250 Carbowax1500 polietilen glicol IV 40/200 SilariOC Cianopropil silicona al 100% IV 0/250 * I a IV de menor a mayor polaridad. 18 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases La muestra líquida se introduce en el cromatógrafo inyectándola con una jeringa a través de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra y el gas acarreador lo lleva a lo largo de la columna. Las columnas analíticas requieren de 0.1 a 10 jal de muestra líquida, mientras que las columnas para trabajo preparativo llegan a utilizar de 20 a 1000 jil. Las muestras gaseosas requieren de jeringas con cierre hermético o válvulas de muestreo de gases. Para el trabajo analítico se utilizan volúmenes de 0.5 a 10 mi de gas, y para el análisis preparativo los volúmenes pueden aumentar hasta un litro (Harris, 1992). Detector de conductividad térmica. La capacidad de enfriamiento de un gas está basada en la facilidad que tiene para transferir el calor que absorbe, cualidad representada por su valor de conductividad térmica. Entre más grande sea el valor, la capacidad para transmitir el calor será mejor. Por lo tanto, si se suministra una cantidad constante de energía eléctrica al filamento del detector, su temperatura estará en función de la conductividad térmica del gas acarreador. Con un gas puro, la temperatura del filamento es constante, pero al presentarse cambios en la composición del gas, la temperatura varía y se modifica la resistencia eléctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a los cambios de temperatura y a la corrosión química. Para su fabricación se emplea generalmente platino, tungsteno y níquel. Los factores que afectan la sensibilidad de los filamentos son: su geometría, la corriente que pasa a través de los mismos, su resistencia y el valor de la conductividad térmica del gas. La tabla 1.3 muestra la conductividad térmica de los gases y de algunos compuestos utilizados en cromatografía. 19 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Tabla 1.3 Conductividad térmica. sustancia ct* Nitrógeno 5.81 Helio 34.80 Argón 3.98 co2 13.52 Hidrógeno 41.60 Oxígeno 5.89 CO 5.63 Metano 7.21 Propano 3.58 n-Butano 3.22 Étanol 3.50 Acetona 2.37 Cloroformo 1.58 * unidades de la conductividad térmica cal cnrr2 seg^2/°C crrr1 Cálculos en cromatografía Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de cálculos sencillos para conocer parámetros como la eficiencia de la columna, además, si aplicamos técnicas de estándares se puede conocer también la concentración de muestras problema. A continuación se desarrollan los cálculos más comunes y útiles en cromatografía. 20 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases Número de platos teóricos en una columna (n) Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribución de la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria. A mayor número de platos teóricos, la separación en la columna es mejor. w= 16 n - número de platos teóricos t^ = tiempo que transcurre desde la inyección hasta el centro del pico del componente Aw=ancho del pico del componente tj^ y Aw se expresan en las mismas unidades (tiempo, volumen, distancia, etc.) Altura equivalente de un plato teórico (AEPT) Un plato teórico puede considerarse la longitud de columna necesaria para establecer un equilibrio de distribución entre la fase estacionaria del soluto y la fase móvil. AEPT = ^ AEPT = altura equivalente de un plato teórico L = longitud de la columna n = número de platos teóricos 21 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Cálculo del área de un pico con forma de triángulo Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una forma gaussiana. Un método sencillo para calcular el área bajo la curva es transformarla en un triángulo, extrapolando la tangente en los puntos de inflexión hacia la línea de referencia, como lo indica la figura 1.3. tr o vr Respuesta del. Punto de inflexión (parte más inclinada de la curva) detector j / / tiempo o volumen t =0 inyección Figura 1.3 Cromatograma ideal Fórmula para calcular el área de un triángulo: A b*h A A = área h = altura b = longitud de la base 22 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases Cálculo de la resolución Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica la manera de medir los parámetros: ECUACIÓN DE RESOLUCIÓN Figura 1.4 Resolución entre dos picos cromatográficos. V V R 2 -V V \ 1/2 (Wx + W2) Vx = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 1 V2 = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 2 FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2 23 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Análisis cuantitativo Existen diversos métodos para el cálculo de concentraciones en un sistema cromatográfico. Los hay sencillos, pero poco confiables, pues no utilizan ninguna sustancia de referencia, y los hay más elaborados con un mayor grado de confiabilidad. Estos métodos son: 1. 2. 3. 4. Normalización Calibración absoluta Estándar interno Estándar externo Normalización o porcentaje por áreas Con base en el cromatograma de una mezcla separada, es posible determinar la concentración de cada uno de sus componentes por el área bajo la curva. Primero hay que medir las áreas individuales de cada pico, sumarlas y, con base en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentaje es proporcional a la concentración del componente en la mezcla, siempre y cuando la conductividad térmica de los componentes sea la misma, o muy parecida, y que la respuesta del detector de conductividad térmica también sea igual para todos los componentes. Como esto no es posible en la mayoría de los casos, se requiere utilizar otros métodos más exactos. Calibración absoluta Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia pura para medir el área del pico resultante. Enseguida, bajo las mismas condiciones de corrimiento cromatográfico, se mide el área del pico que resulte de la sustancia en la mezcla desconocida. Finalmente, estableciendo una proporción, se puede encontrar la concentración de la sustancia desconocida. 24 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases Estándar interno Este método se puede utilizar de dos formas, para calcular un factor de respuesta o elaborando una curva estándar para encontrar la concentración de una muestra problema. El estándar o patrón interno es aquella sustancia que se inyecta junto con la o las muestras problema en un cromatógrafo. Las condiciones que esta sustancia debe cumplir son (León, 1982): • No debe formar parte de la muestra que se desea analizar. • Tener similitud con los componentes del problema. • Proporcionar por sí sola y junto con la muestra problema, picos bien resueltos y de buena forma. • Eluir en un tiempo cercano al de los componentes del problema. • No debe reaccionar con los componentes de la muestra. a) Factor de respuesta El método se basa en calcular el factor de respuesta para cada sustancia analizada, ya que los detectores no responden de la misma manera a todos los solutos. La técnica no es muy complicada y consiste en medir el área bajo los picos de cada compuesto, en relación con el área de los picos de un patrón interno. El factor de respuesta está definido por la relación: [P] \Ap [S] = concentración del soluto (cualquier unidad de masa/volumen) [P] = concentración del patrón (cualquier unidad de masa/volumen) As = Área del soluto Ap = Área del patrón Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el método de normalización como con el del patrón interno. b) Estándar interno con elaboración de curva estándar. En este caso también se requiere de la adición de un compuesto de concentración conocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrón (P) y del soluto o analito (S) para construir una curva patrón, como en la figura 1.5. Si una 25 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II cantidad conocida de patrón se agrega a una muestra problema, la curva de calibración puede utilizarse para hallar la concentración del soluto. Cuando se use un estándar interno es recomendable que la curva de calibración se elabore cuando menos con tres puntos. Las unidades de concentración pueden ser moles/litro, g/1, mg/1, porcentuales, etc. hs ~hp [S] = concentración del soluto [P] = concentración del patrón hs = altura del soluto hp = altura del patrón Figura 1.5 Curva para estándares internos. Estándar externo Esta técnica es menos complicada que el estándar interno, pero requiere de mayor cuidado durante las separaciones cromatográficas. Las curvas de calibración con patrones puros son elaboradas con base en varias concentraciones. Es importante cuidar que los volúmenes de inyección sean los mismos que para los compuestos de interés. Se construye una gráfica de área o altura, en función de la concentración, la cual puede estar en cualquier unidad de masa/volumen, ya sea molaridad, % p/v, o también puede utilizarse el % p/p. La concentración del compuesto desconocido se interpola en el gráfico, con base en el dato de área o altura del pico correspondiente (figura 1.6). Área o altura Concentración Figura 1.6 Curva para estándares externos. 26 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases Operación del cromatógrafo Gow-Mac modelo 69-350 Descripción Todos los controles de operación del modelo 69-350 están localizados en la parte frontal del aparato (figura 1.7). 11 Figura 1.7 Cromatógrafo de gases Gow-Mac. 27 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Puerto de inyección para la columna "A" Control de ajuste del flujo de la columna "A" Control de temperatura del puerto de inyección Control de temperatura del detector Control de temperatura de la columna Sistema analógico de medición Selector de medición Control de encendido del cromatógrafo Control de cambio de polaridad Control de encendido del detector Control de ajuste del cero Control de atenuación Control de la corriente del detector Control de ajuste de flujo de la columna "B" Puerto de inyección para la columna "B" Tapa del horno del cromatógrafo Uso del cromatógrafo 1. 2. 3. Verifique que todos los controles estén apagados y siga las instrucciones, en función de los parámetros a utilizar en cada una de las prácticas de cromatografía de gases. Abra la llave del tanque que contiene el gas acarreador y verifique que la presión se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2, en caso de ser menor a 500 lb/in2, repórtelo al profesor. La presión de entrada del gas al cromatógrafo debe ser de 30 lb/in2. Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando un flujómetro de burbuja que tenga una disolución de jabón al 3 %. 28 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases Marcas de calibración Flujo del gas del cromatógrafo Burbuja _ Disolución jabonosa u PERA Figura 1.8 Medidor de flujo. La metodología es la siguiente: conecte la manguera del flujómetro a la salida de la columna donde se quiere ajustar el flujo. Presione ligeramente el bulbo lleno de disolución jabonosa, para formar las burbujas que serán arrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la marca cero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguiente ecuación: 600 Flujo = tseg 4. 5. 6. Con base en el resultado y utilizando el control correspondiente (columna "A" o "B") ajuste el flujo requerido. Ajuste los controles de temperatura y de inyección (tanto de la columna como del detector). Fije la corriente de este último. Verifique que el registrador tenga papel y tinta para un buen funcionamiento, enciéndalo y seleccione la velocidad de corrimiento. Para su buen funcionamiento el cromatógrafo requiere aproximadamente de 2 horas para que se estabilice la línea base. Durante este tiempo se puede preparar la muestra, limpiar la jeringa y ajustar el cero. Ajuste del cero: el atenuador del cromatógrafo debe marcar infinito (número 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador, coloque la plumilla donde desee la línea base. Ponga el control de la 29 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 7. 8. 9. atenuación del cromatógrafo en la posición 1. Coloque el atenuador en la posición 256 y el cero con el control del cromatógrafo. Inyección de la muestra. Se debe tener cuidado al introducir la j eringa, si ésta es de una capacidad de 5 o 10 |il, tanto el émbolo como la aguja son muy delgadas y se doblan fácilmente. Debe colocarse la jeringa en posición perpendicular con respecto al cromatógrafo e introducirla en el puerto de inyección de la columna. Efectuar la inyección con fuerza, para asegurar que la muestra entre en la columna. Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringa cuando menos cinco veces con el disolvente adecuado. Debe limpiarse inmediatamente después de usarla, para prevenir que la muestra se seque y queden residuos en la jeringa o el émbolo. Si los picos de la muestra se salen de escala, incremente la atenuación y corra nuevamente su sistema. Una vez terminado el trabajo cromatografía) disminuyalas temperaturas de la columna, inyector y detector, y apague la corriente de este último. Cuide que el flujo del gas continúe hasta que la temperatura de la columna descienda hasta 50 °C o menos. Cierre él paso del gas acarreador y limpie lajeringa. Precauciones en el manejo del detector de conductividad térmica a) b) c) Para evitar que se queme el filamento del detector, verifique que el gas acarreador fluya a través del cromatógrafo, antes de encender el detector. Apagar la corriente del filamento, antes de abrir el sistema, para evitar que éste se oxide. La velocidad de flujo del gas portador debe permanecer constante. 30 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía de gases Metodología para las prácticas de química analítica II 1. 2. Los alumnos deben cubrir totalmente las nueve prácticas de este manual. Cada alumno debe elaborar una bitácora, en la cual, además de anotar todas las observaciones de la práctica en cuestión, realizará las siguientes actividades: • Dibuj ar un diagrama de bloques de la práctica que se va a realizar. • Anotar las propiedades físicas, químicas y tóxicas de cada uno de los reactivos mencionados en el protocolo de la práctica (investigados previamente en la biblioteca). • Realizar los cálculos necesarios para la preparación de las disoluciones mencionadas en la práctica, tomando como base 100 mi de disolución. Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas* 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Al manipular sustancias corrosivas será obligatorio el uso de equipo personal de protección. La transferencia de líquidos, especialmente los corrosivos o tóxicos, debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamente prohibido usar las pipetas succionando con la boca. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentamente o al calentar líquidos en tubos de ensayo o frascos, la cara deberá apartarse para que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usar anteojos protectores o careta de plástico. Nunca vierta agua sobre ácido sulfúrico concentrado. Todas las operaciones con sustancias volátiles deberán hacerse en la campana de extracción. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia química. Las sustancias susceptibles de generar peróxidos (THF, éter, etc.) deberán ser verificadas periódicamente. * Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extraídas del Instructivo sobre elfuncionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalaciones de los laboratorios de docencia de la UAM, aprobado por el Consejo Académico en su sesión 133. 31 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 1 Análisis cualitativo de cromatografía de gases (dos columnas) Introducción Conocer y utilizar la cromatografía de gases es hoy en día un aspecto primordial, tanto en la industria como en el campo científico. La elaboración de productos alimenticios o farmacéuticos necesita de un buen control de calidad, y muchas de las técnicas utilizadas para esto requieren de la precisión del análisis cromatográfico. Uno de los primeros problemas en cromatografía es la selección de la fase estacionaria o tipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de fases líquidas disponibles para la cromatografía de reparto gas-líquido. Para resolver este problema es necesario considerar que un soporte polar retendrá más fuertemente un soluto polar y que, por lo tanto, las sustancias menos polares saldrán con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retención más cortos. En esta práctica se corrobora tal criterio, ya que son separados compuestos de diferente polaridad corriéndolos en una columna polar como la Carbowax 20 M. Posteriormente se efectúa la misma separación, pero utilizando la columna DC-200 no polar. Objetivo El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de gases Gow-Mac, modelo 69-350, para el análisis cualitativo de mezclas y observará la diferencia de separar una misma muestra en dos columnas de diferente polaridad. 33 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica Ií Materiales y reactivos • • • • • • • • • Cromatógrafo de gases Medidor de fluj o de burbuj a Cronómetro Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi 5 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita 5 vasos de precipitados de 50 mi 5 pipetas volumétricas de 1 mi Propipeta n-pentano Tetrahidrofurano 2-butanona n-propanol En la parte teórica de este capítulo se encuentran las instrucciones de operación del cromatógrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p. 27). Normas de seguridad Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilice propipetas para hacer la mezcla. Asegúrese de que no haya mecheros prendidos y coloque letreros para indicar que está trabajando con disolventes. Cuando trabaje con el cromatógrafo, asegúrese de que se encuentre presente el profesor del laboratorio, quien le ayudará y brindará asesoría sobre el buen manejo del equipo. Procedimiento 1. Mezcle un mililitro de cada uno de los siguientes disolventes: n-heptano, tetrahidrofurano, 2-butanona y n-propanol. Guarde la mezcla en un recipiente cerrado. 34 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Análisis cualitativo de cromatografía de gases 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes: Temperatura de la columna 130°C Flujo del gas 80 ml/min. Corriente del detector 200 mA (si el gas es helio) 100 mA (si el gas es nitrógeno) Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de calentamiento previo, con el fin de estabilizar la temperatura de la columna, el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todo esto se refleje en una línea base estable. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor de burbuja como se indica en la figura 1.8. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4 y ponga a funcionar el graficador a una velocidad de 2.5 cm/min. Con una jeringa de 50 fil, mida 3 \ú de n-heptano y adicione otros 10 |Lil de aire. Inyéctelos en la columna y enjuague la jeringa. Marque el punto de inyección en la carta, así como la información relacionada con la muestra inyectada. El primer pico que debe eluir es el pico de aire, seguido por el pico del n-heptano. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por último, inyecte la mezcla de los disolventes. Baj o las mismas condiciones de trabaj o, repita todo el proceso utilizando la columna DC-200. Cambie la polaridad del sistema para que los picos salgan en el mismo sentido que con la columna polar. Tratamiento de datos experimentales • • Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas las corridas. Con la ayuda de los tiempos de retención de las sustancias puras, identifique los componentes de la mezcla en los cromatogramas de las dos columnas. 35 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada columna, utilizando los datos del n-heptano. Calcule el porcentaje de cada componente de las mezclas, utilizando el método de normalización (por áreas). Cuestionario i. ¿En qué se basa la cromatografía de gases? 2. ¿Cómo puede medirse la eficiencia de una columna? 3. ¿Qué se entiende por cromatografía líquido-líquido y cromatografía gaslíquido? ¿Qué ventajas tiene la programación de temperatura en la cromatografía de gases? ¿Se puede hacer esta programación en un cromatógrafo de gases con detector de conductividad térmica? Justifique su respuesta. Explique cuáles son las ventajas y desventajas de las columnas capilares y las columnas empacadas. Con base en los siguientes datos, obtenidos con el empleo de una columna de ftalato de dodecilo, realice los ejercicios que se piden. Compuesto Acetona Vr(ml) 21.5 Butanona 58.0 3-pentanona Acetilcetona a) b) 145.0 400.0 Calcular el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada compuesto. Calcular el porcentaje de cada componente, utilizando el método de normalización. 36 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 2 Factor de respuesta en cromatografía de gases Introducción El uso de estándares internos es necesario en el análisis cuantitativo. La sensibilidad de los detectores de conductividad térmica difiere de un compuesto a otro, ya que depende de la conductividad térmica del analito. A menor conductividad térmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada de compuesto. Por lo tanto, debe medirse unfactor de respuesta empírico para cada sustancia que se somete a un análisis cuantitativo. El factor de respuesta F está definido por la relación: [P] \ApJ Objetivo El alumno efectuará el análisis de cromatografía de gases para conocer el factor de respuesta con el n-heptano, empleando como estándar interno al n-pentano. Materiales y reactivos • • Cromatógrafo de gases Medidor de fluj o de burbuj a 37 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Cronómetro Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi 2 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita 2 vasos de precipitados de 50 mi 2 pipetas volumétricas de 1 mi Propipeta n-pentano n-butano Normas de seguridad Los compuestos a trabajar son muy volátiles y flamables, trabaje en un área ventilada y lejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas de seguridad de la práctica 1. Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. Prepare en tubo de ensayo una disolución estándar, mezclando un mililitro de n-heptano con otro de n-pentano. Ajuste las condiciones del cromatógrafo con base en los siguientes datos: Columna DC-200 Gas acarreador Helio Flujo del gas 60 ml/min. Temperatura 90 °C Atenuación 4 Corriente del detector 200 mA Velocidad de la carta 2.5 cm/min. Verifique que la línea base se encuentre estable. Inyecte 3 (il de la disolución estándar, repita por triplicado. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3 \ú9 repita por triplicado. 38 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Factor de respuesta en cromatografía de gases Tratamiento de datos experimentales Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas las corridas. Con base en las áreas y concentraciones de la disolución patrón, calcular el factor de respuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano como estándar interno. Calcular la concentración del n-heptano en la muestra problema, utilizando el factor de respuesta y las áreas del segundo grupo de cromatogramas. Cuestionario 1. Explicar qué se entiende por factor de respuesta. 2. Esta técnica para el cálculo del factor ¿se puede utilizar con otros detectores como el de ionización de flama o el de captura de electrones? 3. ¿Cómo se seleccionan las temperaturas para el inyector, la columna y el detector? 4. Problema: Para la cuantificación de una muestra comercial del antimicrobiano metil parabeno, se utilizó la técnica del factor de respuesta usando el propil parabeno como estándar interno. Se corrieron las muestras en un cromatógrafo con detector de ionización de flama, columna capilar BP5 con película de 0.5 |Lim, temperatura inicial de 160 °C y un gradiente de 15 °C/min. La temperatura final fue de 280 °C. Para el cálculo del factor se utilizaron 0.98 mmol de metil parabeno y 0.75 mmol de propil parabeno. Se obtuvieron las siguientes alturas respectivas: 180 y 165 mm. Una segunda corrida cromatográfica es utilizada para cuantificar la muestra comercial. Se mezcla el problema con 1.2 mmol de propil parabeno. Las alturas resultantes fueron 150 mm para el metil y 160 mm para el propil parabeno. Calcular la concentración del metil parabeno en la muestra comercial. 39 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Bibliografía Baugh, P. J. (editor). 1993. Gas Chromatography A Praetical Approach. IRL Press, Gran Bretaña. Bens, E. 1961. "Adsorption Characteristics of Some Gas-Liquid Chromatographic Supports."Anal Chem., 33:178, California. Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa, México. Ewing, G. W. 1979. Métodos instrumentales de análisis químicos. Ed. Me Graw Hill, México. Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965. Advances in Chromatography. Vol. 1:199, USA. Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1971. Advances in Chromatography. Vol. 4:333, USA. Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial Iberoamérica, México. Meloan, C. F. y R. M. Kiser. 1973. Problemas y experimentos en análisis instrumental. Ed. Reverte, México. Miller, J. M. y R. L. Harmon. 1978. Elementary Theory ofGas Cromatography. Gow-Mac Instrument Co., USA. Operator }s Manual Gas Chromatograph, Model 69-350.1989. Gow Mac Instrument Co., USA. Pecsok, R. L. 1981. Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa, México. 40 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Bibliografía Rowan, R. Jr. 1961. "Prediction of Retention Temperatures in Programmed Temperature Gas Chromatography. A Descriptive Equation and Computacional Method." Anal. Chem., 33:510-515, Nueva Jersey. Storch de García y Asensio, J. M. 1975. Fundamentos de la cromatografía de gases. Alhambra, España. 41 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Capítulo 2 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Introducción La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años ha incrementado su importancia en muchas de las áreas del análisis, tanto a nivel investigación como a nivel industrial. Muchas de las técnicas de control de calidad de fármacos, alimentos, aditivos y contaminantes ya se están efectuando conHPLC. Hace más de 80 años que se conoce la cromatografía de líquidos, pero sólo a partir de 1967 los avances tecnológicos permitieron desarrollar un proceso cromatográfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ninguna manera sustituye a la cromatografía de gases, sólo es un complemento para el análisis de componentes que no toleran una fase móvil gaseosa o temperaturas muy elevadas. De hecho, presenta las siguientes ventajas frente a la cromatografía de gases: • • • Tiene una difusión mínima en la fase móvil, debido a la rapidez del análisis. No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente se realiza a temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas a temperaturas menores de 100 °C. La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uso posterior. La cromatografía de líquidos es una técnica de separación que utiliza una fase móvil líquida, es ideal para la separación de macromoléculas de interés biológico y de compuestos iónicos, ya que no depende de la volatilidad o estabilidad térmica de los componentes. Se puede utilizar para separar proteínas, aminoácidos, lípidos, ácidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales son el análisis de pesticidas, aceites, polímeros, antioxidantes, análisis de agua, contaminantes, sabores, colorantes, etc. La cromatografía de líquidos se basa en la solubilidad de los compuestos: hay que escoger el disolvente o la mezcla de disolventes apropiados para llevar a la muestra a través del sistema, también hay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o mayor DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II medida en la fase estacionaria y que gracias a las altas presiones con las que se mueve la fase móvil, se puede obtener una rápida separación de los componentes de una mezcla. La cromatografía de líquidos se puede clasificar en cuatro tipos, dependiendo de su uso: Cromatografía de líquido-sólido En este caso, la separación depende de la afinidad de la muestra hacia la fase sólida o líquida. Si la muestra es muy afín a la fase estacionaria (compuesta por partículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solvente utilizado se conoce como eluyente y también influye de manera importante en la separación: si la muestra es más afín a la fase líquida, los tiempos de retención serán más cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes según su capacidad para eluir solutos. La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de las muestras. Los solventes pueden ser de naturaleza orgánica o acuosa. Existen muchas características que debe tener una buena fase móvil, entre las más importantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolver la muestra, ser de baja viscosidad y, una vez terminada la separación, debe permitir la recuperación del soluto de manera simple (Watty, 1989). En la cromatografía líquido-sólido existen dos subdivisiones que están en función de su conformación: la fase normal y la fase inversa. Para l^fase normal se requiere de una fase estacionaria polar, por lo tanto, la fase móvil debe ser no polar. Los empaques que se pueden utilizar en fase normal son diol, sílica y amino, entre otros. En \difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase móvil polar. Los empaques más comunes para la fase reversa son: ODS (C18), octyl, dimetil, etc. Otra variación de este tipo de cromatografía se conoce como fase ligada (bondedphase), que consiste en enlazar con el soporte de sílica compuestos que aumenten su carácter no polar (C2, C6, C8, Clg). En función del tamaño de la cadena de hidrocarburos que se haya unido, los tiempos de retención de los solutos que eluyan en estas columnas, tenderán a aumentar, pues se retendrán más fuertemente. 46 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución Tabla 2.1 Lista de disolventes. Disolvente Ácido acético Acetona Acetonitrilo Benceno N-butanol Tetracloruro de carbono Cloroformo Ciclohexano 1,2-dicloroetano Cloruro de metileno Dimetil sulfóxido Dioxano Acetato de etilo Etanol índice de polaridad Longitud de onda de corte nm 0.62 230 100 5.10 5.80 2.70 3.90 330 190 100 100 0.18 1.60 4.10 0.20 3.50 3.10 280 215 263 245 200 225 Solubilidad en agua % p/p 7.81 0.08 0.815 0.01 0.81 7.20 4.80 4.40 6.20 235 268 215 260 210 Dietiléter Heptano 2.80 0.00 220 200 Hexano 0.00 200 0.001 Metanol Pentano N-propanol Iso-propanol 5.10 0.00 100 0.004 4.00 3.90 205 200 210 210 Tetrahidrofurano Tolueno 4.00 2.40 215 285 100 0.051 Tricloroetileno 1.00 9.00 2.50 273 200 290 0.11 100 0.018 Agua Xileno 1.6 100 100 8.7 100 6.89 0.0003 100 100 47 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Cromatografía de intercambio iónico Consiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encuentran disueltos en la fase móvil. Aniones como el sulfito -SO3~ o cationes [N-(CH3*)3+] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones de soluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atraídos por fuerzas electrostáticas (la fase móvil es un líquido, figura 2.1). Se puede efectuar cromatografía de intercambio iónico no solamente en HPLC, sino también en capa fina, en columna y en papel impregnado de resina. En este método la separación depende de las variables: fuerza iónica, capacidad de carga de la columna y del pH durante el proceso de separación. El procedimiento deriva de la cromatografía de líquido-sólido, y se utiliza en la separación de aminoácidos, en análisis de trazas, en la separación de metales por formación de complejos, etc. Las resinas utilizadas en las columnas pueden estar o no polimerizadas. En el mercado existen resinas intercambiadoras catiónicas, tipo ácido fuerte o débil, e intercambiadores amónicos tipo base fuerte o débil. También hay geles de intercambio iónico, que se utilizan para separar moléculas pequeñas con pesos moleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnas de intercambio iónico comerciales, mencionando el tipo de iones que puede retener, el pH de trabajo y la presión máxima a la que pueden ser utilizadas. Aniones móviles mantenidos cerca de los cationes unidos covalentemente a la fase estacionaria Figura 2.1 Cromatografía de intercambio iónico (resina de intercambio aniónico, sólo los aniones pueden ser atraídos hacia ella). 48 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución Tabla 2.2 Columnas para HPLC de intercambio iónico. Columna Soporte pH Presión máx. Syn Chropac SAX Fuertemente aniónica Sílica 2a8 5 000 psi Syn Chropac WAX Débilmente aniónica Sílica 2a8 5 000 psi Syn Chropac SCX Fuertemente catiónica Sílica 2a8 5 000 psi TSKcatiónica Resina 2a12 200 psi Cromatografía de exclusión molecular Con este método las moléculas se separan por su tamaño y conformación: si el peso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molécula es globular, la retención será mayor, comparada con una molécula de peso superior al de la capacidad del gel o con una molécula de conformación irregular (figura 2.2). Las aplicaciones de esta técnica son amplias, ya que permite separar muestras con pesos moleculares entre 700 y más de 150 millones, particularmente aquellas de interés bioquímico. También es muy utilizada para la separación de polímeros (tabla 2.3). Los soportes utilizados pueden ser de gel de sílice unido a compuestos que aumentan su carácter hidrofílico, como las columnas Biosep-SEC-S; o pueden ser polímeros como los de la serie PolysepGFC-P (poliestireno, polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.). En el mercado de la cromatografía de exclusión molecular existe un gran número de columnas que permiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento que se requiera (Phenomenex, 1994). 49 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica Moléculas grandes son excluidas Moléculas pequeñas penetran el gel Figura 2.2 Cromatografía de exclusión molecular. Tabla 2.3 Columnas comerciales para la exclusión molecular. Columna Rango PM Aplicaciones Styagel HR 0.5 0 a 1 000 Aditivos, fenoles, epóxidos, urea Styagel HT 4 5 000 a 600 000 Styagel HMW7 500 000 a 1x10 PM intermedio 8 PM alto Cromatografía de afinidad Se basa en la interacción específica que existe entre un soluto de una mezcla y un sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columna. Las interacciones están relacionadas más con las características estructurales que con la carga, tamaño, solubilidad u otras propiedades que se aprovechan en otros tipos de cromatografía. Ejemplos de aplicaciones son la relación sustrato enzima y la relación antígeno anticuerpo (Day y Underwood, 1989). Una mayor fuente de información sobre los métodos cromatográficos se puede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992; Pecsok, 1981. 50 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución Operación del cromatógrafo de alta resolución (HPLC) El HPLC consta de cuatro partes: el sistema de bombas encargado de mantener constante el flujo de la fase móvil; el sistema de inyección que permite introducir la muestra a trabaj ar; la columna que tiene la función de separar los componentes de la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual manda una señal al sistema de registro. Sistema de bombas Este sistema es un componente importante del cromatógrafo de líquidos, el cual requiere de una bomba de alta presión, comúnmente de un máximo de 6 000 psi. La presión es necesaria para mover las partículas del soluto entre la fase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografía de líquidos debe tener un flujo continuo y libre de pulsaciones. Existen dos tipos de sistemas de elución: uno donde el disolvente no cambia de composición durante el proceso de aislamiento, conocido como elución ¡socrática, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separación de los componentes en una mezcla (elución por gradiente). Las bombas con pistones sincronizados son las más empleadas en los sistemas de HPLC. Un pistón siempre bombea disolvente, mientras el otro se llena. Este arreglo proporciona un flujo relativamente libre de pulsos o pulsaciones. Pueden evitarse muchos problemas con las bombas si se cuidan los solventes utilizados: no deben tener un pH muy bajo ni formar precipitados con facilidad. En columnas convencionales de 5 mm de diámetro interno y con flujos entre 1 y 2 ml/min, pueden resultar presiones de 400 bar, dependiendo de la longitud de la columna, el tamaño de partícula y el disolvente. El sistema de bombas debe de mantenerse en óptimas condiciones si se quiere tener reproducibilidad en las corridas cromatográficas. 51 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC Figura 2.4 Sistema de bombas del HPLC 52 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución Operación del sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4): Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha (número 8 de la figura 2.4). La parte frontal consta de (figura 2.3): 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Pantalla digital para conocer la presión del sistema, la cual está dada en libras por pulgada cuadrada (psi). El número que aparece en la pantalla debe multiplicarse por 10, a fin de obtener la presión verdadera. Botones que fij an la presión mínima y máxima de trabaj o durante el proceso de separación. Se recomienda establecer la presión baja en cero psi y la máxima en 3 500 psi. El valor máximo depende del tipo de columna a utilizar y de la viscosidad del disolvente o mezcla de ellos. Si durante el proceso de separación la presión del sistema rebasa estos valores, el sistema de bombas se apaga automáticamente. Standby. Permite que el motor se apague y el sistema eléctrico siga funcionando. Reset. Botón que reenciende las bombas y restablece elflujo y la presión del sistema. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo del sistema tiende a cero. Control de fluj o. Consta de tres diales rotatorios individuales y permite preseleccionar el flujo del sistema en ml/min. El flujo debe incrementarse poco a poco (de décima de mi en décima de mi). Una lectura de 070 indica un flujo de 0.70 ml/min. Válvula de purga. Permite la purga hidráulica del sistema. Botón de encendido o apagado. Sistema de detección de solutos eluidos Existen diferentes tipos de detectores utilizados en la cromatografía de líquidos, los hay defluorescencia,índice de refracción, conductividad eléctrica, de UVvisible, arreglo de diodos, etc. El tipo UV-visible es el más ampliamente distribuido como detector en HPLC, la mayoría de los compuestos tienen cuando menos alguna absorbancia en las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de estas 53 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos. 6 7 Figura 2.6 Detector UV-visible. 54 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, la cual relaciona la absorbancia del soluto con su concentración (c, en moles/1) y la longitud del paso del haz de luz (b): A = 8be. Los detectores de los equipos actuales tienen una mayorflexibilidadque los espectros comunes, ya que pueden reportar valores menores de 0.001 unidades de absorbancia. Operación del sistema de detección Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha. La parte frontal (figuras 2.5 y 2.6) consta de: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Pantalla. Permite leer hasta diezmilésimas de unidades de absorbancia. Botón de polaridad. Sirve para cambiar la señal de salida del sistema de registro. Botón de corte (short switch). Conecta o desconecta las terminales positiva y negativa nulificando la señal del integrador o registrador. Este efecto es lo mismo que si se mandara una señal de cero volts al registrador, permitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho en el registrador o integrador. Mark. Este botón permite producir una marca en la carta y se utiliza generalmente para indicar el momento de la inyección de la muestra. Auto cero. Este botón permite definir la línea base y tiene un intervalo de ± 0.7 UA (unidades de absorbancia). Cuando la lámpara parpadea indica que la señal de salida de la línea base excede el intervalo de trabajo del auto cero. Pantalla indicadora de la longitud de onda seleccionada. Control de selección de longitud de onda. Ajusta la longitud de onda de trabajo entre 190 y 700 nm con incrementos de 0.2 nm. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS, Absorbance Units Full Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan la sensibilidad de las unidades de absorbancia. Botón de control. Consta de seis posiciones que se pueden seleccionar y observar en la pantalla: 55 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II • 10. SE {Sample Energy). La pantalla reporta la energía UV de la celda de la muestra problema. RE (Reference Energy). Reporta la energía UV de la celda de referencia. AU (Absorbance Units). Se observan la unidades de absorbancia presentes en la muestra problema. Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato toma como cero. DLV(Deuterium Lamp Voltage). Reporta el voltaje de la lámpara de deuterio. DLC {Deuterium Lamp Current). Reporta la corriente del filamento de la lámpara en miliamperios, una lectura de 300 es ideal y de 285 a 315 es aceptable. Tiempo de respuesta. Son cinco posiciones que seleccionan los diferentes tiempos de respuesta: • • • • • 0.05 sea, respuesta rápida que provoca picos angostos y mucho ruido en la línea base. 0.10 sea, respuesta rápida con ruido ligeramente menor que la anterior. 0.50 sea, más rápida que la respuesta normal y con ruido ligeramente mayor de lo normal. 1.00 sea, respuesta normal con picos angostos y una cantidad pequeña de ruido. 5.00 sea, respuesta lenta para una supresión máxima del ruido. Operación del integrador SP4400 Es un equipo que permite interpretar la señal mostrando no sólo el cromatograma, sino también un reporte completo con los tiempos de retención, las áreas y sus porcentajes. Si se requiere, también proporciona información sobre las condiciones bajo las cuales se corrió el sistema y cuenta con programas para hacer cálculos con patrones externos e internos (figura 2.7). 56 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución Figura 2.7 Integrador Figura 2.8 Vista parcial del teclado del integrador. 57 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentran los métodos numéricos que permiten realizar diferentes tipos de cálculos, como los siguientes: a) b) c) Método numérico cero: MN = 0. Es un método de porciento de área usado cuando los resultados de concentración no son necesarios. Este método no utiliza factores de respuesta del detector y de esta manera no requiere de calibración. Una vez que el diálogo de rutina termina, se selecciona el método en el reporte, el cual incluye todos los picos del cromatograma identificados por orden de elución. Los nombres de los componentes no son generalmente utilizados. Método numérico uno: MN = 1. Es el más utilizado en cromatografía de gases, en particular cuando todos los componentes de la muestra son conocidos. Es muy similar al método cero, con excepción de que las áreas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuesta, calculados previamente en una corrida con sustancias patrón de concentración conocida. Método numérico dos: MN = 2. Requiere la utilización de estándares internos para cuantificar de manera exacta los componentes de una mezcla. Es de uso común en análisis de compuestos farmacéuticos, aditivos alimentarios, etc. La concentración del estándar interno debe ser ligeramente mayor, pero no pasar de un factor de 10, con respecto a los componentes de interés en una mezcla. Descripción del teclado (figura 2.8) Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrás. LCD status: Presenta un cuadro en pantalla donde indica el canal (C/z), archivo (FI\ número de inyecciones en ese archivo (Biri), la velocidad de la carta (Cs), atenuación (Atteri), tiempo de corrimiento (Runtime), nivel (Level) y capacidad de memoria. Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar la inyección en la columna "A". Shift inj/endA: Detiene el desarrollo del cromatograma sin dar el reporte del mismo. 58 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución A ítem Se usa para verificar la atenuación en cualquier momento del proceso cromato gráfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece el valor que se está utilizando. Chart speed: Se utiliza para verificar la velocidad de la carta en cualquier momento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece el valor que se está utilizando. Se recomienda usar velocidad 2 para cromatogramas con pocos picos y 2 o 4 para cromatogramas ricos en picos. PTeval: No debe utilizarse durante la corrida. Normalmente se observa su valor antes de inyectar nuevamente la muestra, ya que un valor menor a 250 indica que ya no hay residuos de soluto del análisis anterior pasando por el detector. Metodología para el manejo del HPLC 1. 2. 3. 4. 5. 6. Preparación del disolvente y la muestra a analizar. Ambos deben ser filtrados en membranas de 0.4 |um, para evitar que las impurezas entren y contaminen la columna. El disolvente debe ser grado HPLC. Revisar que el sistema de entrada y salida de los disolventes estén sumergidos en sus respectivos recipientes. Encender el sistema de bombas (número 8 de la figura 2.4). Ajustar el flujo oprimiendo los botones respectivos (número 6 de la figura 2.3) del sistema de bombas. Seleccione la longitud de onda con base en el sistema a separar, moviendo el dial correspondiente (número 7 de la figura 2.6). Al igual que el cromatógrafo de gases, el HPLC requiere de un tiempo (20 a 30 minutos) para que se estabilicen las condiciones de trabajo. Encender el integrador y ajustar la velocidad de la carta y la atenuación, presionando primero la tecla Chart speed del teclado del integrador y posteriormente la tecla Atten (figura 2.8). Se puede elegir entre una serie de valores que van desde 0.5 hasta 4 096 en incrementos geométricos para la atenuación. Si en una primera corrida los picos 59 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 7. 8. rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuación al valor próximo, de manera que los picos reduzcan a la mitad su tamaño (siempre y cuando se utilicen las mismas condiciones de separación). Verifique el valor del PT evaluation: debe ser como máximo de 250. Inyecte la muestra con una jeringa de 50 jal con aguja sin punta, mida la cantidad establecida en el manual de prácticas de la muestra a correr e introduzca la jeringa en la válvula de inyección. El mecanismo de inyección de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: carga y descarga. Presione el émbolo para que la muestra pase a la tubería de acceso (loop). Mueva la palanca a la posición de descarga para que la muestra sea llevada a la columna, el líquido contenido en el loop será desplazado hacia la columna. El movimiento debe ser rápido para evitar una caída brusca de presión que desconecte el sistema de bombas. Posteriormente oprima la tecla inj/endA del integrador. Terminado el tiempo de corrimiento vuelva a presionar la tecla inj/end A, el integrador le dará un reporte completo de su sistema separado. 60 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cromatografía líquida de alta resolución Flujo Flujo Jeringuilla I Hacia la columna Unión Alojamiento de muestras Exceso de inyección CARGAR INYECTAR Figura 2.9 Válvula de inyección para cromatógrafo de líquidos de alta resolución. 61 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 3 Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído (método del patrón interno) Introducción El funcionamiento de un comatógrafo de alta resolución empieza con el sistema de bombas de alta presión, el cual impulsa el disolvente a través de todo el sistema. La muestra es inyectada por medio de una microj eringa, el volumen es de unos cuantos microlitros para que la resolución de los picos sea buena y la separación sea más rápida. Una vez en la columna, se realiza la interacción soporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separación de los componentes de la muestra. El detector está compuesto por una microcelda en forma de "Z", a través de la cual fluye la disolución; es excelente para que los compuestos no se mezclen y el flujo sea rápido. Por último, en el integrador, la absorbancia es convertida en señal eléctrica y así es reproducida como cromatograma. En la cromatografía de líquidos de partición existen dos grupos de trabajo, el más frecuente se conoce como cromatografía de fase inversa, en ella la fase estacionaria tiene un carácter no polar y se eluye con un disolvente polar. El segundo grupo es la cromatografía de fase normal que utiliza un soporte polar y un disolvente no polar. El sistema de elución puede ser isocrático o por gradiente y el detector más común es el uv-visible, aunque también es utilizado el de índice de refracción. La cuantificación de una muestra problema por medio de un estándar interno se puede efectuar con la elaboración de una curva estándar, la cual debe ser hecha mínimo con tres puntos. En el laboratorio se debe tener especial cuidado 63 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II sobre las condiciones de separación, en cuanto a volumen inyectado, flujo y composición de la fase móvil. La curva se desarrollará en función de la relación de alturas o áreas de los picos del compuesto entre las del estándar (ver capítulo 1: Cálculos en cromatografía). En las abscisas se coloca la relación de la concentración del soluto entre la concentración de la sustancia patrón. La concentración de la muestra problema se interpola de la curva patrón. Objetivo El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de líquidos de alta resolución para cuantificar una muestra problema de anisaldehído, utilizando el método del patrón interno. Materiales y reactivos Cromatógrafo de líquidos de alta resolución Columna Spherisorb ODS C]810 mm Filtros de teflón de 0.4 mm Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC 5 frascos viales de 5 mi con tapa 2 pipetas volumétricas de 1 mi Anisaldehído Acetonitrilo Tolueno Muestra problema con anisaldehído Normas de seguridad Al preparar la mezcla acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno debe hacerlo en la campana de extracción. Revise su bitácora para recordar que el acetonitrilo es venenoso y flamable, que debe evitar respirar sus vapores y que puede causar irritación en la piel. 64 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. 6. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser las siguientes: Columna Spherisorb 10ODS10jim Dimensiones 250 x 4.6 mm Presión máxima 3 500 psi Fase móvil acetonitrilo/agua (50:50) Flujo 0.8 ml/min Prenda y acondicione el cromatógrafo dejando que el sistema se estabilice. Prepare las siguientes mezclas de anisaldehído y tolueno: Compuesto Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Anisaldehído 0.07 M 0.05 M 0.03 M Tolueno 0.05 M 0.05 M 0.05 M Filtre por membranas de 0.4 jom: a) La mezcla de acetonitrilo agua, b) cada una de las mezclas patrón y c) la muestra problema. Solicite al profesor la muestra problema que contiene 0.05 M de tolueno como estándar interno, mida 2 |il e inyéctelos. Repita por triplicado la determinación. Tratamiento de datos experimentales Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo, elabore una curva patrón como la que se muestra en la figura 2.10. 65 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II ALTURA S ALTURA P [SOLUTO S] [SOLUTO P] Figura 2.10 Curva patrón. La concentración de la muestra problema se calcula a partir de sustituir el valor de la altura del anisaldehído (altura S) en la mezcla problema en la relación: ALTURAS ALTURA P La altura "P" es la altura del tolueno, el valor de esta relación se interpola en la curva patrón y el valor de la gráfica es sustituido en la siguiente relación, para obtener la concentración del soluto de la muestra problema: SOLUTO S SOLUTO P Cuestionario 1. Mencione tres diferencias, en cuanto a su aplicación, entre la cromatografía degasesyelHPLC. 2. Describa los cuidados experimentales que se deben tener para: a) los disolventes a utilizar como fase móvil, b) la muestra problema a separar o cuantificar. 66 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cuantifícación de una muestra problema de anisaldehído Indique usted qué fase estacionaria, qué fase móvil y qué detector serían los indicados para efectuar una buena separación de las siguientes mezclas: a) de carbohidratos, b) de aminoácidos y c) de proteínas. Para conocer el contenido de anfetamina en un preparado farmacéutico comercial, se utiliza como estándar interno la metanfetamina y se efectúan tres corridas cromato gráficas. Con base en estos datos construya una curva patrón y calcule la concentración de una muestra problema de anfetamina que dio una altura de 123 mm. 1 Corrida Fármaco 2 3 Conc. Altura Conc. Altura Conc. Altura Anfetamina 0.6 30 1.2 60 1.8 98 Metanfetamina 0.6 38 0.6 38 0.6 38 Conc.= concentración en mM. 67 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 4 Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas (método del patrón externo) Introducción La cromatografía de líquidos de alta resolución ha tenido un gran auge en los últimos 20 años, se ha utilizado como técnica para separar, identificar y preparar sustancias en muchas áreas. Actualmente estos equipos se combinan con el banco de memoria de una computadora, lo que ofrece una mayor facilidad en la identificación de compuestos. Una aplicación actualizada es la separación e identificación de antocianinas, tanto en uvas como en vinos tintos. A pesar de tener el vino tantos años de historia, aún no se conoce qué ocurre con sus compuestos durante el añejamiento. El color es uno de los atributos más importantes del vino y es determinante en la evaluación sensorial. En las uvas tintas está dado por el contenido de antocianinas y en las uvas blancas por los flavonoles. Existen en las uvas tintas 14 antocianinas, de las cuales cinco se encuentran en mayor proporción: malvidina, petunidina, cianidina, peonidinay delfidina (Reyes etal., 1992). Las antocianinas son pigmentos de color rojo, azul y violeta. En condiciones acidas, el color rojo predomina; en presencia del ion bisulfito (HSO~3 ) reaccionan y se decoloran, esta reacción es reversible. El color de los vinos tintos se debe principalmente a las antocianinas libres (estos compuestos tienden a polimerizarse casi de manera inmediata desde que son estrujadas), y a pigmentos polímeros formados durante el tiempo de afiejamiento del vino, por condensación de antocianinas con otros compuestos flavonoides y proba- 69 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II blemente aldehidos. El color de los vinos tintos depende del pH, el contenido de SO2? de los pigmentos poliméricos y los taninos. El uso de equipos como el HPLC permite la separación de las antocianinas en vinos tintos y éstas aparecen como picos discretos. Objetivo El alumno utilizará el cromatógrafo de líquidos de alta resolución para separar y cuantificar una muestra de antocianinas, utilizando el método del patrón extemo. Materiales y reactivos Cromatógrafo de líquidos de alta resolución Columna Spherisorb ODS Clg 10 mm Filtros de teflón de 0.4 mm Papel filtro WhatmanNo. 1 Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC 4 tubos de ensayo con tapa de rosca Mortero con pistilo Pipeta graduada de 10 mi Clorhidrato de malvidinamonoglucósido Ácido fórmico Acetonitrilo Metanol HC1 (concentrado) Normas de seguridad Cuide que al preparar las mezclas acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno se haga en la campana de extracción. 70 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Separación y cuantifícación de una muestra de antocianinas Recuerde que el acetonitrilo es venenoso,flamabley que causa irritación en la piel. Se debe evitar respirar sus vapores. Maneje con cuidado el ácido fórmico y evite el contacto con la piel, ya que es corrosivo. Procedimiento 1. 2. Extracto a partir del hollejo de la uva: lavar y quitar el hollej o a 10 uvas tintas, colocando éste en un mortero limpio. Adicionar 10 mi de metanol y presionar suavemente con el pistilo contra el hollejo para obtener una disolución muy colorida. El extracto es prefiltrado con papel Whatman No. 1, antes de filtrar con membranas Millipore de 0.45 |Ltm. El extracto se guarda en un tubo de ensayo limpio y con tapón de rosca. Se protege de la luz y debe utilizarse a la brevedad. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser: Columna Spherisorb 10 ODS 10 |jm Dimensiones 250 x 4.6 mm Presión máxima 3 500 psi Fase móvil. Se utiliza un gradiente de elución con dos disolventes: Disolvente A, ácido fórmico al 40% Disolvente B, acetonitrilo Gradiente inicial: 25 % solvente A 6 minutos después incremente el disolvente B a 23 %. 8 minutos después incremente el disolvente B a 50 %. 5 minutos después incremente el disolvente B a 95 %. Flujo 0.7 ml/min NOTA: verifique que tanto las muestras como los disolventes de la fase móvil se filtren en membranas Millipore de 0.45 |jm. 3. 4. Prenda y acondicione el cromatógrafo, permitiendo que se estabilice el flujo y la columna. Se inyectan 2 (il del extracto colorido. Repítalo por triplicado. 71 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 5. Para elaborar la curva patrón con el clorhidrato de malvidin 3monoglucósido, se preparan cuatro diferentes concentraciones 25,50, 100 y 150 mg/1 en metanol con 1 ml/1 de HC1 concentrado. Se inyectan en la columna por separado, los volúmenes de inyección deben ser de 214,1. Ajuste la atenuación para que los picos no rebasen la escala del integrador. Tratamiento de datos experimentales Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo, elabore una curva patrón como la de la figura 1.6. Calcule el coeficiente de correlación. Con la altura de los picos del extracto de uva en el cromatograma interpole los datos en la curva patrón. Con el valor verdadero (dato proporcionado por el profesor) calcule la precisión y exactitud y discuta sus resultados. Cuestionario 1. ¿Qué influencia pueden tener los siguientes cambios sobre el cromatograma obtenido en esta práctica? a) Utilizar una columna C-8 en lugar de una C-18. b) Disminuir el flujo de la fase móvil. c) Hacer una elución isocrática (en lugar de una por gradiente) en condiciones de disminución del flujo de la fase móvil. 2. ¿Qué puede suceder si, por descuido, no se filtra el extracto de materia colorante y se inyecta en el cromatógrafo? 72 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas 3. ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durante una corrida que presentó fuertes variaciones en la presión de las bombas? ¿Qué puede ocasionar este comportamiento? 4. ¿Qué otros sistemas de detección son de uso frecuente en los cromatógrafos de alta resolución? 5. Mencione brevemente tres aplicaciones directas de la cromatografía líquida de alta resolución, mencionando además tipo de columna, fase móvil que se podría utilizar y el detector adecuado. 73 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Bibliografía Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa, México. Dallas, C. y O. Laureano. 1994. "Effects of pH, Sulphur Dioxide, Alcohol Content, Temperature and Storage Time on Colour Composition of a YoungPortugueseRedTable Wine". J.Scl Food Agrie. 65:477-485. Ewing, G. W. 1979. Métodos instrumentales de análisis químicos. Ed. Me Graw Hill, México. Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial Iberoamérica, México. León, R. 1982. Libro básico para cromatografía de líquidos. LDC/Milton Roy, USA. Meites, L. (editor). 1963. HandbookofChemistry. Me Graw Hill, USA. Operator's Manual. 1993. SpeetroMonitor 3200 Variable Wavelength Detector. Thermo Separation Products, USA. Operator'sManual. 1993. ConstaMetric 3200 Fluid Metering Pump. Thermo Separation Products, USA. Pecsok, R. L. y L. D. Shields. 1987. Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa, México. Reyes-Dorantes, A., M. L. Escamilla-Hurtado y J. R. Verde-Calvo. 1992. Enología Vol I. Elaboración de vinos de mesa. Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa, México. Watty, M. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra Mexicana, México. 74 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Capítulo 3 ESPECTROFOTOMETRIA DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo I. VISIBLE ULTRAVIOLETA Introducción Los usos analíticos de la espectrofotometría en la zona del visible ultravioleta son muchos y muy variados. El objeto de este capítulo es hacer mención de algunas de estas aplicaciones, y que el alumno ponga en práctica los conocimientos adquiridos en la teoría sobre la ley de Lambert y Beer. Cuando un compuesto o ion capaz de absorber luz es colocado en una celda en un espectrofotómetro, cierta cantidad de luz monocromática será absorbida por dicho compuesto y el resto saldrá de la celda para ir a incidir sobre el fototubo que la detectará. Este comportamiento es aprovechado para conocer la concentración de los compuestos. La transmitancia, T, de una disolución se define como la fracción de la intensidad o de la fuerza de la luz incidente, Po, que se transmite verdaderamente a través de la disolución. En donde P es la intensidad de la luz que sale de la muestra. T = — Po o T = 100 \Po) La absorbancia, A, de una disolución es la luz que absorbe, no la que se transmite, y se define como: A = - logT = log — La ley de Beer (también conocida como la ley de Bouguer-Beer o de Lambert y Beer) establece que: a una longitud de onda dada, la absorbencia es proporcional a la concentración de la especie absorbente en una disolución, como lo indica la siguiente ecuación. A = zbc DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II En donde b es el recorrido del haz de luz en la celda, c es la concentración (moles/1) y la constante de proporcionalidad es la absortividad molar, e. Su valor numérico depende de las unidades que se usen para expresar b y c. Si b está dada en cm y c en moles por litro, se le denomina coeficiente de extinción molar o absortividad molar y recibe el símbolo de e. Si la concentración se da en g/1, solamente se llama coeficiente de extinción o absortividad y su símbolo es "a" (para obtener mayor información sobre esta ley se pueden leer los trabajos de Hughes, 1952,Liebhafsky, 1953,yLykos, 1992). Desviaciones de la ley de Beer Una gran cantidad de compuestos absorbentes siguen bastante bien la ley de Beer en soluciones diluidas, pero en algunas sustancias las absorbancias varían en forma no lineal respecto de la concentración. Este comportamiento se conoce como "desviación de la ley de Beer". Para trabajar estos sistemas se requiere una curva de calibración, trazada con valores de muestras de concentración conocida, de este modo se puede conocer el intervalo de concentraciones en el cual la relación es lineal. Se debe tomar en cuenta que las desviaciones con respecto a esta ley pueden tener causas diversas: por muestras muy concentradas o muy diluidas, por variación del equilibrio químico de la sustancia que absorbe y por limitaciones del instrumento utilizado. Para tener el mínimo de problemas con las desviaciones, se recomienda trabajar en el intervalo de concentraciones de 10'2 M a 10'6 M. Si se utiliza una técnica poco reconocida, hay que cuidar el equilibrio químico poniendo especial atención en la fuerza iónica y en el pH del sistema, ya que hay muchos compuestos cromóforos o quelatos que presentan equilibrios parciales, en estos casos hay que agregar un exceso de ligando para desplazar el equilibrio hasta la formación del complejo con mayor número de coordinación. También existen problemas causados por los equipos, como las radiaciones reflejadas dentro del aparato que llegan al detector, los cambios de sensibilidad del detector y lasfluctuacionesen la corriente eléctrica que provocan cambios en la intensidad de la radiación y por ende modificaciones en la lectura registrada. Un dato muy importante es que las mediciones espectrofotométricas sólo son confiables con valores intermedios de absorbancia, aproximadamente entre 0.187 y 0.824; o en % de T, entre 15 y 65; si se requiere, se puede ampliar 78 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Espectrofotometría esta escala hasta 80% de 7, pero entonces se aumenta el error fotométrico (valores de absorbancia para un espectro de un solo haz, utilizando la gráfica de Ringbom. Servicios Centrales de Instrumentación, 1983). Celdas La celda es un depósito transparente especialmente diseñado para contener la disolución de prueba o el disolvente de referencia (blanco) durante los estudios espectrofotométricos. Existen celdas o cubetas de diversos tamaños y formas apropiadas para los diferentes tipos de espectros comerciales (figura 3.1). Las celdas más comunes para medir espectros en la región del visible-ultravioleta están fabricadas con cuarzo y tienen un paso de luz de 1.0 cm. Las celdas de vidrio óptico son apropiadas sólo para mediciones en la región del visible, ya que absorben la radiación ultravioleta. Generalmente las celdas son cuadradas con dos lados esmerilados, pero las hay cilindricas en forma de tubo de ensayo para ser utilizadas en el Spectronic 20. También existen las celdas de flujo que permiten la circulación continua de una disolución a través de la cubeta. Son útiles para medir la absorbancia de disoluciones que fluyen de una columna cromatográfica. También existen las celdas térmicas con recirculación de agua o algún líquido que fluye en una camisa para mantener el contenido de la celda a la temperatura deseada. Las características de transmisión de las celdas en varias longitudes de onda son función de los materiales de fabricación. Por ejemplo, el vidrio pyrex transmite en el intervalo de los 320 a los 2 500 nm. La figura 3.2 muestra las zonas de absorción de los materiales más comúnmente empleados en la fabricación de celdas. Se pueden utilizar vidrios o plásticos especiales en la región del visible. 79 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Celda cilindrica para flujo constante Celda normal con tapa Microcelda típica con tapa Celda cuadrada para flujo constante s Figura 3.1 Diferentes tipos de celdas para espectrofotometria. 80 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Espectro fotometría 200 250 1. Spectrosil 2. Sílice fundido 3. Cuarzo fundido 300 350 400 nm 4. Vitreosil grado IR 5. Vidrio óptico especial 6. Vidrio Figura 3.2 Espectro de transmisión para materiales utilizados en la fabricación de celdas. Resulta conveniente contar con una marca en el lado donde incida la luz, de manera que la celda pueda siempre ser orientada en la misma posición para permitir la reproducibilidad de los resultados. 81 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 1 3. Control de cero y de encendido 4. Portaceldas 7. Control de longitud de onda 2. Control de ajuste de 0% de transmitancia o de absorbancia Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20. Operación del espectrofotómetro Spectronic 20 Descripción El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la perilla izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj. El aparato se calienta 82 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 1 3. Control de cero y de encendido 4. Portaceldas 7. Control de longitud de onda 2. Control de ajuste de 0% de transmitancia o de absorbancia Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20. Operación del espectrofotómetro Spectronic 20 Descripción El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la perilla izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj. El aparato se calienta 82 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 2. 3. 4. 5. 6. 7. Evite el uso de agentes limpiadores que sean abrasivos, corrosivos o que produzcan coloración de las superficies. Por ningún motivo las limpie con un escobillón. Enjuague las celdas cuando menos tres veces con pequeñas porciones de la disolución de prueba antes de tomar la lectura. Evite usar solamente agua destilada, ya que esto produce un efecto de dilución sobre la muestra a medir. Cuando introduzca la celda en el compartimento de muestras, limpie el tercio inferior de la celda con papel especial para lente (nunca use servilletas, pañuelos o la bata), y asegúrese que las paredes no muestren fibrillas adheridas o manchas. Evite producir rayaduras en las superficies de las celdas, colóquelas dentro del portaceldas con la línea indicadora alineada con su respectiva guía Mantenga cerrada la tapa del compartimento de muestras mientras realiza las mediciones, ya que esto restringe la entrada de luz parásita. Al finalizar todas las mediciones, enjuague con el disolvente puro. Si las celdas están muy sucias o si presentan depósitos difíciles de remover, use una mezcla de ácido clorhídrico 3 N y alcohol etílico absoluto 1:1. Aplique un último enjuague con etanol o metanol grado espectroscópico y deje secar al aire. 84 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 5 Desarrollo de un método espectrofotométrico Introducción Para la cuantificación de sustancias que pueden absorber la luz que las atraviesa, las técnicas espectrofotométricas son confiables y de fácil manejo. Además, no sólo sirven para calcular la cantidad de soluto presente en una disolución, sino también se pueden utilizar para identificar sustancias de manera cualitativa. Cuando se realiza un proyecto de investigación, se puede requerir el desarrollo de un método espectrofotométrico para cuantificar algún soluto o quizás el producto de una reacción, que tengan la cualidad de absorber la luz. Para conseguir esto se necesita: a) b) c) Conocer la longitud de máxima absorbancia del compuesto, que se obtiene haciendo un barrido en la región del espectro de absorción de interés. La preparación de una curva de calibración con disoluciones de concentración conocida. Conocer la curva permite verificar si la ley de Lambert y Beer se cumple en el intervalo de trabajo. Conocer si hay interferencias entre los reactivos, si las reacciones involucradas son estables en las condiciones de trabajo y si hay reproducibilidad en los resultados experimentales. Tome en cuenta que la absorción de la energía radiante en las regiones espectrales del visible y del ultravioleta, depende principalmente del número de 85 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II arreglos de los electrones de las moléculas o iones absorbentes. En sustancias inorgánicas se presenta una absorción selectiva, cuando un nivel energético electrónico incompleto se halla cubierto o sobrepuesto por un nivel de energía completo, normalmente formado por valencias de coordinación con otros átomos. En las moléculas orgánicas la absorción selectiva está relacionada con la localización de los electrones en la molécula. Los compuestos completamente saturados no muestran una absorción selectiva en las regiones del visible y en las accesibles del ultravioleta lejano. Las dobles ligaduras conjugadas producen absorción con mayores longitudes de onda. Si la molécula es muy grande, la absorción entrará en la región del visible y presentará color, tal como sucede con la molécula del (3 caroteno (Ewing, 1979). Objetivo El alumno aprenderá a utilizar un espectrofotómetro (Spectronic 20) y a implementar una metodología para la cuantificación de compuestos que absorben la luz en la región del visible. Materiales y reactivos Espectrofotómetro Spectronic 20 2 celdas para el espectro 3 matraces aforados 100 mi 5 matraces volumétricos de 25 mi 3 vasos de precipitados de 100 mi 3 pipetas graduadas de 5 mi Vidrio de reloj Agitador de vidrio Balanza analítica Espátula Piseta con agua destilada NH4Fe(SO4)2*12H2O H2SO4 concentrado 1,10-fenantrolina CH3COONa 86 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Desarrollo de un método espectrofotométrico Normas de seguridad Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1. Para preparar soluciones diluidas de ácido sulfúrico es recomendable: a) Enfriar el recipiente que contenga agua en un baño de hielo. b) Agregar el ácido al agua en porciones pequeñas, dejando que éste resbale por la pared del recipiente. c) Agitar después de cada adición de ácido regresando el recipiente al baño de hielo. Procedimiento 1. Metodología para encontrar la longitud de máxima absorbancia del complejo hierro-fenantrolina: se obtiene haciendo un barrido en la región del espectro de 400 a 620 nm. Preparación de disoluciones: • Disolución estándar del hierro (III). Preparar 100 mi de disolución 1.8 x 10-3MdeNH4Fe(SO4)2 • 12H2O en disolución de H2SO4 0.1 N. • Disolución de 1,10-fenantrolina alO.l % (p/p) en agua. Preparar 100 ml • Acetato de sodio 2 M. Preparar 100 ml. • Coloque 5 ml de disolución estándar de Fe (III) en un matraz volumétrico de 100 ml. Adicione 10 ml de disolución de acetato de sodio para mantener el pH entre 3 y 5. Verifique con papel pH. Adicione 10 ml de 1, 10-fenantrolina y diluya hasta la marca de aforo con agua destilada. Deje transcurrir 10 minutos para que se desarrolle el color rojo anaranjado. • Mida la absorbancia a intervalos de 10 nm, de 400 a 620 nm. En cada longitud de onda ajuste la transmitancia a cero y cien porciento, use un blanco que contenga acetato de sodio y 1,10-fenantrolina. 87 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II 2. La preparación de una curva de calibración con disoluciones de concentración conocida permite verificar si la ley de Lambert y Beer se cumple en el intervalo de trabajo. • Curva estándar. Prepare en matraces volumétricos de 25 mi una serie de disoluciones que contengan 1,2,3,4 y 5 mi de la disolución estándar de Fe (III). Agregue 10 mi de disolución de acetato de sodio, 10 mi de 1,10-fenantrolina y diluya hasta la marca con agua destilada. Mídase la absorbancia de estas disoluciones en la longitud de onda seleccionada. 3. Además se requiere conocer si hay interferencias entre los reactivos, si las reacciones involucradas son estables en las condiciones de trabajo y si hay reproducibilidad en los resultados experimentales. • Solicite al profesor una muestra problema de Fe (III) y mida la absorbancia. Realice por triplicado la determinación. Tratamiento de datos experimentales Con los resultados del punto 1, construya una gráfica de longitud de onda en función de la absorbancia. Determine la longitud de onda de máxima absorbancia para el complejo 1,10-fenantrolina de hierro (III) que ha de emplearse. Muestre al profesor de laboratorio la longitud de onda seleccionada, antes de proceder al análisis cuantitativo. Construya una gráfica de la absorbancia en función de la concentración (moles/1). Compruebe en qué intervalo la ley de Lambert y Beer se cumple. Determine la concentración de la muestra problema y exprésela en molaridadyenppm. Calcule el coeficiente de extinción molar del complejo colorido. Calcule la cantidad de mM por mi necesarios para dar una absorbancia de 1.0. 88 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Desarrollo de un método espectrofotométrico Cuestionario i. Explique cuáles son las desviaciones que pueden presentarse en la aplicación de la ley de Beer. 2. ¿Cuáles son los cuidados que se deben tener con las celdas del espectrofotómetro? 3. ¿Cuáles son los factores que se deben tomar en cuenta para la determinación espectrofotométrica de iones inorgánicos por formación de complejos? Una disolución de permanganato de potasio 1.28x10"4 M tiene una transmitancia de 0.5 a 525 nm, en una celda de 1.0 cm. a) ¿Qué absorbancia tiene esta disolución? b) Si la concentración fuese el doble, ¿cuál sería la absorbancia y la transmitancia? c) ¿Qué concentración correspondería a una transmitancia de 0.75 en esta celda? El cobalto (II) forma fácilmente un complejo de color azul cuando reacciona con el tiocianato. El procedimiento es el siguiente: se prepara una disolución de tres partes de acetona por una de disolución acuosa al 50% de NH4SCN. Esta disolución se agrega a un matraz que contiene Co (II), el complejo resultante es de color azul intenso. Se prepararon las siguientes disoluciones y se efectuó la lectura a 620 nm: Co, ppm A 3.0 0.10 6.0 0.21 9.0 0.32 12.0 0.42 89 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Se tomaron 4.0 mi del líquido que salía de una columna de separación y se diluyeron hasta 100 mi con acetona y NH4SCN. La absorbancia medida a 620 nm fue de 0.25. ¿Cuál fue la concentración del cobalto, en ppm, en el matraz de 100 mi que contenía la muestra? 6. Se tienen 20 mi de disolución con 3.0 mg de hierro (II) formando un complejo con la 1,10-fenantrolina. La absorbancia de la disolución es de 0.45 en una celda de 1 cm a 515 nm. Calcule el % de Ty el coeficiente de extinción molar del complejo. 90 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 6 Determinación por espectrofotometría de la concentración de cobalto y níquel en una mezcla Introducción Frecuentemente es preciso analizar mezclas de dos o más sustancias. A veces es posible hacerlo a través de determinaciones espectrofotométricas simultáneas, en lugar de efectuar las separaciones físicas o químicas necesarias para analizar los componentes puros por separado. Se conocen varios métodos para determinar las concentraciones de sistemas con dos o más compuestos, el más conocido requiere de establecer los picos de absorción de cada componente y que cada uno de ellos se encuentre prácticamente libre de absorciones de los otros compuestos, además, se debe considerar que las absorbancias de cada uno son aditivas. Existe otro método para sistemas en los cuales las curvas de absorción se traslapan, de manera que requieren un barrido de las dos longitudes de onda. En este caso de debe utilizar la metodología propuesta por Blanco et al. (1989), en la cual se establece una correlación lineal que permite con base en la pendiente y la ordenada al origen conocer las concentraciones de mezclas binarias. En esta práctica se utilizará el primer método para casos en que las longitudes de onda de máxima absorbancia no se traslapan. En la determinación de la concentración de dos (o más) sustancias hay que tener cuidado, ya que los pequeños errores experimentales se suman rápidamente. Un error en la lectura de absorbancia en una longitud de onda puede disminuir la precisión en el resultado final. 91 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Objetivo El alumno aplicará sus conocimientos sobre espectrofotometría para la cuantificación de una mezcla de dos compuestos. Materiales y reactivos Espectrofotómetro Spectronic 20 2 celdas para el espectro 2 matraces aforados 100 mi 2 matraces volumétricos de 25 mi 2 vasos de precipitados de 100 mi 2 pipetas graduadas de 5 mi Vidrio de reloj Agitador de vidrio Balanza analítica Espátula Piseta con agua destilada Co(NO3)2 • 6 H2O Ni(NO3)2 •6H 2 O Normas de seguridad Tome en cuenta el apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1. Procedimiento 1. Preparar las siguientes disoluciones: a) 100 mi de Co(NO3)2 • 6 H2O 0.09 M. b) 100 mi deNi(NO3)2 • 6 H2O 0.09 M. 92 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Determinación de la concentración de cobalto y níquel en una mezcla 2. 3. 4. Verificar que las longitudes de onda de máxima absorbancia no se sobrepongan, haciendo un barrido de ± 50 nm, de 10 en 10 nm, para cada valor. El Co(NO3)2 tiene un máximo de absorción en 510 nm y el Ni(NO3 )2 lo tiene en 395 nm. Medir la transmitancia del nitrato de cobalto y del nitrato de níquel en 510y395nm. Medir la absorbancia de una mezcla problema en 510 y 395 nm. Tratamiento de datos experimentales A partir de los porcientos de transmitancia calcule los valores de absorbancia para cada longitud de onda. Si se hacen varias determinaciones, tome el promedio. Con estos datos calcule los coeficientes de extinción molar de los dos iones en las dos diferentes longitudes de onda. Calcule la concentración molar de cada componente. Para obtener mejores resultados efectúe los cálculos conservando tres cifras después del punto decimal. Reporte los resultados en molaridad y en mg de Ni/ml y mg de Co/ml. Cuestionario 1. ¿Qué diferencia existe entre la fuente de radiación de los espectrofotómetros de la región ultravioleta y los de la región visible? 2. Calcule la concentración de cada uno de los colorantes en la siguiente mezcla analizada por espectrofotometría. Una disolución 0.02 M de un colorante rojo produce una absorbancia de 0.8 a 515 nm y de 0.15 a 635 nm. Una disolución 0.03 M de un segundo colorante azul tiene una absorbancia de 0.2 a 515 nm y de 1.0 a 635 nm. Una mezcla de ambos colorantes dio una absorbancia de 0.55 y 0.825 a 515 y 635 nm, respectivamente. 93 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Calcule la concentración de una disolución que contiene Fe (III), a partir de la siguiente técnica: A un mi de disolución con hierro se le adicionan acetona, disolución de tiocianato de amonio y agua hasta 100 mi. La determinación se lleva a cabo con una celda de 2 cm. La absorbancia en 480 nm fue de 0.75. El coeficiente de extinción molar fue de 14 000. Una disolución que contiene una mezcla de AMP y GMP da una absorbancia de 0.621 en 260 nm y de 0.214 en 280 nm. Calcule la concentración de AMP y GMP, si los coeficientes de absorción molar (en litros mol"1 cm"1) en estas longitudes de onda son: AMP GMP 260 nm 0.0154 280 nm 0.0025 260 nm 0.0117 280 nm 0.077 AMP = Adenosin mono fosfato GMP= Glucosa mono fosfato Las medidas fueron hechas con una celda de 1 cm de longitud de paso óptico. 94 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Espectrofotometría II. TURBIDIMETRIA El método turbidimétrico se fundamenta en el fenómeno de que la luz, al pasar a través de un medio con partículas dispersas, con un índice de refracción diferente al del medio, disminuye su intensidad debido a la dispersión. Instrumentalmente se detecta la intensidad de la luz transmitida por el medio, o sea, la luz no dispersada. La turbidimetría es muy similar a la colorimetría, en cuanto que ambas se basan en la medición de la luz transmitida por un medio y emplean aparatos similares. La intensidad de la luz que se dispersa en cualquier ángulo es función de la concentración de las partículas dispersantes, de su tamaño y forma, de la longitud de onda y de la diferencia entre los índices de refracción de las partículas y el medio. La dispersión total de un determinado número de partículas (suponiendo que no haya interacciones de dispersión múltiple), está dada por la suma de las dispersiones individuales, mientras que la absorbancia del sistema es directamente proporcional a la concentración de partículas (Willard, 1974). Es importante tomar en cuenta que la relación entre la intensidad de la luz dispersa y la concentración no es simple, por lo que este tipo de determinaciones deben tener un carácter empírico. La luz no es realmente absorbida por la disolución, sino que se dispersa en todas direcciones y no llega al detector. La absorción aparente o turbidancia obedece a una ecuación análoga a la ley de Beer en un intervalo limitado de concentraciones. = kbc "A " es la absorbancia aparente o turbidancia (Ewing, 1978, utiliza la letra S como símbolo de turbidancia) Po es la potencia radiante del haz de luz incidente P es la potencia del haz de luz emergente k es una constante b es el recorrido del haz de luz en la celda c es la concentración de la disolución 95 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II El valor de k se determina empíricamente con una serie de patrones (Harris, 1992). Esta ecuación es válida sólo para suspensiones muy diluidas, porque a medida que la concentración aumenta, una mayor proporción de la luz dispersa encuentra su camino hacia la fotocelda de medida a través de una dispersión múltiple (Ewing, 1978). La ecuación de la absorbancia aparente se puede transformar en: UT » _ P _ - rb "T" es la transmitancia de la disolución turbia T es el coeficiente de turbidez y es igual a 2.303 k. Prácticamente cualquier espectrofotómetro puede utilizarse en turbidimetría: se mide la fracción de la luz dispersada (la transmitancia), la cual es independiente de la intensidad de la fuente luminosa. La turbidimetría aplicada a titulaciones no es muy precisa, debido a que la detección del punto final depende del tamaño de las partículas. Sin embargo, la sensibilidad es muy buena, por ejemplo, los sulfates pueden determinarse hasta el orden de partes por millón. En cuanto a la selección de la longitud de onda, ésta no es crítica; sin embargo, si la disolución a trabajar contiene un soluto colorido, además del componente turbio, es preferible escoger una región de longitudes de onda de mínima absorción. En cambio, si el componente turbio es el que absorbe, deberá trabajarse en la región donde se presente la longitud de onda de máxima absorbancia. 96 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 7 Cuantificación turbidimétrica de sulfatos Introducción La aplicación de técnicas turbidimétricas es amplia, aunque en los últimos años ha sido desplazada por la aplicación de otros métodos instrumentales más sensibles. Actualmente aún existen procedimientos en el área de farmacia y alimentos que la siguen utilizando. Por ejemplo, en la industria de vinos y también en la de aguardientes la transparencia y brillantez son características importantes de la calidad de estos productos. La presencia de materiales suspendidos, aun en cantidades tan pequeñas que resultan invisibles al embotellar, producirán un sedimento visible y desagradable después de cierto tiempo. La calidad de las aguas para procesos industriales y la transparencia del agua para la alimentación de calderas, son otros ejemplos típicos de aplicaciones comunes. Hay técnicas donde la turbidez en la muestra se desarrolla en condiciones controladas. La reacción de precipitación debe efectuarse con rapidez y las partículas formadas deben ser de baja solubilidad y de tamaño pequeño. La adición de agentes tensoactivos o de coloides protectores es útil, ya que favorece el tamaño de las partículas, promueve la nucleación a expensas del crecimiento de los cristales y aumenta lareproducibilidad de la técnica. Se pueden presentar problemas con la exactitud del método, pues se encuentra limitado por la falta de reproducibilidad de la forma física del precipitado o, una vez formado, por la inestabilidad del mismo. 97 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Objetivo El alumno utilizará una técnica turbidimétricapara la cuantificación de una muestra problema de sulfates. Materiales y reactivos Espectrofotómetro Spectronic 20 2 celdas para el espectro Matraz aforado de 500 mi Matraz aforado de 200 mi 4 matraces aforados de 250 mi 4 matraces Erlenmeyer de 500 mi 2 vasos de precipitados de 100 mi 2 pipetas graduadas de 5 mi Vidrio de reloj Agitador de vidrio Balanza analítica Espátula Piseta con agua destilada Na2SO4 NaCl HC12M BaCL Normas de seguridad Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1. Para preparar soluciones diluidas de ácido clorhídrico es recomendable hacerlo en la campana de extracción. 98 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Cuantifícación turbidimétrica de sulfatos Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. Disolución estándar de sulfatos. Prepare 500 mi de sulfato de sodio anhidro con 200 ppm. Disolución de NaCl al 20 % (p/p) en HCl 2 M. Prepare 200 mi. Prepare 4 disoluciones de 250 mi, con las siguientes concentraciones, para elaborar la curva patrón: 25, 50, lOOy 150ppm. Agregue 25 mi de la disolución de NaCl en HCl 2 M a cada dilución, antes de llevar a la marca de aforo. Trasvase cada una de las diluciones a un matraz Erlenmeyer de 5 00 mi y adicione 1.0 g de BaCl2 a cada sistema. Agite muy bien y mida la transmitancia, utilizando como blanco la disolución patrón a 3 5 5 nm. Solicite al profesor del laboratorio una muestra problema y mida su transmitancia. Tratamiento de datos experimentales Trace la gráfica de transmitancia en función de la concentración (mg/1). Interpole el dato de transmitancia en la gráfica y determine la concentración de la muestra problema. Cuestionario 1. ¿Cuál es la diferencia entre una determinación turbidimétrica y una efectuada por nefelometría? 2. Investigue dos aplicaciones directas de la turbidimetría dentro de algún proceso de elaboración o de control de calidad de interés para usted. 3. Para medir la cantidad defluoruroen una muestra de agua de una ciudad, se utilizaron dos litros de agua a la cual se le adicionaron 0.5 g de nitrato 99 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II de calcio. Se agitó y la disolución se evaporó hasta 150 mi. Se midió la transmitancia resultando de 55 %. La tabla muestra las concentraciones utilizadas en la curva patrón y los datos de transmitancia obtenidos. Calcule usted la concentración del fluoruro del agua citadina. Concentración ppm "A" 12 0.04 25 0.10 50 0.30 110 0.52 100 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Bibliografía Bibliografía Blanco, M. et al 1989. "A Simple Method for Spectrophotometric Determination of Two-Components with Overlapped Spectra". J. Chem. Educ. 66:178-180. Bosh-Reig, F. etal 1991. "Development of the H-point Standar-Aditions Method for Ultraviolet Visible Spectroscopic Kinetic Analysis of TwoComponents System". Anal Chem. 63:2424-2429. Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa, México. Cope, V. W. 1978. "Determination of the Performance Parameters of Spectrophotometer, and Advanced Analytical Experiment". J. Chem. Educ. 55:680-681. Dean, J. A. 1989. Manual de química. Tomo IV: Espectroscopia. Me Graw Hill, México. Espectrofotometría UV-visible. 1983. Servicios Centrales de Instrumentación y Laboratorios, S. A., México. Ewing, G. W. 1979. Métodos instrumentales de análisis químicos. Ed. Me Graw Hill, México. García, V. Y. M. 1988. Equilibrio químico aplicado a la química analítica. Ed. Diana, México. Hughes, H. A. et al 1952. "Suggested Nomenclature in Applied Spectroscopy". Anal Chem. 24: 1349-1354. Koltoff, I. M. y E. B. Sandel. 1969. Quantitative Chemical Analysis. The Macmillan Company, USA. 101 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Liebhafsky, H. A. y H. G. Pfeiffer. 1953.J. Chem. Educ. 30:450. Lykos, P. 1992. "The Beer-Lambert Law Revisited a Development Without Calculus"../ Chem. Educ. 69: 730-732. Meloan, C. F. y R. M. Kiser. 1973. Problemas y experimentos en análisis instrumental. Ed. Reverte, México. Operator 's Manual. 1987. Spectronic 20 Series. Spectrophotometers Milton Roy, USA. Pecsok, R. L. 1973. Métodos modernos de análisis químico. Experimentos. Ed. Limusa, México. Pecsok, R. L. y L. D. Shields. 1987. Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa, México. Watty, M. B. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra, México. Willard, H. H. et al. 1981. Métodos instrumentales de análisis. Ed. Cecsa, México. 102 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Capítulo 4 MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Introducción Los métodos electroquímicos abarcan una amplia variedad de técnicas, basadas en los diferentes fenómenos que se llevan a cabo dentro de una celda electroquímica. Todas las mediciones eléctricas básicas, como la corriente, las resistencias y el voltaje, se han empleado solas o en combinación para propósitos analíticos. Los métodos electroquímicos se clasifican en: 1. 2. 3. 4. 5. Potenciometría. Utiliza de manera directa la ecuación de Nernst, midiendo el potencial de los electrodos no polarizados bajo condiciones de corriente igual a cero (sin aplicación de corriente). Voltametría y polarografia. Estos métodos se usan para estudiar la composición de disoluciones electrolíticas diluidas utilizando curvas de corriente-voltaje. La polarografia se refiere a las aplicaciones del electrodo de goteo de mercurio. Conductimetría. Se emplean dos electrodos inertes idénticos, y se mide el recíproco de la resistencia que es la conductancia. Cronopotenciometría. En esta técnica se hace pasar una corriente conocida a través de la disolución y se registra el potencial de los electrodos en función del tiempo. Coulombimetría. Involucra dos técnicas: a) La coulombimetría de corriente constante, que mantiene una corriente de este tipo durante todo el período de la reacción. En este caso se debe agregar un exceso de un regulador de oxidorreducción para que el potencial no aumente a un valor que permita la realización de otra reacción no deseada, b) Las separaciones de potencial controlado o electrogravimetría. Se pueden lograr separaciones cuantitativas por medio de una oxidación o reducción electrolítica y medir la sustancia separada por coulombimetría o gravimetría: se mantiene un potencial de electrodo constante y se detecta en forma continua el potencial del electrodo de trabajo en comparación con un electrodo de referencia. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Los métodos de cronopotenciometría, coulombimetríay las separaciones de potencial controlado no se estudian en el curso de Química analítica II, pero si existe interés acerca de estos métodos, en la bibliografía de este capítulo se pueden encontrar referencias sobre el tema. Todos los métodos electroquímicos se caracterizan por su alto grado de selectividad y precisión. Celdas electroquímicas Existen dos tipos de celdas: la galvánica y la electrolítica. La primera es aquella en que una reacción de oxidorreducción espontánea genera una corriente eléctrica (Harris, 1992). Si se suministra energía eléctrica a una celda, con una fuente de poder, entonces recibe el nombre de celda electrolítica. Electrodos de referencia Un electrodo de referencia tiene un potencial conocido y constante, están constituidos por una hemicelda interna de referencia, que puede ser de plata, cloruro de plata o de calomel (cada uno de ellos con su respectivo valor de potencial estándar); tienen un electrólito de puente salino y un pequeño canal en la punta del electrodo, a través del cual fluye muy lentamente el electrólito, permitiendo el contacto con los otros componentes de la celda. Electrodos de calomel Tienen un elemento no atacable, como el platino, el cual está en contacto con mercurio, cloruro mercuroso (calomel) y con una disolución neutra de cloruro de potasio (de concentración conocida) que se encuentra saturada con calomel. 106 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Métodos electroquímicos HgCUs) 2Hg(\) + 2CI- Existen tres versiones de este electrodo: el electrodo de calomel saturado (ECS), en donde la disolución de KCl es 4.2 N (figura 4.1), y los electrodos que tienen 1.0 N o 0.1 N de la disolución de KCl. Estos últimos se prefieren porque alcanzan sus potenciales de equilibrio más rápidamente y porque dependen menos de la temperatura que el de tipo saturado. Los valores para estos tres electrodos a 30 °C son: Electrodo de calomel saturado (ECS) = 0.241 V Electrodo de calomel normal (ECN) = 0.280 V Electrodo de calomel décimo normal = 0.335 V Si requiere mayor información sobre los valores de potencial de los electrodos de referencia, consulte el Lange s Handbook ofChemistry o el Handbook Analytical Chemistry Figura 4.1 Electrodo de referencia de calomel saturado. 107 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Electrodos de plata-cloruro de plata El electrodo contiene un alambre de plata recubierto con una capa de cloruro de plata y sumergido en una disolución de cloruro de potasio (de concentración conocida), la cual también está saturada con cloruro de plata. AgCl (s) + e~ 4 Ag (s) + Cl- E° = 0.222 V E (saturado con KC1) = 0.197 V Electrodo de vidrio combinado de pH Es el más utilizado en el análisis químico cuantitativo, y está clasificado entre los electrodos selectivos de iones. En la parte interna del electrodo de vidrio hay un alambre de plata con un extremo sumergido en una disolución de HC10.1 M (figura 4.2). El bulbo de la parte inferior del electrodo está fabricado con un vidrio de composición especial. La superficie interior de esta membrana de vidrio está en contacto con la disolución de HC10.1 M, y la superficie externa, con la disolución cuyo pH se va a determinar. En las dos superficies la membrana de vidrio absorbe agua, formando una capa de gel. La zona del electrodo que responde a las variaciones de pH es la membrana delgada de constitución y construcción especial, ya que presenta una red de silicato con átomos de oxígeno cargados negativamente, los cuales se encuentran disponibles para coordinarse con cationes monovalentes, en particular el Na+. Esta membrana tiene un espesor aproximado de 0.1 mm. En estudios realizados con tritio (3H) como trazador radioactivo, se ha demostrado que los iones hidrógeno no atraviesan la membrana de vidrio del electrodo de pH. Las dos caras de la membrana están en equilibrio con H+, y los iones Na+ transportan las cargas a través de la membrana. La diferencia de potencial entre los electrodos de plata, cloruro de plata interno y externo depende de la concentración del ion cloruro en el compartimento de cada electrodo, así como de la diferencia de potencial que existe entre las caras de la membrana. 108 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Métodos electroquímicos Como la concentración del cloruro es constante en cada compartimento, y la concentración de H+ es fija en la parte interna de la membrana de vidrio, el único factor que provoca un cambio en la diferencia de potencial es la variación del pH de la disolución del analito en la parte externa de la membrana del electrodo (Harris, 1992). Un electrodo combinado de vidrio llega a responder en forma muy cercana a lo indicado por la ecuación de Nernst. Es por esto que cada cambio de una unidad de pH en un analito da como resultado un cambio de potencial de 59.16mV. Unión reemplazable Electrodo de Ag Protección de la membrana de vidrio \ Membrana d e vidrio Figura 4.2 Vista parcial de un electrodo de vidrio combinado. Calibración del electrodo de vidrio Un electrodo de pH debe calibrarse antes de ser utilizado. Para ello existen en el mercado muchas disoluciones patrón de pH. Se recomienda calibrar el electrodo y el potenciómetro con una disolución reguladora o de preferencia con dos, seleccionadas de manera que el pH del problema se sitúe dentro del intervalo de las disoluciones patrón. El procedimiento de calibración de cada potenciómetro puede variar con la marca y el modelo, por lo que es recomendable la lectura de los instructivos de cada aparato en particular. 109 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II A continuación se describe el uso y manejo del potenciómetro, se explica como calibrar en dos puntos el medidor de pH Conductronic modelo 20 y el potenciómetro de campo, Conductronic 10, modelo muy abundante en los laboratorios de docencia de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Operación del potenciómetro Conductronic modelo 20 o modelo 10 Descripción 1. 2. 3. 4. El o los electrodos se enjuagan con agua destilada y se secan suavemente con papel absorbente. Cuide de no frotar el electrodo (sobre todo si el cuerpo es de vidrio) porque esto produce electricidad estática en la superficie del vidrio. Medir la temperatura de la disolución cuyo pH se desea conocer y ajustar el dato en el potenciómetro con el botón correspondiente. Sumergir el electrodo en una disolución reguladora de pH 7 y dejar que alcance su equilibrio (entre 30 y 60 segundos). Se ajusta el aparato al valor de pH de la disolución amortiguadora. Para realizar una lectura correcta, el electrodo de vidrio se debe sumergir en una disolución de pH desconocido hasta una profundidad tal que la unión reemplazable (figura 4.2), situada en la parte inferior, se encuentre por debajo del nivel del líquido. Esto permite que los dos electrodos de plata midan la diferencia del potencial entre las caras interna y externa de la membrana de vidrio. Colocar el selector de funciones del potenciómetro en standby y sacar el electrodo de la disolución, enjuagándolo con agua destilada; secarlo y sumergirlo en una segunda disolución amortiguadora de pH diferente (si se trabaja en intervalos ácidos, la segunda disolución puede ser de pH 4, si es en la zona básica, el amortiguador puede ser de pH 10). Se vuelve a mover el selector de funciones del potenciómetro de standby a pH y se hace la lectura. Si el electrodo responde siguiendo la ecuación 110 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Métodos electroquímicos de Nernst, el potencial debe variar en 0.05916 V por cada unidad de pH a 25 °C. Si el valor de pH de esta segunda solución no coincide con la lectura, ésta se ajusta con el botón de temperatura. Los modelos Conductronic 20 digitales tienen un tercer botón de "pendiente", ajuste con él. Cuidados Cuando el electrodo no se usa se debe guardar en una disolución acuosa, de manera que la capa del gel hidratado no se seque. Si el electrodo ya está seco, se reactiva sumergiéndolo en agua durante varias horas. Los electrodos de vidrio se desgastan poco a poco, además de ensuciarse fácilmente con el mal uso, esto hace que la composición del vidrio cambie, provocando que la respuesta del electrodo se vuelva lenta o errónea; cuando el problema ya es muy grave, ni siquiera se puede estandarizar. Si esto sucede se recomienda un lavado con HC16 M y luego enjuagar con agua destilada. Si el lavado no funciona, reporte el electrodo con su profesor o a la Coordinación de Laboratorios para que procedan a un lavado más riguroso con bifluoruro de amonio, NH4HF2, al 20 % p/p. Precaución: este compuesto provoca quemaduras en la piel y disuelve el vidrio, por lo que se debe preparar en vaso de precipitados de plástico (Nalgen). El electrodo se sumerge en la disolución durante un minuto, disolviendo un poco de la membrana de vidrio y exponiendo una superficie nueva. Enseguida se enjuaga el electrodo con abundante agua destilada y se calibra nuevamente (Harris, 1992). 111 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 8 Determinación potenciométrica de constantes de ionización Introducción El método potenciométrico consiste en la medición de la diferencia de potencial entre el electrodo indicador y el electrodo de referencia, en diferentes intervalos, durante el transcurso de una valoración. Un potencial de electrodo corresponde aun proceso de equilibrio y durante su medición no debe alterarse, porque de otro modo el potencial obtenido será incorrecto. Los dos tipos principales de electrodos usados en el trabajo potenciométrico son: a) b) De referencia: Su potencial no se afecta al cambiar la composición de la disolución que se estudia. Indicador o de medición: Su potencial depende de la concentración de uno de los iones en la disolución. Aunque se dispone de innumerables sistemas de electrodos, se recomiendan los descritos en la tabla 4.1, porque proporcionan el mayor intervalo de utilidad (Meloan,1973). Objetivo El alumno aprenderá la instalación y el uso de una celda para la determinación potenciométrica de las constantes de ionización. 113 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Tabla 4.1 Electrodos de referencia y medición. Sistema Referencia Indicador Ácido base acuoso Calomel Vidrio Ácido base no acuoso Ag-AgCI Vidrio Red-ox orgánico Ni Pt Red-ox inorgánico W Pt Precipitación, ion Ag Hg 2 so 4 Ag Precipitación metales pesados Calomel Metal pesado Materiales y reactivos Potenciómetro Electrodo combinado de vidrio para medir pH 2 matraces aforados de 100 mi 4 vasos de precipitados de 100 mi Pipeta volumétrica de 20 mi Piseta con agua destilada Vidrio de reloj Espátula Balanza analítica Agitador de vidrio Bureta de 50 mi Soporte universal Pinzas para bureta Parrilla con agitación magnética Agitador magnético Ácido tartárico NaOH Disolución amortiguadora de pH 4 y 7 114 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Determinación potenciométrica de constantes de ionización Normas de seguridad Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1. Para el manejo del NaOH es necesario el uso de lentes de seguridad y guantes de neopreno, nitrilo o vinilo. Siempre debe manejarse en la campana y no deben utilizarse lentes de contacto al trabajar con este compuesto. Recuerde que es irritante y corrosivo y que puede causar daño al tracto respiratorio, piel y ojos. Procedimiento 1. Prepare las siguientes disoluciones: • 100 mi de ácido tartárico 0.1 M. • 100 mi de hidróxido de sodio 0.1 M, estandarizado. 2. 3. 4. Calibre el medidor de pH, provisto del electrodo combinado de vidrio, con las dos disoluciones amortiguadoras. Retire y lave muy bien los electrodos con agua destilada. Vierta 20 mi del ácido tartárico en un vaso de 100 mi y añada 3 0 mi de agua destilada. Sumerja el electrodo en la disolución y ajuste la agitación con una barra magnéticay una parrilla con agitación magnética, de manera que no golpee los electrodos. Con una bureta agregue disolución de NaOH en proporciones de 1 mi, salvo cerca del punto de equivalencia, donde se han de agregar porciones de 0.1 mi. Mida el pH después de cada adición de sosa y realice la determinación por triplicado. 115 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Tratamiento de datos experimentales Trace la gráfica de los valores de pH en función de los mi de NaOH. Con base en el pH de cada punto de equivalencia, obtenido gráficamente, calcule Kax y Ka2 para el ácido tartárico y compare con los valores reportados en la literatura. Explique cualquier diferencia que pueda encontrarse. Cuestionario 1. ¿Qué características debe tener un electrodo para que pueda utilizarse como electrodo indicador en un potenciómetro? 2. ¿Qué son los electrodos de referencia? 3. ¿Qué es una celda galvánica y cómo se representa? 4. Una celda preparada de la siguiente manera: Pt, H2(l atm), HA (0.15 M) // KC1 sat, Hg2Cl2, Hg, dio un potencial de 0.575 v. Calcular la constante de ionización del ácido. 116 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Práctica 9 Titulación potenciométrica del ferrocianuro con cerio Introducción El curso de la reacción de titulación potenciométrica se sigue, midiendo con un potenciómetro la concentración de una o de varias especies. En esta práctica se estudia la titulación del Fe (II) con el Ce (IV), en donde la variación de las concentraciones durante la titulación es la siguiente: Fe2+ + Ce4+ » Fe3+ + Ce3+ Inicio Co Agregado XCo A.P.E. Co(l-X) eCo XCo XCo P.Eq. sCo eCo Co Co D.P.E. sCo Co(X-l) Co Co A.P.E. antes del punto de equivalencia P. Eq. punto de equivalencia D.P.E. después del punto de equivalencia s valor pequeño de concentración debido al equilibrio reversible Co concentración inicial de [Fe2+] X relación de la concentración del [Fe2+]/[Ce3+] 117 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II En el inicio sólo se tiene Fe2+, de manera que el valor de potencial no se puede calcular teóricamente. Antes del punto de equivalencia (A.P.E.) se encuentran las cuatro especies (Fe2+? Ce4+, Fe3+, Ce3+), y aunque la cantidad de Ce4+ es muy pequeña, el valor de potencial se puede medir en estos puntos utilizando la ecuación de Nernst y el par: Fe 37Fe2+. En el punto de equivalencia (P. Eq.) los reactivos se terminan y el valor del potencial está dado por la ecuación: E= Después del punto de equivalencia (D.P.E.), la especie que impone el valor del potencial es el reactivo titulante Ce 47Ce3+. Métodos para determinar el punto de equivalencia Existen varios métodos para la determinación del punto de equivalencia, se describen los tres más utilizados: 1. 2. El método más simple se aplica principalmente a las valoraciones de ácidos y bases fuertes, donde hay cambios muy grandes de pH en el punto final. Se traza la gráfica de pH en función de los mililitros de disolución valorante, como se muestra en la figura 4.3, se escoge el punto medio en el pH como punto de equivalencia y finalmente se baja una línea perpendicular a la línea base. El punto de intersección con ésta es el volumen gastado. Método de la primera derivada: Este segundo método es más preciso y es aplicable en todos los casos de neutralización. Se traza la gráfica de los valores de ApH/Aml, en función de los mi de disolución valorante. Se obtiene una curva como la que se muestra en la figura 4.4. 118 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Titulación potenciométrica del ferrocianuro con cerio pH 1 H /! 11 /i / | 'j mi de disolución valorante Figura 4.3 Método gráfico para obtener el volumen en el punto de equivalencia. ApH Aml mi de disolución valorante Figura 4.4 Método de la primera derivada. 119 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Método de la segunda derivada: Consiste en trazar la gráfica de los valores de A2pH/A2ml en función de los mi de valorante, como se observa en la figura 4.5. El punto de equivalencia en la segunda derivada es numéricamente igual a cero, pues el valor de la ordenada pasa con gran rapidez de un número positivo a uno negativo (Willard, 1981). A 2 pH A 2 ml mi de disolución valorante Figura 4.5 Método de la segunda derivada. Objetivo El alumno efectuará una titulación potenciométrica redox, para el estudio experimental de la curva de valoración del ferrocianuro de potasio con nitrato cérico amoniacal. 120 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Titulación potenciométrica del ferrocianuro con cerio Materiales y reactivos Potenciómetro Electrodo de vidrio para medir pH Electrodo de referencia de calomel normal 3 matraces aforados de 100 mi 3 vasos de precipitados de 100 mi Pipeta volumétrica de 20 mi Piseta con agua destilada Vidrio de reloj Espátula Balanza analítica Agitador de vidrio Bureta de 50 mi Soporte universal Pinzas para bureta Parrilla con agitación magnética Agitador magnético Ferrocianuro de potasio trihidratado Nitrato cérico amoniacal HCl concentrado Disolución reguladora pH 4 Disolución reguladora pH 7 Normas de seguridad Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1. Para el manejo del HCl es necesario el uso de lentes de seguridad y de guantes de neopreno. Siempre debe manej arse en la campana y no deben utilizarse lentes de contacto al trabajar con este compuesto. Recuerde que es irritante, corrosivo y que puede causar daño al tracto respiratorio, piel y ojos. 121 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Procedimiento 1. Prepare las siguientes disoluciones: • 100 mi de ferrocianuro de potasio trihidratado 0.1 M. • 100 mi de nitrato cérico amoniacal 0.1 M en HCl 1 M. • lOOmldeHCllM. 2. 3. 4. Empleando el aparato de la figura 4.6, instale su sistema de titulación. Calibre el potenciómetro. Vierta 20 mi de disolución de ferrocianuro de potasio en un vaso de precipitados de 100 mi. Agregue 20 mi de HCl 1 M, para cubrir los electrodos. Titule con la disolución de cerio con adiciones de 1 mi hasta cerca del punto final, alrededor del cual deberán hacerse adiciones de 0.1 mi. Efectúe la titulación por triplicado. Potenciómetrro Electrodo indicador Electrodo de calomel saturado Figura 4.6 Titulación potenciométrica. 122 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Titulación potenciométrica del ferrocianuro con cerio Tratamiento de datos experimentales Trace las gráficas de: a) Potencial (E, V) en función de los mi de disolución de cerio. b) La primera derivada en función de los mi de disolución de cerio. c) La segunda derivada en función de los mi de disolución de cerio. Con base en los resultados calcule la concentración del hierro (II). Utilizando las gráficas, encuentre el punto de equivalencia empleando el método de la segunda derivada. Cuestionario 1. Enumere las condiciones experimentales que se requieren para la titulación potenciométrica del vanadio (II) con permanganato de potasio. 2. Investigue cómo se representa una celda galvánica para la siguiente reacción, según la IUPAC: Sn4+ + Fe2+ » Sn2++ Fe3+ en concentraciones Sn4+ 0.2 M y Fe2+ 0.2 M. 3. Se titulan 50 mi deFe 2+ 0.12 M con una disolución de Ce 4+ 0.12 M. La titulación se efectúa potenciométricamente con electrodos de platino y calomel saturado. Con base en los siguientes datos, encuentre el volumen en el punto de equivalencia, empleando una gráfica de equivalencia contra el volumen del titulante, una gráfica de la primera derivada y una gráfica de la segunda derivada. 123 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II V mi de Ce adicionado E(v) 12.5 0.496 25.0 0.524 37.5 0.552 45.0 0.58 47.5 0.559 48.5 0.613 49.5 0.641 49.55 0.644 49.7 0.655 49.8 0.665 49.9 0.683 50 0.944 50.1 1.205 50.2 1.22 50.3 1.233 50.4 1.24 50.4 1.24 51 1.263 55 1.305 62.5 1.328 75 1.346 124 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Bibliografía Bibliografía Bates, R. G. 1973. Determination ofpH. Theory andPractice. Ed. Wiley and Sons, USA. Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa,. México. Campbell, M. L. y B. A. Waite. 1990. "The Ka Valúes of Water and the Hydronium ion for Comparison with other Acids". J. Chem. Educ. Vol. 67, No. 5:386-388. Ewing, G. W. 1979. Métodos instrumentales de análisis químicos. Ed. Me GrawHill, México. García, V. Y. M. 1988. Equilibrio químico aplicado a la química analítica. Ed. Diana, México. Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Ed. Iberoamérica, México. Instrucciones de operación del medidor depH Conductronic modelo 10. 1990. Conductronic, S.A., México. Instrucciones de operación del medidor de pH Conductronic modelo 20. 1989. Conductronic, S.A., México. Koltoff, Y. M. y E. B. Sandel. 1969. Quantitative Chemical Analysis. The Macmillan Company, USA. Meites, L. (editor). 1963. HandbookofChemistry. Me Graw Hill, USA. Meloan, C. F. y R. M. Kiser. 1973. Problemas y experimentos en análisis instrumental. Ed. Reverte, México. Nakagawa, K. 1990. "Amodified Graphical Method for Acid-base Equilibria". J. Chem. Educ, Vol. 67, No. 8: 673-676. 125 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II Pecsok, R. L. y L. D. Shields. 1987, Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa, México. Satsuo, K. y K. Onoyama. 1991. "Lead-Selective Membrane Electrode using Methylene bis (diisobutyldithiocarbamate) Neutral Carrier", Anal Chem. 63:1295-1298. Stapanian, M. y R. Metcalf. 1990. "State-of-the-art pH Electrode Quality Control for Measurements of Acidic, Low Ionic Strength Waters". J. Chem. Educ. Vol. 67, No. 7: 623-626. Watty, M. B. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra, México. Willard, H. H., L. L. Merrit Jr, y J, A. Dea. 1981. Métodos instrumentales de análisis, Cecsa, México. 126 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Manual de prácticas de química analítica II se terminó de imprimir en febrero de 1999 en Grupo Gráfico. La edición consta de 1 000 ejemplares. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Alberto Reyes Dorantes estudió en la Facultad de Química de la UNAM la licenciatura de químico farmacéutico biólogo, orientación en Tecnología de Alimentos. Posteriormente realizó estudios en viticultura y enología en la Universidad Politécnica de Madrid, y estudió la maestría en Biología en la Facultad de Ciencias de la UNAM. Ingresó a la UAM-Iztapalapa en 1980 como profesor investigador de tiempo completo, y ha impartido cursos de Química de Alimentos, Análisis de Alimentos y Alimentos Fermentados. Actualmente imparte el curso de Enología en la licenciatura de Ingeniería de los Alimentos. Ha colaborado como asesor y director en proyectos de investigación para la obtención de vinos de mesa, vinos especiales y fabricación de licores. Actualmente, en colaboración con estudiantes de la licenciatura en Ingeniería de los Alimentos, se dedica a aislar, seleccionar y caracterizar cepas naturales de la familia Streptococcaceae para inducir la fermentación maloláctica en vinos tintos de la zona vinícola del estado de Zacatecas, México. Frida P. Malpica Sánchez realizó sus estudios de licenciatura en la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, División de Ciencias Básicas y de la Salud, obteniendo el título de Ingeniería en Alimentos. Comenzó como profesora-investigadora en este mismo plantel en 1993, colaborando en diferentes proyectos de investigación para la obtención de vinos de mesa y especiales y la fabricación de licores, así como en la elaboración de notas de curso de temas relacionados con la química analítica, por ejemplo: espectroscopia infrarroja, potenciometría y cromatografía líquida de alta resolución. Así mismo, ha impartido los cursos de Microbiología General y de Alimentos y Laboratorios de Química Analítica I y II, así como la materia de Enología. Ha sido responsable de convenios establecidos entre la industria privada y la UAM-I para el desarrollo de diferentes investigaciones, que además de su importancia intrínseca permiten a estudiantes o pasantes de la licenciatura realizar su servicio social, a la vez que establecen un mayor vínculo con la industria alimentaria. La licenciada Malpica imparte actualmente el laboratorio de la materia de Enología. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected] Casa abierta al tiempo Este manual va dirigido a todas las personas interesadas en conocer los principios y fundamentos del análisis instrumental. Las técnicas actuales de control de calidad se basan en gran parte en la cromatografía de gases. La industria en general requiere de personal capacitado en el manejo de cromatógrafos no sólo de gases sino también de líquidos de alta resolución. En este manual se encontrarán los fundamentos de ambas técnicas, así como prácticas para el uso del análisis cualitativo y cuantitativo en las cuales se manejan las técnicas de uso común en patrones internos y externos. En cuanto al análisis espectral, se lleva de la mano al lector para que pueda hacer un análisis completo, desde la selección de la longitud de onda de máxima absorción hasta la cuantificación de una muestra problema. En resumen, este libro puede ser utilizado por alumnos de cualquier licenciatura cuyos programas de estudio manejen la cromatografía de gases y de líquidos, la potenciometría y la espectrofotometría. Por su parte, los profesionales de la educación encontrarán en él un apoyo para manejar estos temas no sólo en la parte práctica sino también en su parte teórica, además de contar con buenas y actualizadas referencias bibliográficas. N.E. 0726 $65.00 9 789706 543639 Manl. práct. química anal. II Libros da Texto UAM-Iztapalapa Librería DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]