Clase 7 vier 1-4-11

Investigación en evolución
Análisis de secuencias de:
nucleótidos en DNA
(genómica)
aminoácidos en Proteínas (proteómica)
Comparación de secuencias de:
nucleótidos
aminoácidos
Bioinformática
Análisis de secuencias nucleótidos en DNA
1- Patrón de fragmentos de restricción
2’,3’- dd de CTP
2’,3’- dd de ATP
a) Hidrólisis catalizada por enzimas de
restricción
b) Electroforesis
2- Secuenciación de ADN (Método de Sanger) (interrupción
controlada de la replicación)
1 hebra de interés de ADN + + + +
ADN polimerasa
++ ++
Cebador
++ ++
4 NTPs
++ ++
2’,3’- didesoxi de ATP
+ - - 2’,3’- didesoxi de TTP
- + - 2’,3’- didesoxi de GTP
- -+ 2’,3’- didesoxi de CTP
- -- +
2’,3’- dd de GTP
2’,3’- dd de TTP
Cebador
3’ GTCGATGATACGACT 5’
5’ CAGCTACTATGCTGA 3’
Las nuevas hebras de DNA son
separadas y sometidas a electroforesis
Determinación de secuencia de aa en
una proteína
 Obtención de péptidos pequeños por hidróslisis
enzimática
 En cada péptido
1- Cuantificación de aa
2- Determinación de aa N-terminal
3- Secuenciación
Obtención de péptidos pequeños por hidróslisis enzimática y no enzimática
Obtención de péptidos pequeños por hidróslisis enzimática. Ejemplo
1- Cuantificación de aa: (determina cuáles y cuánto de c/aa pero no la secuencia)
a) Hidrólisis ácida del péptido; b) derivatización (por ej. con nihindrina, fluorescamina); c) HPLC
para separación y cuantificación de los derivados de aa derivatizados
2- Determinación del aa N-terminal (marcaje c/cloruro de dabsilo, hidrólisis)
3- Secuenciación
(Met. Químico= Degradación de Edman)
(Mét.Físico= MALDI-TOFF)
Análisis de secuencias de aa en Proteínas
Secuenciación de Edman
separa el residuo amino terminal y se obtiene PTH-aa
MALDI-TOFF
Espectrometría de masas
Investigación de la evolución
Similitud en la estructura
Antecesor común?
ortólogos (homólogos presentes
en distintos organismos igual
función y que han evolucionado
mediante descendencia directa)
parálogos (homólogos presentes
en un mismo organismo que
codifican proteínas con similar o
distinta función,).
Análisis de homologías: Análisis estadístico de secuencias alineadas
Contar número de identidades para cada alineamiento
Técnicas de calificación de homologías:
- Identidades: +10 puntos
-Inseción de huecos (para compensar desajustes por deleciones de
nucleótidos): -25 puntos
El alineamiento es significativo?
Alineamientos para
muchas secuencias
barajadas
Hemoglobina y
mioglobina humanas
Análisis para secuencias
verdaderas
La homologia del 25,9% es estadisticamente significativa
Matriz de sustitución BLOSUM-62
Para análisis de parentescos lejanos
Se analiza sustituciones en bloques de secuencias alineadas
Enmarcado (arriba): aa sustituido
Rojo: aa cargados
Verde: aa polares
Azul: aa grandes e hidrofobicos
Negro: otros
Alineamiento con inserción de un hueco.
147 aa totales, 38 aa emparejados – 25,9% similitud
Alineamientos con anotación de sustituciones “conservadoras” (en amarillo), poseen calificación superior a
cero s/matriz Blosum-62
Distribución de calificaciones de alineamientos
de mioglobina humana y leghemoglobina de altramuz
P=1/20
P=1/300
p-= probabilidad de que
alineamiento sea debido al
azar
Blosum 62 aporta
mayor valor
estadístico
IDENTIDADES
>25%
Secuencias probablemente homólogas
15-25%: análisis de significación estadística del alineamiento
<15% no descarta la posible homología (analizar estructuras tridimensionales).
Comparación de estructuras: terciaria se conserva más que la primaria
Chaperona
Citoesqueleto
Homología en
secuencia
(estr.1ria) sólo del
15.6% pero alta
en estr.3ria
Alinear secuencias consigo mismas permiten detectar motivos repetidos
GRAFICO AUTODIAGONAL
Puntos: aa alineados
Diagonal: alineamiento consigo misma
Lineas // a la diagonal: repeticiones
El gen que codifica a
la proteína evolucionó
mediante la
duplicación del gen
que codificaba a un
único dominio.
EVOLUCION:
Divergente: mismo ancestro
Convergente: no tienen antepasado común pero evolucionan hacia una estructura semejante cuando
realizan igual actividad bioquimica
Proteasas de serina:
En el sitio activo confluyen Ser,
His,Asp
En el resto, las estructuras son muy
diferentes entre si.
ANALISIS DE SECUENCIAS DE RNA
Nucleotidos en posiciones 9
y 22 mantienen capacidad de
formar parejas de Watson y
Crick
CONSTRUCCION DE ARBOLES EVOLUTIVOS
1- Analisis de homologías
2- Calibrar tiempos de divergencia con registros de fósiles
Comparacion de secuencias de DNA
PCR+secuenciación
EVOLUCION EN EL LABORATORIO
RNAs sintetizados por química combinatoria
- Moleculas de RNA que unen ATP con alta afinidad se transcriben inversamente a DNA
- Amplificar por PCR
- Transcripción a RNA
- Despues de 8 generaciones: secuenciación
- 17 secuencias; 16 con igual estructura; Afinidad KdATP= 50 µM
MOLECULA DE RNA QUE SE UNE AL ATP
Estructura secundaria conservada
Dos regiones helicoidales con
bases emparejadas de Watson y
Crick
Hueco adonde puede unirse el
anillo de adenina