óxido nítrico endógeno exhalado en el recién nacido con alto riesgo

ÓXIDO NÍTRICO ENDÓGENO EXHALADO EN EL
RECIÉN NACIDO CON ALTO RIESGO DE INFECCIÓN
PERINATAL
J.Figueras Aloy, I.Jordán, J.M.Rodríguez-Miguélez, R.Jiménez
Servicio de Neonatología. Hospital Clínic. Institut Clínic de Ginecologia, Obstetricia i
Neonatología. Unitat Integrada de Pediatría. Universidad de Barcelona.
El óxido nítrico endógeno (NO) es una molécula de señalización intercelular que participa
en la regulación de una amplia variedad de funciones respiratorias y juega un papel fundamental en
la fisiopatología de distintas enfermedades(1). Los nitritos y nitratos (NOx) en sangre y orina son
sus metabolitos estables y se utilizan como marcadores de la cuantía de su síntesis endógena(2).
Fisiología del óxido nítrico
El NO endógeno se forma a partir del aminoácido L-arginina mediante la acción del enzima
NO-sintetasa (NOS), del que se han caracterizado dos isoformas constitutivas (cNOS), que se
expresan en las células endoteliales y en las neuronas, y una isoforma inducible (iNOS), que se
expresa en las células epiteliales bronquiales, los neutrófilos y los macrófagos alveolares(3). La
síntesis de NO a partir de NOS inducible puede ser estimulada por la acción de citocinas
proinflamatorias y de endotoxinas, ejerciendo una acción citostática y bactericida(1). Esta gran
variedad de acciones y mecanismos de síntesis da lugar a que el NO endógeno pueda estar
implicado en distintos procesos fisiológicos y patológicos que afectan al aparato respiratorio.
Origen del óxido nítrico exhalado
El NO exhalado (NOe) incluye al NO espirado (NO de origen broncoalveolar) y al NO nasal
residual (diferencia entre el NO nasofaríngeo autoinhalado y el reabsorbido en las vías aéreas
inferiores y alveolos).
El NO espirado es producido en varios tipos de células pulmonares, incluyendo las
inflamatorias, endoteliales y del epitelio de las vías aéreas. Parece que el NO espirado se forma
preferentemente en los bronquiolos respiratorios y terminales(4).
También se genera NO en las cavidades oral (muy escasas cantidades) y nasal (NO nasofaríngeo),
contribuyendo a que sea detectado junto con el NO espirado si la recogida del gas exhalado es a
través de la boca y nariz. Debe recordarse que el recién nacido y lactante pequeño son
preferentemente respiradores nasales. Las bacterias nasales pueden tomar parte en la síntesis del NO
nasofaríngeo(5). Según Gerlach H et al(5), en no fuma-dores se detectan las siguientes
concentraciones de NO en ppm:
Inspiración Espiración
- Boca
poco
poco
- Nasofaringe
0.109
0.079
- Tráquea
0.089
0.042
- Ventilador
0.002
0.063
- Síntesis en nasofaringe: media de 0.649 ppm
Las cifras de nasofaringe y tráquea, más altas en la inspiración que en la espiración, sugieren
que el NO exhalado no procede de la síntesis pulmonar (aunque no se puede descartar que exista
una porción de origen broncoalveolar) sino que sería sobre todo el NO residual del NO nasal
autoinhalado, después de pasar y ser reabsorbido por los alveolos. El NO nasofaríngeo debe ser
inhalado y reabsorbido por el tracto respiratorio inferior, puesto que la suma de NO y NO2 estaba
reducida en la fracción espiratoria y el cociente NO/NO2 sólo cambiaba ligeramente (por lo tanto la
disminución espiratoria del NO no era a causa de la conversión de NO en NO2). La intubación
endotraqueal impide la natural autoinhalación del NO producido en la nasofaringe. Si la
ventiloterapia utiliza "aire comprimido" en vez de "aire medicinal", se aportan pequeñas cantidades
de NO (entre 0,013-0,079 ppm) que tienen efectos fisiológicos positivos como va sodilatador
pulmonar y que suplen a la autoinhalación del NO producido en las vias aéreas superiores(6).
El hecho de que en el síndrome de Kartagener prácticamente no exista NOe(7) indica que en
los individuos sanos el NO exhalado tiene un origen casi exclusivamente nasal. El NO nasal
también está disminuido en la fibrosis quística(8), pero se eleva en la rinitis alérgica(9).
En la cavidad gástrica se producen grandes cantidades de NO (0,8-6 ppm), y sus
concentraciones son hasta 100 veces superiores que las encontradas en el NOe a través de la boca.
Esta producción requiere un ambiente ácido, y disminuye un 95% si previamen-te se administra
omeprazol (inhibidor de la bomba de protones)(10).
Elevación del NOe
El pico de NOe es más alto tras aguantar la respiración durante 50-60 seg. Las
concentraciones de NOe disminuyen durante el ejercicio, pero si se tiene en cuenta el aumento del
volumen minuto ventilatorio, la excreción total de NOe aumenta durante la hiperventilación o el
ejercicio(4).
La ingesta de 0,1-0,2 mg/kg de L-arginina comporta una elevación significativa de NOe, que es
máxima a las 2 horas(11). La administración de nitroglicerina aumenta el NOe(12).
En adultos se ha constatado una elevación del óxido nítrico exhalado (NOe) en pacientes con
asma(13,14), bronquiectasias(15) y durante las infecciones agudas de la via aérea superior(16). El
aumento de las bacterias nasales eleva el NOe(5). En conjunto, estas observaciones sugieren que el
incremento de NOe procede de un aumento en la síntesis de NO, presumiblemente a partir de la
NOS-inducible, estimulada por la mayor actividad inflamatoria en la via aérea. Además, la
administración de corticoides inhalados a los pacientes con asma reduce la concentración de NOe a
niveles similares a adultos sanos(13). También aumenta el NOe en cirrosis hepáticas
descompensadas(17).
En el niño se ha descrito elevación del NOe en el asma y reducción del mismo tras el
tratamiento corticoideo inhalado(18).
Disminución del NOe
Los adultos fumadores presentan concentraciones más bajas de NOe(14). Estas personas
inhalan grandes cantidades de NO procedente del humo del tabaco, que puede inhibir la producción
endógena de NO; también podría existir un daño tóxico de las células productoras de NO causado
por el humo del tabaco. El NOe disminuye tras la ingesta de etanol(19) y en hipertensos(20).
La ventiloterapia prolongada disminuye la síntesis nasofaríngea, y ello podría deberse a la
administración de antibióticos. Sin embargo, el tratamiento con antibióticos durant e 1 semana no
parece afectar al NOe(7).
El NOe no cambia entre las semanas 10 y 42 de gestación. Sin embargo, los nitritos en
líquido amniótico disminuyen significativamente después de la semana 37, lo cual indica
disminución en la producción endógena de NO que puede contribuir al aumento de la actividad
uterina(21).
Unidades del NOe
1/ Concentración en ppm. Recordar que 1 ppm = 1000 ppb.
2/ Concentración en ppm, convertida a "porcentaje del control"(19).
3/ Total de NO excretado en nL (nanolitros), en función del tiempo y del tamaño corporal (peso y/o
superficie corporal en m2): nL * min-1 * Kg-1 ó nL * min-1 * (m2)-1
El total espirado equivaldrá a su proporción en el aire espirado, multiplicado por el volumen total
espirado en determinado tiempo. Por todo ello, el total excretado de NOe /kg será: [NOe en ppm] *
(Volumen espirado /tiempo(min)) / peso en Kg
Ejemplo: Peso=3 Kg; Volumen espirado= 900 mL/minuto; [NOe]= 0,045 ppm; 0.045 ppm = 0.045
nL / 1000000 nL
0,045 nL NO 900 mL 1000000 nL
nL NO
[NOe]= --------------- X --------- X -------------- / 3 kg = 13,5 -------1000000 nL 1 min
1 mL
min*Kg
4/ Total de NO excretado en nmol (nanomoles): Para convertir nL a nmol se tendrá en cuenta que 1
mol = 24,3 litros, a una tempera-tura ambiental de 23ºC.
Recientemente, Schedin et al(22,23) han descrito los niveles de NO nasal en neonatos sanos, usando
la ley general de gases para estimar la excreción nasal de NO. Sus resultados para una sola fosa
nasal en neonatos a término de 4-7 días de vida fueron 0,11 nmol/min*kg (equivalentes a 2,64
nL/min*kg). Por lo tanto, para las dos fosas nasales sería aproximadamente el doble: 5,28
nL/min*kg.
Premisas para la medición del NOe
Para obtener resultados correctos debe tenerse en cuenta:
- Los materiales del sistema no deben generar ni captar NO, demostrándolo con experimentos en los
que el sistema sea atravesado por aire medicinal libre de NO o NO a concentraciones conocidas(4).
Al recoger en bolsas, puede inactivarse el NOe(13). El material ideal es el Teflón.
- Los aparatos electroquímicos son poco sensibles, y para detectar pequeñas cantidades de NO es
imprescindible disponer de quimioluminiscencia, con calibración mediante 0,100 ppm de NO
aproximadamente.
- Las concentraciones de NO en aire ambiental (0-0.038 ppm) no afectan las lecturas del pico de
NOe(13) ni las mediciones de NOe mediante la técnica de "exhalación lenta contra resistencia"(24).
Sin embargo, en las técnicas de recogida total del aire exhalado, la contaminación con aire
ambiental (o aire centralizado comprimido) rico en NO invalidaría los resultados.
- Las cifras obtenidas suelen ser algo variables de una determinación a otra realizada
inmediatamente después, por lo que es mejor efectuar tres mediciones en cada sujeto y adoptar
como correcta la media de las mismas, siempre que la variabilidad sea baja (coeficiente de
variación= DS/media, inferior a 30%).
Medición del NOe en niños mayores de 6 años
El mejor método actualmente aceptado para la medición del NO exhalado es la técnica de
"exhalación lenta contra resistencia"(25). El niño debe exhalar a través de una cánula la cual, para
generar un flujo espiratorio de 250 mL/seg, origina una presión retrógrada de 50 mm de agua en la
boca, que es suficiente para ocluir las fosas nasales por el velo del paladar e impedir la
contaminación del NO exhalado por el NO nasal. El registro del NO exhalado consta de dos partes:
una inicial o "pico" que corresponde al aire del espacio muerto y presenta gran contaminación con
aire nasal previamente inhalado, y una segunda o "meseta" que es el registro estable de NO y
traduce la producción de NO a nivel broncoalveolar. El registro del verdadero NO exhalado se hará
en la meseta cuando el CO2 esté entre el 5-6%.
El NO nasal se determina con la misma técnica anterior de "exhalación lenta contra
resistencia" pero dejando libre un orificio nasal mientras el analizador de NO aspira aire a través de
la otra fosa nasal ocluída. El registro del verdadero NO nasal se realiza cuando el CO2 es 0,21 (aire
ambiente nasal). Para que el registro sea válido, el NO ambiental debe ser despreciable(18).
Estas técnicas determinan la concentración del NO en ppm, pero no cuantifican la síntesis total del
mismo.
Nueva metodología para determinar el NOe total en el recién nacido (26)
Se recoge el gas exhalado tanto por nariz como por boca, incluyendo por tanto el NOe de
síntesis nasal (NO nasal) y en vías respiratorias bajas (NO broncoalveolar). Interesa evitar que el
RN llore mientras se recoge el NOe.
1. Mascarilla conectada a válvulas unidireccionales. Tanto la mascarilla como las dos válvulas
unidireccionales, una inspiratoria y otra espiratoria, deben presentar muy poco espacio muerto. La
estanqueidad tras su colocación se consigue con una cobertura externa con el adhesivo Opside o
similar.
2. Para conseguir que el aire inspirado no contenga el NO de contaminación ambiental, es útil
introducir a través del tubo inspiratorio de la mascarilla un flujo a demanda de aire medicinal. El
aire medicinal se introduce en una bolsa de plástico de 2 L de capacidad, a un flujo de 1 L/min
durante 15 minutos. De esta manera se consigue que el gas que sale de la bolsa tenga un NO de
0,002 ppm, cifra tolerable para ser basal(2). Posteriormente se conecta la salida de la bolsa al tubo
inspiratorio de la mascarilla, previamente fijada de modo estanco. Pasados 5 minutos de respirar el
RN el aire medicinal, se considera que en el espacio muerto y los alveolos ya sólo exis ten
cantidades mínimas de NO contaminante.
3. Para recoger el aire espirado, contabilizando su flujo y la concentración de NOe, debe construirse
un sistema de recogida con dos bolsas de plástico de 2 L de capacidad cada una, separadas por una
llave de tres pasos conectada a una jeringa de 50-60 mL de capacidad. El material del sistema no
debe reaccionar con el NO ni generarlo(2). La entrada a la primera bolsa se conectará al tubo
espiratorio de la mascarilla, para recoger el gas espirado por el RN. Entre la mascarilla y la entrada
a la primera bolsa habrá una conexión en Y, que permitirá (mediante su cierre adecuado con pinzas)
que el gas espirado por el niño sea rechazado al exterior o bien recogido cuando se desee. La salida
de la segunda bolsa dispondrá de una válvula de cierre, y tras la misma se conectará directamente
con el aparato de quimioluminiscencia.
Una vez construido este sistema de recogida, y antes de su utilización, debe comprobarse:
1/ Total estanqueidad de todas las conexiones. Se ratifica colocando una pinza a diferentes niveles,
y haciendo aspiración con la jeringa, al constatar que se hace el vacío.
2/ Limpieza del NO "ambiental" dentro del sistema de recogida. Se consigue haciendo pasar a
través de todo el sistema (dos bolsas, jeringa y tubos), después de llenar las dos bolsas, 0,75 L/min
de aire medicinal durante 15 minutos. Con ello la concentración de NO a la salida del circuito es
inferior a 0,004 ppm(2).
Cuando el RN se tranquilice (no llanto, FC y FR estables), se iniciará la recogida del aire espirado
durante 1 minuto (más de 3 Kg), 1,5 minutos (2-3 Kg) o 2 minutos (menos de 2 Kg). Durante la
recogida, con la mascarilla convenientemente sellada, la llave de tres pasos estará cerrada y se
anotarán aproximadamente los segundos con llanto. Al terminar el tiempo indicado se cerrará la
pinza de entrada en la primera bolsa.
Inmediatamente después de la recogida del aire espirado, se pasará el gas de la primera a la segunda
bolsa contabilizando el número de emboladas de jeringa necesarias (por su capacidad equivaldrá al
flujo = volumen/ tiempo usado). Cuando la primera bolsa ya está vacía, se cierra la llave de tres
pasos; se abre la válvula de salida de la segunda bolsa y se determina la concentración de NOe
mediante quimioluminiscencia.
Línea de Investigación(2,27)
Hipótesis de trabajo
- El NO exhalado recogido a través de boca y nariz en el recién nacido varia (aumenta, disminuye)
según:
- las horas de vida: al nacer no existe flora bacteriana nasal, que aparecerá en las primeras
horas/días de vida
- la edad gestacional y/o peso de nacimiento (no influye)
- la terapéutica: antibioterapia (lo disminuye),...
- la contaminación / sobreinfección nasal (lo eleva): presente ya al nacimiento en caso de
corioamnionitis, y menos en otras causas de riesgo de infección perinatal
- la patología pulmonar inflamatoria (lo eleva): DBP, neumonía,...
Resultados previos
- El análisis del coeficiente de variabilidad se efectuó determinando la variación intrasujeto de la
medición en 24 recién nacidos, llevando a cabo en 17 de ellos las determinaciones por duplicado y
en los otros 7 por triplicado. Las recogidas del gas expirado se practicaron consecutivamente en
cada recién nacido, sin cambiar su condición. La variabilidad intrasujeto de las determinaciones de
NO exhalado se calculó usando el coeficiente de variación porcentual (Desviación estandar / media
* 100). Se aplicó tanto a la concentración de NO exhalado como al total de NO exhalado. La
variabilidad media del total de NO exhalado fue 13,9%, y la máxima variabilidad (media + 2
desviaciones estandar) 28,96%.
- Para analizar la influencia de la sedación del neonato en las cifras de NO exhalado total, se
compararon los resultados en 7 casos con sedación versus 29 sin sedación. Los grupos eran
comparables al no existir diferencias en el peso del nacimiento, edad gestacional, horas de vida,
peso y NO ambiental en el momento de la recogida del gas expirado. Los neonatos sedados
mostraron un descenso significativo del volumen tidal / Kg (p=0.015), volumen minuto / Kg
(p=0.032) y en el NO exhalado total (p=0.003). La duración del llanto durante la recogida y la
concentración del NO exhalado en ppm fueron similares. Por lo tanto, el NO exhalado total
disminuye en el neonato sedado, debido a la reducción del volumen minuto respiratorio. En
consecuencia la sedación no debe ser usada, y además no suele ser necesaria si la recogida se
efectúa en la primera hora tras la ingesta.
Objetivos
1. Determinar los valores normales del NO exhalado (nL/min*Kg) en el recién nacido, según su
edad gestacional (pretérmino de 34 a 36 semanas, a término de >=37 semanas), tipo de parto
(vaginal, cesárea) y horas de vida (menos de 72 horas y entre 72 y 168 horas).
2. Estudiar los cambios del NO exhalado en los tres primeros días de vida del recién nacido con alto
riesgo de infección perinatal.
3. Analizar los cambios del NO exhalado en la primera semana de vida, en recién nacidos con
sospecha de infección (con o sin corioamnionitis) o con sepsis clínico-analítica (hemocultivo
negativo) precoz.
4. Correlacionar las cifras de NO exhalado con los niveles de nitritos en sangre y orina
(relativizados según la creatinina urinaria).
Pacientes
Se han estudiado 232 recién nacidos: 143 sanos, 31 con riesgo de infección y 58 con sospecha de
infección tratada con antibióticos (de los cuales 26 se etiquetaron como con sepsis clínico-analítica
precoz, ya que ninguno presentó un hemocultivo positivo a pesar de una sintomatología propia de
sepsis).
Resultados
1. Grupo de recién nacidos sanos:
- Se demostró una correlación positiva entre el NO exhalado y las horas de vida (n=143, r=0.577,
p=0.000). Ello se explicaría porque tras el nacimiento, al colonizarse las fosas nasales y la vía aérea,
aumentaría la producción de NOe, siendo este aumento proporcional a las horas de vida. Además, el
NOe fue:
<72 horas
72-167 horas
n
107
36
media
4.50
6.41
DS
1.249
1.593
p=0.000
Al llevar a cabo un estudio longitudinal en 26 neonatos sanos nacidos por cesárea, se observó un
aumento significativo del NOe en la segunda determinación (6.53±1.545 VS 4.36±0.906; P=0.000).
- Los principales resultados del NO exhalado, estratificado según el factor de confusión horas de
vida, se resumen en la siguiente tabla (n;X±DS):
NO exhalado (nL/min*Kg)
<72 horas
72-168 horas
p
- Global:
107; 4.50±1.249
36; 6.41±1.593
0.0000
- Término:
62; 4.52±1.385
23; 6.05±1.636
0.0000
- Pretérmino: 45; 4.47±1.049 NS 13; 7.06±1.339 NS
0.0000
- Vaginal:
- Cesárea:
55; 4.52±1.198
52; 4.48±1.312 NS
7; 6.84±1.138
29; 6.31±1.685 NS
0.0000
0.0000
- Los principales resultados de los Nitritos en sangre se resumen en la siguiente tabla (n;X±DS):
Nitritos en sangre (nmol/mL)
- Global:
89; 38.87±22.432
- Término:
55; 39.98±25.258
- Pretérmino : 34; 37.07±17.103 NS
- Vaginal:
- Cesárea:
46; 37.49±20.38
43; 40.34±24.595 NS
- No hay correlación entre los Nitritos en sangre y las horas de vida (n=89; r=-0.045; p=0.673). Sí
existe una muy escasa correlación entre los Nitritos/creatinina en orina y las horas de vida (n=21;
r=0.489; p=0.024).
- No se ha demostrado correlación entre el NO exhalado y los nitritos en sangre (n=89, r=-0.157,
p=0.140). Ello sugiere que la síntesis del NO exhalado no está relacionada con la producción
endógena de NO, cuantificada con los nitritos + nitratos en sangre, sino más bien sería una
producción independiente en las propias vías aéreas.
- No se ha demostrado correlación entre los nitritos en sangre y los nitritos/creatinina en orina
(n=21; r=0.092, p=0.690), y tampoco entre los nitritos en sangre y los nitritos en orina en nmol/mL
(n=21; r=0.120, p=0.604). No se ha podido determinar la correlación entre los nitritos en sangre y
los nitritos totales en orina durante 6 horas, pues la recogida de orina no ha sido fiable y el sondaje
vesical no se consideró éticamente indicable.
2. Recién nacido con alto riesgo de infección perinatal.
- Los principales resultados del NO exhalado, estratificado según el factor de confusión horas de
vida, se resumen en la siguiente tabla (n;X±DS):
NO exhalado (nL/min*Kg)
<72 horas
72-168 horas
p
Sano:
107; 4.50±1.249
36; 6.41±1.593
0.0000
Riesgo infección:
31; 4.34±1.087
Sospecha infección: 30; 8.51±2.975
28; 9.82±2.928
(0.095)
- Sin corioamnionitis: 24; 8.22±2.937
23; 9.85±3.036
(0.068)
- Con corioamnionitis:6; 9.65±3.112 NS 5; 9.69±2.674 NS
NS
- Sin sepsis precoz
- Con sepsis precoz
16; 8.06±3.205
14; 9.02±2.712 NS
16; 10.10±2.948
12; 9.45±2.989 NS
(0.070)
NS
En el grupo <72 horas, el análisis de varianza unifactorial entre SANO / RIESGO / SOSPECHA da
una p=0.0000, con significación entre SANO / SOSPECHA y RIESGO /SOSPECHA. También el
análisis de varianza unifactorial entre SANO / RIESGO / SOSPECHA SIN SEPSIS / SEPSIS
PRECOZ da una p=0.0000, con significación entre SANO / SOSPECHA, SANO / SEPSIS,
RIESGO /SOSPECHA Y RIESGO / SEPSIS.
En el grupo 72-168 horas, el análisis de varianza unifactorial entre SANO / SOSPECHA da una
p=0.0000. También el análisis de varianza unifactorial entre SANO / SOSPECHA SIN SEPSIS /
SEPSIS PRECOZ da una p=0.0000, con significación entre SANO / SOSPECHA y SANO /
SEPSIS.
- Los principales resultados de los Nitritos en sangre se resumen en la siguiente tabla (n;X±DS):
Nitritos en sangre (nmol/mL)
Sano:
89; 38.87±22.432
Riesgo infección:
28; 32.88±16.781
Sospecha infección: 31; 49.16±21.913
- Sin corioamnionitis: 24; 48.63±21.399
- Con corioamnionitis: 7; 50.95±25.313 NS
- Sin sepsis precoz: 18; 48.72±22.455
- Con sepsis precoz: 13; 49.76±22.030 NS
El análisis de varianza unifactorial entre SANO / RIESGO / SOSPECHA da una p=0.0125, con
significación entre RIESGO /SOSPECHA. También el análisis de varianza unifactorial entre SANO
/ RIESGO / SOSPECHA SIN SEPSIS / SEPSIS PRECOZ da una p=0.0327, pero sin significación
entre los diferentes grupos.
Conclusiones
1. El NOe total aumenta a lo largo de la primera semana de vida, pero no es influido por la edad
gestacional ni la vía del parto.
2. El NOe total no guarda relación con los nitritos plasmáticos ni urinarios.
3. Las situaciones con riesgo de infección sin trastornos clínicos ni analíticos no modifican el NOe.
4. Las situaciones con sospecha de infección con trastornos clínicos y/o analíticos (y que reciben
tratamiento antibiótico) elevan el NOe, tanto precoz como tardíamente, aún siendo negativo el
hemocultivo.
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